ES2428766T3

ES2428766T3 - Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores

Info

Publication number: ES2428766T3
Application number: ES09004788T
Authority: ES
Inventors: Stephen R. Hamilton
Original assignee: Glycofi Inc
Current assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2013-11-11
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: JP2010220616A; ES2428766T9; EP2333095B1; JP2006518599A; US8299228B2; AU2004213861B2; ES2399736T3; JP5513243B2; JP4792387B2; ES2338324T3; US20100062516A1; EP1597380B2; EP1597380A2; WO2004074498A3; US8298811B2; EP2088201B1; EP2333096A3; US7625756B2; EP2083084A1; EP2333096B1

Abstract

Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende: (a) un dominio catalítico de manosidasa capaz de hidrolizar un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal 3 y/o Manal,6; condensado con (b) un péptido señal de dirección celular que normalmente no está asociado con el dominio catalítico de (a), en el que dicho péptido señal de dirección celular está dirigido a dicho dominio catalítico de la manosidasa a la ruta secretora de la célula huésped en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo al menos el 10% de los enlaces Manal,3 y/o Manal,6 de 10 un sustrato que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal,3 y Manal,6, de modo que convierte Man6GlacNAc2 en Man4GlacNAc2.

Description

Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la glicosilación de proteínas en levaduras u hongos filamentosos unicelulares o multicelulares, específicamente a la introducción de una enzima manosidasa que tiene especificidad de sustrato para hidrólisis de enlaces glucosídicos Mana 1,3 y/o Mana 1,6. La presente invención se refiere además a células huésped novedosas que comprenden genes que codifican una enzima manosidasa y N-glicano o intermedios que contienen N-glicano producidos como resultado de la hidrólisis.

Antecedentes de la invención

Rutas de glicosilación en seres humanos y eucariotas inferiores

Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento postraduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas de glicosilación diferentes, (glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleótidicos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, será diferente dependiendo del sistema huésped en el que la proteína particular se esté expresando. Las bacterias típicamente no glicosilan las proteínas y, si lo hacen, solo lo hacen de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderleyden, 1997 Arch Microbiol. 168(3): 169-175). Los eucariotas inferiores, tales como los hongos filamentosos y las levaduras, añaden principalmente los azúcares manosa y manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano o un manano de tipo "de alto contenido en manosa". Las células vegetales y las células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra manera. Por el contrario, en eucariotas superiores, tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacáridos naciente se puede cortar para eliminar varios restos de manosa y alargar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en los N-glicanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30, 193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; Weikert S., y col. , Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Malissard M., y col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267,169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9: 528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35 .

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones en secuencia durante el transcurso de las cuales se añaden y se eliminan restos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 enlazados a lípidos se ensamblan mediante un conjunto de reacciones en secuencia en la membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolichilo anclado a lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica está definido por un resto de asparagina (ASN) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne, 1990 Protein Eng. 3: 433-42). El procesamiento adicional mediante glicosidasas y manosidasas ocurre en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde los restos de manosa adicionales se retiran mediante alfa manosidasas (a-1, 2-) específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcares específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y Sialiltransferasas (ST) producen una estructura de la glicoproteína que se libera a partir del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contiene galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico terminal de grado elevado, que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se obtienen a partir de un precursor oligosacárido enlazado a lípido común Glc3Man9GlcNAc2-dolichol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolichol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido de núcleo mediante células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente del de humanos ya que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares manosa.

En levadura, estas etapas están catalizadas por las manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mntlp y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de S. cerevisiae, que carecen de actividad manosil-transferasa (por ejemplo, mutantes de Och1 o mnn9) han demostrado ser no mortales y presentan contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura, pareciéndose más, por tanto, a oligosacáridos de eucariotas superiores.

Precursores de nucleótidos de azúcar

Los N-glicanos de glicoproteínas animales típicamente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, el intervalo completo de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-Nacetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido de núcleo mediante glicosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, J. Cell Biol 1981. 91 (2): A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18): 811-817; Pérez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709 --715).

Las reacciones de transferencia de glicosilo típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras los monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato de nucleósido mediante un mecanismo de antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos de nucleósidos y fosfato inorgánico antes exportarse. Esta reacción es importante para la glicosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, que GDPasa tiene una actividad reducida en el 90% hacia UDP (Berninsone y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1): 207-211). Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi, ya que los mismos no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteína basada en Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requerimiento potencial de una enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. . 269(1): 207-211). Se conoce que UDP es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este producto secundario de la glicosilación puede ser importante para evitar la inhibición de glicosil-transferasa en el lumen del Golgi (Khatara y col., 1974). Véase Berninsone, P., y col. 1995. J. Biol. Chem. 270(24): 14564-14567; Beaudet, L, y col. 1998 Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects. 292: 397-413.

Procesamiento secuencial de N-glicanos mediante actividades enzimáticas compartimentalizadas

Las transferasas y glicosidasas de azúcar (por ejemplo, manosidasas) surcan la superficie interna (luminal) del RE y el aparato de Golgi y, por lo tanto, proporcionan una superficie "catalítica" que permite el procesamiento secuencial de las glicoproteínas a medida que avanzan a través del RE y la red de Golgi. Los múltiples compartimentos del Golgi cis, medio y trans y la Red trans del Golgi (TGN), proporcionan los emplazamientos diferentes en los que la secuencia ordenada de reacciones de glicosilación se puede producir. A medida que una glicoproteína avanza desde la síntesis en el RE hasta la maduración completa en el Golgi tardío o TGN, se expone secuencialmente a diferentes glicosidasas, manosidasas y glicosiltransferasas de forma que se puede sintetizar una estructura de carbohidrato específica. Se ha dedicado mucho trabajo a descubrir el mecanismo exacto mediante el cual estas enzimas se retienen y anclan a su organelo respectivo. La situación en desarrollo es compleja, pero la evidencia sugiere que la región troncal, la región transmembrana y la cola citoplasmática, individualmente o en conjunto, dirigen las enzimas hacia la membrana de los organelos individuales y de ese modo localizan el dominio catalítico asociado en ese locus (véase, por ejemplo, Gleeson, PA (1998) Histochem. Cell Biol. 109, 517-532).

En algunos casos, estas interacciones específicas se observó que funcionaban a través de las especies. Por ejemplo, el dominio transmembrana de a2,6-ST de ratas, una enzima que se conoce que se localiza en el Golgi trans del animal, también demostró localizar un gen informador (invertasa) en el Golgi de levadura (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Sin embargo, el mismo dominio transmembrana como parte de una a2,6-ST de longitud completa se retuvo en el RE y no se transportó adicionalmente al Golgi de levadura (Krezdom y col. (1994) Eur. J. Biochem. 220(3): 809-17). Una GalT de longitud completa de seres humanos ni siquiera se sintetizaba en levaduras, a pesar de niveles de transcripción que se podía demostrar que eran elevados. Por el contrario, la región transmembrana de la misma GalT humana fusionada a un informador de invertasa fue capaz de dirigir la localización al Golgi de levadura, aunque a niveles de producción bajos. Schwientek y sus colaboradores han demostrado que fusionar 28 aminoácidos de una manosiltransferasa de levadura (MNT1), una región que contiene una cola citoplasmática, una región transmembrana y ocho aminoácidos de la región troncal, al dominio catalítico de GalT humana son suficientes para la localización en Golgi de una GalT activa. Otras galactosiltransferasas parecen depender de interacciones con enzimas residentes en organelos particulares debido a que, después de la remoción de su región transmembrana, las mismas todavía son capaces de localizarse correctamente.

La localización inapropiada de una enzima de glicosilación puede evitar el funcionamiento apropiado de la enzima en la ruta. Por ejemplo, Aspergillus nidulans, que tiene muchas a-1,2-manosidasas (Eades y Hintz, 2000 Gene 255(1): 25-34), no añade GlcNAc a Man5GlcNAc2 cuando se transforma con el gen GnTI de conejo, a pesar de un nivel global elevado de actividad de GnTI (Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). GnTI, aunque se expresa activamente, puede estar localizada de forma incorrecta de forma que la enzima no esté en contacto con ambos de sus sustratos: UDP-GlcNAc y un sustrato Man5GlcNAc2 productivo (no todas las estructuras de Man5GlcNAc2 son productivas; véase más adelante). Como alternativa, el organismo huésped puede no proporcionar un nivel adecuado de UDP-GlcNAc en el Golgi o la enzima puede estar localizada apropiadamente pero, sin embargo, inactiva en su nuevo entorno. Además, las estructuras Man5GlcNAc2 presentes en la célula huésped pueden diferir en estructura de Man5GlcNAc2 encontradas en mamíferos. Maras y colaboradores han observado que aproximadamente un tercio de los N-glicanos de celobiohidrolasa I (CBHI) obtenidos a partir de T. reesei se pueden cortar a Man5GlcNAc2 mediante 1,2 manosidasa de A.saitoi in vitro. Sin embargo, menos del 1% de esos N-glicanos podría servir como un sustrato productivo para GnTI. Maras y col., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 701-707. Por lo tanto, la simple presencia de Man5GlcNAc2, no asegura que se pueda conseguir el procesamiento in vivo adicional de Man5GlcNAc2. Lo que se necesita es la formación de una estructura de Man5GlcNAc2 reactiva con GnTI productiva. Aunque Man5GlcNAc2 se podría producir en la célula (aproximadamente el 27% en mol), sólo una pequeña fracción se podría convertir en Man5GlcNAc2 (menos de aproximadamente el 5%, véase el documento Chiba WO 01/14522).

Hasta la fecha, no existe una manera fiable de predecir si una glicosiltransferasa o manosidasa expresada de forma heteróloga particular en un eucariota inferior se (1) traducirá de forma suficiente, (2) será catalíticamente activa o (3) se localizará en el organelo apropiado dentro de la ruta secretora. Debido a que para lograr los patrones de glicosilación en eucariotas inferiores todos estos tres son necesarios, sería deseable un esquema sistemático para conseguir la función catalítica deseada y la retención apropiada de enzimas en ausencia de herramientas predictivas, que no están disponibles actualmente.

Producción de glicoproteínas terapéuticas

Un número significativo de proteínas aisladas a partir de seres humanos o animales se modifican posttraduccionalmente, siendo la glicosilación una de las modificaciones más significativas. Aproximadamente el 70% de todas las proteínas terapéuticas están glicosiladas y, por tanto, actualmente dependen de un sistema de producción (es decir, célula huésped) que sea capaz de glicosilar de una manera similar a los seres humanos. Varios estudios han demostrado que la glicosilación juega un papel importante en la determinación de (1) inmunogenicidad, (2) propiedades farmacocinéticas, (3) tránsito y (4) eficacia de proteínas terapéuticas. Por tanto, no es sorprendente que los esfuerzos sustanciales por la industria farmacéutica se hayan dirigido a desarrollar procedimientos para obtener glicoproteínas que sean tan "humanoides" o "similares a humanos" como sea posible. Hasta la fecha, la mayoría de las glicoproteínas se preparan en un sistema de huésped mamífero. Esto puede implicar la ingeniería genética de tales células de mamífero para potenciar el grado de sialilación (es decir, adición terminal de ácido siálico) de las proteínas expresadas por las células, que se conoce que mejora las propiedades farmacocinéticas de tales proteínas. Como Alternativa, se puede mejorar el grado de sialilación mediante adición in vitro de tales azúcares usando glicosiltransferasas conocidas y sus azúcares nucleotídicos respectivos (por ejemplo, 2,3-sialiltransferasa y ácido CMP-siálico).

Aunque la mayoría de los eucariotas superiores realizan reacciones de glicosilación que son similares a las encontradas en seres humanos, las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped mencionados anteriormente difieren invariablemente de su homólogo humano "natural" (Raju y col. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486). Por tanto, el trabajo de desarrollo extensivo se ha dirigido a encontrar maneras de mejorar el "carácter humano" de proteínas preparadas en estos sistemas de expresión. Esto incluye la optimización de condiciones de fermentación y la modificación genética de huéspedes de expresión de proteínas mediante la introducción de genes que codifican enzimas implicadas en la formación de glicoformas similares a humano. Goochee y col. (1999) Biotechnology 9(12): 1347-55; Andersen y Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5): 54649; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung. 48(8): 870-80; Weikert y col. (1999) Nat Genet. 17(11): 1116-21; Yang y Butler (2000) Biotech. Bioeng. 68: 370-80. Los problemas intrínsecos asociados con todos los sistemas de expresión de mamífero no han sido resueltos.

Producción de glicoproteínas usando microorganismos eucariotas

Aunque la estructura de oligosacárido de núcleo transferida a una proteína en el retículo endoplasmático es básicamente idéntica en mamíferos y eucariotas inferiores, se han encontrado diferencias sustanciales en las reacciones de procesamiento posteriores que ocurren en el aparato de Golgi de hongos y mamíferos. De hecho, incluso entre los eucariotas inferiores diferentes existe una gran variedad de estructuras de glicosilación. Esto ha evitado históricamente el uso de eucariotas inferiores como huéspedes para la producción de glicoproteínas humanas recombinantes a pesar de las ventajas de otra forma importantes sobre los sistemas de expresión de mamífero.

Las glicoproteínas terapéuticas producidas en un huésped de microorganismo tal como levadura utilizando la ruta de glicosilación de huésped endógena difiere estructuralmente de las que se producen en células de mamífero y típicamente muestran eficacia terapéutica enormemente reducida. Tales glicoproteínas son típicamente inmunógenas en seres humanos y muestran una semivida reducida (y por tanto bioactividad) in vivo después de la administración (Takeuchi (1997) Trenes in Glycoscience and Glycotechnology 9, S29-S35). Los receptores específicos en seres humanos y animales (es decir, receptores de manosa de macrófagos) pueden reconocer restos de manosa y promover la eliminación rápida de la glicoproteína extraña del torrente sanguíneo. Los efectos secundarios adicionales pueden incluir cambios en el plegamiento, la solubilidad, la susceptibilidad a proteasas, el tránsito, el transporte, la compartimentalización, la secreción, el reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad de las proteínas.

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se han usado satisfactoriamente para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares como secretadas (Cereghino, JL y JM Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki, A., y col. 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, RM, y col. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121-BIOT; Svetina, M., y col. 2000 J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251). Diversas levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha, han jugado papeles particularmente importantes como sistemas de expresión eucariotas debido a que son capaces de crecer hasta densidades celulares elevadas y secretar grandes cantidades de proteína recombinante. Análogamente, los hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa y otros, se han usado para producir eficazmente glicoproteínas a escala industrial. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, las glicoproteínas expresadas en cualquiera de estos microorganismos eucariotas difieren sustancialmente en la estructura de N-glicano de aquellas en los animales. Esto ha evitado el uso de levaduras u hongos filamentosos como huéspedes para la producción de muchas glicoproteínas terapéuticas.

Aunque la glicosilación en levaduras y hongos es muy diferente a la de seres humanos, se comparten algunos elementos comunes. La primera etapa, la transferencia de la estructura del oligosacárido de núcleo a la proteína naciente, se conserva altamente en todos los eucariotas, incluyendo levaduras, hongos, plantas y seres humanos (comparar Figuras 1A y 1B). Sin embargo, el procesamiento posterior de los oligosacáridos de núcleo difiere significativamente en levaduras e implica la adición de varios azúcares manosa. Esta etapa está catalizada por manosiltransferasas que residen en el Golgi (por ejemplo, OCH1, NMT1, MNN1, etc.), que añaden de forma secuencial azúcares manosa al oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas humanoides y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de S. cerevisiae que carecen de actividad manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes OCH1 o mnn9) han demostrado ser no mortales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura. Otras enzimas procesadoras de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasas, también pueden tener que eliminarse dependiendo del patrón de glicosilación endógeno particular del huésped. Después de reducir las reacciones de glicosilación endógenas indeseadas, la formación de N-glicanos complejos se tiene que manipular con ingeniería genética en el sistema de huésped. Esto requiere la expresión estable de varias enzimas y transportadores de nucleótidos de azúcar. Además, se tienen que localizar estas enzimas de forma que se asegure un procesamiento secuencial de la estructura de glicosilación de maduración.

Se han realizado varios esfuerzos para modificar las rutas de glicosilación de microorganismos eucariotas para proporcionar glicoproteínas más adecuadas para uso como agentes terapéuticos de mamíferos. Por ejemplo, se han clonado por separado varias glicosiltransferasas y expresado en S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos (Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8, Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Sin embargo, no se han obtenido N-glicanos que se parezcan a los que se han preparado en células humanas.

Las levaduras producen una diversidad de manosiltransferasas (por ejemplo, 1,3-manosiltransferasas tales como MNN1 en S. cerevisiae; Graham y Emr, 1991 J. Cell. Biol. 114(2): 207-218), 1,2-manosiltransferasas (por ejemplo, familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (por ejemplo, OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (por ejemplo, MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas reacciones glicosilación endógena. Muchos de estos genes se han suprimido individualmente dando origen a organismos viables que tienen perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Ejemplos de cepas de levadura que tienen manosilación alterada

Cepa N-glicano (de tipo Mutación N-glicano (mutante) Referencia silvestre)

S. pombe Man>9GlcNAc2 OCH1 Man8GlcNAc2 Yoko-o y col., 2001 FEBS Lett. 489(1 ): 7580

S. cerevisiae Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1 Man8GlcNAc2 Nakanishi-Shindo y col.1993 J. Biol. Chem. 268(35): 26338-26345

S. cerevisiae Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1/MNN4 Man8GlcNAc2 Chibaetal., 1998 J. Biol. Chem. 273, 2629826304

P. pastoris Hiperglicosilado OCH1 (supresión No hiperglicosilado Welfide, Publicación de

completa) Solicitud Japonesa Nº 8-336387

P. pastoris Man>8GlcNAc2 OCH1 (alteración) Man>8GlcNAc2 Contreras y col. WO 02/00856

La Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Nº 8-336387 describe la supresión de un homólogo de OCH1 en Pichia pastoris. En S. cerevisiae, OCH1 codifica una 1,6-manosiltransferasa, que añade una manosa a la estructura de 5 glicano Man8GlcNAc2 para producir Man9GlcNAc2. La estructura de Man9GlcNAc2, que contiene tres restos de 1,6 manosa, entonces es un sustrato para 1,2-, 1,6- y 1,3- manosiltransferasas adicionales in vivo, conduciendo a las glicoproteínas hipermanosiladas que son características de S. cerevisiae y que típicamente tienen 30-40 restos de manosa por N-glicano . Debido a que el Ochlp inicia la transferencia de 1,6 manosa al núcleo Man8GlcNAc2, con frecuencia se denomina "1,6 manosiltransferasa iniciadora" para distinguirla de otras 1,6 manosiltransferasas que

10 actúan posteriormente en el Golgi. En una cepa mutante de och1 mnn1 mnn4 de S. cerevisiae, las proteínas glicosiladas con Man8GlcNAc2 se acumulan y la hipermanosilación no ocurre. Sin embargo, Man8GlcNAc2 no es un sustrato para glicosiltransferasas de mamífero, tales como UDP-GlcNAc transferasa I y, por consiguiente, el uso de esa cepa mutante, por sí misma, no es útil para producir proteínas similares a mamífero, es decir, con patrones de glicosilación complejos o híbridos.

15 Se pueden cortar las estructuras Man8GlcNAc2 hasta un isómero Man5GlcNAc2 en S. cerevisiae (aunque todavía se tiene que demostrar una eficiencia alta de corte mayor del 50% in vivo) modificando genéticamente una manosidasa fúngica de A. saitoi en el retículo endoplasmático (RE). Los defectos de ese enfoque son dobles: (1) no está claro si las estructuras Man5GlcNAc2 se forman, de hecho, in vivo (en lugar de haberse secretado y modificado adicionalmente por manosidasas fuera de la célula); y (2) es no está claro si cualquiera de las estructuras de

20 Man5GlcNAc2 formadas, de hecho formadas in vivo, son la isoforma correcta para ser un sustrato productivo para la modificación de N-glicano posterior mediante por GlcNAc transferasa I (Maras y col., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 701-707).

Con el objeto de proporcionar una glicoproteína más de tipo humano obtenida a partir de un huésped fúngico, la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 describe un procedimiento para producir una glicoproteína híbrida

25 obtenida a partir de Trichoderma reseei. Un N-glicano híbrido sólo tiene restos de manosa en el brazo Mana1-6 de la estructura de manosa de núcleo y una o dos antenas complejas en el brazo Mana1-3. Aunque esta estructura tiene utilidad, el procedimiento tiene la desventaja de que se tienen que realizar numerosas etapas enzimáticas in vitro, lo cual es costoso y requiere mucho tiempo. Las enzimas aisladas son costosas de preparar y necesitan sustratos costosos (por ejemplo, UDP-GlcNAc). El procedimiento tampoco permite la producción de glicanos

30 complejos en una proteína deseada.

Actividad de manosidasa intracelular implicada en corte de N-glicano

Se requiere actividad alfa-1,2-manosidasa para el corte de Man8GlcNAc2 para formar Man5GlcNAc2, que es un intermedio principal para la formación de N-glicano complejo en mamíferos. El trabajo previo ha demostrado que la a-1,2-manosidasa fúngica y humana truncada murina se puede expresar en la levadura metilotrópica P. pastoris y

35 presentar actividad de corte de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2 (Lal y col., Glycobiology 1998 8 Oct (10): 981-95; Tremblay y col. Glycobiology 1998 Jun; 8 (6): 585-95, Callewaert y col. (2001) FEBS Lett. 503 (2-3): 173-8). Sin embargo, hasta la fecha, no existen informes que muestren el nivel elevado de corte in vivo de Man8GlcNAc2 a

Man5GlcNAc2 en una glicoproteína secretada a partir de P. pastoris.

Además, la simple presencia de una a-1,2-manosidasa en la célula, por sí misma, no asegura el corte intracelular apropiado de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2. (Véase, por ejemplo, Contreras y col. WO 02/00856 A2, en el que una manosidasa marcada con HDEL de T. reesei se localiza principalmente en el RE y se co-expresa con una proteína informadora de hemaglutinina de influenza (HA) en la que no se pudo detectar prácticamente ninguna Man5GlcNAc2. Véase también Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304, en el que una fusión de a1,2-manosidasa quimérica/dominio transmembrana Och1p localizada en el RE, Golgi temprano y citosol S. cerevisiae, no tenía actividad de corte de manosidasa. Por consiguiente, la simple localización de una manosidasa en el RE o Golgi es insuficiente para asegurar la actividad de la enzima respectiva en ese organelo dirigido. (Véase también, Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, que muestra que a-1,2-manosidasa de T. reesei, aunque se localiza intracelularmente, aumentaba en lugar de disminuir el alcance de manosilación). Hasta la fecha, no existen informes que demuestren la localización intracelular de una a-1,2-manosidasa heteróloga activa en levaduras u hongos usando una secuencia de localización transmembrana.

Aunque es útil modificar por ingeniería genética cepas que sean capaces de producir Man5GlcNAc2 como la estructura de N-glicano primaria, cualquier intento de modificar adicionalmente estas estructuras precursoras con alto contenido en manosa para que se parezcan más a glicanos humanos requiere etapas in vivo o in vitro adicionales. Los procedimientos para humanizar adicionalmente glicanos a partir de fuentes fúngicas y de levadura in vitro se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 (mencionada anteriormente). Si se tiene que humanizar adicionalmente Man5GlcNAc2 in vivo, se tiene que asegurar que las estructuras de Man5GlcNAc2 generadas sean, de hecho, se generen intracelularmente y no sean el producto de actividad manosidasa en el medio. La formación de N-glicano complejo en levaduras u hongos requerirá que se generen niveles elevados de Man5GlcNAc2 dentro de la célula debido a que sólo los glicanos Man5GlcNAc2 intracelulares se pueden procesar adicionalmente hasta N-glicanos híbridos y complejos in vivo. Además, se tiene que demostrar que la mayoría de las estructuras de Man5GlcNAc2 generadas son, de hecho, un sustrato para GnTI y, por tanto, permiten la formación de N-glicanos híbridos y complejos.

Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos para producir glicoproteínas caracterizadas por un contenido de Man5GlcNAc2 intracelular elevado que se puedan procesar adicionalmente en estructuras de glicoproteína similares a humano en las células huésped eucariotas no humanas y, particularmente, en levaduras y hongos filamentosos.

Manosidasas de clase 2

Varias manosidasas de clase 2 se han purificado y caracterizado: manosidasa II de ratón, manosidasa II humana y manosidasa II de Drosophila (la Figura 24 muestra un árbol filogenético de las clases de manosidasas). Se ha observado que las enzimas manosidasa de Clase 2 son responsables de la hidrólisis de enlaces glicosídicos a1,3, y a1,6 manosa en oligosacáridos enlazados a N localizados generalmente en el Golgi. Al menos cinco tipos de manosidasas de Clase 2 se han identificado, concretamente: (1) a-manosidasa II de Golgi; (2) a-manosidasa IIx de Golgi; (3) a-manosidasa lisosomal; (4) a-manosidasa citosólica; y (5) una enzima caracterizada a partir de esperma

o tejidos epididimarios de ratón y cerdo. Moremen KW., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235.

La anemia diseritropoyética congénita humana de tipo II se ha asociado con la carencia del gen de a-manosidasa II funcional como se ha mostrado en ratones. Chui y col. Cell 1997 11 Jul; 90(1): 157-67. Este defecto genético se denomina HEMPAS (multinuclearidad eritroblástica hereditaria con ensayo de lisis de suero acidificado positivo) y la investigación adicional avanza hacia el estudio del papel de a-manosidasa II. Por ejemplo, una mutación de un gen único que codifica a-manosidasa II ha demostrado dar como resultado una enfermedad autoinmune sistémica similar al lupus eritematoso sistémico humano. Chui y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2001 98: 1142-1147.

La importancia de la actividad enzimática en la formación de glicoproteínas se ha establecido; sin embargo, la expresión eficaz de tal actividad para la producción de glicoproteínas terapéuticas no se ha conseguido en células eucariotas inferiores.

(1) a-manosidasa II de Golgi

La a-manosidasa II de Golgi (EC. 3.2.1.114) es una proteína transmembrana de tipo II, de aproximadamente 125 kDa de tamaño, compuesta de una cola citoplasmática N-terminal corta, un dominio transmembrana único conectado por un segmento de tronco con una porción catalítica C-terminal luminal grande. Moremen y Touster, J. Biol. Chem., 260, 6654-6662; y Touster Moremen, J. Biol. Chem., 261, 10945-10951. La función de la manosidasa II es básica en el procesamiento de N-glicanos en la ruta secretora. En células de mamífero, se ha establecido que esta enzima particular hidroliza los enlaces glicosídicos Mana1,3 y Mana1,6 en el sustrato GlcNAcMan5GlcNAc2. El procesamiento de N-glicano posterior está catalizado por otras enzimas de glicosilación (por ejemplo, Nacetilglicosaminiltransferasas, galactosiltransferasas, sialiltransferasas) para producir la glicoformas deseadas con sus sustratos (UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, ácido CMP-Siálico) y sus transportadores respectivos. Véase, por ejemplo, el documento WO 02/00879, que se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad.

Un clon parcial que codifica la a-manosidasa II de Golgi se ha aislado a partir de una biblioteca de ADNc Agt11 de hígado de rata. Moremen, KW. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1989 Jul; 86(14): 5276-80. La a-manosidasa II de Golgi de ratón y la a-manosidasa II humana también se han caracterizado y expresado en células COS. Moremen y Robbins, J. Cell. Biol. 1991 Dic; 115 (6): 1521-34. La investigación conducida en la enzima a-manosidasa II de Golgi muestra que existe similitud considerable con el dominio C-terminal de esta clase de enzima. Además, los estudios de especificidad de sustrato muestran que la hidrólisis de los enlaces glicosídicos a1,3 y/o a1,6 mediante la enzima a-manosidasa II de Golgi requiere un GlcNAc terminal en el sustrato de oligosacárido.

La a-manosidasa II de Golgi de Drosophila melanogaster se ha aislado usando el ADNc de a-manosidasa II de Golgi murina y ha demostrado tener similitud considerable con regiones de otras a-manosidasas. Foster y col. Gene 154 (1995) 183-186. El trabajo previo ha demostrado que las secuencias de ADNc de Drosophila y ratón traducen secuencias de aminoácidos de identidad del 41% y similitud del 61%. La expresión de la secuencia de amanosidasa II de Golgi de Drosophila en células CHOP (células CHO que expresan de forma estable antígeno T grande de polioma) ha demostrado ser activa y también ha demostrado localizarse principalmente en el aparato de Golgi. Rabouille y col. J. Cell. Sci. 1999 Oct; 112 (Pt 19) : 3319-30.

(2) a-manosidasa IIx de Golgi

El gen que codifica la a-manosidasa IIx humana (a-manosidasa de isotipo II) se ha caracterizado. Ogawa y col. Eur.

J. Biochem. 242, 446-453 (1996). La sobreexpresión de la enzima a-manosidasa IIx conduce a la conversión de Man6GlcNAc2 en Man4GlcNAc2 en células CHO. Oh-eda, y col. Eur. J. Biochem. 268, 1280-1288 (2001). Los dos tipos de a-manosidasas (II y IIx) están íntimamente relacionadas con el procesamiento de N-glicanos en el Golgi. Esta a-manosidasa IIx de Golgi tiene una identidad del 66% con a-manosidasa II y tiene una actividad catalítica similar para hidrolizar el Mana1,6 y Mana1,3 del oligosacárido Man6GlcNAc2. Estudios más recientes han revelado un fenotipo de infertilidad obvio en ratones macho sin a-manosidasa IIx. Biochim Biophys Acta. 2002 19 Dic; 1573(3): 382-7. Un estudio ha encontrado que los testículos de ratón sin a-manosidasa IIx mostraban niveles reducidos de N-glicanos de tipo complejo terminados en GlcNAc.

(3) a-manosidasa Lisosomal

Otro tipo de manosidasa de clase 2 se encuentra en el lisosoma de las células eucariotas y está implicado en el catabolismo de glicoproteínas (degradación). A diferencia de la enzima manosidasa II de Golgi, que tiene un pH neutro óptimo, la manosidasa II lisosomal tiene un pH óptimo bajo (pH 4,5), tiene especificidad de sustrato natural amplia, es activa hacia el sustrato sintético p-nitrofenil-a-manosidasa y es sensible a la inhibición mediante swainsonina. Daniel y col., (1994) Glycobiology 4, 551-566; Moremen y col., (1994) Glycobiology, 4, 113-125. Estructuralmente, la a-manosidasa lisosomal tiene una secuencia señal N-terminal en lugar de la cola citoplasmática, dominio transmembrana y región de tronco de la enzima de Golgi. Moremen, KW, Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235. La a-manosidasa lisosomal humana (EC 3.2.1.24) se ha clonado y expresado en Pichia pastoris. Liao y col., J Biol Chem 1996 8 Nov; 271 (45): 28348-58. Basándose en regiones de conservación de secuencia de aminoácidos entre la a-manosidasa lisosomal de Dictyostelium discoideum y la amanosidasa II de Golgi murina (una glicoproteína que procesa la actividad de a1,3/1,6-manosidasa) se ha clonado un ADNc que codifica la a-manosidasa lisosomal murina. Merkle y col., Biochim Biophys Acta 1997 29 Agosto; 1336 (2): 132-46. Una deficiencia en la a-manosidasa lisosomal da como resultado una enfermedad genética humana denominada a-manosidosis.

(4) a-manosidasa citosólica

La a-manosidasa II citosólica es menos similar a las otras manosidasas de Clase 2 y parece preferir Co2+ sobre Zn2+para la actividad catalítica. Moremen, KW., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235. Al igual que la amanosidasa II lisosomal, está implicada en el catabolismo de glicoproteínas. La a-manosidasa II citosólica cataboliza las glicoproteínas plegadas de forma inapropiada en el lumen del RE que se han trasladado de forma retrógrada al citoplasma para desecho proteolítico. Duvet y col., Biochem. J. 335 (1998) 389-396; Grard y col., Biochem. J. 316 (1996) 787-792. Estructuralmente, esta enzima no tiene secuencia señal escindible o dominio transmembrana.

Las manosidasas adicionales que muestran características de manosidasas de Clase 2 se han descrito, pero todavía se tienen que clonar para la comparación directa mediante alineamiento de secuencias. Moremen, KW., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235.

Manosidasas de clase III

Las manosidasas de Clase III, que también están implicadas en el corte de los enlaces glicosídicos Mana1,3 y

Mana1,6 de un oligosacárido, por ejemplo, convirtiendo Man5GlcNAc2 en Man3GlcNAc2, se han clonado e identificado recientemente. Hasta la fecha, sólo se conocen dos miembros de esta clase de proteínas. El primer miembro identificado era de un ratón anémico que no tenía la actividad manosidasa II de Golgi clásica, pero poseía un mecanismo alternativo para convertir Man5GlcNAc2 directamente en Man3GlcNAc2, que era independiente de la presencia de GlcNAc en la rama de manosa-1,3 de núcleo (D. Chui, y col. Cell. 1997 90: 157-167). Estas manosidasas de clase III todavía tienen que clonarse, pero una proteína con actividad similar se ha clonado a partir de células Sf9 (Z. Kawar, y col. J. Biol. Chem. 2001 276(19): 16335-16340). El único miembro de las manosidasas de clase III que se tiene que clonar y caracterizar se origina de la línea de células de insectos lepidópteros Sf9 (D. Jarvis, y col. Glyco-biology 1997 7: 113-127). Esta manosidasa III de Golgi de Sf9 convierte Man5GlcNAc2 en Man3GlcNAc2 y, a diferencia de la manosidasa II de Golgi, no procesa GlcNAcMan6GlcNAc2. Una característica única de esta clase de manosidasas es que, además de poseer actividad Mana1,3/1,6, las mismas también poseen actividad a-1,2 manosidasa similar a manosidasa de Golgi de clase I. Además, al igual que las enzimas manosidasa I de Golgi, esta manosidasa III de Sf9 corta Man8GlcNAc2 más eficazmente que Man9GlcNAc2.

El documento EP 1211310 describe mutantes de levadura novedosos capaces de producir una glicoproteína en la que una cadena de azúcar de alto contenido en manosa, Man5GlcNAc2 o GlcNAcMan5GlcNAc2 está unida a un resto de asparagina de una proteína; y un procedimiento para producir la cadena de azúcar y la glicoproteína mediante una técnica de glicoingeniería usando los mutantes. El presente documento describe adicionalmente la introducción de genes para la biosíntesis de una cadena de azúcar de tipo mamífero en los mutantes, para producir glicoproteínas que tienen una cadena de azúcar de tipo mamífero.

Choi y col. (PNAS, 2003, 100(9): 5022-7) describe un enfoque en el que la ruta secretora de Pichia pastoris se volvía a modificar por ingeniería genética para realizar reacciones de glicosilación secuenciales que mimetizan el procesamiento temprano de N-glicanos en seres humanos y otros mamíferos superiores.

La expresión recombinante de una proteína informadora humana en estas cepas modificadas por ingeniería genética condujo a la formación de una glicoproteína con GlcNAcMan5GlcNAc2 como el N-glicano principal.

Dada la utilidad de las actividades de enzima manosidasa en el procesamiento de N-glicanos, sería deseable tener un procedimiento para producir glicoproteínas similares a humano en células huésped eucariotas inferiores que comprenda la etapa de expresar una a-manosidasa II catalíticamente activa que tenga una especificidad de sustrato por Mana1,3 y Mana1,6 en un oligosacárido.

Sumario de la Invención

La invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular o multicelular que comprende la etapa de expresión de un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado a un péptido señal de dirección celular, donde dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo más del 40% de los enlaces Mana1,3 y/o Mana1,6 de un sustrato GlcNAcMan5GlcNAc2. El dominio catalítico de manosidasa y el péptido señal de dirección celular se seleccionan entre la Tabla 11 descrita en el presente documento más adelante.

Preferiblemente, el N-glicano deseado producido es GlcNAcMan3GlcNAc2. En otra realización preferida, el N-glicano deseado se caracteriza por que tiene, al menos, la rama de oligosacárido Mana1,3 (Mana1,6) Man11,4-GlcNAc 11,4-GlcNAc 11-Asn. La glicoproteína preferiblemente se aísla a partir de la célula huésped. En otra realización preferida, la actividad enzimática de manosidasa es capaz de hidrolizar in vivo los enlaces tanto de Mana1,3 como Mana1,6 de un sustrato de oligosacárido que comprende un enlace glicosídico Mana1,3 y Mana1,6.

En otra realización preferida, el sustrato de oligosacárido se caracteriza como GlcNAc11,2 Mana1,3 (Mana1,6 Mana1,6) Man11,4-GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn; GlcNAc11,2 Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6) Man11,4-GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn; y GlcNAc11,2Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6 Mana1,6) Man11,4-GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn.

En una realización preferida, la actividad manosidasa se caracteriza como una actividad manosidasa de Clase 2. En una realización más preferida, la actividad manosidasa de Clase 2 tiene una especificidad de sustrato por GlcNAc11,2 Mana1,3 (Mana1,6 Mana1,6) Man11,4-GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn; GlcNAc11,2 Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6) Man11,4-GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn; o GlcNAc11,2 Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6 Mana1,6) Man11,4GlcNAc11,4-GlcNAc-Asn. En una realización aún más preferida, la actividad manosidasa de Clase 2 es una que normalmente se encuentra en el aparato de Golgi de una célula huésped eucariota superior.

En una cualquiera de las realizaciones anteriores, la actividad manosidasa está preferiblemente sobreexpresada. En otra realización preferida, la manosidasa es capaz además de hidrolizar un enlace Mana1,2. Las actividades manosidasa de la invención preferiblemente tienen un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.

En otra realización la actividad manosidasa se localiza dentro de la ruta secretora de la célula huésped.

Preferiblemente, la actividad manosidasa se expresa a partir de un polipéptido localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red trans del Golgi de la célula huésped.

En una realización preferida, la actividad manosidasa se expresa a partir de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado a un péptido señal de dirección celular. En una realización más preferida, la actividad manosidasa se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa nativo para la célula huésped. En otra realización más preferida, la actividad manosidasa se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa heterólogo a la célula huésped.

En otra realización preferida, la actividad enzimática de manosidasa se selecciona entre el grupo constituido por Manosidasa II de Arabidopsis thaliana, Manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de Ciona intestinalis, manosidasa II de Drosophila, manosidasa II Humana, manosidasa II de Ratón, manosidasa II de Rata, manosidasa II lisosomal Humana y manosidasa II citoplasmática Humana.

En otra realización preferida, el polipéptido se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido diana nativo para la célula huésped.

En otra realización preferida, el polipéptido se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido diana heterólogo para el dominio catalítico de manosidasa.

En una realización preferida, la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. En una realización más preferida, la célula huésped es Pichia pastoris.

La solicitud proporciona además glicoproteínas y N-glicanos producidos por uno de los procedimientos anteriores. En una realización preferida, la glicoproteína es una proteína terapéutica. En una realización más preferida, la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por eritropoyetina, citoquinas tales como interferón-a, interferón-1, interferón-y, interferón-w y CSF de granulocitos, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IgF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina, a-1 antitripsina, ADNasa II, afetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína de Unión a TNF aka 1),TACI-lg (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículo), GM-CSF, GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1), agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, fusión Fc de receptor de TNF soluble aka) ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa e IgG de CTLA4 (Ig de Antígeno 4 asociado con Linfocito T Citotóxico).

La solicitud describe además una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende al menos dos construcciones genéticas diferentes, donde al menos una construcción genética comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica una manosidasa de Clase 2, IIx o dominio catalítico III ligado en marco con un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular que normalmente no está asociado con el mismo.

Se describe que el dominio catalítico de manosidasa se selecciona entre el grupo constituido por: Manosidasa II de Arabidopsis thaliana, Manosidasa II de C elegans, manosidasa II de Ciona intestinalis, manosidasa II de Drosophila, manosidasa II Humana, manosidasa II de Ratón, manosidasa II de Rata, manosidasa IIx Humana, manosidasa III de células de insecto, manosidasa II lisosomal Humana y manosidasa II citoplasmática Humana.

Se describen fragmentos de ácido nucleico que codifican un péptido de dirección celular, seleccionado entre el grupo constituido por: GLS 1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces.

La solicitud describe además un vector que comprende una construcción de fusión obtenida a partir de una cualquiera de las bibliotecas anteriores enlazada a una secuencia de control de expresión, donde dicho péptido señal de dirección celular se dirige a al menos uno del RE, Golgi o red trans del Golgi. La secuencia de control de expresión se describe como que es inducible o constitutiva. El vector, tras la expresión en una célula huésped, se describe como que codifica una actividad manosidasa implicada en la producción de GlcNAcMan3GlcNAc2 Man3GlcNAc2 o Man4GlcNAc2 in vivo.

La solicitud describe además una célula huésped que comprende al menos uno de los vectores anteriores. El vector se describe como que se selecciona entre el grupo de vectores denominados pKD53, pKD1, pKD5, pKD6 y pKD16.

Otra realización de la invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado en fase a un péptido señal de dirección y, tras la expresión en la célula huésped de levadura

o de hongo filamentoso unicelular o multicelular, es capaz de hidrolizar in vivo un sustrato de oligosacárido que comprende cualquiera o ambos enlaces glicosídicos Mana1,3 y Mana1,6 hasta el alcance de que al menos el 10% de los enlaces Mana1,3 y/o Mana1,6 del sustrato se hidrolizan in vivo.

Otra realización de la invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado en fase a un péptido señal de dirección y, tras la expresión en una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular o multicelular, capaz de hidrolizar in vivo un sustrato de oligosacárido que comprende un enlace gliosídico Mana1,3, Mana1,6, o Mana1,2 hasta el alcance de que un resto detectable del enlace Mana1,3, Mana1,6 o Mana1,2 del sustrato se hidroliza in vivo.

Otra realización de la invención proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido quimérico anterior o una célula huésped que comprende el polipéptido quimérico anterior.

Otra realización de la invención proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico anterior.

Otra realización de la invención proporciona una composición de glicoproteína producida en la célula huésped anterior. En una realización más preferida, se proporciona un N-glicano producido en la célula huésped. Más preferiblemente, la composición de glicoproteína se caracteriza como uniforme.

Otra realización de la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido por las regiones conservadas SEC ID Nº: 5 -SEC ID Nº: 15.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es un diagrama esquemático de una ruta de N-glicosilación fúngica típica.

La Figura 1B es un diagrama esquemático de un ruta de N-glicosilación humana típica.

La Figura 2 representa la construcción de una biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión. La Figura 2A diagrama la inserción de un fragmento de péptido de dirección en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). La Figura 2B muestra la sub-biblioteca de péptido de dirección generado que tiene sitios de restricción Notl -Ascl. La Figura 2C diagrama la inserción de una región de dominio catalítico en pJN347, un vector de pUC19 modificado. La Figura 2D muestra la sub-biblioteca de dominio catalítico generada que tiene sitios de restricción Notl, Ascl y PacI. La Figura 2E representa una construcción de fusión particular generada a partir de la subbiblioteca de péptido de dirección y la sub-biblioteca de dominio catalítico.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico de fase de lectura abierta de a-1,2 manosidasa IA de M. musculus (SEC ID Nº: 1) y secuencia de polipéptido codificado (SEC ID Nº: 2). Las secuencias de los cebadores de PCR usados para generar los truncamientos N-terminal están subrayadas.

Las Figuras 4A -4F ilustran la ingeniería genética de vectores con múltiples marcadores auxótrofos e integración genética de proteínas diana en el locus OCH1 de P. pastoris.

Las Figuras 5A -5E muestran análisis de MALDI-TOF que demuestran la producción de dominio de kringle 3 de glicoproteínas de plasminógeno humano (K3) que tienen Man5GlcNAc2 como la estructura de N-glicano predominante en P. pastoris. La Figura 5A representa el glicano Man5GlcNAc2 [a] convencional (Glyko, Novato, CA) y Man5GlcNAc2 + Na + [b]. La Figura 5B muestra glicanos liberados por PNGasa a partir de tipo silvestre K3. Los Nglicanos mostrados son los siguientes: Man9GlcNAc2 [d]; Man10GlcNAc2 [e]; Man11GlcNAc2 [f]; Man12GlcNAc2 [g]. La Figura 5C representa la supresión de och1 que da como resultado la producción de Man8GlcNAc2 [c] como el Nglicano predominante. Las Figuras 5D y 5E muestran la producción de Man5GlcNAc2 [b] después del corte in vivo de Man8GlcNAc2 con una a-1,2-manosidasa quimérica. El N-glicano predominante se indica mediante un pico con una masa (m/z) de 1253 coherente con su identificación como Man5GlcNAc2 [b].

Las Figuras 6A -6F muestran análisis de MALDI-TOF que demuestran la producción de glicoproteínas de IFN-1 que tienen Man5GlcNAc2 como la estructura de N-glicano predominante en P. pastoris. La Figura 6A muestra el Man5GlcNAc2 [a] y Man5GlcNAc2 + Na+ [b] como el patrón (Glyko, Novato, CA). La Figura 6B muestra glicanos liberados por PNGasa a partir de IFN-1 de tipo silvestre. La Figura 6C representa la eliminación de och1 que produce Man8GlcNAc2 [c]; Man9GlcNAc2 [d]; Man10GlcNAc2 [e]; Man11GlcNAc2 [f]; Man12GlcNAc2 [g]; y la no producción de Man5GlcNAc2 [b]. La Figura 6D muestra una cantidad relativamente pequeña de Man5GlcNAc2 [b] entre otros N-glicanos intermedios Man8GlcNAc2 [c] a Man12GlcNAc2 [g]. La Figura 6E muestra una cantidad significativa de Man5GlcNAc2 [b] en relación con los otros glicanos Man8GlcNAc2 [c] y Man9GlcNAc2 [d] producidos por pGC5 (MS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón). La Figura 6F muestra la producción predominante de Man5GlcNAc2 [b] de la glicoproteína secretada IFN-1 mediante pFB8 (SEC12 de Saccharomyces (m)/manosidasa IA ∆187 de ratón). El N-glicano está indicado por un pico con una masa (m/z) de 1254 coherente con su identificación como Man5GlcNAc2 [b].

La Figura 7 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, ∆ och1 transformado con manosidasa de pFB8, que demuestra una carencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante y (C) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB después de exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo).

La Figura 8 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, ∆ och1 transformado con manosidasa de pGC5, que demuestra una carencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante y (C) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB después de exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo).

La Figura 9 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, ∆ och1 transformado con manosidasa de pBC18-5, que demuestra una carencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante y

(C) sobrenadante de medio de P. pastoris, Aoch1 transformado con pDD28-3, que demuestra actividad en el sobrenadante (control positivo).

Las Figuras 10A -10B demuestran la actividad de un transportador de UDP-GlcNAc en la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 en P. pastoris.La Figura 10A representa una cepa de P. pastoris (YSH-3) transformada con un GnTI humano pero sin que el transportador UDP-GlcNAc dé como resultado alguna producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] sino una producción predominante de Man5GlcNAc2 [a]. La Figura 10B representa la adición de transportador UDP-GlcNAc de K. lactis en una cepa (PBP-3) transformada con la GnTI humano, que dio como resultado la producción predominante de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b]. El pico prominente único de masa (m/z) en 1457 es coherente con su identificación como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] como se muestra en la Figura 10B.

La Figura 11 muestra un pH óptimo de una enzima manosidasa heteróloga codificada por pBB27-2 (MNN10 de Saccharomyces/manosidasa IB ∆31 de C. elegans) expresada en P. pastoris.

Las Figuras 12A -12C muestran análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos liberados a partir de un extracto sin células de K. lactis. La Figura 12A muestra los N-glicanos liberados a partir de células de tipo silvestre, que incluye N-glicanos de alto contenido en manosa. La Figura 12B muestra los N-glicanos liberados a partir de células con och1 y mnn1 suprimidos, que revelan un pico claro de masa (m/z) en 1908 coherente con su identificación como Man9GlcNAc2 [d]. La Figura 12C muestra los N-glicanos liberados a partir de células con och1 mnn1 suprimidos después de digestión con a-1,2-manosidasa in vitro correspondiente a un pico coherente con Man5GlcNAc2.

La Figura 13 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de glicoproteína Kringle 3 producidos en P. pastoris YSH-1 (mutante con supresión och1 transformado con a-manosidasa y GnT I) que muestra un pico predominante en 1465 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d].

La Figura 14 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-1 transformada con manosidasa II∆74 de D. melanogaster/MNN2 (s) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1140 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] en 1303 m/z y GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] en 1465 m/z. Esta cepa se denominó YSH-37.

La Figura 15 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-37 transformada con GnT II de rata/líder de MNN2 (s) que muestra un pico predominante en 1356 m/z correspondiente a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x]. Esta cepa se denominó YSH

44.

La Figura 16 muestra una análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-44 (GlcNAc2Man3GlcNAc2 [b] producido como se muestra en la Figura 15) que muestra un pico predominante en 933 m/z correspondiente a la masa de Man3GlcNAc2 [a] después de digestión con 1-N-acetilhexosaminidasa.

La Figura 17 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-44 (GlcNAc2Man3GlcNAc2 [b] producido como se muestra en la Figura 15) que muestra un pico predominante en 1665 m/z que corresponde a la masa de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 después de la adición de 11,4-galactosil transferasa in vitro.

La Figura 18 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-1 transformada con manosidasa II∆74 de D. melanogaster/MNN9(m) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1464 m/z correspondiente a la masa de Man5GlcNAc2 [d].

La Figura 19 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-1 transformada con manosidasa II∆74 de D. melanogaster/MNS1 (1) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1464 m/z correspondiente a la masa de Man5GlcNAc2 [d] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] en 1139 m/z y GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] en 1302 m/z.

La Figura 20 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-1 transformada con manosidasa II∆74 de D. melanogaster/GLS1 (s) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1139 m/z que corresponde a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b]. Esta cepa se denominó YSH-27.

La Figura 21 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-1 transformada con manosidasa II∆74 de D. melanogaster/MNS1 (m) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1140 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] en 1302 m/z y GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] en 1464 m/z. Esta cepa se denominó YSH-74.

La Figura 22 muestra un análisis de MALDI-TOF-MS de N-glicanos aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P. pastoris YSH-74 digeridos con una a-1,2 manosidasa de T. reesei/A. saitoi que muestra un pico predominante en 1141 m/z que corresponde a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b].

La Figura 23 muestra una Comparación de Secuencia de BLAST de manosidasa II, manosidasa IIx y manosidasas de Clase III conocidas e hipotéticas (SEC ID Nº: 96, 92, 93, 99, 98, 97, 94, 95 y 100-102, respectivamente en orden de aparición).

La Figura 24 muestra un árbol filogenético de las clases de manosidasa.

La Figura 25 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 49) de Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) y proteína codificada (SEC ID Nº: 95).

La Figura 26 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 50) de Manosidasa II de C. elegans (NM_073594) y proteína codificada (SEC ID Nº: 92).

La Figura 27 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 51) de manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116684) y proteína codificada (SEC ID Nº: 94).

La Figura 28 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 52) de manosidasa II de D. melanogaster (X77652) y proteína codificada (SEC ID Nº: 96).

La Figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 53) de manosidasa II humana (U31520) y proteína codificada (SEC ID Nº: 97).

La Figura 30 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 54) de manosidasa II de ratón (X61172) y proteína codificada (SEC ID Nº: 98).

La Figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 55) de manosidasa II de rata (XM_218816) y proteína codificada (SEC ID Nº: 93).

La Figura 32 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 56) de manosidasa IIx humana (D55649) y proteína codificada (SEC ID Nº: 99).

La Figura 33 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 57) de manosidasa II de célula de insecto (AF005034) y proteína codificada (SEC ID Nº: 100).

La Figura 34 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 58) de manosidasa II lisosomal humana (NM_000528) y proteína codificada (SEC ID Nº: 101).

La Figura 35 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 59) de manosidasa II citoplasmática humana (N_006715) y proteína codificada (SEC ID Nº: 102).

La Figura 36 ilustra intermedios de oligosacáridos producidos usando las actividades manosidasa II, manosidasa IIx y manosidasa III.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de otra manera en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados con relación a la presente invención tendrán los significados comprendidos comúnmente por los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Los procedimientos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. En general, las nomenclaturas usadas en relación con y las técnicas de bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica.

Los procedimientos y técnicas de la presente invención en general se realizan de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se ha descrito en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a través de toda la presente memoria descriptiva a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y Suplementos hasta 2002); Hariow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Wor-thington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins Vol 1.1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). Las nomenclaturas usadas en relación con y los procedimientos y técnicas de laboratorio de biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento son aquellos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica.

Las siguientes expresiones, a menos que se indique de otra manera, se debe apreciar que tienen los siguientes significados:

Como se usa en el presente documento, el término “N-glicano” se refiere a un oligosacárido enlazado a N, por ejemplo, uno que está unido por un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a un resto de asparagina de un polipéptido. Los N-glicanos tienen un núcleo pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a manosa; "Glc" se refiere a glucosa y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). La expresión “núcleo trimanosa” usada con respecto al N-glicano también se refiere a la estructura Man3GlcNAc2 ("Man3"). Los Nglicanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura de núcleo Man3. Los N-glicano se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, alto contenido de manosa, complejo o híbrido).

Un N-glicano de tipo “alto contenido de manosa” tiene cinco o más restos de manosa. Un N-glicano de tipo “complejo” típicamente tiene al menos un GlcNAc unido al brazo 1,3 manosa y al menos un GlcNAc unido al brazo

1,6 manosa del núcleo trimanosa. Los N-glicanos complejos también pueden tener restos de galactosa ("Gal") que están opcionalmente modificados con ácido siálico o sus derivados ("NeuAc", donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico y “Ac” se refiere a acetilo). Un N-glicano complejo típicamente tiene al menos una rama que termina en un oligosacárido tal como, por ejemplo, NeuNAc-; NeuAca2-6Ga1NAca1-; NeuAca2-3Galb1-3GalNAca1-; NeuAca23/6Galb1-4GlcNAcb1-; GlcNAcal-4Galb1-(sólo mucinas); Fuca1-2Galb1-(grupo sanguíneo H). Los ésteres de sulfato pueden aparecer en restos de galactosa, GalNAc y GlcNAc y los ésteres de fosfato pueden estar presentes en restos de manosa. NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo) pueden estar O-acetilados o reemplazados por NeuGI (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos también pueden tener sustituciones intracadena que comprenden GlcNAc “bisecantes” y fucosa de núcleo ("Fuc"). Un N-glicano “híbrido” tiene al menos un GlcNAc en el extremo del brazo 1,3 manosa del núcleo trimanosa y cero o más manosas en el brazo 1,6 manosa del núcleo trimanosa.

El término “predominante” o “predominantemente” usado con respecto a la producción de N-glicano se refiere a una estructura que presenta el pico principal detectado mediante análisis de espectrometría de masa de deserción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).

Las abreviaturas usadas en el presente documento son de uso común en la técnica, véanse, por ejemplo, abreviaturas de azúcares, anteriormente. Otras abreviaturas comunes incluyen “PNGasa", que se refiere a Nglicosidasa peptídica F (EC 3.2.2.18); "GlcNAc Tr" o "GnT", que se refieren a enzimas N-acetilglucosaminil Transferasa; “NANA” se refiere a ácido N-acetilneuramínico.

Como se usa en el presente documento, una “glicoproteína humanizada” o una “glicoproteína de tipo humano” se refiere como alternativa a una proteína que tiene unida a la misma N-glicanos que tienen tres o menos restos de manosa e intermedios de glicoproteínas sintéticas (que también son útiles y se pueden manipular adicionalmente in vitro o in vivo). Preferiblemente, las glicoproteínas producidas de acuerdo con la invención contienen al menos el 20% en mol, preferiblemente del 20-30% en mol, más preferiblemente del 30-40% en mol, aún más preferiblemente del 40-50% en mol y aún más preferiblemente del 50-100% en mol del intermedio GlcNAcMan3GlcNAc2, al menos transitoriamente. Esto se puede conseguir, por ejemplo, modificando por ingeniería genética una célula huésped de la invención para que exprese una enzima de glicosilación “mejor”, es decir, más eficaz. Por ejemplo, se selecciona una manosidasa II de forma que la misma tendrá actividad óptima en las condiciones presentes en el sitio en la célula huésped en el que las proteínas se glicosilan y se introduce en la célula huésped preferiblemente dirigiendo la enzima a un organelo de la célula huésped donde se desea la actividad.

El término “enzima”, cuando se usa en el presente documento con relación a la alteración de la glicosilación de la célula huésped, se refiere a una molécula que tiene al menos una actividad enzimática e incluye enzimas de longitud completa, fragmentos catalíticamente activos, quiméricos, complejos y similares. Un “fragmento catalíticamente activo” de una enzima se refiere a un polipéptido que tiene un nivel detectable de actividad funcional (enzimática). La actividad enzimática es “sustancialmente intracelular” cuando las enzimas de procesamiento posterior tienen la capacidad de producir aproximadamente el 51% de las glicoformas deseadas in vivo.

Una célula huésped eucariota inferior, cuando se usa en el presente documento con relación a perfiles de glicosilación, se refiere a cualquier célula eucariota que produce de forma normal N-glicanos que contienen manosa elevada y, por tanto, tiene por objeto incluir algunas células animales o vegetales y la mayoría de las células eucariotas inferiores típicas, incluyendo células fúngicas y de algas uni y multicelulares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ruta de secreción” se refiere a la línea de ensamblaje de diversas enzimas de glicosilación a la que se exponen secuencialmente un precursor de oligosacárido enlazado a lípido y un sustrato de N-glicano, siguiendo el flujo molecular de una cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma hasta el retículo endoplasmático (RE) y los compartimentos del aparato de Golgi. Las enzimas se dice que se localizan a lo largo de esta ruta. Una enzima X que actúa sobre un glicano enlazado a lípido o un N-glicano antes de una enzima Y se dice que es o actúa “cadena arriba” de la enzima Y; de forma similar, la enzima Y está o actúa “cadena abajo” de la enzima X.

La expresión “péptido de dirección” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de nucleótido o aminoácidos que codifican un péptido señal de dirección celular que media la localización (o retención) de una secuencia asociada a emplazamientos subcelulares, por ejemplo, organelos.

Las expresiones “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Las expresiones incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico o sintético) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm o ARN sintético), así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos nucleotídicos no naturales, enlaces internucleósido no nativos o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser de hélice única, de doble hélice, de triple hélice, en cuádruplex, parcialmente de doble hélice, ramificado, en horquilla, circular o en una conformación de candado. La expresión incluye formas de hélice única y de doble hélice de ADN. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede incluir hebras tanto sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Los mismos se pueden modificar químicamente

o bioquímicamente o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivatizadas, como podrán apreciar fácilmente los expertos en la materia. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc), enlaces cargados (por ejemplo, fósforotioatos, fósforoditioatos, etc), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc), enlaces quelantes, alquilantes y modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc). También se incluyen moléculas sintéticas que mimetizan los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada a través de un enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces fosfato sustituyen a los enlaces peptídicos en la estructura principal de la molécula.

A menos que se indique de otra manera, un “ácido nucleico que comprende “SEC ID Nº X” se refiere a un ácido

nucleico, al menos una parte del mismo que tiene (i) la secuencia de SEC ID Nº: X o (ii) una secuencia complementaria a SEC ID Nº: X. La elección entre las dos está determinada por el contexto. Por ejemplo, si el ácido nucleico se usa como una sonda, la elección entre los dos está determinada por la necesidad de que la sonda sea complementaria a la diana deseada.

Un ácido nucleico o polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está naturalmente asociado. Las expresiones abarcan un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno de origen natural, (2) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza o (4) no está presente en la naturaleza. Las expresiones “aislado” o “sustancialmente puro” también se pueden usar con referencia a aislados de ADN recombinante o clonado, análogos polinucleotídicos químicamente sintetizados o análogos polinucleotídicos que se sintetizan biológicamente mediante sistemas heterólogos.

Sin embargo, “aislado” no necesariamente requiere que el ácido nucleico o polinucleótido descrito se haya retirado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera “aislada” en el presente documento si se coloca una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no es adyacente de forma natural a esta secuencia de ácido nucleico endógena) adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de forma que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena está alterada. A modo de ejemplo, una secuencia promotora no nativa se puede sustituir (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) por el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula humana, de forma que este gen tiene un patrón de expresión alterado. Este gen ahora estaría “aislado” debido a que está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de manera natural.

Un ácido nucleico también se considera “aislado” si el mismo contiene cualquier modificación que no está presente

de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante

endógena se considera “aislada” si la misma contiene una inserción, supresión o una mutación puntual introducida artificialmente, por ejemplo, mediante intervención humana. Un “ácido nucleico aislado” también incluye un ácido

nucleico integrado en un cromosoma de una célula huésped en un sitio heterólogo, una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un “ácido nucleico aislado” puede estar sustancialmente libre de otro material celular o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “variante degenerada” de una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que se pueden traducir, de acuerdo con el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la que se traduce a partir de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácido nucleico se

refiere a los restos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferiblemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias polinucleótidicas se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto como se proporcionan en GCG Versión 6.1.

La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando están óptimamente alineados con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente el 60% de las bases nucleotídicas, habitualmente al menos aproximadamente el 70%, más habitualmente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las bases nucleotídicas, medido por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, existe homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo se hibrida a otro ácido nucleico, a una hebra de otro ácido nucleico o a la hebra complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. “Condiciones de hibridación rigurosas” y “condiciones de lavado rigurosas” en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácido nucleico estará afectada por condiciones tales como la concentración de sal, temperatura, disolventes, la composición de base de las especies de hibridación, longitud de las regiones complementarias y el número de falta de coincidencias de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que se están hibridando, como apreciarán fácilmente los expertos en la materia. Un experto en la materia sabe cómo variar estos parámetros para conseguir una rigurosidad de hibridación particular.

En general, la “hibridación rigurosa” se realiza aproximadamente a 25ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para el híbrido de ADN específico en un conjunto particular de condiciones. Se realiza “lavado riguroso” a temperaturas de aproximadamente 5ºC menores que el Tm para el híbrido de ADN específico en un conjunto particular de condiciones. El Tm es la temperatura a la cual el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Véase, Sambrook y col., mencionado anteriormente, página 9.51, incorporado en el presente documento como referencia. Para los propósitos de el presente documento, se definen “condiciones de rigurosidad elevadas” para hibridación en fase de solución como hibridación acuosa (es decir, sin formamida) en 6X

SSC (donde 20X SSC contiene NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS al 1% a 65ºC durante 8-12 horas, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 20 minutos. El experto apreciará que la hibridación a 65ºC ocurrirá a diferentes velocidades dependiendo de varios factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se están hibridando.

El término “mutado” cuando se aplica a secuencias de ácido nucleico se refiere a que se pueden insertar, suprimir o

cambiar nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Se puede realizar una alteración única en un locus (una mutación puntual) o se pueden insertar, suprimir

o cambiar múltiples nucleótidos en un locus único. Además, se pueden realizar una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico se puede mutar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica que incluye, pero sin limitación, técnicas de mutagénesis tales como “PCR propensa a error” (un procedimiento para realizar PCR en condiciones en las que la fidelidad de la copia de la ADN polimerasa es baja, de forma que se obtiene un alto índice de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de PCR. Véase, por ejemplo, Leung, D. W., y col., Technique, 1, págs. 11-15 (1989) y Caldwell, R. C. & Joyce G. F., PCR Methods Applic, 2, págs. 28-33 (1992)); y “mutagénesis dirigida a oligonucleótido” (un procedimiento que posibilita la generación de mutaciones específicas de sitio en cualquier segmento de ADN clonado de interés. Véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson, J. F. & Sauer, R. T., y col., Science, 241, págs. 53-57 (1988)).

El término “vector” como se usa en el presente documento tiene por objeto referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se

refiere a un bucle de ADN de doble hélice circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral (analizado con más detalle más adelante). Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que los mismos se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, de ese modo, se replican junto con le genoma del huésped. Además, determinados vectores preferidos son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales ellos están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”).

Secuencias de control de expresión “unidas operativamente” se refiere a un enlace en el que la secuencia de control de expresión está contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.

La expresión “secuencia de control de expresión” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias polinucleótidicas que son necesarias para influir sobre la expresión de secuencias codificantes a las que las mismas están unidas operativamente. Las secuencias de control de expresión son secuencias que controlan la transcripción, acontecimientos postraduccionales y la traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación, secuencias que estabilizan ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma); secuencias que potencian la estabilidad de proteína y, cuando se desea, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen secuencias promotoras, de sitio de unión a ribosoma y de terminación de la transcripción. La expresión “secuencias de control” tiene por objeto incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la

expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es provechosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.

La expresión “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), como se usa en el presente

documento, tiene por objeto referirse a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico tal como un vector recombinante. Se debe apreciar que tales expresiones tienen por objeto referirse no sólo a la célula objeto particular sino a la progenie de una célula de este tipo. Debido a que pueden ocurrir determinadas modificaciones en generaciones subsiguientes debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede o no, de hecho, ser idéntica a la célula parental, pero aún están incluidas dentro del alcance de la expresión “célula huésped” como se usa en el presente documento. Una célula huésped recombinante puede ser una célula aislada o una línea celular desarrollada en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo.

El término “péptido” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que típicamente tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos de largo y más típicamente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de largo. El término como se usa en el presente documento abarca análogos y miméticos que mimetizan la función estructural y, por tanto, la biológica.

El término “polipéptido” como se usa en el presente documento abarca proteínas tanto de origen natural como de origen no natural y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de las mismas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes cada uno de los cuales tiene una o más actividades diferentes.

La expresión “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o polipéptido que, en virtud de su origen o su fuente de obtención (1) no está asociada con componentes asociados de forma natural que la acompañan en su estado nativo (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la naturaleza, donde la pureza se puede considerar con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, está libre de otras proteínas de la misma especie) (3) se expresa mediante una célula a partir de diferentes especies o (4) no está presente en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido encontrado en la naturaleza o incluye análogos o derivados de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza o enlaces diferentes a los enlaces peptídicos convencionales). Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular

diferente a la célula de la cual se origina de forma natural estará “aislado” de sus componentes asociados de forma

natural. Un polipéptido o proteína también se puede volver sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en el campo. Por tanto, como se ha definido, “aislado” no necesariamente requiere que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de esta manera se haya retirado físicamente de su entorno nativo.

La expresión “fragmento polipeptídico” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino terminal y/o carboxi terminal en comparación con un polipéptido de longitud completa. En una realización preferida, el fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que una secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos de largo, preferiblemente al menos 12, 14, 16 ó 18 aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de largo, más preferiblemente al menos 25, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 50 ó 60 aminoácidos de largo y lo más preferible es que tenga al menos 70 aminoácidos de largo.

Un “derivado modificado” se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, marcaje, por ejemplo, con radionúclidos y diversas modificaciones enzimáticas, como será apreciado fácilmente por los expertos en la materia. Una diversidad de procedimientos para marcar polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles con tales propósitos se conocen bien en la técnica e incluyen isótopos radiactivos tales como 125l, 32P, 35S y 3H, ligandos que se unen a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden servir como miembros de par de unión específicos para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugación con el cebador, de los requerimientos de estabilidad y los instrumentos disponibles. Los procedimientos para marcar polipéptidos se conocen bien en la técnica. Véase, Ausubel y col., Current Potocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 y suplementos hasta 2002).

Un “mutante polipeptídico” o “muteína” se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción,

duplicación, supresión, rearreglo o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un aminoácido único en una posición se ha cambiado por otro aminoácido, una o más inserciones y/o supresiones, en la que uno o más aminoácidos se insertan o suprimen, respectivamente, en la secuencia de la proteína de origen natural y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o ambos extremos amino o carboxilo. Una muteína puede tener la misma pero preferiblemente tiene una actividad biológica diferente en comparación con la proteína de origen natural.

Una muteína tiene una homología de secuencia global de al menos el 70% con su homólogo de tipo silvestre. Incluso más preferidas son las muteínas que tienen una homología de secuencia global del 80%, el 85% o el 90% con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferida, una muteína muestra una identidad de secuencia global del 95%, aún más preferiblemente del 97%, aún más preferiblemente el 98% e incluso más preferiblemente el 99%. La homología de secuencia se puede medir por cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como Gap o Bestfit.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran la afinidad de unión o actividad enzimática y (5) confieren o modifican otras propiedades físicoquímicas o funcionales de tales análogos.

Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology-A Synthesis (2ª Edición, E. S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a, a disustituídos, aminoácidos N-alquilo y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen 4-hidroxiprolina, y-carboxi-glutamato, s-N,N,Ntrimetillisina, s-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-Nmetilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la nomenclatura de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso y la convención convencional.

Una proteína tiene “homología” o es “homóloga” a una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que

codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Como alternativa, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos “similares”. (Por tanto, la expresión “proteínas homólogas” se define como que se refiere a que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización preferida, una proteína homóloga es una que muestra una homología de secuencia del 60% con la proteína de tipo silvestre y más preferiblemente es una homología de secuencia del 70%. Incluso más preferidas son las proteínas homólogas que muestran una homología de secuencia del 80%, el 85% o el 90% con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferida, una proteína homóloga muestra una identidad de secuencia del 95%, el 97%, el 98% o el 99%. Como se usa en el presente documento, la homología entre dos regiones de secuencia de aminoácidos (especialmente con respecto a similitudes estructurales pronosticadas) se interpreta como que implica similitud de función.

Cuando se usa “homólogo” con referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticos con frecuencia difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que un resto aminoacídico se sustituye por otros restos aminoacídicos que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pearson y col., 1994).

Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas los uno de los otros: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

La homología de secuencia para polipéptidos, a la que también se hace referencia como porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencia de Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El software de análisis de secuencia empareja secuencias similares usando la medida de homología asignada a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos íntimamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies u organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de molécula inhibidora con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul, S.

F. y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish y States (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L. y col.

(1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S. F. y col. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-3402; Zhang, J: y Madden, T. L. (1997) Genome Res. 7: 649-656), especialmente blastp o tblastn (Altschul y col., 1997). Los parámetros preferidos de BLASTp son: valor de Expectación: 10 (por defecto); Filtro: s (por defecto); Coste de apertura de un hueco: 11 (por defecto); Coste para extender un hueco: 1 (por defecto); Alineamientos máximos: 100 (por defecto); Tamaño de palabra: 11 (por defecto); Nº de descripciones: 100 (por defecto); Matriz de Penalización: BLOWSUM62.

La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para determinar homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28 restos y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos. Cuando se realiza una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar las secuencias de aminoácidos. La búsqueda de bases de datos que usan secuencias de aminoácidos se puede medir mediante algoritmos diferentes a blastp conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas se pueden comparar usando FASTA, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.

El término “motivo” con referencia a las regiones conservadas indica el resto aminoacídico que se encuentra

habitualmente en proteínas y que se conoce convencionalmente como alanina (Ala o A), valina (Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina (lle o I); prolina (Pro o P), fenilalanina (Phe o F), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M), glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparagina (Asn o N), glutamina (Gln o Q), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), lisina (Lys o K), arginina (Arg o R) e histidina (His o H).

La expresión “proteína de fusión” se refiere a una polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles debido a que las mismas se pueden construir para que contengan dos o más elementos funcionales deseados a partir de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferiblemente al menos 20 ó 30 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 40, 50 ó 60 aminoácidos y todavía más preferiblemente al menos 75, 100 ó 125 aminoácidos. Las proteínas de fusión se pueden producir de forma recombinante construyendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente y después expresando la proteína de fusión. Como alternativa, una proteína de fusión se puede producir químicamente entrecruzando el polipéptido o un fragmento del mismo con otra proteína.

El término “región” como se usa en el presente documento se refiere a una parte físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región está definida por una parte contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término “dominio” como se usa en el presente documento se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser coextensivos con regiones o porciones de los mismos; los dominios también pueden incluir regiones diferentes no contiguas de una biomolécula. Los ejemplos de dominio de proteína incluyen, pero sin limitación, un dominio de Ig, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

Como se usa en el presente documento, el término “molécula” se refiere a cualquier compuesto, incluyendo, pero sin limitación, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc y un compuesto de este tipo puede ser natural o sintético.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tiene el mismo significado que el apreciado de forma común por un experto en la materia a quien se refiere la presente invención. Los procedimientos y materiales ilustrativos se describen más adelante, aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento también se pueden usar en la práctica de la presente invención y serán evidentes para los expertos en la materia.

En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, controlará. Los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se apreciará que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Procedimientos Para Producir Glicoproteínas De Tipo Humano en Células Huésped de Levadura o de Hongo Filamentoso Unicelular o Multicelular

La invención proporciona procedimientos para producir una glicoproteína que tiene glicosilación de tipo humano en una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular o multicelular. Como se describe con más detalle más adelante, una célula huésped eucariota que no expresa de manera natural o que está modificada genéticamente para que no exprese, una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en manosa se selecciona como una célula huésped de partida. Una célula huésped seleccionada de este tipo se modifica genéticamente para expresar una o más enzimas u otros factores necesarios para producir glicoproteínas similares a humano. Una cepa huésped deseada se puede modificar por ingeniería genética una enzima o más de una enzima a la vez. Además, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades se puede usar para modificar por ingeniería genética una cepa huésped de la invención. Preferiblemente, se crea una biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas potencialmente útiles (por ejemplo, enzimas quiméricas que comprenden un fragmento enzimático catalíticamente activo ligado en fase a una secuencia de dirección subcelular heteróloga) (por ejemplo, mediante ligamientos de sub-bibliotecas que comprenden fragmentos enzimáticos y secuencias de dirección subcelulares) y una cepa que tiene una o más

enzimas con actividades opcionales o que producen las glicoproteínas más “similares a humano” se pueden

seleccionar transformando células huésped diana con uno o más elementos de la biblioteca.

En particular, los procedimientos descritos en el presente documento posibilitan la obtención, in vivo, de estructuras Man5GlcNAc2 en alto rendimiento, al menos transitoriamente, con el propósito de modificarla adicionalmente para producir N-glicanos complejos. Un esquema satisfactorio para obtener estructuras Man5GlcNAc2 adecuadas en rendimientos apropiados en una célula huésped, tal como una levadura u hongo filamentoso unicelular o multicelular, generalmente implica dos enfoques paralelos: (1) reducir la estructuras con alto contenido en manosa preparadas mediante actividades manosiltransferasa endógena, si existe alguna y (2) retirar 1,2-a-manosa mediante manosidasas para producir niveles elevados de estructuras Man5GlcNAc2 adecuadas que se pueden someter a reacción adicional dentro de la célula huésped para formar glicoformas complejas similares a humano.

Por consiguiente, una primera etapa implica la selección o creación de una célula huésped eucariota, por ejemplo, una levadura u hongo filamentoso unicelular o multicelular, capaz de producir una estructura precursora específica de Man5GlcNAc2 que es capaz de aceptar GlcNAc in vivo mediante la acción de una GlcNAc transferasa 1 ("GnTI"). En una realización, el procedimiento implica preparar o usar una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular o multicelular agotada en una actividad 1,6 manosil transferasa con respecto al N-glicano o una glicoproteína. Preferiblemente, la célula huésped está agotada en una actividad 1,6 manosiltransferasa iniciadora (véase más adelante). Una célula huésped de este tipo carecerá de una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en manosa que son indeseables para producir glicoproteínas similares a humano.

Después, se introducen una o más actividades enzimáticas en una célula huésped de este tipo para producir Nglicanos dentro de la célula huésped caracterizados por que tienen al menos el 30% en mol de las estructuras de carbohidrato Man5GlcNAc2 ("Man5"). Las estructuras de Man5GlcNAc2 son necesarias para la formación de Nglicano complejo: Man5GlcNAc2 se tiene que formar in vivo en un alto rendimiento (por ejemplo, en más del 30%), al menos transitoriamente, ya que las reacciones de glicosilación similares a mamífero y a humano posteriores requieren Man5GlcNAc2 o un derivado del mismo.

Esta etapa también requiere la formación de una estructura isomérica particular de Man5GlcNAc2 dentro de la célula en un rendimiento alto. Mientras que las estructuras de Man5GlcNAc2 son necesarias para la formación de Nglicano complejo, su presencia no es suficiente de ninguna manera. Esto es debido a que Man5GlcNAc2 puede estar presente en diferentes formas isoméricas, que pueden o no servir como un sustrato para GlcNAc transferasa

I. Como la mayoría de las reacciones de glicosilación no son completas, una proteína glicosilada particular generalmente contiene una diversidad de estructuras de carbohidrato diferentes (es decir, glicoformas) sobre su superficie. Por tanto, la simple presencia de cantidades traza (es decir, menos del 5%) de una estructura particular similar a Man5GlcNAc2 es de poca relevancia práctica para producir glicoproteínas similares a mamífero o a humano. Es la formación de un intermedio Man5GlcNAc2 aceptor de GlcNAc transferasa l (Figura 1B) en alto rendimiento (es decir, por encima del 30%) lo que se requiere. La formación de este intermedio es necesaria para posibilitar la síntesis in vivo posterior de N-glicanos complejos o proteínas glicosiladas de interés (proteínas diana).

Por consiguiente, alguno o todo el Man5GlcNAc2 producido por la célula huésped seleccionada tiene que ser un sustrato productivo para actividades enzimáticas a lo largo de una ruta de glicosilación de mamífero, por ejemplo, puede servir como sustrato para actividad de GlcNAc transferasa I in vivo, formando de ese modo el intermedio Nglicano de tipo humano GlcNAcMan5GlcNAc2 en la célula huésped. En una realización preferida, al menos el 10%, más preferiblemente el 30% y más preferiblemente el 50% o más del intermedio Man5GlcNAc2 producido en la célula huésped de la invención es un sustrato productivo para GnTI in vivo. Se aprecia que si, por ejemplo, se produce GlcNAcMan5GlcNAc2 al 10% y se produce Man5GlcNAc2 al 25% en una proteína diana, la cantidad total de

Man5GlcNAc2 producido de forma transitoria es el 35% debido a que GlcNAcMan5GlcNAc2 es un producto de Man5GlcNAc2.

Un experto en la materia puede seleccionar células huésped de la naturaleza, por ejemplo, hongos u otros eucariotas inferiores existentes que producen niveles significativos de Man5GlcNAc2 in vivo. Sin embargo, hasta el momento ningún eucariota inferior ha demostrado proporcionar tales estructuras in vivo en más del 1,8% de los Nglicanos totales (véase, por ejemplo, Maras y col., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 701-707). Como alternativa, tales células huésped se pueden modificar por ingeniería genética para producir la estructura Man5GlcNAc2 in vivo. Los procedimientos tales como los que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 se pueden usar para identificar la ausencia o presencia de glicosiltransferasas, manosidasas y transportadores de nucleótidos de azúcar particulares en una célula huésped diana u organismo de interés.

Inactivación de enzimas de glicosilación de célula huésped indeseables

Los procedimientos de la invención se refieren a preparar células huésped que producen glicoproteínas que tienen estructuras de N-glicano alteradas y preferiblemente similares a humano. En una realización preferida, los procedimientos se refieren a preparar células huésped en las que los precursores de oligosacáridos tienen alto contenido de Man5GlcNAc2. Preferiblemente, se usa una célula huésped eucariota que no expresa una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en manosa. Una célula huésped de este tipo se puede encontrar en la naturaleza o se puede fabricar por ingeniería genética, por ejemplo, comenzando con u obteniéndose a partir de uno de muchos mutantes tales como los que ya se han descrito en levaduras. Por tanto, dependiendo de la célula huésped seleccionada, se tendrán que suprimir uno o varios genes que codifican enzimas que se conoce que son características de reacciones de glicosilación no humanas. Tales genes y sus proteínas correspondientes se han caracterizado exhaustivamente en varios eucariotas inferiores (por ejemplo, S. cerevisiae,

T. reesei, A. nidulans etc.), proporcionando de ese modo una lista de glicosiltransferasas conocidas en eucariotas inferiores, sus actividades y sus secuencias genéticas respectivas. Estos genes probablemente se seleccionan entre el grupo de manosiltransferasas, por ejemplo, 1,3 manosiltransferasas (por ejemplo, MNN1 en S. cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2 manosiltransferasas (por ejemplo, familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas en reacciones de glicosilación aberrantes, es decir, no humanas. Muchos de estos genes se han suprimido, de hecho, individualmente dando origen a fenotipos viables con perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se muestran en la Tabla 1 (anteriormente).

Las células huésped eucariotas inferiores preferidas de la invención, como se describe en el presente documento para ilustrar las etapas de manipulación necesarias, son mutantes sin hipermanosilación (och1)de Pichia pastoris o

K. lactis. Al igual que otros eucariotas inferiores, P. pastoris procesa las estructuras de Man9GlcNAc2 en el RE con una a-1,2-manosidasa para producir Man8GlcNAc2 (Figura 1A). A través de la acción de varias manosiltransferasas, esta estructura después se convierte en estructuras hipermanosiladas (Man>9GlcNAc2), también conocidas como mananos. Además, se ha observado que P. pastoris es capaz de añadir grupos fosfato no terminales, a través de la acción de manosilfosfato transferasas, a la estructura de carbohidrato. Esto difiere de las reacciones realizadas en células de mamífero, que implican la remoción en lugar de la adición de azúcares de manosa. Esto es de particular importancia para eliminar la capacidad de la célula huésped eucariota, por ejemplo, hongos, de hipermanosilar una estructura de Man8GlcNAc2 existente. Esto se puede conseguir seleccionando una célula huésped que no hipermanosile o modificando por ingeniería genética una célula de este tipo.

Los genes que están implicados en el procedimientos de hipermanosilación se han identificado, por ejemplo, en Pichia pastoris y creando mutaciones en estos genes, se puede reducir la producción de glicoformas “indeseables”. Tales genes se pueden identificar mediante homología con manosiltransferasas existentes o sus reguladores (por ejemplo, OCH1, MNN4, MNN6, MNN1) encontrados en otros eucariotas inferiores tales como C. albicans, Pichia angusta o S. cerevisiae o mutagenizando la cepa huésped y seleccionando un fenotipo de glicosilación con manosilación reducida. Basándose en homologías entre manosiltransferasas y manosilfosfato transferasas conocidas, se pueden diseñar cebadores de PCR (ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 2, SEC ID Nº: 60-91 son ejemplos adicionales de cebadores) o usar genes o fragmentos génicos que codifican tales enzimas como sondas para identificar homólogos en bibliotecas de ADN del organismo diana o un organismo relacionado. Como alternativa, se puede identificar un homólogo funcional que tiene actividad manosiltransferasa por su capacidad para complementar fenotipos de glicosilación particulares en organismos relacionados.

Tabla 2. Cebadores de PCR

Cebador de PCR A: Cebador de PCR B Gen o genes diana en P. pastoris Homólogos

ATGGCGAAGGC AGATGGCAGT (SEC ID Nº: 18): TTAGTCCTTC CAACTTCCTT C (SEC ID Nº: 19) 1,6-manosiltransferasa OCH1 de S. cerevisiae, Pichia albicans

TAYTGGMGNGT NGARCYNGAYATHAA (SEC ID Nº: 103): GCRTCNCCCC ANCKYTCRTA (SEC ID Nº: 104) 1,2 manosiltransferasas Familia KTR/KRE, S. cerevisiae

Leyenda: M = A o C, R = A o G, W = A o T, S = C o G, Y = C o T, K = G o T, V = A o C o G, H = A o C o T, D = A o G o T, B = C o G o T, N = G o A o T o C.

Para obtener el gen o genes que codifican actividad 1,6-manosiltransferasa en P. pastoris, por ejemplo, se pueden realizar las siguientes etapas: mutantes OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a temperatura y son de crecimiento 5 lento a temperaturas elevadas. Por tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante OCH1 de S. cerevisiae con un ADN o biblioteca de ADNc de P. pastoris. Los mutantes de S. cerevisiae están disponibles, por ejemplo, en la Universidad de Stanford y están disponibles en el mercado en ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Los mutantes que muestran un fenotipo de crecimiento normal a temperatura elevada, después de haberse trasformado con una biblioteca de ADN de P. pastoris, tienen

10 probabilidad de portar un homólogo de OCH1 de P. pastoris. Una biblioteca de este tipo se puede crear digiriendo parcialmente ADN cromosómico de P. pastoris con una enzima de restricción adecuada y, después de inactivar la enzima de restricción, ligando el ADN digerido en un vector adecuado, que se ha digerido con una enzima de restricción compatible.

Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pRS314, un plásmido de copia baja (CEN6/ARS4) basado en

15 pBluescript que contiene el marcador Trp1 (Sikorski, R. S., y Hieter, P., 1989, Genetics 122, pág. 19-27) y pFL44S, un plásmido de copias elevadas (2 !) basado en un pUC19 modificado que contiene el marcador URA3 (Bonneaud, N., y col., 1991, Yeast 7, págs. 609-615). Tales vectores se usan comúnmente por los investigadores académicos y vectores similares están disponibles en varios distribuidores diferentes (por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad, CA); Pharmacia (Piscataway, NJ); New England Biolabs (Beverly, MA)). Los ejemplos adicionales incluyen pYES/GS,

20 plásmido de expresión en levadura basado en origen de replicación de 2 ! o vehículo de clonación Yep24 de New England Biolabs.

Después del ligamiento del ADN cromosómico y el vector, se puede transformar la cepa de S. cerevisiae con una biblioteca de ADN con una mutación específica y seleccionar la corrección del fenotipo correspondiente. Después de subclonar y secuenciar el fragmento de ADN que es capaz de restaurar el fenotipo de tipo silvestre, se puede

25 usar este fragmento para eliminar la actividad del producto génico codificado por OCH1 en P. pastoris usando mutagénesis in vivo y/o técnicas se recombinación bien conocidas por expertos en la materia.

Como alternativa, si la secuencia genómica entera de una célula huésped particular, por ejemplo, hongo, de interés se conoce, se pueden identificar tales genes simplemente realizando búsquedas en bases de datos de ADN disponibles al público, que están disponibles en varias fuentes, tales como NCBI y Swissprot. Por ejemplo, 30 realizando una búsqueda de una secuencia genómica o base de datos dadas con secuencias a partir de un gen de 1,6-manosiltranferasa conocido (por ejemplo, OCH1 de S. cerevisiae), se pueden identificar genes de homología elevada en un genoma de célula huésped de este tipo que puede (aunque no necesariamente) codificar proteínas que tienen actividad 1,6-manosiltransferasa. Sin embargo, la homología de secuencia de ácido nucleico sola no es suficiente para probar que se ha identificado y aislado un homólogo que codifica una enzima que tiene la misma 35 actividad. Hasta la fecha, por ejemplo, no existen datos que muestren que una supresión de OCH1 en P. pastoris elimina la actividad 1,6-manosiltransferasa iniciadora crucial. (Martinet y col. Biotech. Letters 20(12) (Dic. 1998):

1171-1177; Contreras y col. WO 02/00856 A2). Por tanto, ningún dato prueba que el homólogo de gen de OCH1 de

P. pastoris codifica realmente esa función. Esa demostración se proporciona por primera vez en el presente documento.

Los homólogos de varias manosiltransferasas de S. cerevisiae se han identificado en P. pastoris usando estos enfoques. Los genes homólogos con frecuencia tienen funciones similares a los genes implicados en la manosilación de proteínas en S. cerevisiae y, por tanto, su supresión se puede usar para manipular el patrón de glicosilación en P. pastoris o, por analogía, en cualquier otra célula huésped, por ejemplo, células de hongos, plantas, insectos o animales, con rutas de glicosilación similares.

La creación de knock-outs génicos, una vez que se ha determinado una secuencia génica diana determinada, es una técnica bien establecida en el campo y la puede realizar un experto en la materia (véase, por ejemplo, R Rothstein, (1991) Methods in Enzymology, vol. 194, pág. 281). La elección de un organismo huésped puede estar influida por la disponibilidad de buenas técnicas de transformación y alteración génica.

Si se tienen que eliminar varias manosiltransferasas, el procedimiento desarrollado por Alani y Kleckner, (Genetics

116: 541 -545 (1987)), por ejemplo, posibilita el uso repetido de un marcador seleccionable, por ejemplo, el marcador URA3 en levaduras, para eliminar de forma secuencial toda la actividad manosiltransferasa endógena indeseable. Esta técnica se ha perfeccionado por otros, pero básicamente implica el uso de dos secuencias de ADN repetidas, que flanquean un marcador contra seleccionable. Por ejemplo: se puede usar URA3 como un marcador para asegurar la selección de un transformante que ha integrado una construcción. Flanqueando el marcador URA3 con repeticiones directas se puede seleccionar en primer lugar transformantes que han integrado la construcción y, por tanto, han alterado el gen diana. Después del aislamiento de los transformantes y su caracterización, se puede contra seleccionar en un segundo ciclo aquellos que sean resistentes a ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). Las colonias que son capaces de sobrevivir en placas que contienen 5-FOA han perdido el marcador URA3 de nuevo a través de un acontecimiento de cruzamiento que implica las repeticiones mencionadas anteriormente. Por tanto, este enfoque permite el uso repetido del mismo marcador y facilita la alteración de múltiples genes sin necesidad de marcadores adicionales. También se pueden usar técnicas similares para eliminación secuencial de genes adaptadas para uso en otras células huésped eucariotas con otros marcadores seleccionables y contra seleccionables.

La eliminación de manositransferasas específicas, tales como 1,6-manosiltransferasa (OCH1) o manosilfosfato transferasas (MNN6, o genes que complementan mutantes Ibd) o reguladores (MNN4) en P. pastoris posibilita la creación de cepas modificadas por ingeniería genética de este organismo que sintetizan principalmente Man8GlcNAc2 y que se pueden usar para modificar adicionalmente el patrón de glicosilación para que se parezca más a estructuras de glicoformas complejas, por ejemplo, las que se producen en mamíferos, por ejemplo, células humanas. Una realización preferida de este procedimiento utiliza secuencias de ADN que codifican actividades de glicosilación bioquímica para eliminar funciones bioquímicas similares o idénticas en P. pastoris para modificar la estructura de glicosilación de glicoproteínas producidas en la cepa de P. pastoris alterada genéticamente.

Los procedimientos usados para modificar por ingeniería genética la ruta de glicosilación en levaduras como se ha ilustrado en el presente documento, se pueden usar en hongos filamentosos para producir un sustrato preferido para modificación posterior. Las estrategias para modificar la ruta de glicosilación en A. niger y otros hongos filamentosos, por ejemplo, se pueden desarrollar usando protocolos análogos a los que se han descrito en el presente documento para modificar genéticamente cepas para producir glicoproteínas similares a humano en levaduras. Las actividades génicas indeseadas implicadas en la actividad 1,2 manosiltransferasa, por ejemplo, homólogos KTR/KRE, se modifican o eliminan. Un hongo filamentoso, tal como Aspergillus, es un huésped preferido debido a que carece de la actividad 1,6 manosiltransferasa y, como tal, no se esperaría una actividad génica de hipermanosilación, por ejemplo, OCH1, en este huésped. Por el contrario, otras actividades deseadas (por ejemplo, a-1,2-manosidasa, transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferasa (GnT), galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST)) implicadas en glicosilación se introducen en el huésped usando los procedimientos de dirección de la invención.

Modificación por ingeniería genética o selección de huéspedes que tienen actividad -1,6 manosiltransferasa iniciadora disminuida

En una realización preferida, el procedimiento de la invención implica preparar o usar una célula huésped cuya actividad a-1,6-manosiltransferasa iniciadora está disminuida o agotada, es decir, una enzima específica de iniciación que inicia la cadena exterior de manosilación en el brazo a-1,3 de la estructura de núcleo Man3GlcNAc2. En S. cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen OCH1. La alteración del gen OCH1 en S. cerevisiae da como resultado un fenotipo en el que los azúcares enlazados a N carecen completamente de la cadena exterior de polimanosa. Los enfoques anteriores para obtener glicosilación de tipo mamífero en cepas de hongos han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273: 26298-304). Sin embargo, la alteración de la actividad iniciadora de a-1,6-manosiltransferasa en una célula huésped de la invención puede ser opcional (dependiendo de la célula huésped seleccionada) ya que la enzima Ochlp requiere un Man8GlcNAc2

intacto para la iniciación de cadena exterior de manosa eficaz. Por tanto, las células huésped seleccionadas o producidas de acuerdo con la presente invención que acumulan oligosacáridos que tienen siete o menos restos de manosa pueden producir N-glicanos hipoglicosilados que probablemente serán sustratos malos de Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama y col. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).

El gen OCH1 se clonó a partir de P. pastoris (Ejemplo 1) y K. lactis (Ejemplo 9), como se ha descrito. La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos del gen OCH1 de K. lactis se exponen en SEC ID Nº: 3 y 4. Usando cebadores específicos de genes, se preparó una construcción a partir de cada clon para suprimir el gen OCH1 del genoma de

P. pastoris y K. lactis (Ejemplos 1 y 9, respectivamente). Células huésped agotadas en actividad a-1,6manosiltransferasa iniciadora y modificadas genéticamente para producir N-glicanos que tienen estructura de carbohidrato Man5GlcNAc2 se obtuvieron de ese modo (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 4 y 9).

La solicitud describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y más preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen OCH1 de K. lactis (SEC ID Nº: 3) y homólogos, variantes y derivados del mismo. La solicitud también describe moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se describen polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención. También se describen vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriores de la invención, como se ha descrito adicionalmente en el presente documento. De forma similar, se describen células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención.

La invención proporciona además procedimientos para preparar o usar una célula huésped eucariota no humana disminuida o agotada en una actividad de gen alg (es decir, actividades alg, incluyendo actividades enzimáticas equivalentes en células huésped no fúngicas) e introduciendo en la célula huésped al menos una actividad glicosidasa. En una realización preferida, la actividad glicosidasa se introduce provocando la expresión de una o más actividades manosidasa dentro de la célula huésped, por ejemplo, mediante activación de actividad manosidasa o mediante expresión a partir de una molécula de ácido nucleico de una actividad manosidasa, en la célula huésped.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un huésped no humano, en el que la glicoproteína comprende un N-glicano que tiene al menos dos GlcNAc unidos a una estructura de núcleo trimanosa.

Expresión de manosidasas de clase 2 en eucariotas inferiores

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para preparar glicoproteínas más similares a humano en células huésped eucariotas inferiores expresando un gen que codifica una manosidasa de Clase 2 catalíticamente activa (EC. 3.2.1.114) (homólogos, variantes, derivados y fragmento catalíticamente activo de la misma).

Mediante el uso de técnicas conocidas en el campo, se diseñan cebadores específicos de genes para complementar las regiones homólogas de los genes de manosidasa de Clase 2 (por ejemplo, a-manosidasa II de D. melanogaster) para amplificar por PCR el gen de manosidasa.

A través de la expresión de una manosidasa de Clase 2 activa en una célula a partir de un ácido nucleico que codifica la manosidasa de Clase 2, una célula huésped (por ejemplo P. pastoris) se modifica genéticamente para producir glicoproteínas más similares a humanos (véanse, por ejemplo, Ejemplos 17-25).

En un aspecto de la solicitud, se describe un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un eucariota inferior (por ejemplo, P. pastoris) construyendo una biblioteca de enzimas a-manosidasa II. En una realización preferida, una sub-biblioteca de secuencias de a-manosidasa II de D. melanogaster (por ejemplo, Genbank Nº de Acceso X77652) se fusiona a una sub-biblioteca de secuencias de péptidos de dirección MNN2 de

S. cerevisiae. En una realización más preferida de la invención, un huésped de P. pastoris que produce GlcNAcMan5GlcNAc2 se transforma con una construcción de fusión que comprende Manosidasa II ∆74 de D. melanogaster/MNN2(s). Véase Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003; 100(9): 5022-7 y el documento WO 02/00879, que describen procedimientos para preparar glicoproteínas similares a humano en eucariotas inferiores que tienen la estructura de N-glicano anterior, que ahora se denomina P. pastoris YSH-1.

La descripción describe además una secuencia de a-manosidasa II de Golgi que se selecciona entre, rata, ratón, ser humano, orugas, plantas e insectos. Tales secuencias están disponibles en bases de datos tales como Swissprot y Genbank. Por ejemplo, secuencias para los siguientes genes se encontraron en Genbank: Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499); Manosidasa II de C. elegans (NM_073594); manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116684); manosidasa II de Drosophila melanogaster (X77652); manosidasa II humana (U31520); manosidasa II de ratón (X61172); manosidasa II de rata (XM_ 218816); manosidasa IIx humana (D55649); manosidasa III de células de insecto (AF005034); manosidasa II lisosomal humana (NM_000528); y manosidasa II citosólica humana (NM_006715) (Figuras 25-35, SEC ID Nº: 49-59, respectivamente). Debido a la similitud de secuencia elevada y la presencia de la actividad Mana1,3 y Mana1,6, la manosidasa II citoplasmática y la manosidasa II lisosomal se denominarán colectivamente en el presente documento manosidasas de Clase 2.

Otras manosidasas que muestran la actividad de a-manosidasa II de Golgi incluyen, entre otras, manosidasa III de insecto (AF005034) y manosidasa IIx humana (D55649). Se describe que estas manosidasas, propiamente dichas, se usan para generar una biblioteca de ADN combinatoria de enzimas catalíticamente activas.

En otro aspecto de la invención, se fusiona una sub-biblioteca de secuencias de péptidos de dirección (líderes) seleccionadas entre el grupo constituido por GLS1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP 1 de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces a secuencias que codifican dominios de manosidasa II catalíticamente activos. La combinación de la biblioteca de líder/dominio catalítico se ilustra en la Tabla 11 (Ejemplo 14).

Las construcciones de fusión de a-manosidasa II de Golgi generadas de acuerdo con la presente invención presentan la actividad de corte de a-1,3 y a-1,6 manosidasa. Por ejemplo, la construcción de fusión de manosidasa II catalíticamente activa escinde los enlaces glicosídicos Mana1,3 y Mana1,6 presentes en GlcNAcMan5GlcNAc2 en GlcNAcMan3GlcNAc2 en P. pastoris YSH-1. En otro ejemplo, una construcción de fusión de manosidasa IIx catalíticamente activa escinde los enlaces glicosídicos de Mana1,3 y Mana1,6 presentes en Man6GlcNAc2 en Man4GlcNAc2.

Hidrólisis de manosidasa de clase 2 de enlace glicosídico

La presente invención también abarca el mecanismo en el que el dominio catalíticamente activo de las enzimas de Clase 2 hidrolizan los enlaces glicosídicos Mana1,3 y/o Mana1,6 en un oligosacárido, por ejemplo, estructura de GlcNAcMan5GlcNAc2 para producir GlcNAcMan3GlcNAc2, un intermedio deseado para procesamiento de N-glicano adicional en un eucariota inferior. En una primera realización, la hidrólisis de los enlaces glicosídicos ocurre de forma secuencial. La enzima hidroliza al menos un enlace glicosídico y gira conformacionalmente para hidrolizar el otro enlace glicosídico. En una segunda realización, la hidrólisis de los enlaces glicosídicos ocurre de forma simultánea. El intermedio producido es un sustrato para procesamiento de Golgi adicional en el que otras enzimas de glicosilación tales como N-acetilglucosaminiltransferasas (GnT), galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) se pueden modificar posteriormente para producir una glicoforma deseada. La Figura 36A ilustra los intermedios de oligosacáridos (por ejemplo GlcNAcMan3GlcNAc2 y GlcNAcMan4GlcNAc2) producidos a través de la ruta de manosidasa II y la Figura 36B ilustra los intermedios de oligosacárido (por ejemplo, Man4GlcNAc2 y Man5GlcNAc2) producidos a través de la ruta de manosidasa IIx.

Regiones conservadas de las enzimas manosidasa II

Es una característica de la presente invención expresar secuencias que codifican regiones conservadas de la enzima manosidasa II. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las regiones conservadas del gen de manosidasa II de diversas fuentes incluyendo insectos, mamíferos, plantas y orugas.

Varias secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican la enzima manosidasa II se han identificado y secuenciado. Las secuencias de enzima manosidasa II se exponen en SEC ID Nº: 49 a SEC ID Nº: 59. Un alineamiento de secuencias de manosidasa II conocida (es decir, Drosophila melanogaster alineada con otras secuencias de insecto, animal y plantas) muestra un motivo altamente conservado entre los aminoácidos 144-166 y aminoácidos 222-285 (Figura 23). Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para proporcionar a una célula huésped un ácido nucleico que codifica una actividad enzimática de manosidasa de Clase 2 donde el ácido nucleico se caracteriza por tener las regiones de manosidasa II conservadas anteriores.

Además, el alineamiento de secuencia adicional revela varios puentes disulfuro cistina-cistina altamente conservados entre los aminoácidos 338-345 y los aminoácidos 346-360 como se muestra en la Figura 23. Estos puentes disulfuro pueden jugar una parte integral en la unión y reconocimiento de sustrato, por ejemplo, manteniendo la arquitectura de la proteína.

La presente invención también proporciona fragmentos catalíticamente activos de manosidasas de Clase 2 que comprenden regiones de secuencia de aminoácidos conservadas, especialmente una primera secuencia de

aminoácidos constituida por 23 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 145 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K E Q N e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 146 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V y L

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 147 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F I H y L

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 148 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V I L y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 149 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V I L y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 150 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 151 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 152 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S T y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 153 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 154 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N C D y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 156 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 157 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 158 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 159 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I L K y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 160 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q M K y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 161 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T y Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 162 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 163 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E D y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 164 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E K D R Q y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 165 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 166 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F y C.

La presente invención proporciona además un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas, especialmente una segunda secuencia de aminoácidos constituida por 57 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 222 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 223 de la primera secuencia se selecciona entre 10 el grupo constituido por F I y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 224 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V A T y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 225 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T G N y Q.

15 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 226 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 227 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 228 de la primera secuencia se selecciona entre 20 el grupo constituido por W y Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 229 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 230 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M y A.

25 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 231 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P T y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 232 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 233 de la primera secuencia se selecciona entre 30 el grupo constituido por E y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 234 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 235 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N T C y A.

35 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 236 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S A P T y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 237 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 238 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W Y I y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 239 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R H F Y G y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 240 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N S y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 241 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V M L I y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 242 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I V y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 243 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L T G D y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 244 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q E y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 245 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 246 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T F I A y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 247 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E L y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 248 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 249 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q H P M N y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 250 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por TE P Q M H R y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 251 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W P F y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 252 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I V y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 253 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K Q R E N y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 254 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q N R K D y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 255 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F H N y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 256 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M I L y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 257 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 258 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V A G y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 259 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T I K V R y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 260 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 261 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T Q R K y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 262 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S N T y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 263 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S H G A y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 264 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 265 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S H y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 266 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 267 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 268 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 269 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 271 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H L e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 272 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S T G y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 273 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P S A R y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 274 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T S E e I.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 275 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M V Q y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 276 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P A y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 277 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y H S y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 278 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I L y W.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 279 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 280 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q T R K N D A y W.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 281 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K S R Q y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 282 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S A y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 283 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G N y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 284 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F I y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 285 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K T S E y D.

La presente invención también proporciona un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas, especialmente una tercera secuencia de aminoácidos constituida por 33 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 325 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H P y S.

10 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 326 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M I L N T y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 327 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M Q A e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 328 de la primera secuencia se selecciona entre 15 el grupo constituido por P y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 329 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F L y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 330 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y D F y L.

20 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 331 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S I T e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 332 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y G y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 333 de la primera secuencia se selecciona entre 25 el grupo constituido por D S V y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 334 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I V y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 335 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P K y Q.

30 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 336 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H S N y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 337 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T G y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 338 de la primera secuencia se selecciona entre 35 el grupo constituido por C Y y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 339 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G N y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 340 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y R.

40 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 341 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D E H P y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 342 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P R y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 343 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K S A N y F.

5 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 344 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V I y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 345 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por C y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 346 de la primera secuencia se selecciona entre 10 el grupo constituido por C L W y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 347 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q S D y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 348 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F V y G.

15 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 349 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D L y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 350 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F C y W.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 351 de la primera secuencia se selecciona entre 20 el grupo constituido por R K A y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 352 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R K D y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 353 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M L I y Q.

25 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 354 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G P R y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 355 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S E G

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 356 de la primera secuencia se selecciona entre 30 el grupo constituido por F G y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 357 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G R K y L.

La presente invención proporciona además un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas, especialmente una cuarta secuencia de 35 aminoácidos constituida por 28 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 380 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M I K T e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 381 de la primera secuencia se selecciona entre 40 el grupo constituido por L I F y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 382 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V Y L I y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 383 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D E N y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 384 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q E V y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 385 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W Y y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 386 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R D T y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 387 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K R A y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 388 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K I Q y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 389 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S G y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 390 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E Q R K T S y F

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 391 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L Y y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 392 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 393 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R P y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 394 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T N S H y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 395 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N S K D y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 396 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V T H y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 397 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I V T y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 398 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L F V y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 399 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I Q V A y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 400 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P I T y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 401 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 403 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D S y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 404 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 405 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F e I.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 406 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 407 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F Y y R.

La presente invención también proporciona un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas especialmente una quinta secuencia de aminoácidos constituida por 12 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 438 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q K L y H.

10 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 439 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 440 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G S y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 441 de la primera secuencia se selecciona entre 15 el grupo constituido por T y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 442 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L P y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 443 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q S E L A y D.

20 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 444 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E D C y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 445 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 446 de la primera secuencia se selecciona entre 25 el grupo constituido por F L y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 447 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D K R N W y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 448 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A K T E y Q.

30 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 449 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V L M y G.

La presente invención también proporciona un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una sexta secuencia de aminoácidos constituida por 14 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

35 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 463 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L F y K. En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 464 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S K H y D. 40 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 465 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G D y V. En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 466 de la primera secuencia se selecciona entre

el grupo constituido por D y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 467 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 468 de la primera secuencia se selecciona entre 5 el grupo constituido por F y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 469 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T S V P y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 470 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y D.

10 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 471 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 472 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 473 de la primera secuencia se selecciona entre 15 el grupo constituido por R I y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 474 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S D E Q F P y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 475 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D Q S H y N.

20 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 476 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N H D E y Q.

La presente invención proporciona además un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una séptima secuencia de aminoácidos constituida por 20 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 477 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 478 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por W y G.

30 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 479 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S T y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 481 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 482 de la primera secuencia se selecciona entre 35 el grupo constituido por Y F y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 483 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T V S y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 484 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S T y G.

40 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 485 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 487 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F A y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 488 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H Y F L y Q.

5 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 489 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 490 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R Q S M A e I.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 491 de la primera secuencia se selecciona entre 10 el grupo constituido por M L Q V e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 492 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D E y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 494 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V I Q y L.

15 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 495 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M F S y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 496 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M Q E Y y R.

La presente invención también proporciona un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que 20 comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una octava secuencia de aminoácidos constituida por 27 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 524 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A L y W.

25 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 525 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R N y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 526 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R Q E y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 527 de la primera secuencia se selecciona entre 30 el grupo constituido por E A T y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 528 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 529 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S G A y F.

35 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 530 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 531 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F L y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 532 de la primera secuencia se selecciona entre 40 el grupo constituido por Q y L

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 534 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 535 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 536 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G A y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 537 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I V e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 538 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 539 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 540 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 541 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 542 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K R y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 543 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T D E S Q e I.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 544 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H A W Y S y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 545 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 546 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V M A y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 547 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V L Q y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 548 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 549 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 550 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E G A y C.

La presente invención también proporciona un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una novena secuencia de aminoácidos constituida por 11 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 789 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A y W.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 790 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 791 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 792 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 793 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L K M R y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 794 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 795 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N D A y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 796 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G N Y Q y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 797 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P E Q N y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 798 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A G S K y T.

La presente invención proporciona además un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una décima secuencia de aminoácidos constituida por 14 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 867 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F T e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 868 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F S y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 869 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T I y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 870 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 871 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L T Q S y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 872 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N S y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 873 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G T y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 874 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M F A Y y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 875 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q R y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 876 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F M V I Y y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 877 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I Q S L y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 878 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K P R E y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 879 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 880 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R M T E V e Y.

La presente invención proporciona además un fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas, especialmente una décimo primera secuencia de aminoácidos constituida por 66 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 904 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N T Q E y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 905 de la primera secuencia se selecciona entre 10 el grupo constituido porT R K H S Q M y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 906 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R Q y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 907 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M y F.

15 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 908 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T S y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 909 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 910 de la primera secuencia se selecciona entre 20 el grupo constituido por L H y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 911 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T S y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 912 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G A R N y D.

25 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 913 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q H R y C.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 914 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P A S y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 915 de la primera secuencia se selecciona entre 30 el grupo constituido por L Q e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 917 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G V y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 918 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S y A.

35 En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 919 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 920 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 921 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S G K E R y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 922 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S N D E P y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 924 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E Q W R y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 925 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L e I.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 926 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 927 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I V L y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 928 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por M I F V y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 929 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q L M V y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 930 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D H y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 931 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 933 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L T y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 934 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A S M V L y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 935 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S Q R Y y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 936 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 937 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 938 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E N G F y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 939 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 940 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 941 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L V I y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 942 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G Q E S y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 943 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q E y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 944 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 945 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V L I y R.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 946 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L R K H Q M y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 947 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 948 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N y F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 949 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K L R G y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 950 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P R I A S e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 951 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V T M G y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 952 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L V C A P T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 953 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H A N E V F W y M.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 954 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I H R L S V Q y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 955 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F N R y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 956 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R V H W G y K.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 957 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I R y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 958 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V L M H y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 959 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L I A F.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 960 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E V y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 961 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K P R S L y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 962 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V M R W N L y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 963 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N S T I P D y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 964 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por N S L V A G y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 965 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por C S M G V I Q y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 966 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por V S N A T y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 967 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por R G P M T A y D.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 968 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P N E K y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 969 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S K V E A K e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 970 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K Q E S R y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 971 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L E Q D K N y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 972 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H E S K T y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 973 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P R S K y N.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 974 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A V T L P e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 975 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por G S A R y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 976 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Y F N y V.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 977 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L H y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 978 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por T S y L

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 979 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S H L M y Q.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 980 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A V L y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 981 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A G S V y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 982 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por H Y D L y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 983 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K L M I Q Y y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 984 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A T S I L y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 985 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S T G y E.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 986 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por Q W M S A R y P

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 987 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por S Y F L E H M y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 988 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L M F V y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 989 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L H N y A.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 990 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D Y T A y H.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 991 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por P y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 992 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por L P A F V I Q y W.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 993 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por D V L I R N y S.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 994 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por K V A P y T.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 995 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F M L e Y.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 996 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por I P V A S y L.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 997 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por F G V L N A y P.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 998 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por A D A S N K y G.

En otra realización preferida, el resto aminoacídico en la posición 999 de la primera secuencia se selecciona entre el grupo constituido por E A K R G T y S.

Expresión de manosidasas de clase III en eucariotas inferiores

En el presente documento también se describe que una manosidasa que tiene especificidad de sustrato por Mana1,2/Mana1,3/Mana1,6 se introduce en un huésped eucariota inferior.

En una realización, una manosidasa de clase III capaz de hidrolizar los enlaces glicosídicos Mana1,2/Mana1,3/Mana1,6 se expresa en huésped eucariota inferior. Mediante la expresión de manosidasas de Clase III in vivo, solas o en conjunto con otras enzimas modificadoras de N-glicano, se obtiene el corte eficaz de estructuras con alto contenido en manosa en Man3GlcNAc2 en glicoproteínas de huésped.

Como se ha descrito en el presente documento, la manosidasa III de Sf9 (Genbank gi:2245567 (D. Jarvis, y col. Glycobiology 1997 7: 113-127)) se clona en un plásmido de integración de levadura bajo el control de un promotor constitutivo o inducible (véase el Ejemplo 26). La cantidad de actividad manosidasa de Clase II se optimiza mientras que se limitan los efectos secundarios en la célula. Esto implica alterar la fuerza del promotor y puede incluir usar un promotor inducible o regulable de otra manera para controlar mejor la expresión de estas proteínas.

Además, de expresar la manosidasa de Clase III de tipo silvestre, las formas modificadas de la manosidasa de Clase III se pueden expresar para potenciar la localización y actividad celular. Esto se consigue a través del enfoque de biblioteca de ADN combinatoria de la invención fusionando longitudes variables del dominio catalítico de manosidasa o manosidasas de Clase III con regiones de dirección de levadura endógenas, como se ha descrito en el presente documento.

Hidrólisis de nanosidasa de clase III de enlaces glicosídicos

En el presente documento también se describe el mecanismo en el que el dominio catalíticamente activo de enzimas de Clase III hidroliza los enlaces glicosídicos Mana1,3 y/o Mana1,6 y/o Mana1,2 en unas estructuras de oligosacárido, por ejemplo, Man5GlcNAc2 o Man8GlcNAc2 para producir Man3GlcNAc2, un intermedio deseado para procesamiento adicional de N-glicano en un eucariota inferior.

Como se ha descrito en el presente documento, la hidrólisis de los enlaces glicosídicos ocurre de forma secuencial. La enzima hidroliza al menos un enlace glicosídico y gira conformacionalmente para hidrolizar los otros enlaces glicosídicos.

Como se describe también en el presente documento, la hidrólisis de los enlaces glicosídicos de Mana1,6 y Mana1,3 ocurre también simultáneamente. Adicionalmente se describe que la enzima específicamente hidroliza los enlaces glicosídicos Mana1,2. El intermedio producido es un sustrato para procesamiento de Golgi adicional en el que otras enzimas de glicosilación tales como N-acetilglucosaminiltransferasas (GnT), galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST) se pueden modificar posteriormente para producir una glicoforma deseada. La Figura 36C ilustra los intermedios de oligosacárido (por ejemplo Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2) producidos a través de la ruta de manosidasa III.

Células huésped de la invención

Una célula huésped preferida de la invención es una levadura, un hongo unicelular o multicelular filamentoso. Sin embargo, se describe una amplia variedad de células huésped como útiles en los procedimientos de la invención. Se describe que las células vegetales o células de insecto, por ejemplo, se modifican genéticamente para expresar una glicoproteína de tipo humano de acuerdo con la invención. Análogamente, se describe una diversidad de células huésped no humanas de mamífero que expresan más glicoproteínas similares a humano o alteradas de otra manera usando los procedimientos de la invención. La solicitud describe además que cualquier célula huésped eucariota (incluyendo una célula humana) se puede usar junto con una biblioteca de la invención para expresar una

o más proteínas quiméricas que se dirigen a un emplazamiento subcelular, por ejemplo, organelo, en la célula huésped donde la actividad de la proteína se modifica y, preferiblemente está potenciada. Una proteína de este tipo es preferiblemente, pero no lo es necesariamente, una enzima implicada en la glicosilación de proteínas, como se ha ilustrado en el presente documento. Se prevé que cualquier secuencia codificante de proteína se puede dirigir y seleccionar para actividad modificada en una célula huésped eucariota usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Los eucariotas inferiores que son capaces de producir glicoproteínas que tienen el Man5GlcNAc2 unido a N-glicano son particularmente útiles debido a que (a) carecen de un grado de manosilación (por ejemplo, mayor de 8 manosas por N-glicano o especialmente 30-40 manosas), las mismas muestran inmunogenicidad reducida en seres humanos y (b) el N-glicano es un sustrato para reacciones de glicosilación adicionales para formar una glicoforma incluso más de tipo humano, por ejemplo, mediante la acción de la GlcNAc transferasa I (Figura 1B; 11,2 GnTI) para formar GlcNAcMan5GlcNAc2. Se obtiene un rendimiento de más del 30% en mol, más preferiblemente un rendimiento del 50-100% en mol, con glicoproteínas con N-glicanos que tienen una estructura de Man5GlcNAc2. En una realización preferida, se muestra que más del 50% de la estructura de Man5GlcNAc2 es un sustrato para una actividad de GnTI y puede servir como un sustrato de este tipo in vivo.

Las levaduras u hongos unicelulares o multicelulares filamentosos preferidos de la invención incluyen, pero sin limitación: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reseei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp. Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

En cada realización anterior, el procedimiento se refiere a la preparación de una célula huésped en la que los precursores de oligosacáridos están enriquecidos en Man5GlcNAc2. Estas estructuras son deseables debido a que las mismas se pueden procesar posteriormente mediante tratamiento in vitro, por ejemplo, usando el procedimiento de Maras y Contreras, Patente de los Estados Unidos Nº 5.834.251. Sin embargo, en una realización preferida, los precursores con alto contenido en Man5GlcNAc2 se procesan mediante al menos una reacción de glicosilación adicional in vivo, con glicosidasas (por ejemplo, a-manosidasa) y glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTI), para producir N-glicanos similares a humano. Los precursores de oligosacárido con altos contenidos de Man5GlcNAc2, por ejemplo, se procesan preferiblemente a aquellos que tienen estructuras de núcleo GlcNAcManxGlcNAc2, donde X es 3. El procesamiento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 mediante tratamiento con glicosiltranferasa (por ejemplo, GnTII) produce estructuras de núcleo de GlcNAc2Man3GlcNAc2 que después se pueden modificar, según se desee, por ejemplo, mediante tratamiento ex vivo o mediante expresión heteróloga en la célula huésped de enzimas de glicosilación adicionales, incluyendo glicosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para volverse N-glicanos similares a humano.

Las glicoproteínas similares a humano preferidas que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen aquellas que comprenden N-glicanos que tienen siete o menos o tres o menos restos de manosa y que comprenden uno o más azúcares seleccionados entre el grupo constituido por galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa.

Una célula huésped apropiada se puede modificar por ingeniería genética o se puede usar uno de muchos de tales mutantes descritos anteriormente en levadura. Una célula huésped preferida de la invención, como se ilustra en el presente documento, es un mutante sin hipermanosilación (OCH1) en Pichia pastoris.

Formación de N-glicanos complejos

La formación de síntesis de N-glicanos complejos es un procedimiento secuencial mediante el cual se retiran restos de azúcares específicos y se unen a la estructura de oligosacárido del núcleo. En eucariotas superiores, esto se consigue exponiendo el sustrato secuencialmente a diversas enzimas de procesamiento. Estas enzimas realizan reacciones específicas dependiendo de su emplazamiento particular dentro de la cascada de procesamiento

completa. Esta “línea de ensamblaje” está constituida por RE, Golgi temprano, medio y tardío y la red de Golgi

trans, todos con su entorno de procesamiento específico. Para recrear el procesamiento de glicoproteínas humanas en el Golgi y RE de eucariotas inferiores, se tienen que expresar y dirigir específicamente a estos organelos numerosas enzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas, glicosidasas, fosfatasas y transportadores) y, preferiblemente, en un emplazamiento de forma que las mismas funcionen más eficazmente con relación a su entorno así como con otras enzimas en la ruta.

Debido a que un objetivo de los procedimientos descritos en el presente documento es conseguir una cepa de producción de proteína sólida que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma de la célula huésped implica una planificación cuidadosa. Como se ha descrito anteriormente, preferiblemente se suprimen uno o más genes que codifican enzimas que se conoce que son características de reacciones de glicosilación no humanas. La cepa celular modificada por ingeniería genética se transforma con una diversidad de genes diferentes que codifican actividades deseadas y estos genes se transforman de una manera estable, asegurando de ese modo que la actividad deseada se mantenga a través del procedimiento de fermentación.

Cualquier combinación de las siguientes actividades enzimáticas se puede modificar genéticamente de forma única

o de forma múltiple en el huésped usando los procedimientos de la invención: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos de RE y Golgi (por ejemplo, transportadores simportador y antiportador para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacárido activados tales como UDP-galactosa y ácido CMP-N-acetilneuramínico. Preferiblemente, las actividades enzimáticas se introducen en una o más moléculas de ácido nucleico (véase también más adelante). Las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir únicamente o de forma múltiple, por ejemplo, en el contexto de una biblioteca de ácidos nucleicos tal como una biblioteca combinatoria de la invención. Sin embargo, se ha de apreciar, que las actividades enzimáticas únicas o múltiples se pueden introducir en una célula huésped de cualquier modo, incluyendo pero sin limitación, procedimientos de administración de proteínas y/o mediante el uso de una o más moléculas de ácido nucleico sin usar necesariamente una biblioteca de ácidos nucleicos o biblioteca combinatoria de la invención.

Expresión de glicosiltransferasas para producir N-glicanos complejos:

Con información de secuencia de ADN, el experto puede clonar moléculas de ADN que codifican actividades de GnT (por ejemplo, Ejemplo 3). Usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia, las moléculas de ácido nucleico que codifican GnTI, II, III, IV o V (o que codifican fragmentos catalíticamente activos de los mismos) se pueden insertar en vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de promotores y otras secuencias de control de expresión capaces de dirigir la transcripción en una célula huésped seleccionada de la invención, por ejemplo, en un huésped fúngico tal como Pichia sp., Kluyveromyces sp. y Aspergillus sp., como se ha descrito en el presente documento, de forma que una o más de estas enzimas GnT de mamífero se puedan expresar activamente en una célula huésped de elección para producción de glicoproteína compleja de tipo humano (por ejemplo, Ejemplos 8, 15, 17 y 19).

Varias glicosiltransferasas individuales se han clonado y expresado en S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos, sin demostrar, sin embargo, el resultado deseado de “humanización” en el patrón de glicosilación de los organismos (Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8; Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Se ha especulado que la estructura de carbohidrato necesaria para aceptar azúcares mediante la acción de tales glicosiltransferasas no estaba presente en cantidades suficientes, lo que más probablemente contribuyó a la carencia de formación de N-glicanos complejos.

Un procedimiento preferido de la invención proporciona la expresión funcional de una glicosiltransferasa, tal como GnTI, GnTII y GnTIII (u otras GnT tales como GnTIV y GnTVI y combinaciones de cualquiera de los anteriores) en el aparato de Golgi temprano, medio o tardío, así como asegura un suministro suficiente de UDP-GlcNAc (por ejemplo, mediante expresión de un transportador de UDP-GlcNAc; véase más adelante).

Procedimientos para Proporcionar Precursores Nucleotídicos de Azúcar al Aparato de Golgi:

Para que una glicosiltransferasa funcione de forma satisfactoria en el Golgi, la enzima necesita una concentración suficiente de un azúcar nucleotídico apropiado, que es el donador de alta energía del resto de azúcar añadido a una glicoproteína naciente. En seres humanos, la variedad completa de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, etc.) generalmente se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen a los oligosacáridos de núcleo mediante glicosiltransferasas.

Para replicar este procedimiento en células huésped no humanas tales como eucariotas inferiores, se tienen que expresar transportadores específicos de nucleósido de azúcar en el Golgi para asegurar niveles adecuados de precursores de azúcares nucleosídicos (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91(2): A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709715). Los azúcares nucleotídicos se pueden proporcionar a los compartimentos apropiados, por ejemplo, expresando en el microorganismo huésped un gen exógeno que codifica un transportador nucleotídico de azúcar. La elección de la enzima transportadora está influida por la naturaleza de la glicosiltransferasa exógena que se esté usando. Por ejemplo, una GlcNAc transferasa puede necesitar un transportador de UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede necesitar un transportador de GDP-fucosa, una galactosiltransferasa puede necesitar un transportador de UDP-galactosa y una sialistransferasa puede necesitar un transportador de ácido CMP-siálico.

La proteína transportadora añadida lleva un azúcar nucleotídico desde el citosol hasta el aparato de Golgi, donde el azúcar nucleotídico se puede someter a reacción mediante la glicosiltransferasa, por ejemplo, para alargar un Nglicano. La reacción libera un difosfato o monofosfato nucleosídico, por ejemplo, UDP, GDP o CMP. Los monofosfatos nucleosídicos se pueden exportar directamente desde el Golgi mediante intercambio por azúcares trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo antiportador. Sin embargo, la acumulación de un difosfato nucleosídico, inhibe la actividad adicional de una glicosiltransferasa. Ya que esta reacción parece ser importante para la glicosilación eficaz, frecuentemente es deseable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica una difosfatasa nucleotídica. La difosfatasa (específica para UDP o GDP según sea apropiado) hidroliza el difosfonucleósido para producir un monofosfato nucleosídico y fosfato inorgánico.

Las enzimas transportadoras adecuadas, que típicamente son de origen mamífero, se describen más adelante. Tales enzimas se pueden modificar por ingeniería genética en una célula huésped seleccionada usando los procedimientos de la invención.

En otro ejemplo, a2,3 o a2,6 sialiltransferasa protege restos de galactosa con ácido siálico en el Golgi trans y TGN de seres humanos conduciendo a una forma madura de la glicoproteína (Figura 1B). Para volver a someter a ingeniería genética esta etapa de procesamiento en una levadura u hongo sometido a ingeniería genética de forma metabólica se requerirá (1) actividad a2,3 o a2,6 sialiltransferasa y (2) un suministro suficiente de ácido CMP-Nacetilneuramínico en el Golgi tardío de levadura. Para obtener suficiente actividad a2,3 sialiltransferasa en el Golgi tardío, por ejemplo, el dominio catalítico de una sialiltransferasa conocida (por ejemplo, de seres humanos) se tiene que dirigir al Golgi tardío en hongos (véase anteriormente). Análogamente, los transportadores se tienen que someter a ingeniería genética para permitir el transporte de ácido CMP-N-acetilneuramínico en el Golgi tardío. Actualmente no existen indicios de que los hongos sinteticen o incluso puedan transportar cantidades suficientes de ácido CMP-N-acetilneuramínico en el Golgi. Por consiguiente, para asegurar un suministro adecuado de sustrato para las glicosiltransferasas correspondientes, se tiene que modificar por ingeniería genética metabólicamente la producción de ácido CMP-siálico en el hongo.

UDP-N-acetilglucosamina

El ADNc de transportador humano de UDP-N-acetilglucosamina, que se reconoció a través de una búsqueda de homología en las bases de datos de etiquetas de secuencia expresadas (dbEST), se ha clonado (Ishida, 1999 J. Biochem. 126(1): 68-77). El transportador de membrana de Golgi de mamífero para UDP-N-acetilglusamina se clonó mediante corrección fenotípica con ADNc a partir de células de riñón caninas (MDCK) de un mutante caracterizado recientemente de Kluyveromyces lactis que carecía de transporte de Golgi del azúcar nucleotídico anterior (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14): 7888-7892). Los resultados demuestran que el gen de transportador de UDP-GlcNAc de Golgi de mamífero tiene toda la información necesaria para que la proteína se exprese y se dirija funcionalmente al aparato de Golgi de levadura y que dos proteínas con secuencias de aminoácidos muy diferentes pueden transportar el mismo soluto dentro de la misma membrana de Golgi (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14): 7888-7892).

Por consiguiente, se puede incorporar la expresión de un transportador de UDP-GlcNAc en una célula huésped por medio de una construcción de ácido nucleico que puede contener, por ejemplo: (1) una región mediante la cual la construcción transformada se mantiene en la célula (por ejemplo, un origen de replicación o una región que media la integración cromosómica), (2) un gen marcador que permite la selección de células que se ha transformado, incluyendo marcadores contra seleccionables y reciclables tales como ura3 o T-urfl3 (Soderholm y col. (2001) Biotechniques 31(2): 306-10) u otros marcadores de selección bien caracterizados (por ejemplo, his4, bla, Sh ble etc.), (3) un gen o fragmento del mismo que codifica un transportador de UDP-GlcNAc funcional (por ejemplo, de K. lactis, (Abeijon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 5963-5968) o de H. sapiens (Ishida y col. (1996) J. Biochem. (Tokyo) 120(6): 1074-8) y (4) un promotor que activa la expresión de la biblioteca de construcción de fusión de dominio de localización/catalítico mencionado. El Ejemplo 8 muestra la adición del gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank NA AP106080) que codifica el transportador de UDP-GlcNAc en un PBP-3 de P. pastoris. Las Figura 10A y 10B comparan los perfiles de N-glicano de MALDI-TOF de una cepa de P. pastoris sin el

transportador de UDP-GlcNAc y una cepa de P. pastoris con el transportador de UDP-GlcNAc (PBP-3), respectivamente. El PBP-3 de P. pastoris muestra un pico prominente único en 1457 (m/z) coherente con su identificación como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b].

GDP-Fucosa

El transportador de GDP-fucosa de membrana de Golgi de hígado de rata se ha identificado y purificado por Puglielli, L. y C. B. Hirschberg (Puglielli, 1999 J. Biol. Chem. 274(50): 35596-35600). El gen correspondiente no se ha identificado, sin embargo, se puede usar secuenciación N-terminal para el diseño de sondas oligonucleotídicas específicas para el gen correspondiente. Estos oligonucleótidos se pueden usar como sondas para clonar el gen que codifica el transportador de GDP-fucosa.

UDP-Galactosa

Dos genes heterólogos, gmal2(+) que codifican alfa 1,2-galactosiltransferasa (alfa 1,2 GalT) de Schizosaccharomyces pombe y (hUGT2) que codifica transportador de UDP-galactosa humano (UDP-Gal), se han expresado funcionalmente en S. cerevisiae para examinar las condiciones intracelulares necesarias para la galactosilación. La correlación entre la galactosilación de proteínas y la actividad de transporte de UDP-galactosa ha indicado que un suministro exógeno de transportador de UDP-Gal, en lugar de alfa 1,2 GalT jugaba un papel clave para la galactosilación eficaz en S. cerevisiae (Kainuma, 1999 Glycobiology 9(2): 133-141). Análogamente, se ha clonado un transportador de UDP-galactosa de S. pombe (Segawa, 1999 Febs Letters 451(3): 295-298).

Ácido CMP-N-acetilneuramínico (ácido CMP-Siálico).

El transportador de ácido CMP-siálico humano (hCST) se ha clonado y expresado en células CHO Lee 8 (Aoki y col. (1999) J. Biochem. (Tokyo) 126(5): 940-50; Eckhardt y col. (1997) Eur. J. Biochem. 248(1): 187-92). La expresión funcional del transportador de ácido CMP-siálico murino se consiguió en Saccharomyces cerevisiae (Berninsone y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 12616-9). En algunos hongos se ha encontrado ácido siálico, sin embargo, no está claro si el sistema huésped elegido será capaz de suministrar niveles suficientes de ácido CMP-Siálico. El ácido siálico se puede suministrar en el medio o, como alternativa, también se pueden integrar rutas fúngicas implicadas en la síntesis de ácido siálico en el genoma del huésped.

Expresión de difosfatasas:

Cuando se transfieren azúcares en una glicoproteína, se libera un difosfato o monofosfato nucleosídico a partir de los precursores nucleotídicos de azúcar. Mientras que los monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos nucleosídicos y fosfatos inorgánicos antes de exportarse. Esta reacción parece ser importante para la glicosilación eficaz, ya que se ha encontrado que la GDPasa de S. cerevisiae es necesaria para la manosilación. Sin embargo, la enzima sólo tiene el 10% de la actividad hacia UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Con frecuencia, los eucariotas inferiores no tienen actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteína en el Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que añade restos de galactosa a los polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, sugiriendo además la necesidad de una enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Se conoce que UDP es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este producto secundario de la glicosilación es importante para evitar la inhibición de la glicosiltransferasa en el lumen del Golgi.

Vectores recombinantes

Se puede usar una diversidad de vectores de expresión para expresar las secuencias de nucleótidos de la presente invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 13). Las secuencias se pueden unir operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector adecuado para transformación de una célula huésped. En una realización, una secuencia de la presente invención está unida operativamente a un vector denominado pJN348, que comprende un promotor GAPDH, un casete de sitio de restricción Notl AscI PacI, un terminador transcripcional Cycll, el casete de selección ura3 para expresión en una P. pastoris YSH-1 (Ampr).

En una realización preferida, el vector comprende un fragmento catalíticamente activo de una enzima manosidasa II como se ha expuesto en la descripción anterior. Otros vectores de expresión adecuados para uso en levaduras y hongos filamentosos se conocen bien en la técnica.

Procedimientos para alterar N-Glicanos en un huésped expresando una actividad enzimática dirigida a partir de una molécula de ácido nucleico

La presente invención proporciona además un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped no humana que comprende la etapa de introducir en la célula una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima o enzimas para producción de la estructura de carbohidrato Man5GlcNAc2. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico que comprende una o más actividades manosidasas implicadas en la producción de Man5GlcNAc2 a partir de Man8GlcNAc2 o Man9GlcNAc2 se introduce en el huésped. La invención se refiere además a procedimientos para preparar glicoproteínas alteradas en una célula huésped que comprenden la etapa de introducir en la célula huésped una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades de glicosilación. Las actividades enzimáticas preferidas se seleccionan entre el grupo constituido por UDP-GlcNAc transferasa, UDP-galactosiltransferasa, GDP-fucosiltransferasa, CMP-sialiltransferasa, transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de ácido CMP-siálico y difosfatasas nucleotídicas. En una realización particularmente preferida, el huésped se selecciona o se modifica por ingeniería genética para expresar dos o más actividades enzimáticas en las que el producto de una actividad aumenta los niveles de sustrato de otra actividad, por ejemplo, una glicosiltransferasa y un transportador de glucosa correspondiente, por ejemplo, GnTI y actividades de transportador de UDP-GlcNAc. En otra realización preferida, el huésped se selecciona o se modifica por ingeniería genética para expresar una actividad para retirar productos que pueden inhibir reacciones de glicosilación posteriores, por ejemplo, una actividad de difosfatasa específica de UDP o GDP.

Los procedimientos preferidos de la invención implican expresar una o más actividades enzimáticas a partir de una molécula de ácido nucleico en una célula huésped y comprenden la etapa de dirigir al menos una actividad enzimática a un emplazamiento subcelular deseado (por ejemplo, un organelo) formando una proteína de fusión que comprende un dominio catalítico de la enzima y un péptido señal de dirección celular, por ejemplo, un péptido señal heterólogo que normalmente no está ligado a o asociado con el dominio catalítico. La proteína de fusión está codificada por al menos una construcción genética (“construcción de fusión”) que comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular ligado en la misma fase de lectura traduccional (“en fase”) a un fragmento de ácido nucleico que codifica una enzima (por ejemplo, enzima de glicosilación) o fragmento catalíticamente activo de la misma.

El componente de péptido señal de dirección de la construcción de fusión o proteína preferiblemente se obtiene a partir de un miembro del grupo constituido por: proteínas unidas a membrana del RE o Golgi, señales de recuperación, proteínas de membrana de Tipo II, proteínas de membrana de Tipo I, transportadores de azúcares nucleotídicos transmembrana, manosidasas, sialiltransferasas, glicosidasas, manosiltransferasas y fosfomanosiltranferasas.

El componente de dominio catalítico de la construcción de fusión o proteína preferiblemente se obtiene a partir de una actividad glicosidasa, manosidasa o glicosiltransferasa obtenida a partir de un miembro del grupo constituido por GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, GalT, Fucosiltransferasa y Sialiltransferasa. El domino catalítico preferiblemente tiene un pH óptimo dentro de 1,4 unidades de pH del pH promedio óptimo de otras enzimas representativas en el organelo en el que está localizada la enzima o tiene una actividad óptima a un pH de entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, el dominio catalítico codifica una manosidasa seleccionada entre el grupo constituido por manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón, manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans y manosidasa II de H. sapiens.

Seleccionar una enzima de glicosilación: pH óptimos y localización subcelular

En una realización, una glicoproteína de tipo humano se prepara eficazmente en una célula de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso introduciendo en un compartimento subcelular de la célula una enzima de glicosilación seleccionada para tener un pH óptimo similar al pH óptimo de otras enzimas en el compartimento subcelular al que se dirige. Por ejemplo, la mayoría de las enzimas que son activas en el RE y el aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen pH óptimos que están entre aproximadamente 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Debido a que la glicosilación de proteínas en un procedimiento altamente evolucionado y eficaz, el pH interno del RE y del Golgi probablemente también está en el intervalo de aproximadamente 6-8. Sin embargo, todos los enfoques anteriores para reducir la manosilación mediante la acción de manosidasa recombinantes en huéspedes fúngicos han introducido enzimas que tienen un pH óptimo de aproximadamente pH 5,0 (Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, y Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304). A pH 7,0 la actividad determinada in vitro de esas manosidasas se reduce hasta menos del 10%, lo que probablemente es actividad insuficiente en su punto de uso, concretamente, el RE y el Golgi temprano, para la producción in vivo eficaz de Man5GlcNAc2 o Nglicanos.

Por consiguiente, una realización preferida de la presente invención dirige una enzima de glicosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma), por ejemplo, una a-manosidasa, a un emplazamiento subcelular en la célula huésped (por ejemplo, un organelo) donde el pH óptimo de la enzima o dominio está dentro de 1,4 unidades del pH promedio óptimo de otras enzimas marcadoras representativas localizadas en el mismo o los mismos organelos. El pH óptimo de la enzima que se tiene que dirigir a un organelo específico debe coincidir con el pH óptimo de otras enzimas encontradas en el mismo organelo para maximizar la actividad por unidad de enzima obtenida. La Tabla 3 resume la actividad de manosidasas de diversas fuentes y sus pH óptimos respectivos. La Tabla 4 resume sus emplazamientos subcelulares típicos.

Tabla 3. Manosidasas y su pH óptimo.

Fuente Enzima pH Referencia óptimo

Aspergillus saitoi a-1,2-manosidasa 5,0 Ichishima y col., 1999 Biochem. J. 339(Pt 3): 589-597 Trichoderma reesei a-1,2-manosidasa 5,0 Maras y col., 2000 J. Biotechnol. 77(2-3): 255-263 Penicillium citrinum a-D-1,2-manosidasa 5,0 Yoshida y col., 1993 Biochem.

J. 290(Pt 2): 349-354

C. elegans a-1,2-manosidasa 5,5 Figura 11 en el presente documento

Aspergillus nidulans a-1,2-manosidasa 6,0 Eades y Hintz, 2000 Gene 255(1 ): 25-34 lA(Golgi) de a-1,2-manosidasa 6,0

Homo sapiens

IB (Golgi) de a-1,2-manosidasa 6,0

Homo sapiens

Células de insectos a-1,2-Man6-manosidasa de 6,0 Ren y col., 1995 Biochem 34(8): 2489-Lepidópteros Tipo I 2495 Homo sapiens a-D-manosidasa 6,0 Chandrasekaran y col., 1984

Cancer Res. 44(9): 4059-68 Xanthomonas manihotis a-1,2,3-manosidasa 6,0 Patente de Estados Unidos Nº

6.300.113 Drosophila melanogaster a-1,2-manosidasa 6,2 Indicado en el presente documento IB (Golgi) de Ratón a-1,2-manosidasa 6,5 Schneikert y Herscovics, 1994. 4(4):

445-50 Bacillus sp. (secretada) a-D-1,2-manosidasa 7,0 Maruyama y col., 1994 Carbohydrate Res. 251: 89-98

En una realización preferida, una enzima particular o dominio catalítico se dirige a un emplazamiento subcelular en la célula huésped por medio de una construcción de fusión quimérica que codifica una proteína que comprende un

10 péptido señal de dirección celular que no está normalmente asociado con el dominio enzimático. Preferiblemente, una enzima o dominio se dirige al RE, el Golgi temprano, medio o tardío o el aparato de Golgi trans de la célula huésped.

En una realización más preferida, la enzima de glicosilación dirigida es una manosidasa, glicosiltransferasa o una glicosidasa. En una realización especialmente preferida, la actividad manosidasa se dirige al RE o Golgi cis, donde 15 ocurren las reacciones tempranas de glicosilación. Mientras que este procedimiento es útil para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped no humana, se apreciará que el procedimiento que se describe

que también es útil más generalmente para modificar los perfiles de carbohidrato de una glicoproteína en cualquier célula huésped eucariota, incluyendo células huésped humanas.

La secuencia de dirección que media en la retención de proteínas en determinados organelos de la ruta secretora de la célula huésped se conoce bien y se ha descrito en la bibliografía científica y bases de datos públicas, como se

5 ha analizado con más detalle más adelante con respecto a bibliotecas para selección de secuencias de dirección y enzimas dirigidas. Tales secuencias de dirección subcelular se pueden usar solas o en combinación para dirigir una enzima de glicosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma) a un emplazamiento subcelular particular en una célula huésped, es decir, especialmente a uno donde la enzima tendrá una actividad potenciada u óptima basándose en el pH óptimo o la presencia de otros factores estimulantes.

10 Cuando se intenta cortar las estructuras con alto contenido en manosa para producir Man5GlcNAc2 en el RE o el aparato de Golgi de una célula huésped tal como S. cerevisiae, por ejemplo, se puede elegir cualquier enzima o combinación de enzimas que (1) tenga un pH óptimo suficientemente cercano (es decir entre pH 5,2 y pH 7,8) y (2) se conoce que genera, sola o en conjunto, la estructura de Man5GlcNAc2 isomérica específica necesaria para aceptar la adición posterior de GlcNAc por GnTI. Cualquier enzima o combinación de enzimas que demuestre que

15 genera una estructura que se puede convertir en GlcNAcMan5GlcNAc2 por GnTI in vitro podría constituir una elección apropiada. Este conocimiento se puede obtener a partir de la bibliografía científica o de forma experimental.

Por ejemplo, se puede determinar si una manosidasa potencial puede convertir Man8GlcNAc2-2AB (2aminobenzamida) en Man5GlcNAc2-AB y después verificar que la estructura de Man5GlcNAc2-2AB obtenida pueda

20 servir como un sustrato para GnTI y UDP-GlcNAc para producir GlcNAcMan5GlcNAc2 in vitro. Manosidasa IA a partir de una fuente humana o murina, por ejemplo, sería una elección apropiada (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). Los ejemplos descritos en el presente documento utilizan oligomanosa enlazada a N marcada con 2aminobenzamida seguido por análisis de HPLC para realizar esta determinación.

Tabla 4. Emplazamiento celular y pH óptimo de diversas enzimas relacionadas con la glicosilación de S. 25 cerevisiae.

Gen Actividad Emplazamiento pH óptimo Referencias

KTR1 a-1,2-manosiltransferasa Golgi 7,0 Romero y col. (1997) Biochem. J. 321 (Pt 2): 289-295

MNS1 a-1,2-manosidasa RE 6,5

CWH41 glicosidasa I RE 6,8 manosiltransferasa Golgi 7-8 Lehele y Tanner (1974) Biochim. Biophys. Acta 350(1 ): 225-235

KRE2 a-1,2-manosiltransferasa Golgi 6,5-9,0 Romero y col. (1997) Biochem. J. 321 (Pt 2): 289-295

Por consiguiente, una enzima de glicosilación tal como una enzima a-1,2-manosidasa usada de acuerdo con la invención tiene una actividad óptima en un pH de entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, la enzima tiene una actividad óptima a un pH de entre 5,5 y 7,5. La enzima manosidasa de C. elegans, trabaja bien en los

30 procedimientos de la invención y tiene un pH óptimo aparente de aproximadamente 5,5. Las manosidasas preferidas incluyen las que se enumeran en la Tabla 3 que tienen un pH óptimo apropiado, por ejemplo, Aspergillus nidulans, IA (Golgi) de Homo sapiens, IB (Golgi) de Homo sapiens, células de insectos Lepidópteros (IPLB-SF21AE), Homo sapiens, IB (Golgi) de ratón, Xanthomonas manihotis, Drosophila melanogaster y C. elegans.

El experimento que ilustra el pH óptimo de una enzima a-1,2-manosidasa se describe en el Ejemplo 7. Una 35 proteína de fusión quimérica BB27-2 (MNN10 (s) de Saccharomyces/ manosidasa IB ∆31 de C. elegans), que se filtra al medio se sometió a diversos intervalos de pH para determinar la actividad óptima de la enzima. Los resultados del experimento muestran que la a-1,2-manosidasa tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,5 para su función (Figura 11).

En una realización preferida, un gen de manosidasa único clonado se expresa en el organismo huésped. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable expresar varios genes de manosidasa diferentes o varias copias de un gen particular, para conseguir la producción adecuada de Man5GlcNAc2. En los casos en los que se usan múltiples genes, las manosidasas codificadas preferiblemente tienen pH óptimos dentro del intervalo preferido de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 8,0 o especialmente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,5. Las actividades manosidasa preferidas incluyen a-1,2-manosidasas obtenidas a partir de ratón, seres humanos, Lepidoptera, Aspergillus nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum, X. laevis o A. nidulans.

Alteración In Vivo de glicosilación de células huésped usando una biblioteca de ADN combinatoria

La presente solicitud describe además una o más bibliotecas de ácido nucleico. Una característica ejemplar de una biblioteca de ácido nucleico combinatoria de la invención es que la misma comprende secuencias que codifican péptidos señal de dirección celulares y secuencias que codifican proteínas que se tienen que dirigir (por ejemplo, enzimas o dominios catalíticos de las mismas, incluyendo, pero sin limitación, las que median la glicosilación).

Se describe que una biblioteca de ácido nucleico combinatoria comprende: (a) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes péptidos señal de dirección celular; y (b) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se tiene que dirigir. Se describe que una biblioteca de ácido nucleico combinatoria comprende: (a) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular y (b) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido que se tiene que dirigir a una célula huésped. Como se ha descrito adicionalmente más adelante, una secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de (a) y una secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de (b) se ligan para producir una o más construcciones de fusión que codifican un péptido señal de dirección celular unido funcionalmente a un domino polipeptídico de interés. Un ejemplo de un enlace funcional es cuando el péptido señal de dirección celular se liga con el dominio polipeptídico de interés en el mismo marco de lectura traduccional (“en marco”).

Se describe una biblioteca de ADN combinatoria que expresa una o más proteínas de fusión que comprenden péptidos señal de dirección celular ligados en fase a dominios enzimáticos catalíticos. La proteína de fusión codificada puede comprender un dominio catalítico de una enzima implicada en modificación de N-glicanos de mamífero o similares a humano. Se describe que el dominio catalítico se obtiene a partir de una enzima seleccionada entre el grupo constituido por manosidasas, glicosiltransferasas y otras glicosidasas que se liga en fase a uno o más péptidos señal de dirección. El domino enzimático puede ser exógeno y/o endógeno a la célula huésped. Un péptido señal particularmente preferido es uno que está normalmente asociado con una proteína que experimenta transporte de RE a Golgi.

Se describe que la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención se usa para producir y localizar in vivo enzimas implicadas en la modificación de N-glicano similar a mamífero o a humano. Las construcciones de fusión de la biblioteca de ADN combinatoria se modifican por ingeniería genética de forma que las enzimas codificadas se localizan en el RE, Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped en la que los mismos están implicados en la producción de N-glicano particulares o una glicoproteína de interés. La localización de enzimas modificadoras de Nglicano de la presente invención se consigue a través de un mecanismo de anclaje o a través de interacción proteína-proteína donde el péptido de localización construido a partir de la biblioteca de ADN combinatoria se localiza en un organelo deseado de la ruta secretora tal como el RE, Golgi o la red de Golgi trans.

Un ejemplo de un N-glicano útil, que se produce eficazmente en cantidades suficientes para modificación adicional mediante reacciones de glicosilación similares a humano (complejas) es Man5GlcNAc2. Se necesita una cantidad suficiente de Man5GlcNAc2 en una glicoproteína de interés para procesamiento de tipo humano adicional in vivo (por ejemplo, más del 30% en mol). El intermedio Man5GlcNAc7 se puede usar como un sustrato para modificación de N-glicano adicional para producir GlcNAcMan5GlcNAc2 (Figura 1B; véase anteriormente). Por consiguiente, se describe que la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención se puede usar para producir enzimas que posteriormente producen GlcNAcMan5GlcNAc2 u otros N-glicanos complejos deseados en una cantidad útil.

Un aspecto adicional de las construcciones de fusión producidas usando una biblioteca de ADN combinatoria es que las mismas posibilitan actividad de corte suficiente y, con frecuencia, casi completa de N-glicano intracelular en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Las construcciones de fusión producidas mediante la biblioteca de ADN combinatoria codifican una enzima de glicosilación, por ejemplo, una manosidasa, que se localiza eficazmente en un compartimento de célula huésped intracelular y, de ese modo, muestra muy poca o, preferiblemente, ninguna actividad extracelular. Se demuestra que las construcciones de fusión descritas en la presente solicitud que codifican enzima manosidasa se localizan donde los N-glicanos se modifican, concretamente, el RE y el Golgi. Las enzimas de fusión descritas se dirigen a tales organelos particulares en la ruta secretora donde las mismas localizan y actúan sobre los N-glicanos tales como Man8GlcNAc2 para producir Man5GlcNAc2 en una glicoproteína de interés.

Las enzimas producidas mediante la biblioteca de ADN combinatoria como se ha descrito en el presente documento pueden modificar N-glicanos en una glicoproteína de interés como se muestra para las proteínas K3 o IFN-1 expresadas en P. pastoris, como se muestra en las Figuras 5 y 6, respectivamente (véanse también los Ejemplos 2 y 4). Sin embargo, se aprecia que otros tipos de glicoproteínas incluyendo, sin limitación, eritropoyetina, citoquinas tales como interferón-a, interferón-1, interferón-y, interferón-w y CSF de granulocitos, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor mieloide 1, osteoprotegerina, a-1 antitripsina, ADNasa II, a-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína de unión a TNF aka 1), TACI-lg (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículo), GM-CSF, GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1), agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, fusión de Fc de receptor de TNF soluble aka), ATIII, Trombina rh, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Ig de Antígeno 4 asociado con Linfocito T Citotóxico) se pueden glicosilar de esta manera.

Construcción de una Biblioteca de ADN Combinatoria de Construcciones de Fusión:

Una biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión presenta uno o más péptidos señal de dirección celular (“péptidos de dirección”) generalmente obtenidos a partir de dominios N terminales de proteínas nativas (por ejemplo, realizando supresiones C terminales). Sin embargo, algunos péptidos de dirección se obtienen a partir del extremo C de proteínas nativas (por ejemplo, SEC12). Las proteínas unidas a membrana del RE o del Golgi preferiblemente se usan como una fuente para dirigir secuencias peptídicas. Estas proteínas tienen secuencias que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y una región de tronco (sr) que varían en longitud. Estas regiones se reconocen por alineamiento de secuencias de proteína y comparaciones con homólogos conocidos y/u otras proteínas localizadas (por ejemplo, comparando representaciones de hidrofobicidad).

Los péptidos de dirección se indican en el presente documento como cortos (s), medios (m) y largos (1) con relación a las partes de una membrana de tipo II. La secuencia de péptido de dirección indicada como corta (s) corresponde al dominio transmembrana (tmd) de la proteína unida a membrana. La secuencia de péptido de dirección indicada como larga (1) corresponde a la longitud del domino transmembrana (tmd) y la región de tronco (sr). La secuencia de péptido de dirección indicada como media (m) corresponde al dominio transmembrana (tmd) y aproximadamente la mitad de la longitud de la región de tronco (sr). Las regiones de dominio catalítico se indican en el presente documento mediante el número de supresión nucleotídica con respecto a su enzima de glicosilación de tipo silvestre.

Sub-bibliotecas

En algunos casos, una biblioteca de ácido nucleico combinatoria como se ha descrito en el presente documento se puede ensamblar directamente a partir de genes existentes o de tipo silvestre. La biblioteca de ADN se ensambla a partir de la fusión de dos o más sub-bibliotecas. Mediante el ligamiento en fase de las sub-bibliotecas, es posible crear un gran número de construcciones genéticas novedosas que codifican dominios de proteína dirigidas útiles tales como aquellas que tienen actividades de glicosilación.

Sub-Bibliotecas de Dominio Catalítico que Codifican Actividades de Glicosilación

Una sub-biblioteca útil incluye secuencias de ADN que codifican enzimas tales como glicosidasas (por ejemplo, manosidasas), glicosiltransferasas (por ejemplo, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glicosiltransferasas), GlcNAc transferasas y sialiltransferasas. Los dominios catalíticos se pueden seleccionar entre el huésped que se tiene que modificar por ingeniería genética, así como entre otros organismos relacionados y no relacionados. Todas las enzimas de mamíferos, plantas, insectos, reptiles, algas u hongos son útiles y se deben elegir para representar un amplio espectro de propiedades bioquímicas con respecto a temperatura y pH óptimos. Los genes se pueden truncar para proporcionar fragmentos, algunos de los cuales codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Mediante la remoción de secuencias de dirección endógenas, las enzimas después se pueden redirigir y expresar en otros loci celulares.

La elección de tales dominios catalíticos puede estar guiada por el conocimiento del entorno particular en el que el dominio catalítico tendrá que posteriormente activarse. Por ejemplo, si una enzima de glicosilación particular tiene que ser activa en el Golgi tardío y todas las enzimas conocidas del organismo huésped en el Golgi tardío tienen un pH óptimo determinado o el Golgi tardío se conoce que tiene un pH particular, entonces se elige un dominio catalítico que muestra actividad adecuada y, preferiblemente máxima, a ese pH, como se ha descrito anteriormente.

Sub-Bibliotecas de secuencia de péptido de dirección

Otra sub-biblioteca útil incluye secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal de dirección que dan como resultado la localización de una proteína en un emplazamiento particular dentro del RE, Golgi o red de Golgi trans. Estos péptidos de dirección se pueden seleccionar entre el organismo huésped que se tiene que modificar por ingeniería genética así como entre otros organismos relacionados o no relacionados. En general, tales 5 secuencias caen en tres categorías: (1) secuencias N-terminal que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y parte o toda una región de tronco (sr), los cuales juntos o individualmente anclan las proteínas a la membrana interna (luminal) del Golgi; (2) señales de recuperación que generalmente se encuentran en el extremo C tales como el tetrapéptido HDEL (SEC ID Nº: 105) o KDEL (SEC ID Nº: 106) y (3) regiones transmembrana de diversas proteínas, por ejemplo, transportadores de azúcar nucleotídico, que se conoce que se

10 localizan en el Golgi.

En el primer caso, cuando el péptido señal está constituido por diversos elementos (ct, tmd y sr), la biblioteca se diseña de forma que la ct, el tmd y diversas partes de la región de tronco estén representadas. Por consiguiente, una realización preferida de la sub-biblioteca de secuencias de péptido de dirección incluye secuencias de ct, tmd y/o sr de proteínas unidas a membrana del RE o Golgi. En algunos casos, puede ser deseable proporcionar a la

15 sub-biblioteca diversas longitudes de secuencia sr. Esto se puede conseguir mediante PCR usando cebadores que se unen al extremo 5’ del ADN que codifica la región citosólica y empleando una serie de cebadores opuestos que se unen a diversas partes de la región de tronco.

Otras fuentes útiles de secuencias de péptidos de dirección incluyen péptidos señal de recuperación, por ejemplo, los tetrapéptidos HDEL (SEC ID Nº: 105) o KDEL (SEC ID Nº: 106), que típicamente se encuentran en el extremo C

20 de proteínas que se transportan de forma retrógrada en el RE o Golgi. Otras fuentes de secuencias de péptidos de dirección incluyen (a) proteínas de membrana de tipo II, (b) las enzimas enumeradas en la Tabla 3, (c) transportadores de azúcares nucleotídicos transmembrana que se localizan en el Golgi y (d) secuencias a las que se hace referencia en la Tabla 5.

Tabla 5. Fuentes de secuencias de dirección compartimentales útiles

Gen o Secuencia: Organismo Función Emplazamiento del producto Génico

MNSI: A. nidulans a-1,2-manosidasa RE

MNSI: A. niger a-1,2-manosidasa RE

MNSI: S. cerevisiae a-1,2-manosidasa RE

GLSI: S. cerevisiae glicosidasa RE

GLSI: A. niger glicosidasa RE

GLSI: A. nidulans glicosidasa RE

HDEL (SEC ID Nº:105) en el extremo C: Universal hongos en señal de recuperación RE

SEC12: S. cerevisiae proteína de vesícula COPII RE/Golgi

SEC12: A. niger proteína de vesícula COPII RE/Golgi

OCH1: S. cerevisiae 1,6-manosiltransferasa Golgi (cis)

OCH1: P. pastoris 1,6-manosiltransferasa Golgi (cis)

MNN9: S. cerevisiae complejo de manosiltransferasa 1,6- Golgi

MNN9: A. niger no determinado Golgi

VAN1: S. cerevisiae no determinado Golgi

VAN1: A. niger no determinado Golgi

ANP1: S. cerevisiae no determinado Golgi

HOC1: S. cerevisiae no determinado Golgi

MNN10: S. cerevisiae no determinado Golgi

MNN10: A. niger no determinado Golgi

MNN11: S. cerevisiae no determinado Golgi (cis)

MNN11: A. niger no determinado Golgi (cis)

MNT1: S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Golgi (cis, medio)

KTR1: P. pastoris no determinado Golgi (medio)

KRE2: P. pastoris no determinado Golgi (medio)

KTR3: P. pastoris no determinado Golgi (medio)

MNN2: S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Golgi (medio)

KTR1: S. cerevisiae no determinado Golgi (medio)

KTR2: S. cerevisiae no determinado Golgi (medio)

MAW1: S. cerevisiae 1,3-manosiltransferasa Golgi (trans)

MNN6: S. cerevisiae Fosfomanosiltransferasa Golgi (trans)

2,6 ST: H. sapiens 2,6-sialiltransferasa red de Golgi trans

UDP-Gal T: S. pombe Transportador de UDP-Gal Golgi

En cualquier caso, se describe que se seleccionan secuencias de péptidos de dirección que son apropiadas para la actividad o actividades enzimáticas particulares para funcionar óptimamente dentro de la secuencia de las reacciones de glicosilación deseadas. Por ejemplo, para desarrollar un microorganismo huésped modificado capaz 5 de sialilación terminal de N-glicanos nacientes, un procedimiento que ocurre en el Golgi tardío en seres humanos, es deseable utilizar una sub-biblioteca de secuencias de péptido de dirección obtenidos a partir de proteínas de Golgi tardío. De forma similar, el corte de Man8GlcNAc2 mediante una a-1,2-manosidasa para producir Man5GlcNAc2 es una etapa temprana en la formación de N-glicano complejo en seres humanos (Figura 1B). Por lo tanto, es deseable que esta reacción ocurra en el RE o Golgi temprano de un microorganismo huésped modificado

10 por ingeniería genética. Se usa una sub-biblioteca que codifica señales de retención de RE y Golgi temprano.

Una serie de construcciones de proteína de fusión (es decir, una biblioteca de ADN combinatoria) después se construye uniendo funcionalmente una o una serie de secuencias de péptidos de dirección a una o una serie de secuencias que codifican dominios catalíticos. Esto se consigue mediante el ligamiento en fase de una subbiblioteca que comprende ADN que codifica secuencias de péptido de dirección (anteriormente) con una sub

15 biblioteca que comprende ADN que codifica enzimas de glicosilación o fragmentos catalíticamente activos de las mismas (véase más adelante).

La biblioteca resultante comprende genes sintéticos que codifican proteínas de fusión que contienen secuencias de péptidos de dirección. En algunos casos es deseable proporcionar una secuencia de péptido de dirección en el extremo N de una proteína de fusión o en otros casos en el extremo C. En algunos casos, las secuencias de

20 péptidos de dirección se pueden insertar dentro de la fase de lectura abierta de una enzima, con la condición de que la estructura de proteína de dominios plegados individuales no se altere. Cada tipo de proteína de fusión se construye (de una manera dirigida gradualmente o semialeatoria) y las construcciones óptimas se pueden seleccionar tras la transformación de células huésped y la caracterización de patrones de glicosilación en células transformadas usando procedimientos de la invención.

25 Generación de diversidad de secuencia adicional

El procedimiento descrito es más eficaz cuando un ácido nucleico, por ejemplo, una biblioteca de ADN transformada en el huésped contiene una gran diversidad de secuencias, aumentando de ese modo la probabilidad de que al menos un transformante mostrará el fenotipo deseado. Por ejemplo, las mutaciones de aminoácido único pueden alterar drásticamente la actividad de enzima de procesamiento de glicoproteínas (Romero y col. (2000) J. Biol. Chem. 275(15): 11071-4). Por consiguiente, antes de la transformación, una biblioteca de ADN o una subbiblioteca constituyente se puede someter a una o más técnicas para generar diversidad de secuencia adicional. Por ejemplo, se pueden realizar uno o más ciclos de transposición de genes, PCR propensa a error, mutagénesis in vitro u otros procedimientos para generar diversidad de secuencias, para obtener una diversidad de secuencias mayor dentro de la combinación de construcciones de fusión.

Secuencias de control de expresión

Además de las secuencias de fase de lectura abierta descritas anteriormente, cada construcción de biblioteca puede estar provista de secuencias de control de expresión, tales como promotores, terminadores de transcripción, potenciadores, sitios de unión a ribosoma y otras secuencias funcionales que pueden ser necesarias para asegurar la transcripción y traducción eficaz de la proteína de fusión tras la transformación de construcciones de fusión en el organismo huésped.

Se seleccionan componentes de vector adecuados, por ejemplo, marcadores seleccionables, secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores, potenciadores, terminadores y similares) y, opcionalmente, secuencias necesarias para replicación autónoma en una célula huésped, como una función de cuál célula huésped particular se elige. Los criterios de selección para los componentes de vector adecuados para uso en una célula huésped de mamífero o eucariota inferior particular son de rutina. Las células huésped eucariotas inferiores preferidas de la invención incluyen Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp. Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. Cuando el huésped es Pichia pastoris, los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOX1, AOX2, GAPDH y P40.

Marcadores seleccionables

También se ha descrito que cada construcción puede estar provista de al menos un marcador seleccionable, tal como un gen para impartir resistencia a fármaco o para complementar una lesión metabólica de huésped. La presencia del marcador es útil en la selección posterior de transformantes; por ejemplo, en levadura se pueden usar los genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLA, o SH BLE. Se conocen y están disponibles una multitud de marcadores seleccionables para uso en levaduras, hongos, plantas, insectos, mamíferos y otras células huésped eucariotas.

Transformación

La biblioteca de ácido nucleico después se transforma en el organismo huésped. En levaduras, se puede usar cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, tal como electroporación, el método de cloruro de litio o el método de esferoplasto. En hongos filamentosos y células vegetales, los procedimientos convencionales incluyen bombardeo de partículas, electroporación y transformación mediada por agrobacterium. Para producir una cepa estable adecuada para cultivo de alta densidad (por ejemplo, fermentación en levadura), es deseable integrar las construcciones de la biblioteca de ADN en el cromosoma del huésped. En una realización preferida, la integración ocurre a través de recombinación homóloga usando técnicas bien conocidas en el campo. Por ejemplo, los elementos de biblioteca de ADN están provistos de secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo huésped. De esta manera, la integración ocurre en un sitio definido del genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o esenciales.

Se describe que el ADN de biblioteca se integra en el sitio de un gen indeseado en un cromosoma huésped, logrando la alteración o supresión del gen. Por ejemplo, la integración en los sitios de los genes OCH1, MNN1 o MNN4 permite la expresión del ADN de biblioteca deseada mientras que evita la expresión de enzimas implicadas en la hipermanosilación de glicoproteínas en levaduras. Además se describe que el ADN de biblioteca se puede introducir en el huésped a través de una molécula de ácido nucleico, plásmido, vector (por ejemplo, vector viral o retroviral), cromosoma y se puede introducir como una molécula de ácido nucleico autónoma o mediante integración homóloga o aleatoria en el genoma del huésped. En cualquier caso, generalmente es deseable incluir con cada construcción de biblioteca de ADN al menos un gen de marcador seleccionable para permitir la selección fácil de organismos huésped que se han transformado de forma estable. Los genes de marcadores reciclables tales como URA3, que se pueden seleccionar por o en contra, son especialmente adecuados.

Procedimientos de exploración y selección

Después de la transformación de la cepa huésped con la biblioteca de ADN, se seleccionan los transformantes que presentan un fenotipo de glicosilación deseado. La selección se puede realizar en una etapa única o mediante una serie de etapas de enriquecimiento y/o agotamiento fenotípico usando cualquiera de una diversidad de ensayos o procedimientos de detección. La caracterización fenotípica se puede realizar manualmente o usando equipo de exploración de alto rendimiento automático. Comúnmente, un microorganismo huésped presenta N-glicanos de proteína en la superficie celular, donde se localizan diversas glicoproteínas.

Por ejemplo, se pueden explorar células que tengan la concentración más alta de GlcNAc terminal en la superficie celular o las células que secreten la proteína con el contenido más alto de GlcNAc terminal. Una exploración de este tipo puede estar basada en un procedimiento visual, como un procedimiento de tinción, la capacidad de unir anticuerpos de unión a GlcNAc terminales específicos o lectinas conjugadas a un marcador (tales lectinas están disponibles en E.Y. Laboratories Inc., San Mateo, CA), la capacidad reducida de lectinas específicas de unirse a restos de manosa terminales, la capacidad de incorporar un azúcar marcado radiactivamente in vitro, unión alterada a colorantes o superficies cargadas o se puede conseguir usando un dispositivo de Separación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) junto con una lectina o anticuerpo marcado con fluoróforo (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14): 7888-7892).

Por consiguiente, las células intactas se pueden explorar para un fenotipo de glicosilación deseado exponiendo las células a una lectina o anticuerpo que se une específicamente al N-glicano deseado. Una amplia diversidad de lectinas específicas de oligosacáridos está disponible en el mercado (por ejemplo, en EY Laboratories, San Mateo, CA). Como alternativa, los anticuerpos para N-glicanos humanos o animales específicos están disponibles en el mercado o se pueden producir utilizando técnicas convencionales. Una lectina o anticuerpo apropiado se puede conjugar a una molécula informadora, tal como un cromóforo, fluoróforo, isótopo radiactivo o una enzima que tenga un sustrato cromogénico (Guillen y col., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14): 7888-7892).

Después la exploración se puede realizar usando procedimientos analíticos tales como espectrofotometría, fluorimetría, separación de células activadas por fluorescencia o recuento de escintilación. En otros casos, puede ser necesario analizar glicoproteínas o N-glicanos aislados a partir de células transformadas. El aislamiento de proteínas se puede realizar mediante técnicas conocidas en el campo. En una realización preferida, se secreta una proteína informadora en el medio y se purifica mediante cromatografía por afinidad (por ejemplo, cromatografía por afinidad a Ni o a glutatión-S-transferasa). En los casos en los que se prefiere un N-glicano aislado, se puede usar una enzima tal como endo-1-N-acetilglucosaminidasa (Genzyme Co., Boston, MA; New England Biolabs, Beverly, MA) para escindir los N-glicanos de las glicoproteínas. Las proteínas o N-glicanos aislados después se pueden analizar mediante cromatografía líquida (por ejemplo, HPLC), espectroscopía de masa u otros medios adecuados. La Patente de los Estados Unidos Nº 5.595.900 muestra varios procedimientos mediante los cuales las células con estructuras de carbohidrato extracelular deseadas se pueden identificar. En una realización preferida, se usa espectrometría de masa de MALDI-TOF para analizar los N-glicanos escindidos.

Antes de la selección de un transformante deseado, puede ser deseable agotar la población de células transformadas que tienen fenotipos indeseados. Por ejemplo, cuando se usa el procedimiento para modificar por ingeniería genética una actividad manosidasa funcional en células, los transformantes deseados tendrán niveles menores de manosa en glicoproteína celular. La exposición de la población transformada a un isótopo radiactivo mortal de manosa en el medio agota la población de transformantes que tienen el fenotipo indeseado, es decir, niveles elevados de manosa incorporada (Huffaker TC y Robbins PW., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1983 Dic; 80(24): 7466-70). Como alternativa, se puede usar una lectina o anticuerpo citotóxico, dirigido contra un N-glicano indeseable, para agotar una población transformada de fenotipos indeseados (por ejemplo, Stanley P y Siminovitch

L. Somatic Cell Genet 1977 Jul; 3(4): 391 -405). La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 muestra varios procedimientos en los que las células con unas estructuras de carbohidrato extracelular deseadas se pueden identificar. La realización de esta estrategia de forma repetida permite la modificación por ingeniería genética secuencial de más y más glicanos complejos en eucariotas inferiores.

Por ejemplo, para detectar células huésped que tienen en su superficie un grado elevado del intermedio de Nglicano de tipo humano GlcNAcMan3GlcNAc2 se pueden seleccionar transformantes que permiten la transferencia más eficaz de GlcNAc mediante GlcNAc Transferasa desde UDP-GlcNAc en un ensayo celular in vitro. Esta exploración se puede realizar cultivando las células que portan la biblioteca transformada en presión selectiva en una placa de agar y transfiriendo colonias individuales a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después de cultivar las células, las células se centrifugan, las células se resuspenden en tampón y después de la adición de UDP-GlcNAc y GnTII, se determina la liberación de UDP mediante HPLC o un ensayo ligado a enzima para UDP. Como alternativa, se pueden usar UDP-GlcNAc y GnTII marcados radiactivamente, lavar las células y después buscar la liberación de GlcNAc radiactivo mediante N-actilglucosaminidasa. Todo esto se puede realizar manualmente o se puede automatizar a través del uso de equipo de exploración de alto rendimiento. Los transformantes que liberan más UDP en el primer ensayo o más GlcNAc marcado radiactivamente en el segundo ensayo se espera que tengan un alto grado de GlcNAcMan3GlcNAc2 en su superficie y, por tanto, constituyen el fenotipo deseado. Se pueden adaptar ensayos similares para buscar también los N-glicanos en proteínas secretadas.

Como alternativa, se puede usar cualquier otra exploración adecuada tal como un ensayo de unión a lectina que sea capaz de revelar patrones de glicosilación alterados en la superficie de células transformadas. En este caso la unión reducida de lectinas específicas a manosas terminales puede ser una herramienta de selección adecuada. Lectina de Galantus nivalis se une específicamente a a-1,3 manosa terminal, que se espera que esté reducida si existe suficiente actividad manosidasa II presente en el Golgi. También se puede aumentar el contenido de transformantes deseados realizando una etapa de separación cromatográfica que permite la remoción de células que contienen un contenido de manosa terminal elevado. Esta etapa de separación se podría realizar con una columna de lectina que se una específicamente a células con un contenido de manosa terminal elevado (por ejemplo, lectina de Galantus nivalis unida a agarosa, Sigma, St. Louis, MO) por encima de aquellas que tienen un contenido de manosa terminal bajo.

Además, se pueden crear directamente tales construcciones de proteína de fusión, ya que está disponible en la bibliografía científica información adicional a cerca de la localización de enzimas modificadoras de carbohidrato activas en diferentes huéspedes eucariotas inferiores. Por ejemplo, se conoce que 11,4-GalTr humana se puede fusionar al dominio de membrana de MNT, una manosiltransferasa de S. cerevisiae y localizarse en el aparato de Golgi mientras que conserva su actividad catalítica (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Si el huésped que se tiene que modificar por ingeniería genética es S. cerevisiae o un organismo relacionado, se pueden incorporar directamente tales hallazgos en la estrategia global para obtener N-glicanos complejos a partir de un huésped de este tipo. Se han identificado varios de tales fragmentos génicos en P. pastoris que están relacionados con glicosiltransferasas en S. cerevisiae y, por tanto, se podrían usar con ese propósito.

Alteración de glicosilación de célula huésped usando construcciones de fusión a partir de bibliotecas combinatorias

La construcción de una biblioteca de ADN combinatoria preferida se ilustra esquemáticamente en la Figura 2 y se describe en el Ejemplo 4. La construcción de fusión se puede unir operativamente a muchos vectores, tales como vectores de expresión bien conocidos en la técnica. Una amplia diversidad de tales construcciones de fusión se ha ensamblado durante actividades representativas como se muestra en la Tabla 6. Las combinaciones de péptidos de dirección/dominios catalíticos se pueden ensamblar para uso en la dirección de actividades de manosidasa, glicosiltransferasa y glicosidasa en el RE, Golgi y la red de Golgi trans de acuerdo con la invención. De forma sorprendente, el mismo dominio catalítico puede no tener efecto o hasta un efecto muy profundo en los patrones de N-glicosilación, dependiendo del tipo de péptido de dirección usado (véase, por ejemplo, Tabla 7, Ejemplo 4).

Construcciones de fusión de manosidasa I

Un ejemplo representativo de una construcción de fusión de manosidasa obtenida a partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pFB8, que tiene un péptido de dirección trucando SEC12(m) de Saccharomyces (988-1296 nucleótidos de SEC12 de SwissProt P11655) ligado en fase a una supresión de 187 aminoácidos Nterminal de una a-manosidasa IA de ratón (Genbank NA 6678787). Por tanto, la nomenclatura usada en el presente documento se refiere a la región de péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como SEC 12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón. La proteína de fusión codificada se localiza en el RE por medio de la secuencia de péptido de dirección SEC12 mientras conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir N-glicanos in vivo que tienen una estructura de Man3GlcNAc2 (Ejemplo 4; Figuras 6F y 7B).

La construcción de fusión pGC5, MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón, es otro ejemplo de una construcción de fusión que tiene actividad de corte de manosidasa intracelular (Ejemplo 4; Figuras 5D y 8B). La construcción de fusión pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C. elegans) es otro ejemplo de una construcción de fusión eficaz capaz de producir N-glicanos in vivo que tienen una estructura de Man5GlcNAc2. Mediante la creación de una biblioteca de ADN combinatoria de estas y otras construcciones de fusión de manosidasa tales de acuerdo con la invención, un experto puede distinguir y seleccionar aquellas construcciones que tengan actividad de corte intracelular óptima de aquellas que tengan actividad relativamente baja o ninguna actividad. Los procedimientos que usan en bibliotecas de ADN combinatorias de la invención son provechosos debido a que sólo unas pocas construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.

Además, la actividad de corte de manosidasa puede ser específica para una proteína particular de interés. Por tanto, se debe apreciar además que no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de manosidasa pueden funcionar igualmente bien para producir la glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés. Por consiguiente, una proteína de interés se puede introducir en una célula huésped transfectada con una biblioteca de ADN combinatoria para identificar una o más construcciones de fusión que expresan una actividad manosidasa óptima para la proteína de interés. Un experto en la materia será capaz de producir y seleccionar construcción o construcciones de fusión óptimas usando el enfoque de biblioteca de ADN combinatoria descrito en el presente documento.

Además, es evidente que se pueden preparar otras construcciones de fusión tales que muestran dominios catalíticos de manosidasa activos localizados (o más generalmente, dominios de cualquier enzima) usando técnicas tales como las que se han ilustrado en el Ejemplo 4 y se han descrito en el presente documento. Será un asunto de experimentación de rutina para un experto en la materia preparar y usar la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención, para optimizar, por ejemplo, la producción de Man5GlcNAc2 a partir de una biblioteca de construcciones de fusión en un vector de expresión particular introducido en una célula huésped particular.

Construcciones de fusión de glicosiltransferasa

De forma similar, se preparó una biblioteca de ADN combinatoria de glicosiltransferasa usando los procedimientos de la invención. Una biblioteca de ADN combinatoria de secuencias obtenidas a partir de actividades glicosiltransferasa I (GnTI) se ensamblaron con péptidos de dirección y se exploraron para la producción eficaz en una célula huésped eucariota inferior de una estructura de N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 en una glicoproteína marcadora. Se ha identificado una construcción de fusión, MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humano (Ejemplo 8) que mostraba que producía GlcNAcMan5GlcNAc2 (pPB104). Se ensambló una gran diversidad de tales construcciones de fusión de GnTI (Ejemplo 8, Tabla 10). Otras combinaciones de péptido de dirección/dominios catalíticos de GnTI se pueden ensamblar fácilmente preparando una biblioteca de ADN combinatoria. También es evidente para un experto en la materia que otras construcciones de fusión tales que muestran actividad glicosiltransferasa se pueden preparar como se ha demostrado en el Ejemplo 8. Será un asunto de experimentación de rutina para un experto en la materia el uso de un procedimiento de biblioteca de ADN combinatoria descrito en el presente documento para optimizar la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 usando una construcción de fusión seleccionada en un vector de expresión y una línea de células huésped particular.

Como se ha indicado anteriormente para las construcciones de fusión de manosidasa, no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de GnTI funcionarán igualmente bien para producir la glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés como se ha descrito en el presente documento. Sin embargo, un experto en la materia será capaz de producir y seleccionar construcción o construcciones de fusión óptimas usando un enfoque de biblioteca de ADN como se ha descrito en el presente documento. El Ejemplo 8 ilustra una realización preferida de una biblioteca de ADN combinatoria que comprende péptidos de dirección y construcciones de fusión de domino catalítico de GnTI implicados en la producción de glicoproteínas con estructura principalmente de GlcNAcMan5GlcNAc2.

Uso de Múltiples Construcciones de Fusión para Alterar la Glicosilación de Células Huésped En otro ejemplo del uso de los procedimientos y bibliotecas de la invención para alterar la glicosilación de células huésped, una cepa de

P. pastoris con una supresión de OCH1 que expresa una proteína informadora (K3) se transformó con múltiples construcciones de fusión aisladas a partir de bibliotecas combinatorias de la invención para convertir N-glicanos con alto contenido en manosa en N-glicanos similares a humano (Ejemplo 8). En primer lugar, la construcción de fusión de manosidasa pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) se transformó en una cepa de

P. pastoris que carecía de actividad 1,6 manosiltransferasa iniciadora (es decir, supresión och 1; Ejemplo 1). En segundo lugar, se construyó pPB103 que comprendía un gen MNN2-2 de K. lactis (Genbank NA AF106080) que codifica un transportador de UDP-GlcNAc para aumentar la producción adicional de GlcNAcMan5GlcNAc2. La adición del transportador de UDP-GlcNAc aumentó la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 significativamente en la cepa de P. pastoris como se ha ilustra en la Figura 10B. En tercer lugar, pPB104 que comprende MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humano se introdujo en la cepa. Esta cepa de P. pastoris se denomina "PBP-3."

Un experto en la materia aprecia que las células huésped tales como las cepas de levadura descritas anteriormente se pueden transformar secuencialmente y/o cotransformar con uno o más vectores de expresión. También se aprecia que el orden de transformación no es particularmente relevante en la producción de la glicoproteína de interés. El experto reconoce que las modificaciones de rutina de los procedimientos descritos en el presente documento pueden proporcionar resultados mejorados en la producción de la glicoproteína de interés.

La importancia del uso de una secuencia de péptido de dirección particular con una secuencia de dominio catalítico particular se hace fácilmente evidente a partir de los experimentos descritos en el presente documento. La biblioteca de ADN combinatoria proporciona una herramienta para construir fusiones de enzimas que están implicadas en la modificación de N-glicanos en una glicoproteína de interés, que es especialmente útil para producir glicoproteínas similares a humano. (Sin embargo, cualquier fusión de enzima se puede seleccionar usando bibliotecas y procedimientos de la invención). Los transformantes deseados que expresan a-1,2-manosidasa apropiadamente dirigida y activa producen K3 con N-glicanos en la estructura Man5GlcNAc2 como se muestra en las Figuras 5D y 5E. Esto confiere una masa molecular reducida al glicano escindido en comparación con el K3 de la cepa con supresión OCH1 parental, como se detectó mediante espectrometría de masa MALDI-TOF en la Figura 5C.

De forma similar, se usó el mismo enfoque para producir otra glicoproteína secretada: IFN-1 que comprendía principalmente Man5GlcNAc2. El Man5GlcNAc2 se retiró mediante digestión con PNGasa (Papac y col. 1998 Glycobiology 8,445-454) y se sometió a MALDI-TOF como se muestra en las Figuras 6A -6F. Un pico prominente único en 1254 (m/z) confirma la producción de Man5GlcNA2 en IFN-1 en las Figuras 6E (pGC5) (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón) y 6F (pFB8) (SEC 12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón). Además, en la cepa PBP-3 de P. pastoris que comprende pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187), pPB104 (MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humano) y pPB103 (gen MNN2-2 de K. lactis), se detectó el híbrido N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] mediante MALDI-TOF (Figura 10).

Después de identificar los transformantes con un alto grado de corte de manosa, se realizaron experimentos adicionales para confirmar que la actividad manosidasa (corte) ocurría in vivo y que no era principalmente el resultado de actividad extracelular en el medio de cultivo (Ejemplo 6; Figuras 7-9).

Construcciones de fusión de a-manosidasa II de Golgi

Como se ha descrito en la presente solicitud, se preparó una biblioteca de ADN combinatoria de a-manosidasa II de Golgi fusionando el dominio catalítico de varias enzimas manosidasa II a una serie de señales peptídicas de dirección celulares (Ejemplo 14). Las más de 500 construcciones de fusión combinatorias resultantes se introdujeron en una cepa de P. pastoris capaz de producir el precursor humano de la glicosilación compleja, GlcNAcMan5GlcNAc2 YSH-1 (Ejemplo 17) en la K3 informadora. Sólo un pequeño subgrupo de cepas (aproximadamente < 5%) fueron capaces de convertir cuantitativamente GlcNAcMan5GlcNAc2 en GlcNAcMan3GlcNAc2. Estas cepas se aislaron y se transformaron posteriormente con una biblioteca combinatoria de varios cientos de fusiones GnTII/péptido líder. La exploración para determinar la presencia de GlcNAc2Man3GlcNAc2 permitió el aislamiento de cepas que eran capaces de secretar glicano complejo homogéneo, como se ilustra mediante la cepa YSH-44 (Ejemplo 19).

Un ejemplo representativo de una construcción de fusión de a-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pKD53, que es un péptido de dirección de MNN2(s) de S. cerevisiae truncado (1 -108 nucleótidos de MNN2 de SwissProt P38069) ligado en fase a una supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una a-manosidasa II de Golgi de D. melanogaster (Genbank NA X77652). Por tanto, la nomenclatura usada en el presente documento se refiere a la región de péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como MNN2(s) de S. cerevisiae/manosidasa II ∆74 de D. melanogaster. La proteína de fusión codificada se localiza en el Golgi por medio de la secuencia de péptido de dirección de MNN2(s) mientras que conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir N-glicanos in vivo que tienen una estructura de GlcNAcMan3GlcNAc2 predominante (Ejemplo 18).

Otro ejemplo de una construcción de fusión de a-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pKD1, que es un péptido de dirección de GLS1 (s) de Saccharomyces truncado (1102 nucleótidos de GLS1 de SwissProt P53008) ligado en fase a una supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una a-manosidasa II de Golgi de D. melanogaster (Genbank NA X77652). Por tanto, la nomenclatura usada en el presente documento se refiere a la región de péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como GLS1 (s) de Saccharomyces/manosidasa II ∆74 de D. melanogaster. La proteína de fusión codificada se localiza en el Golgi por medio de la secuencia de péptido de dirección de GLS1(s) mientras que conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir in vivo N-glicanos que tienen una estructura de GlcNAcMan3GlcNAc2 predominante (Ejemplo 22).

Otro ejemplo de una construcción de fusión de a-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pKD5, que un péptido de dirección de MNS1(m) de Saccharomyces truncado (1246 nucleótidos de MNS1 de SwissProt P32906) ligado en fase a una supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una a-manosidasa II de Golgi de D. melanogaster (Genbank AN X77652). Por tanto, la nomenclatura usada en el presente documento se refiere a la región de péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa II ∆74 de D. melanogaster. La proteína de fusión codificada se localiza en el Golgi por medio de la secuencia de péptido de dirección de MNS1(m) mientras que conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir in vivo N-glicanos que tienen una estructura de GlcNAcMan3GlcNAc2 predominante (Ejemplo 23). A diferencia de la uniformidad de N-glicanos presentes en YSH-27, la Figura 21 muestra una mezcla heterogénea de N-glicanos producidos por YSH-74. Sin embargo, la actividad de corte aparentemente mediocre de esta enzima manosidasa II indica la heterogeneidad como adiciones de Mana1,1 como se ha sugerido en la Figura 23, donde el pico de GlcNAcMan3GlcNAc2 aparece después de la digestión de YSH-74 con a-1,2-manosidasa de A. saitoi. Mediante la creación de una biblioteca de ADN combinatoria de estas y otras construcciones de fusión de manosidasa de acuerdo con la invención, un experto puede distinguir y seleccionar aquellas construcciones que tienen actividad de corte intracelular óptima de aquellas que tienen actividad relativamente baja o ninguna actividad. Los procedimientos que usan bibliotecas de ADN combinatorias de la invención son provechosos debido a que sólo unas pocas construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.

Además, la actividad de corte de manosidasa puede ser específica para una proteína particular de interés. Por tanto, se ha de apreciar adicionalmente que no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de manosidasa pueden funcionar igualmente bien para producir la glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés. La Figura 18 no muestra actividad aparente en una YSH-1 de P. pastoris transformada con una construcción de fusión de a-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención pKD16, que son péptidos de dirección de MNN9(m) de Saccharomyces truncados (1-273 nucleótidos de MNN9 de SwissProt P39107) ligados en fase a una supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una amanosidasa II de Golgi de D. melanogaster (Genbank NA X77652). Por consiguiente, una proteína de interés se puede introducir en una célula huésped transformada con una biblioteca de ADN combinatoria para identificar una o más construcciones de fusión que expresan una actividad manosidasa óptima para la proteína de interés. Un experto en la materia será capaz de producir y seleccionar una construcción o construcciones de fusión óptimas usando el enfoque de biblioteca de ADN combinatoria descrito en el presente documento.

Células Huésped

Aunque la presente invención se ilustra usando un organismo huésped de P. pastoris, se ha de apreciar por los expertos en la materia que otras especies de levadura y huéspedes fúngicos se pueden alterar como se ha descrito en el presente documento para producir glicoproteínas similares a humano. Las técnicas descritas en el presente documento para identificación y alteración de genes de glicosilación de célula huésped indeseables, por ejemplo, OCH1, se entiende que se pueden aplicar para estos y/u otros genes homólogos o funcionalmente relacionados en otras cepas de levadura y hongos. Como se ha descrito en el Ejemplo 9, los genes ochl mnnl se suprimieron de K. lactis para modificar por ingeniería genética una célula huésped conduciendo a N-glicanos que se convierten completamente en Man5GlcNAc2 por 1,2-manosidasa (Figura 12C).

El gen MNN1 se clonó a partir de K. lactis como se ha descrito en el Ejemplo 9. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen MNN1 de K. lactis se muestran en las SEC ID Nº: 16 y 17, respectivamente. Usando cebadores específicos de genes, se ha preparado una construcción para suprimir el gen MNN1 del genoma de K. lactis (Ejemplo 9). Las células huésped agotadas en actividades de ochl y mnnl producen N-glicanos que tienen una estructura de Carbohidrato de Man9GlcNAc2 (véase, por ejemplo, la Figura 10). Tales células huésped se pueden modificar por ingeniería genética adicionalmente usando, por ejemplo, procedimientos y bibliotecas de la invención, para producir glicoproteínas similares a humano o mamífero.

Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y más preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen MNN1 de K. lactis (SEC ID Nº: 16) y homólogos, variantes y derivados de la misma. La solicitud también describe moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se proporcionan los polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención. Además, también se proporcionan vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, como se ha descrito adicionalmente en el presente documento. De forma similar, se proporcionan las células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una cepa huésped eucariota no humana que expresa glicoproteínas que comprenden N-glicanos modificados que se parecen a aquellos preparados por células humanas. Se contempla que se puede usar una biblioteca de ácido nucleico combinatoria como se ha descrito en el presente documento anteriormente para seleccionar construcciones que modifiquen la ruta de glicosilación en cualquier sistema de célula huésped eucariota. Por ejemplo, las bibliotecas combinatorias como se han descrito anteriormente también se pueden usar en plantas, algas e insectos y en otras células huésped eucariotas incluyendo células de mamíferos y humanas, para localizar proteínas, incluyendo enzimas de glicosilación o dominios catalíticos de las mismas, en un emplazamiento deseado a lo largo de una ruta secretora de una célula huésped. Preferiblemente, las enzimas de glicosilación o dominios catalíticos y similares se dirigen a un emplazamiento subcelular a lo largo de la ruta secretora de la célula huésped donde las mismas son capaces de funcionar y, preferiblemente, donde las mismas se diseñan o seleccionan para que funcionen más eficazmente.

Las células huésped preferidas de la presenten invención incluyen Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

Además se describe que las células de plantas e insectos también se pueden modificar por ingeniería genética para alterar la glicosilación de proteínas expresadas usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la solicitud. Se describe adicionalmente que la glicosilación en células de mamífero, incluyendo células humanas, también se puede modificar usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la solicitud. Por ejemplo, se describe para optimizar una actividad enzimática particular o modificar de otra manera las proporciones relativas de diversos N-glicanos preparados en una célula huésped de mamífero usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la invención.

Los ejemplos de modificaciones a la glicosilación que se pueden afectar usando un procedimiento de acuerdo con esta realización de la invención son: (1) modificación por ingeniería genética de una célula huésped eucariota para cortar restos de manosa de Man8GlcNAc2 para producir un N-glicano de Man5GlcNAc2; (2) modificación por ingeniería genética de una célula huésped eucariota para añadir un resto de N-acetilglucosamina (GleNAc) a Man5GlcNAc2 mediante la acción de GleNAc transferasa I; (3) modificación por ingeniería genética de una célula huésped eucariota para que exprese funcionalmente una enzima tal como una N-acetilglucosaminil Transferasa (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI), manosidasa II, fucosiltransferasa (FT), galactosiltranferasa (GalT) o una sialiltransferasa (ST).

Mediante la repetición del procedimiento, se pueden modificar por ingeniería genética rutas de glicosilación cada vez más complejas en un huésped diana, tal como un microorganismo eucariota inferior. En una realización preferida, el organismo huésped se transforma dos o más veces con bibliotecas de ADN incluyendo secuencias que codifican actividades de glicosilación. La selección de fenotipos deseados se puede realizar después de cada ciclo de transformación o, como alternativa, después de que varias transformaciones han ocurrido. Las rutas de glicosilación complejas se pueden modificar por ingeniería genética rápidamente de esta manera.

Reacciones de glicosilación secuencial

En una realización preferida, tales bibliotecas de péptido de dirección/dominio catalítico se diseñan para incorporar información existente sobre la naturaleza secuencial de las reacciones de glicosilación en eucariotas superiores. Las reacciones que se conoce que ocurren temprano en el transcurso del procesamiento de glicoproteína requieren la dirección de enzimas que catalizan tales reacciones a una parte temprana del Golgi o el RE. Por ejemplo, el corte de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2 mediante manosidasas es una etapa temprana en la formación de N-glicano complejo. Debido a que el procesamiento de proteínas se inicia en el RE y después avanza a través del Golgi temprano, medio y tardío, es deseable que esta reacción ocurra en el RE o Golgi temprano. Cuando se diseña una biblioteca para localización de manosidasa I, por ejemplo, se puede intentar que coincidan señales de dirección de RE y Golgi temprano con el dominio catalítico de manosidasa I.

Sitios de integración

Como un objetivo final de este esfuerzo de modificación por ingeniería genética está una cepa de producción de proteína sólida que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma del huésped (por ejemplo, hongo) preferiblemente implica una planificación cuidadosa. La cepa modificada por ingeniería genética probablemente puede tener que transformarse con una variedad de genes diferentes y estos genes tendrán que transformarse de una manera estable para asegurar que la actividad deseada se mantenga a través del procedimiento de fermentación. Como se ha descrito en el presente documento, cualquier combinación de diversas actividades enzimáticas deseadas se pueden modificar por ingeniería genética en el huésped de expresión de proteína fúngico, por ejemplo, sialiltransferasa, manosidasa, fucosiltransferasa, galactosiltransferasa, glicosiltransferasa, GlcNAc transferasa, transportadores específicos de RE y Golgi (por ejemplo, transportadores simportador y antiportador para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacárido activados tales como UDP-galactosa y ácido CMP-N-acetilneuramínico. Los ejemplos de los procedimientos preferidos para modificar la glicosilación en una célula huésped eucariota inferior, tal como Pichia Pastoris, se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Algunas realizaciones preferidas para modificar la glicosilación en un microorganismo eucariota inferior

Estructura Deseada: Actividades Catalíticas Adecuadas Fuentes de Secuencias de Localización Adecuadas Supresione s Génicas Adecuadas Transportadore s y/o Fosfatasas Adecuadas

Man5GlcNAc2: a-1,2- Mns1 (extremo N, OCH1 ninguno

manosidasa: S. cerevisiae) MNN4

(murina, humana, Bacillus sp., A. nidulans): Och1 (extremo N, S. cerevisiae, P. pastoris) Ktr1 Mnn9 Mnt1 (S. cerevisiae) KDEL, HDEL (extremo C) MNN6

GlcNAcMan5GlcNAc 2: GlcNAc Ochl (extremo N, OCH1 Transportador de

Transferasa I,: S. cerevisiae, MNN4 UDP-GlcNAc

(humana, murina, de rata, etc.): P. pastoris) KTR1 (extremo N) Mnn1 (extremo N, S. cerevisiae) Mnt1 (extremo N, S. cerevisiae) GDPasa (extremo N, S. cerevisiae) MNN6 (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

GlcNAcMan3GlcNAc 2: manosidasa II Ktr1 OCH1 Transportador de

Mnn1 (extremo N,: MNN4 UDP-GlcNAc

S. cerevisiae) Mnt1(extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae): MNN6 (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

GlcNAc(2-4)-Man3GlcNAc2: GlcNAc Mnn1 (extremo N, S. cerevisiae) OCH1 Transportador de

Transferasa II, III, IV, V: Mat1 (extremo N, MNN4 UDP-GlcNAc

(humana, murina): S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae) MNN6 (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

Gal(1-4)GlcNAc(2-4)-Man3GlcNAc2: 1-1,4-Galactosiltransferasa (humana) Mnn1 (extremo N, OCH1 Transportador de

S. cerevisiae): MNN4 UDP-Galactosa

Mnt1(extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae): MNN6 (humano, S. pombe)

NANA(1.4): a-2,6- KTR1 OCH1 Transportador de ácido CMP

Gal(1-4)GlcNAc(1-4)-Man3GlcNAc2: Sialiltransferasa (humana) MNN1 (extremo N, MNN4 Siálico

a-2,3-Sialiltransferasa: S. cerevisiae) MNT1 (extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) MNN1 (S. cerevisiae) MNN6 (humano)

Como cualquier estrategia para modificar por ingeniería genética la formación de N-glicanos complejos en una célula huésped tal como un eucariota inferior implica tanto la eliminación como la adición de actividades glicosiltransferasa particulares, un esquema completo intentará coordinar ambos requerimientos. Los genes que codifican enzimas que son indeseables sirven como sitios de integración potencial para genes que son deseables. Por ejemplo, la actividad de 1,6 manosiltransferasa es un sello de glicosilación en muchos eucariotas inferiores conocidos. El gen que codifica alfa-1,6 manosiltransferasa (OCH1) se ha clonado a partir de S. cerevisiae y las mutaciones en el gen dan origen a un fenotipo viable con manosilación reducida. El locus génico que codifica la actividad de alfa-1,6 manosiltransferasa es, por lo tanto, una diana principal para la integración de genes que codifican actividad glicosiltransferasa. De una manera similar, se puede elegir una variedad de otros sitios de integración cromosómicos que, basándose en un acontecimiento de alteración génica en ese locus, se espera que:

(1) mejoren la capacidad de las células de glicosilar de una manera más de tipo humano, (2) mejoren la capacidad de la célula de secretar proteínas, (3) reduzcan la proteólisis de proteínas extrañas y (4) mejoren otras características del procedimiento que faciliten la purificación o el propio procedimiento de fermentación.

Glicoproteínas diana

Los procedimientos descritos en el presente documento son útiles para producir glicoproteínas, especialmente glicoproteínas usadas terapéuticamente en seres humanos. Las glicoproteínas que tienen glicoformas específicas pueden ser especialmente útiles, por ejemplo, en la dirección de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, manosa-6fosfato ha demostrado dirigir las proteínas al lisosoma, lo que puede ser básico para la función apropiada de varias enzimas relacionadas con trastornos de almacenamiento lisosomal tales como enfermedad de Gaucher, de Hunter, de Hurler, de Scheie, de Fabry y de Tay-Sachs, para mencionar sólo unos pocos. Análogamente, la adición de uno

o más restos de ácido siálico a la cadena lateral de glicano puede aumentar la vida de una glicoproteína terapéutica in vivo después de la administración. Por consiguiente, las células huésped (por ejemplo, eucariotas inferiores o mamífero) se pueden modificar genéticamente para aumentar el alcance de ácido siálico terminal en glicoproteínas expresadas en las células. Como alternativa, el ácido siálico se puede conjugar a la proteína de interés in vivo antes de la administración usando una transferasa de ácido siálico y un sustrato apropiado. Los cambios en la composición del medio de cultivo se pueden emplear además de la expresión de las actividades enzimáticas implicadas en glicosilación de tipo humano para producir glicoproteínas que se parezcan más a formas humanas (Weikert y col. (1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung 48(8): 870880; Andersen y Goochee (1994) Cur. Opin. Biotechnol. 5: 546-549; Yang y Butler (2000) Biotechnol.Bioengin. 68(4): 370-380). Las modificaciones de glicano específicas a anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la adición de un GlcNAc bisecante) han demostrado mejorar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80), que puede ser deseable para la producción de anticuerpos u otras proteínas terapéuticas.

Las proteínas terapéuticas típicamente se administran mediante inyección, por vía oral o por vía pulmonar u otros medios. Los ejemplos de glicoproteínas diana adecuadas que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación: eritropoyetina, citoquinas tales como interferón-a, interferón-1, interferón-y, interferón-w y CSF de granulocitos, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana, cadena a de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IgF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina, a-1 antitripsina, ADNasa II, a-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína de unión a TNF aka 1), TACI-lg (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículos), GM-CSF, GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1), agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, fusión Fc de receptor TNF soluble aka), ATIII, Trombina rh, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Ig de Antígeno 4 asociado con Linfocito T Citotóxico).

Actividades glicosiltransferasa posteriores: N-acetilglucosaminiltransferasa II, galactosiltransferasa y sialiltransferasa

En un aspecto adicional de la invención, los glicanos recién formados producidos mediante la enzima a-manosidasa II de Golgi son sustratos para reacciones de glicosilación posteriores. En una realización, GnT II, UDP-GlcNAc y opcionalmente el transportador de UDP-GlcNAc protegen la rama Mana1,6 recién formada del oligosacárido producido en P. pastoris YSH-37 con un GlcNAc para formar GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Ejemplo 19). En otra realización, otras GnT (por ejemplo, GnT III, GnT IV, GnT V) reaccionan ante el sustrato transitorio GlcNAc2Man3GlcNAc2. Este sustrato, a su vez, se vuelve un sustrato para galactosiltransferasas (Ejemplo 25) y el procesamiento adicional ocurre con sialiltransferasas.

Los siguientes son ejemplos que ilustran las composiciones y procedimientos de la presente invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes: los ejemplos se incluyen sólo con propósitos de ilustración.

EJEMPLO 1

Clonación y alteración del gen OCH1 en P. pastoris

Una ORF de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris que codifica una a-1,6 manosiltransferasa supuesta se amplificó a partir de ADN genómico de P. pastoris (cepa X-33, Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los oligonucleótidos 5'-ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT-3' (SEC ID Nº: 18) y 5'-TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3' (SEC ID Nº: 19) que se diseñaron basándose en la secuencia de OCH1 de P. pastoris (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Nº 8336387). Posteriormente, se amplificaron 2685 pb cadena arriba y 1175 pb cadena debajo de la ORF del gen OCH1 a partir de una biblioteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm, T. y col. Yeast 1999 Mayo; 15(7): 563-72) usando los oligonucleótidos internos 5'-ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT-3' (SEC ID Nº: 20) en el gen OCH1 y oligonucleótidos 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' T7 (SEC ID Nº: 21) y 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' T3 (SEC ID Nº: 22) en la estructura principal de la biblioteca que porta el plásmido lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). El fragmento de 5075 pb resultante se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se denominó pBK9.

Después de ensamblar una construcción con eliminación génica que sustituía la fase de lectura de OCH1 con un gen de resistencia HIS4, P. pastoris se transformó y las colonias se exploraron para determinar la sensibilidad de temperatura a 37ºC. Los mutantes de OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a la temperatura y crecen lentamente a temperaturas elevadas. Por tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante de OCH1 de S. cerevisiae con un ADN o biblioteca de ADNc de P. pastoris. Aproximadamente 20 cepas sensibles a la temperatura se sometieron adicionalmente a exploración por PCR de colonia para identificar colonias con un gen och1 suprimido. Se obtuvieron varias supresiones de och1.

El pBK9.1 linealizado, que tiene una secuencia cadena arriba de 2,1 kb y una secuencia cadena abajo de 1,5 kb de un casete de gen de OCH1 que porta el gen HIS4 de Pichia, se transformó en BK1 de P. pastoris [GS115 (his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) que portaba el gen IFN-1 humano en el locus AOX1] para eliminar el gen OCH1 de tipo silvestre. La exploración inicial de los transformantes se realizó usando medio con histidina retirada seguido por réplica en placas para seleccionar las colonias sensibles a temperatura. Veinte de doscientas colonias positivas a histidina mostraron un fenotipo sensible a temperatura a 37ºC. Para excluir la integración aleatoria de pBK9.1 en el genoma de Pichia, los 20 aislados sensibles a temperatura se sometieron a PCR de colonia utilizando cebadores específicos para la secuencia cadena arriba del sitio de integración y para ORF de HIS4. Dos de veinte colonias no tenían och1 y se analizaron adicionalmente usando una transferencia de Southern y una transferencia de Western indicando la alteración de och1 funcional mediante la construcción sin och1. Los ADN genómicos se digirieron usando dos enzimas de restricción separadas Bglll y Clal para confirmar la eliminación de och1 y para confirmar la integración en la fase de lectura abierta. La transferencia de Western mostró mutantes de och1 que carecían de una banda específica producida en el GS 115 de tipo silvestre a 46,2 kDa.

EJEMPLO 2

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris con -1,2-Manosidasa para producir precursores de IFN1 que contienen Man5GleNAC2

Se requiere una a-1,2-manosidasa para el corte de Man8GlcNAc2 para producir Man5GleNAc2, un intermedio esencial para la formación de N-glicano complejo. Mientras la producción de un precursor de Man5GlcNAc2 es esencial, no es necesariamente suficiente para la producción de glicanos híbridos y complejos debido a que el isómero específico de Man5GlcNAc2 puede o no ser un sustrato para GnTI. Un mutante de och1 de P. pastoris se modifica por ingeniería genética para expresar interferón-1 humano secretado bajo el control de un promotor aox. Se construye una biblioteca de ADN mediante el ligamiento en fase del dominio catalítico de manosidasa IB humana (una a-1,2-manosidasa) con una sub-biblioteca que incluye secuencias que codifican péptidos de localización de Golgi temprano y RE. Después, el organismo huésped se transforma con la biblioteca de ADN, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que cada uno de los transformantes individuales expresa interferón-1 así como un gen de manosidasa sintético a partir de la biblioteca. Las colonias transformantes individuales se cultivan y la producción de interferón se induce mediante la adición de metanol. En estas condiciones, más del 90% de la proteína secretada es interferón-1 glicosilado.

Los sobrenadantes se purifican para retirar sales y contaminantes de peso molecular bajo mediante cromatografía en fase inversa de H18 sílice. Los transformantes deseados que expresan a-1,2-manosidasa activa dirigida apropiadamente producen interferón-1 incluyendo N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2, que tiene una masa molecular reducida en comparación con el interferón-1 de la cepa parental. El interferón-1 purificado se analiza mediante espectroscopía de masa MALDI-TOF y las colonias que expresan la forma deseada de interferón-1 se identifican.

EJEMPLO 3

Generación de una cepa mutante de och1 que expresa una -1,2-manosidasa, GnTI para la producción de una glicoproteína de tipo humano.

La fase de lectura abierta de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris así como 2685 pb cadena arriba y 1175 pb cadena abajo se amplificaron por PCR (véase también el documento WO 02/00879), se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se denominó pBK9. Para crear una cepa sin och1 que contenga múltiples marcadores auxótrofos, 100 !g de pJN329, un plásmido que contiene un alelo mutante och1::URA3 flanqueado con sitios de restricción Sfil se digirió con Sfil y se usó para transformar la cepa JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169) mediante electroporación. A continuación de la incubación en medio definido sin uracilo durante 10 días a temperatura ambiente, 1000 colonias se escogieron y se volvieron a sembrar en estrías. Los clones URA+ que no eran capaces de crecer a 37º, pero que crecieron a temperatura ambiente se sometieron a PCR de colonia para ensayar la integración correcta del alelo mutante och1::URA3. Un clon que mostraba el patrón de PCR esperado se denominó YJN153. El dominio Kringle 3 de plasminógeno humano (K3) se usó como una proteína modelo. Un plásmido marcado con NeoR que contenía el gen K3 se transformó en la cepa YJN153 y una cepa resultante, que expresaba K3, se denominó BK64-1.

El plásmido pPB103, que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis que codifica un transportador de UDPN-acetilglucosamina de Golgi se construyó clonando un fragmento romo de BglII-HindIII a partir del vector pDL02 (Abeijon y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 5963-5968) en pBLADE-SX digerido con BglII y BamHI y con extremos romos que contenía el gen ADE1 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169). Este plásmido se linealizó con EcoNI y se transformó en la cepa BK64-1 mediante electroporación y una cepa que se confirmó que contenía el MNN2-2 mediante análisis de PCR se denominó PBP1.

Se generó una biblioteca de construcciones de manosidasa, que comprendía fusiones en fase de los dominios líder de varias proteínas de membrana de tipo I o tipo II de S. cerevisiae y P. pastoris fusionadas con dominios catalíticos de varios genes de a-1,2-manosidasa de fuentes humanas, de ratón, de mosca, de oruga y de levadura (véase, por ejemplo, el documento WO02/00879, incorporado en el presente documento como referencia). Esta biblioteca se creó en un vector de integración HIS4 de P. pastoris y se exploró linealizando con SalI, transformando mediante electroporación en la cepa PBP1 y analizando los glicanos liberados a partir de la proteína informadora K3. Una construcción activa escogida era una quimera de los nucleótidos 988-1296 (extremo C) del gen SEC12 de levadura fusionado con una supresión N-terminal del gen de a-1,2-manosidasa IA de ratón (Figura 3), al que le faltaban los 187 nucleótidos. Una cepa de P. pastoris que expresa esta construcción se denominó PBP2.

Se generó una biblioteca de construcciones de GnTI, que comprendía fusiones en fase de la misma biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTI a partir de fuentes humanas, de orugas, de rana y de mosca (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración ARG4 de P. pastoris y se exploró linealizando con AatII, transformando mediante electroporación en la cepa PBP2 y analizando los glicanos liberados a partir de K3. Una construcción activa escogida fue una quimera de los primeros 120 pb del gen NFNN9 de S. cerevisiae fusionado a una supresión del gen de GnTI humana, al que le faltaban los primeros 154 pb. Una cepa de

P. pastoris que expresaba esta construcción se denominó PBP3.

EJEMPLO 4

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris para producir Man5GlcNAc2 como la estructura de N-Glicano predominante usando una biblioteca de ADN combinatoria

Un mutante de och1 de P. pastoris (véanse los Ejemplos 1 y 3) se modificó por ingeniería genética para expresar y secretar proteínas tales como el dominio kringle 3 de plasminógeno humano (K3) bajo el control del promotor inducible AOX1. El dominio Kringle 3 de plasminógeno humano (K3) se usó como una proteína modelo. Un fragmento de ADN que codifica el K3 se amplificó usando polimerasa Pfu turbo (Strategene, La Jolla, CA) y se clonó en los sitios EcoRI y Xbal de pPICZaA (Invitrogen, Carlsbad, CA), dando como resultado una etiqueta 6 His C-terminal. Para mejorar la eficacia de glicosilación enlazada a N de K3 (Hayes y col. 1975 J. Arch. Biochem. Biophys. 171, 651-655), Pro46 se reemplazó con Ser46 usando mutagénesis dirigida. El plásmido resultante se denominó pBK64. La secuencia correcta de la construcción de PCR se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Se construyó una biblioteca de ADN combinatoria mediante el ligamiento en fase de dominios catalíticos de a-1,2manosidasa IB (Genbank NA 6678787) e IA (Genbank NA 6754619) murinas con una sub-biblioteca que incluía secuencias que codificaban los péptidos de localización de vesícula, RE y de Golgi temprano Cop II de acuerdo con la Tabla 6. La biblioteca de ADN combinada se usó para generar construcciones de fusión individuales, que después se transformaron en el organismo huésped que expresaba K3, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que cada uno de los transformantes individuales expresa K3 así como un gen de fusión de señal de localización/manosidasa a partir de la biblioteca. Los transformantes individuales se cultivaron y la

producción de K3 se indujo mediante transferencia a un medio que contenía metanol. En estas condiciones, después de 24 horas de inducción, más del 90% de la proteína en el medio era K3. La proteína informadora K3 se purificó a partir del sobrenadante para retirar las sales y los contaminantes de bajo peso molecular mediante cromatografía de afinidad a Ni. A continuación de la purificación por afinidad, la proteína se desaló mediante

5 cromatografía de exclusión por tamaño en una resina Sephadex G10 (Sigma, St. Louis, MO) y se sometió directamente a análisis de MALDI-TOF descrito más adelante o los N-glicanos se retiraron mediante digestión con PNGasa como se ha descrito más adelante (Liberación de N-glicanos) y se sometió a análisis de MALDI-TOF Miele y col. 1997 Biotechnol. Appl. Biochem. 25, 151-157.

A continuación de este enfoque, se obtuvo un conjunto diverso de transformantes; algunos no mostraron

10 modificación de los N-glicanos en comparación con la cepa sin och1 y otros mostraron un grado alto de corte de manosa (Figuras 5d y 5E). Los transformantes deseados que expresan a-1,2-manosidasa activa dirigida apropiadamente produjeron K3 con N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2. Esto confiere una masa molecular reducida a la glicoproteína en comparación con la K3 de la cepa con supresión och1 parental, una diferencia que se detectaba fácilmente mediante espectrometría de masa MALDI-TOF (Figura 5). La Tabla 7 indica los niveles de

15 producción de Man5GlcNAc2 relativos.

Tabla 7. Una biblioteca de ADN combinatoria representativa de secuencias de localización/dominios catalíticos que muestran niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2.

Secuencias de péptidos de dirección

Dominios Catalíticos: MNS1(s) MNS1(m) MNS1(l) SEC12(s) SEC12(m)

Manosidasa 1A ∆187 de ratón: FB4 ++ FB5 + FB6 FB7 ++ FB8 ++++

Manosidasa 1B ∆58 de ratón: GB4 ++ GB5 + GB6 + GB7 ++ GB8 +

Manosidasa 1B ∆99 de ratón: GC4 GC5 +++ GC6 + GC7 + GC8 +

Manosidasa 1B ∆170 de ratón: GD4 - GD5 - GD6 - GD7 + GD8 +

Tabla 8. Otra biblioteca de ADN combinatoria de secuencias de localización/dominios catalíticos que 20 muestran niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2.

Secuencias de péptidos de dirección

Dominios Catalíticos: VAN1(s) VAN1(m) VAN1(l) MNN10(s) MNN10(m) MNN10(l)

Manosidasa IB ∆80 de elegans: C. BC18-5 +++++ BC19 ++++ BC20 +++ BC27 +++++ BC28 +++++ BC29 +++

Manosidasa IB ∆31 de elegans: C. BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++ BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++

Los péptidos de dirección se seleccionaron entre MNS I (SwissProt P32906) en S. cerevisiae (largo, medio y corto) (véase, anteriormente, Bibliotecas de Ácidos Nucleicos; Biblioteca de ADN Combinatoria para Construcciones de Fusión) y SEC12 (SwissProt P11655) en S. cerevisiae (988-1140 nucleótidos: corto) y (988-1296: medio). Aunque la mayoría de las secuencias de péptido de dirección eran supresiones N-terminal, algunas secuencias de péptidos de dirección, tales como SEC12, eran supresiones C-terminal. Los dominios catalíticos usados en este experimento se seleccionaron entre manosidasa 1A de ratón con una supresión N-terminal de 187 aminoácidos y manosidasa 1B de ratón con una supresión de 58, 99 y 170 aminoácidos. El número de (+), como se usa en el presente documento,

5 indica los niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2. El símbolo (-) indica que no hay producción aparente de Man5GlcNAc2, el símbolo (+) indica menos del 10% de producción de MansGlcNAc2. El símbolo (++) indica una producción de aproximadamente el 10-20% de Man5GlcNAc2. El símbolo (+++) indica una producción de aproximadamente el 20-40% de Man5GlcNAc2. El símbolo con (++++) indica una producción de aproximadamente el 50% de Man5GlcNAc2. El símbolo con (+++++) indica una producción mayor del 50% de Man5GlcNAc2.

10 La Tabla 9 muestra las cantidades relativas de Man5GlcNAc2 detectadas en una glicoproteína informadora K3 secretada. Se generaron seiscientas ocho (608) cepas diferentes de P. pastoris (∆och1) transformando cada una con una construcción única a partir de una biblioteca genética combinatoria que se había generado fusionando diecinueve (19) dominios catalíticos de a-1,2-manosidasa a treinta y dos (32) líderes de RE fúngicos y de Golgi cis.

Tabla 9

Cantidad de Man5GlcNAc2 en proteína K3 secretada (% de los glicanos totales): Número de construcciones (%)

N.D.*: 19 (3,1)

0-10%: 341 (56,1)

10-20%: 50 (8,2)

20-40&: 75 (12,3)

40-60%: 72 (11,8)

Más del 60%: 51 (8,4) †

Total: 608 (100)

* Varias construcciones de fusión no se ensayaron debido a que los plásmidos correspondientes no se pudieron propagar en E. coli antes de la transformación en P. pastoris. † Los clones con el grado más alto de corte de Man5GlcNAc2 (30/51) se analizaron adicionalmente para determinar actividad de manosidasa en el sobrenadante del medio. La mayoría (28/30) presentó actividad manosidasa detectable en el sobrenadante (por ejemplo, Figura 4B). Sólo dos construcciones presentaron niveles de Man5GlcNAc2 elevados, mientras que carecían de actividad manosidasa en el medio (por ejemplo, Figura 4C).

La Tabla 7 muestra dos construcciones pFB8 y pGC5, entre otras, que posibilitan que una célula huésped transformada elabore glicoproteína K3 que presenta Man5GlcNAc2. La Tabla 8 muestra una construcción más preferida, pBC18-5, una secuencia de péptido de dirección VAN1 (s) de S. cerevisiae (de SwissProt 23642) ligada en fase a una manosidasa IB de C. elegans (Genbank NA CAA98114) con una supresión N-terminal de 80

20 aminoácidos (Van1 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C. elegans). Esta construcción de fusión también produce una estructura de Man5GlcNAc2 predominante, como se muestra en la Figura 5E. Esta construcción de fusión de manosidasa demostró producir más del 50% de Man5GlcNAc2 (+++++).

Generación de una biblioteca de localización/manosidasa combinatoria:

La generación de una biblioteca de ADN combinatoria de dominios catalíticos de a-1,2-manosidasa fusionada a

25 péptidos de dirección necesitó la amplificación de dominios de manosidasa con diversas longitudes de supresiones N-terminal a partir de varios organismos. Para conseguir este objetivo, las fases de lectura abiertas de longitud completa (ORF) de a-1,2-manosidasas se amplificaron por PCR a partir de ADNc o ADN genómico obtenido a partir de las siguientes fuentes: Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus nidulans y Penicillium citrinum. En cada caso, el ADN se incubó en presencia de cebadores de oligonucleótidos específicos para la secuencia de manosidasa deseada además de reactivos necesarios para realizar la reacción de PCR. Por ejemplo, para amplificar la ORF de la a-1,2-manosidasa IA de M. musculus, el cebador 5’-ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC (SEC ID Nº: 23) y el cebador 3’-TCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEC ID Nº: 24) se incubaron en presencia de ADN polimerasa PfU (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificaron en las condiciones recomendadas por Stratagene usando los parámetros de ciclación: 94ºC durante 1 min (1 ciclo); 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min (30 ciclos). A continuación de la amplificación la secuencia de ADN que codifica la ORF se incubó a 72ºC durante 5 min con 1 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, Wl) antes del ligamiento en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformó en E. coli químicamente competente TOP10, como recomendó Invitrogen. El producto de PCR clonado se confirmó mediante secuenciación ABI usando cebadores específicos para la ORF de manosidasa.

Para generar los truncamientos N-terminales deseados de cada manosidasa, la ORF completa de cada manosidasa se usó como el molde en un ciclo posterior de reacciones de PCR en las que la posición de hibridación del cebador 5’ era específica para el extremo 5’ del truncamiento deseado y el cebador 3’ permaneció específico para el extremo 3’ original de la ORF. Para facilitar la subclonación del fragmento de manosidasa truncado en el vector de expresión de levadura, los sitios de restricción AscI y PacI de pJN347 (Figura 2C) se modificaron por ingeniería genética en cada producto de truncamiento, en los extremos 5’ y 3’ respectivamente. El número y posición de los truncamientos N-terminales generados para cada ORF de manosidasa dependían de la posición de la región transmembrana (TM) en relación con el dominio catalítico (DC). Por ejemplo, si la región de tronco localizada entre la TM y la DC era menor de 150 pb, entonces sólo se generó un truncamiento para esa proteína. Sin embargo, si la región de tronco era más larga que 150 pb entonces se generaron uno o dos truncamientos más dependiendo de la longitud de la región de tronco.

Un ejemplo de cómo se generaron los truncamientos para la manosidasa IA de M. musculus (Genbank NA 6678787) se describe en el presente documento, usándose un enfoque similar para las otras manosidasas. La Figura 3 ilustra la ORF de la a-1,2-manosidasa IA de M. musculus estando los dominios transmembrana y

catalíticos pronosticados destacados en negritas. Basándose en esta estructura, se diseñaron tres cebadores 5’ (posiciones de hibridación subrayadas en la Figura 3) para generar las supresiones N-terminales ∆65-, ∆105-y ∆187-. Usando la supresión N-terminal ∆65 como un ejemplo el cebador 5’ usando fue GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC-3’ (SEC ID Nº: 25) (con el sitio de restricción AscI destacado en negrita) junto con el cebador 3’ 5’-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3’ (SEC ID Nº: 26) (con el sitio de restricción Pacl destacado en negrita). Ambos de estos cebadores se usaron para amplificar un fragmento de 1561 pb en las condiciones indicadas anteriormente para amplificar la ORF de manosidasa IA de M. musculus de longitud completa. Además, al igual que el producto obtenido para la ORF de longitud completa, el producto truncado también se incubó con Taq ADN polimerasa, se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), se transformó en TOP10 y se secuenció por ABI. Después de haber amplificado y confirmado la secuencia del fragmento de manosidasa truncado, el plásmido resultante, pCR2.1-A65mMannIA, se digirió con AscI y PacI en tampón Nº 4 de New England Biolabs (Beverly, MA) durante 16 h a 37ºC. Paralelamente, pJN347 (Figura 2C) se digirió con las mismas enzimas y se incubó como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión, tanto la estructura principal de pJN347 (Figura 2C) como el dominio catalítico truncado se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, MA), como lo recomendaron los fabricantes y se transformó en células DH5a químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó PCR de colonia para confirmar la generación de la construcción pJN347-Manosidasa IA∆65 de ratón.

Habiendo generado una biblioteca de dominios catalíticos de a-1,2-manosidasa truncada en el vector de expresión de levadura pJN347 (Figura 2C) la etapa restante para generar la biblioteca de péptido de dirección/dominio catalítico era clonar en fase las secuencias de péptido de dirección (Figura 2). Tanto las construcciones de pJN347-manosidasa (Figura 2D) como las construcciones de pCR2.1TOPO-péptido de dirección (Figura 2B) se incubaron durante una noche a 37ºC en tampón Nº 4 de New England Biolabs en presencia de las enzimas de restricción Notl y AscI. A continuación de la digestión, tanto la estructura principal de pJN347-manosidasa como las regiones de péptidos de dirección se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, MA), como lo recomendaron los fabricantes y se transformó en células DH5a químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, las construcciones de pJN347-péptido de dirección/manosidasa se secuenciaron por ABI para confirmar que las fusiones generadas estaban en fase. El tamaño estimado de la biblioteca final de péptido de dirección/alfa-1,2-manosidasa contiene más de 1300 construcciones generadas mediante el enfoque descrito anteriormente. La Figura 2 ilustra la construcción de la biblioteca de ADN combinatoria.

Modificación por ingeniería genética de una cepa sin OCH1 de P. pastoris con múltiples marcadores auxótrofos.

La primera etapa en la construcción de plásmidos implicó crear un conjunto de plásmidos universales que contenían regiones de ADN del gen KEX1 de P. pastoris (Boehm y col. Yeast 1999 Mayo; 15(7): 563-72) como separadores para las regiones 5’ y 3’ de los genes que se tenían que eliminar. Los plásmidos también contenían los Ura-blaster de S. cerevisiae (Alani y col., Genetics 116, 541-545. 1987) como un separador para los marcadores auxótrofos y un casete de expresión con un sitio de clonación múltiple para inserción de un gen extraño. Un fragmento de 0,9 kb de la región KEX1-5’ de P. pastoris se amplificó por PCR usando los cebadores GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEC ID Nº: 27) y GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEC ID Nº: 28) y ADN genómico de P. pastoris como un molde y se clonó en los sitios SacI, SaIl de pUC 19 (New England Biolabs, Beverly, MA). El plásmido resultante se cortó con BamHI y SaIl y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3’ que se había amplificado usando los cebadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEC ID Nº: 29) y GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGG ATGACTCTTTTC (SEC ID Nº: 30) se clonó en los sitios abiertos creando pJN262. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de 3,8 kb de BamHI, Bglll de pNKY51 (Alani y col., Genetics 116, 541-545. 1987) se insertó en ambas orientaciones posibles dando como resultado los plásmidos pJN263 (Figura 4A) y pJN284 (Figura 4B).

Se creó un casete de expresión con NotI y PacI como sitios de clonación. El promotor GAPDH de P. pastoris se amplificó usando los cebadores CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEC ID Nº: 31) y GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGACAA (SEC ID Nº: 32) y plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI y SphI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) (Figura 4B). El plásmido resultante se cortó con Spel y Sphl y la región terminadora de transcripción CYC1 (“TT”) que se había amplificado usando cebadores CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEC ID Nº: 33) y GGACATGCATGCGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATT AAAGCCTTCGAGCGTCCC (SEC ID Nº: 34) y el plásmido pPICZ-A (Invitrogen) como un molde se clonó en los sitios abiertos creando pJN261 (Figura 4B).

Un plásmido con el gen OCH1 eliminado de P. pastoris se creó digiriendo pJN263 con SaII y SpeI y un fragmento de ADN de 2,9 kb de la región OCH1-5’, que se había amplificado usando los cebadores GAACCACGTCGACGGCCATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATT CAAACACAAGGCATTGC (SEC ID Nº: 35) y CTCCAATACTAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEC ID Nº: 36) y ADN genómico de P. pastoris como un molde, se clonó en los sitios abiertos (Figura 4C). El plásmido resultante se cortó con EcoRI y Pmel y un fragmento de ADN de 1,0 kb de la región OCH1-3’ que se había generado usando los cebadores TGGAAGGTTTAAACAAAGCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAG ATTAGAGAATG (SEC ID Nº: 37) y AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTT TTCATC (SEC ID Nº: 38) se insertó para generar pJN298 (Figura 4C). Para permitir la posibilidad de usar simultáneamente el plásmido para introducir un gen nuevo, el casete de expresión BamHI de pJN261 (Figura 4B) se clonó en el sitio único BamHI de pJN298 (Figura 4C) para crear pJN299 (Figura 4E).

El casete Ura3-blaster de P. pastoris se construyó usando una estrategia similar a la descrita en Lu y col. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 141-146. Un fragmento de Pstl, Spel de 2,0 kb de URA3 de P. pastoris se insertó en los sitios Pstl, Xbal de pcU19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear pJN306 (Figura 4D). Después un fragmento de ADN Sacl, Pvull de 0,7 kb de la fase de lectura abierta lacZ se clonó en los sitios Sacl, Smal para producir pJN308 (Figura 4D). A continuación de la digestión de pJN308 (Figura 4D) con Pstl y tratamiento con T4 ADN polimerasa, el fragmento Sacl - Pvull de lacZ al que se habían hecho los extremos romos con T4 ADN polimerasa se insertó generando pJN315 (Figura 4D). El casete lacZ/URA3 se liberó mediante digestión con Sacl y SphI, sus extremos se volvieron romos con T4 ADN polimerasa y se clonó en la estructura principal de pJN299 que se había digerido con Pmel y AfIII y al que se habían hecho los extremos romos con T4 ADN polimerasa. El plásmido resultante se denominó pJN329 (Figura 4E).

Un plásmido de expresión marcado con HIS4 se creó cortando pJN261 (Figura 4F) con EcoICRI (Figura 4F). Un fragmento de 2,7 kb del gen HIS4 de Pichia pastoris que se había amplificado usando los cebadores GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA AAAATACGG (SEC ID Nº: 39) y GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTA AAATCTCTAA (SEC ID Nº: 40) se cortó con NgoMIV y Swal y después sus extremos se hicieron romos usando T4 ADN polimerasa, después se ligó en el sitio abierto. Este plásmido se denominó pJN337 (Figura 4F). Para construir un plásmido con un sitio de clonación múltiple adecuado para construcción de biblioteca de fusión, pJN337 se cortó con Notl y Pacl y los dos oligonucleótidos GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEC ID Nº: 41) y

TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC (SEC ID Nº: 42), que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, creando pJN347 (Figura 4F).

Para crear una cepa sin och 1 que contenga múltiples marcadores auxótrofos, 100 !g de pJN329 se digirieron con Sfil y se usaron para transformar la cepa JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169) mediante electroporación. A continuación de la transformación, las placas con URA retirado se incubaron a temperatura ambiente durante 10 días. Mil (1000) colonias se escogieron y se volvieron a sembrar en estrías. Todos los 1000 clones después se sembraron en estrías en 2 conjuntos de placas con URA retirado. Un conjunto se incubó a temperatura ambiente, mientras que el segundo conjunto se incubó a 37ºC. Los clones que no fueron capaces de crecer a 37ºC, pero crecieron a temperatura ambiente, se sometieron a PCR de colonia para ensayar la eliminación de OCH1 correcta. Un clon que mostraba la señal de PCR esperada (aproximadamente 4,5 kb) se denominó YJN153.

EJEMPLO 5

Caracterización de la biblioteca de localización/manosidasa combinatoria

Los transformantes positivos (Ejemplo 4) explorados mediante PCR de colonia para confirmar la integración de la construcción de manosidasa en el genoma de P. pastoris se cultivaron posteriormente a temperatura ambiente en 50 ml de medio complejo de metanol tamponado con BMGY que consistía en extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, biotina al 4 X 10-5% y glicerol al 1% como un medio de cultivo) hasta DO600nm 2-6, punto en el cual los mismos se lavaron con 10 ml de medios de BMMY (medio complejo de metanol tamponado constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, biotina 4 X 10-5% y metanol al 1,5% como un medio de cultivo) antes de la inducción de la proteína informadora durante 24 horas a temperatura ambiente en 5 ml de BMMY. Por consiguiente, la proteína informadora se aisló y se analizó como se ha descrito en el Ejemplo 3 para caracterizar su estructura de glicano. Usando los péptidos de dirección de la Tabla 6, los dominios catalíticos de manosidasa localizados en el RE o el Golgi mostraron un nivel significativo de corte de un glicano que contenía principalmente Man8GlcNAc2 a un glicano que contenía principalmente Man5GlcNAc2. Esto es evidente cuando la estructura de glicano de la glicoproteína informadora se compara entre la de P. pastoris sin och1 en las Figuras 5C y 6C y la misma cepa transformada con construcciones de manosidasa de M. musculus como se muestra en las Figuras 5D, 5E, 6D - 6F. Las Figuras 5 y 6 muestran la expresión de construcciones generadas a partir de la biblioteca de ADN combinatoria que muestran actividad manosidasa significativa en P. pastoris. La expresión de pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB "99 de ratón) (Figuras 5D y 6E) produjo una proteína que tenía aproximadamente el 30% de todos los glicanos cortados a Man5GlcNAc2, mientras que la expresión de pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA "187 de ratón) (Figura 6F) produjo aproximadamente el 50% de Man5GlcNAc2 y la expresión de pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB "80 de C. elegans) (Figura 5E) produjo el 70% de Man5GlcNAc2.

EJEMPLO 6

Corte in vivo mediante alfa-1,2-manosidasa

Para asegurar que las cepas modificadas por ingeniería genética novedosas del Ejemplo 4 producían de hecho la estructura de Man5GlcNAc2 deseada in vivo, los sobrenadantes celulares se ensayaron para determinar la actividad de manosidasa (véanse las Figuras 7-9). Para cada construcción/cepa huésped descrita más adelante, se realizó HPLC a 30ºC con una columna de 4,0 mm x 250 mm de resina Econosil-NH2 de Altech (Avondale, PA, EE.UU) (5 !m) a un caudal de 1,0 ml/min durante 40 min. En las Figuras 7 y 8 se demostró que ocurría la degradación del Man9GlcNAc2 [b] convencional dando como resultado un pico que se correlaciona con Man8GlcNAc2. En la Figura 7, el Man9GlcNAc2 [b] convencional se eluyó a 24,61 min y Man5GlcNAc2 [a] se eluyó a 18,59 min. En la Figura 8, Man9GlcNAc2 se eluyó a 21,37 min y Man5GlcNAc2 a 15,67 min. En la Figura 9, el Man8GlcNAc2 [b] convencional demostró que se eluía a 20,88 min.

Células de P. pastoris que comprenden plásmido pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA "197 de ratón) se cultivaron a 30ºC en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 a partir de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una etapa de purificación única usando cromatografía de CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que se eluía en NaCl entre 300-500 mM. El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos de K3 se muestra en la Figura 6F. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de actividad manosidasa secretada. Un patrón disponible en el mercado de oligomanosa 9 de tipo enlazado a N marcado con 2-aminobenzamida (Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) se añadió a: BMMY (Figura 7A), el sobrenadante de la alícuota anterior (Figura 7B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de a1,2-manosidasa de Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., WO 02/00856 A2) (Figura 7C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante HPLC de amino sílice para determinar el alcance de corte de manosidasa.

Células de P. pastoris que comprenden el plásmido pGC5 (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB "99 de ratón) se cultivaron y se ensayaron de forma similar. Las células se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una etapa de purificación única usando cromatografía de CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que se eluía en NaCl entre 300-500 mM. El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos de K3 se muestran en la Figura 5D. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 8B. Un patrón disponible en el mercado de Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) se añadió a: EMMY (Figura 8A), sobrenadante de la alícuota anterior (Figura 8B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de a1,2-manosidasa de Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., WO 02/00856 A2) (Figura 8C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante HPLC de amino sílice para determinar el alcance de corte de manosidasa.

Man9-2-AB se usó como un sustrato y es evidente que después de 24 horas de incubación, la actividad manosidasa estaba prácticamente ausente en el sobrenadante de la digestión de la cepa pFB8 (SEC12(m) de Saccharomyces/manosidasa IA "187 de ratón) (Figura 7B) y digestión de la cepa pGC5 (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB "99 de ratón) (Figura 8B) mientras el control positivo (a-1,2-manosidasa purificada de

T. reesei obtenida de Contreras) conduce a conversión completa de Man9GlcNAc2 en Man5GlcNAc2 en las mismas condiciones, como se muestra en las Figuras 7C y 8C. Estos son datos concluyentes que muestran el corte de manosidasa in vivo en la cepa pGC5 de P. pastoris y la cepa pFB8, que es definitivamente diferente de lo que se ha indicado hasta la fecha (Contreras y col., WO 02/00856 A2).

La Figura 9 confirma además la localización y la actividad de la enzima manosidasa. P. pastoris que comprende pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB "80 de C. elegans) se cultivó a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente de 10. Las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una etapa de purificación única usando cromatografía de CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que se eluye en NaCl entre 300-500 mM. El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos a partir de K3 se muestra en la Figura 5E. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 9B. Un patrón disponible en el mercado de Man8-2-AB (Glyko, Novato, CA) se añadió

a: a BMMY (Figura 9A), sobrenadante de la alícuota anterior de pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB "80 de C. elegans) (Figura 9B) y medios que contenían BMMY a partir de una construcción de fusión diferente pDD283 (MNN10(m) de Saccharomyces (de SwissProt 50108)/manosidasa IB "99 de H. sapiens) (Figura 9C). Después de incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante HPLC de amino sílice para determinar el alcance del corte de manosidasa. La Figura 9B demuestra la actividad de manosidasa intracelular en comparación con una construcción de fusión pDD28-3 (MNN10(m) de Saccharomyces/ manosidasa IB "99 de H. sapiens) que muestra un resultado negativo (Figura 9C).

EJEMPLO 7

Ensayo de pH óptimo de una -1,2-manosidasa modificada por ingeniería genética

Células de P. pastoris que comprenden plásmido pBB27-2 (MNN10(s) de Saccharomyces (de SwissProt50108)/manosidasa IB "31 de C. elegans) se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 17. Aproximadamente 80!l de estas células se inocularon en 60!l de BMGY y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 a partir de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente (pH 6,43). El sobrenadante se retiró para ensayos de pH óptimo de manosidasa. Se añadió Man8GlcNAc2 marcado con fluorescencia (0,5 !g) a 20!l de sobrenadante ajustado a diversos pH (Figura 11) y se incubó durante 8 horas a temperatura ambiente. A continuación de la incubación la muestra se analizó mediante HPLC usando una columna de sílice unida a amino Econosil NH2 4,6 X 250 mm, perla de 5 micrómetros (Altech, Avondale, PA). El caudal fue 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30°C. Después de eluir isocráticamente (A 68%:B 32%) durante 3 min, se empleó un gradiente de disolvente lineal (A 68%:B 32% a A 68%:B 60%) durante 27 min para eluir los glicanos (18). Disolvente A (acetonitrilo) y disolvente B (formato de amonio, 50 mM, pH 4,5. La columna se equilibró con disolvente (A 68%:B 32%) durante 20 min entre los desarrollos.

EJEMPLO 8

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris para producir N-glicanos con la estructura GlcNAcMan5GlcNAc2

La actividad de GlcNAc Transferasa I es necesaria para la maduración de N-glicanos complejos e híbridos (Patente de los Estados Unidos Nº 5.834.251). Man5GlcNAc2 se puede cortar sólo mediante manosidasa II, una etapa necesaria en la formación de glicoformas humanas, después de la adición de N-acetilglucosamina al resto a-1,3 manosa terminal del tronco trimanosa mediante GlcNAc Transferasa I (Schachter, 1991 Glycobiology 1(5): 453-461). Por consiguiente, se preparó una biblioteca de ADN combinatoria incluyendo fragmentos de ADN que codifican dominios catalíticos dirigidos adecuadamente de genes de GlcNAc Transferasa I a partir de C. elegans y Homo sapiens; y secuencias de localización a partir de GLS, MNS, SEC, MNN9, VAN1, ANP1, HOC1, MNN10, MNN11, MNT1, KTR1, KTR2, MNN2. MNN5, YUR1, MNN1 y MNN6 y a partir de a-1,2-manosiltransferasas supuestas de S. cerevisiae y P. pastoris basándose en la homología de S. cerevisiae: D2, D9 y J3, que son homólogos KTR. La Tabla 10 incluye, pero no se limita a secuencias de péptidos de dirección tales como SEC y OCH1 de GnTI de P. pastoris y K. lactis (véase la Tabla 6 y Tabla 10).

Tabla 10. Una biblioteca combinatoria representativa de secuencias de péptidos de dirección/dominio catalítico para UDP-N-Acetilglucosaminil Transferasa I (GnTI)

Péptido de dirección

Dominio Catalítico: OCHI(s) OCHI(m) OCHI(l) MNN9(s) MNN9(m)

GnTI, "38 Humano: PB105 PB106 PB107 PB104 N/A

GnTI, "86 Humano: NB12 NB13 NB14 NB15 NB

GnTI, "88 de C. elegans: OA12 OA13 OA14 OA15 OA16

GnTI, "35 de C. elegans: PA12 PA13 PA14 PAIS PA16

GnTI, "63 de C. elegans: PB12 PB13 PB14 PB15 PB16

GnTI, "33 de X. leavis: QA12 QA13 QA14 QA15 QA16

GnTI, "103 de X. leavis: QB12 QB13 QB14 QB15 QB16

Se seleccionaron secuencias de péptidos de dirección a partir de OCH1 en P. pastoris (largo, medio y corto) (véase el Ejemplo 4) y MNN9 (SwissProt P39107) en S. cerevisiae corto y medio. Los dominios catalíticos se seleccionaron a partir de GnTI humana con una supresión N-terminal de 38 y 86 aminoácidos, GnTI de C. elegans (gli-12) con una supresión de 35 y 63 aminoácidos, así como GnTI de C. elegans (gli-14) con una supresión N-terminal de 88 aminoácidos y GnTI de X. leavis con una supresión N-terminal de 33 y 103 aminoácidos, respectivamente.

Una porción del gen que codifica N-acetilglucosaminil-Transferasa I humana (MGATI, Número de Acceso NM002406), que carece de los primeros 154 pb, se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGCGCCTCAGTCAGCGCTCTCG-3' (SEC ID Nº: 43) y 5'-AGGTTAATTAAGTGCTAATTCCAGCTAGG-3' (SEC ID Nº: 44) y el vector pHG4.5 (ATCC Nº 79003) como molde. El producto de PCR resultante se clonó en pCR2.1-TOPO y la secuencia correcta se confirmó. A continuación de la digestión con AscI y PacI la GnTI truncada se insertó en el plásmido pJN346 para crear pNA. Después de la digestión de pJN271 con NotI y AscI, el inserto de 120 pb, se le ligó pNA para generar una fusión en fase del dominio transmembrana de MNN9 con la GnTI, creando pNA15.

El organismo huésped es una cepa de P. pastoris que carece de hipermanosilación (por ejemplo, un mutante och1), proporciona el sustrato UDP-GlcNAc en el Golgi y/o RE (es decir, contiene un transportador de UDP-GlcNAc funcional) y proporciona un N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2 en el Golgi y/o RE (por ejemplo, pFB8 de P. pastoris (SEC12 (m) de Saccharomyces /manosidasa IA "187 de ratón) anteriormente). En primer lugar, pFB8 de P. pastoris se transformó con pPB103 que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank NA AF106080) (que codifica transportador de UDP-GlcNAc) clonado en el sitio BamHI y Bglll del plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169). Después, la biblioteca de ADN combinatoria mencionada anteriormente que codifica una combinación de GnTI exógena o endógena/genes de localización se transformó y se seleccionaron colonias y se analizaron para determinar la presencia de la construcción de GnTI mediante PCR de colonia. La eficacia de transformación e integración generalmente estuvo por encima del 80% y la exploración por PCR se puede omitir una vez que se han establecido parámetros de transformación sólidos.

En resumen, los procedimientos de la invención producen cepas de P. pastoris que producen GlcNAcMan5GlcNAc2 en alto rendimiento, como se muestra en la Figura 10B. Al menos el 60% de los N-glicanos son GlcNAcMan5GlcNAc2. Hasta la fecha, no existen informes que describan la formación de GlcNAcMan5GlcNAc2 en glicoproteínas solubles secretadas en ninguna levadura. Los resultados presentados en el presente documento muestran que la adición del transportador de UDP-GlcNAc junto con la actividad de GnTI produce una estructura de GlcNAcMan5GlcNAc2 predominante, que se confirma mediante el pico a 1457 (m/z) (Figura 10B).

Construcción de la cepa PBP-3:

La cepa de P. pastoris que expresa K3, ("ochl, arg-, ade-, his-) se transformó sucesivamente con los siguientes vectores. En primer lugar, pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA "187 de ratón) se transformó en la cepa de P. pastoris mediante electroporación. En segundo lugar, pPB103 que contiene gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank NA AF106080) (que codifica transportador de UDP-GlcNAc) clonado en el plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169) digerido con las enzimas BamHI y Bg/II se transformó en la cepa de P. pastoris. En tercer lugar, pPB104 que contiene gen que codifica MNN9(s) de Saccharomyces/GnTI "38 humana clonado como fragmento NotI-Pacl en pJN336 se transformó en la cepa de P. pastoris.

EJEMPLO 9

Modificación por ingeniería genética de células de K. lactis para producir N-glicanos con la estructura Man5GlcNAc2

Identificación y alteración del gen OCH1 de K. lactis

El gen OCH1 de la levadura en germinación S. cerevisiae codifica una 1,6-manosiltransferasa que es responsable de la primera adición de manosa localizada en Golgi a la estructura de N-glicano Man8GlcNAc2 en proteínas secretadas (Nakanishi-Shindo y col. (1993), J. Biol. Chem.; 268(35): 26338-45). Esta transferencia de manosa generalmente se reconoce como la etapa inicial clave en la polimanosilación específica de hongos de estructuras de N-glicano (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(35): 26338-26345; Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19; Morin-Ganet y col., Traffic 1(1): 56-68. (Enero 2000)). La supresión de este gen en S. cerevisiae da como resultado una estructura de N-glicano significativamente más corta que no incluye esta polimanosilación típica o un defecto de crecimiento a temperaturas elevadas (Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19).

La secuencia Och1p de S. cerevisiae se alineó con homólogos conocidos de Candida albicans (Nº de acceso de GenBank AAL49987) y P. pastoris junto con las proteínas de Hoc1 de S. cerevisiae (Neiman y col., Genetics, 145(3): 637-45 (Mar 1997) y K. lactis (base de datos PENDANT EST), que son manosiltransferasas relacionadas pero diferentes. Las regiones de alta homología que estaban en común entre homólogos de Och1p pero diferentes de los homólogos de Hoc1p se usaron para diseñar pares de cebadores degenerados que se dirigieron frente a ADN genómico de la cepa MG1/2 de K. lactis (Bianchi y col., Current Genetics 12, 185-192 (1987)). La amplificación por PCR con cebadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG) (SEC ID Nº: 45) y RCD34 (CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA) (SEC ID Nº:46) dio como resultado un producto de 302 pb que se clonó y se secuenció, y la traducción pronosticada demostró tener un grado elevado de homología con proteínas de Och1 (>55% con Och1p de S. cerevisiae).

El producto de PCR de 302 pb se usó para sondear una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa (MG1/2) de K. lactis con rigurosidad elevada (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observó hibridación en un patrón coherente con un gen único indicando que este segmento de 302 pb corresponde a una porción del genoma de K. lactis y K. lactis (KIOCH1) contiene una copia única del gen. Para clonar el gen KIOCH1 entero, se usó la transferencia de Southern para cartografiar el locus genómico. Por consiguiente, se clonó un fragmento de 5,2 kb de BamHI/PstI digiriendo ADN genómico y ligando esos fragmentos en el intervalo de 5,2 kb en pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear una biblioteca subgenómica de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se transformó en E. coli y varios cientos de clones se ensayaron mediante PCR de colonia usando RCD 33/34. El clon de 5,2 kb que contiene el gen KIOCH1 pronosticado se secuenció y una fase de lectura abierta de 1362 pb que codifica una proteína pronosticada que es el 46,5% idéntica al OCH1 de S. cerevisiae. La secuencia de 5,2 kb se usó para preparar cebadores para la construcción de un alelo de supresión och1::KANR usando un procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148 (Pt8): 2607-15). Este alelo de supresión se transformó en dos cepas de K. lactis y se seleccionaron colonias resistentes a G418. Estas colonias se exploraron tanto por PCR como para sensibilidad a temperatura para obtener una cepa suprimida para la ORF de OCH1. Los resultados del experimento muestran cepas que revelan un patrón de PCR mutante, que se caracterizaron por análisis del crecimiento a diversas temperaturas y análisis de carbohidratos N-glicanos de proteínas secretadas y de pared celular a continuación de digestión con PNGasa. La mutación de och1 confirió una sensibilidad a temperatura que permitió que las cepas crecieran a 30°C, pero no a 35°C. La Figura 12A muestra un análisis de MALDI-TOF de una cepa de K. lactis de tipo silvestre, que produce N-glicanos de Man8GlcNAc2 [c] y superiores.

Identificación, clonación y alteración del gen MNN1 de K. lactis

MNN1 de S. cerevisiae es el gen estructural para la a-1,3-manosiltransferasa de Golgi. El producto de MNN1 es una proteína de membrana de tipo II de 762 aminoácidos (Yip y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91(7): 2723-7. (1994)). Oligosacáridos tanto enlazados a N como enlazados a O aislados a partir de mutantes de mnn1 carecen de enlaces a1,3-manosa (Raschke y col., J Biol Chem., 248(13): 4660-6. (10 de Julio de 1973).

La secuencia de Mnn1p de S. cerevisiae se usó para buscar las secuencias genóminas traducidas de K. lactis (PEDANT). Se ha identificado una secuencia de ADN de 405 pb que codifica un fragmento proteico supuesto de similitud significativa con Mnn1p. Un segmento interno de esta secuencia posteriormente se amplificó por PCR con los cebadores KMN1 (TGCCATCTTTTAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEC ID Nº: 47) y KMN2 (GATCCCACGACGCATCGTATTTCTTTC), (SEC ID Nº: 48) y se usó para sondear una transferencia de Southern de ADN genómico a partir de la cepa (MG1/2) de K. lactis. Basándose en los datos de hibridación del Southern se clonó un fragmento de 4,2 Kb BamHI-PstI generando una biblioteca seleccionada por tamaño como se ha descrito en el presente documento. Un clon único que contenía el gen MNN1 de K. lactis se identificó mediante PCR de colonia completa, usando los cebadores KMN1 (SEC ID Nº: 47) y KMN2 (SEC ID Nº: 48) y se secuenció. Dentro de este clon se identificó una ORF de 2241 pb que codificaba una proteína pronosticada que era el 34% idéntica al gen MNN1 de S. cerevisiae. Se diseñaron cebadores para construcción de un alelo de supresión mnn1::NATR usando el procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15).

Este alelo de alteración se transformó en una cepa de K. lactis mediante electroporación y se seleccionaron transformantes resistentes a nourseotricina y se amplificaron por PCR para inserción homóloga del alelo de alteración. Las cepas que revelaron un patrón de PCR mutante se pueden someter a análisis de carbohidratos N-glicano de un gen informador conocido.

La Figura 12B representa los N-glicanos de la cepa de supresión de och1 mnn1 de K. lactis observados a continuación de digestión con PNGasa de MALDI-TOF como se ha descrito en el presente documento. El pico predominante en 1908 (m/z) indicaba que [d] es coherente con la masa de Man9GlcNAc2.

En la bibliografía se describen procedimientos y reactivos adicionales que se pueden usar en los procedimientos para modificar la glicosilación, tales como la Patente de Estados Unidos. Nº 5.955.422, la Patente de Estados Unidos. Nº 4.775.622, la Patente de Estados Unidos Nº 6.017.743, la Patente de Estados Unidos. Nº 4.925.796, la Patente de Estados Unidos Nº 5.766.910, la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251, la Patente de Estados Unidos Nº 5.910.570, la Patente de Estados Unidos Nº 5.849.904, la Patente de Estados Unidos Nº 5.955.347, la Patente de Estados Unidos Nº 5.962.294, la Patente de Estados Unidos Nº 5.135.854, la Patente de Estados Unidos Nº 4.935.349, la Patente de Estados Unidos Nº 5.707.828, y la Patente de Estados Unidos Nº 5.047.335. Se pueden obtener sistemas de expresión de levadura apropiados a partir de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD. Los vectores están disponibles en el mercado a partir de una diversidad de fuentes.

EJEMPLO 10

Cepas, condiciones de cultivo de reactivos

Para los ejemplos siguientes, se usaron las siguientes cepas, condiciones de cultivo y reactivos. Se usaron las cepas TOP10 o DH5a de Escherichia coli para trabajo de ADN recombinante.

Se realizó expresión de proteínas a temperatura ambiente en un formato de placa de 96 pocillos con medio complejo de glicerol tamponado (BMGY) constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, biotina al 4 X 10-5% y glicerol al 1% como un medio de cultivo. El medio de inducción fue medio complejo de metanol tamponado (BMMY) constituido por metanol al 1,5% en lugar de glicerol en BMGY.

Las enzimas de restricción y modificación fueron de New England Biolabs (Beverly, MA).

Los oligonucleótidos se obtuvieron de la instalación de Dartmouth College Core (Hanover, NH) o Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).

EJEMPLO 11

Clonación y generación de vectores de expresión para producir Man3GlcNAc2

Las enzimas de restricción y modificación fueron de New England Biolabs (Beverly, MA). El vector lanzadera pVM2 se generó a partir pUC19 mediante PCR inversa (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) en: Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2ª Edición, Cold Spring Harbor N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) usando los cebadores VJM104 y VJM106 (5'-GCGGCCGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACT-3' (SEC ID Nº: 107) y 5'

GGGGCGCGCCTTAATTAACGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT-3' (SEC ID Nº: 108), respectivamente, los sitios de restricción introducidos NotI, Ascl y Pacl están subrayados).

El plásmido de transferencia pJN285 es un derivado del plásmido pJN266 insertado que se construyó de la siguiente manera. Un fragmento de 0,9 kb de la región PpKEK1-5' se amplificó por PCR, usando los cebadores Kex55 (5'-GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAG CTTCAGA 3', SEC ID Nº: 27) y Kex53 (5'-GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAG AGGCTGACACCGCTACTA-3', SEC ID Nº: 28) a partir de ADN genómico de Pichia pastoris y se clonó en pUC19 digerido con SacI y SalI. El plásmido resultante se cortó con BamHI y SaII y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3' que se había amplificado usando los cebadores Kex35 (5'-CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG-3', SEC ID Nº: 29) y Kex33 (5'-GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGA CTCTTTTC-3', SEC ID Nº: 30) se clonó en pJN262 digerido con las mismas enzimas. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de BamHI-BgIll de 3,8 kb de pNKY51 (1) se insertó en cada una de las dos orientaciones posibles dando como resultado los plásmidos pJN263 y pJN264. Para crear un casete de expresión con sitios de clonación NotI y PacI y, el promotor GAPDH de P. pastoris se amplificó usando los cebadores Gap5 (5'-CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT-3', SEC ID Nº: 31) y Gap3 (5'-GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA-3', SEC ID Nº: 32) y el plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI-SphI de pUC19. El plásmido resultante se cortó con SpeI y SphI y la región terminadora de transcripción CYC1 de S. cerevisiae, que se había amplificado a partir de pPICZ-A (Invitrogen) usando los cebadores Cyc5 (5'-CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCA-3', SEC ID Nº : 33) y Cyc3 (5'-GGACATGCATG CGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC CC-3', SEC ID Nº: 34), se clonó en los sitios abiertos creando pJN261. El casete de expresión GAPDH/CYC1 se liberó mediante digestión con BamHI y se clonó en pJN263 dando como resultado el plásmido pJN265 o en pJN264 dando como resultado los plásmidos pJN266 y pJN267 (dependiendo de la orientación del inserto). Posteriormente, el plásmido pJN266 se cortó con NgoMIV y SwaI para liberar el casete URA-blaster, y un fragmento de NgoMIV-SwaI que contenía el gen PpHIS4, que se había amplificado a partir de pPIC3.5 (Invitrogen) usando los cebadores JNHIS1 (5'-GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG-3', SEC ID Nº: 39) y JNHIS2 (5'-GGGCGCGTATTTAAA TACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAA-3 ', SEC ID Nº: 40), se clonó en los sitios abiertos para crear pJN285.

El vector de expresión pJN348 se basa en plásmido pBLURA-SX (2). En primer lugar un fragmento de BamHI que contiene el casete de expresión GAPDH/CYC1 del vector pJN261 se clonó en pBLURA-SX que se había cortado con BamHI y BgIll para crear el plásmido pJN338. Posteriormente, el último plásmido se cortó Notl y PacI y los dos oligonucleótidos Exprl (5'-GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT-3', SEC ID Nº: 41) y Expr2 (5'-TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC-3' (SEC ID Nº: 42), el sitio de restricción AscI está subrayado) que se habían hibridado in vitro, se ligaron en los sitios abiertos, para crear pJN348.

El vector de expresión pPB124 se construyó en varias etapas, basándose en el vector pBLADE-SX descrito por Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169. En primer lugar, el fragmento BamHI que contiene el casete de expresión GAPDH/CYC1 del vector pJN261 (descrito en Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2003 29 de abril; 100 (9): 5022-7) se clonó en el vector pBLADE-SX después de la digestión con BamHI-BgIll. A continuación, el fragmento de Xhol-NotI que contiene promotor GAPDH de P. pastoris se reemplazó con el promotor del gen PMA1 de P. pastoris que se amplificó con cebadores PMA1 (5'-TTCCTCGAGATTCAAGCGAATGAGAATAATG-3', SEC ID Nº: 109) y PMA2 (5'-TTGCGGCCGCGAAG TTTTTAAAGGAAAGAGATA-3', SEC ID Nº: 110). El vector resultante después se digirió con enzimas Xbal-BamHI para retirar el marcador ADE1, y después de reacción de llenado se ligó con un fragmento de extremos romos BgIll-SacI que contiene marcador de resistencia a nourseotricina del vector pAG25 (Goldstein y McCusker, Yeast. Oct de 1999 ; 15(14): 1541-53).

EJEMPLO 12

Generación de fusiones de señal de localización/dominio catalítico de manosidasa I

Amplificación de manosidasa IA de ratón. La secuencia génica que codifica el dominio catalítico de manosidasa IA de ratón (Genbank: NM_008548, Lai y Moremen 1994) se amplificó a partir de ADNc de hígado de ratón (Clontech). En resumen, el cebador directo mMIA"187-AscI y el cebador inverso mMIA-PacI (5'-GGCGCGCCGAGCCCGCTGACGCCACCATCCGTGAGAAGAGG GC-3', (SEC ID Nº: 111) y 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 26), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados) se usaron para amplificar los aminoácidos 188-655 de la ORF de manosidasa IA de ratón a partir de ADNc de hígado de ratón (Clontech) con ADN polimerasa Pfu (Stratagene). Las condiciones usadas para la ciclación térmica fueron: 94°C durante 1 min, 1 ciclo; 94°C durante 30 s, 68°C durante 30 s, 72°C durante 3 min, 30 ciclos. Posteriormente, se añadió 1 !l de Taq ADN polimerasa (Promega) y la reacción se incubó además a 72°C durante 10 min ligando el producto de 1,4 Kb en pCR2.1, dando el plásmido pSH9. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, la

manosidasa IA de ratón se digirió con las enzimas de restricción AscI y PacI antes de subclonación en el vector pVM2, digerido con las mismas enzimas de restricción, generando el plásmido pSH21.

Para facilitar la localización posterior de la manosidasa IA de ratón truncada en el Golgi de levadura una región de la proteína Sec12 de S. cerevisiae (aminoácidos 331-432, que codifican el dominio transmembrana) se amplificó con los cebadores SC125 y SC122 (5'-ATGTGGCGGCGGCCGCCACCATGAACACTATCCACATAATAAAATTAC CGCTTAACTACGCC-3', (SEC ID Nº: 112) y 5'-GGCGCGCCCCACGCCTAGCACTTTTATGGAATCTACGCTAGGTAC3' (SEC ID Nº: 113), respectivamente, los sitios de restricción NotI y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN305. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy el fragmento Sec12, digerido con las enzimas de restricción Notl y AscI, se subclonó en pSH21 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH29. Posteriormente, el fragmento Notl/Pacl de pSH29, que codifica el fragmento Sec12 en fase con la manosidasa IA de ratón truncada, se subclonó en pJN285 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pFB8.

EJEMPLO 13

Generación de construcción de manosidasa II

El dominio catalítico de una manosidasa II de Drosophila (GenBank: X77652, Foster y Roberts 1995), que codifica los aminoácidos 75-1108, se amplificó a partir de ADNc de ovario de Drosophila usando ExTaqADN polimerasa en las condiciones de termociclado descritas anteriormente, hibridando a 55°C y prolongando durante 5 minutos. Se usó el cebador directo dMannll"74_Ascl y el cebador inverso dMannll_Pacl y (5'-GGCGCGCCCGCGACGATCCAATAAGACCTCCAC-3' (SEC ID Nº: 69) y 5'-CCTTAATTAATCAGCTTG AGTGACTGCTCACATAAGCGGCGG-3' (SEC ID Nº: 71), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados). A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el plásmido se denominó pSH214. Posteriormente, el fragmento de manosidasa II de Drosophila se retiró de este plásmido mediante digestión con las enzimas de restricción AscI y PacI y se subclonó en pJN348 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH220.

Para facilitar la localización posterior del dominio de manosidasa II de Drosophila truncado al Golgi, una región de la proteína Mnn2 de S. cerevisiae (aminoácidos 1-36, que codifican el dominio transmembrana) se amplificó con los cebadores Mnn25 y Mnn21 (5'-AGTAAAATGCGGCCGCCACCATGCTGCTTACCAAAAGGTTTTCAAAGCTGTTC-3' (SEC ID Nº: 114) y 5'-GGCGCGCCCCGACGTGTTCTCATCCATGTATTTGTTTGTAATGAC-3' (SEC ID Nº: 115), respectivamente, los sitios de restricción Notl y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN281. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el fragmento de Mnn2 se digirió con las enzimas de restricción Notl y AscI y se subclonó en pSH220 digerido con las mismas enzimas, produciendo una fusión en fase de la señal de localización Mnn2 con el dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila, generando el plásmido pKD53. El pH óptimo de este dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila modificado por ingeniería genética se determinó que era pH 6,2 usando un ensayo de pH básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 7.

EJEMPLO 14

Biblioteca de dominio catalítico de manosidasa II

La biblioteca de dominios catalíticos de manosidasa II y líderes que muestran actividad se muestran más adelante en la Tabla 11. El número de (+), como se usan en el presente documento, indica los niveles relativos de producción de GlcNAcMan3GlcNA2 del % de glicanos neutros. El símbolo (-) indica la no producción aparente de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo (+) indica menos del 20% de producción de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo (+ +) indica aproximadamente del 20-30% de producción de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo con (+++) indica aproximadamente el 30-40% de producción de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo con (++++) indica aproximadamente el 40-50% de producción de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo con (+++++) indica una producción de más del 50% de GlcNAcMan3GlcNA2. El símbolo (NG) indica que no se detectaron glicanos evidentes a partir de ninguna colonia transformada con la construcción de fusión.

Tabla 11. Dominios satalíticos

Líderes: Manosidasa II "48 de D. melanogaster Manosidasa II "99 de D. melanogaster Manosidasa II "48 humana Manosidasa II "74 de D. melanogaster Manosidasa II "108 de C. elegans

Gls1-s: ++ - + +++++ +++++

GIs1-m: + - - - ++

Gls1-I: ++ ++

Mns1-s: ++ ++++ ++++

Mns1-m: ++ ++++ ++++

Mns1-l: ++ +

S.Sec-s: ++ ++++ ++++

S.Sec-m: ++ ++++ +++

S.Sec-l: + ++++ ++++

P.Sec-s: ++ ++++ ++++

P.Sec-m: ++++ ++

P.Och-s: ++ ++

P.Och-m: +++ +++

P.Och-l: ++ ++

Mnn9-s: ++ ++++ +++

Mnn9-m

Mnn9-l: ++ ++

Van1-s: +++++ +++++

Van1-m: +++++ +++++

Van1-l: +++++ ++++

Anpl1s: +++++ ++++

Anp1-m: +++++ ++

Anp1-I: - - - ++++ +++

Hoc1-s: - - - ++++ +++

Hoc1-m: - - - ++++ +++++

Hoc1-l: + - - ++++ +++++

Mnn10-s: - - - + +++++

Mnn10-m: - - - ++++ +++++

Mnn10-l: +++ +++++

Mnn11-s: +++++ +++++

Mnn11-m: +++++

Mnn11-l: ++ ++

Mnt1-s: +++ +++++

Mnt1-m: ++++ +++++

Mnt1-l: +++ +++++

D2-s: ++ +++++

D2-m: +++ +++++

D2-l: + ++

D9-s: +++ +++

D9-m: +++++

D9-I: ++

J3-s: + + - ++

J3-m: +++++ ++++

J3-I: + +

Ktr1-s: + +++++ +++

Ktr1-l: - - + ++

Ktr2-s: + - - +++++ +++++

Ktr2-m: + - - ++ +++

Ktr2-l: + - - + ++

Gnt1-s: + + - ++++ ++++

Gnt1-m: - - + +++++ +++++

Gnt1-l: - + - ++++ ++

Mnn2-s: + + + ++++ ++++

Mnn2-m: + + - ++++ ++++

Mnn2-1: + + ++++ ++++

Mnn5-s: +++ ++++

Mnn5-m: + - +++++ +++++

Mnn5-I: + ++ +++

Yur1-s: ++ +++

Yur1-m: - + +++

Yur1-I: - ++++

Mnn1-s: + + +++++ +++++

Mnn1-m: + - + +++++ +++++

Mnn1-l: + - + +++++ +++

Mnn6-s: - + ++++ +++

Mnn6-m: + + +++++ ++++

Mnn6-l: - - ++ +++

EJEMPLO 15

Generación de construcciones de expresión de GnTII

La construcción de un vector de expresión de GnTI (pNA15) que contiene un gen de GnTI humana fusionado con la parte N-terminal del gen MNN9 de S. cerevisiae se ha descrito previamente (Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003 ;100(9): 5022-7). De una manera similar, el gen de GnTII de rata se clonó. El gen de GnTII de rata (GenBank Nº Acceso U21662) se amplificó por PCR utilizando Takara EX Taq™ polimerasa (Panvera) a partir de una biblioteca de ADNc de hígado de rata (Clontech) con los cebadores RAT1 (5'-TTCCTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3', SEC ID Nº: 116) y RAPT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3', SEC ID Nº: 117). Después, el producto de PCR se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Usando este vector como un molde, el fragmento AscI-PacI de GnTII, que codifica los aminoácidos 88-443, se amplificó con turbo polimerasa Pfu (Stratagene) y cebadores, RAT44 y RAT11 (5'-TTGGCGCGCCTCCCT AGTGTACCAGTTGAACTTTG-3' (SEC ID Nº: 118) y 5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3' (SEC ID Nº: 119), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI están subrayados). A continuación de la confirmación mediante secuenciación, el dominio catalítico de GnTII de rata se clonó después cadena abajo del promotor PMA1 como un fragmento de AscI-PacI en pBP124. En la etapa final, el fragmento génico que codifica la señal de localización Mnn2 de S. cerevisiae se clonó a partir de pJN281 como un fragmento NotI-AscI para generar una fusión en fase con el dominio catalítico de GnTII, para generar el plásmido pTC53.

EJEMPLO 16

Expresión de proteína informadora, purificación y liberación de glicanos enlazados a N

El dominio K3, bajo el control del promotor alcohol oxidasa 1 (AOX1), se usó como una glicoproteína modelo y se purificó usando la etiqueta de hexa-histidina como se ha informado en Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003;100 (9): 5022-7). Los glicanos se liberaron y se separaron de las glicoproteínas mediante una modificación de un procedimiento indicado anteriormente (Papac y col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Después de que las proteínas se redujeron y carboximetilaron, y las membranas se bloquearon, los pocillos se lavaron tres veces con agua. La proteína se desglicosiló mediante la adición de 30 !l de NH4HC03 10 mM pH 8,3 que contenía una miliunidad de Nglicanasa (Glyko). Después de incubación durante 16 h a 37°C, la solución que contenía los glicanos se retiró mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad.

Purificación de proteínas

Kringle 3 se purificó usando un formato de 96 pocillos en un robot de manejo de muestras Beckman Biomek 2000 (Beckman/Coulter Rancho Cucamonga, CA). Kringle 3 se purificó a partir de medios de expresión que usan una etiqueta de hexa-histidina C-terminal. La purificación robótica fue una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para sus resinas HisBind. En resumen, un volumen sedimentado de 150!l (!l) de resina se vertió en los pocillos de una placa de unión a lisado de 96 pocillos, se lavó con 3 volúmenes de agua y se cargó con 5 volúmenes de NiSO4 50 mM y se lavó con 3 volúmenes de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). Los medios de expresión de proteína se diluyeron 3:2, medios/PBS (PO4 60 mM, KCI 16 mM, NaCl 822 mM, pH 7,4) y se cargaron en las columnas. Después del drenaje, las columnas se lavaron con 10 volúmenes de tampón de unión y 6 volúmenes de tampón de lavado (imidazol 30 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCI 20 mM, pH 7,9) y la proteína se eluyó con 6 volúmenes de tampón de elución (imidazol 1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCI 20 mM, pH 7,9). Las glicoproteínas eluidas se evaporaron hasta sequedad mediante liofilización.

Liberación de glicanos enlazados a N

Los glicanos se liberaron y se separaron a partir de las glicoproteínas mediante una modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac, y col. AJS (1998) Glycobiology 8, 445-454). Los pocillos de una placa MultiScreen IP de 96 pocillos (membrana Immobilon-P) (Millipore) se mojaron con 100 !l de metanol, se lavaron con 3 x 150 !l de agua y 50 !l de tampón RCM (urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6), drenando con vacío ligero después de cada adición. Las muestras de proteína seca se disolvieron en 30 !l de tampón RCM y se transfirieron a los pocillos que contienen 10 !l de tampón RCM. Los pocillos se drenaron y se lavaron dos veces con tampón RCM. Las proteínas se redujeron mediante adición de 60 !l de DDT 0,1 M en tampón RCM durante 1 h a 37°C. Los pocillos se lavaron tres veces con 300 !l de agua y se carboximetilaron mediante la adición de 60 !l de ácido yodoacético 0,1 M durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron nuevamente tres veces con agua y las membranas se bloquearon mediante la adición de 100 !l de PVP 360 al 1% en agua durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se drenaron y se lavaron tres veces con 300 !l de agua y se desglicosilaron mediante la adición de 30 !l de NH4HC03 10 mM, pH 8,3 que contiene una miliunidad de N-glicanasa (Glyko). Después de 16 horas a 37ºC,

la solución que contenía los glicanos se retiró mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad.

Espectrometría de masa de MALDI/tiempo de vuelo (TOF).

Los pesos moleculares de los glicanos se determinaron usando un espectrómetro de masa MALDI-TOF lineal Voyager DE PRO (Applied Biosciences) usando extracción retardada. Los glicanos secos a partir de cada pocillo se disolvieron en 15 !l de agua y 0,5 !l se aplicaron puntualmente en placas de muestra de acero inoxidable y se mezclaron con 0,5 !l de matriz S-DHB (9 mg/ml de ácido hidroxibenzóico, 1 mg/ml de ácido 5-metoxisalicílico en 1:1 de agua/acetonitrilo al 0,1% TFA) y se permitió que se secara. Se generaron iones mediante radiación con un láser de nitrógeno pulsátil (337 nm) con un tiempo de impulso de 4 ns. El instrumento se hizo funcionar en el modo de extracción retardada con un retardo de 125 ns y un voltaje de aceleración de 20 kV. El voltaje de rejilla fue el 93,00%, el voltaje del cable guía fue el 0,1%, la presión interna fue menos de 5 X 10-7 torr, y la abertura de masa baja fue 875 Da. Los espectros se generaron a partir de la suma de 100-200 impulsos láser y se adquirieron con un digitalizador de 500 MHz. Se usó oligosacárido Man5GlcNAc2 como un patrón de peso molecular externo. Todos los espectros se generaron con el instrumento en el modo de ión positivo.

Otros:

Las proteínas se separaron mediante SDS/PAGE de acuerdo con Laemmli (Laemmli 1970).

EJEMPLO 17

Generación de Cepa YSH-1 de levadura ( och1, a1,2-manosidasa, GnTI)

La cepa indicada anteriormente BK64 de P. pastoris (Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003; 100(9): 5022-7), un auxótrofo triple (ADE, ARG, HIS), que posee la eliminación de OCH1 y que expresa el dominio kringle 3 (K3) de plasminógeno humano, se usó como la cepa huésped. BK64 se transformó con el plásmido pPB103 linealizado con la enzima de restricción EcoNI para introducir el transportador de UDP-N-acetilglucosamina de K. lactis en la célula huésped, creando de ese modo la cepa PBP-1. El Mnsl de ratón se introdujo en esta cepa mediante transformación con el plásmido pFB8 linealizado con la enzima de restricción EcoNI, generando la cepa PBP-2. El análisis de glicanos K3 a partir de proteínas aisladas de la cepa PBP-2 demostró que la glicoforma principal presente era Man5GlcNAc2.

PBP-2 se transformó posteriormente con el plásmido de GnTI humana pNA15 linealizado con la enzima de restricción Aatll, generando la cepa PBP-3. El análisis de las glicoformas de K3 producidas en la cepa PBP-3 demostró que el glicano híbrido GlcNacMan5GlcNAc2 era la estructura predominante. Para recuperar el marcador URA3 a partir de PBP-3, esta cepa se cultivó en YPD antes de la selección en medios mínimos que contenían 5-Fluoroorotico (5-FOA, BioVectra) y uracilo (Boeke y col., Mol. Gen. Genet. 197: 345-346 (1984)). La cepa recuperada sin Ura que produce glicoformas GlcNacMan5GlcNAc2 se denominó YSH-1. El perfil de N-glicano de la cepa YSH-1 se muestra en la Fig. 13 y presenta un pico predominante en 1465 m/z correspondiente a la masa de GlcNacMan5GlcNAc2 [d].

EJEMPLO 18

Generación de la cepa YSH-37 de levadura (P. pastoris que expresa manosidasa II)

YSH-1 (Ejemplo 17) se transformó con el plásmido (pKD53) de manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNN2(s) de S. cerevisiae linealizado con la enzima de restricción Apal, generando la cepa YSH-37. El análisis de las estructuras de glicano de K3 producidas en la cepa YSH-37 (Fig. 14) demostró que la glicoforma predominante a 1140 m/z corresponde a la masa de GlcNacMan3GlcNAc2 [b] y otras glicoformas de GlcNacMan4GlcNAc2 [c] a 1303 m/z y GlcNacMan5GlcNAc2 [d] a 1465 m/z.

EJEMPLO 19

Generación de la cepa YSH-44 de levadura

La cepa YSH-37 (Ejemplo 18) se transformó con un plásmido que codifica GnTII de rata/líder MNN2 (s), pTC53, linealizado con la enzima de restricción EcoRI. La cepa resultante, YSH-44, produjo un N-glicano de K3 que tiene una glicoforma única en 1356 m/z, correspondiente a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x], mediante espectrometría de masa de MALDI-TOF en modo positivo (Fig. 15).

Digestión con 1-N-acetilhexosaminidasa

Los glicanos de YSH-44 se liberaron y separaron a partir de las glicoproteínas mediante una modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac, y col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Después de que las proteínas se redujeron y se carboximetilaron y las membranas se bloquearon, los pocillos se lavaron tres veces con agua. La proteína se desglicosiló mediante la adición de 30 !l de NH4HC03 10 mM pH 8,3 que contiene una miliunidad de la N-glicanasa (Glyko, Novato, CA). Después de una digestión de 16 h a 37°C, la solución que contiene los glicanos

se retiró mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad. Después, los glicanos se secaron en un speed vac aSC210A (Thermo Savant, Halbrook, NY). Los glicanos secos se pusieron en NH4Ac 50 mM pH 5,0 a 37°C durante una noche y se añadió 1 mU de hexos (Glyko, Novato, CA). Los glicanos se analizaron y mostraron que contenían un glicano único mostrado en la Fig. 16 a 933 m/z correspondiente a la masa de Man3GlcNAc2 [a].

EJEMPLO 20

Generación de una cepa de levadura sin actividad de manosidasa II evidente

YSH-1 se transformó con un plásmido que codifica una manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNN9(m) de S. cerevisiae, plásmido pKD16, linealizado con la enzima de restricción EcoRI. La cepa resultante produjo una glicoforma única en 1464 m/z que corresponde a la masa de Man5GlcNAc2 [d] mediante espectrometría de masa MALDI-TOF en modo positivo (Fig.18). Por tanto, esta cepa no expresaba actividad de manosidasa II evidente a partir de la construcción de fusión de manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae, al menos con respecto a la glicosilación de la glicoproteína informadora K3.

EJEMPLO 21

Generación de una cepa de levadura que tiene actividad de manosidasa II

YSH-1 se transformó con un plásmido que codifica una manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae, plásmido (pKD6), linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de N-glicano de la glicoproteína K3 expresado en la cepa resultante (Fig. 19) mostró un pico predominante a 1464 m/z correspondiente a la masa de Man5GlcNAc2 [d] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] a 1139 m/z y GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] a 1302 m/z. Por tanto, la cepa de levadura resultante expresaba alguna actividad de manosidasa II detectable a partir de la construcción de fusión de manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae.

EJEMPLO 22

Generación de Cepa de Levadura YSH-27 que Tiene Actividad de Manosidasa II

YSH-1 se transformó con plásmido de manosidasa II"74 de D. melanogaster/GLS1(s) de S. cerevisiae (pKD1), linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de N-glicano de glicoproteína K3 expresada en la cepa resultante, YSH-27, mostró un pico predominante a 1139 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] (Fig. 20). La cepa resultante YSH-27 por tanto expresaba niveles significativos de actividad de manosidasa II a partir de la construcción de fusión de manosidasa II"74 de D. melanogaster/GLS1(s) de S. cerevisiae.

EJEMPLO 23

Generación de la cepa de levadura YSH-74 (actividad de manosidasa II baja)

YSH-1 se transformó con el plásmido de manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNS1(m) de S. cerevisiae (pKD5), linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de N-glicano de la glicoproteína K3 expresada en la cepa resultante, YSH-74, mostraba un pico predominante a 1140 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2

[b] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] a 1302 m/z y GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] a 1464 m/z (Fig. 21). La cepa resultante YSH-74 expresaba niveles medios de actividad manosidasa II a partir de la construcción de fusión de manosidasa II"74 de D. melanogaster/MNS1(m) de S. cerevisiae, al menos con respecto a la glicosilación de la glicoproteína informadora K3. Los glicanos de YSH-74 se analizaron adicionalmente mediante digestión con a-1,2 manosidasa de A. saitoi (Glyko, Novato, CA), que dio como resultado glicanos que mostraron un pico predominante a 1141 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] (Fig. 22).

EJEMPLO 24

Ensayos de manosidasa

Se añadió Man8GlcNAc2 marcado fluorescentemente (0,5 !g) a 20 !l de sobrenadante y se incubó durante 30 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, la muestra se analizó mediante HPLC con una columna de sílice unida a amino Econosil NH2 4,6 x 250 mm, perla de 5 micrómetros (Altech, Avondale, PA). El caudal fue de 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30°C. Después de eluir isocráticamente (A 68%:B 32%) durante 3 min, se empleó un gradiente de disolvente lineal (A 68%:B 32% a A 40%:B 60%) a lo largo de 27 min para eluir los glicanos (Turco, SJ (1981) Allal. Biochem. 118, 278-283). El disolvente A (acetonitrilo) y el disolvente B fue una solución acuosa de formato de amonio, 50 mM, pH 4,5. La columna se equilibró con disolvente (A 68%:B 32%) durante 20 min entre los desarrollos.

EJEMPLO 25

Transferencia de galactosa in vitro

Glicano enlazado a N GlcNAC2Man3GlcNAc2 obtenido a partir de la cepa YSH-44 se usó como el sustrato para la transferencia de galactosa. Veinte mg de este glicano se incubaron con 75 mg de UDP-Gal y de 10 a 50 mU de 1-1,4galactosiltranferasa (leche bovina, Calbiochem) en NH4HC03 50 mM, MnCI2 1 mM, pH 7,5 a 37°C durante 16-20 h. La Fig. 17 muestra una espectrometría de masa MALDI-TOF en modo positivo que presenta un pico uniforme en 1665 m/z que corresponde a la masa de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. El control negativo, menos galactosiltransferasa, se realizó como se ha descrito anteriormente y no mostró transferencia de galactosa al sustrato GlcNAc2Man3GlcNAc2.

EJEMPLO 26

Introducción de una nanosidasa de clase III en eucariotas inferiores

Un ADNc que codifica una manosidasa de clase III (Jarvis y col. Glycobiology 1997 7: 113-127) de células de insecto Sf9 se amplificó usando cebadores específicos para los extremos 5' y 3'. Posteriormente, el ADNc se subclonó en un plásmido de integración de levadura para investigar el efecto de esta proteína en el patrón de N-glicosilación de una proteína informadora secretada. Varios productos truncados se produjeron para generar una biblioteca de construcciones de manosidasa de clase III con diferentes fragmentos líder de dirección, como se ha descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 14. Además de expresarse solos en una cepa huésped deseada, las proteínas de fusión resultantes se expresan en combinación con otras enzimas modificadoras de glicosilación para potenciar la producción de una estructura de N-glicano deseada.

Aunque la manosidasa de Sf9 es el único miembro clonado de esta clase III hasta la fecha, los genes y EST que muestran homología significativa con esta ORF, y en particular, el dominio catalítico (restos 273 a 2241 de la ORF). Se genera una biblioteca de manosidasas de clase III que posee unos intervalos de temperatura y pH óptimos. A su vez, esto posibilitará la selección de una o más construcciones de manosidasas de clase III que funcionan óptimamente en la modificación del patrón de glicosilación de una proteína informadora seleccionada para producir una estructura de Nglicano deseada cuando se expresa en una cepa huésped deseada tal como levadura y hongos filamentosos.

Listado de Secuencias

SEC ID Nº: 1

Secuencia de ácido nucleico de a-1,2-manosidasa IA de M. musculus

SEC ID Nº: 2

Secuencia polipeptídica codificada de a-1,2-manosidasa IA de M. musculus

SEC ID Nº: 3

cebador para gen OCH1 K. lactis: ccagaagaat tcaattytgy cartgg

SEC ID Nº: 4

cebador para gen OCH1 K. lactis: cagtgaaaat acctggnccn gtcca

SEC ID Nº: 5

Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 6 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 7 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 8 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 9

Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: Gin Phe Gly Thr Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Ala Leu

SEC ID Nº: 10

Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

Leu Ser Gly Asp Phe Phe Thr Tyr Ala Asp Arg Ser Asp His

SEC ID Nº: 11

Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 12 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 13 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asp Gly Glu Ala SEC ID Nº: 14 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

Phe Tyr Thr Asp Leu Asn Gly Phe Gin Met Gin Lys Arg Arg SEC ID Nº: 15 Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2:

SEC ID Nº: 16 cebador para gen MNN1 de K. lactis: tgccatcttt taggtccagg cccgttc SEC ID Nº: 17 cebador para gen MNN1 de K. lactis: gatcccacga cgcatcgtat ttctttc SEC ID Nº: 18 Cebador: ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT SEC ID Nº: 19 Cebador: TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC SEC ID Nº: 20 Cebador: ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT SEC ID Nº: 21 Cebador: GTAATACGACTCACTATAGGGC SEC ID Nº: 22 Cebador: AATTAACCCTCACTAAAGGG SEC ID Nº: 23 Cebador: ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC SEC ID Nº: 24 Cebador: TCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG SEC ID Nº: 25 Cebador: GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC SEC ID Nº: 26 Cebador: CCTTAATTAATCATTTCTCTTTG CCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG SEC ID Nº: 27 Cebador: GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCAGA SEC ID Nº: 28 Cebador: GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACCGCTACTA SEC ID Nº: 29 Cebador: CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCCACATGG SEC ID Nº: 30 Cebador: GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGACTCTTTTC

SEC ID Nº: 31 Cebador: CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT SEC ID Nº: 32 Cebador: GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGACAA SEC ID Nº: 33 Cebador: CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCA SEC ID Nº: 34 Cebador: GGACATGCATGCGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC SEC ID Nº: 35 Cebador: GAACCACGTCGACGGCCATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATTCAAACACAAGGCATTGC SEC ID Nº: 36 Cebador: CTCCAATACTAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC SEC ID Nº: 37 Cebador: TGGAAGGTTTAAACAAAGCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAGATTAGAGAATG SEC ID Nº: 38 Cebador: AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTTTTCATC SEC ID Nº: 39 Cebador: GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG SEC ID Nº: 40 Cebador: GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAA SEC ID Nº: 41 Cebador: GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT SEC ID Nº: 42 Cebador: TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC SEC ID Nº: 43 Cebador: TGGCAGGCGCGCCTCAGTCAGCGCTCTCG SEC ID Nº: 44 Cebador: AGGTTAATTA AGTGCTAATTCCAGCTAGG SEC ID Nº: 45 Cebador: CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG SEC ID Nº: 46 Cebador: CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA SEC ID Nº: 47 Cebador: TGCCATCTTTTAGGTCCAGGCCCGTTC SEC ID Nº: 48 Cebador: GATCCCACGACGCATCGTATTTCTTTC SEC ID Nº: 49 Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) SEC ID Nº: 50 Manosidasa II de C. elegans (NM_073594) SEC ID Nº: 51 Manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116684) SEC ID Nº: 52 Manosidasa II de Drosophila (X77652) SEC ID Nº: 53 Manosidasa II Humana (U31520) SEC ID Nº: 54 Manosidasa II de ratón (X61172) SEC ID Nº: 55 Manosidasa II de rata (XM_218816) SEC ID Nº: 56 Manosidasa IIx humana (D55649) SEC ID Nº: 57 Manosidasa III de células de insectos (AF005034) SEC ID Nº: 58 Manosidasa II lisosomal humana (NM_000528) SEC ID Nº: 59 Manosidasa II citoplasmática humana (NM_006715) SEC ID Nº: 60 cebador sentido 5'- GGCGCGCCCTCACTCTCTTCCACTTCGGCGTACCAGGAC-3' Mannll de d69 AscI de arabidopsis SEC ID Nº: 61 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAATCACTTGTGAGGTCGCAGTTCAAGCTTATAAGCTC-3' Mannll de PacI de arabidopsis SEC ID Nº: 62 cebador sentido 5'- GGGCGCGCCGCGCTCACCAAACGACAAGCAAATGATTTACGG-3' Mannll d31 AscI de C. elegans SEC ID Nº: 63 cebador sentido 5'-GGGCGCGCCGCTCATATTCATCAAGTAAAGCAACATATCAAGCC-3' Mannll d108 AscI de C. elegans SEC ID Nº: 64 cebador antisentido 5'-CTTAATTAATTAAAATGATACAAGAATACTGGAAATATCGTTTGG-3' Mannll PacI de C. elegans SEC ID Nº: 65 cebador sentido 5'-GGCGCGCCACCCTTCAAGACAAACTTAGTCTGGTGG-3' Mannll d47 AscI de C. intestinalis SEC ID Nº: 66 cebador sentido 5'-GGCGCGCCCTACCACTTATAATGCCCAAGCAATTTGCG MannII d100 AscI de C. intestinalis SEC ID Nº: 67 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAATTACGTCAGTACTATTTTGTAAGCTTGTATCTC-3' Manll PacI de C. intestinalis SEC ID Nº: 68 cebador sentido 5'-GGCGCGCCCATGAGCTGGAAAATGGTTTGCAGGAGCACG-3' Mannll d48 AscI de D. melanogaster SEC ID Nº: 69 cebador sentido 5'-GGCGCGCCCGCGACGATCCAATAAGACCTCCAC-3' MannII d74 AscI de D. melanogaster SEC ID Nº: 70 cebador sentido 5'-GGCGCGCCGACGTGCCCAATGTGGATGTACAGATGCTG-3' Mannll d99 AscI de D. melanogaster SEC ID Nº: 71 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAATCAGCTTGAGTGACTGCTCACATAAGCGGCGG-3' Mannll PacI de D. melanogaster SEC ID Nº: 72 cebador sentido 5'-GGCGCGCCATAGACCATTTGGAGCGTTTGCTAGCTGAG-3' Mann2a d53 AscI humana SEC ID Nº: 73 cebador sentido 5'-GGCGCGCCGCTTCACAAAGTGGAAGTCACAATTCAGATGTGC-3'

Man2 d118 AscI humana

SEC ID Nº: 74

cebador antisentido

5'-CCCTTAATTAATCACCTCAACTGGATTCGGAATGTGCTGATTTC-3'

Mann2A PacI humana

SEC ID Nº: 75 cebador sentido 5'-GGCGCGCCGACCATTTGGAGCGTTTGCTCGCTGAGAAC-3'

Man2 d54 AscI de ratón

SEC ID Nº: 76

cebador sentido

5'-GGCGCGCCCTGCAGGCTGACCCCAGAGACTGT-3'

Man2 d107 Ascl de ratón

SEC ID Nº: 77

cebador antisentido

5'-CCCTTAATTAATCAGGTCCAACGCAAGCGGATACGGAACGTGCTGATCTC-3'

Man2 Pac1 de ratón

SEC ID Nº: 78

cebador sentido

5'-GGCGCGCCGGTGGGAACTTCCCCAGGAGCCAAATTTCTG-3'

Mannll Ascl d38 de rata

SEC ID Nº: 79

cebador sentido

5'-GGCGCGCCGCGGAGGGCCCACCAGCCCTGCTGCCCTACCAC-3'

Mannll Ascl d81 de rata

SEC ID Nº: 80

cebador antisentido

5'-CCTTAATTAACTAACCCAAGCGCAGGCGGAAGGTGCTG-3'

Mannll PacI de rata

SEC ID Nº: 81

cebador sentido

5'-GGCGCGCCCAACACGATCCCACCCGACACCAGAATG-3'

Mannllx d29 Ascl humano

SEC ID Nº: 82 cebador sentido 5'-GGCGCGCCGTGCTGGAGCTGACAGCCAACGCAGAGGG-3' Mannllx d74 Ascl humano SEC ID Nº: 83 cebador sentido 5'-GGCGCGCCGGTCAGAAGCCAGAGCTGCAGATGCTCACTG-3' Mannllx d123 Ascl humano SEC ID Nº: 84 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAACTAACCCAAGCGGAGGCGAAAGGTAGCAATC-3' Mannllx Pacl humano SEC ID Nº: 85 cebador sentido 5'-GGCGCGCCCAGAACTATAACAAACCAAGAATCAGTTACCCAGCC-3' SfMannlII d36 AscI SEC ID Nº: 86 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAATTAAAACCTGATCTTGTAAGTTTTTACCTCCATAGCG-3' SfMannlll PacI SEC ID Nº: 87 cebador sentido 5'-GGCGCGCCATGGGCTACGCGCGGGCTTCGGGGGTCTGCG-3' MannII AscI lisosomal humano SEC ID Nº: 88 cebador sentido 5-GGCGCGCCCCGCCTCTCTGCTTTTTCCTTTTGTTGCTG-3' MannII d31 AscI lisosomal humano SEC ID Nº: 89 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAACTAACCATCCACCTCCTTCCATTGAACTGAG-3' MannII PacI lisosomal humano SEC ID Nº: 90 cebador sentido 5'-GGCGCGCCATGGCGGCAGCGCCGTTCTTGAAGCACTGGCGC-3' Mannll AscI citosólica humana SEC ID Nº: 91 cebador antisentido 5'-CCTTAATTAATTAGGCTGGGGAAGCAGAAATTAGGAGTCC-3' Mannll PacI citosólica humana

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> HAMILTON, STEPHEN R.

<120> EXPRESIÓN DE MANOSIDASA DE CLASE 2 Y MANOSIDASA DE CLASE III EN CÉLULAS EUCARIOTAS INFERIORES

<130> L2573 EP/2 S3

<150>: 10/616,082 <151> 2003-07-08

<150>: 10/371,877 <151> 2003-02-20

<150>: 09/892,591 <151> 2001-06-27

<150>: 60/214,358 <151> 2000-06-28

<150>: 60/215,638 <151> 2000-06-30

<150>: 60/279,997 <151> 2001-03-30

<160> 119

<170> PatentIn Ver. 3.2

<210> 1

<211> 1968

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1965)

<400> 1

<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> ADN

<213> Kluyveromyces lactis 5

<400> 3 ccagaagaat tcaattytgy cartgg 26

<210> 4

<211>.25 10 <212> ADN

<213> Kluyveromyces lactis

<220>

<221> base modificada

<222> (17) 15 <223> a, c, g, t, otro o desconocido

<220>

<221> base modificada

<222> (20)

<223> a, c, g, t, otro o desconocido

20 <400> 4 cagtgaaaat acctggnccn gtcca 25

<210> 5

<211> 23

<212> PRT 25 <213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de organismo desconocido: Secuencia de aminoácidos conservados de la manosidasa de clase 2

<400> 5

30 <210> 6

<211> 57

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción deOrganismo desconocido: Secuencia de aminoácidos conservados de la manosidasa de clase 2

<400> 6

<210> 7

<211> 33

<212> PRT

<213> Organismo desconocido 10 <220>

<400> 7

<210> 8 15 <211> 28

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo desconocido: Secuencia de aminoácidos conservados de la manosidasa de clase 2 20 <400> 8

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<400> 9

<210> 10

<211> 14 10 <212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> Organismo desconocido 20 <220>

<400> 11

<210> 12 25 <211> 27

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de organismo desconocido: Secuencia de aminoácidos conservados de la manosidasa de clase 2 <400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<400> 13

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> Organismo desconocido 15 <220>

<400> 14

<210> 15 20 <211> 66

<212> PRT

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de organismo desconocido: Secuencia de aminoácidos conservados de la manosidasa de clase 2 25 <400> 15

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 16 tgccatcttt taggtccagg cccgttc 27

<210> 17

<211> 27

<212> ADN

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 17 gatcccacga cgcatcgtat ttctttc 27

<210> 18

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético"

<400> 18 atggcgaagg cagatggcag t 21

<210> 19

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: Cebador sintético"

<400> 19 ttagtccttc caacttcctt c 21

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 20 actgccatct gccttcgcca t 21

<210> 21

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 21 gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 22 aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 23

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 23 atgcccgtgg ggggcctgtt gccgctcttc agtagc 36

<210> 24

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 24 tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg 40

<210> 25

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 25 ggcgcgccga ctcctccaag ctgctcagcg gggtcctgtt ccac 44

<210> 26

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 26 ccttaattaa tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg 50

<210> 27

<211>: 51

<211>: 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 27

ggcgagctcg gcctacccgg ccaaggctga gatcatttgt ccagcttcag a: 51

<210> 28

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 28

gcccacgtcg acggatccgt ttaaacatcg attggagagg ctgacaccgc tacta 55

<210> 29

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 29

cgggatccac tagtatttaa atcatatgtg cgagtgtaca actcttccca catgg: 55

<210> 30

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 30

ggacgcgtcg acggcctacc cggccgtacg aggaatttct cggatgactc ttttc: 55

<210> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 31 cgggatccct cgagagatct tttttgtaga aatgtcttgg tgcct 45

<210> 32

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 32

<210> 33

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 33 ccttgctagc ttaattaacc gcggcacgtc cgacggcggc ccacgggtcc ca 52

<210> 34

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 34

<210> 35

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 35

<210> 36

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 36 ctccaatact agtcgaagat tatcttctac ggtgcctgga ctc 43

<210> 37

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 37 tggaaggttt aaacaaagct agagtaaaat agatatagcg agattagaga atg 53

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221>: Fuente

<221>: Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 38

aagaattcgg ctggaaggcc ttgtaccttg atgtagttcc cgttttcatc 50

<210> 39

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 39

gcccaagccg gccttaaggg atctcctgat gactgactca ctgataataa aaatacgg: 58

<210> 40

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 40

gggcgcgtat ttaaatacta gtggatctat cgaatctaaa tgtaagttaa aatctctaa: 59

<210> 41

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 41

ggccgcctgc agatttaaat gaattcggcg cgccttaat: 39

<210> 42

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 42 taaggcgcgc cgaattcatt taaatctgca gggc 34

<210> 43

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 43 tggcaggcgc gcctcagtca gcgctctcg 29

<210> 44

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 44 29 aggttaatta agtgctaatt ccagctagg 29

<210> 45

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 45 ccagaagaat tcaattytgy cartgg 26

<210> 46

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<220>

<221> base modificada

<222> (17)

<223> a, c, g, or t

<220>

<221> base modificada

<222> (20)

<223> a, c, g, or t

<400> 46 cagtgaaaat acctggnccn gtcca 25

<210> 47

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 47 tgccatcttt taggtccagg cccgttc 27

<210> 48

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 48 gatcccacga cgcatcgtat ttctttc 27

<210> 49

<211> 3522

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS

<222> (1)..(3519)

<400> 49

<210> 50

<211> 3432

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3429)

<400> 50

<210> 51

<211> 3450

<212> ADN

<213> Ciona intestinalis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3447)

<400> 51

<210> 52

<211> 3327

<212> ADN

<213> Drosophila sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3324)

<400> 52

<210> 53

<211> 3435

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3432) <400> 53

<210> 54

<211> 3453

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3450)

<400> 54

<210> 55

<211> 3840 5 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3837) 10 <400> 55

<210> 56

<211> 3420

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3417)

<400> 56

<210> 57

<211> 3393

<212> ADN

<213> spodoptera frugiperda

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3390)

<400> 57

<210> 58

<211> 3033

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3030)

<400> 58

<210> 59

<211> 3189

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3186)

<400> 59

<210> 60

<211> 39

<212> ADN

5: <213> Arabidopsis thaliana

<400> 60

ggcgcgccct cactctcttc cacttcggcg taccaggac: 39

<210> 61

<211> 45

10: <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 61

ccttaattaa tcacttgtga ggtcgcagtt caagcttata agctc: 45

<210> 62

15: <211> 42

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 62

gggcgcgccg cgctcaccaa acgacaagca aatgatttac gg: 42

20: <210> 63

<211> 44

<212> ADN

<213> caenorhabditis elegans

<400> 63

gggcgcgccg ctcatattca tcaagtaaag caacatatca agcc: 44

<210> 64

<211> 45

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 64

cttaattaat taaaatgata caagaatact ggaaatatcg tttgg: 45

<210> 65

<211> 36

<212> ADN

<213> Ciona intestinalis

<400> 65

ggcgcgccac ccttcaagac aaacttagtc tggtgg: 36

<210> 66

<211> 38

<212> ADN

<213> Ciona intestinalis

<400> 66

ggcgcgccct accacttata atgcccaagc aatttgcg: 38

<210> 67

<211> 43

<212> ADN

<213> Ciona intestinalis

<400> 67

ccttaattaa ttacgtcagt actattttgt aagcttgtat ctc: 43

<210> 68

<211> 39

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 68

ggcgcgccca tgagctggaa aatggtttgc aggagcacg: 39

<210> 69

<211> 33

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 69

ggcgcgcccg cgacgatcca ataagacctc cac: 33

<210> 70

<211> 38

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 70

ggcgcgccga cgtgcccaat gtggatgtac agatgctg: 38

<210> 71

<211> 42

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 71

ccttaattaa tcagcttgag tgactgctca cataagcggc gg: 42

<210> 72

<211> 38

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72

ggcgcgccat agaccatttg gagcgtttgc tagctgag: 38

<210> 73

<211> 42

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73

ggcgcgccgc ttcacaaagt ggaagtcaca attcagatgt gc: 42

<210> 74

<211> 44

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74

cccttaatta atcacctcaa ctggattcgg aatgtgctga tttc: 44

<210>: 75

<210>: 81

<211> 38

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 75

ggcgcgccga ccatttggag cgtttgctcg ctgagaac: 38

<210> 76

<211> 32

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 76

ggcgcgccct gcaggctgac cccagagact gt: 32

<210> 77

<211> 50

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 77

cccttaatta.atcaggtcca acgcaagcgg atacggaacg tgctgatctc: 50

<210> 78

<211> 39

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 78

ggcgcgccgg tgggaacttc cccaggagcc aaatttctg: 39

<210> 79

<211> 41

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 79

ggcgcgccgc ggagggccca ccagccctgc tgccctacca c: 41

<210> 80

<211> 38

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 80

ccttaattaa ctaacccaag cgcaggcgga aggtgctg: 38

<211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 81 ggcgcgccca acacgatccc acccgacacc agaatg 36

<210> 82

<211> 37

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 82 ggcgcgccgt gctggagctg acagccaacg cagaggg 37

<210> 83

<211> 39

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 83 ggcgcgccgg tcagaagcca gagctgcaga tgctcactg 39

<210> 84

<211> 41

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 84 ccttaattaa ctaacccaag cggaggcgaa aggtagcaat c 41

<210> 85

<211> 44

<212> ADN

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo desconocido: SfMannIII d36 ASCI

<400> 85 ggcgcgccca gaactataac aaaccaagaa tcagttaccc agcc 44

<210> 86

<211> 47

<212> ADN

<213> Organismo desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo desconocido: SfMannIII PacI

<400> 86 ccttaattaa ttaaaacctg atcttgtaag tttttacctc catagcg 47

<210> 87

<211> 39

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 87 ggcgcgccat gggctacgcg cgggcttcgg gggtctgcg 39

<210> 88

<211> 38

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 88 ggcgcgcccc gcctctctgc tttttccttt tgttgctg 38

<210> 89

<211> 41

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 89 ccttaattaa ctaaccatcc acctccttcc attgaactga g 41

<210> 90

<211> 41

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 90 ggcgcgccat ggcggcagcg ccgttcttga agcactggcg c 41

<210> 91

<211> 40

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 91 ccttaattaa ttaggctggg gaagcagaaa ttaggagtcc 40

<210> 92

<211> 1143

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 92

<210> 93

<211> 1279

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 93

<210> 94

<211> 1149

<212> PRT

<213> Ciona intestinalis

<400> 94

<210> 95

<211> 1173

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 95

<210> 96

<211> 1108

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

<400> 96

<210> 97

<211> 1144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

<210> 98

<211> 1150

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 98

<210> 99

<211> 1139

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

<210> 100

<211> 1130

<212> PRT

<213> spodoptera frugiperda

<400> 100

<210> 101

<211> 1010

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

<210> 102

<211> 1062

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

<210> 103

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<220>

<221> base modificada

<222> (9)

<223> a, c, g or t

<220>

<221> base modificada

<222> (12)

<223> a, c, g or t

<220>

<221> base modificada

<222> (18)

<223> a, c, g or t

<400> 103 taytggmgng tngarcynga yathaa 26

<210> 104

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<220>

<221> base modificada

<222> (6)

<223> a, c, g or t

<220>

<221> base modificada

<222> (12) <223> a, c, g or t

<400> 104 gcrtcncccc anckytcrta 20

<210> 105

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: Synthetic peptide"

<400> 105 His Asp Glu Leu 1

<210> 106

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: Synthetic peptide"

<400> 106 Lys Asp Glu Leu 1

<210> 107

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 107 gcggccgcgg atccccgggt accgagctcg aattcact 38

<210> 108

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente .

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 108 ggggcgcgcc ttaattaacg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcat 57

<210> 109

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 109 ttcctcgaga ttcaagcgaa tgagaataat g 31

<210> 110

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 110 ttgcggccgc gaagttttta aaggaaagag ata 33

<210> 111

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 111 ggcgcgccga gcccgctgac gccaccatcc gtgagaagag ggc 43

<210> 112

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 112

<210> 113

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 113 ggcgcgcccc acgcctagca cttttatgga atctacgcta ggtac 45

<210> 114

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 114 agtaaaatgc ggccgccacc atgctgctta ccaaaaggtt ttcaaagctg ttc 53

<210> 115

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético"

<400> 115 ggcgcgcccc gacgtgttct catccatgta tttgtttgta atgac 45

<210> 116

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<400> 116 ttcctcactg cagtcttcta taact 25

<210> 117

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<400> 117 tggagaccat gaggttccgc atctac 26

<210> 118

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<400> 118 ttggcgcgcc tccctagtgt accagttgaa ctttg 35

<210> 119

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota="Descripción de Secuencia artificial: primer"

<400> 119 gattaattaa ctcactgcag tcttctataa ct 32

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende:

(a)

un dominio catalítico de manosidasa capaz de hidrolizar un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal 3 y/o Manal,6; condensado con

(b)

un péptido señal de dirección celular que normalmente no está asociado con el dominio catalítico de (a), en el que dicho péptido señal de dirección celular está dirigido a dicho dominio catalítico de la manosidasa a la ruta secretora de la célula huésped

en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo al menos el 10% de los enlaces Manal,3 y/o Manal,6 de un sustrato que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal,3 y Manal,6, de modo que convierte

Man6GlacNAc2 en Man4GlacNAc2.
2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio catalítico IIx de manosidasa es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99).
3.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido señal de dirección celular se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces GLS1, Saccharomyces MNS1, Saccharomyces SEC12, Pichia SEC, Saccharomyces MNN9, Saccharomyces VAN1, Saccharomyces ANP1, Saccharomyces HOC1, Saccharomyces MNN10, Saccharomyces MNN11, Saccharomyces MNT1, Pichia D2, Pichia D9, Pichia J3, Saccharomyces KTR1, Saccharomyces KTR2, Kluyveromyces GnTI, Saccharomyces MNN2, Saccharomyces MNN5, Saccharomyces YUR1, Saccharomyces MNN1 y Saccharomyces MNN6.
4.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la célula huésped expresa además al menos una actividad enzimática seleccionada del grupo que consiste en a-1,2-manosidasa, el transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferasa (GnT), galacosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST)),
5.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos que comprenden Man3GlcNAc2,Man4GlcNAc2,GlcNAc2 Man3GlcNAc2 o GlcNAc2 Man3GlcNAc2
6.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos que comprenden la rama de oligosacárido Mana1,3 (Manal,6), Man11,4-GlcNAc 11,4-GlcNAc-Asn,
7.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa Ix tiene una especificidad de sustrato por Manα1,2 Manal,3 (Manal,3 Manal,6 Manal,6) Manβ1,4-GlcNAc β1,4-GlcNAc-Asn; Manα1,2 Manα1,3 (Manα1,6, Manα1,6) Manβ1,4-GlcNAc β1,4-GlcNAc-Asn; Manα1,2 Manal,3 (Manal,3 Manal,6) Manβ1,4-GlcNAc β1,4-GlcNAc-Asn; o alto contenido en mananos.
8.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa IIx está sobreexpresada.
9.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa IIx tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.
10.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped.
11.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa nativo de la la célula huésped.
12.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa heterólogo para la célula huésped.
13.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx es una manosidasa IIx de células humanas.
14.

El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99).
15.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa de

un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido nativo de dirección celular nativo para la célula huésped.
16.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido nativo de dirección celular heterólogo para el dominio catalútico de la manosidasa.

17- El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de aislar la glicoproteína de la célula huésped.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.
19.El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.
20.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína es una proteína terapéutica.
21.El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por eritropoyetina, citoquinas, factores de coagulación, cadena a de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa, inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina, a-1-antitripsina, a-feto proteína , AAT, rhTBP-1 (onercept o proteína de unión a TNF1), TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículos), GM-CSF, GLP-1, con y sin FC (proteína similar a glucagón 1), agonista del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel o fusión Fc de receptor de TNF soluble), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg (lg Antígeno 4 asociado con Linfocitos T Citotóxicos).
22.

Una biblioteca de ácido nucleico que comprende al menos dos constructos genéticos diferentes para expresión en una célula huésped hongo filamentoso unicelular o multicelular, que comprende fragmentos de ácido nucleico que codifican dominios catalíticos de la manosidasa IIx ligados en el mismo marco con fragmentos de ácido nucleico que codifican péptidos señal de dirección celular que normalmente no se asocian con el dominio catalítico.
23.

La biblioteca de la reivindicación 22, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es una manosidasa IIx de célula humana.
24.

La biblioteca de la reivindicación 23, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es el el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99).
25.

La biblioteca de la reivindicación 22, e la que el fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido de dirección celular se selecciona del grupo que consiste en: Saccharomyces GLS 1, Saccharomyces MNS1, Saccharomyces SEC12, Pichia SEC, Pichia OCH1, Saccharomyces MNN9, Saccharomyces VAN1, Saccharomyces ANP1, Saccharomyces HOC1, Saccharomyces MNN10, Saccharomyces MNN11, Saccharomyces MNT1, Pichia D2, Pichia D9, Pichia J3, Saccharomyces KTR1, Saccharomyces KTR2, Kluyveromyces GnTI, Saccharomyces MNN2, Saccharomyces MNN5, Saccharomyces YLJR1, Saccharomyces MNN1, and Saccharomyces MNN6.
26.Una enzima quimérica que comprende un dominio catalítico de manosidasa IIx condensado en el mismo marco con un péptido señal de dirección celular que normalmente no se asocia con dicho dominio catalítico y dirige la enzima quimérica a la ruta secretora de la célula huésped, en la que tras la expresión en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, es capaz de hidrolizar in vivo un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos del enlace glicosífico Mana1,3 y Manal,6, hasta el alcance que al menos 10% de los enlaces Mana1,3 y/o Manal,6 del sustrato se hidrolizan in vivo.
27. La enzima quimérica de la reivindicación 26, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIc humana (SEC ID Nº:99).
28.Un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica de la reivindicación 26.
29.Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o multicelular que comprende una enzima quimérica de la reivindicación 26.
30.

Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o multicelular que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 28
31.

Una célula huésped de la reivindicación 29 o 30, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae,

5 Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.
32. Una célula huésped de la reivindicación 31, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

Fase de lectura abierta de alfa-1,2-manosidasa IA de M. musculus. Los dominios transmembrana y catalítico se destacan en negritas respectivamente. La secuencia de los cebadores usados para generar los truncamientos N-terminal se destacan mediante subrayado y el inicio de cada fragmento de proteína respectivo se indica mediante una flecha.

FIG. 25 Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499)

FIG. 27 Manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116648)

FIG. 29 Manosidasa II humana (U31520)

FIG. 31 Manosidasa II de rata (XM_218816)

FIG. 33 Manosidasa II de células de insecto (AF005034)

FIG. 35 Manosidasa II citoplasmática humana (NM_006715)