PT1597380E

PT1597380E - Expressão de manosidase de classe 2 e de manosidase de classe iii em células de eucariotas inferiores

Info

Publication number: PT1597380E
Application number: PT04713372T
Authority: PT
Inventors: Stephen R Hamilton
Original assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2010-03-22
Also published as: WO2004074498A3; ES2399736T3; ATE455860T1; EP2088201B1; ES2428766T9; US8299228B2; EP2333096A3; EP1597380B1; EP2083084A1; CA2516544A1; EP2333096B1; SI1597380T1; EP2088201A1; JP2011036252A; EP2333096A2; DE602004025206D1; ES2338324T3; US20040230042A1; EP2333095A1; EP1597380B2

Description

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DESCRIÇÃO "EXPRESSÃO DE MANOSIDASE DE CLASSE 2 E DE MANOSIDASE DE CLASSE III EM CÉLULAS DE EUCARIOTAS INFERIORES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção insere-se no campo da glicosilação de proteínas em leveduras ou em fungos filamentosos unicelulares ou multicelulares, e diz respeito concretamente à introdução de uma enzima manosidase que possui especificidade de substrato para a hidrólise de ligações glicosídicas Manai,3 e/ou Manai,6. A presente invenção também diz respeito a novas células hospedeiras que compreendem genes que codificam uma enzima manosidase e intermediários N-glicanos ou que contêm N-glicanos produzidos como resultado da hidrólise.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vias de glicosilação em seres humanos e eucariotas inferiores

Depois de o ADN ter sido transcrito e traduzido numa proteína, o processamento subsequente pós-traducional implica a ligação de resíduos de açúcares, um processo conhecido por glicosilação. Os diferentes organismos produzem diferentes enzimas de glicosilação (glicosil-transferases e glicosidases) e têm disponíveis diferentes substratos (açúcares de nucleótidos), pelo que os padrões de glicosilação e também a composição dos oligossacarídeos individuais, ainda que da mesma proteína, irão ser diferentes consoante o sistema hospedeiro em que a proteína particular 2 irá ser expressa. As bactérias, tipicamente, não realizam a glicosilação de proteínas, e quando esta ocorre é de uma maneira bastante não específica (Moens e Vanderleyden (1997) Arch Microbiol. 168 (3): 169-175). Os eucariotas inferiores, tais como os fungos filamentosos e as leveduras, acrescentam principalmente manose e açúcares manosilfosfatos. 0 glicano resultante é conhecido pela designação de glicano de tipo "rico em manose" ("high-manose") ou manano. As células vegetais e as células de insectos (tais como as células Sf9) glicosilam proteínas ainda de uma outra maneira. Pelo contrário, nos eucariotas superiores, tais como os seres humanos, a cadeia lateral oligossacarídica nascente pode ser rectificada para remoção de diversos resíduos manose e alongada com resíduos açúcar suplementares que não se encontram tipicamente nos N-glicanos dos eucariotas inferiores. Ver, v.g., R.K. Bretthauer, et al. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30: 193-200; W. Martinet, et al. Biotechnology Letters, 1998, 20: 1171-1177; S. Weikert, et al. Nature Biotechnology, 1999, 17: 1116-1121; M. Malissard, et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267: 169-173; Jarvis, et al., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9: 528-533; e M. Takeuchi Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9: S29-S35. A síntese de uma estrutura oligossacarídica do tipo da dos mamíferos começa com um conjunto de reacções sequenciais no decurso da qual os resíduos açúcares são acrescentados e removidos enquanto a proteína se desloca ao longo da via secretória no organismo hospedeiro. As enzimas residentes ao longo da via de glicosilação da célula ou organismo 3 hospedeiro determinam os padrões resultantes de glicosilação das proteinas secretadas. Assim, o padrão resultante de glicosilação de proteinas expressas em células hospedeiras de eucariotas inferiores difere substancialmente do padrão de glicosilação das proteinas expressas em eucariotas superiores, tais como os seres humanos e outros mamíferos (Bretthauer, 1999). A estrutura de um N- glicano fúngico típico está ilustrada na figura IA.

Os passos iniciais de glicosilação nos seres humanos podem ser divididos pelo menos em duas fases diferentes: (i) os oligossacarídeos Glc3Man9GlcNAc2 ligados a lípidos são montados por meio de um conjunto sequencial de reacções na membrana do retículo endoplásmico (RE) e (ii) a transferência deste oligossacarídeo a partir da âncora lipídica pirofosfato de dolicilo para a proteína sintetizada de novo. 0 local da transferência específica é definido por um resíduo asparagina (Asn) na sequência Asn-Xaa-Ser/Thr, em que Xaa pode ser qualquer aminoácido com a excepção de prolina (Gavel e von Heijne, 1990, Protein Eng. 3: 433-42). O processamento subsequente por glucosidades e manosidases ocorre no RE antes de a glicoproteína nascente ser transferida para a face cis do aparelho de Golgi, onde os resíduos manose adicionais são removidos pelas (α)-1,2-manosidases específicas do aparelho de Golgi. O processamento prossegue à medida que a proteína avança através do Golgi. No Golgi mediano, há diversas enzimas modificadoras, incluindo as N-acetil-glucosaminil-transferases (GnTl, GnTII, GnTlll, GnTIV e GnTV), a manosidase II e as fucosil-transferases, que adicionam e removem resíduos de açúcar específicos. Finalmente, no trans- 4

Golgi, as galactosil-tranferases (GalT) e as sialil-transferases (ST) produzem uma estrutura glicoproteíca que é libertada a partir do Golgi. É esta estrutura, caracterizada por estruturas bi-, tri- e tetra-antenárias, contendo galactose, fucose, N-acetilglucosamina e uma concentração elevada de ácido siálico terminal, que confere às glicoproteinas as suas caracteristicas humanas. A estrutura de um N-glicano humano tipico está ilustrada na figura 1B.

Em quase todos os eucariotas, as glicoproteinas provêm de um precursor oligossacaridico Glc3Man9GlcNAC2-dolicol-pirofosfato ligado a um lipido comum. No interior do reticulo endoplásmico, a sintese e o processamento de oligossacarideos ligados ao pirofosfato de dolicol são idênticos em todos os eucariotas conhecidos. No entanto, o processamento subsequente do oligossacarideo central (core) pelas células fúngicas, v.g., de leveduras, depois de ter sido transferido para um péptido que sai do RE e entra no Golgi, difere significativamente do que sucede nos seres humanos, à medida que se desloca ao longo da via secretória e implica a adição de diversos açúcares manose.

Nas leveduras, estes passos são catalisados pelas manosil-transferases residentes no Golgi, tais como Ochlp, Mntlp e Mnnlp, que acrescentam sequencialmente açúcares manose ao oligossacarideo central. A estrutura resultante é indesejável para a produção de proteínas de tipo humano e por esse motivo é desejável reduzir ou eliminar a actividade da manosil-transferase. Foi já comprovado que mutantes de S. cerevisiae, deficientes em actividade de manosil-transferase (por exemplo, os mutantes ochl ou mnn9) não são letais e 5 apresentam um teor reduzido em manose no oligossacarídeo de glicoproteínas de leveduras, sendo assim mais semelhantes aos oligossacarideos de eucariotas superiores.

Precursores de açúcares dos nucleótidos

Os N-glicanos das glicoproteínas de animais contêm tipicamente galactose, fucose e ácido siálico terminal. Estes açúcares não existem nas glicoproteínas produzidas em leveduras e em fungos filamentosos. Nos seres humanos, todos os precursores de açúcares dos nucleótidos (v.g., UDP-N-acetil-glucosamina, UDP-N-acetil-galactosamina, ácido CMP-N-acetil-neuramínico, UDP-galactose, GDP-fucose, etc.) são sintetizados no citossol e transportados para o Golgi, onde são ligados ao oligossacarídeo central pelas glicosil-transferases. (Sommers e Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91 (2): A406-A406; Sommers e Hirschberg (1982) J Biol. Chem. 257 (18): 811-817; Perez e Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715).

As reacções de transferência do grupo glicosilo produzem tipicamente um produto secundário que é um difosfato ou monofosfato de nucleosídeo. Enquanto os monofosfatos podem ser exportados directamente na permuta com açúcares de trifosfato de nucleosídeo por meio de um mecanismo anti-porte, os difosfonucleosídeos (v.g., GDP) têm de ser clivados pelas fosfatases (v.g., GDPase) para gerarem monofosfatos de nucleosídeo e fosfato inorgânico antes de serem exportados. Esta reacção é importante para uma glicosilação eficiente; por exemplo, concluiu-se que a GDPase proveniente de Saccharomyces cerevisiae {S. cerevisiae) era necessária para 6 a manosilação. No entanto, essa GDPase tem uma actividade 90% reduzida em relação a UDP (Berninsone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Aos eucariotas inferiores falta-lhes, tipicamente, no Golgi, actividade de difosfatase específica de UDP, uma vez que não utilizam os precursores de UDP-açúcar para a síntese de glicoproteínas com base no Golgi. Descobriu-se que o Schizosaccharomyces pombe, uma levedura sobre a qual se sabe que acrescenta resíduos galactose aos polissacarídeos das paredes celulares (a partir de UDP-galactose) possui actividade de UDPase específica, indicando a potencial necessidade de uma tal enzima (Berninsone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Sabe-se que a UDP é um poderoso inibidor das glicosil-transferases e que a remoção deste produto secundário da glicosilação pode ser importante para evitar a inibição da glicosil-transferase no lúmen do Golgi (Khatara et al., 1974). Ver Berninsone, P., et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 (24): 14564-14567; Beaudet, L., et al., 1998, Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects 292: 397-413.

Processamento sequencial de N-glicanos por actividades enzimáticas compartimentalizadas

As transferases de açúcares e as glicosidases (v.g., manosidases) revestem a superfície interior (luminal) do RE e do aparelho de Golgi e por esse motivo proporcionam uma superfície "catalítica" que permite o processamento sequencial de glicoproteínas, à medida que progridem através da rede de RE e do Golgi. Os compartimentos múltiplos do Golgi cis, mediano e trans e a rede trans-Golgi (TGN) , 7 proporcionam as diferentes locais onde pode ter lugar a sequência ordenada de reacções de glicosilação. À medida que uma glicoproteina progride desde a sintese no RE até à maturação total no Golgi trans ou TGN, vai ficando sequencialmente exposta a diferentes glicosidases, manosidases e glicosil-transferases, de tal modo que pode ser sintetizada uma estrutura específica de hidratos de carbono. Foi já dedicado imenso trabalho à pesquisa do mecanismo exacto segundo o qual estas enzimas são retidas e ancoradas aos seus respectivos organelos. 0 quadro desta transformação progressiva é complexo, mas os dados existentes sugerem que a região formativa, a região transmembranar e a cauda citoplásmica, individual ou concertadamente, encaminham as enzimas para a membrana de cada um dos organelos e assim localizam o dominio catalítico associado a esse local (ver, v.g.r Gleeson, P.A. (1998) Histochem. Cell Biol. 109: 517- 532) .

Em alguns casos, concluiu-se que estas interacções específicas funcionam noutras espécies. Por exemplo, demonstrou-se que o domínio transmembranar de oí-2,6-ST dos ratos, que é uma enzima sobre a qual se sabe que está localizada no trans-Golgi do animal, localiza também um gene repórter (invertase) no Golgi de leveduras (Schwientek et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). No entanto, esse mesmo domínio transmembranar, enquanto parte do comprimento completo de a-2,6-ST, foi retido no RE e já não foi transportado para o Golgi de leveduras (Krezdorn et al. (1994) Eur. J. Biochem. 220(3): 809-17). Um GalT de comprimento completo dos seres humanos ainda não foi sintetizado em leveduras, apesar dos níveis de transcrição demonstravelmente elevados. Pelo contrário, a região transmembranar do mesmo GalT humano, fundida com um repórter de invertase, foi capaz de orientar a localização para o Golgi de leveduras, embora com níveis de produção diminutos. Schwientek e seus colaboradores demonstraram que a fusão de 28 aminoácidos de uma manosil-transferase de leveduras (MNT1), uma região que contém uma cauda citoplásmica, uma região transmembranar e 8 aminoácidos da região formativa, com o domínio catalítico do GalT humano é suficiente para a localização de um GalT activo no Golgi. Há outras galactosil-transferases que parece que contam com interacções com enzimas residentes em organelos particulares porque continuam a ser, após a remoção da sua região transmembranar, capazes de efectuar a localização correcta. A localização inadequada de uma enzima de glicosilação pode impedir o funcionamento correcto da enzima na via. Por exemplo, Aspergillus nidulans, que possui inúmeras a-1,2-manosidases (Eades e Hintz (2000) Gene 255(1): 25-34), não acrescenta GlcNAc a Man5GlcNAc2 quando transformado com o gene GnTI de coelho, apesar do elevado nível geral de actividade de GnTI (Kalsner et al. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). O GnTI, embora activamente expresso, pode estar incorrectamente localizado, de tal modo que a enzima não fique em contacto com os seus dois substratos: UDP-GlcNAc e um substrato de Man5GlcNAc2 produtivo (nem todas as estruturas de Man5GlcNAc2 são produtivas; ver adiante). Em alternativa, o organismo hospedeiro pode não proporcionar um nível adequado de UDP-GlcNAc no Golgi ou a enzima pode estar correctamente 9 localizada, mas, mesmo assim, inactiva no seu novo ambiente. Além disso, as estruturas de Man5GlcNAc2 presentes na célula hospedeira podem ser diferentes da estrutura de Man5GlcNAC2 existente em mamíferos. Maras e seus colaboradores concluíram que cerca de um terço dos N-glicanos provenientes de celobioidrolase I (CBHI), obtidas a partir de T. reeseí, podem ser rectificados em Man5GlcNAc2 pela 1,2-manosidase de A. saitoi in vitro. No entanto, menos de 1% desses N-glicanos poderiam servir como substrato produtivo para o GnTI. Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707. Assim sendo, a simples presença de Man5GlcNAc2 não garante que seja possível conseguir in vivo o processamento subsequente de Man5GlcNAc2. o que é necessário é a formação de uma estrutura produtiva de Man5GlcNAc2 reactiva com GnTI. Embora o Man5GlcNAc2 pudesse ser produzido na célula (cerca de 27% em moles), apenas uma pequena fracção poderia ser convertida em Man5GlcNAc2 (menos de cerca de 5%, ver Chiba et al., WO 01/14522).

Até ao momento presente, ainda não houve nenhuma forma viável de se prever se uma glicosil-transferase ou uma manosidase particulares, expressas heterologamente, num eucariota inferior serão (1) suficientemente traduzidas, (2) cataliticamente activas ou (3) localizadas no organelo adequado contido na via secretório. Uma vez que são necessárias as três condições enumeradas para afectar os padrões de glicosilação em eucariotas inferiores, considera-se que seria desejável dispor de um esquema sistemático para conseguir a desejada função catalítica e a correcta retenção de enzimas na ausência de ferramentas de previsão, que presentemente não existem. 10

Produção de glicoproteínas terapêuticas Há um número significativo de proteínas, isoladas a partir de seres humanos ou de animais, que são modificadas pós-traducionalmente, sendo a glicosilação uma das modificações mais significativas. De todas as proteínas terapêuticas há uma quantidade estimada de 70% que é glicosilada, e por isso contam normalmente com um sistema de produção (isto é, uma célula hospedeira) que é capaz de glicosilar de uma maneira semelhantes à dos seres humanos. Diversos estudos comprovaram que a glicosilação desempenha um papel importante na determinação de (1) imunogenicidade, (2) propriedades farmacocinéticas, (3) circulação e (4) eficácia das proteínas terapêuticas. Assim sendo, não é surpreendente que tenham sido feitos esforços substanciais pela indústria farmacêutica orientados para processos de desenvolvimento para a obtenção de glicoproteínas que sejam tão "humanóides" ou "semelhantes às humanas" quanto possível. Até ao momento presente, a maior parte das glicoproteínas são produzidas no sistema hospedeiro de mamíferos. Isto pode implicar a manipulação genética das células desses mamíferos para aumentar o grau de sialilação (isto é, adição terminal de ácido siálico) de proteínas expressas pelas células, sabendo-se que isso melhora as propriedades farmacocinéticas de tais proteínas. Em alternativa, é possível melhorar o grau de sialilação adicionando in vitro esses açúcares, utilizando glicosil-transferases conhecidas e os seus respectivos açúcares de nucleótidos (v.g., 2,3-sialil-transferase e CMP-ácido siálico). 11

Embora a maior parte dos eucariotas superiores realizem reacções de glicosilação que são semelhantes às encontradas nos seres humanos, as proteínas humanas recombinantes expressas nos sistemas hospedeiros supramencionados diferem invariavelmente do seu equivalente humano "natural" (Raju et al. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486). Deste modo, têm sido realizados trabalhos exaustivos de desenvolvimento orientados para a descoberta de caminhos para melhorar o "carácter humano" de proteínas produzidas nestes sistemas de expressão. Isto inclui a optimização das condições de fermentação e a modificação genética de hospedeiros de expressão de proteínas mediante a introdução de genes que codifiquem enzimas implicadas na formação de glicoformas humanóides. Goochee et al. (1999) Biotechnology 9(12): 1347-55; Andersen e Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5): 546-49; Werner et al. (1998) Arzsteimittelforschung. 48(8): 870-80; Weikert et al. (1999) Nat Biotechnol. 17(11): 1116-21; Yang e Butler (2000) Biotech. Bioeng 68:370-80. Os problemas inerentes, associados a todos os sistemas de expressão de mamíferos, ainda não foram resolvidos.

Produção de glicoproteínas utilizando microrganismos eucarióticos

Embora a estrutura oligossacarídica central transferida para uma proteína no retículo endoplásmico seja basicamente idêntica nos mamíferos e nos eucariotas inferiores, foram encontradas diferenças substanciais nas subsequentes reacções de processamento que ocorrem no aparelho de Golgi de fungos e mamíferos. Na realidade, mesmo entre eucariotas inferiores 12 diferentes há uma grande variedade de estruturas de glicosilação. Isto impediu, historicamente, a utilização de eucariotas inferiores enquanto hospedeiros para a produção de glicoproteínas humanas recombinantes, apesar das vantagens notáveis relativamente aos sistemas de expressão de mamíferos.

As glicoproteínas terapêuticas produzidas num microrganismo hospedeiro, tal como uma levedura, utilizando a via de glicosilação endógena do hospedeiro, diferem estruturalmente das produzidas nas células de mamíferos e revelam tipicamente uma eficácia terapêutica altamente reduzida. Tais glicoproteínas são tipicamente imunogénicas nos seres humanos e possuem um período de semi-vida reduzido (e consequentemente de bioactividade) in vivo após a administração (Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9:S29-S35). Os receptores específicos nos seres humanos e nos animais (isto é, receptores de manose dos macrófagos) conseguem reconhecer resíduos manose terminais e favorecem a depuração rápida da glicoproteína exógena para fora da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos suplementares podem compreender as modificações no desdobramento e solubilidade das proteínas, susceptibilidade às proteases, circulação, transporte, compartimentalização, secreção, reconhecimento por outras proteínas ou factores, antigenicidade ou alergenicidade.

As leveduras e os fungos filamentosos têm sido utilizados com êxito para a produção de proteínas recombinantes, quer intracelulares quer segregadas (Cereghino, J.L. e J.M. Cregg, 2000, FEMS Microbiology Reviews 13 24(1): 45-66; Harkki, A. et al., 1989, BioTechnology 7(6): 596; Berka, R.M., et al., 1992, Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121 - BIOT; Svetina, M. et al., 2000, J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251). Há diversas leveduras, tais como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica e Hansenula polymorpha, que têm desempenhado papéis particularmente importantes enquanto sistema de expressão eucarióticos devido ao facto de serem capazes de crescerem até alcançarem densidades celulares elevadas e segregarem grandes quantidades de proteínas recombinantes. De igual modo, os fungos filamentosos, tais como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa e outros, têm sido utilizados para produzirem eficientemente glicoproteínas à escala industrial. No entanto, conforme se disse antes, as glicoproteínas expressas em quaisquer destes microrganismos eucarióticos diferem substancialmente na estrutura dos N-glicanos comparativamente com as observadas nos animais. Isto tem impedido a utilização de leveduras ou de fungos filamentosos enquanto hospedeiros para a produção de inúmeras glicoproteínas terapêuticas.

Embora a glicosilação em leveduras e em fungos seja muito diferente da observada em seres humanos, são partilhados alguns elementos comuns. O primeiro passo, a transferência da estrutura oligossacarídica central para a proteína nascente, é altamente conservado nos eucariotas, incluindo leveduras, fungos, plantas e seres humanos (comparar as figuras IA e 1B). No entanto, o processamento subsequente do oligossacarídeo central difere significativamente nas leveduras e implica a adição de diversos açúcares manose. 14

Este passo é catalisado pelas manosil-transferases residentes no Golgi (v.g., 0CH1, MNTl, MNN1, etc.), que adicionam sequencialmente açúcares manose ao oligossacarideo central. A estrutura resultante é indesejável para a produção de proteínas humanóides e por esse motivo é desejável reduzir ou eliminar a actividade das manosil-transferases. Comprovou-se que os mutantes de S. cerevisiae, deficientes em actividade de manosil-transferase (v.g., os mutantes ochl ou mnn9) são não letais e apresentam um teor reduzido em manose no oligossacarideo das glicoproteínas de leveduras. Eventualmente, também pode ser necessário eliminar outras enzimas de processamento de oligossacarídeos, tais como manosil-fosfato-transferase, dependendo isso do padrão de glicosilação endógeno particular do hospedeiro. Após a redução das reacções de glicosilação endógenas indesejadas, a formação do complexo de N-glicanos tem de ser manipulado no sistema hospedeiro. Isto exige a expressão estável de diversas enzimas e de transportadores de açúcar-nucleótidos. Além disso, é necessário localizar estas enzimas para que fique garantido um processamento sequencial da estrutura de glicosilação em maturação.

Foram já feitos diversos esforços para modificar as vias de glicosilação de microrganismos eucarióticos para proporcionar glicoproteínas mais estáveis para utilização como agentes terapêuticos para mamíferos. Por exemplo, diversas glicosil-transferases foram já clonadas e expressas separadamente em S. S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) e noutros fungos (Yoshida et al. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8, Kalsner et al. (1995) Glycoconj. J. 15 12(3): 360-370). Todavia, não foram obtidos N-glicanos que se assemelhassem aos produzidos em células humanas.

As leveduras produzem diversas manosil-transferases (v.g., 1,3-manosil-transferases, tais como MNN1 em S. cerevisiae; Graham e Emr (1991) J. Cell. Biol. 114(2): 207-218), 1,2-manosil-transferases (v.g., familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosil-transferases (v.g., OCHl de S. cerevisiae), manosil-fosfato-transferases e seus reguladores (v.g., MNN4 e MNN6 de S. cerevisiae) e outras enzimas que estão implicadas nas reacções endógenas de glicosilação. Muitos destes genes foram suprimidos individualmente, dando origem a organismos viáveis que possuem perfis de glicosilação alterados. No quadro 1 estão indicados exemplos.

Quadro 1. Exemplos de estirpes de leveduras com manosilação alterada

Estirpe N-glicano (tipo selvagem) Mutação N-glicano (mutante) Referência S. pombe Man>9GlcNAc2 OCHl Man8GlcNAc2 Yoko-o et al. (2001) FEBS Lett. 489(1): 75-80 s. cerevisiae Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1 Man8GlcNAc2 Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(35): 26338-26345 16 (continuação)

Estirpe N-glicano (tipo selvagem) Mutação N-glicano (mutante) Referência s. cerevisiae Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1/MNN4 Man8GlcNAc2 Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 26298-26304 P. pastoris hiperglicosilada OCH1 (delecção completa) Não hiperglicos ilada Welfide, Publicação do pedido de patente de invenção japonesa N° 8-336387 P. pastoris Man>8GlcNAc2 OCH1 (disrupção) Man>8GlcNAc2 Contreras et al. WO 02/00856 A2 A publicação do pedido de patente de invenção japonesa n° 8-336387 descreve a delecção de um homólogo de 0CH1 em Pichia pastoris. Em S. cerevisiae, o 0CH1 codifica uma 1,6-manosil-transferase que adiciona manose à estrutura do glicano Man8GlcNAC2 para proporcionar Man9GlcNAc2. A estrutura de Man9GlcNAc2, que contém três resíduos 1,6-manose, constitui então um substrato para as outras 1,2-, 1,6- e 1,3-manosil-transferases in vivo, originando as glicoproteinas hipermanosiladas que são características de S. cerevisiae e que podem ter, tipicamente, entre 30 e 40 resíduos manose por cada N-glicano. Uma vez o Ochlp inicia a transferência de 1,6-manose para o centro de Man8GlcNAC2, é frequentemente 17 designado por "iniciador de 1,6-manosil-transferase" para se fazer a distinção relativamente a outras 1,6-manosil-transferases que actuam posteriormente no Golgi. Numa estirpe de S. cerevisiae mutante ochl mnnl mnn4, as proteínas glicosiladas com Man8GlcNAc2 acumulam-se e não tem lugar a hipermanosilação. No entanto, Man8GlcNAc2 não é um substrato para as glicosil-transferases de mamíferos, tais como a UDP-GlcNAc-transferase humana e por tal motivo, a utilização dessa estirpe mutante, por si só, não é útil para a produção de proteínas semelhantes às dos mamíferos, isto é, as que apresentam padrões de glicosilação complexos ou híbridos. É possível rectificar as estruturas de Man8GlcNAc2 para se obter um isómero Man5GlcNAc2 em S. cerevisiae (embora ainda tenha de ser demonstrada uma rectificação com elevada eficiência superior a 50% in vivo), introduzindo no retículo endoplásmico (RE) uma manosidase fúngica proveniente de A. saitoi. As insuficiências desta metodologia são duplas: (1) não é evidente que as estruturas de Man5GlcNAc2 formadas sejam realmente formadas in vivo (em vez de terem sido segregadas e posteriormente modificadas por manosidases fora da célula); e (2) não é evidente se todas as estruturas de Man5GlcNAc2 formadas, se realmente tiverem sido formadas in vivo, sejam a isoforma correcta para ser um substrato produtivo para a subsequente modificação do N-glicano pela GlcNAc-transferase I (Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707).

Com o objectivo de se obter uma glicoproteína mais humanóide, a partir de um hospedeiro fúngico, a patente de invenção norte-americana n° 5 834 251 descreve um método para a produção de uma glicoproteína híbrida a partir de 18

Trichoderitia reseei. Um N-glicano híbrido possui apenas resíduos manose na ramificação Manal-β da estrutura central da manose e uma ou duas antenas complexas na ramificação Manal-3. Embora esta estrutura tenha utilidade, o método tem o inconveniente de terem de ser realizados inúmeros passos enzimáticos in vitro, o que é dispendioso e bastante moroso. A preparação de enzimas isoladas é dispendiosa e requer substratos bastantes caros (v.g., UDP-GlcNAc). 0 método também não permite a produção de glicanos complexos numa proteína desejada.

Actividade de manosidase intracelular implicada na rectificação de N-glicanos É necessária a actividade de a-1,2-manosidase para a rectificação de Man8GlcNAc2 para se obter Man5GlcNAc2, que é um intermediário fundamental para a formação de N-glicanos complexos em mamíferos. Trabalhos anteriores comprovaram que a a-1,2-manosidase truncada de murinos, fungos e seres humanos pode ser expressa na levedura metilotrópica P. pastoris e apresentar actividade rectificadora de Man8GlcNAc2 para Man5GlcNAc2 (Lai et al. Glycobiology, Outubro de 1998, 8(10): 981-95; Tremblay et al., Glycobiology, Junho de 1998, 8(6): 585-95, Callewaert et al. (2001) FEBS Lett. 503(2-3): 173-8) . No entanto, até ao momento presente, não há informação que comprove o nível elevado de rectificação in vivo de Man8GlcNAc2 para originar Man5GlcNAc2 numa glicoproteína segregada a partir de P. pastoris.

Além do mais, a simples presença de uma a-1,2-manosidase na célula não garante, por si só, a rectificação intracelular 19 correcta de Man8GlcNAc2 para se obter Man5GlcNAc2. (Ver, v.g., Contreras et al. WO 02/00856 A2, em que uma manosidase de T. reesei, identificada com HDEL, está localizada sobretudo no RE e é co-expressa com uma proteína repórter da hemaglutinina (HA) da gripe, na qual não foi possível virtualmente detectar nenhuma estrutura Man5GlcNAc2. Ver também Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(41): 26298-26304, em que uma fusão quimérica de a-1,2-manosidase/domínio transmembranar de Ochlp, localizada no RE, no Golgi proximal e no citossol de S. cerevisiae, não revelou nenhuma actividade rectificadora de manosidase) . Assim sendo, a simples localização de uma manosidase no RE ou no Golgi é insuficiente para garantir a actividade da correspondente enzima nesse organelo visado. (Ver também Martinet et al. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, que comprova que a a-1,2-manosidase proveniente de T. reesei, apesar de se localizar intracelularmente, aumentou em vez de diminuir a intensidade da manosilação). Até ao momento presente, não há informação que demonstre a localização intracelular de uma a-1,2-manosidase heterólogo activa quer em leveduras quer em fungos, utilizando uma sequência de localização transmembranar.

Embora seja útil manipular estirpes capazes de produzirem Man5GlcNAc2 como estrutura primária de N-glicanos, todos os esforços para se modificar ainda mais estas estruturas precursoras de manoses superiores para se assemelharem melhor aos glicanos dos seres humanos, exigem passos suplementares in vivo ou in vitro. Na patente de invenção norte-americana n° 5 834 251 (supra) estão descritos métodos para humanizar ainda mais glicanos provenientes de 20 fontes de fungos e leveduras, in vitro. No caso de se pretender humanizar ainda mais in vivo a estrutura Man5GlcNAc2, é necessário garantir que as estruturas Man5GlcNAc2 geradas são, na realidade, produzidas intracelularmente e não o produto da actividade de manosidase no meio. A formação de N-glicanos complexos em leveduras ou em fungos irá exigir que sejam gerados níveis elevados de Man5GlcNAc2 dentro da célula, uma vez que apenas os glicanos de Man5GlcNAc2 intracelulares podem ser objecto de processamento subsequente para proporcionar N-glicanos híbridos e complexos in vivo. Além disso, é necessário demonstrar que a maior parte das estruturas de Man5GlcNAc2 geradas são, na realidade, um substrato para GnTI, permitindo consequente a formação de N-glicanos híbridos e complexos.

Assim sendo, há a necessidade de se dispor de métodos para a produção de glicoproteínas caracterizadas por terem um elevado conteúdo de Man5GlcNAc2 intracelular, o qual pode ser objecto de processamento suplementar para proporcionar estruturas de glicoproteínas humanóides em células hospedeiras eucarióticas não humanas, e particularmente em leveduras e em fungos filamentosos.

Manosidases de classe 2

Foram já purificadas e caracterizadas diversas manosidases de classe 2: a manosidase II dos murganhos, a manosidase II dos seres humanos e a manosidase II das drosófilas (a figura 24 representa uma árvore filogenética das classes de manosidases). Chegou-se à conclusão que as enzimas manosidases de classe 2 são responsáveis pela 21 hidrólise das pontes glicosidicas das manoses a-1,3 e a-1,6 em oligossacarideos ligados a N, localizados geralmente no Golgi. Foram identificados pelo menos cinco tipos de manosidases de classe 2, designadamente: (1) α-manosidase II do Golgi; (2) α-manosidase IIx do Golgi; (3) a-manosidase lisossómica; (4) α-manosidase citossólica e (5) uma enzima caracterizada a partir do esperma de murganhos e de porcos ou a partir de tecidos epididímicos. Moremen K.W., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235. A anemia diseritropoiética congénita humana de tipo II foi associada à falta do gene funcional de α-manosidase li, tal como exibido em murganhos. Chui et al. Cell, 11 de Julho de 1997; 90(1): 157-67. Esta deficiência genética é conhecida por HEMPAS (multinuclearidade eritroblástica hereditária com teste positivo na lise de soro acidificado) e estão a ser feitas novas pesquisas para se estudar o papel de a-manosidase II. Por exemplo, verificou-se que uma mutação num único gene que codifica a α-manosidase II tem como consequência uma doença auto-imune sistémica semelhante ao lúpus eritematoso sistémico humano. Chui et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001, 98:1142-1147. A importância da actividade enzimática na formação de glicoproteínas está perfeitamente estudada; no entanto, a expressão eficiente de tal actividade para a produção de glicoproteínas terapêuticas ainda não foi realizada em células eucarióticas inferiores. (1) α-Manosidase II do Golgi 22 A α-manosidase II do Golgi (EC. 3.2.1.114) é uma proteína transmembranar de tipo II, aproximadamente com 125 kDa, constituída por uma cauda curta citoplásmica no terminal N, um único domínio transmembranar ligado por um segmento peduncular a uma parte luminal catalítica grande do terminal C. Moremen e Touster, J. Biol. Chem., 260, 6654-6662; Moremen e Touster, J. Biol. Chem., 261, 10945-10951. A função da manosidase II é essencial no processamento de N-glicanos na via secretória. Em células de mamíferos foi confirmado que esta enzima particular hidrolisa as ligações glicosídicas Mana-1,3 e Mana-Ι,β no substrato GlcNAcMan5GlcNAc2. O processamento subsequente dos N-glicanos é catalisado por outras enzimas de glicosilação (v.g., N-acetil-glucosaminil-transferases, galactosil-transferases, sialil-transferases), sendo produzidas as glicoformas desejadas com os seus substratos (UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, CMP-ácido siálico) e seus respectivos transportadores. Ver, v.g., o documento WO 02/00879, que se considera aqui totalmente incorporado por referência.

Foi já isolado um clone parcial que codifica a a-manosidase II do Golgi, a partir de uma biblioteca de ADNc de Àgtll de fígado do rato. Moremen, KW. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Julho de 1989; 86(14): 5276-80. Também foram já caracterizadas e expressas em células COS a α-manosidase II do Golgi do murganho e a α-manosidase II humana. Moremen e Robbins, J. Cell. Biol., Dezembro de 1991; 115(6): 1521-34. As pesquisas efectuadas com a enzima α-manosidase II do Golgi demonstraram que há uma semelhança considerável com o domínio do terminal C desta classe de enzimas. Além disso, estudos 23 sobre a especificidade do substrato revelam que a hidrólise das ligações glicosidicas a-1,3 e/ou a-1,6 por acção da enzima α-manosidase II do Golgi necessita de uma GlcNAc terminal no substrato oligossacaridico. A α-manosidase II do Golgi de Drosophila melanogaster foi já isolada utilizando o ADNc de α-manosidase II do Golgi de murinos e comprovou-se que tem uma considerável semelhança com as regiões de outras α-manosidases. Foster et al. Gene 154 (1995) 183-186. Trabalhos anteriores comprovaram que as sequências de ADNc da Drosophila e do murganho traduzem as sequências de aminoácidos com uma identidade de 41% e uma similaridade de 61%. Comprovou-se que a expressão da sequência de α-manosidase II do Golgi das drosófilas em células de CHOP (células de CHO que expressam estavelmente o antigénio T grande do polioma) é activa e também se comprovou que se localiza essencialmente no aparelho de Golgi. Rabouille et al. J. Cell. Sei., Outubro de 1999; 112 (Pt 19): 3319-30. (2) a-Manosidase IIx do Golgi O gene que codifica a α-manosidase IIx humana (isotipo α-manosidase II) foi já caracterizado. Ogawa et al. Eur. j. Biochem. 242, 446-453 (1996). A sobre-expressão da enzima a-manosidase IIx conduz à conversão de Man6GlcNAc2 em Man4GlcNAc2 em células de CHO. Oh-eda et al. Eur. J. Biochem. 268, 1280-1288 (2001). Os dois tipos de manosidases (II e IIx) estão estreitamente relacionados com o processamento de N-glicanos no Golgi. Esta α-manosidase IIx do Golgi tem uma identidade de 66% com a α-manosidase II e tem uma actividade 24 catalítica semelhante para hidrolisar Mana-1,6 e Mana-1,3 do oligossacarídeo Man6GlcNAc2. Estudos mais recentes revelaram um fenótipo óbvio de infertilidade nos machos de murganhos deficientes em α-manosidase IIx. Biochim Biophys Acta., 19 de Dezembro de 2002; 1573(3): 382-7. Um estudo permitiu concluir que os testículos de murganhos deficientes em a-manosidase IIx revelavam níveis reduzidos de N-glicanos de tipo complexo terminados por GlcNAc. (3) a-Manosidase lisossómica Há um outro tipo de manosidase de classe 2 que se encontra nos lisossomas de células eucarióticas e que está implicado no catabolismo (decomposição) das glicoproteínas. Ao contrário da enzima manosidase II do Golgi, que tem um valor óptimo de pH neutro, a manosidase II lisossómica tem um valor óptimo de pH baixo (pH 4,5), possui uma ampla especificidade de substrato natural, é activa para o substrato sintético p-nitrofenil-a-manosidase e é sensível à inibição pela swainsonina. Daniel et al., (1994) Glycobiology 4, 551-566; Moremen et al., (1994) Glycobiology, 4, 113-125. Estruturalmente, a α-manosidase lisossómica possui uma sequência de sinal no terminal N em vez de cauda citoplásmica, domínio transmembranar e região formativa da enzima do Golgi. Moremen, K.W., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235. A α-manosidase lisossómica humana (EC 3.2.1.24) foi clonada e expressa em Pichia pastoris. Liao et al., J Biol Chem, 8 de Novembro de 1996; 271(45): 28348-58. Com base nas regiões de conservação de sequências de aminoácidos entre a α-manosidase lisossómica de Dictyostelíum 25 discoideum e a α-manosidase II do Golgi de murinos (uma glicoproteína que processa a actividade de a-1,3/1,6-manosidase), efectuou-se a clonagem de um ADNc que codifica a α-manosidase lisossómica de murinos. Merkle et ai., Biochim Biophys Acta, 29 de Agosto de 1997; 1336(2): 132-46. Uma deficiência em α-manosidase lisossómica tem como consequência uma doença genética humana designada por α-manosidase. (4) a-Manosidase citossólica A α-manosidase II citossólica é menos semelhante às outras manosidases de classe 2 e parece preferir Co2+ em vez de Zn2+ para a actividade catalítica. Moremen, K.W., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235. Tal como a a-manosidase II lisossómica está implicada no catabolismo das glicoproteínas. A α-manosidase li citossólica cataboliza as glicoproteínas incorrectamente dobradas no lúmen do RE que tenham sido retrotranslocadas para dentro do citoplasma para eliminação proteolítica. Duvet et ai., Biochem. J. 335 (1998) 389-396; Grard et ai., Biochem. J. 316 (1996) 787-792. Estruturalmente, esta enzima não tem nenhuma sequência de sinal ou domínio transmembranar clivável.

Foram já descritas também outras manosidases que possuem características das manosidases de classe 2, mas ainda não foram clonadas para comparação directa por alinhamento das sequências. Moremen, K.W., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235.

Manosidases de classe III 26

As manosidases de classe III/ que também estão implicadas na retificação das ligações glicosídicas Mana-1,3 e Mana-1,6 de um oligossacarídeo, v.g., convertendo Man5GlcNAc2 em Man3GlcNAC2, foram recentemente clonadas e identificadas. Até ao momento presente, apenas são conhecidos dois membros desta classe de proteínas. 0 primeiro membro identificado proveio de um murganho anémico que era deficiente em actividade de manosidase II clássica do Golgi, mas que possuía um mecanismo alternativo para converter Man5GlcNAc2 directamente em Man3GlcNAc2, o qual era independente da presença de GlcNAc na ramificação central de manose-1,3 (D. Chui, et al. Cell, 1997, 90:157-167). Esta manosidase de classe III ainda não foi clonada, mas há uma proteína com actividade semelhante que foi já clonada a partir de células Sf9 (Z. Kawar, et al. J. Biol. Chem. 2001 276(19): 16335-16340). O único membro das manosidases de classe III que foi clonado e caracterizado tem a sua origem na linhagem de células de insectos lepidópteros Sf9 (D. Jarvis, et al. Glycobiology, 1997 7:113-127). A manosidase III do Golgi das Sf9 converte Man5GlcNAc2 em Man3GlcNAc2 e, ao contrário da manosidase II do Golgi, não faz o processamento de GlcNAcMan5GlcNAc2. Uma particularidade exclusiva desta classe de manosidases é o facto de, para além de fazerem o processamento da actividade de Mana-1,3/1,6, efectuarem também o processamento da actividade das a-1,2-manosidases, tal como uma manosidase de classe I do Golgi. Além do mais tal como sucede com as enzimas manosidase I do Golgi, esta manosidase III de Sf9 retifica o Man8GlcNAc2 mais eficientemente do que retifica o Man9GlcNAc2. 27 0 documento ΕΡ 1211310 descreve novos mutantes de leveduras capazes de produzirem uma glicoproteína em que uma cadeia de açúcar com alto teor em manose Man5GlcNAc2 ou GlcNAcMan5GlcNAc2 é acoplada a um resíduo asparagina de uma proteína; e descreve também um processo para a produção da cadeia açúcar e da glicoproteína por meio de uma técnica de glicomanipulação, em que são utilizados os mutantes. Este documento descreve também a introdução de genes nos mutantes para a biossíntese de uma cadeia açúcar do tipo da cadeia dos mamíferos para se obter glicoproteínas que têm uma cadeia açúcar do tipo da cadeia dos mamíferos.

Choi et al. (PNAS, 2003, 100(9): 5022-7) descrevem uma metodologia em que a via secretória de Pichia pastoris foi geneticamente manipulada diversas vezes para execução das reacções de glicosilação sequenciais que simulam o processamento inicial de N-glicanos nos seres humanos e noutros mamíferos superiores. A expressão recombinante de uma proteína repórter humana, nestas estirpes geneticamente manipuladas, leva à formação de uma glicoproteína com GlcNAcMan5GlcNAc2 enquanto N-glicano primário.

Dada a utilidade das actividades das enzimas manosidases no processamento de N-glicanos, considera-se que seria desejável que houvesse um método para produzir glicoproteínas de tipo humano em células hospedeiras eucarióticas inferiores, compreendendo o passo que consiste em efectuar a expressão de uma α-manosidase II cataliticamente activa que possua uma especificidade de substrato para Mana-1,3 e Mana-1,6 num oligossacarídeo. 28

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para a produção de uma glicoproteina de tipo humano em células hospedeiras de leveduras ou em células hospedeiras de fungos filamentosos unicelulares ou multicelulares, o qual compreende o passo de expressão de um ácido nucleico que codifica uma enzima quimérica que compreende um dominio catalítico de manosidase fundido com um péptido de sinal de endereçamento celular, em que a referida enzima quimérica é capaz de hidrolisar in vivo mais de 40% das ligações Mana-1,3 e/ou Mana-1,6 de um substrato GlcNAcMan5GlcNAc2. O domínio catalítico de manosidase e o péptido de sinal de endereçamento celular são seleccionados entre os agrupados no quadro 11, aqui apresentado mais adiante.

De preferência, o N-glicano desejado produzido é GlcNAcMan3GlcNAc2. De acordo com uma outra variante preferencial, o N-glicano desejado caracteriza-se por ter pelo menos a ramificação oligossacarídica Mana-1,3 (Mana-1,6) Manp-l, 4-GlcNAc p-l,4-GlcNAc β-1-Asn. De preferência, isola-se a glicoproteina a partir da célula hospedeira. De acordo com uma outra variante preferencial, a actividade enzimática de manosidase é capaz de hidrolisar in vivo as duas ligações Mana-1,3 e Mana-1,6 de um substrato oligossacarídico que possua uma ligação glicosídica Mana-1,3 e Mana-1,6.

De acordo com uma outra variante preferencial, o substrato oligossacarídico é caracterizado como GlcNAcp-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,6 Mana-1,6) Manp-l,4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn; 01οΝΑοβ-1,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6) Μ3ηβ-1,4-GlcNAc 29 β-l,4-GlcNAc-Asn; e GlcNAcp-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6 Mana-1,6) Μ3ηβ-1,4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn.

De acordo com uma variante preferencial, a actividade de manosidase é caracterizada como uma actividade de manosidase de classe 2. De acordo com uma variante mais preferencial, a actividade de manosidase de classe 2 possui uma especificidade de substrato para GlcNAcp-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,6 Mana-1,6) Μ3ηβ-1,4-GlcNAc β-l, 4-GlcNAc-Asn; GlcNAcp-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6) Manp-l,4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn; ou 61οΝΑαβ-1,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6 Mana-1,6) Μ3ηβ-1, 4-GlcNAc β—1, 4—GlcNAc—Asn. De acordo com uma variante ainda mais preferencial, a actividade de manosidase de classe 2 é uma actividade que se encontra normalmente no aparelho de Golgi de uma célula hospedeira eucariótica superior.

Em todas as variantes supramencionadas, a actividade de manosidase é, preferencialmente, sobre-expressa. De acordo com uma outra variante preferencial, a manosidase ainda é capaz de hidrolisar uma ligação Mana-1,2. De preferência, as actividades de manosidase da invenção possuem um valor óptimo de pH compreendido entre cerca de 5,0 e cerca de 8,0.

De acordo com uma outra variante a actividade de manosidase está localizada dentro da via secretória da célula hospedeira. De preferência, a actividade de manosidase é expressa a partir de um polipéptido localizado pelo menos dentro do RE ou do aparelho de Golgi ou da rede trans-Golgi da célula hospedeira.

De acordo com uma variante preferencial, a actividade de manosidase é expressa a partir de um ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende um dominio catalítico 30 de manosidase fundido com um péptido de sinal de endereçamento celular. De acordo com uma variante mais preferencial, a actividade de manosidase é expressa a partir de um ácido nucleico que compreende sequências que codificam um domínio catalítico de manosidase que é nativo em relação à célula hospedeira. De acordo com uma outra variante mais preferencial, a actividade de manosidase é expressa a partir de um ácido nucleico que compreende sequências que codificam um domínio catalítico de manosidase que é heterólogo em relação à célula hospedeira.

De acordo com uma outra variante preferencial, a actividade enzimática de manosidase é seleccionado entre o conjunto constituído por manosidase II de Arabidopsis thaliana, manosidase II de C. elegans, manosidase II de Ciona intestinalis, manosidase II de Drosophila, manosidase II humana, manosidase II de murganho, manosidase II de rato, manosidase II lisossómica humana e manosidase II citoplásmica humana.

De acordo com uma outra variante preferencial, o polipéptido é expresso a partir de um ácido nucleico que compreende sequências que codificam um péptido destinatário nativo em relação à célula hospedeira.

De acordo com uma outra variante preferencial, o polipéptido é expresso a partir de um ácido nucleico que compreende sequências que codificam um péptido destinatário heterólogo em relação ao domínio catalítico de manosidase.

De acordo com uma variante preferencial, a célula hospedeira é seleccionado entre o conjunto constituído por células de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia 31 trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa. De acordo com uma variante mais preferencial, a célula hospedeira é de Pichia pastoris. A presente invenção proporciona também glicoproteínas e N-glicanos produzidos por meio de um dos métodos supramencionados. De acordo com uma variante preferencial, a glicoproteina é uma proteína terapêutica. De acordo com uma variante mais preferencial, a proteína terapêutica é seleccionado entre o conjunto constituído por eritropoietina, citoquinas, tais como o interferão α, o interferão β, o interferão γ, o interferão ω e o granulócito-CSF, factores de coagulação, tais como o factor VIII, o factor IX e a proteína C humana, a cadeia α do receptor de IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, igM, interleucinas, urocinase, quimase e o inibidor de tripsina da ureia, proteína de ligação a IGF, factor de crescimento epidermal, factor de libertação da hormona do crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor 2 do crescimento endotelial vascular, factor 1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegerina, antitripsina α-l, DNase II, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, também conhecida por proteína 1 de ligação do 32 TNF), TACI-Ig (activador transmembranar e modulador do cálcio e interactor do ligando da ciclofilina), FSH (hormona estimuladora dos folículos), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteina 1 de tipo glucagona), agonista do receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, também conhecido como fusão do Fc com o receptor TNF solúvel), ATUI, rhTrombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (antigénio 4 - Ig associado ao linfócito T citotóxico). A invenção descreve também uma biblioteca de ácidos nucleicos que compreende pelo menos duas construções genéticas diferentes, em que pelo menos uma das construções genéticas compreende um fragmento de ácido nucleico que codifica um domínio catalítico de manosidase de classe 2, IIx ou III, ligado concatenadamente com um fragmento de ácido nucleico que codifica um péptido de sinal de endereçamento celular com o qual não está normalmente associado.

Descreve-se o domínio catalítico de manosidase seleccionado entre o conjunto constituído por: manosidase II de Arabidopsis thaliana, manosidase li de C. elegans, manosidase II de Ciona intestinalis, manosidase II de Drosophila, manosidase II humana, manosidase II de murganho, manosidase II de rato, manosidase IIx humana, manosidase III de células de insecto, manosidase II lisossómica humana e manosidase II citoplásmica humana.

Descreve-se fragmentos de ácidos nucleicos que codificam um péptido de endereçamento celular, seleccionados entre o conjunto constituído por: GLS 1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, 0CH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VANl de Saccharomyces, ANPl de 33

Saccharomyces, H0C1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNNll de Saccharomyces, MNTl de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTRl de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTl de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YURI de Saccharomyces, MNNl de Saccharomyces e MNN6 de Saccharomyces. A invenção descreve também um vector que compreende uma construção de fusão obtida a partir de uma qualquer das bibliotecas anteriores ligada a uma sequência de controlo da expressão, em que o referido péptido de sinal de endereçamento celular é endereçado pelo menos para o RE ou para o Golgi ou para a rede trans-Golgi. Explica-se que a sequência de controlo da expressão é induzivel ou constitutiva. Explica-se que o vector, após expressão numa célula hospedeira, codifica uma actividade de manosidase implicada na produção de GlcNAcMan3GlcNAc2, Man3GlcNAc2 ou Man4GlcNAc2 in vivo. A invenção descreve também uma célula hospedeira que compreende pelo menos um dos vectores supramencionados. Explica-se que o vector pode ser seleccionado entre o conjunto de vectores designados por pKD53, pKDl, pKD5, pKD6 e pKDl6.

Uma outra variante da invenção proporciona um polipéptido quimérico que compreende um domínio catalítico de manosidase fundido concatenadamente com um péptido de sinal de endereçamento e, após expressão numa célula hospedeira de uma levedura ou numa célula hospedeira de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, capaz de hidrolisar in vivo um substrato oligossacarídico que compreenda ambas ou 34 uma das ligações glicosídicas Mana-1,3 e Mana-1,6, com uma intensidade tal que sejam hidrolisados in vivo pelo menos 10% das ligações Mana-1,3 e/ou Mana-1,6 do substrato.

Uma outra variante da invenção proporciona um polipéptido quimérico que compreende um domínio catalítico de manosidase fundido concatenadamente com um péptido de sinal de endereçamento e que é capaz, após expressão numa célula hospedeira de uma levedura ou numa célula hospedeira de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, de hidrolisar in vivo um substrato oligossacaridico que compreenda uma ligação glicosidica Mana-1,3, Mana-1,6 ou Mana-1,2, com uma intensidade tal que seja hidrolisado in vivo um radical detectável da ligação Mana-1,3, Mana-1,6 ou Mana-1,2 do substrato.

Uma outra variante da invenção proporciona um ácido nucleico que codifica o polipéptido quimérico supramencionado ou uma célula hospedeira que compreende o polipéptido quimérico supramencionado.

Uma outra variante da invenção proporciona uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico supramencionado.

Uma outra variante da invenção proporciona uma composição de glicoproteinas produzidas na célula hospedeira supramencionada. De acordo com uma variante mais preferencial, a invenção proporciona um N-glicano produzido na célula hospedeira. Mais preferencialmente, a composição de glicoproteinas caracteriza-se pelo facto de ser uniforme.

Uma outra variante da invenção proporciona um polinucleótido isolado que é formado ou constituído por uma sequência de ácidos nucleicos, seleccionada entre o conjunto 35 constituído pelas regiões conservadas das SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 15.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS A figura IA é uma representação esquemática de uma via típica de N-glicosilação nos fungos. A figura 1B é uma representação esquemática de uma via típica de N-glicosilação nos seres humanos. A figura 2 ilustra a construção de uma bibleoteca de ADN combinatória de construções de fusão. A figura 2A ilustra esquematicamente a inserção de um fragmento peptídico de endereçamento no pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A figura 2B representa uma biblioteca secundária de péptidos de endereçamento que possuem os locais de restrição Notl-AscI. A figura 2C representa esquematicamente a inserção de uma região do domínio catalítico no pJN347, que é um vector pUC 19 modificado. A figura 2D representa a biblioteca secundária de domínios catalíticos gerados que possuem os locais de restrição Notl, Asei e Pacl. A figura 2E representa uma construção de fusão particular gerada a partir da biblioteca secundária de péptidos de endereçamento e da biblioteca secundária de domínios catalíticos. A figura 3 ilustra a sequência de ácido nucleico da grelha de leitura aberta de a-1,2-manosidase IA de M. musculus (SEQ ID NO: 48) e uma sequência do polipéptido codificado (SEQ ID NO: 49) . As sequências dos iniciadores da PCR, utilizados para gerar os truncamentos no terminal N, estão sublinhadas. 36

As figuras 4A a 4F ilustram a manipulação de vectores com múltiplos marcadores auxotróficos e a integração genética das proteínas visadas no locus OCHl de P. pastoris.

As figuras 5A a 5E ilustram a análise de maldi-tof que demonstra a produção do domínio kringle 3 das glicoproteínas do plasminogéneo humano (K3) que possuem Man5GlcNAc2 enquanto estrutura do N-glicano predominante em P. pastoris. A figura 5A ilustra o glicano padrão Man5GlcNAc2 [a] (Glyko, Novato, CA) e o Man5GlcNAc2 + Na+ [b] . A figura 5B ilustra os glicanos libertados por PNGase a partir do tipo selvagem de K3. Os N-glicanos representados são os seguintes: Man9GlcNAc2 [d]; ManioGlcNAc2 [e]; ManllGlcNAc2 [f ]; Mani2GlcNAc2 [g] . A figura 5C mostra a delecçao de ochl resultante da produção de Man8GlcNAc2 [c] enquanto N-glicano predominante. As figuras 5D e 5E mostram a produção de Man5GlcNAc2 [b] após rectificação de Man8GlcNAc2 in vivo com uma a-1,2-manosidase quimérica. 0 N-glicano predominante está indicado por um pico com uma massa (m/z) igual a 1253, o que é consistente com a sua identificação como sendo Man5GlcNAc2 [b] .

As figuras 6A a 6F ilustram a análise de MALDI-TOF que demonstra a produção de glicoproteínas de IFN-β que possuem Man5GlcNAc2 enquanto estrutura de N-glicano predominante em P. pastoris. A figura 6A representa o glicano padrão Man5GlcNAc2 [a] e o glicano Man5GlcNAc2 + Na+ [b] como controlo (Glyko, Novato, CA) . A figura 6B ilustra os glicanos libertados por PNGase a partir do tipo selvagem de IFN-β. A figura 6C ilustra a inactivação de ochl que produz Man8GlcNAc2 [c]; Man9GlcNAc2 [d]; Mani0GlcNAc2 [e]; MannGlcNAc2 [ f ]; Mani2GlcNAc2 [g]; e sem nenhuma produção de Man5GlcNAc2 [b] . A figura 6D 37 mostra a quantidade relativamente pequena de Man5GlcNAc2 [b] entre outros N-glicanos intermédios desde Man8GlcNAc2 [c] até Mani2GlcNAc2 [g]. A figura 6E mostra uma quantidade significativa de Man5GlcNAc2 [b] relativamente aos outros glicanos Man8GlcNAc2 [c] e Man9GlcNAc2 [d] produzidos por pGC5 (Saccharomyces MNS1(m)/IB Δ99 da manosidase do murganho). A figura 6F ilustra a produção predominante de Man5GlcNAc2 [b] no lFN-β da glicoproteína segregada por pFB8 (Saccharomyces SEC12{m)/IB Δ187 da manosidase do murganho). 0 N-glicano está indicado por um pico com uma massa (m/z) igual a 1254, consistente com a sua identificação como Man5GlcNAc2 [b] . A figura 7 ilustra um cromatograma de cromatografia liquida de alto rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão marcado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio de crescimento de P. pastoris, Aochl transformado com manosidase de pFB8, que demonstra a falta de actividade de manosidase extracelular no sobrenadante; e (C) Man9GlcNAc2 padrão marcado com 2-AB após exposição a manosidase de T. reeseí (controlo positivo). A figura 8 representa um cromatograma de cromatografia liquida de alto rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão marcado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio de crescimento de P. pastoris, Aochl transformado com manosidase de pGC5, que demonstra a falta de actividade de manosidase extracelular no sobrenadante; e (C) Man9GlcNAc2 padrão marcado com 2-AB após exposição a manosidase de Γ. reeseí (controlo positivo). A figura 9 representa um cromatograma de cromatografia liquida de alto rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão 38 marcado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio de crescimento de P. pastoris, Aochl transformado com manosidase de pBC 18-5, que demonstra a falta de actividade de manosidase extracelular no sobrenadante; e (C) sobrenadante do meio P. pastoris, Aochl transformado com pDD28-3, que demonstra a actividade no sobrenadante (controlo positivo).

As figuras 10A a 10B demonstram a actividade de um transportador de UDP-GlcNAc na produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 em P. pastoris. A figura 10A ilustra a estirpe de P. pastoris (YSH-3) transformada com um GnTl humano, mas sem o transportador de UDP-GlcNAc, dai resultando alguma produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b], mas com uma produção predominante de

Man5GlcNAc2 [a] . A figura 10B ilustra a adição do transportador de UDP-GlcNAc proveniente de K. lactis numa estirpe (PBP-3) transformada com o GnTI humano, de que resultou a produção predominante de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] . A existência de um único pico distinto de massa (m/z) igual a 1457 é consistente com a sua identificação como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b], conforme ilustrado na figura 10B. A figura 11 traduz um valor de pH óptimo de uma enzima de manosidase heteróloga codificada por pBB27-2 (Saccharomyces MNN10 (s)/IB Δ31 da manosidase de C. elegans) expressa em P. pastoris.

As figuras 12A a 12C ilustram uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos libertados a partir de um extracto de K. lactis isento de células. A figura 12a corresponde aos N-glicanos libertados a partir de células de tipo selvagem, as quais contêm N-glicanos de tipo rico em manose. A figura 12B 39 corresponde aos N-glicanos libertados a partir de células em que foi feita a delecção de ochl mnnl, revelando um pico distinto de massa (m/z) igual a 1908, consistente com a sua identificação como Man9GlcNAc2 [d] . A figura 12C corresponde aos N-glicanos libertados a partir de células em que foi feita a delecção de ochl mnnl após a digestão in vitro feita com oí-1,2-manosidase, correspondente a um pico consistente com Man5GlcNAc2. A figura 13 ilustra uma análise por MALDI-TOF-MS para N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris (mutante de delecção de ochl transformado com α-manosidase e GnT I), revelando um pico predominante para o valor m/z igual a 1465, correspondente à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] . A figura 14 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris, transformados com manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNN2(s) de S. cerevisiae, revelando um pico predominante para o valor m/z igual a 1140, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e outros picos correspondentes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] para o valor de m/z igual a 1303 m/z e GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] para o valor de m/z igual a 1465. Esta estirpe recebeu a designação de YSH-37. A figura 15 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-37 de P. pastoris, transformados com GnT II do rato/lider MNN2(s), revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1356, correspondente à massa de 40

GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] . Esta estirpe recebeu a designação de YSH-44. A figura 16 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-44 de P. pastoris (GlcNAc2Man3GlcNAc2 [b], produzido conforme ilustrado na figura 15), revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 933, correspondente à massa de Man3GlcNAc2 [a], após digestão com β-Ν-acetil-hexosaminidase. A figura 17 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzidos na estirpe na estirpe YSH-44 de P. pastoris (GlcNAc2Man3GlcNAc2 [b], produzido conforme ilustrado na figura 15), revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1665, correspondente à massa de

Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, após a adição de β-l,4-galactosil-transferase in vitro. A figura 18 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris, transformados com a manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNN9 (m) de S. cerevisiae, revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1464, correspondente à massa de Man5GlcNAc2 [d], A figura 19 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris, transformados com a manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae, revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1464, correspondente à massa de Man5GlcNAc2 [d] e 41 outros picos correspondentes a GlcNAcMan3GlcNA02 [b] para o valor de m/z igual a 1139 e GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] para o valor de m/z igual a 1302. A figura 20 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris, transformados com a manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/GLSl(s) de S. cerevisiae, revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1139, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b]. Esta estirpe recebeu a designação de YSH-27. A figura 21 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzida na estirpe YSH-1 de P. pastoris, transformados com a manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNS1(m) de S. cerevisiae, revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1140, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e outros picos correspondentes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] para o valor de m/z igual a 1302 e a GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] para o valor de m/z igual a 1464. Esta estirpe recebeu a designação de YSH-74. A figura 22 ilustra uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados a partir da glicoproteina Kringle 3 produzidos numa estirpe YSH-74 de P. pastoris, tendo a digestão sido feita com a-1,2-manosidase de T. reesei/A. saitoi, revelando um pico predominante para o valor de m/z igual a 1141, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] . A figura 23 mostra uma comparação de sequências feita com a aplicação informática 'BLAST', de manosidase II, manosidase IIx e manosidases de classe III, conhecidas e 42 hipotéticas (SEQ ID NOS: 96, 92, 93, 99, 98, 97, 94, 95 e 100-102, respectivamente pela ordem em que aparecem). A figura 24 ilustra uma árvore filogenética de classes de manosidases. A figura 25 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 49) de manosidase II (NM_121499) de Arabidopsis thaliana e a proteína codificada (SEQ ID NO: 95). A figura 26 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 50) de manosidase II (NM_073594) de C. elegans e a proteína codificada (SEQ ID NO: 92). A figura 27 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 51) de manosidase II (AK116684) de Ciona intestinalis e a proteína codificada (SEQ ID NO: 94). A figura 28 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 52) de manosidase II (X77652) de D. melanogaster e a proteína codificada (SEQ ID NO: 96). A figura 29 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 53) de manosidase II (U31520) humana e a proteína codificada (SEQ ID NO: 97). A figura 30 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 54) de manosidase II (X61172) de murganho e a proteína codificada (SEQ ID NO: 98). A figura 31 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 55) de manosidase II (XM_218816) de rato e a proteína codificada (SEQ ID NO: 93). A figura 32 ilustra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 56) de manosidase Ilx (D55649) humana e a proteína codificada (SEQ ID NO: 99). 43 A figura 33 ilustra uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 57) de manosidase III (AF005034) de células de insecto e a proteina codificada (SEQ ID NO: 100). A figura 34 ilustra uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 58) de manosidase lisossómica II (NM_000528) humana e a proteína codificada (SEQ ID NO: 101). A figura 35 ilustra uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 59) de manosidase II citoplásmica (N_006715) humana e a proteína codificada (SEQ ID NO: 102). A figura 36 ilustra os intermediários oligossacarídicos produzidos utilizando as actividades de manosidase li, manosidase IIx e manosidase III.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO

Salvo quando aqui definido de outra forma, os termos científicos e técnicos utilizados no contexto da presente invenção possuem as significações que normalmente lhes atribuem os especialistas na matéria. Além disso, salvo quando solicitado pelo contexto, os termos no singular compreendem os mesmos termos no plural e os termos no plural compreendem os mesmos termos no singular. Os métodos e as técnicas da presente invenção são geralmente realizados em conformidade com metodologias convencionais conhecidas na especialidade. De um modo geral, a nomenclatura aqui utilizada e associada às técnicas de bioquímica, enzimologia, biologia molecular e celular, microbiologia, genética e química e hibridação de proteínas e de ácidos nucleicos é perfeitamente conhecida e vulgarmente utilizada na especialidade. 44

Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente executados em conformidade com metodologias convencionais perfeitamente conhecidas na especialidade e conforme descrito em diversas obras bibliográficas gerais e mais especificas que são citadas e apresentadas ao longo desta memória descritiva, salvo quando indicado de outro modo. Ver, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, e suplementos até 2002); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). A nomenclatura aqui utilizada e associada aos procedimentos laboratoriais e às técnicas de biologia molecular e celular, bioquímica de proteínas, enzimologia e química médica e farmacêutica é perfeitamente conhecida e vulgarmente utilizada na especialidade.

Aos termos a segui utilizados, salvo quando especificado de outro modo, devem ser-lhes atribuído as significações a seguir indicadas.

Tal como aqui utilizado, o termo "N-glicano" refere-se a um oligossacarídeo com ligações N, v.g., um que esteja 45 acoplado por uma ligação asparagina-N-acetil-glucosamina a um resíduo asparagina de um polipéptido. Os N-glicanos possuem um pentassacarídeo central comum de Man3GlcNAc2 ("Man" designa a manose; "Glc" designa glicose e "NAc" designa N-acetilo; GlcNAc designa N-acetil-glucosamina). 0 termo "centro de trimanose", utilizado a propósito dos N-glicanos, designa também a estrutura Man3GlcNAc2 ("Man3") . Os N-glicanos diferem entre si em função do número de ramificações (antenas) compreendendo açúcares periféricos (v.g., fucose e ácido siálico) que são adicionados à estrutura central de Man3. os N-glicanos são classificados em função dos seus constituintes ramificados (v.g., com alto teor em manose, complexos ou híbridos).

Um N-glicano "com alto teor em manose" possui cinco ou mais resíduos manose. Um N-glicano de tipo "complexo" possui tipicamente pelo menos um GlcNAc fixado à ramificação 1,3-manose e pelo menos um GlcNAc fixado à ramificação 1,6-manose do centro de trimanose. Os N-glicanos complexos também podem possuir resíduos galactose ("Gal") que são facultativamente modificados com ácido siálico ou seus derivados ("NeuAc", em que "Neu" designa o ácido neuramínico e "Ac" designa acetilo). Um N-glicano complexo possui tipicamente pelo menos uma ramificação que termina num oligossacarídeo tal como, por exemplo: NeuNAc-; NeuAca2-6GalNAcal-; NeuAca2-3Galpl-3GalNAcal-; NeuAca2-3/6Galpl-4GlcNAcpl-; GlcNAcal-4Galpl-(apenas mucinas); Fucal-2Galpl- (grupo H sanguíneo). Os ésteres sulfato podem ocorrer em resíduos de galac, GalNAc, e GlcNAc, e os ésteres fosfato podem ocorrer em resíduos de manose. 0 grupo NeuAc (Neu: ácido neuramínico;; Ac: acetilo) 46 pode ser O-acetilado ou substituído por NeuGl (ácido N-glicolilneuramínico). Os N-glicanos complexos também podem ter substituições intra-cadeias, compreendendo o GlcNAc "bissector" e a fucose central ("Fuc"). Um N-glicano "híbrido" possui pelo menos um GlcNAc no terminal da ramificação de 1,3-manose do centro de trimanose e nenhuma ou mais manoses na ramificação 1,6-manose do centro de trimanose. 0 termo "predominante" ou "predominantemente", utilizado a propósito da produção de N-glicanos, refere-se a uma estrutura que representa o pico principal detectado numa análise por espectrometria de massa por ionização/dessorção da matriz auxiliada por laser no período de duração (MALDI-TOF) .

As abreviaturas aqui utilizadas são de utilização vulgar na especialidade; ver, v.g., as abreviaturas para açúcares, indicadas antes. Outras abreviaturas vulgares são "PNGase" que designa o péptido N-glicosidase F (EC 3.2.2.18); "GlcNAc Tr" ou "GnT" que designam as enzimas N-acetil-glucosaminil-transferases; "NANA" que designa o ácido N-acetilneuramínico.

Tal como aqui utilizado, os termos "glicoproteína humanizada" ou "glicoproteína humanóide" designam, em alternativa, uma proteína à qual lhe foram fixados N-glicanos que possuem três ou menos resíduos manose, e glicoproteínas sintéticas intermediárias (as quais também são úteis e podem ser manipuladas ainda mais in vitro ou in vivo) . De preferência, as glicoproteínas produzidas de acordo com a invenção contêm pelo menos 20% em moles, de preferência entre 20% e 30% em moles, mais preferencialmente entre 30% e 40% em 47 moles, ainda mais preferencialmente entre 40% e 50% em moles e muito mais preferencialmente entre 50% e 100% em moles de GlcNAcMan3GlcNAC2 intermediário, pelo menos transitoriamente. Isto pode ser conseguido, v.g., manipulando geneticamente uma célula hospedeira da invenção para que exprima uma "melhor", isto é, uma mais eficiente enzima de glicosilação. Por exemplo, selecciona-se uma manosidase II de tal modo que tenha uma actividade óptima nas condições presentes no local na célula hospedeira onde as proteínas são glicosiladas, para ser introduzida na célula hospedeira de preferência encaminhando a enzima para um organelo da célula hospedeira onde a actividade é pretendida. O termo "enzima", tal como aqui utilizado a propósito da alteração da glicosilação das células hospedeiras, refere-se a uma molécula que possua pelo menos uma actividade enzimática, e abrange as enzimas de comprimento completo, os fragmentos cataliticamente activos, as formas quiméricas, complexos e não só. Um "fragmento cataliticamente activo" de uma enzima corresponde a um polipéptido que tenha um nível detectável de actividade funcional (enzimática). A actividade enzimática é "substancialmente intracelular" no caso de as enzimas subsequentes de processamento possuem a aptidão para produzir cerca de 51% da glicoforma desejada in vivo. O termo "célula hospedeira de um eucariota inferior", quando aqui utilizado em associação com perfis de glicosilação, refere-se a quaisquer células eucarióticas que produzam vulgarmente N-glicanos ricos em manose, ficando assim abrangidas consequentemente algumas células de animais ou vegetais e mais tipicamente células de eucariotas 48 inferiores, incluindo as células de algas e de fungos unicelulares e multicelulares.

Tal como aqui utilizado, o termo "via de secreção" refere-se à linha de montagem de diversas enzimas de glicosilação a que são expostos sequencialmente um precursor oligossacarideo ligado a lipidos e um substrato de N-glicanos, acompanhando o fluxo molecular de uma cadeia polipeptidica nascente que passa do citoplasma para o reticulo endoplásmico (RE) e para os compartimentos do aparelho de Golgi. Considera-se que as enzimas estão localizadas ao longo desta via. Se uma enzima X actuar sobre um glicano ligado por lipidos ou sobre um N-glicano antes de uma enzima Y, diz-se que está ou que actua "a montante" da enzima Y; de igual modo, a enzima Y está ou actua "a jusante" da enzima X. 0 termo "péptido de endereçamento", tal como aqui utilizado, refere-se a sequências de nucleótidos ou de aminoácidos que codificam um péptido de sinal de endereçamento celular que intervém indirectamente na localização (ou retenção) de uma sequência associada às localizações subcelulares, v.g., os organelos. 0 termo "polinucleótido" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos que possuem pelo menos 10 bases de comprimento. O termo abrange moléculas de ADN (v.g., ADNc ou ADN sintético ou genómico) e moléculas de ARN (v.g., ARNm ou ARN sintético), e também os análogos de ADN ou de ARN que contenham análogos de nucleótidos não naturais, ligações intranucleósidos não nativos ou ambos. O ácido nucleico pode ter qualquer conformação topológica. Por 49 exemplo, o ácido nucleico pode ser de cadeia singular, de cadeia dupla, de cadeia tripla, de cadeia quádrupla, parcialmente de cadeia dupla, ramificado, uniforme, circular ou ter uma conformação de cadeado. 0 termo abrange as formas de ADN de cadeias singular e dupla. Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode compreender ambas as cadeias de sentido codificador e anti-sentido de ARN, ADNc, ADN genómico e as formas sintéticas e os polímeros mistos das formas supramencionadas. Essas formas podem ser modificadas química ou bioquimicamente ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou transformadas, conforme é facilmente evidente para os especialistas na matéria. Tais modificações compreendem, por exemplo, os identificadores, a metilação, a substituição de um ou vários dos nucleótidos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídicas, tais como as ligações sem carga eléctrica (v.g., fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos e carbamatos de metilo, etc.), ligações com carga eléctrica (v.g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), radicais pendentes (v.g., polipéptidos), intercaladores (v.g., acridina, psoraleno, etc.), agentes quelantes, agentes alquilantes e ligações modificadas (v.g., ácidos nucleicos a-anoméricos, etc.). Também estão abrangidas as moléculas sintéticas que simulam polinucleótidos na sua aptidão para se ligarem a uma sequência projectada por meio de pontes de hidrogénio e de outras interacções químicas. Tais moléculas são conhecidas na especialidade e compreendem, por exemplo, aquelas em que as pontes fosfato são substituídas por pontes peptídicas na estrutura da molécula. 50

Salvo quando especificado de outro modo, o termo "um ácido nucleico que compreenda a SEQ ID NO: X" refere-se a um ácido nucleico em que pelo menos uma sua parte possui quer (i) a sequência designada por SEQ ID NO: X ou (ii) uma sequência complementar da SEQ ID NO: X. A escolha entre ambas é determinada pelo contexto. Por exemplo, se o ácido nucleico for utilizado como sonda, a escolha entre as duas é determinada pela necessidade de a sonda ser complementar para o alvo pretendido.

Um ácido nucleico ou um polinucleótido "isolado" ou "substancialmente puro" (v.g., um ARN, ADN ou um polimero misto) é aquele que se encontra substancialmente separado de outros componentes celulares que naturalmente acompanham o polinucleótido nativo na sua célula hospedeira natural, v.g., ribossomas, polimerases e sequências genómicas com que estejam naturalmente associados. O termo abrange um ácido nucleico ou um polinucleótido que (1) tenha sido removido do seu ambiente que ocorre naturalmente, (2) não esteja associado nem com a totalidade nem com uma parte de um polinucleótido em que o "polinucleótido isolado" seja encontrado na natureza, (3) esteja funcionalmente ligado a um polinucleótido com o qual não esteja ligado na natureza ou (4) não ocorra naturalmente. O termo "isolado" ou "substancialmente puro" também pode ser utilizado relativamente aos isolados de ADN recombinante ou clonado, aos análogos de polinucleótidos sintetizados quimicamente ou aos análogos de polinucleótidos que sejam biologicamente sintetizados por sistemas heterólogos. 51

No entanto, o termo "isolado" não implica necessariamente que o ácido nucleico ou polinucleótido assim descrito tenha sido fisicamente removido do seu ambiente nativo. Por exemplo, considera-se que uma sequência de ácido nucleico endógeno no genoma de um organismo está ai "isolada" se uma sequência heteróloga (isto é, uma sequência que não esteja naturalmente adjacente a esta sequência de ácido nucleico endógeno) for colocada em posição adjacente à sequência de ácido nucleico endógeno, de tal modo que a expressão da sequência de ácido nucleico endógeno seja alterada. A título de exemplo, com uma sequência de promotor não nativo é possível substituir {v.g., por recombinação homóloga) o promotor nativo de um gene no genoma de uma célula humana, de tal modo que este gene tenha um padrão de expressão alterado. Este gene poderia passar a ser agora "isolado" devido ao facto de ter sido separado pelo menos de algumas das sequências que naturalmente o flanqueiam.

Considera-se também que um ácido nucleico está "isolado" se contiver quaisquer modificações que não ocorram naturalmente no correspondente ácido nucleico num genoma. Por exemplo, considera-se que uma sequência codificadora endógena está "isolada" se contiver uma inserção, uma delecção ou uma mutação pontual, introduzidas artificialmente, v.g., por intervenção humana. 0 termo "ácido nucleico isolado" compreende também um ácido nucleico integrado num cromossoma de uma célula hospedeira num local heterólogo, uma construção de ácido nucleico presente como um epissoma. Além disso, um "ácido nucleico isolado" pode estar substancialmente isento de outros materiais celulares ou substancialmente isento de 52 meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes ou substancialmente isento de precursores quimicos ou de outros compostos quimicos quando sintetizado por via química.

Tal como aqui utilizada, a expressão "variante degenerada" de uma sequência de ácido nucleico de referência diz respeito às sequências de ácidos nucleicos que possam ser traduzidas, de acordo com o código genético convencional, para proporcionar uma sequência de aminoácidos idêntica à que foi traduzida a partir da sequência de ácido nucleico de referência. 0 termo "percentagem de identidade sequencial" ou "idêntico", no contexto das sequências de ácidos nucleicos, refere-se aos resíduos existentes nas duas sequências e que são iguais quando estas forem alinhadas para que haja uma correspondência máxima. 0 comprimento de comparação de identidades de sequências pode ser feito num segmento que tenha pelo menos cerca de nove nucleótidos, normalmente tenha pelo menos cerca de 20 nucleótidos, mais vulgarmente tenha pelo menos cerca de 24 nucleótidos, tipicamente tenha pelo menos cerca de 28 nucleótidos, mais tipicamente tenha pelo menos cerca de 32 nucleótidos e preferencialmente tenha pelo menos cerca de 36 ou mais nucleótidos. Na especialidade há diversos algoritmos diferentes que podem ser utilizados para medir a identidade entre sequências de nucleótidos. Por exemplo, as sequências de polinucleótidos podem ser comparadas utilizando os programas FASTA, Gap ou Bestfit, na versão 'Wisconsin Package Version 10.0', Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. O programa FASTA permite fazer alinhamentos e determinar o valor percentual da 53 identidade entre sequências das regiões da melhor sobreposição entre a sequência de referência e a sequência pesquisada (Pearson, 1990). Por exemplo, o valor percentual da identidade entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinado utilizando o programa FASTA com os seus parâmetros de opção por defeito (uma palavra de tamanho igual a 6 e o factor NOPAM para a matriz de classificação) ou utilizando o programa Gap com os seus parâmetros de opção por defeito, conforme previsto na versão 'GCG Version 6.1' . O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial", quando se refere a um ácido nucleico ou a um seu fragmento, indica que, quando este se encontra perfeitamente alinhado com inserções ou delecções de nucleótidos adequados, com um outro ácido nucleico (ou com a sua cadeia complementar), há uma identidade entre sequências de nucleótidos correspondente pelo menos a cerca de 50%, mais preferencialmente 60%, frequentemente pelo menos cerca de 70%, mais frequentemente pelo menos cerca de 80%, preferencialmente pelo menos cerca de 90% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotidicas, conforme determinado por qualquer dos algoritmos perfeitamente conhecidos para a determinação de identidades entre sequências, tais como FASTA, BLAST ou Gap, conforme se disse anteriormente.

Em alternativa, há uma homologia ou similaridade substancial quando um ácido nucleico ou um seu fragmento híbrida com um outro ácido nucleico, com uma cadeia de um outro ácido nucleico ou com a sua cadeia complementar, em condições de hibridação restringentes. As "condições de 54 hibridação restringentes" e as "condições de lavagem restringentes", no contexto das experiências de hibridação de ácidos nucleicos, dependem do número de diferentes parâmetros físicos. A hibridação de ácidos nucleicos irá ser afectada por condições, tais como a concentração salina, a temperatura, os solventes, a composição básica das espécies hibridantes, o comprimento das regiões complementares e o número de correspondências entre bases nucleotídicas entre os ácidos nucleicos hibridantes, conforme é sabido pelos especialistas na matéria. Um técnico da especialidade com conhecimentos vulgares sabe como fazer variar estes parâmetros para alcançar uma restringência particular de hibridação.

De um modo geral, realiza-se uma "hibridação restringente" a uma temperatura que esteja cerca de 25°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para o híbrido de ADN especifico num conjunto particular de condições. Realiza-se uma "lavagem restringente" a uma temperatura que esteja cerca de 5°C abaixo do valor Tm para o hibrido de ADN especifico num conjunto particular de condições. 0 valor Tm é a temperatura a que 50% da sequência visada híbrida com uma sonda perfeitamente alinhada. Ver, Sambrook et ai., supra, página 9.51, aqui incorporada por referência. No âmbito da presente invenção, as "condições de restringência elevada" são definidas para a hibridação na fase de solução como hibridação em meio aquoso (isto é, sem formamida) em 6X SSC (em que 20X SSC contém NaCl 3,0 M e citrato de sódio 0,3 M), SDS a 1% a 65°C durante 8 a 12 horas, seguindo-se duas lavagens em 0,2X SSC, contendo 0,1% de SDS a 65°C durante 20 55 minutos. Faz-se observar aos especialistas na matéria que a hibridação a 65°C irá ocorrer com velocidades diferentes, dependendo isso de diversos factores, incluindo o comprimento e a percentagem de identidade das sequências que estão a hibridar. 0 termo "mutacionado" quando aplicado às sequências de ácidos nucleicos, significa que é possível inserir, suprimir ou modificar nucleótidos numa sequência de ácido nucleico, comparativamente com uma sequência de ácido nucleico de referência. É possível fazer uma única alteração num local (uma mutação pontual) ou é possível inserir, suprimir ou modificar diversos nucleótidos num único local. Além disso, é possível efectuar uma ou várias alterações em qualquer número de locais dentro de uma sequência de ácido nucleico. Uma sequência de ácido nucleico pode ser mutacionada por meio de qualquer método conhecido na especialidade, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as técnicas de mutagénese, tais como "PCR com tendência para o erro" (um processo de execução da PCR em condições em que é fraca a fidelidade da polimerase de ADN para fazer cópias, de tal modo que se obtém uma taxa elevada de mutações pontuais ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Ver, v.q., Leung, D.W. et al. Technique, 1, págs. 11-15 (1989) e

Caldwell, R.C. e Joyce, G.F. PCR Methods Applic. 2, págs. 28-33 (1992)); e a "mutagénese dirigida aos oligonucleótidos" (um processo que permite gerar mutações específicas do local em qualquer segmento de and clonado relevante. Ver, v.g., Reidhaar-Olson, J.F. e Sauer, R.T., et al., Science, 241, págs. 53-57 (1988)). 56 0 termo "vector", tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligada. Um tipo de vector é um "plasmideo", termo este que designa um elo de ADN de cadeia dupla circular dentro do qual podem ser ligados outros segmentos de ADN. Há outros vectores entre os quais se refere cosmideos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e cromossomas artificiais de leveduras (YAC). Um outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN suplementares podem ser ligados no genoma virai (adiante descrito de forma mais minuciosa). Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira onde tenham sido introduzidos (v.g., vectores que possuam uma origem de replicação que funcione na célula hospedeira). Há outros vectores que podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a sua introdução na célula hospedeira, sendo consequentemente replicados em conjunto com o genoma hospedeiro. Mais ainda, há determinados vectores preferenciais que são capazes de comandar a expressão de genes aos quais se encontrem funcionalmente ligados. Tais vectores são aqui designados por "vectores de expressão recombinante" (ou simplesmente "vectores de expressão").

As sequências de controlo de expressão "funcionalmente ligadas" referem-se a uma ligação em que a sequência de controlo de expressão é contigua com o gene relevante para controlar o gene relevante, e também as sequências de controlo de expressão que actuam em posição trans ou a uma determinada distância para controlarem o gene relevante. 57 0 termo "sequência de controlo de expressão", tal como aqui utilizado, refere-se às sequências de polinucleótidos que são necessárias para afectar a expressão de sequências codificadoras às quais se encontram funcionalmente ligadas. As sequências de controlo de expressão são sequências que controlam a transcrição, os episódios pós-traducionais e a tradução de sequências de ácidos nucleicos. As sequências de controlo de expressão compreendem as sequências adequadas de inicio e de terminação da transcrição e as sequências de promotores e de intensificadores; sinais eficientes de processamento de arn, tais como os sinais de junção e de poliadenilação; as sequências que estabilizam o ARNm citoplásmico; as sequências que reforçam a eficiência da tradução (v.g., locais de ligação ribossómicos); as sequências que reforçam a estabilidade das proteínas e, se desejado, as sequências que reforçam a supressão de proteínas. A natureza de tais sequências de controlo difere em função do organismo hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo compreendem geralmente as sequências dos promotores, locais de ligação ribossómicos e sequências de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" abrange, no mínimo, todos os componentes cuja presença seja essencial para a expressão, e pode abranger também componentes suplementares cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências líderes e sequências do padrão de fusão. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizado, serve para designar uma célula onde tenha sido introduzido um ácido nucleico enquanto vector recombinante. Faz-se observar 58 que estes termos servem para designar não só a célula em causa particular, mas também a progenia de uma célula destas. Uma vez que podem ocorre algumas modificações nas gerações subsequentes devido quer a mutações quer a influências ambientais, na realidade, tal progenia pode não ser idêntica à célula parental, ficando todavia, mesmo assim, abrangida no âmbito do termo "célula hospedeira", tal como aqui utilizado. Uma célula hospedeira recombinante pode ser uma célula isolada ou uma linhagem de células que se desenvolvam em cultura ou pode ser uma célula que resida num tecido ou num organismo vivo. 0 termo "péptido", tal como aqui utilizado, designa um polipéptido curto, v.g., um que tenha tipicamente um comprimento com menos de cerca de 50 aminoácidos e mais tipicamente que tenha um comprimento com menos de cerca de 30 aminoácidos. O termo, tal como aqui utilizado, abrange os análogos e as variedades miméticas que simulam a função estrutural e consequentemente a função biológica. O termo "polipéptido", tal como aqui utilizado, abrange simultaneamente as proteinas que ocorrem naturalmente e as que ocorrem não naturalmente e os seus fragmentos, mutantes, derivados e análogos. Um polipéptido pode ser monomérico ou polimérico. Além disso, um polipéptido pode compreender diversos domínios diferentes, em que cada um deles possui uma ou várias actividades distintas. O termo "proteína isolada" ou "polipéptido isolado" designa uma proteína ou um polipéptido que, devido à sua origem ou fonte de proveniência (1) não está associado a componentes que lhe estão naturalmente associados e que o 59 acompanham no seu estado nativo, (2) quando existir com uma pureza que não se encontre na natureza, em que a pureza pode ser avaliada em relação à presença de outro material celular (v.g., estar isento de outras proteínas da mesma espécie), (3) é expresso num célula proveniente de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza (v.g., é um fragmento de um polipéptido existente na natureza ou compreende análogos de aminoácidos ou derivados de aminoácidos não existentes na natureza ou em ligações diferentes das uniões peptídicas convencionais). Assim, um polipéptido que seja sintetizado quimicamente ou sintetizado num sistema celular diferente da célula de onde é originariamente natural será considerado "isolado" dos seus componentes que lhes estão naturalmente associados. Um polipéptido, ou uma proteína, também pode passar a estar substancialmente isento dos componentes que lhes estão naturalmente associados, por isolamento, recorrendo a técnicas de purificação de proteínas perfeitamente conhecidas na especialidade. Assim sendo, a significação de "isolado" não implica necessariamente que a proteína, o polipéptido, o péptido ou o oligopeptido assim descritos tenham sido fisicamente retirados do seu ambiente nativo. 0 termo "fragmento polipeptídico", tal como aqui utilizado refere-se a um polipéptido que foi objecto de uma delecção no terminal amino e/ou no terminal carboxilo, comparativamente com um polipéptido de comprimento completo. De acordo com uma variante preferencial, o fragmento polipeptídico é uma sequência contígua em que a sequência de aminoácidos do fragmento é idêntica às posições correspondentes 60 na sequência que ocorre naturalmente. Os fragmentos têm tipicamente um comprimento pelo menos igual a 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, de preferência um comprimento pelo menos igual a 12, 14, 16 ou 18 aminoácidos, mais preferencialmente um comprimento pelo menos igual a 20 aminoácidos, muito mais preferencialmente um comprimento pelo menos igual a 25, 30, 35, 40 ou 45 aminoácidos, ainda muito mais preferencialmente um comprimento pelo menos igual a 50 ou 60 aminoácidos e ainda muitíssimo mais preferencialmente um comprimento pelo menos igual a 70 aminoácidos. O termo "derivado modificado" refere-se a polipéptidos ou aos seus fragmentos que sejam substancialmente homólogos na sequência de estrutura primária mas que compreendam, v.g., in vivo ou in vitro modificações químicas ou bioquímicas ou que incorporem aminoácidos que não existam no polipéptido nativo. Tais modificações compreendem, por exemplo, acetilação, carboxilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitinação, marcação, v.g., com radionuclidos, e diversas modificações enzimáticas, conforme é evidente para os especialistas na matéria. Há diversos métodos para marcar polipéptidos e substituintes, sendo os identificadores de marcação úteis para tais fins perfeitamente conhecidos na especialidade, abrangendo os isótopos radioactivos, tais como 1251^ 32pr 35s e 3H, ligandos que se ligam a anti-ligandos marcados {v.g., anticorpos), fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas e anti-ligandos que podem servir como membros de um par de ligação específico para um ligando marcado. A escolha do identificador de marcação irá depender da sensibilidade pretendida, da facilidade de conjugação com 61 o iniciador, dos requisitos de estabilidade e da disponibilidade de instrumentação. Os métodos para a marcação de polipéptidos são perfeitamente conhecidos na especialidade. Ver, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 e suplementos até 2002) . O termo "mutante polipeptidico" ou "muteína" designa um polipéptido cuja sequência contém uma inserção, duplicação, delecção, rearranjo ou substituição de um ou vários aminoácidos, comparativamente com a sequência de aminoácidos da proteína nativa ou de tipo selvagem. Uma muteína pode ter uma ou várias substituições pontuais de aminoácidos, em que um único aminoácido numa posição foi trocado por um outro aminoácido, uma ou várias inserções e/ou delecções, em que um ou vários aminoácidos foram respectivamente inseridos ou suprimidos na sequência da proteína que ocorre naturalmente e/ou truncamentos da sequência de aminoácidos em qualquer dos terminais amino ou carboxilo. Uma muteína pode ter a mesma actividade biológica da proteína que ocorre naturalmente, mas tem, de preferência, uma actividade biológica diferente daquela.

Uma muteína possui uma sequência que tem uma homologia global que é pelo menos igual a 70% da sequência equivalente de tipo selvagem. São ainda mais preferíveis as muteínas com sequências 80%, 85% ou 90% de homologia global com a proteína de tipo selvagem. De acordo com uma variante ainda mais preferencial, uma muteína revela 95% de identidade sequencial, ainda mais preferencialmente 97%, ainda mais preferencialmente 98% e ainda mais preferencialmente 99% de 62 identidade sequencial global. A homologia entre sequências pode ser determinada recorrendo a qualquer algoritmo vulgar de análise de sequências, por exemplo, Gap ou Bestfit.

As substituições de aminoácidos preferenciais são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formarem complexos de proteínas, (4) alteram a afinidade de ligação ou a actividade enzimática e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos.

No texto presente, utiliza-se de maneira convencional os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Os estereoisómeros (v.g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, os aminoácidos não naturais, tais como os a-aminoácidos, os α-aminoácidos dissubstituídos, os N-alquil-aminoácidos e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipéptidos da presente invenção. Como exemplos de aminoácidos não convencionais refere-se os seleccionados entre: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxi-lisina, s-N-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes e também os iminoácidos (v.g., 4-hidroxiprolina). Na notação de polipéptidos aqui utilizada, o sentido para a esquerda é o sentido do terminal amino e o sentido para a direita é o 63 sentido do terminal carboxilo, de acordo com a convenção e a utilização normal.

Uma proteína possui "homologia" ou é "homóloga" com uma segunda proteína se a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína possuir uma sequência semelhante à sequência de ácidos nucleicos que codifica a segunda proteína. Em alternativa, uma proteína possui homologia com uma segunda proteína se as duas proteínas tiverem sequências de aminoácidos "semelhantes" (assim, o termo "proteínas homólogas" pretende significar que as duas proteínas têm sequências de aminoácidos semelhantes). De acordo com uma variante preferencial, uma proteína homóloga é aquela que apresente uma sequência com uma homologia de 60% com a sequência da proteína de tipo selvagem e mais preferencialmente uma homologia de 70% entre tais sequências. Ainda mais preferencialmente, são homólogas as proteínas que apresentem sequências com homologias de 80%, 85% ou 90% com as sequências das proteínas de tipo selvagem. Segundo uma variante ainda mais preferencial, uma proteína homólogo apresenta uma identidade sequencial de 95%, 97%, 98% ou 99%. No texto presente, a homologia entre duas regiões de sequências de aminoácidos (especialmente no que diz respeito às similaridades estruturais previstas) é interpretada como implicando similaridade de funções.

No caso de se utilizar o termo "homólogo" a propósito de proteínas ou péptidos, faz-se observar que as posições dos resíduos que não são idênticos diferem frequentemente por substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é uma substituição em que um 64 resíduo aminoácido é substituído por um outro resíduo aminoácido que possui uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (v.g.r carga eléctrica ou hidrofobicidade). Em geral, um substituição conservadora de aminoácidos não irá modificar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos difiram entre si por meio de substituições conservadoras, a identidade percentual entre sequências, ou grau de homologia, podem ser ajustados para um valor superior para corrigir a natureza conservadora da substituição. As metodologias para fazer este ajustamento são perfeitamente conhecidas pelos especialistas na matéria (ver, v.g., Pearson et al., 1994).

Cada um dos seis grupos seguintes contém aminoácidos que são substituições conservadoras entre si: 1) serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q) ; 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), alanina (A), valina (V) e 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W) . A homologia entre sequências de polipéptidos, também designada por identidade percentual de sequências, mede-se tipicamente utilizando aplicações informáticas para análise de sequências. Ver, v.g., a aplicação 'Sequence Analysis Software Package' do Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. As aplicações informáticas de análise de proteínas estabelecem a correspondência entre sequências semelhantes, utilizando a medição de homologia 65 atribuída a diversas substituições, delecções e outras modificações, incluindo as substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, o GCG contém programas, tais como os programas "Gap" e "Bestfit", que podem ser utilizados com parâmetros por defeito para a determinação da homologia entre sequências ou da identidade entre sequências de polipéptidos estreitamente afins, tais como polipéptidos homólogos de espécies diferentes de organismos, ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma sua muteína. Ver, v.g., versão 6.1 de GCG.

Um algoritmo preferencial para a comparação de uma sequência de moléculas inibidoras com uma base de dados que contenha um grande número de sequências provenientes de organismos diferentes é o programa informático BLAST (Altschul, S.F., et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish e States (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T.L., et al. (1996) Meth. Enzymes 266: 131-141; Altschul, S.F., et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. e

Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7: 649-656) e em particular blastp ou tblastn (Altschul et al., 1997). Os parâmetros preferidos para a aplicação BLASTp são: valor esperado: 10 (por defeito); frequência de filtragem: seg (por defeito); custo para abrir uma lacuna: 11 (por defeito); custo para ampliar uma lacuna: 1 (por defeito); n° máximo de alinhamentos: 100 (por defeito); tamanho de palavra: 11 (por defeito); n° de descrições: 100 (por defeito); matriz de elisões forçadas: BLOWSUM62.

Os comprimentos das sequências polipeptídicas que se pretende comparar para determinação da homologia têm 66 geralmente pelo menos cerca de 16 resíduos aminoácidos, normalmente têm pelo menos cerca de 20 resíduos, mais vulgarmente têm pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente têm pelo menos cerca de 28 resíduos e preferencialmente têm mais de cerca de 35 resíduos. Quando se pesquisa uma base de dados que contenha sequências provenientes de um grande número de organismos diferentes, é preferível comparar as sequências de aminoácidos. A pesquisa em base de dados utilizando sequências de aminoácidos pode ser feita por meio de algoritmos diferentes do 'blastp', conhecidos na especialidade. Por exemplo, é possível comparar sequências de polipéptidos utilizando a aplicação lógica FASTA que é um programa na versão 6.1 do GCG. A aplicação FASTA permite fazer alinhamentos e determinar o valor percentual da identidade sequencial das regiões da melhor sobreposição entre a sequência de referência e a sequência pesquisada (Pearson 1990). Por exemplo, o valor percentual de identidade entre sequências de aminoácidos pode ser determinado utilizando a aplicação FASTA com os seus parâmetros por defeito (um tamanho de palavra igual a 2 e a matriz de classificação PAM250) , conforme previsto na versão 6.1 do GCG. 0 termo "motivo", quando utilizado a propósito das regiões conservadas, designa os residuos aminoácidos normalmente existentes em proteínas, convencionalmente designados por alanina (Ala ou A), valina (Vai ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (Ile ou I); prolina (Pro ou P), fenilalanina (Phe ou F), triptofano (Trp ou W), metionina (Met ou M), glicina (Gly ou G), serina (Ser ou S), treonina 67 (Thr ou T), cisteína (Cys ou C) , tirosina (Tyr ou Y), asparagina (Asn ou N), glutamina (Gin ou Q), ácido aspártico (Asp ou D), ácido glutâmico (Glu ou E), lisina (Lys ou K), arginina (Arg ou R) e histidina (His ou H). 0 termo "proteína de fusão" refere-se a um polipéptido que compreende um polipéptido ou um fragmento acoplado às sequências de aminoácidos heterólogos. As proteínas de fusão são úteis porque podem ser construídas de modo a conterem dois ou mais elementos funcionais desejados, provenientes de duas ou mais proteínas diferentes. Uma proteína de fusão contém pelo menos 10 aminoácidos contíguos provenientes de um polipéptido relevante, mais preferencialmente contém pelo menos 20 ou 30 aminoácidos, ainda mais preferencialmente contém pelo menos 40, 50 ou 60 aminoácidos e ainda muito mais preferencialmente contém pelo menos 75, 100 ou 125 aminoácidos. As proteínas de fusão podem ser produzidas por via recombinante, construindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifique o polipéptido ou um seu fragmento in frame com uma sequência de ácidos nucleicos que codifique uma proteína ou um péptido diferentes e efectuando depois a expressão da proteína de fusão. Em alternativa, é possível produzir uma proteína de fusão por via química, reticulando o polipéptido ou um seu fragmento com uma outra proteína. 0 termo "região", tal como aqui utilizado, refere-se a uma parte fisicamente contígua da estrutura primária de uma biomolécula. No caso das proteínas, define-se uma região como sendo uma parte contígua da sequência de aminoácidos dessa proteína. 68 0 termo "domínio", tal como aqui utilizado, refere-se a uma estrutura de uma biomolécula que contribua para uma função conhecida ou presumível de uma biomolécula. Os domínios podem ser co-extensivos com regiões ou suas porções; os domínios também podem conter regiões distintas, não contíguas, de uma biomolécula. Como exemplos de domínios de proteínas, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um domínio Ig, um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio citoplásmico.

Tal como aqui utilizado, o termo "molécula" designa qualquer composto, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, uma molécula pequena, um péptido, uma proteína, um açúcar, um nucleótido, um ácido nucleico, um lípido, etc., podendo tal composto ser de origem natural ou obtido por síntese.

Salvo quando especificado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm as mesmas significações que vulgarmente lhes são atribuídas pelos especialistas na matéria em que se insere a presente invenção. Os métodos e materiais exemplificativos estão descritos adiante, embora também possam ser utilizados, na prática da presente invenção, métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, os quais são evidentes para os especialistas na matéria.

Em caso de incompatibilidade, prevalece a presente memória descritiva, incluindo as definições. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não têm objectivos limitativos. 69

Ao longo da presente memória descritiva e reivindicações anexas, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" deve ser tomada no sentido em que implica a inclusão de um número inteiro especificado ou um grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de inteiros. Métodos para a produção de glicoproteínas humanóides em células hospedeiras de leveduras ou fungos filamentosos unicelulares ou multicelulares A invenção proporciona métodos para a produção de uma glicoproteina, com glicosilação de tipo humano, numa célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular. Conforme adiante descrito de forma mais minuciosa, selecciona-se como célula hospedeira de partida uma célula hospedeira eucariótica que não expresse naturalmente ou que tenha sido geneticamente manipulada para não expressar uma ou várias enzimas implicadas na produção de estruturas ricas em manose. Uma tal célula hospedeira seleccionada é manipulada geneticamente para expressar uma ou várias enzimas ou outros factores necessários para a produção de glicoproteínas humanóides. Uma estirpe hospedeira desejada pode ser geneticamente manipulada com uma enzima ou com mais do que uma enzima ao mesmo tempo. Além disso, é possível utilizar uma molécula de ácido nucleico que codifique uma ou várias enzimas ou actividades para manipular geneticamente uma estirpe hospedeira da invenção. De preferência, cria-se uma biblioteca de molécula de ácidos nucleicos (v.g., por ligação de bibliotecas secundárias constituídas por 70 fragmentos enzimáticos e sequências de endereçamento subcelulares), que codificam enzimas potencialmente úteis (v.g., enzimas quiméricas que compreendem um fragmento enzimático cataliticamente activo ligado in frame a uma sequência de endereçamento subcelular heteróloga), podendo ser seleccionada uma estirpe que tenha uma ou várias enzimas com actividades óptimas ou que produza as glicoproteinas mais "humanóides", transformando as células hospedeiras visadas com um ou vários componentes da biblioteca.

Em particular, os métodos aqui descritos permitem obter, in vivo, estruturas de Man5GlcNAc2 com elevados rendimentos, pelo menos transitoriamente, com a finalidade de as modificar ainda mais para se obter N-glicanos complexos. Um esquema bem sucedido para se obter estruturas adequadas de Man5GlcNAc2 com rendimentos convenientes numa célula hospedeira, tal como uma levedura ou um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, implica geralmente duas operações paralelas: (1) reduzir as estruturas ricas em manose produzidas pelas actividades de manosil-transferases endógenas, se as houver, e (2) remover 1,2-a-manose por acção de manosidases para se obter rendimentos elevados de estruturas adequadas de Man5GlcNAc2 que podem ainda reagir depois dentro da célula hospedeira para formarem glicoformas complexas humanóides.

Assim sendo, um primeiro passo consiste na selecção ou na criação de uma célula hospedeira eucariótica, v.g., de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, capaz de produzir uma estrutura precursora especifica de Man5GlcNAc2 que seja capaz de aceitar, in vivo, GlcNAc pela acção de uma transferase I de GlcNAc ("GnTI"). De 71 acordo com uma variante, o método consiste em fazer ou utilizar uma célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular com diminuta actividade de 1,6-manosil-transferase, comparativamente com a do N-glicano numa glicoproteína. De preferência, diminui-se a actividade iniciadora de 1,β-manosil-transferase na célula hospedeira (ver adiante). A uma tal célula hospedeira irão faltar-lhe uma ou várias enzimas implicadas na produção de estruturas ricas em manose que são indesejáveis para a produção de glicoproteínas humanóides.

Depois são então introduzidas uma ou várias actividades enzimáticas nessa célula hospedeira para a produção de N-glicanos dentro da célula hospedeira, caracterizados pelo facto de possuírem pelo menos 30% em moles das estruturas de hidratos de carbono Man5GlcNAc2 ("Man5") . As estruturas de Man5GlcNAc2 são necessárias para a formação de N-glicanos complexos: a estrutura de Man5GlcNAc2 tem de ser formada in vivo com um rendimento elevado (v.g., numa proporção superior a 30%), pelo menos transitoriamente, uma vez que as reacções de glicosilação subsequentes, humanóides e em mamíferos, solicitam Man5GlcNAc2 ou um seu derivado.

Este passo também exige a formação de uma estrutura isomérica particular de Man5GlcNAc2 dentro da célula com um rendimento elevado. Embora as estruturas de Man5GlcNAc2 sejam necessárias para a formação de N-glicanos complexos, a sua presença por si só não é suficiente. Isto deve-se ao facto de a estrutura de Man5GlcNAc2 poder ocorrer com diferentes formas isoméricas, as quais podem servir ou não como substrato para a transferase I de GlcNAc. Uma vez que a maior parte das 72 reacções de glicosilação não são completas, uma proteína glicosilada particular contém geralmente um conjunto de estruturas de hidratos de carbono diferentes (isto é, glicoformas) sobre a sua superfície. Assim, a simples presença de quantidades vestigiais (isto é, menos de 5%) de uma estrutura particular, tal como a de Man3GlcNAc2, tem pouca relevância prática para a produção de glicoproteínas humanóides ou do tipo das observadas nos mamíferos. 0 que é necessário é a formação de um intermediário de Man5GlcNAc2 que aceite a transferase I de GlcNAc (figura 1B), com um elevado rendimento (isto é, superior a 30%) . A formação deste intermediário é necessária para permitir a síntese subsequente in vivo de N-glicanos complexos nas proteínas glicosiladas relevantes (proteínas visadas).

Deste modo, uma parte ou a totalidade do Man5GlcNAc2 produzido pela célula hospedeira seleccionada deve ser um substrato produtivo para as actividades enzimáticas ao longo de uma via de glicosilação de um mamífero, v.g., pode servir como substrato para uma actividade da transferase I de GlcNAc in vivo, formando assim o intermediário GlcNAcMan5GlcNAc2 de N-glicanos humanóides na célula hospedeira. De acordo com uma variante preferencial, pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 30% e muito mais preferencialmente 50% ou mais do intermediário de Man5GlcNAc2 produzido numa célula hospedeira é um substrato produtivo para GnTI in vivo. Por exemplo, faz-se observar que no caso de GlcNAcMan5GlcNAc2 ser produzido a 10% e Man5GlcNAc2 ser produzido a 25% na proteina visada, a quantidade total de Man5GlcNAc2 produzido transitoriamente é 35% porque o GlcNAcMan5GlcNAc2 é um produto de Man5GlcNAc2. 73

Um especialista na matéria sabe como seleccionar células hospedeiras naturais, v.g., células de fungos existentes ou de outros eucariotas inferiores que produzam niveis significativos de Man5GlcNAC2 in vivo. No entanto, mais uma vez se afirma que ainda não foi comprovado a existência de nenhum eucariota inferior produza tais estruturas in vivo com valores acima de 1,8% do total dos N-glicanos (ver, v.g., Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707). Em alternativa, tais células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para produzirem a estrutura de Man5GlcNAc2 in vivo. Podem ser utilizados métodos tais como os descritos na patente de invenção norte-americana n° 5 595 900 para identificar a ausência ou a presença de glicosil-transferases, manosidases e transportadores de nucleótidos de açúcares particulares numa célula hospedeira visada ou num organismo relevante.

Inactivação das enzimas indesejadas de glicosilação de células hospedeiras

Os métodos da presente invenção têm por objecto a produção de células hospedeiras que produzem glicoproteinas que possuam estruturas de N-glicanos alteradas e de preferência de tipo humano. De acordo com uma variante preferida, os métodos têm por objecto produzir células hospedeiras em que os precursores oligossacarídeos são enriquecidos em Man5GlcNAc2. De preferência, utiliza-se uma célula hospedeira eucariótica que não exprima uma ou mais enzimas implicadas na produção de estruturas ricas em manose. As células hospedeiras deste tipo podem ser encontradas na 74 natureza ou podem ser manipuladas geneticamente, v.g., começando com um dos inúmeros mutantes de leveduras, já descritos, ou a partir de um deles modificado. Assim, consoante a célula hospedeira seleccionada, irá ser necessário fazer a delecção de um ou vários genes que codificam enzimas conhecidas por serem caracteristicas de reacções de glicosilação não humanas. Tais genes, e suas proteínas correspondentes, foram já exaustivamente caracterizados em diversos eucariotas inferiores (v.g., S. cerevisiae, T. reesei, A. nidulans, etc.), proporcionando consequentemente uma lista de glicotransferases conhecidas em eucariotas inferiores, as suas actividades e as suas correspondentes sequências genéticas. Estes genes são provavelmente seleccionados entre o conjunto constituído por manosil-transferases, v.g., 1,3-manosil-transferases (v.g., MNNl em S. cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2-manosil-transferases {v.g., família KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosil-transferases (OCHl de S cerevisiae), manosil-fosfato-transferases e seus reguladores (MNN4 e MNN6 de S. cerevisiae) e outras enzimas que estejam implicadas em reacções de glicosilação aberrantes, isto é, não humanas. Na realidade, muitos destes genes foram suprimidos individualmente, dando origem a fenótipos viáveis com perfis de glicosilação alterados. No quadro 1 {supra) estão ilustrados alguns exemplos.

As células hospedeiras de eucariotas inferiores preferidas da presente invenção, conforme aqui descrito para exemplificar os necessários passos de manipulação, são de mutantes de hipermanosilação-menos (ochl) de Pichia pastoris 75 ou de K. lactis. Tal com sucede com outros eucariotas inferiores, P. pastoris faz o processamento de estruturas de Man9GlcNAc2 no RE com uma a-1,2-manosidase para gerar Man8GlcNAc2 (figura IA) . Devido à acção de diversas manosil-transferases, esta estrutura é convertida depois em estruturas hipermanosiladas (Man>9GlcNAc2), também designadas por mananos. Além disso, concluiu-se que P. pastoris é capaz de acrescentar grupos fosfato não terminais, através da acção de manosil-fosfato-transferases, às estruturas de hidratos de carbono. Isto difere das reacções efectuadas em células de mamiferos, que implicam a remoção em vez da adição de açúcares manose. É de particular importância eliminar a aptidão da célula hospedeira eucariótica, v.g., de fungos, para hipermanosilar uma estrutura de Man8GlcNAc2 existente, isto pode ser conseguido quer escolhendo uma célula hospedeira que não realize uma hipermanosilação quer manipulando geneticamente tal célula.

Os genes que estão implicados nos processos de hipermanosilação foram já identificados, v.g., em Pichia pastoris, sendo possível reduzir, mediante a criação de mutações nesses genes, a produção de glicoformas "indesejáveis". Tais genes podem ser identificados por homologia com as manosil-transferases existentes ou com os seus reguladores (v.g., 0CH1, MNN4, MNN6, MNNl) encontrados noutros eucariotas inferiores, tais como C. albicans, Pichia angusta ou S. cerevisiae, ou efectuando a mutagénese da estirpe hospedeira e seleccionando um fenótipo de glicosilação com manosilação reduzida. Com base em homologias entre manosil-transferases e manosil-fosfato-transferases conhecidas, é possível conceber 76 iniciadores de PCR (no quadro 2 estão indicados alguns exemplos, SEQ ID NOs: 60-91, são exemplos suplementares de iniciadores), ou utilizar genes ou fragmentos de genes que codifiquem tais enzimas, enquanto sondas para identificar homólogos em bibliotecas de ADN do organismo visado ou de um organismo congénere. Em alternativa, é possivel identificar um homólogo funcional que possua actividade de manosil-transferase, pela sua aptidão para complementar fenótipos de glicosilação particulares em organismos congéneres.

Quadro 2. Iniciadores de PCR

Iniciador A de Iniciador B de Gene(s) visado(s) Homólogos PCR PCR em P. Pastoris ATGGCGAAGGC TTAGTCCTTC 1, 6-manosil- OCHl S. cerevisiae, AGATGGCAGT CAACTTCCTT transferase Pichia albicans (SEQ ID NO: 18) C (SEQ ID NO: 19) TAYTGGMGNGT GCRTCNCCCC 1,2-manosil- família de KTR/KRE, NGARCYNGAY ANCKYTCRTA transferase S. cerevisiae ATHAA (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 103) Legenda: M = A ou C, R = A ou G; W = A ou T, S = C ou G, Y = C ou T, K = G ou T, V = A ou C ou G, H = A ou C ou T, D = A ou G ou T f B = C ou G ou T, N = G ou A ou T ou C.

Para se obter o gene ou os genes que codificam a actividade de 1,6-manosil-transferase em P. pastoris, poder-se-ia executar, por exemplo, os passos seguintes: os mutantes OCHl de S. cerevisiae são sensíveis à temperatura e crescem lentamente a temperaturas elevadas. Assim, é possível identificar homólogos funcionais de OCHl em P. pastoris 77 complementando um mutante 0CH1 de S. cerevisiae com uma biblioteca de ADN ou ADNc de P. pastoris. Os mutantes S. cerevisiae podem ser obtidos, v.g., na Universidade de Stanford e são colocados nos circuitos comerciais por ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) . É provável que os mutantes que apresentam um fenótipo com crescimento normal a uma temperatura elevada, depois de terem sido transformados com uma biblioteca de ADN de P. pastoris, transportem um homólogo 0CH1 de P. pastoris. Uma biblioteca deste tipo pode ser criada fazendo digerir parcialmente ADN cromossómico de P. pastoris com uma enzima de restrição adequada e ligando, após a inactivação da enzima de restrição, o ADN assim digerido num vector conveniente, que tenha sido digerido com uma enzima de restrição compatível.

Os vectores adequados compreendem, v.g., pRS314, que é um plasmídeo de poucas cópias (CEN6/ARS4) com base no pBluescript contendo o marcador Trpl (Sikorski, R.S. e Hieter, P., (1989) Genetics 122: 19-27), e o pFL44S, que é um plasmídeo de muitas cópias (2μ) com base num pUC19 modificado contendo o marcador URA3 (Bonneaud, N., et al. (1991) Yeast 7: 609-615). Tais vectores são vulgarmente utilizados pelos investigadores académicos e há vectores semelhantes comercialmente disponíveis em diversos locais (v.g., Invitrogen (Carlsbad, CA); Pharmacia (Piscataway, NJ) ; New England Biolabs (Beverly, MA)). Outro exemplos são o pYES/GS, o plasmídeo de expressão de leveduras com base na origem de replicação 2μ que pode ser obtido em Invitrogen, ou o veículo de clonagem Yep24 de New England Biolabs. 78

Após a ligação do ADN cromossómico e do vector, é possível transformar a biblioteca de ADN dentro de uma estirpe de S. cerevisiae com uma mutação específica e fazer a selecção em função da correcção do fenótipo correspondente. Após a sub-clonagem e a sequenciação do fragmento de ADN que é capaz de restaurar o fenótipo de tipo selvagem, é possível utilizar este fragmento para eliminar a actividade do produto génico codificado por 0CH1 em P. pastoris, utilizando técnicas de mutagénese e/ou de recombinação in vivo, perfeitamente conhecidas pelos especialistas na matéria.

Em alternativa, se for conhecida a totalidade da sequência genómica de uma célula hospedeira relevante particular, v.g., de fungos, então é possível identificar tais genes pesquisando simplesmente bases de dados de ADN acessíveis ao público, que podem ser obtidas em diversas fontes, tais como NCBI, Swissprot. Por exemplo, pesquisando uma dada sequência genómica ou uma base de dados com sequências provenientes de um gene conhecido de 1,6-manosil-transferase (v.g., OCHl de S. cerevisiae), é possível identificar genes de elevada homologia no genoma de uma tal célula hospedeira, o qual pode codificar proteínas, mas não necessariamente, que possuam actividade de 1,6-manosil-transferase. Contudo, a homologia entre sequências de ácidos nucleicos por si só não é suficiente para comprovar que tenha sido identificado e isolado um homólogo que codifique uma enzima que possua a mesma actividade. Até ao momento presente, por exemplo, não há dados disponíveis que demonstrem que uma delecção de OCHl em P. pastoris elimine a actividade crucial iniciadora de 1,6-manosil-transferase. (Martinet et al. 79

Biotech. Letters 20 (12) (Dezembro de 1998): 1171-1177; Contreras et al., WO 02/00856 A2) . Deste modo, não há nenhuns dados que comprovem que o homólogo do gene OCHl de P. pastoris codifique realmente essa função. Tal demonstração é feita aqui pela primeira vez.

Foram identificados homólogos de diversas manosil-transferases de S. cerevisiae em P. pastoris, utilizando estas metodologias. Os genes homólogos têm frequentemente funções semelhantes às dos genes implicados na manosilação de proteínas em S. cerevisiae e consequentemente a sua delecção pode servir para manipular o padrão de glicosilação em P. pastoris ou, por analogia, em qualquer outra célula hospedeira, v.g., em células de fungos, plantas, insectos ou animais, com vias de glicosilação semelhantes. A criação de inactivações de genes, uma vez determinada uma dada sequência de um gene visado, é uma técnica perfeitamente conhecida na especialidade e pode ser executada por um técnico vulgar neste domínio (ver, v.g., R. Rothstein (1991) Methods in Enzymology, vol. 194, pág. 281). A escolha do organismo hospedeiro pode ser influenciada pela disponibilidade de boas técnicas de transformação e de desmembramento de genes.

Se houver diversas manosil-transferases que tenham de ser inactivadas, o método desenvolvido por Alani e Kleckner, (Genetics 116: 541-545 (1987)), por exemplo, permite a utilização repetida de um marcador seleccionável, v.g., o marcador URA3 em leveduras, para eliminar sequencialmente toda a actividade indesejável de manosil-transferase endógena. Esta técnica foi refinada por outros investigadores, 80 mas consiste basicamente na utilização de duas sequências repetidas de ADN, flanqueando um marcador equivalente seleccionável. Por exemplo: é possível utilizar URA3 como marcador para garantir a selecção de um transformante onde esteja integrado uma construção. Flanqueando o marcador URA3 com repetições directas, é possível seleccionar primeiro transformantes onde esteja integrado a construção e tenham assim provocado a disrupção do gene visado. Após o isolamento dos transformantes, e sua caracterização, é possível fazer a selecção inversa numa segunda experiência para aqueles que sejam resistentes ao ácido 5-fluór-orótico (5-FOA). As colónias que sejam capazes de sobreviver em placas contendo 5-FOA perderam mais uma vez o marcador URA3 através de um fenómeno de recombinação envolvendo as repetições mencionadas antes. Assim, esta metodologia permite a utilização repetida do mesmo marcador e facilita o desmembramento de vários genes sem serem necessários outros marcadores. Também é possível utilizar técnicas semelhantes para a eliminação sequencial de genes, adaptadas para utilização noutras células hospedeiras eucariotas com outros marcadores seleccionáveis e contra-seleccionáveis. A eliminação de manosil-transferases específicas, tais como 1,β-manosil-transferase (OCHl) ou manosil-fosfato-transferases (MNN6 ou genes que complementam os mutantes lbd) ou reguladores (MNN4) em P. pastoris permite criar estirpes deste organismo geneticamente manipuladas que sintetizam essencialmente Man8GlcNAc2 e que podem ser utilizadas para modificar ainda mais o padrão de glicosilação para se assemelhar a estruturas de glicoformas mais complexas, v.g., 81 as produzidas em mamíferos, v.g., células humanas. Numa variante preferencial deste método são utilizadas sequências de ADN que codificam actividades bioquímicas de glicosilação para eliminar funções bioquímicas semelhantes ou idênticas em P. pastoris para modificar a estrutura de glicosilação de glicoproteínas produzidas na estirpe de P. pastoris geneticamente modificada.

Os métodos utilizados para modificar geneticamente a via de glicosilação em leveduras, conforme aqui exemplificado, podem ser utilizados em fungos filamentosos para a produção de um substrato preferencial para subsequente modificação. É possível desenvolver estratégias para modificar vias de glicosilação em A. niger e noutros fungos filamentosos, por exemplo, utilizando protocolos análogos aos aqui descritos para a manipulação genética de estirpes para a produção de glicoproteínas humanóides em leveduras. As actividades génicas indesejadas, implicadas na actividade de 1,2-manosil-transferase, v.g., homólogos de KTR/KRE, são modificadas ou eliminadas. 0 hospedeiro preferido é um fungo filamentoso, tal como Aspergillus, uma vez que lhe falta a actividade de 1,6-manosil-transferase e por esse motivo não seria previsível a ocorrência de uma actividade do gene da hipermanosilação, v.g., 0CH1, neste hospedeiro. Pelo contrário, são introduzidas no hospedeiro outras actividades desejadas (v.g., de a-1,2-manosidase, de transportador UDP-GlcNAc, de glicosil-transferase (GnT), de galactosil-transferase (GalT) e de sialil-transferase (ST)) implicadas na glicosilação, utilizando os métodos de endereçamento da presente invenção. 82

Selecção ou manipulação genética de hospedeiros que possuem uma actividade atenuada de a-1,6-manosil-transferase iniciadora

De acordo com uma variante preferida, o método da invenção consiste em produzir ou utilizar uma célula hospedeira em que esteja atenuada ou suprimida a actividade de uma a-1,6-manosil-transferase iniciadora, isto é, uma enzima especifica de iniciação que inicia a manosilação da cadeia exterior numa ramificação a-1,3 da estrutura central de Man3ClcNAc2. Em S. cerevisiae, esta enzima está codificada pelo gene OCHl. 0 desmembramento do gene OCHl em S. cerevisiae dá origem a um fenótipo em que na cadeia exterior de polimanose não há nenhum açúcar com ligações N. Em práticas anteriores para se conseguir obter a glicosilação em estirpes fúngicas, do tipo observado em mamíferos, foi necessária a inactivação de OCHl (ver, v.g.r Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 26298-304). No entanto, o desmembramento da actividade de a-1,6-manosil-transferase iniciadora numa célula hospedeira da invenção pode ser facultativo (dependendo isso da célula hospedeira seleccionada), uma vez que a enzima Ochlp necessita de uma Man8GlcNAc2 intacta para uma iniciação eficiente da cadeia exterior da manose. Deste modo, as células hospedeiras seleccionadas ou produzidas em conformidade com a presente invenção, as quais acumulam oligossacarídeos que possuem sete ou menos resíduos manose, podem produzir N-glicanos hipoglicosilados que irão ser provavelmente substratos medíocres para Ochlp (ver, v.g., Nakayama et al. (1997) FEBS Lett. 412 (3): 547-50). 83 0 gene OCHl foi clonado a partir de P. pastoris (exemplo 1) e de K. lactis (exenqplo 9), conforme descrito. As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos do gene 0CH1 proveniente de K. lactis estão explicitadas em SEQ ID NO: 3 e 4. Utilizando iniciadores específicos dos genes, produziu-se uma construção a partir de cada clone para suprimir o gene OCHl do genoma de P. pastoris e de K. lactis (respectivamente exemplos 1 e 9). Obteve-se assim células hospedeiras sem a actividade de a-1,6-manosil-transferase e geneticamente manipuladas para produzirem N-glicanos com uma estrutura de hidratos de carbono Man5GlcNAC2 (ver, v.g., exemplos 4 e 9) . A presente invenção descreve uma molécula de ácido nucleico isolada que possui uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ou é constituída pelo menos por quarenta e cinco, de preferência pelo menos 50, mais preferencialmente pelo menos 60 e muito mais preferencialmente 75 ou mais resíduos nucleotídicos do gene OCHl de K. lactis (SEQ ID NO: 7) e seus homólogos, variantes e derivados. A presente invenção também descreve moléculas de ácidos nucleicos que hibridam em condições restringentes com as moléculas de ácidos nucleicos supramencionadas. De igual modo, a invenção proporciona polipéptidos isolados (incluindo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados e análogos) codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas. São também descritos vectores, incluindo vectores de expressão, que compreendem as moléculas de ácidos nucleicos supramencionadas, conforme aqui melhor descrito. De igual modo, a invenção proporciona também células hospedeiras 84 transformadas com as moléculas de ácidos nucleicos ou vectores aqui descritos. A presente invenção proporciona ainda métodos para fazer ou utilizar uma célula hospedeira eucariótica não humana em que se diminuiu ou suprimiu uma actividade do qene alg (isto é, actividades de alg, incluindo as actividades enzimáticas equivalentes em células hospedeiras não fúnqicas) e introduzindo na célula hospedeira pelo menos uma actividade de glicosidase. De acordo com uma variante preferencial, a actividade de glicosidase é introduzida provocando a expressão de uma ou várias actividades de manosidase dentro da célula hospedeira, por exemplo, por activação de uma actividade de manosidase, ou por expressão a partir de uma molécula de ácido nucleico de uma actividade de manosidase, na célula hospedeira.

Ainda de acordo com uma outra variante, a invenção proporciona um método para produzir uma glicoproteina humanóide num hospedeiro não humano, em que a glicoproteina compreende um N-glicano que possui pelo menos dois GlcNAc acoplados a uma estrutura central de trimanose.

Expressão de manosidases de classe 2 em eucarlotas inferiores

A presente invenção prevê também um método para a produção de glicoproteinas de tipo mais humano em células hospedeiras eucarióticas inferiores, mediante a expressão de um gene que codifica manosidases de classes II cataliticamente activas (EC. 3.2.1.114) (homólogos, variantes, derivados e seus fragmentos cataliticamente activos). 85

Utilizando técnicas conhecidas na especialidade, são concebidos iniciadores específicos do gene para complementar as regiões homólogas dos genes das manosidases de classe 2 (v.g., α-manosidase II de D. melanogaster) com a finalidade de se amplificar por PCR o gene da manosidase.

Através da expressão de uma manosidase de classe 2 activa numa célula, a partir de um ácido nucleico que codifica a manosidase de classe 2, manipula-se geneticamente uma célula hospedeira (v.g., de P. pastoris) para produzir glicoproteínas de tipo mais humano (ver, v.g., os exemplos 17 a 25) .

De acordo com um aspecto da invenção, descreve-se um método para produzir uma glicoproteína de tipo humano num eucariota inferior (v.g., P. pastoris), construindo uma biblioteca de enzimas α-manosidase II. De acordo com uma variante preferencial, recorre-se a uma biblioteca secundária de sequências de α-manosidase II de D. melanogaster (v.g., com o n° de registo X77652 no Genbank) que é fundida com uma biblioteca secundária de sequências peptídicas de endereçamento de MNN2 de S. cerevisiae. De acordo com uma variante mais preferencial da invenção, utiliza-se uma construção de fusão que compreende manosidase II Δ74 de D. melanogaster/MNN2(s) que é transformada dentro de um hospedeiro P. pastoris, produzindo GlcNAcMan5GlcNAc2. Ver, Choi et al., Proc Natl Acad Sei USA., 29 de Abril de 2003; 100(9): 5022-7 e o documento WO 02/00879, onde estão descritos métodos para a produção de glicoproteínas de tipo humano em eucariotas inferiores que possuem a estrutura de N- 86 glicanos supramencionada, a qual recebe agora a designação de YSH-1 de P. pastoris. 0 texto descreve também uma sequência de α-manosidase II do Golgi, seleccionada a partir de ratos, murganhos, seres humanos, vermes, plantas e insectos. Tais sequências podem ser obtidos nos bancos de dados tais como Swissprot e Genbank. Por exemplo, no Genbank foram obtidas as sequências de genes seguintes: manosidase II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) ; manosidase II de C. elegans (NM__073594) ; manosidase II de Ciona intestinalis (AK116684); manosidase II de Drosophila melanogaster (X77652); manosidase II dos seres humanos (U31520); manosidase II de murganho (X61172); manosidase II de rato (XM_218816) ; manosidase IIx dos seres humanos (D55649); manosidase III de células de insecto (AF005034); manosidase II lisossómica dos seres humanos (NM_000528) e manosidase II citossólica dos seres humanos (NM_006715) (figuras 25 a 35, SEQ ID NOs: 49 a 59, respectivamente). Devido à elevada similaridade entre sequências e à presença de actividade de Mana-1,3 e Mana-1,6, a manosidase II citoplásmica e a manosidase II lisossómica serão aqui designadas colectivamente como manosidases de classe 2.

Outras manosidases que revelam actividade de a-manosidase II do Golgi compreendem, inter alia, a manosidase III de insectos (AF005034) e a manosidase IIx dos seres humanos (D55649). Posto isto, explica-se no texto que estas manosidases podem ser utilizadas para gerar uma biblioteca de ADN combinatório de enzimas cataliticamente activas. 87

De acordo com um outro aspecto da invenção, utiliza-se uma biblioteca secundária de sequências (lideres) de péptidos de endereçamento, seleccionadas entre o conjunto constituído por GLS1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, 0CH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VANl de Saccharomyces, ANP 1 de Saccharomyces, H0C1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNNll de

Saccharomyces, MNTl de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTRl de Saccharomyces, KTR2 de

Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YURI de Saccharomyces, MNNl de

Saccharomyces e MNN6 de Saccharomyces, as quais são fundidas com sequências que codificam domínios de manosidases II cataliticamente activas. A combinação da biblioteca de sequências líderes/domínios catalíticos está ilustrada no quadro 11 (exemplo 14).

As construções de fusão de α-manosidase II do Golgi, geradas de acordo com a presente invenção, apresentam actividade retificadora de a-1,3-manosidase e de a-1,6- manosidase. Por exemplo, a construção de fusão de manosidase II cataliticamente activa cliva as ligações glicosídicas Mana-1,3 e Mana-1,6 presentes nos substratos desde GlcNAcMan5GlcNAc2 até GlcNAcMan3GlcNAc2 na estirpe YSH-1 de P. pastoris. De acordo com um outro exemplo, uma construção de fusão de manosidase IIx cataliticamente activa cliva as ligações glicosídicas Mana-1,3 e Mana-1,6 presentes nos oligossacarídeos desde Man6GlcNAC2 até Man4GlcNAC2.

Hidrólise da ligação glicosidica pelas manosidases de classe 2 88 A presente invenção diz respeito também ao mecanismo que permite que o domínio cataliticamente activo das enzimas de classe 2 hidrólise as ligações glicosídicas Mana-1,3 e/ou Mana-1,6 num oligossacarídeo, v.g., numa estrutura GlcNAcMan5GlcNAc2 para proporcionar GlcNAcMan3GlcNAc2, que é um intermediário desejado para o processamento subsequente dos N-glicanos num eucariota inferior. De acordo com uma primeira variante, a hidrólise das ligações glicosídicas ocorre sequencialmente. A enzima hidrolisa pelo menos uma ligação glicosídica e roda conformacionalmente para hidrolisar a outra ligação glicosídica. De acordo com uma segunda variante, a hidrólise das ligações glicosídicas ocorre simultaneamente. 0 intermediário produzido é um substrato para processamento posterior no Golgi, em que outras enzimas de glicosilação, tais como N-acetil-glucosaminil-transferases (GnT), galactosil-transferases (GalT) e sialil-transferases (ST), o podem modificar subsequentemente para se obter uma glicoforma desejada. A figura 36A ilustra os intermediários oligossacarídicos (v.g., GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan4GlcNAc2) produzidos por acção da via de manosidase II e a figura 36B ilustra os intermediários oligossacarídicos (v.g., Man4GlcNAc2, Man5GlcNAc2) produzidos por acção da via de manosidase Ilx.

Regiões conservadas das enzimas manosidases II

Constitui uma particularidade da presente invenção a expressão de sequências que codificam regiões conservadas da enzima manosidase II. A presente invenção proporciona moléculas isoladas de ácidos nucleicos que compreendem as 89 regiões conservadas do gene da manosidase II, provenientes de diversas fontes, incluindo insectos, mamíferos, plantas e vermes.

Foram identificadas e sequenciadas diversas sequências de ácidos nucleicos de comprimento completo que codificam as enzimas manosidases II. As sequências das enzimas manosidases II são as compreendidas entre SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 59. Um alinhamento de sequências conhecidas de manosidases II (isto é, a sequência de Drosophíla melanogaster alinhada com outras sequências de insectos, animais e plantas) revela um motivo altamente conservado entre os aminoácidos 144-166 e os aminoácidos 222-285 (figura 23) . Assim sendo, de acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para se aplicar a uma célula hospedeira um ácido nucleico que codifica uma actividade enzimática de manosidases de classe 2, em que o ácido nucleico se caracteriza pelo facto de possuir as regiões conservadas de manosidases II supramencionadas.

Além disso o alinhamento de sequências revela também diversas pontes dissulfureto entre cisteína-cisteína altamente conservadas, entre os aminoácidos 338-345 e os aminoácidos 346-360, conforme ilustrado na figura 23. Estas pontes dissulfureto podem desempenhar uma função importante na ligação e reconhecimento do substrato, v.g., mantendo a arquitectura da proteína. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma primeira sequência de 90 aminoácidos constituída por 23 resíduos aminoácidos que possuem a sequência sequinte: 144 Léu Lys Vai Phe Vã! Ysi Pro Hís Ser Hís Am Asp Pso Gly Ττρ Se <3133. Ti» Pàe Gk Glu Tyr % (SEQIB EÚ: 5), o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o

De acordo com uma outra variante, na posição 145 da primeira sequência é conjunto constituído por K E Q N e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 146 da primeira sequência é conjunto constituído por V e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 147 da primeira sequência é conjunto constituído por F I H e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 148 da primeira sequência é conjunto constituído por V I L e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 149 da primeira sequência é conjunto constituído por V I L e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 150 da primeira sequência é conjunto constituído por P e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 151 da primeira sequência é conjunto constituído por H e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 152 da primeira sequência é conjunto constituído por S T e G. 91

De acordo com uma outra variante, na posição 153 da primeira sequência é conjunto constituído por H e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 154 da primeira sequência é conjunto constituído por N C D e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 156 da primeira sequência é conjunto constituído por P e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 157 da primeira sequência é conjunto constituído por G e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 158 da primeira sequência é conjunto constituído por W e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 159 da primeira sequência é conjunto constituído por I L K e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 160 da primeira sequência é conjunto constituído por Q Μ K e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 161 da primeira sequência é conjunto constituído por T e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 162 da primeira sequência é conjunto constituído por F e V. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 92

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 163 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por E D e N.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 164 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por E K D R Q e V.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 165 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y e A.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 166 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y F e C. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma primeira sequência de aminoácidos constituída por 23 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 222

Glu Phe Vai Thr Gly Gly Trp Vai Met Pr* Asp GIuÁla Àsu SsrTrp ArgAs&VaJ

Lm Lei GÈi Leu Thr Glu Gly Gto Thr Tsp Leu Lys Gin PM Mct Ám Vai Tfc Pm m Alá Ser Tip Ala Be Asp Pro FM Gly His SerFrolhrMetProTyr Be Lm (SMqmmt 6).

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 222 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por E e R.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 223 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F I e S. 93

De acordo com uma outra variante, na posição 224 da primeira sequência é conjunto constituído por V A T e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 225 da primeira sequência é conjunto constituído por T G N e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 226 da primeira sequência é conjunto constituído por G e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 227 da primeira sequência é conjunto constituído por G e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 228 da primeira sequência é conjunto constituído por w e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 229 da primeira sequência é conjunto constituído por V e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 230 da primeira sequência é conjunto constituído por M e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 231 da primeira sequência é conjunto constituído por P T e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 232 da primeira sequência é conjunto constituído por D e Q. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 94

De acordo com uma outra variante, na posição 233 da primeira sequência é conjunto constituído por E e M.

De acordo com uma outra variante, na posição 234 da primeira sequência é conjunto constituído por A e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 235 da primeira sequência é conjunto constituído por N T C e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 236 da primeira sequência é conjunto constituído por S A P T e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 237 da primeira sequência é conjunto constituído por H e C.

De acordo com uma outra variante, na posição 238 da primeira sequência é conjunto constituído por W Y I e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 239 da primeira sequência é conjunto constituído por R H F Y G e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 240 da primeira sequência é conjunto constituído por N S e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 241 da primeira sequência é conjunto constituído por V M L I e Q. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 95 95 o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o

De acordo com uma outra variante, na posição 242 da primeira sequência é conjunto constituído por L I V e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 243 da primeira sequência é conjunto constituído por L T G D e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 244 da primeira sequência é conjunto constituído por Q E e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 245 da primeira sequência é conjunto constituído por L M e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 246 da primeira sequência é conjunto constituído por TF I A e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 247 da primeira sequência é conjunto constituído por E L e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 248 da primeira sequência é conjunto constituído por G e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 249 da primeira sequência é conjunto constituído por Q Η P Μ N e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 250 da primeira sequência é conjunto constituído por TEPQMHReA. 96

De acordo com uma outra variante, na posição 251 da primeira sequência é conjunto constituído por W P F e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 252 da primeira sequência é conjunto constituído por L I V e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 253 da primeira sequência é conjunto constituído por K Q R E N e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 254 da primeira sequência é conjunto constituído por Q N R K D e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 255 da primeira sequência é conjunto constituído por F Η N e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 256 da primeira sequência é conjunto constituído por Μ I L e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 257 da primeira sequência é conjunto constituído por N e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 258 da primeira sequência é conjunto constituído por V A G e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 259 da primeira sequência é conjunto constituído por T I K V R e G. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 97

De acordo com uma outra variante, na posição 260 da primeira sequência é conjunto constituído por P e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 261 da primeira sequência é conjunto constituído por T Q R K e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 262 da primeira sequência é conjunto constituído por A S N T e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 263 da primeira sequência é conjunto constituído por S H G A e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 264 da primeira sequência é conjunto constituído por W e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 265 da primeira sequência é conjunto constituído por A S H e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 266 da primeira sequência é conjunto constituído por I e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 267 da primeira sequência é conjunto constituído por D e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 268 da primeira sequência é conjunto constituído por P e A. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 98

De acordo com uma outra variante, na posição 269 da primeira sequência é conjunto constituído por F e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 271 da primeira sequência é conjunto constituído por H L e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 272 da primeira sequência é conjunto constituído por S T G e C.

De acordo com uma outra variante, na posição 273 da primeira sequência é conjunto constituído por P S A R e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 274 da primeira sequência é conjunto constituído por T S E e I.

De acordo com uma outra variante, na posição 275 da primeira sequência é conjunto constituído por Μ V Q e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 276 da primeira sequência é conjunto constituído por P A e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 277 da primeira sequência é conjunto constituído por Y H S e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 278 da primeira sequência é conjunto constituído por I L e W. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 99

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 279 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L e F.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 280 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por QTRKNDAeW.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 281 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por K S R Q e P.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 282 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por S A e M.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 283 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G N e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 284 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F I e L.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 285 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por K T S E e D. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma terceira sequência de aminoácidos constituída por 33 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 325 100

His Met Mei Pro Piie Tyt S«rl>AspÍle Pm His Thr Cys Oly Pro Asp Pro Arg Se Cys (¾¾ Gin Ffae Asp Phs Arg Âtg MeíPro CHy GlyArg (SEQ © MO: ?)-

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 325 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Η P e S.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 326 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Μ I L N T e R.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 327 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por M Q A e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 328 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por P e D.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 329 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F L e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 330 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y D F e L.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 331 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por S I T e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 332 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y G e S. 101

De acordo com uma outra variante, na posição 333 da primeira sequência é conjunto constituído por D S V e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 334 da primeira sequência é conjunto constituído por I V e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 335 da primeira sequência é conjunto constituído por P K e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 336 da primeira sequência é conjunto constituído por H S N e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 337 da primeira sequência é conjunto constituído por T G e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 338 da primeira sequência é conjunto constituído por C Y e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 339 da primeira sequência é conjunto constituído por G N e C.

De acordo com uma outra variante, na posição 340 da primeira sequência é conjunto constituído por P e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 341 da primeira sequência é conjunto constituído por D E Η P e G. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 102

De acordo com uma outra variante, na posição 342 da primeira sequência é conjunto constituído por P R e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 343 da primeira sequência é conjunto constituído por K S A N e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 344 da primeira sequência é conjunto constituído por V I e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 345 da primeira sequência é conjunto constituído por C e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 346 da primeira sequência é conjunto constituído por C L w e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 347 da primeira sequência é conjunto constituído por Q S D e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 348 da primeira sequência é conjunto constituído por F V e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 349 da primeira sequência é conjunto constituído por D L e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 350 da primeira sequência é conjunto constituído por F C e W. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 103

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 351 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R K A e V.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 352 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R K D e E.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 353 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por M L I e Q.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 354 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G P Re D.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 355 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por S E G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 356 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F G e N.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 357 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G R K e L. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma quarta sequência de aminoácidos constituída por 28 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 380 104

Lira Lm Lm Asp Gla Tyr Mg Lys Lys Ser Gia Lea Phe Arg Thr Asa VaJ. Leu Lm De fm Leu Gly Asp Asp Ffc® Arg Tyr (SEQ D HO: 8).

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 380 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L Μ I K T e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 381 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L I F e C.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 382 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por V Y L I e S.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 383 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D E N e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 384 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Q E V e F.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 385 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por W Y e A.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 386 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R D T e L.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 387 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por K R A e P. 105

De acordo com uma outra variante, na posição 388 da primeira sequência é conjunto constituído por K I Q e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 389 da primeira sequência é conjunto constituído por A S G e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 390 da primeira sequência é conjunto constituído por EQRKTSeE

De acordo com uma outra variante, na posição 391 da primeira sequência é conjunto constituído por L Y e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 392 da primeira sequência é conjunto constituído por Y F e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 393 da primeira sequência é conjunto constituído por R P e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 394 da primeira sequência é conjunto constituído por T N S H e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 395 da primeira sequência é conjunto constituído por N S K D e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 396 da primeira sequência é conjunto constituído por V T He L. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 106

De acordo com uma outra variante, na posição 397 da primeira sequência é conjunto constituído por L I V T e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 398 da primeira sequência é conjunto constituído por L F V e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 399 da primeira sequência é conjunto constituído por I Q V A e M.

De acordo com uma outra variante, na posição 400 da primeira sequência é conjunto constituído por P I T e M.

De acordo com uma outra variante, na posição 401 da primeira sequência é conjunto constituído por L M e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 403 da primeira sequência é conjunto constituído por D S e C.

De acordo com uma outra variante, na posição 404 da primeira sequência é conjunto constituído por D e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 405 da primeira sequência é conjunto constituído por Fel.

De acordo com uma outra variante, na posição 406 da primeira sequência é conjunto constituído por R e Q. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 107

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 407 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F Y e R. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma quinta sequência de aminoácidos constituída por 12 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte:

43S

Gm Pbe Sfy Pr t&s @§r Asp Tyr Phe Asp A& {SsQ ÍD NO: $),

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 438 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Q K L e H.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 439 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 440 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G S e P.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 441 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por τ e P.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 442 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L P e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 443 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Q S E L A e D. 108

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 444 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por E D C e S.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 445 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y e F.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 446 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F L e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 447 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D K R N W e M.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 448 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por A κ T E e Q.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 449 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por V L M e G. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma sexta sequência de aminoácidos constituída por 14 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 463

Lea S«rGly Asp Phe R»Thrlyr A& Asp Afg Ser Asp His (SEG !D NO: iS).

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 463 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L F e K. 109

De acordo com uma outra variante, na posição 464 da primeira sequência é conjunto constituído por S K H e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 465 da primeira sequência é conjunto constituído por G D e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 466 da primeira sequência é conjunto constituído por D e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 467 da primeira sequência é conjunto constituído por F e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 468 da primeira sequência é conjunto constituído por F e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 469 da primeira sequência é conjunto constituído por T S V P e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 470 da primeira sequência é conjunto constituído por Y e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 471 da primeira sequência é conjunto constituído por A S e K.

De acordo com uma outra variante, na posição 472 da primeira sequência é conjunto constituído por D e G. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 110

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 473 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R I e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 474 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por SDEQFPeA.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 475 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D Q S H e N.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 476 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por N H D E e Q. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma sétima sequência de aminoácidos constituída por 20 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 47?

Tyr Ίψ Ser Gly Tyr fyr Xhr Ser Ârg Pró TL· Tyr Àrg Árg hkt Asp Arg Vai Le» GIu(SIQID NG: II).

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 477 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y e F.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 478 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por W e G. 111

De acordo com uma outra variante, na posição 479 da primeira sequência é conjunto constituído por S T e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 481 da primeira sequência é conjunto constituído por Y e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 482 da primeira sequência é conjunto constituído por Y F e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 483 da primeira sequência é conjunto constituído por T V S e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 484 da primeira sequência é conjunto constituído por S T e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 485 da primeira sequência é conjunto constituído por R e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 487 da primeira sequência é conjunto constituído por Y F A e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 488 da primeira sequência é conjunto constituído por Η Y F L e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 489 da primeira sequência é conjunto constituído por K e T. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 112

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 490 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R Q S Μ A e I.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 491 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por M L Q V e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 492 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D E e A.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 494 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por VI Q e L.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 495 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L M F S e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 496 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por M Q E Y e R. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma oitava sequência de aminoácidos constituída por 27 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 524

Ala Arg Arg Glu Les G!y Lm Phe GlnHk Eis Asp Ala Se Tk Gly Tk Ala Arg Asp, Eis Vai Vai Vai Asp Tyr Gly (SBQ ÍD NO: 12). 113

De acordo com uma outra variante, na posição 524 da primeira sequência é conjunto constituído por A L e W.

De acordo com uma outra variante, na posição 525 da primeira sequência é conjunto constituído por R N e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 526 da primeira sequência é conjunto constituído por R Q E e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 527 da primeira sequência é conjunto constituído por E A T e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 528 da primeira sequência é conjunto constituído por L e M.

De acordo com uma outra variante, na posição 529 da primeira sequência é conjunto constituído por S G A e F.

De acordo com uma outra variante, na posição 530 da primeira sequência é conjunto constituído por L e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 531 da primeira sequência é conjunto constituído por F L e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 532 da primeira sequência é conjunto constituído por Q e L. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 114

De acordo com uma outra variante, na posição 534 da primeira sequência é conjunto constituído por H e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 535 da primeira sequência é conjunto constituído por D e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 536 da primeira sequência é conjunto constituído por G A e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 537 da primeira sequência é conjunto constituído por I V e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 538 da primeira sequência é conjunto constituído por T e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 539 da primeira sequência é conjunto constituído por G e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 540 da primeira sequência é conjunto constituído por T e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 541 da primeira sequência é conjunto constituído por A e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 542 da primeira sequência é conjunto constituído por K R e Q. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 115

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 543 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por T D E S Q e I.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 544 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Η A W Y S e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 545 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por V e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 546 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por V Μ A e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 547 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por V L Q e N.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 548 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D e R.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 549 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y e E.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 550 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por E G A e C. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma nona sequência de aminoácidos 116 constituída por 11 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 78» <5ly A& Tyr Lsu PHe l&is Pm âs$ Ôiy Glu Ala íBfcô ID NO:: IS).

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 789 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por A e W.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 790 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y e D.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 791 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L I e V.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 792 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F e M.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 793 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L K M R e D.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 794 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por P e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 795 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por N D A e H.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 796 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G N Y Q e L. 117

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 797 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por P E Q N e D.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 798 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por A G S K e T. A presente invenção proporciona também fragmentos cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma décima sequência de aminoácidos constituída por 14 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 86?

PteTjírThrAsp leis Asn í3;íy Phe íSífi MetQín LysAígArg (SEQID NO: 14)..

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 867 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F T e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 868 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por Y F S e E.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 869 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por T I e S.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 870 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por D e Q.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 871 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L T Q S e F. 118 118 o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o também fragmentos

De acordo com uma outra variante, na posição 872 da primeira sequência é conjunto constituído por N S e G.

De acordo com uma outra variante, na posição 873 da primeira sequência é conjunto constituído por G T e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 874 da primeira sequência é conjunto constituído por L M F AY e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 875 da primeira sequência é conjunto constituído por Q R e Ξ.

De acordo com uma outra variante, na posição 876 da primeira sequência é conjunto constituído por F Μ v I Y e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 877 da primeira sequência é conjunto constituído por I Q S L e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 878 da primeira sequência é conjunto constituído por K P R E e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 879 da primeira sequência é conjunto constituído por R e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 880 da primeira sequência é conjunto constituído por R Μ T E V e Y. A presente invenção proporciona cataliticamente activos de manosidases de classe 2 que 119 compreendem regiões conservadas das sequências de aminoácidos, especialmente uma décima primeira sequência de aminoácidos constituída por 66 resíduos aminoácidos que possuem a sequência seguinte: 904

Lys Lea Pro Leu Gin Ala Asa Tyr Tyr Pro Md Pro Ser Met Áfe Tyr Se Gin Aaj>

Ala Ass Thí Arg Im Tk Leu Leu Thr Gly Gin Pro Leu Gíy Vai Ser Ser Leu Ala Ser Gly Glu Lei Glu Vai Met hm Âsp Arg Arg Leu. Met Ser Asp Asp Am Arg Gly hm Gly Gin Gly Vai Leu Asp Am. Lys {SiQ 1D NO; 15),

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 904 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por N T Q E e K.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 905 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por TRKHSQMeF.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 906 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por R Q e G.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 907 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L M e F.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 908 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por T S e A.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 909 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por L I e V. 120

De acordo com uma outra variante, na posição 910 da primeira sequência é conjunto constituído por L H e M.

De acordo com uma outra variante, na posição 911 da primeira sequência é conjunto constituído por T S e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 912 da primeira sequência é conjunto constituído por G A R N e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 913 da primeira sequência é conjunto constituído por Q H R e C.

De acordo com uma outra variante, na posição 914 da primeira sequência é conjunto constituído por P A S e K.

De acordo com uma outra variante, na posição 915 da primeira sequência é conjunto constituído por L Q e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 917 da primeira sequência é conjunto constituído por G V e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 918 da primeira sequência é conjunto constituído por S e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 919 da primeira sequência é conjunto constituído por S e A. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 121

De acordo com uma outra variante, na posição 920 da primeira sequência é conjunto constituído por L M e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 921 da primeira sequência é conjunto constituído por ASGKERet

De acordo com uma outra variante, na posição 922 da primeira sequência é conjunto constituído por S N D E P e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 924 da primeira sequência é conjunto constituído por E Q W R e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 925 da primeira sequência é conjunto constituído por Lei.

De acordo com uma outra variante, na posição 926 da primeira sequência é conjunto constituído por E e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 927 da primeira sequência é conjunto constituído por I V L e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 928 da primeira sequência é conjunto constituído por Μ I F V e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 929 da primeira sequência é conjunto constituído por Q L Μ V e S. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 122

De acordo com uma outra variante, na posição 930 da primeira sequência é conjunto constituído por D H e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 931 da primeira sequência é conjunto constituído por R e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 933 da primeira sequência é conjunto constituído por L T e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 934 da primeira sequência é conjunto constituído por A S Μ V L e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 935 da primeira sequência é conjunto constituído por S Q R Y e K.

De acordo com uma outra variante, na posição 936 da primeira sequência é conjunto constituído por D e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 937 da primeira sequência é conjunto constituído por D e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 938 da primeira sequência é conjunto constituído por E N G F e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 939 da primeira sequência é conjunto constituído por R e A. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 123

De acordo com uma outra variante, na posição 940 da primeira sequência é conjunto constituído por G e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 941 da primeira sequência é conjunto constituído por L V I e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 942 da primeira sequência é conjunto constituído por G Q E S e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 943 da primeira sequência é conjunto constituído por Q E e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 944 da primeira sequência é conjunto constituído por G e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 945 da primeira sequência é conjunto constituído por V L I e R.

De acordo com uma outra variante, na posição 946 da primeira sequência é conjunto constituído por LRKHQMet

De acordo com uma outra variante, na posição 947 da primeira sequência é conjunto constituído por D e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 948 da primeira sequência é conjunto constituído por N e F. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 124

De acordo com uma outra variante, na posição 949 da primeira sequência é conjunto constituído por K L R G e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 950 da primeira sequência é conjunto constituído por P R I A S e Y.

De acordo com uma outra variante, na posição 951 da primeira sequência é conjunto constituído por V T M G e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 952 da primeira sequência é conjunto constituído por L V C A P T.

De acordo com uma outra variante, na posição 953 da primeira sequência é conjunto constituído por HANEVFWe De acordo com uma outra variante, na posição 954 da primeira sequência é conjunto constituído por iHRLSVQe De acordo com uma outra variante, na posição 955 da primeira sequência é conjunto constituído por Y F N R e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 956 da primeira sequência é conjunto constituído por R V H W G e K.

De acordo com uma outra variante, na posição 957 da primeira sequência é conjunto constituído por L I R e G. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o M. o resíduo aminoácido seleccionado entre o P. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 125

De acordo com uma outra variante, na posição 958 da primeira sequência é conjunto constituído por V L Μ H e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 959 da primeira sequência é conjunto constituído por L I A F.

De acordo com uma outra variante, na posição 960 da primeira sequência é conjunto constituído por E V e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 961 da primeira sequência é conjunto constituído por K P R S L e D.

De acordo com uma outra variante, na posição 962 da primeira sequência é conjunto constituído por VMRWNLeí De acordo com uma outra variante, na posição 963 da primeira sequência é conjunto constituído por NSTIPDeC De acordo com uma outra variante, na posição 964 da primeira sequência é conjunto constituído por NSLVAGel De acordo com uma outra variante, na posição 965 da primeira sequência é conjunto constituído por CSMGVIQe De acordo com uma outra variante, na posição 966 da primeira sequência é conjunto constituído por V S N A T e Q. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o A. o resíduo aminoácido seleccionado entre o 126 126 o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido

De acordo com uma outra variante, na posição 967 da primeira sequência é conjunto constituído por RGPMTAeE De acordo com uma outra variante, na posição 968 da primeira sequência é conjunto constituído por P N E K e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 969 da primeira sequência é conjunto constituído por SKVEAKel De acordo com uma outra variante, na posição 970 da primeira sequência é conjunto constituído por K Q E S R e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 971 da primeira sequência é conjunto constituído por LEQDKNeC De acordo com uma outra variante, na posição 972 da primeira sequência é conjunto constituído por Η E S K T e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 973 da primeira sequência é conjunto constituído por P R S K e N.

De acordo com uma outra variante, na posição 974 da primeira sequência é conjunto constituído por A V T L P e Y. De acordo com uma outra variante, na posição 975 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por G S A R e Q. 127

De acordo com uma outra variante, na posição 976 da primeira sequência é conjunto constituído por Y F N e V.

De acordo com uma outra variante, na posição 977 da primeira sequência é conjunto constituído por L H e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 978 da primeira sequência é conjunto constituído por T S e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 979 da primeira sequência é conjunto constituído por S H L M e Q.

De acordo com uma outra variante, na posição 980 da primeira sequência é conjunto constituído por A V L e T.

De acordo com uma outra variante, na posição 981 da primeira sequência é conjunto constituído por A G S V e L.

De acordo com uma outra variante, na posição 982 da primeira sequência é conjunto constituído por Η Y D L e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 983 da primeira sequência é conjunto constituído por KLMIQYeí

De acordo com uma outra variante, na posição 984 da primeira sequência é conjunto constituído por A T S I L e P. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o 128 128 o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o A. o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o o resíduo aminoácido seleccionado entre o W. o resíduo aminoácido

De acordo com uma outra variante, na posição 985 da primeira sequência é conjunto constituído por S T G e E.

De acordo com uma outra variante, na posição 986 da primeira sequência é conjunto constituído por QWMSAReE De acordo com uma outra variante, na posição 987 da primeira sequência é conjunto constituído por SYFLEHMe De acordo com uma outra variante, na posição 988 da primeira sequência é conjunto constituído por L M F V e P.

De acordo com uma outra variante, na posição 989 da primeira sequência é conjunto constituído por L Η N e A.

De acordo com uma outra variante, na posição 990 da primeira sequência é conjunto constituído por D Y T A e H.

De acordo com uma outra variante, na posição 991 da primeira sequência é conjunto constituído por P e S.

De acordo com uma outra variante, na posição 992 da primeira sequência é conjunto constituído por LPAFVIQe De acordo com uma outra variante, na posição 993 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por DVLIRNeS. 129

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 994 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por K V A P e T.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 995 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por F M L e Y.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 996 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por I P V A S e L.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 997 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por FGVLNAeP.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 998 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por ADASNKeG.

De acordo com uma outra variante, o resíduo aminoácido na posição 999 da primeira sequência é seleccionado entre o conjunto constituído por EAKRGTeS.

Expressão de manosidases de classe III em eucariotas inferiores

Também se descreve aqui a possibilidade de introduzir uma manosidase, que tenha especificidade de substrato para Mana-Ι,2/Mana-l,3/Mana-l,6 num hospedeiro eucariota inferior.

De acordo com uma variante, uma manosidase de classe III, capaz de hidrolisar as ligações glicosídicas Mana-1,2/Mana-l,3/Mana-l,6 é expressa num hospedeiro eucariótico inferior. Por expressão das manosidases de classe III in vivo, quer por si sós quer em conjunto com outras enzimas modificadoras dos N-glicanos, obtém-se nas glicoproteínas 130 hospedeiras uma retificação eficiente das estruturas com alto teor em manose, transformando-as em Man3GlcNAc2.

Conforme aqui descrito, a manosidase III de Sf9 (Genbank gi:2245567 (D. Jarvis, et al. Glycobiology 1997 7:113-127)) é clonada dentro de um plasmideo de integração de leveduras sob o controlo de um promotor constitutivo ou induzivel (ver o exemplo 26) . A quantidade de actividade de manosidase de classe III é optimizada e simultaneamente são restringidos os efeitos adversos na célula. Isto implica alterar a potência do promotor, podendo ser utilizado, eventualmente, um promotor induzivel ou de qualquer outra forma regulável para se controlar melhor a expressão destas proteínas.

Para além de expressarem a manosidase de classe III espontânea típica, as formas modificadas da manosidase de classe III podem ser expressas para aumentar a localização e a actividade celular. Isto é conseguido através da metodologia da invenção com a biblioteca de ADN combinatória, fundindo comprimentos variáveis do domínio catalíticas das manosidases de classe III com regiões de endereçamento endógenas de leveduras, conforme aqui descrito.

Hidrólise das ligações glicosídicas por meio de manosidases de classe III

Também se descreve aqui o mecanismo segundo o qual o domínio cataliticamente activo das enzimas de classe III hidrolisa as ligações glicosídicas Mana-1,3 e/ou Mana-1,6 e/ou Mana-1,2 num oligossacarídeo, v.g., nas estruturas Man5GlcNAc2 ou Man8GlcNAc2, para se obter Man3GlcNAc2, que é um 131 intermediário desejado para o processamento complementar de N-glicanos num eucariota inferior.

Conforme aqui descrito, a hidrólise das ligações glicosidicas ocorre sequencialmente. A enzima hidrolisa pelo menos uma ligação glicosidica e roda conformacionalmente para hidrolisar a outra ligação glicosidica.

Conforme também se descreve aqui, a hidrólise das ligações glicosidicas Mana-1,6 e Mana-1,3 ocorre também simultaneamente. Descreve-se ainda que a enzima hidrolisa especificamente as ligações glicosidicas Mana-1,2. 0 produto intermediário é um substrato para o processamento complementar do Golgi, em que outras enzimas de glicosilação, tais como N-acetil-glucosaminil-transferases (GnT), galactosil-transferases (GalT) e sialil-transferases (ST), podem modificá-lo subsequentemente para se obter uma glicoforma desejada. A figura 36C ilustra os intermediários oligossacarideos (v.g., Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2) produzidos por acção da via das manosidases III. Células hospedeiras da invenção

Uma célula hospedeira preferida da invenção é uma célula de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular. No entanto, há uma grande variedade de células hospedeiras que são descritas como sendo úteis nos métodos da invenção. Por exemplo, as células vegetais ou as células de insectos podem ser modificadas geneticamente para expressarem uma glicoproteina humanóide de acordo com a invenção. De igual modo, há uma variedade de células hospedeiras de mamíferos, não humanas, que podem ser alteradas para 132 expressarem glicoproteínas humanóides ou alteradas de qualquer outra forma, utilizando os métodos da invenção. A invenção descreve ainda que é possível utilizar todas as células hospedeiras eucarióticas (incluindo células humanas) em conjunto com uma biblioteca da invenção para a expressão de uma ou várias proteínas quiméricas encaminhadas para uma localização subcelular, v.g., um organelo, na célula hospedeira onde a actividade da proteína é modificada e preferencialmente reforçada. Uma tal proteína é preferencialmente - mas não tem de o ser necessariamente -uma enzima implicada na glicosilação de proteínas, tal como aqui exemplificado. Considera-se que todas as sequências que codificam proteínas possam ser encaminhadas e seleccionadas em função da actividade modificada numa célula hospedeira eucariótica, utilizando os métodos aqui descritos.

Os eucariotas inferiores com aptidão para produzirem glicoproteínas às quais estão fixados os N-glicanos Man5GlcNAc2 são particularmente úteis, uma vez que (a) por lhes faltar um elevado grau de manosilação (v.g., mais de 8 manoses por N-glicano, ou especialmente 30 a 40 manoses), manifestam uma imunogenicidade reduzida nos seres humanos e (b) os N-glicanos são um substrato para subsequentes reacções de glicosilação para se obter glicoformas ainda mais humanóides, v.g., pela acção de transferase I GlcNAc (figura 1B; β1,2 GnTI) para proporcionar GlcNAcMan5GlcNAc2. Obtém-se um rendimento superior a 30% em moles e mais preferencialmente um rendimento entre 50% e 100% em moles, em glicoproteínas com N-glicanos que possuem uma estrutura de Man5GlcNAc2. De acordo com uma variante preferencial, 133 comprova-se que mais de 50% da estrutura de Man5GlcNAc2 é um substrato para a actividade de GnTI e que pode servir como substrato in vivo.

Como leveduras ou fungos filamentosos unicelulares ou multicelulares preferidos da invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefadens, Pichia opuntíae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reseei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa.

Em cada um das variantes anteriores, o método tem por objecto produzir uma célula hospedeira em que os precursores oligossacarídicos são enriquecidos em Man5GlcNAc2. Estas estruturas são desejáveis uma vez que podem ser então objecto de processamento por tratamento in vitro, por exemplo, utilizando o método de Maras e Contreras, patente de invenção norte-americana n° 5 834 251. Contudo, de acordo com uma variante preferencial, os precursores enriquecidos em Man5GlcNAc2 são objecto de um processamento em que tem lugar pelo menos mais uma reacção de glicosilação in vivo - com glicosidases (v.g., α-manosidases) e glicosil-transferases (v.g., GnTI) - para se obter N-glicanos humanóides. Por exemplo, os precursores oligossacarídicos enriquecidos em Man5GlcNAc2 são preferencialmente objecto de processamento 134 para proporcionarem aqueles que possuem estruturas centrais de GlcNAcManxGlcNAc2, em que o símbolo X representa 3. 0 processamento complementar de GlcNAcMan3GlcNAc2 por tratamento com glicosil-transferases (v.g., GnTIl) produz estruturas centrais de GlcNAc2Man3GlcNAc2 que podem ser depois modificadas, conforme desejado, v.g., por tratamento ex vivo ou por expressão heteróloga na célula hospedeira das enzimas de glicosilação suplementares, incluindo as glicosil-transferases, transportadores de açúcares e manosidases (ver infra), para se transformarem em N-glicanos humanóides.

As glicoproteínas humanóides preferíveis podem ser produzidas de acordo com a invenção e compreendem as que contêm N-glicanos que possuem sete ou menos, ou três ou menos resíduos manose, e as quais possuem um ou vários açúcares seleccionados entre o conjunto constituído por galactose, GlcNAc, ácido siálico e fucose. É possível modificar geneticamente uma célula hospedeira adequada ou é possível utilizar um dos inúmeros mutantes de leveduras já descritos. Uma célula hospedeira preferível da presente invenção, conforme aqui exemplificado, é um mutante de hipermanosilação-menos (0CH1) em Pichia pastoris.

Formação de N-glicanos complexos A formação de N-glicanos complexos por síntese é um processo sequencial mediante o qual resíduos açúcares específicos são removidos e acoplados à estrutura oligossacarídica central. Nos eucariotas superiores, isto é conseguido expondo o substrato sequencialmente a diversas enzimas de processamento. Estas enzimas realizam reacções 135 específicas, consoante a sua localização particular ao longo de toda a cascata de processamento. Esta "linha de montagem" é constituída pelo RE, pelo Golgi proximal, mediano e distai e pela rede trans-Golgi, havendo para todos um ambiente de processamento específico. Para se recriar o processamento de glicoproteínas humanas no Golgi e no RE de eucariotas inferiores, é necessário que tenha lugar a expressão de inúmeras enzimas (v.g., glicosil-transferases, glicosidases, fosfatases e transportadores) e que sejam especificamente encaminhadas para estes organelos, e preferencialmente numa localização tal que funcionem mais eficientemente em relação ao seu ambiente e também em relação a outras enzimas na via.

Uma vez que um dos objectivos dos métodos aqui descritos é conseguir uma estirpe robusta para a produção de proteínas, capaz de suportar bem um processo de fermentação industrial, a integração de genes múltiplos no cromossoma da célula hospedeira requer um planeamento cuidadoso. Conforme descrito antes, efectua-se preferencialmente a delecção de um ou vários genes que codificam enzimas sobre as quais se sabe que são caracteristicas de reacções de glicosilação não humanas. A estirpe celular geneticamente modificada é transformada com um conjunto de genes diferentes que codificam as actividades desejadas, sendo estes genes transformados de uma maneira estável, para assim se garantir que a actividade desejável é mantida ao longo de todo o processo de fermentação. fucosil-transferases

Qualquer combinação das seguintes actividades enzimáticas pode ser geneticamente manipulada uma ou várias vezes na célula hospedeira, utilizando métodos da invenção: sialil-transferases, manosidases, 136 galactosil-transferases, GlcNAc-transferases, transportadores específicos do RE e do Golgi (v.g., transportadores sinporte e antiporte para UDP-galactose e outros precursores), outras enzimas implicadas no processamento de oligossacarídeos e enzimas implicadas na síntese de precursores de oligossacarídeos activados, tais como UDP-galactose e CMP-ácido N-acetilneuramínico. De preferência, as actividades enzimáticas são introduzidas em uma ou em várias moléculas de ácidos nucleicos (ver também infra) . As moléculas de ácidos nucleicos podem ser introduzidas uma ou várias vezes, v.g., no contexto de uma biblioteca de ácidos nucleicos, tal como uma biblioteca combinatória da invenção. No entanto, convém salientar que é possível introduzir actividades enzimáticas singulares ou múltiplas numa célula hospedeira, de uma maneira qualquer, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os métodos de transporte de proteínas e/ou mediante a utilização de uma ou várias moléculas de ácidos nucleicos sem se utilizar necessariamente uma biblioteca de ácidos nucleicos ou uma biblioteca combinatória da invenção.

Expressão de glicosil-transferases para produzir N-glicanos complexos

Com a informação sobre a sequência do ADN, um especialista na matéria consegue clonar moléculas de ADN que codifiquem actividades de GnT (v.g., exenqplo 3). Utilizando técnicas convencionais perfeitamente conhecidas pelos especialistas na matéria, é possível inserir moléculas de ácidos nucleicos que codificam GnTI, II, III, IV ou V (ou que 137 codificam os seus fragmentos cataliticamente activos) em vectores de expressão adequados, sob o controlo transcricional de promotores de outras sequências de controlo da expressão capazes de comandarem a transcrição de uma célula hospedeira seleccionada da invenção, v.g., células hospedeiras fúngicas, tais como as de Pichia sp.,

Kluyveromyces sp. e Aspergillus sp., conforme aqui descrito, de tal modo que uma ou várias destas enzimas de GnT de mamíferos possam ser activamente expressas numa célula hospedeira escolhida para a produção de uma glicoproteina complexa humanóide (v.g., exemplos 8, 15, 17 e 19).

Foram já clonadas e expressas diversas glicosil-transferases individuais em S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) e noutros fungos, sem demonstrarem, contudo, o desejado resultado de "humanização" no padrão de glicosilação dos organismos (Yoshida et al. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8; Kalsner et al. (1995)

Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Especulou-se, afirmando que a estrutura de hidratos de carbono necessária para aceitar açúcares pela acção de tais glicosil-transferases não se encontrava presente em quantidades suficientes, o que muito provavelmente contribuiu para a falta de formação de N-glicanos complexos.

Um método preferencial da invenção prevê a expressão funcional de uma actividade de glicosil-transferase, tal como as actividades de GnTI, GnTII e GnTIII (ou outras GnT, tal como GnTlV e GnTVl e combinações destas), no aparelho de Golgi proximal, mediano e distai , e também garante um 138 fornecimento suficiente de UDP-GlcNAc (v.g., por expressão de um transportador de UDP-GlcNAc; ver infra) . Métodos para fornecer precursores de açúcares de nucleótidos ao aparelho de Golgi

Para que uma glicosil-transferase funcione satisfatoriamente no aparelho de Golgi, a enzima tem de dispor de uma concentração suficiente de um açúcar adequado de nucleótidos, o qual é o dador de alta energia do radical açúcar acrescentado a uma glicoproteína nascente. Nos seres humanos, todos os precursores de açúcares de nucleótidos (v.g., UDP-N-acetil-glucosamina, UDP-N-acetil-galactosamina, CMP-ácido N-acetil-neuraminico, UDP-galactose, etc.) são geralmente sintetizados no citossol e transportados para o Golgi, onde são fixados pelas glicosil-transferases ao oligossacarideo central.

Para replicar este processo em células hospedeiras não humanas, tais como as de eucariotas inferiores, os transportadores de açúcares específicos dos nucleósidos têm de ser expressos no Golgi para garantir niveis adequados de precursores de açúcares de nucleósidos (Sommers e Hirschberg (1981) J. Cell. Biol. 91(2): A406-A406; Sommers e Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez e Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715). Os açúcares de nucleótidos podem ser fornecidos aos compartimentos adequados, v.g., exprimindo no microrganismo hospedeiro um gene exógeno que codifique um transportador de açúcares de nucleótidos. A escolha da enzima transportadora é 139 influenciada pela natureza da glicosil-transferase exógena que venha a ser utilizada. Por exemplo, uma GlcNAc-transferase pode necessitar de um transportador UDP-GlcNAc, uma fucosil-transferase pode necessitar de um transportador GDP-fucose, uma galactosil-transferase pode necessitar de um transportador UDP-galactose e uma sialil-transferase pode necessitar de um transportador CMP-ácido siálico. A proteina transportadora acrescentada transporta um açúcar de nucleótidos do citossol para dentro do aparelho de Golgi, onde o açúcar de nucleótidos pode reagir pela acção da glicosil-transferase, v.g., para aumentar um N-glicano. A reacção liberta um difosfato ou um monofosfato de nucleósidos, v.g., UDP, GDP ou CMP. Os monofosfatos nucleósidos podem ser exportados directamente do Golgi para irem substituir açúcares de trifosfatos de nucleósidos, por um mecanismo antiporte. No entanto, a acumulação de um difosfato de nucleósidos inibe a actividade subsequente de uma glicosil-transferase. Como esta reacção parece ser importante para uma glicosilação eficiente, é frequentemente desejável proporcionar uma cópia expressa de um gene que codifique uma nucleótido-difosfatase. As difosfatases (especificas para UDP ou GDP, conforme adequado) hidrolizam o difosfononucleósido para gerarem um monofosfato de nucleósidos e um fosfato inorgânico. São descritas adiante enzimas transportadoras adequadas, que têm tipicamente origem em mamíferos. Tais enzimas podem ser geneticamente modificadas numa célula hospedeira seleccionada, utilizando os métodos da invenção. 140

De acordo com um outro exemplo, as a-2,3- ou a-2,6-sialil-transferases protegem os resíduos galactose com ácido siálico no trans-Golgi e no TGN de seres humanos que conduzem a uma forma matura da glicoproteína (figura 1B) . a manipulação genética repetida deste passo de processamento numa levedura ou num fungo metabolicamente manipulado irá necessitar de (1) uma actividade de a-2,3- ou a-2,6- sialil-transferase e (2) um fornecimento suficiente de CMP-ácido N-acetil-neuramínico no Golgi distai da levedura. Para se obter uma actividade suficiente de a-2,3-sialil-transferase no Golgi distai, por exemplo, o domínio catalítico de uma sialil-transferase conhecida (v.g.r de seres humanos) tem de ser dirigida para o Golgi distai dos fungos (ver supra). De igual modo, os transportadores têm de ser geneticamente modificados para permitirem o transporte de CMP-ácido N-acetil-neuramínico para dentro do Golgi distai. Presentemente não há nenhuma informação de que os fungos sintetizem ou possam mesmo transportar quantidades suficientes de CMP-ácido N-acetil-neuramínico para o interior do Golgi. Em consequência, para se garantir o adequado fornecimento de substrato para as correspondentes glicosil-transferases, é necessário manipular geneticamente a produção de CMP-ácido siálico no interior dos fungos. UDP-N-acetil-glucosamina

Efectuou-se a clonagem (Ishida (1999) J. Biochem. 126(1): 68-77) do ADNc do transportador de UDP-N-acetil-glucosamina humana, que foi reconhecido mediante uma pesquisa de homologia na base de dados de identificadores de 141 sequências expressas (dbEST). 0 transportador membranar do

Golgi de mamíferos para a UDP-N-acetil-glucosamina foi clonado por correcção fenotípica com ADNc de células dos rins de caninos (MDCK) de um mutante de Kluyveromyces lactis recentemente caracterizado, deficiente em transporte de açúcar de nucleótidos supramencionados no Golgi (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(14): 7888-7892). Os resultados demonstram que o gene do transportador de UDP-GlcNAc no Golgi de mamíferos contém toda a informação necessária para que a proteína seja expressa e encaminhada funcionalmente para o aparelho de Golgi da levedura e que há duas proteínas com sequências de aminoácidos bastante diferentes que podem transportar o mesmo soluto no interior da mesma membrana do Golgi (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(14): 7888-7892).

Assim sendo, é possível incorporar a expressão de um transportador de UDP-GlcNAc numa célula hospedeira por meio de uma construção de ácido nucleico que pode conter, por exemplo: (1) uma região pela qual a construção transformada é mantida na célula (v.g., uma origem de replicação ou uma região que intervém indirectamente na integração cromossómica), (2) um gene marcador que permite a selecção de células que tenham sido transformadas, incluindo os marcadores contra-seleccionáveis e recicláveis, tais como ura3 ou T-u7fl3 (Soderholm et al. (2001) Biotechniques 31(2): 306-10) ou outros marcadores de selecção bem caracterizados (v.g., his4, bla, Sh ble, etc.), (3) um gene ou um seu fragmento que codifique um transportador funcional de UDP-GlcNAc (v.g., proveniente de K. lactis, (Abeijon, (1996) 142

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 5963-5968) ou proveniente de H. sapiens (Ishida et al. (1996) J. Biochem. (Tokyo) 120(6): 1074-8)) e (4) um promotor que active a expressão da biblioteca supramencionada de construções de fusão de domínios de localização/cataliticos. O exemplo 8 ilustra a adição do gene MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AP106080) que codifica o transportador UDP-GlcNAc numa estirpe pbp-3 de P. pastoris. As figuras 10A e 10B comparam os perfis dos N-glicanos obtidos por MALDI-TOF para uma estirpe de P. pastoris sem o transportador UDP-GlcNAc e para uma estirpe de P. pastoris com o transportador UDP-GlcNAc (PBP-3), respectivamente. A estirpe PBP-3 de P. pastoris apresenta um único pico saliente para o valor de m/z igual a 1457, consistente com a sua identificação como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b]. GDP-fucose O transportador de GDP-fucose da membrana do Golgi do fígado de rato foi identificado e purificado por Puglielli, L. e C.B. Hirschberg (Puglielli, 1999, J. Biol. Chem. 274(50): 35596-35600). O gene correspondente não foi identificado; todavia, é possível utilizar a sequenciação do terminal N para conceber sondas oligonucleotídicas específicas para o gene correspondente. Estes oligonucleótidos podem ser utilizados como sondas para clonar o gene que codifica o transportador de GDP-fucose. UDP-galactose 143

Os dois genes heterólogos, gmal2(+) que codifica a-1,2-galactosil-transferase (a-1,2-GalT), proveniente de Schizosaccharomyces pombe e o (hUGT2) que codifica o transportador humano de UDP-galactose (UDP-Gal), foram expressos funcionalmente em S. cerevisiae para se examinar as condições intracelulares para a galactosilação. A correlação entre a galactosilação das proteínas e a actividade do transportador de UDP-galactose indicou que um fornecimento exógeno de transportador de UDP-Gal, em vez de a-l,2-GalT, desempenhou um papel fundamental para uma galactosilação eficiente em S. cerevisiae (Kainuma (1999) Glycobiology 9(2): 133-141). De igual modo, foi clonado um transportador de UDP-galactose proveniente de S. pombe (Segawa (1999) FEBS Letters 451 (3) : 295-298) . CMP-ácido N-acetil-neuramínico (CMP-ácido siálico) 0 transportador de CMP-ácido siálico humano (hCST) foi clonado e expresso em células de CHO de Lee 8 (Aoki et al. (1999) J. Biochem. (Tokyo) 126(5): 940-50; Eckhardt et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248(1): 187-92). A expressão funcional do transportador de CMP-ácido siálico de murinos foi conseguida em Saccharomyces cerevisiae (Berninsone et al. (1997)) J. Biol. Chem. 272(19): 12616-9). Encontrou-se ácido siálico em alguns fungos; no entanto, não é evidente se o sistema hospedeiro escolhido irá ser capaz de fornecer quantidades suficientes de CMP-ácido siálico. O ácido siálico pode ser fornecido ao meio ou, em alternativa, também é possível integrar no genoma do hospedeiro vias fúngicas implicadas na síntese do ácido siálico. 144

Expressão de difosfatases

Quando os açúcares são transferidos para uma glicoproteína, é libertado um difosfato ou um monofosfato de nucleósidos a partir dos precursores de açúcares de nucleótidos. Embora os monofosfatos possam ser exportados directamente para irem substituir açúcares de trifosfato de nucleósidos por meio de um mecanismo antiporte, os difosfonucleósidos, (v. g. , GDP) têm de ser clivados pelas fosfatases (v.g., GDPase ) para produzirem monofosfatos de nucleósidos e fosfatos inorgânicos antes de serem exportados. Esta reacção parece ser importante para uma glicosilação eficiente, uma vez que se concluiu que a GDPase de S. cerevisiae é necessária para a manosilação. No entanto, a enzima tem apenas 10% da actividade relativamente ao UDP (Berninsone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (1): 207-211). Os eucariotas inferiores não têm, frequentemente, actividade de difosfatase especifica de UDP no Golgi, uma vez que não utilizam os precursores de UDP-açúcares para a síntese de glicoproteínas no Golgi. Concluiu-se que a levedura Schizosaccharomyces pombe, que é uma levedura que acrescenta resíduos galactose aos polissacarídeos das paredes celulares (a partir de UDP-galactose), possui uma actividade específica de UDPase, sugerindo isso ainda mais a necessidade de tal enzima (Berninsone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211) . Sabe-se que o UDP é um poderoso inibidor de glicosil-transferases e que a remoção deste produto secundário da glicosilação é importante para evitar a inibição das glicosil-transferases no lúmen do Golgi. 145

Vectores recombinantes É possível utilizar diversos vectores de expressão para expressar sequências de nucleótidos da presente invenção (ver, v.g., o exemplo 13). As sequências podem ser funcionalmente ligadas a uma sequência de controlo da expressão num vector adequado para transformação de uma célula hospedeira. De acordo com uma variante, a sequência da presente invenção é funcionalmente ligada a um vector designado por pJN348, o qual compreende um promotor GAPDH, uma cassete dos locais de restrição Noti Asei Pacl, o terminador transcricional CycII e a cassete de selecção ura3 para expressão numa estirpe YSH-1 de P. pastoris (Ampr) .

De acordo com uma variante preferencial, o vector compreende um fragmento cataliticamente activo de uma enzima manosidase II, tal como explicitado no texto anterior. Há outros vectores de expressão adequados para utilização em leveduras e em fungos filamentosos, os quais são perfeitamente conhecidos na especialidade. Métodos para alterar N-glicanos num hospedeiro por expressão de uma actividade enzimática relevante a partir de uma molécula de ácido nucleico A presente invenção proporciona um método para a produção de uma glicoproteína humanóide, numa célula hospedeira não humana que compreende o passo que consiste em introduzir na célula uma ou várias moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma enzima ou várias enzimas para a produção da estrutura de hidratos de carbono Man5GlcNAc2. De 146 acordo com uma variante preferencial, introduz-se no hospedeiro uma molécula de ácido nucleico que codifique uma ou várias actividades de manosidase envolvidas na produção de MansGlcNAc2 a partir de Man8GlcNAc2 ou Man9GlcNAC2. A invenção também diz respeito a métodos para produzir qlicoproteinas alteradas numa célula hospedeira, os quais compreendem um passo que consiste em introduzir na célula hospedeira uma molécula de ácido nucleico que codifique uma ou várias actividades ou enzimas de glicosilação. As actividades enzimáticas preferíveis são seleccionadas entre o conjunto constituído por UDP-GlcNAc-transferase, UDP-galactosil-transferase, GDP-fucosil-transferase, CMP-sialil-transferase, transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactose, transportador de GDP-fucose, transportador de CMP-ácido siálico e difosfatases de nucleótidos. De acordo com uma variante particularmente preferencial, o hospedeiro é seleccionado ou manipulado geneticamente para expressar duas ou mais actividades enzimáticas em que o produto de uma actividade aumenta os níveis de uma outra actividade no substrato, v.g., uma glicosil-transferase e um correspondente transportador de açúcares, v.g., as actividades de GnTI e dos transportadores de UDP-GlcNAc. De acordo com uma outra variante preferencial, o hospedeiro é seleccionado ou manipulado geneticamente para expressar uma actividade para remover produtos que possam inibir as subsequentes reacções de glicosilação, v.g., uma actividade de difosfatase específica de UDP ou de GDP.

Os métodos preferenciais da invenção implicam a expressão de uma ou várias actividades enzimáticas a partir 147 de uma molécula de ácido nucleico numa célula hospedeira e compreendem o passo que consiste em encaminhar pelo menos uma actividade enzimática para uma localização subcelular desejada {v.g., um organelo), mediante a formação de uma proteína de fusão que possua um domínio catalítico da enzima e um péptido de sinal de endereçamento celular, v.g., um péptido de sinal heterólogo que não esteja normalmente ligado ou associado ao domínio catalítico. A proteína de fusão é codificada pelo menos por uma construção genética ("construção de fusão") que compreende um fragmento de ácido nucleico que codifica um péptido de sinal de endereçamento celular ligado, na mesma grelha de leitura traducional ("in frame"), a uma fragmento de ácido nucleico que codifica uma enzima {v.g., uma enzima de glicosilação), ou um seu fragmento cataliticamente activo. 0 componente constituído pelo péptido de sinal de endereçamento da construção de fusão ou da proteína é obtido preferencialmente a partir de um membro do conjunto constituído por: proteínas do RE ou do Golgi ligadas às membranas, sinais de recuperação, proteínas membranares de tipo II, proteínas membranares de tipo I, transportadores de açúcares nucleotídicos transmembranares, manosidases, sialil-transferases, glucosidases, manosil-transferases e fosfomanosil-transferases. 0 componente de domínio catalítico da proteína ou da construção de fusão é obtido preferencialmente a partir de uma actividade de glicosidase, manosidase ou glicosil-transferase proveniente de um membro do conjunto constituído por GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, GalT, fucosil- 148 transferase e sialil-transferase. 0 domínio catalítico possui preferencialmente um valor de pH óptimo a menos de 1,4 unidades de pH relativamente ao valor médio de pH óptimo das outras enzimas representativas no organelo onde a enzima está localizada, ou possui uma actividade óptima para valores de pH entre 5,1 e 8,0. De acordo com uma variante preferencial, o domínio catalítico codifica uma manosidase seleccionado entre o conjunto constituído por manosidase IA de C. elegans, manosidase IB de C. elegans, manosidase IA de D. melanogaster, manosidase IB de H. sapiens, manosidase I de P. citrinum, manosidase ia de murganho, manosidase IB de murganho, manosidase IA de A. nidulans, manosidase IB de A. nidulans, manosidase IC de A. nidulans, manosidase II de murganho, manosidase II de C. elegans e manosidase II de H. sapiens.

Escolha de uma enzima de glicosilação: pH óptimo e localização subcelular

De acordo com uma variante da invenção, produz-se eficientemente uma glicoproteina humanóide, numa célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, introduzindo num compartimento subcelular da célula uma enzima de glicosilação escolhida de modo a ter um valor de pH óptimo semelhante ao valor de pH óptimo das outras enzimas no compartimento subcelular visado. Por exemplo, a maior parte das enzimas que são activas no RE e no aparelho de Golgi de S. cerevisiae possuem valores de pH óptimos que estão compreendidos entre cerca de 6,5 e 7,5 (ver o quadro 3) . Uma vez que a glicosilação de proteínas é um 149 processo altamente elaborado e eficiente, o valor de pH interno no RE e no Golgi também está provavelmente compreendida no intervalo entre cerca de 6 e 8. No entanto, todas as metodologias anteriores para se reduzir a manosilação pela acção de manosidases recombinantes em hospedeiros fúngicos introduziram enzimas com um valor de pH óptimo à volta de 5,0 (Martinet et al. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177 e Chiba et al. (1998) J Biol. Chem. 273(41): 26293-26304). Para um valor de pH de 7,0, a actividade dessas manosidases, determinada in vitro, é reduzido para menos de 10%, o que é provavelmente uma actividade insuficiente no ponto de utilização, designadamente no RE e no Golgi proximal, para que haja uma produção eficiente in vivo de Man5GlcNAc2 nos N-glicanos.

Assim sendo, de acordo com uma variante preferencial da presente invenção, é enviada uma enzima de glicosilação escolhida (ou um seu domínio catalítico), v.g., uma a-manosidase, para uma localização subcelular na célula hospedeira (v.g., um organelo) onde o valor de pH óptimo da enzima ou do domínio está a menos de 1,4 unidades de pH do valor médio de pH óptimo das outras enzimas marcadoras representativas localizadas nos mesmos organelos. O valor de pH óptimo da enzima destinada a um organelo específico deve ser ajustado ao valor de pH óptimo das outras enzimas existentes no mesmo organelo para se maximizar a actividade por cada unidade enzimática obtida. O quadro 3 resume a actividade de manosidases provenientes de diversas fontes e os seus correspondentes valores óptimos de pH. O quadro 4 resume as usas localizações subcelulares típicas. 150

Quadro 3

Manosidases e seus valores óptimos de pH

Fonte Enzima pH óptimo Referência Aspergillus saitoi Oí-1, 2-manosidase O LO Ichishima et al. (1999) Biochem. J. 339 (Pt3): 589-597 Trichoderma reesei Oí-1, 2-manosidase O LO Maras et al. (2000) J. Biotechnol. 77(2-3) : 255-263 Penicillium citrinum Oi-D-1,2-manosidase 5, 0 Yoshida et al. (1993) Biochem. J. 290 (Pt2): 349-354 C. elegans oí-1, 2-manosidase LO LO Ver a figura 11 Aspergillus nidulans oí-1, 2-manosidase 6, 0 Eades e Hintz (2000) Gene 255(1): 25-34 Homo sapiens IA oí-1, 2-manosidase 6, 0 (Golgi) Homo sapiens IB oí-1, 2-manosidase 6, 0 (Golgi) Células de oí-1,2-Man6-manosidase 6, 0 Ren et al. (1995) insecto Lepidopteran de tipo I Biochem. 34(8): 2489-2495 Homo sapiens Oí-D -mano sida se 6, 0 Chandrasekaran et al. (1984) Câncer Res. 44(9) : 4059-68 Xanthomonas manihoitis Oí-1,2,3-mano sida se 6, 0 Patente de invenção norte-americana n° 6 300 113 151 (continuação)

Manosidases e seus valores óptimos de pH Fonte Enzima pH óptimo Referência Drosophila melanogaster a-1,2-manosidase 6,2 Aqui descrito Murganho IB (Golgi) Oí-1, 2-manosidase 6,5 Schneikert e Herscovics (1994) Glycobiology. 4(4) : 445-50 Bacillus sp. (segregado) a-1,2-D-manosidase 7,0 Maruyama et al. (1994) Carbohydrate Res. 251: 89-98

De acordo com uma variante preferencial, encaminha-se uma enzima ou um domínio catalítico particular para uma localização subcelular na célula hospedeira por meio de uma construção de fusão quimérica que codifique uma proteína que compreenda um péptido de sinal de endereçamento celular que não esteja normalmente associado ao domínio enzimático. De preferência, encaminha-se uma enzima ou um domínio para o RE, para o aparelho de Golgi proximal, mediano ou distai, ou para o aparelho trans-Golgi da célula hospedeira.

De acordo com uma variante mais preferencial, a enzima de glicosilação relevante é uma manosidase, uma glicosil-transferase ou uma glicosidase. De acordo com uma variante especialmente preferencial, a actividade de manosidase é encaminhada para o RE ou para o cis-Golgi, onde ocorrem as primeiras reacções. Embora este método seja útil para a produção de uma glicoproteína humanóide numa célula hospedeira não humana, faz-se observar que o método descrito 152 também é útil, mais genericamente, para modificar perfis de hidratos de carbono de uma glicoproteina numa célula hospedeira eucariótica, incluindo as células hospedeiras humanas.

As sequências de endereçamento que intervêm indirectamente na retenção de proteínas em determinados organelos da via secretora das células hospedeiras são perfeitamente conhecidas e estão descritas na literatura cientifica e em bases de dados públicas, conforme adiante descrito mais minuciosamente a propósito de bibliotecas para selecção de sequências de endereçamento e de enzimas encaminhadas. Tais sequências de endereçamento subcelulares podem ser utilizadas por si só ou combinadamente para encaminharem uma enzima de glicosilação escolhida (ou um seu domínio catalítico) para uma localização subcelular particular numa célula hospedeira, isto é, especialmente para uma onde a enzima irá ter uma actividade reforçada ou óptima, com base em valores óptimos de pH ou na presença de outros factores estimuladores.

Quando se tenta rectificar estruturas ricas em manose para se obter Man5GlcNAc2 no RE ou no aparelho de Golgi de uma célula hospedeira, por exemplo, de S. cerevisiae, é possível escolher, por exemplo, qualquer enzima ou combinação de enzimas que (1) tenha um valor de pH suficientemente próximo do valor óptimo (isto é, entre pH 5,2 e pH 7,8) e (2) seja conhecida pelo facto de gerar, por si só ou concertadamente, a estrutura de Man5GlcNAC2 isomérica especifica necessária para aceitar a adição subsequente de GlcNAc por GnTI. Qualquer enzima ou combinação de enzimas que seja conhecida 153 pelo facto de gerar uma estrutura que possa ser convertida em GlcNAcMan5GlcNAc2 por GnTI in vitro constituiria uma opção adequada. Este conhecimento pode ser obtido na literatura cientifica ou experimentalmente.

Por exemplo, é possível determinar se uma manosidase potencial consegue converter Man8GlcNAc2-2AB (2-aminobenzamida) em Man5GlcNAc2-AB e verificar então se a estrutura de Man5GlcNAc2-2AB obtida pode servir como substrato para GnTI e UDP-GlcNAc para se obter GlcNAcMan5GlcNAc2 in vitro. A manosidase IA proveniente de uma fonte humana ou de murinos, por exemplo, seria uma opção adequada (ver, v.g., o exemplo 4). Nos exemplos aqui descritos utiliza-se oligomanose ligada a N e marcada com 2-aminobenzamida, seguindo-se uma análise por HPLC para se fazer esta determinação.

Quadro 4. Localização celular e valores óptimos de pH de diversas enzimas de S. cerevisiae associadas à glicosilação

Gene Actividade Localização pH óptimo Referências KTR1 Oí-1, 2-manosil-transferase Golgi 7,0 Romero et al. (1997) Biochem. J. 321 (Pt 2) : 289-295 MNSl Oí-1,2-manosidase RE 6,5 CWH41 — glucosidase I RE 6, 8 Lehele e Tanner manosil- transferase Golgi 1 00 (1974) Biochim. Biophys. Acta 350(1): 225-235 KRE2 Oí-1, 2-manosil-transferase Golgi 6,5-9,0 Romero et al. (1997) Biochem. J. 321 (Pt 2): 289-295 154

Assim sendo, uma enzima de glicosilação, tal como uma enzima a-1,2-manosidase, utilizada de acordo com a invenção, possui uma actividade óptima a valores de pH compreendidos entre 5,1 e 8,0. De acordo com uma variante preferencial, a enzima tem uma actividade óptima a valores de pH compreendidos entre 5,5 e 7,5. Por exemplo, a enzima manosidase de C. elegans serve perfeitamente nos métodos da invenção e tem um valor de pH óptimo aparente de cerca de 5,5. As manosidases preferidas compreendem as que estão enumeradas no quadro 3 que possuem valores de pH óptimos

convenientes, v.g., as de Aspergillus nidulans, Homo sapiens IA (Golgi), Homo sapiens IB (Golgi), células de insecto de Lepidopteran (IPLB-SF21AE), Homo sapiens, murganho IB (Golgi), Xanthomonas manihotis, Drosophilia melanogaster e C. elegans.

No exemplo 7 está descrita uma experiência que ilustra o valor de pH óptimo para uma enzima a-1,2-manosidase. Submeteu-se uma proteína de fusão quimérica BB27-2 (Saccharomyces MNN10 (s)/manosidase IB Δ31 de C. elegans), que se dispersa no meio, a diversos valores de pH para se determinar a actividade óptima dessa enzima. Os resultados da experiência mostram que a enzima a-1,2-manosidase tem um valor óptimo de pH igual a cerca de 5,5 para a sua actividade (figura 11) .

De acordo com uma variante preferencial, é expresso no organismo hospedeiro um só gene de manosidase clonado. No entanto, em alguns casos, pode ser desejável expressar diversos genes de manosidases diferentes, ou diversas cópias de um gene particular, para se conseguir uma produção 155 adequada de Man5GlcNAc2. Nos casos em que são utilizados vários genes, as manosidases codificadas possuem todas elas, preferencialmente, valore de pH óptimos no intervalo preferencial compreendido entre cerca de 5,1 e cerca de 8,0 ou especialmente entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5. As actividades de manosidase preferíveis compreendem as a-1,2-manosidases obtidas a partir de murganhos, seres humanos, lepidopteros, Aspergillus nidulans ou Bacillus sp.r C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum, X. laevis ou A. nidulans.

Alteração da glicosilação de uma célula hospedeira in vivo, utilizando uma biblioteca de ADN combinatória A presente invenção descreve também uma ou várias bibliotecas de ácidos nucleicos. Com particularidade exemplificativa de uma biblioteca de ácidos nucleicos combinatórios da invenção refere-se o facto de a biblioteca compreender sequências que codificam péptidos de sinal de endereçamento celular e sequências que codificam proteínas que irão ser endereçadas (v.g., enzimas ou os seus domínios catalíticos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, para aquelas intervêm indirectamente na glicosilação).

Descreve-se uma biblioteca combinatória de ácidos nucleicos que compreende: (a) pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam diferentes péptidos de sinal de endereçamento celular e (b) pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido que irá ser 156 encaminhado. Descreve-se uma biblioteca combinatória de ácidos nucleicos que compreende: (a) pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um péptido de sinal de endereçamento celular e (b) pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido que irá ser encaminhado numa célula hospedeira. Conforme melhor descrito adiante, liga-se uma sequência de ácidos nucleicos obtida a partir de (a) e uma sequência de ácidos nucleicos obtida a partir de (b) para se produzir uma ou várias construções de fusão que codificam um péptido de sinal de endereçamento celular funcionalmente ligado a um domínio polipeptídico relevante. Um exemplo de uma ligação funcional ocorre quando o péptido de sinal de endereçamento celular é ligado ao domínio polipeptídico relevante na mesma grelha de leitura traducional {"in frame").

Descreve-se uma biblioteca combinatória de ADN que expressa uma ou várias proteínas de fusão que compreendem péptidos de sinal de endereçamento celular ligados in frame a domínios enzimáticos catalíticos. A proteína de fusão codificada pode compreender um domínio catalítico de uma enzima implicada na modificação de N-glicanos de mamíferos ou humanóides. Descreve-se que o domínio catalítico provém de uma enzima seleccionada entre o conjunto constituído por manosidases, glicosil-transferases e outras glicosidases que são ligadas in frame a um ou a vários péptidos de sinal de endereçamento. 0 domínio enzimático pode ser exógeno e/ou endógeno em relação à célula hospedeira. Um péptido de sinal particularmente preferível é um que está normalmente 157 associado a uma proteína sujeita a transporte do RE para o

Golgi. A biblioteca combinatória de ADN da presente invenção pode ser utilizada para produzir e localizar in vivo enzimas implicadas na modificação de N-glicanos de mamíferos ou humanóides. As construções de fusão da biblioteca combinatória de ADN são manipuladas geneticamente para que as enzimas codificadas fiquem localizadas no RE, no Golgi ou na rede trans-Golgi da célula hospedeira, onde ficam implicadas na produção de N-glicanos particulares numa glicoproteína relevante. A localização das enzimas da presente invenção modificadores de N-glicanos é conseguida por meio de um mecanismo de fixação ou por meio de uma interacção de tipo proteína-proteína, em que a localização do péptido construído a partir da biblioteca combinatória de ADN se concentra num organelo desejado da via secretória, tal como o RE, o Golgi ou a rede trans-Golgi.

Um exemplo de um N-glicano útil, que é produzido eficientemente e em quantidades suficientes para modificação subsequente pelas reacções de glicosilação humanóides (complexas) é o Man5GlcNAc2. É necessária uma quantidade suficiente de Man5GlcNAc2 numa glicoproteína relevante para um processamento humanóide suplementar in vivo (v.g., mais de 30% em moles). O Man5GlcNAc2 intermediário pode ser utilizado como substrato para posterior modificação pelos N-glicanos para se obter GlcNAcMan5GlcNAc2 (figura 1B; ver supra). Assim sendo, a biblioteca combinatória de ADN da presente invenção pode ser utilizada para produzir enzimas que produzam depois 158

GlcNAcMan5GlcNAc2 ou outros N-glicanos complexos desejados, numa quantidade útil.

Um outro aspecto das construções de fusão produzidas utilizando a biblioteca combinatória de ADN é o facto de permitirem uma actividade rectificadora suficiente e frequentemente quase completa do N-glicano intracelular na célula hospedeira geneticamente manipulada. As construções de fusão produzidas pela biblioteca combinatória de ADN codificam uma enzima de glicosilação, v.g., uma manosidase, que está efectivamente localizada num compartimento intracelular de uma célula hospedeira e que por isso manifesta pouca e preferencialmente nenhuma actividade extracelular. As construções de fusão descritas no presente pedido de patente de invenção que codificam uma enzima manosidase são conhecidas pelo facto de se localizarem onde os N-glicanos são modificados, designadamente no RE e no Golgi. As enzimas de fusão descritas são encaminhadas para tais organelos particulares na via secretória onde se localizam e actuam sobre os N-glicanos, tais como Man8GlcNAc2, para produzirem Man5GlcNAc2 numa glicoproteina relevante.

As enzimas produzidas pela biblioteca combinatória de ADN, aqui descritas, conseguem modificar os N-glicanos numa proteína relevante, conforme comprovado para as proteínas K3 ou IFN-β expressas em P. pastoris, tal como ilustrado nas figuras 5 e 6, respectivamente (ver também os exemplos 2 e 4) . No entanto, faz-se observar que há outros tipos de glicoproteínas que também podem ser glicosiladas desta maneira, incluindo, sem limitações, as seleccionadas entre eritropoietina, citoquinas, tais como o interferão α, o 159 interferão β, o interferão γ, ο interferão ω e ο granulócito-CSF, factores de coagulação, tais como o factor VIII, o factor IX e a proteína C humana, a cadeia α do receptor de igE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, igM, interleucinas, urocinase, quimase e o inibidor de tripsina da ureia, proteína de ligação a IGF, factor de crescimento epidermal, factor de libertação da hormona do crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor 2 do crescimento endotelial vascular, factor 1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegerina, antitripsina α-l, DNase II, a-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, também conhecida por proteína 1 de ligação do TNF), TACI-Ig (activador transmembranar e modulador do cálcio e interactor do ligando da ciclofilina), FSH (hormona estimuladora dos folículos), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 de tipo glucagona), agonista do receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, também conhecido como fusão do Fc com o receptor TNF solúvel), ATUI, rhTrombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (antigénio 4 - Ig associado ao linfócito T citotóxico).

Construção de uma biblioteca de construções de fusão de ADN combinatória A biblioteca de construções de fusão de ADN combinatória caracteriza um ou vários péptidos de sinal de endereçamento celular ("péptidos de endereçamento") obtidos geralmente a partir de domínios do terminal N de proteínas nativas (v.g., fazendo delecções no terminal C). No entanto, alguns péptidos de endereçamento são obtidos a partir do terminal C de proteínas nativas (v.g., SEC12). As proteínas ligadas a 160 membranas do RE ou do Golgi são utilizadas preferencialmente como fontes para as sequências dos péptidos de endereçamento. Estas proteínas têm sequências que codificam uma cauda citossólica (ct), um domínio transmembranar (tmd) e uma região formativa (sr) que tem comprimentos variados. Estas regiões são reconhecíveis pelos alinhamentos das sequências de proteínas e pelas comparações feitas com sequências homólogas e/ou outras proteínas localizadas {v.g., comparando gráficos de hidrofobicidade).

Os péptidos de endereçamento são aqui classificados em curtos (s), médios (m) e compridos (1) relativamente às partes de uma membrana de tipo II. A sequência de um péptido de endereçamento classificada como sendo curta (s) corresponde ao domínio transmembranar (tmd) da proteína ligada à membrana. A sequência do péptido de endereçamento classificada como sendo comprida (1) corresponde ao comprimento de um domínio transmembranar (tmd) e à região formativa (sr). A sequência do péptido de endereçamento classificada como sendo média (m) corresponde ao domínio transmembranar (tmd) e aproximadamente mais metade do comprimento da região formativa (sr). As regiões dos domínios catalíticos são aqui indicadas pelo número de delecções de nucleótidos comparativamente com a sua enzima de glicosilação de tipo selvagem.

Bibliotecas secundárias

Em alguns casos, é possível construir directamente uma biblioteca de ácidos nucleicos combinatória, aqui descrita, a partir de genes de tipo selvagem. A biblioteca de ADN é 161 construída a partir da fusão de duas ou mais bibliotecas secundárias. Na ligação in frame de bibliotecas secundárias, é possível criar um grande número de novas construções genéticas que codificam domínios úteis de proteínas encaminhadas, tais como os que possuem actividades de glicosilação.

Bibliotecas secundárias de domínios catalíticos que codificam actividades de glicosilação

Uma biblioteca secundária útil compreende sequências de ADN que codificam enzimas tais como glicosidases (v.g., manosidases), glicosil-transferases (v.g., fucosil-transferases, galactosil-transferases, glucosil-transferases), GlcNAc-transferases e sialil-transferases. Os domínios catalíticos podem ser seleccionados a partir do hospedeiro que irá ser geneticamente modificado e também a partir de outros organismos congéneres ou não congéneres. Todas as enzimas de mamíferos, plantas, insectos, répteis, algas ou fungos são úteis e devem ser escolhidas de modo a representarem o espectro amplo de propriedades bioquímicas, tendo em conta valores de temperatura e valores óptimos de pH. Os genes podem ser truncados para proporcionarem fragmentos dos quais alguns codificam os domínios catalíticos das enzimas. Removendo as sequências de endereçamento endógenas, as enzimas podem ser então reencaminhadas e expressas noutros locais celulares. A escolha de tais domínios catalíticos pode ser determinada pelo conhecimento do ambiente particular em que o domínio catalítico vai ser activo subsequentemente. Por 162 exemplo, se uma enzima de glicosilação particular se destinar a ser activa no Golgi distai e se todas as enzimas conhecidas do organismo hospedeiro no Golgi distai tiverem um determinado valor óptimo de pH, ou no caso de se saber que o Golgi distai possui um valor particular de pH, então escolhe-se um domínio catalítico que manifeste uma actividade adequada, de preferência máxima, para esse valor de pH, conforme descrito antes.

Bibliotecas secundárias de sequências de péptidos de endereçamento

Uma outra biblioteca secundária útil compreende as sequências de ácidos nucleicos que codificam os péptidos de sinal de endereçamento de que resulta a localização de uma proteína nu local particular no RE, no Golgi ou na rede trans-Golgi. De um modo geral, tais sequências são classificadas em três categorias: (1) sequências do terminal N que codificam uma cauda citossólica (ct), um domínio transmembranar (tmd) e uma parte ou a totalidade de uma região formativa (sr), que conjunta ou individualmente fixam proteínas à membrana interior (lumenal) do Golgi; (2) sinais de recuperação que são encontrados geralmente no terminal C, tais como os tetrapéptidos HDEL (SEQ ID NO: 105) ou KDEL (SEQ ID NO: 106) e (3) regiões transmembranares de diversas proteínas, v.g., transportadores de açúcares de nucleótidos sobre os quais se sabe que estão localizados no Golgi.

No primeiro caso, quando o péptido de endereçamento é constituído por diversos elementos (ct, tmd e sr) , a biblioteca é delineada de tal modo que a ct, o tmd e diversas 163 partes da região formativa estejam representadas. Assim sendo, de acordo com uma variante preferencial, a biblioteca secundária de sequências de péptidos de endereçamento compreende as sequências de ct, tmd e/ou sr provenientes de proteínas ligadas às membranas do RE ou do Golgi. Em alguns casos, pode ser desejável dotar a biblioteca secundária com sequências de sr com comprimentos variáveis. Isto pode ser efectuado por PCR utilizando iniciadores que se ligam à extremidade 5' do ADN que codifica a região citossólica e utilizando um conjunto de iniciadores em oposição que se ligam a diversas parte da região formativa.

Outras fontes de sequências de péptidos de endereçamento que também são úteis compreendem os péptidos de sinal de recuperação, v.g., os tetrapéptidos HDEL (SEQ ID NO: 105) ou KDEL (SEQ ID NO: 106), que se encontram tipicamente no terminal C de proteínas que são transportadas num movimento de retrocesso para o RE ou para o Golgi. Há ainda outras fontes de sequências de péptidos de endereçamento que compreendem (a) as proteínas membranares de tipo II, (b) as enzimas enumeradas no quadro 3, (c) os transportadores de açúcares de nucleótidos transmembranares que estão localizados no Golgi e (d) as sequências enumeradas no quadro 5. 164

Quadro 5. Fontes de sequências úteis de endereçamento compartimentai

Gene ou sequência Organismo Função Localização do produto génico MNSI A. nidulans Oí-1,2-manosidase RE MNSI A. niger a-1,2-manosidase RE MNSI S. cerevisiae ai,2-mannosidase RE GLSI S. cerevisiae glucosidase RE GLSI A. niger glucosidase RE GLSI A. nidulans glucosidase RE HDEL (SEQ ID NO: 105) no terminal C Universal em fungos sinal de recuperação RE SEC12 S. cerevisiae proteína da vesícula COPII RE/Golgi SEC12 A. niger proteína da vesícula COPII RE/Golgi OCHI S. cerevisiae í, 6-manosil-transferase Golgi (cis) OCHI P. pastoris 1,6-manosil-transferase Golgi (cis) MNN9 S. cerevisiae complexo de 1, 6-manosil-transferase Golgi MNN9 A. niger não determinada Golgi VAN1 S. cerevisiae não determinada Golgi VAN1 A. niger não determinada Golgi ANP1 S. cerevisiae não determinada Golgi HOCI S. cerevisiae não determinada Golgi MNN10 S. cerevisiae não determinada Golgi MNN10 A. niger não determinada Golgi MNN11 S. cerevisiae não determinada Golgi (cis) MNNll A. niger não determinada Golgi (cis) 165 (continuação)

Gene ou sequência Organismo Função Localização do produto génico MNTl S. cerevisiae 1,2-manosil-transferase Golgi (cis, medial) KTR1 P. pastoris não determinada Golgi (medial) KRE2 P. pastoris não determinada Golgi (medial) KTR3 P. pastoris não determinada Golgi (medial) MNN2 s. cerevisiae 1,2-manosil-transferase Golgi (medial) KTRl s. cerevisiae não determinada Golgi (medial) KTR2 s. cerevisiae não determinada Golgi (medial) MAW1 s. cerevisiae 1,3-manosil-transferase Golgi (trans) MNN6 s. cerevisiae fosfomanosil-transferase Golgi (trans) 2, 6 ST H. sapiens 2,6-sialil-transferase rede trans de -Golgi UDP-Gal T S. pombe transportador UDP-Gal Golgi

Em qualquer caso, é preferível que sejam seleccionadas sequências de péptidos de endereçamento adequadas para que a actividade ou as actividades enzimáticas particulares funcionem de maneira óptima no encadeamento das reacções de glicosilação desejadas. Por exemplo, ao desenvolver-se um microrganismo hospedeiro modificado, capaz de sialilação terminal dos N-glicanos nascentes, um processo que ocorre no Golgi distai dos seres humanos, é desejável utilizar uma biblioteca secundária de sequências de péptidos de endereçamento obtidas a partir das proteínas do Golgi distai. 0 mesmo é válido para o encurtamento de Man8GlcNAc2 por uma a-1,2-manosidase para se obter Man5GlcNAc2 num passo inicial da formação de N-glicanos complexos nos seres humanos (figura 166 1Β). Deste modo, é desejável que esta reacção ocorra no RE ou no Golgi proximal de um microrganismo hospedeiro modificado geneticamente. Utiliza-se uma biblioteca secundária que codifica sinais de retenção do RE e do Golgi proximal.

Depois constrói-se um conjunto de construções de proteínas de fusão (isto é, uma biblioteca de ADN combinatória) ligando funcionalmente uma ou várias sequências de péptidos de endereçamento a uma ou várias sequências que codifiquem dominios cataliticos. Tal é efectuado pela ligação in frame de uma biblioteca secundário que compreende ADN que codifica as sequências de péptidos de endereçamento (supra) com uma biblioteca secundário que compreende ADN que codifica enzimas de glicosilação ou os seus fragmentos cataliticamente activos (ver infra) . A biblioteca resultante compreende genes sintéticos que codificam proteínas de fusão que contêm sequências de péptidos de endereçamento. Em alguns casos, é desejável colocar uma sequência de um péptido de endereçamento no terminal N de uma proteina de fusão e noutros casos no terminal C. em alguns casos, as sequências dos péptidos de endereçamento podem ser inseridas numa grelha de leitura aberta de uma enzima, desde que a estrutura proteica dos domínios individuais desdobrados não seja destruída. Constrói-se cada tipo de proteína de fusão (de uma maneira orientada progressivamente ou semi-aleatória), sendo possível seleccionar as construções óptimas após a transformação de células hospedeiras e a caracterização dos padrões de glicosilação em células transformadas, utilizando os métodos da invenção. 167

Geração de uma diversidade de sequências suplementares 0 método descrito é mais eficaz quando um ácido nucleico, v.g., uma biblioteca de ADN transformada dentro do hospedeiro contém uma grande diversidade de sequências, aumentando assim a probabilidade de haver pelo menos um transformante que apresente o fenótipo desejado. Por exemplo, as mutações de aminoácidos singulares podem alterar drasticamente a actividade das enzimas de processamento das glicoproteinas (Romero et al. (2000) J Biol. Chem. 275 (15): 11071-4). Assim sendo, antes da transformação, é possível submeter uma biblioteca de adn ou uma biblioteca secundária constituinte, a uma ou várias técnicas para gerar uma diversidade de sequências suplementares. Por exemplo, é possível efectuar uma ou várias experiências de mistura genes, PCR com propensão para o erro, mutagénese in vitro ou outros métodos para gerar diversidade de sequências, para se obter uma maior diversidade de sequências no conjunto de construções de fusão.

Sequências de controlo de expressão

Para além das sequências das grelhas de leitura aberta acima descritas, cada construção de biblioteca pode conter sequências de controlo de expressão, tais como promotores, terminadores da transcrição, intensificadores, locais de ligação de ribossomas e outras sequências funcionais, conforme o que for necessário para garantir a transcrição e a tradução eficazes de proteínas de fusão após a transformação de construção de fusão no organismo hospedeiro. 168

Os componentes de vectores convenientes, v.g., marcadores seleccionáveis, sequências de controlo da expressão (v.g., promotores, intensificadores, terminadores e não só) e, facultativamente, sequências necessárias para a replicação autónoma numa célula hospedeira, são seleccionados como determinantes da escolha da célula hospedeira particular. Os critérios de selecção para os componentes de vectores adequados para utilização numa célula hospedeira de um mamífero ou de um eucariota inferior são matéria rotineira. As células hospedeiras eucarióticas inferiores preferíveis da presente invenção são seleccionadas entre células de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporíum lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa. Se o hospedeiro for Pichia pastoris, os promotores adequados compreendem, por exemplo, os promotores A0X1, A0X2, GAPDH e P40.

Marcadores seleccionáveis

Também é preferível dotar cada construção pelo menos com um marcador seleccionável, tal como um gene que confira resistência aos fármacos ou que complemente uma lesão metabólica no hospedeiro. A presença do marcador é útil na 169 selecção subsequente de transformantes; por exemplo, em leveduras é possível utilizar os genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLA ou SH BLE. São conhecidos inúmeros marcadores seleccionáveis, os quais estão disponíveis para utilização em células hospedeiras de leveduras, fungos, plantas, insectos, mamíferos e em outras células hospedeiras eucarióticas.

Transformação A biblioteca de ácidos nucleicos é depois transformada no organismo hospedeiro. Em leveduras, é possível utilizar todos os métodos convenientes de transferência de adn, tais como a electroporação, o método do cloreto de lítio ou o método dos esferoplastos. Em células vegetais e de fungos filamentosos, os métodos convencionais compreendem o bombardeamento com partículas, a electroporação e a transformação mediada por agrobacterium. Para a produção de uma estirpe estável, adequada para uma cultura de alta densidade (v.g., transformação em leveduras), é desejável integrar as construções de bibliotecas de adn no cromossoma do hospedeiro. De acordo com uma variante preferencial, a integração é feita por recombinação homóloga, utilizando técnicas perfeitamente conhecidas na especialidade. Por exemplo, os elementos da biblioteca de ADN são dotados com sequências de flanqueamento homólogas de sequências do organismo hospedeiro. Deste modo, a integração ocorre no local definido no genoma do hospedeiro, sem destruição dos genes desejáveis ou essenciais.

Descreve-se que a biblioteca de ADN é integrada no local de um gene indesejado num cromossoma do hospedeiro, 170 efectuando a destruição ou delecção do gene. Por exemplo, a integração nos locais dos genes OCHl, MNNl ou MNN4 permite a expressão do ADN da biblioteca desejada, ao mesmo tempo que evita a expressão de enzimas implicadas na hipermanosilação de glicoproteinas em leveduras. Descreve-se ainda que o ADN da biblioteca pode ser introduzido no hospedeiro através de uma molécula de ácido nucleico, de um plasmídeo, de um vector (v.g., um vector virai ou retroviral), ou de um cromossoma, e pode ser introduzido sob a forma de uma molécula de ácido nucleico autónoma ou por integração homóloga ou aleatória no genoma do hospedeiro. Em todos os casos, é geralmente desejável associar a cada construção de ADN da biblioteca pelo menos um gene marcador seleccionável que permita a selecção fácil dos organismos hospedeiros que tenham sido estavelmente transformados. São especialmente adequados os genes marcadores recicláveis, tais como ura3, que permitem uma selecção positiva ou negativa.

Processos de separação e selecção

Após a transformação da estirpe hospedeira com a biblioteca de ADN, são seleccionados os transformantes que apresentem um fenótipo de glicosilação desejado. A selecção pode ser efectuada num só passo ou num conjunto de passos de enriquecimento fenotipico e/ou depleção, utilizando diversos ensaios ou métodos de detecção. A caracterização fenotipica pode ser efectuada manualmente ou utilizando equipamento de separação automático de elevada produtividade global. Normalmente, um microrganismo hospedeiro apresenta N-glicanos 171 de proteínas sobre a superfície celular, onde estão localizadas diversas glicoproteínas.

É possível separar as células, por exemplo, que tenham a mais elevada concentração de GlcNAc terminal sobre a superfície celular ou as células que segreguem uma proteína com o conteúdo mais elevado de GlcNAc terminal. Esta separação pode ser feita com base num método visual, por exemplo, um procedimento de coloração, pela aptidão para se ligarem a anticorpos de ligação específicos de GlcNAc terminal ou por lectinas conjugadas com um marcador (tais lectinas podem ser obtidas em E. Y. Laboratories inc., San Mateo, CA), pela reduzida aptidão de lectinas específicas para se ligarem aos resíduos manose terminais, pela aptidão para incorporarem um açúcar marcado radioactivamente in vitro, pela ligação alterada a corantes ou superfícies com cargas eléctricas, ou pode ser efectuada utilizando um seleccionador celular activado pela fluorescência (FACS) em conjunto com uma lectina ou um anticorpo marcado com um fluoróforo (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (14) : 7888-7892) .

Assim sendo, é possível pesquisar e separar células intactas em função de um fenótipo de glicosilação desejado, expondo as células a uma lectina ou a um anticorpo que se ligue especificamente ao N-glicano desejado. Nos circuitos comerciais há uma grande variedade de lectinas específicas de oligossacarídeos (v.g., as provenientes de ΈΥ Laboratories', San Mateo, CA) . Em alternativa, há nos circuitos comerciais anticorpos específicos de N-glicanos de seres humanos ou de animais, os quais também podem ser produzidos utilizando 172 técnicas convencionais. É possivel conjugar uma lectina ou um anticorpo adequado com uma molécula repórter, tal como um cromóforo, um fluoróforo, um radioisótopo ou uma enzima que possua um substrato cromogénico (Guillen et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(14): 7888-7892). A pesquisa pode ser então efectuada recorrendo a métodos analíticos tais como a espectrofotometria, a fluorimetria, a selecção celular activada pela fluorescência ou a contagem de cintilações. Noutros casos, pode ser necessário analisar glicoproteínas isoladas ou N-glicanos isolados provenientes de células transformadas. 0 isolamento de proteínas pode ser efectuado por meio de técnicas conhecidas na especialidade. De acordo com uma variante preferencial, é segregada no meio uma proteína repórter que é purificada por cromatografia por afinidade (v.g., cromatografia por afinidade com Ni ou cromatografia por afinidade com glutationa-S-transferase). Nos casos em que seja preferível um N-glicano isolado, é possível utilizar uma enzima, tal como a endo^-10-acetil-glucosaminidase (Genzyme Co., Boston, MA; New England Biolabs, Beverly, MA) para clivar os N-glicanos existentes na glicoproteínas. As proteínas isoladas ou os N-glicanos isolados podem ser então analisados por cromatografia em líquido (v.g., HPLC), por espectroscopia de massa ou por outros meios adequados. A patente de invenção norte-americana n° 5 595 900 descreve diversos métodos que permitem identificar células com as desejadas estruturas de hidratos de carbono extracelulares. De acordo com uma variante preferencial, recorre-se à espectrometria de massa por MALDI-TOF para analisar os N-glicanos clivados. 173

Antes da selecção de um transformante pretendido, pode ser desejável fazer a depleção da população transformada de células que contêm fenótipos indesejados. Por exemplo, se o método for utilizado para modificar geneticamente uma actividade de manosidase funcional nas células, os transformantes desejados irão ter níveis inferiores de manose na glicoproteína celular. A exposição da população transformada a um radioisótopo letal de manose no meio vai realizar a depleção da população de transformantes que possuem o fenótipo indesejado, isto é, níveis elevados de manose incorporada (Huffaker TC e Robbins PW., Proc Natl Acad Sei USA., Dezembro de 1983; 80(24): 7466-70). Em alternativa, é possível utilizar uma lectina citotóxica ou um anticorpo citotóxico, dirigidos contra um N-glicano indesejável, para fazer a depleção de uma população transformada que contenha fenótipos indesejados (v.g., Stanley P e Siminovitch L., Somatic Cell Genet, Julho de 1977, 3(4): 391-405). A patente de invenção norte-americana n° 5 595 900 descreve diversos métodos que permitem identificar células com as desejadas estruturas de hidratos de carbono extracelulares. A execução repetida desta estratégia permite a manipulação sequencial de glicanos cada vez mais complexos em eucariotas inferiores.

Para a detecção de células hospedeiras que possuem sobre a sua superfície um grau elevado do N-glicano humanóide intermediário GlcNAcMan3GlcNAc2, é possível, por exemplo, seleccionar transformantes que permitem uma transferência mais eficiente de GlcNAc pela GlcNAc-transferase a partir de UDP-GlcNAc num ensaio celular in vitro. Esta pesquisa pode ser efectuada em culturas de células que contenham a 174 biblioteca transformada, sob uma pressão selectiva numa placa de gelose e transformando as colónias individuais numa placa de microtitulação de 96 cavidades. Após o desenvolvimento das células, estas são centrifugadas e depois recolocadas em suspensão em solução tampão e, após a adição de UDP-GlcNAc e GnTII, determina-se a libertação de UDP quer por HPLC quer por meio de um ensaio associado a enzimas próprio para UDP. Em alternativa, é possível utilizar UDP-GlcNAc e GnTII marcados radioactivamente, lavar as células e depois procurar GlcNAc radioactivo libertado por N-acetil-glucosaminidase. Tudo isto pode ser efectuado manual ou automaticamente, utilizando equipamento de análise e pesquisa de elevada produtividade total. Prevê-se que os transformantes que libertem mais UDP, no primeiro ensaio, ou mais GlcNAc marcada radioactivamente, no segundo ensaio, tenham um grau mais elevado de GlcNAcMan3GlcNAc2 sobre a sua superfície e consequentemente constituem o fenótipo desejado. Também é possível adaptar ensaios semelhantes para pesquisar N-glicanos em proteínas segregadas.

Em alternativa, é possível utilizar quaisquer outros métodos de pesquisa adequados, por exemplo, um ensaio de ligação com lectinas capaz de revelar padrões de glicosilação alterados sobre a superfície de células transformadas. Neste caso, a reduzida ligação de lectinas específicas para as manoses terminais pode ser uma ferramenta de selecção conveniente. A lectina de Galantus nivalis liga-se especificamente a a-1,3-manose terminal, antevendo-se que seja reduzida se estiver presente no Golgi uma actividade suficiente de manosidase II. Também é possível fazer o 175 enriquecimento em transformantes desejados, executando um passo de separação cromatográfica que permita a remoção de células que contenham um teor elevado em manose terminal. 0 passo de separação poderia ser efectuado com uma coluna de lectina que se ligue especificamente a células com um elevado teor em manose terminal (v.g., a lectina de Galantus nivalis liga-se a agarose, Sigma, St. Louis, MO), comparativamente com aquelas que possuem um fraco teor em manose terminal.

Além disso, é possivel criar directamente tais construções de proteínas de fusão à medida que vá estando disponível na literatura científica informação suplementar sobre a localização de enzimas modificadoras de hidratos de carbono activos em diferentes hospedeiros eucarióticos inferiores. Por exemplo, sabe-se que a p-l,4-GalTr humana pode ser fundida com o domínio membranar de mnt, que é uma manosil-transferase proveniente de S. cerevisiae, e que está localizada no aparelho de Golgi, conservando a sua actividade catalítica (Schwientek et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Se o organismo que se pretende manipular for S. cerevisiae ou um organismo congénere, é possível incorporar directamente tais conclusões na estratégia global para se obter N-glicanos complexos a partir de tal hospedeiro. Foram identificados diversos desses fragmentos génicos em P. pastoris, que estão relacionados com as glicosil-transferases em S. cerevisiae, podendo consequentemente ser utilizados para tal fim. 176

Alteração da qlicosilação das células hospedeiras utilizando construções de fusão provenientes de bibliotecas combinatórias A construção de uma biblioteca preferencial de ADN combinatória está ilustrada esquematicamente na figura 2 e descrita no exemplo 4. A construção de fusão pode ser funcionalmente ligada a inúmeros vectores, tais como vectores de expressão perfeitamente conhecidos na especialidade. Há uma grande variedade de tais construções de fusão que foram construídas utilizando actividades representativas, conforme indicado no quadro 6. É possível construir combinações de péptidos de endereçamento/domínios catalíticos utilizáveis no endereçamento de actividades de manosidase, glicosil-transferase e glicosidase no RE, no Golgi e na rede trans-Golgi, de acordo com a invenção. De forma surpreendente, o mesmo domínio catalítico pode não ter efeito nenhum ou ter um efeito bastante profundo nos padrões de N-glicosilação, dependendo isso do tipo de péptido de endereçamento utilizado (ver, v.g., quadro 7, exemplo 4).

Construções de fusão de manosidase I

Um exemplo representativo de uma construção de fusão de manosidase, obtida a partir de uma biblioteca combinatória de ADN da invenção, é o pFB8, que é um péptido de endereçamento truncado SEC12 (m) de Saccharomyces (nucleótidos 988-1296 de SEC12 de SwissProt P11655) ligado in frame a uma delecção de 187 aminoácidos do terminal N de uma α-manosidase IA de murganho (n° 6678787 de admissão no Genbank). Deste modo, a nomenclatura aqui utilizada refere-se ao péptido de 177 endereçamento/região de domínio catalítico de uma enzima de glicosilação, tal como Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase IA Δ187 de murganho. A proteína de fusão codificada localiza-se no RE por meio da sequência do péptido de endereçamento SEC12, ao mesmo tempo que conserva a sua actividade de domínio catalítico de manosidase e é capaz de produzir in vivo N-glicanos que possuem uma estrutura de Man5GlcNAc2 (exemplo 4; figuras 6F e 7B). A construção de fusão pGC5, Saccharomyces MNS1 (m) /manosidase IB Δ99 de murganho, é um outro exemplo de uma construção de fusão que possui actividade de rectificação de manosidase intracelular (exemplo 4; figuras 5D e 8B). A construção de fusão pBC18-5 (Saccharomyces VAN1(s)/manosidase IB Δ80 de C. elegans) constitui um outro exemplo de uma construção de fusão eficiente capaz de produzir in vivo N-glicanos que possuem uma estrutura de Man5GlcNAc2. Criando uma biblioteca combinatória de ADN destas e de outras construções de fusão de manosidase, de acordo com a invenção, um especialista na matéria consegue distinguir e seleccionar as construções que possuem uma actividade óptima de rectificação intracelular daquelas que possuem uma actividade relativamente fraca ou nenhuma actividade. Os métodos em que se utiliza bibliotecas combinatórias de ADN da presente invenção são vantajosos uma vez que apenas um pequeno conjunto seleccionado de construções de fusão de manosidase conseguem produzir in vivo um N-glicano particularmente desejado.

Além disso, a actividade rectificadora da manosidase pode ser específica para uma proteína particular relevante. 178

Assim, faz-se observar que nem todas as construções de fusão de péptidos de endereçamento/domínios catalíticos da manosidase podem funcionar igualmente bem para produzirem a glicosilação correcta numa glicoproteína relevante. Assim sendo, é possível introduzir uma proteína relevante numa célula hospedeira transfectada com uma biblioteca combinatória de ADN para identificar uma ou várias construções de fusão que expressem uma actividade de manosidase óptima para a proteína relevante. Um especialista na matéria irá ser capaz de produzir e seleccionar construções de fusão óptimas, utilizando a metodologia das bibliotecas de AND combinatório aqui descrita.

Além do mais, é evidente que é possível fazer outras dessas construções de fusão, que apresentam domínios catalíticos de manosidase activos (ou mais geralmente, domínios de qualquer enzima) utilizando técnicas como as exemplificadas no exemplo 4 e aqui descritas. É uma simples questão de experimentação rotineira para um especialista na matéria fazer e utilizar a biblioteca combinatória de ADN, da presente invenção, para optimizar, por exemplo, a produção de Man5GlcNAc2 a partir de uma biblioteca de construções de fusão num vector de expressão particular introduzido numa célula hospedeira particular.

Construções de fusão de glicosil-transferase

De igual modo, preparou-se uma biblioteca combinatória de ADN de glicosil-transferase, utilizando os métodos da invenção. Construiu-se uma biblioteca de sequências de ADN combinatório, obtidas a partir das actividades de glicosil- 179 transferase I (GnTI) com péptidos de endereçamento e analisou-se para se investigar a produção eficiente, numa célula hospedeira eucariótica inferior, de uma estrutura de N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 numa glicoproteina marcadora. Foi identificada uma construção de fusão para a qual se comprovou que produz GlcNAcMan5GlcNAc2 (pPBl04), Saccharomyces MNN9 (s)/GnTl Δ38 humana (exemplo 8). Construiu-se uma grande variedade de tais construções de fusão de GnTI (exemplo 8, quadro 10). É possivel construir facilmente outras combinações de péptidos de endereçamento/dominios catalíticos de GnTI, preparando uma biblioteca combinatória de ADN. Também é evidente para os especialistas na matéria que é possível produzir outros destas construções de fusão que apresentem actividade de glicosil-transferase, conforme demonstrado no exemplo 8. Para um especialista na matéria é uma questão de simples experimentação rotineira utilizar o método da biblioteca combinatória de ADN aqui descrito para optimizar a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2, utilizando uma construção de fusão seleccionada num vector de expressão e numa linhagem de células hospedeiras particulares.

Conforme explicitado anteriormente para as construções de fusão de manosidase, nem todas as construções de fusão de péptidos de endereçamento/dominios catalíticos de GnTI irão funcionar igualmente bem para produzirem a glicosilação correcta numa glicoproteina relevante, tal como aqui descrito. No entanto, um especialista na matéria irá ser capaz de produzir e seleccionar construções de fusão óptimas, utilizando a metodologia das bibliotecas de ADN, tal como aqui descrito. O exemplo 8 ilustra uma variante preferencial 180 de uma biblioteca combinatória de ADN que compreende construções de fusão de péptidos de endereçamento e de dominios catalíticos de GnTI, implicados na produção de glicoproteínas com uma estrutura predominantemente de

GlcNAcMan5GlcNAC2.

Utilização de múltiplas construções de fusão para alterar a glicosilação das células hospedeiras

De acordo com um outro exemplo de utilização dos métodos e bibliotecas da invenção para alterar a glicosilação de uma célula hospedeira, transformou-se uma estirpe de P. pastoris com uma delecção OCHl que expressa uma proteína repórter (K3), com múltiplas construções de fusão isoladas a partir de bibliotecas combinatórias da invenção, para converter N-glicanos ricos em manose em N-glicanos humanóides (exemplo 8) . Em primeiro lugar, transformou-se a construção de fusão de manosidase pFB8 (Saccharomyces SEC12(m)/manosidase ΙΑ Δ187 de murganho) numa estirpe de P. pastoris à qual lhe faltava a actividade iniciadora de 1,6-manosil-transferase (isto é, delecção ochl; exemplo 1) . Em segundo lugar, construiu-se o pPB103, que compreende um gene MNN2-2 de K. lactis (n° AF10 6 0 8 0 de admissão no Genbank) que codifica um transportador de UDP-GlcNAc, para aumentar ainda mais a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2. A adição do transportador de UDP-GlcNAc aumenta a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 significativamente na estirpe de P. pastoris, conforme ilustrado na figura 10B. Em terceiro lugar, introduziu-se na estirpe o pPBl04 que compreende a construção de fusão 181

Saccharomyces MNN9(s)/GnTI Δ38 humano. Esta estirpe de P. pastoris é designada por "PBP-3". É do conhecimento de um especialista na matéria que as células hospedeiras, tais como as das estirpes de leveduras supramencionadas, podem ser transformadas sequencialmente e/ou co-transformadas com um ou vários vectores de expressão. Também é sabido que a ordem de transformação não é particularmente importante na produção da glicoproteína relevante. Um especialista na matéria sabe que há modificações vulgares introduzidas na prática dos processos aqui descritos que podem proporcionar resultados melhores na produção da glicoproteína relevante. A importância de se utilizar uma sequência de um péptido de endereçamento particular com uma sequência de um domínio catalítico particular torna-se facilmente evidente a partir das experiências aqui descritas, a biblioteca combinatória de ADN constitui uma ferramenta para construir fusões de enzimas implicadas na modificação de N-glicanos numa glicoproteína relevante, o que é especialmente útil para a produção de glicoproteínas humanóides. (No entanto, é possível seleccionar qualquer fusão de enzimas, utilizando bibliotecas e métodos da invenção). Os transformantes desejados, que expressam a-1,2-manosidase activa correctamente encaminhada, produzem K3 com N-glicanos de estrutura Man5GlcNAc2, conforme ilustrado nas figuras 5D e 5E. isto confere ao glicano clivado uma massa molecular reduzida, comparativamente com o K3 da estirpe parental com delecção de 0CH1, tal como detectado por espectrometria de massa de MALDI-TOF na figura 5C. 182

De igual modo, utilizou-se a mesma metodologia para produzir uma outra glicoproteina segregada: IFN-β que compreende predominantemente Man5GlcNAc2. Removeu-se a Man5GlcNAc2 por digestão com PNGase (Papac et ai., 1998, Glycobiology 8: 445-454) e submeteu-se a uma análise de MALDI-TOF, conforme ilustrado nas figuras 6A a 6F. Um único pico proeminente para o valor de m/z igual a 1254 confirme a produção de Man5GlcNA2 em IFN-β nas figuras 6E (pGC5) (Saccharomyces MNS1 (m) /manosidase IB Δ99 de murganho) e 6F (pFFB) (Saccharomyces SEC12(m)/manosidase ΙΑ Δ187 de murganho). Além disso, na estirpe PBP-3 de P. pastoris que compreende pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase ΙΑ Δ187 de murganho), pPBl04 (Saccharomyces MNN9(s)/GnTI Δ38 de seres humanos) e pPBl03 (gene MNN2-2 de K. lactis), detectou-se o N-glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2 [b], por análise de MALDI-TOF (figura 10).

Após a identificação de transformantes com um grau elevado de rectificação de manose, forma efectuadas outras experiências para se confirmar se a actividade de manosidase (rectificação) tinha ocorrido in vivo e se não era predominantemente o resultado de actividade extracelular no meio de crescimento (exemplo 6; figuras 7 a 9).

Construções de fusão de α-manosidase II do Golgi

Conforme descrito no presente pedido de patente de invenção, preparou-se uma biblioteca de ADN combinatória de α-manosidase II do Golgi fundindo o domínio catalítico de diversas enzimas manosidases II com um conjunto de péptidos de sinal de endereçamento celular (exemplo 14). Foram obtidas 183 mais de 500 construções de fusão combinatórias que foram introduzidas numa estirpe de P. pastoris capaz de produzir o precursor humano de glicosilação complexa, GlcNAcMan5GlcNAc2 YSH-1 (exemplo 17) no K3 repórter. Apenas um pequeno subconjunto de estirpes (menos de 5%) foi capaz de converter quantitativamente GlcNAcMan5GlcNAc2 em GlcNAcMan3GlcNAc2. Estas estirpes foram isoladas e depois transformadas com uma biblioteca combinatória de várias centenas de fusões GnTII/péptido líder. A pesquisa para se procurar a presença de GlcNAC2Man3GlcNAC2 permitiu isolar estirpes que eram capazes de segregar glicanos complexos homogéneos, conforme exemplificado pela estirpe YSH-44 (exemplo 19).

Um exemplo representativo de uma construção de fusão de α-manosidase II do Golgi, obtida a partir de uma biblioteca de ADN combinatória da presente invenção é o pKD53, que é um péptido de endereçamento de MNN2{s) truncado de S. cerevisiae (1-108 nucleótidos de MNN2 proveniente de 'SwissProt P38069') ligado concatenadamente a uma delecção de 74 aminoácidos do terminal N de uma α-manosidase II do Golgi de D. melanogaster (Genbank ΑΝ X77652). Assim, a nomenclatura aqui utilizada refere-se à região do domínio catalítico/péptido de endereçamento de uma enzima de glicosilação, tal como MNN2(s) de S. cerevisiae/manosidase II Δ74 de D. melanogaster. A proteína de fusão codificada localiza-se no Golgi por meio da sequência do péptido de endereçamento de MNN2(s), ao mesmo tempo que conserva a sua actividade de domínio catalítico de manosidase e é capaz de produzir N-glicanos in vivo que possuem uma estrutura predominante GlcNAcMan3GlcNAc2 (exemplo 18) . 184

Um outro exemplo de uma construção de fusão de a-manosidase II do Golgi, obtida a partir de uma biblioteca de ADN combinatória da presente invenção é o pKDl, que é um péptido de endereçamento de GLSl(s) truncado de Saccharomyces (1-102 nucleótidos de GLS1 proveniente de 'SwissProt P53008') ligado concatenadamente a uma delecção de 74 aminoácidos do terminal N de uma α-manosidase II do Golgi de D. melanogaster (Genbank ΑΝ X77652). Assim, a nomenclatura aqui utilizada refere-se à região do dominio catalitico/péptido de endereçamento de uma enzima de glicosilação, tal como GLS1(s) de Saccharomyces/manosidase II Δ74 de D. melanogaster. A proteina de fusão codificada localiza-se no Golgi por meio da sequência do péptido de endereçamento de GLS1{s), ao mesmo tempo que conserva a sua actividade de dominio catalítico de manosidase e é capaz de produzir N-glicanos in vivo que possuem uma estrutura predominante GlcNAcMan3GlcNAc2 (exemplo 22) .

Um outro exemplo de uma construção de fusão de a-manosidase li do Golgi, obtida a partir de uma biblioteca de ADN combinatória da presente invenção é o pKD5, que é um péptido de endereçamento de MNS1(m) truncado de Saccharomyces (1-246 nucleótidos de MNS1 proveniente de 'SwissProt P32906') ligado concatenadamente a uma delecção de 74 aminoácidos do terminal N de uma α-manosidase II do Golgi de D. melanogaster (Genbank ΑΝ X77652). Assim, a nomenclatura aqui utilizada refere-se à região do dominio catalitico/péptido de endereçamento de uma enzima de glicosilação, tal como MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidase II Δ74 de D. melanogaster. A proteina de fusão codificada localiza-se no Golgi por meio da 185 sequência do péptido de endereçamento de GLSl(s), ao mesmo tempo que conserva a sua actividade de domínio catalítico de manosidase e é capaz de produzir N-glicanos in vivo que possuem uma estrutura predominante GlcNAcMan3GlcNAc2 (exeirçplo 23) . Ao contrário dos N-glicanos uniforme presentes em YSH-27, a figura 21 ilustra uma mistura heterogénea de N-glicanos produzidos em YSH-74. No entanto, a actividade retificadora aparentemente medíocre desta enzima manosidase II indica a existência de heterogenecidade sob a forma de adições de Mana-1,2, conforme sugerido na figura 23, em que o pico de GlcNAcMan3GlcNAc2 aparece após a digestão de YSH-74 com a-1,2-manosidase de A. saitoi. Ao criar uma banco de ADN combinatório destas e de outras construções de fusão de manosidases, de acordo com a invenção, um especialista na matéria consegue distinguir e seleccionar as construções que tenham uma actividade retificadora intracelular óptima, separando-as daquelas que têm uma actividade relativamente fraca ou mesmo nenhuma. Os métodos em que são utilizados bancos de adn combinatório da presente invenção são vantajosos na medida em que há apenas um pequeno conjunto de construções de fusão de manosidases que consegue produzir in vivo um N-glicano particularmente desejado.

Além disso, a actividade retificadora das manosidases pode ser específica para uma proteína particular relevante. Assim, faz-se observar que nem todas as construções de fusão de péptidos de endereçamento/domínios catalíticos de manosidases servem igualmente bem para a produção da glicosilação correcta numa glicoproteína relevante. A figura 18 mostra que não há nenhuma actividade aparente numa estirpe 186 YSH-1 de P. pastoris transformada com uma construção de fusão de α-manosidase II do Golgi, obtida a partir de uma biblioteca de ADN combinatória do pKDl6 da invenção, que é um péptido de endereçamento de MNN9(m) truncado de Saccharomyces (1-273 nucleótidos de MNN9 proveniente de 'SwissProt P39107') ligado concatenadamente a uma delecção de 74 aminoácidos do terminal N de uma α-manosidase II do Golgi de D. melanogaster (Genbank ΑΝ X77652). Posto isto, é possível introduzir uma proteína relevante numa célula hospedeira transformada com uma biblioteca de ADN combinatório para se identificar uma ou várias construções de fusão que expressem uma actividade de manosidase óptima para a proteína relevante. Um especialista na matéria irá ser capaz de produzir e seleccionar construções de fusão óptimas, utilizando a metodologia do banco de ADN combinatório aqui descrita. Células hospedeiras

Embora a presente invenção seja identificada utilizando um organismo hospedeiro P. pastoris, faz-se observar aos especialistas na matéria que há outras espécies de hospedeiros fúngicos e leveduras que podem ser alterados conforma aqui descritos para se obter glicoproteínas de tipo humano. As técnicas aqui descritas para a identificação e desmembramento de genes de glicosilação indesejada de células hospedeiras, v.g., 0CH1, são também aplicáveis a estes e/ou outros genes homólogos ou funcionalmente congéneres noutras estirpes de leveduras e de fungos. Conforme descrito no exemplo 9, suprimiu-se em K. lactis os genes ochl mnnl para se fazer a manipulação genética de uma célula hospedeira que 187 proporcionasse N-glicanos que fossem totalmente convertidos em Man5GlcNAc2 pela 1, 2-manosidase (figura 12C) . 0 gene MNNl foi clonado a partir de K. lactis, conforme descrito no exemplo 9. A sequência de ácido nucleico e a sequência deduzida de aminoácidos do gene MNNl de K. lactis estão representadas e identificadas respectivamente por SEQ ID NOS: 16 e 17. Utilizando iniciadores específicos dos genes, preparou-se uma construção para suprimir o gene MNNl retirando-o do genoma de K. lactis (exemplo 9) . As células hospedeiras libertas das actividades de ochl e de mnnl produziram N-glicanos que possuem uma estrutura de hidratos de carbono de Man9GlcNAc2 (ver, v.g., a figura 10). Tais células hospedeiras podem ser manipuladas geneticamente ainda mais, utilizando, v.g., métodos e bancos da invenção, para se obter glicoproteínas de tipo humano ou do tipo de mamíferos.

Descreve-se uma molécula isolada de ácido nucleico que possui uma sequência de ácido nucleico que compreende ou abrange pelo menos quarenta e cinco, de preferência pelo menos 50, mais preferencialmente pelo menos 60 e muito mais preferencialmente 75 ou mais resíduos nucleotídicos do gene MNNl de K. lactis (SEQ ID NO: 16), e seus homólogos, suas variantes e seus derivados. O pedido de patente de invenção também descreve moléculas de ácidos nucleicos que hibridam em condições restringentes com as moléculas de ácidos nucleicos supramencionadas. De igual modo, são também descritos polipéptidos isolados (incluindo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados e análogos) codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos da invenção. Além disso, conforme descrito mais adiante, também são proporcionados 188 vectores, incluindo vectores de expressão, que contenham uma molécula de ácido nucleico da invenção. Igualmente, são proporcionadas células hospedeiras transformadas com moléculas de ácidos nucleicos ou vectores da invenção.

Deste modo, de acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma estirpe hospedeira eucariótica, não humana, que expressa glicoproteinas que compreendem N-glicanos modificados que se assemelham aos produzidos pelas células humanas. Faz-se observar que é possível utilizar uma biblioteca de ácido nucleico combinatória, conforme aqui descrito anteriormente, para seleccionar construções que modifiquem a via de glicosilação em todos os sistemas de células hospedeiras eucarióticas. Por exemplo, os bancos combinatórios anteriormente descritos também podem ser utilizadas em células hospedeiras de plantas, algas e insectos e noutras células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de mamíferos e de seres humanos, para localizar proteínas, incluindo enzimas de glicosilação ou seus domínios catalíticos, num local desejado ao longo de uma via secretória da célula hospedeira. De preferência, as enzimas de glicosilação ou os domínios catalíticos, e semelhantes, são encaminhados para um local subcelular ao longo da via secretória da célula hospedeira onde são capazes de funcionar mais eficientemente e, de preferência, papara onde foram concebidos ou seleccionados para funcionarem mais eficientemente.

As células hospedeiras preferíveis da presente invenção são seleccionadas entre Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia 189 membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevísíae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactís, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa.

Também está descrito que é possível ainda manipular geneticamente células de plantas e de insectos para alterar a glicosilação das proteínas expressas, utilizando o banco combinatório e os métodos da presente invenção. Descreve-se também que a glicosilação em células de mamíferos, incluindo as células humanas, pode ser ainda modificada utilizando a bibleoteca combinatório e os métodos da presente invenção. Por exemplo, descreve-se a forma de optimizar uma actividade enzimática particular ou a forma de modificar as proporções relativas dos diversos N-glicanos produzidos numa célula hospedeira de um mamífero, utilizando a bbiblioteca combinatória e os métodos da presente invenção.

Como exemplos de modificações de glicosilação que é possível influenciar utilizando um método de acordo com esta variante da invenção refere-se: (1) manipulação genética de uma célula hospedeira eucariótica para rectificar resíduos de manose a partir de Man8GlcNAc2 para se obter um N-glicano Man5GlcNAc2; (2) manipulação genética de uma célula hospedeira eucariótica para acrescentar um resíduo N-acetil-glucosamina (GlcNAc) a Man5GlcNAc2 por acção de uma transferase I de GlcNAc; (3) manipulação genética de uma célula hospedeira 190 eucariótica para expressar funcionalmente uma enzima, tal como uma N-acetil-glucosaminil-transferase (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTlV, GnTV, GnTVl), uma manosidase II, uma fucosil-transferase (FT), uma galactosil-tranferase (GalT) ou uma sialil-transferase (ST).

Repetindo o método, é possível manipular geneticamente vias de glicosilação cada vez mais complexas, num hospedeiro relevante, tal como um microrganismo eucariótico inferior. De acordo com uma variante preferencial, o organismo hospedeiro é transformado duas ou mais vezes com bibliotecas de ADN que incluem sequências que codificam actividades de glicosilação. A selecção de fenótipos desejados pode ser efectuada após cada experiência de transformação ou, em alternativa, depois de terem ocorrido diversa transformações. As vias de glicosilação complexas podem ser, desta maneira, geneticamente manipuladas com rapidez.

Reacções de glicosilação sequenciais

De acordo com uma variante preferencial, tais bibliotecas de péptidos de endereçamento/domínios catalíticos são delineadas para incorporarem a informação existente sobre a natureza sequencial das reacções de glicosilação em eucariotas superiores. As reacções conhecidas que ocorrem inicialmente no decurso do processamento das glicoproteínas necessitam do endereçamento das enzimas que catalisam tais reacções para uma parte proximal do Golgi ou do RE. Por exemplo, a rectificação de Man8GlcNAC2 para proporcionar MansGlcNAc2 pelas manosidases é um passo inicial na formação de N-glicanos complexos. Uma vez que o processamento de proteínas é iniciado no RE e depois prossegue através do 191

Golgi proximal, mediano e distai, é desejável que esta reacção ocorra no RE ou no Golgi proximal. Por exemplo, ao delinear uma biblioteca para a localização da manosidase I, procura-se fazer a correspondência dos sinais de endereçamento do RE e do Golgi proximal com o dominio catalítico da manosidase I.

Locais de integração

Considerando que um dos objectivos finais deste esforço de manipulação genética é a obtenção de uma estirpe robusta para a produção de proteínas, capaz de suportar bem um processo de fermentação industrial, a integração de genes múltiplos no cromossoma do hospedeiro (v.g., fungos) está associada, preferencialmente, a um planeamento cuidadoso. É provável que a estirpe manipulada geneticamente tenha de ser transformada com um conjunto de genes diferentes e estes genes terão de ser transformados de uma maneira estável para se garantir que a actividade desejada é mantida ao longo de todo o processo de fermentação. Conforme aqui descrito, qualquer combinação das diversas actividades enzimáticas desejadas pode ser objecto de manipulação genética no hospedeiro fúngico de expressão das proteínas, v.g., sialil-transferases, manosidases, fucosil-transferases, galactosil-transferases, glucosil-transferases, GlcNAc-transferases, transportadores específicos do RE e do Golgi (v.g., transportadores sin-porte e antiporte para a UDP-galactose e outros precursores), noutras enzimas implicadas no processamento de oligossacarídeos e em enzimas implicadas na síntese de precursores oligossacarídicos activados, tais como UDP-galactose e CMP-ácido N-acetil-neuramínico. Como exemplos 192 de métodos preferenciais para modificar a glicosilação numa célula hospedeira eucariótica inferior, por exemplo, de Pichia pastoris, indica-se os que constam do quadro 6.

Quadro 6. Algumas variantes preferenciais para modificar a glicosilação num microrganismo eucariótico inferior

Estrutura desejada Actividades catalíticas adequadas Fontes adequadas de sequências de localização Delecções de genes convenien tes Transportadores adequados e/ou fosfatases Man5GlcNAc2 oí-1,2-manosidasee (murinos, humana, Bacillus sp., A. nidulans) MnsI (terminal N, S. cerevisiae) Ochl (terminal N, S.cerevisiae, P. pastoris) Ktrl Mnn9 Mntl (S. cerevisiae) KDEL, HDEL (terminal C) 0CH1 MNN4 MNN6 nenhum GlcNAcMan5- GlcNAc- Ochl (terminal 0CH1 transportador G1cNAc2 transferase N, S.cerevisiae, MNN4 de UDP-GlcNAc I, (humana, murinos, ratos, etc.) P. pastoris) KTR1 (terminal N) Mnnl (terminal N, S.cerevisiae) Mntl (terminal N, S.cerevisiae) GDPase (terminal N, S.cerevisiae) MNN6 (humana, murinos, K. lactis) UDPase (humana) 193 (continuação)

Estrutura desejada Actividades catalíticas adequadas Fontes adequadas de sequências de localização Delecções de genes convenien tes Transportadores adequados e/ou fosfatases GlcNAcMan3- manosidase II Ktrl 0CH1 transportador G1cNAc2 Mnnl (terminal N, S.cerevisiae) Mntl (terminal N, S.cerevisiae) Kre2/Mntl (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktrl (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) Mnnl (S. cerevisiae) MNN4 MNN6 de UDP-GlcNAc (humana, murinos, K. lactis) UDPase (humana) GlcNAc (2-4)— GlcNac Mnnl (terminal 0CH1 transportador Man3GlcNAc2 transferase N, S.cerevisiae) MNN4 de UDP-GlcNAc II, III, IV, V (humana, murinos) Matl (terminal N, S.cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktrl (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) Mnnl (S. cerevisiae) MNN6 (humana, murinos, K. lactis) UDPase (humana) 194 (continuação)

Estrutura desejada Actividades catalíticas adequadas Fontes adequadas de sequências de localização Delecções de genes convenien tes Transportadores adequados e/ou fosfatases Gal (1-4)- 1 «nF i—1 1 CQ. Mnnl (terminal 0CH1 transportador —GlcNAc (2-4)- galactosil- N, S.cerevisiae) MNN4 de UDP-galactose -Man3GlcNac2 transferase (humana) Mntl (terminal N, S.cerevisiae) Kre2/Mntl (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktrl (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) Mnnl (S. cerevisiae) MNN6 (humana, S. pombe) NANA (i~4) — oí-2,6-sialil- KTRl 0CH1 transportador -Gal (i-4) - transferase MNN1 (terminal MNN4 de CMP-ácido —GlcNAc (2-4)- (humana) N, S.cerevisiae) MNN6 siálico -Man3GlcNac2 oí-2,3-sialil-transferase MNT1 (terminal N, S.cerevisiae) Kre2/Mntl (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktrl (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) MNN1 (S. cerevisiae) (humano) 195

Uma vez que qualquer estratégia para manipular a formação de N-glicanos complexos numa célula hospedeira, por exemplo, num eucariota inferior, implica simultaneamente a eliminação e também a adição de actividades de glicosil-transferases particulares, com um esquema exaustivo procurar-se-á coordenar os dois requisitos. Os genes que codificam enzimas que são desejáveis servem como locais potenciais de integração para os genes que são desejáveis. Por exemplo, a actividade de 1,6-manosil-transferase é uma garantia de glicosilação em muitos eucariotas inferiores conhecidos. 0 gene que codifica a-1,6-manosil-transferase (OCHl) foi clonado a partir de S. cerevisiae e mutações no gene deram origem a um fenótipo viável com manosilação reduzida. Deste modo, o local do gene que codifica a actividade de a-1,6-manosil-transferase é um alvo importante para a integração de genes que codificam a actividade de glicosil-transferase. De igual modo, é possível escolher um conjunto de outros locais de integração cromossómicos para os quais se prevê, com base num fenómeno de destruição de genes nesses locais, o seguinte: (1) melhorem a aptidão das células para que nelas haja uma glicosilação de uma maneira mais humanóide, (2) melhorem a aptidão das células para segregarem proteínas, (3) reduzam a proteólise de proteínas exógenas e (4) melhorem outras características no processo que facilita a purificação ou o próprio processo de fermentação.

Glicoproteínas visadas

Os métodos aqui descritos são úteis para a produção de glicoproteínas, em especial glicoproteínas utilizadas 196 terapeuticamente em seres humanos. As glicoproteínas que possuam glicoformas específicas podem ser especialmente úteis, por exemplo, no endereçamento de proteínas terapêuticas. Por exemplo, demonstrou-se que o composto manose-6-fosfato orienta proteínas para o lisossoma, o que pode ser essencial para o funcionamento correcto de diversas enzimas relacionadas com patologias de armazenagem lisossómica, tais como as doenças de Gaucher, Hunter, Hurler, Scheie, Fabry e Tay-Sachs, isto apenas para mencionar algumas. De igual modo, a adição de um ou vários resíduos de ácido siálico a uma cadeia lateral de um glicano pode aumentar o período de vida de uma glicoproteína terapêutica ín vivo, após a sua administração. Posto isto, é possível manipular geneticamente células hospedeiras (v.g., de eucariotas inferiores ou de mamíferos) para aumentar a intensidade do ácido siálico terminal em glicoproteínas expressas nas células. Em alternativa, o ácido siálico pode ser conjugado com a proteína relevante in vitro, antes da administração, utilizando uma transferase de ácido siálico e um substrato adequado. Também é possível introduzir modificações na composição do meio de crescimento, para além da expressão de actividades enzimáticas implicadas na glicosilação humanóide, para se obter glicoproteínas que se assemelhem mais aproximadamente às formas humanas (Weikert et al. (1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121, Werner et al. (1998) Arzneimittelforschung 48(8): 870-880; Andersen e Goochee (1994) Cur. Opin. Biotechnol. 5: 546-549; Yang e Butler (2000) Biotechnol. Bioengin. 68(4): 370-380). Comprovou-se que as modificações de glicanos específicas para anticorpos 197 monoclonais (v.g., a adição de um GlcNAc bissector) melhoram a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17 (2): 176-80), o que pode ser eventualmente desejável para a produção de anticorpos ou de outras proteínas terapêuticas.

As proteínas terapêuticas são administradas, tipicamente, por injecção, pelas vias oral e pulmonar ou por outros meios. Como exemplos de glicoproteínas úteis pretendidas, que podem ser produzidas de acordo com a invenção, refere-se, mas sem qualquer limitação: eritropoietina, citoquinas, tais como as seleccionadas entre interferão a, interferão β, interferão γ, interferão ω, e granulócitos-CSF, factores de coagulação, tais como o factor VIII, o factor IX e proteína C humana, a cadeia α do receptor IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, igM, interleucinas, urocinase, quimase, inibidores da tripsina da ureia, proteína de ligação ao IGF, factor de crescimento epidermal, factor de libertação da hormona do crescimento, proteína de fusão com a anexina V, angiostatina, factor 2 do crescimento endotelial vascular 2, factor 1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegerina, a-1-antitripsina, Dnase II e α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, também conhecida por proteína 1 de ligação do TNF), TACI-Ig (activador transmembranar e modulador do cálcio e interactor do ligando da ciclofilina), FSH (hormona estimuladora dos folículos), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 de tipo glucagona), agonista do receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, também conhecido como fusão do Fc com o receptor TNF solúvel), ATUI, rhTrombina, glucocerebrosidase 198

e CTLA4-Ig (antigénio 4 - Ig associado ao linfócito T citotóxico).

Actividades subsequentes de glicosil-transferases: N-acetil-glucosaminil-transferase II, galactosil-transferase e sialil-transferase

De acordo com um outro aspecto da invenção, os glicanos recém-formados, produzidos pela enzima α-manosidase II do Golgi, são substratos para as reacções de glicosilação subsequentes. De acordo com uma variante, o GnT II, o UDP-GlcNAc e facultativamente o transportador de UDP-GlcNAc protegem a ramificação Mana-1,6 recém-formada do oligossacarídeo produzido na estirpe YSH-37 de P. pastoris com um GlcNAc para proporcionar GlcNAc2Man3GlcNAc2 (exenqplo 19). De acordo com uma outra variante, os outros GnT (v.g., GnT III, GnT IV, GnT V) reagem no substrato transitório GlcNAc2Man3GlcNAc2. Por sua vez, este substrato passa a ser um substrato para as galactosil-transferases (exemplo 25), ocorrendo um processamento suplementar com as sialil- transferases.

Seguidamente são descritos exemplos que ilustram as composições e os métodos da presente invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como limitativos: os exemplos visam apenas fins ilustrativos. EXEMPLO 1

Clonagem e destruição do gene OCH1 em P. Pastoris 199

Ampliou-se uma grelha de leitura aberta (ORF) de 1215 pb do gene OCHl de P. pastoris que codifica uma a-1,6-manosil-transferase putativa, a partir do ADN genómico de P. pastoris (estirpe x-33, Invitrogen, Carlsbad, CA), utilizando os oligonucleótidos 5'-ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT-3' (SEQ ID NO: 18) e 5'-TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3' (SEQ ID NO: 19), que foram delineados com base na sequência do OCHl de P. pastoris (publicação do pedido de patente de invenção japonesa n° 8-336387) . Subsequentemente, foram amplificados 2685 pb a montante e 1175 pb a jusante do ORF do gene OCHl, a partir da biblioteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm, T. et al., Yeast, Maio de 1999, 15(7): 563-72), utilizando os oligonucleótidos internos 5'-ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT-3' (SEQ ID NO: 20) no gene OCHl e 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' T7 (SEQ ID NO: 21) e 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' T3 (SEQ ID NO: 22); oligonucleótidos na estrutura da biblioteca que suporta o plasmideo lambda ΖΑΡ II (Stratagene, La Jolla, CA). O fragmento resultante de 5075 pb foi clonado no vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e recebeu a designação de pBK9.

Após a montagem de uma construção inactivada do gene que substitui a grelha de leitura de OCHl com o gene de resistência a HIS4, transformou-se a estirpe de P. pastoris, tendo as colónias sido rastreadas em função da sensibilidade à temperatura a 37°C. Os mutantes de OCHl de S. cerevisiae são sensíveis à temperatura e desenvolvem-se lentamente a temperaturas elevadas. Assim, é possível identificar homólogos funcionais de OCHl em P. pastoris complementando o mutante OCHl de S. cerevisiae com uma biblioteca de ADN ou de 200 ADNc de P. pastoris. Cerca de 20 estirpes sensíveis à temperatura foram ainda sujeitas a rastreio de colónias por PCR para identificação de colónias com um gene OCHl eliminado. Foram obtidas diversas delecções de OCHl. O pBK9.1 linearizado, que possui uma sequência de 2,1 kb a montante e uma sequência de 1,5 kb a jusante da cassete do gene OCHl, portadora do gene HIS4 de Pichia, foi transformada em BK1 de P. pastoris [GS115 (his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) portador do gene de IFN-β humano no local AOXl] para inactivar o gene OCHl de tipo selvagem. O rastreio inicial dos transformantes foi efectuado utilizando meio sem histidina, seguindo-se a preparação de réplicas em placas para selecção das colónias sensíveis à temperatura. Vinte das duzentas colónias positivas à histidina revelaram um fenótipo sensível à temperatura a 37°C. Para excluir a integração aleatória de pBK9.1 no genoma de Pichia, os 20 isolados, sensíveis à temperatura, foram submetidos a PCR de colónias utilizando iniciadores específicos para a sequência a montante do local de integração e para o ORF de HIS4. Duas das vinte colónias eram defectivas em ochl e quando analisadas por Southern Blot e por Western Blot indicaram a disrupção do ochl funcional pela construção com ochl desactivado. O ADN genómico foi digerido utilizando duas enzimas de restrição em separado, BglII e Ciai, para confirmar a inactivação do ochl e para confirmar a integração na grelha de leitura aberta. O Western Blot demonstrou que aos mutantes de ochl lhes falta uma banda discreta produzida no tipo selvagem de GS115, a 46,2 kDa. 201 EXEMPLO 2

Manipulação genética de P. pastoris com o-l,2-manosidase para a produção de precursores de lFN-β que contêm Man5GlcNAc2 É necessária uma a-1,2-manosidase para rectificação do Man8GlcNAc2 para gerar Man5GlcNAc2, que é um intermediário essencial para a formação de N-glicanos complexos. Embora a produção de um precursor de Man5GlcNAc2 seja essencial, não é necessariamente suficiente para a produção de glicanos híbridos e complexos, uma vez que o isómero especifico de Man5GlcNAc2 pode ser ou não um substrato para GnTl. Utiliza-se um mutante o chi de P. pastoris que é geneticamente manipulado para expressar o interferão β humano segregado, sob o controlo de um promotor aox. Constrói-se uma biblioteca de

ADN ligando in frame o domínio catalítico da manosidase IB humana (uma a-1,2-manosidase) com uma biblioteca secundária que contém as sequências de codificam os péptidos de localização do Golgi proximal e do RE. A biblioteca de ADN é depois transformada dentro do organismo hospedeiro, daí resultando uma população geneticamente mista em que cada um dos transformantes expressa interferão β e também um gene sintético de manosidase, a partir da biblioteca. São criadas em cultura colónias dos transformantes individuais e é induzida a produção do interferão por adição de metanol. Nestas condições, mais de 90% da proteína segregada é o interferão β glicosilado.

Faz-se a purificação dos sobrenadantes para se lhes remover os sais e os contaminantes de baixo peso molecular por cromatografia de fase inversa através de sílica numa 202 coluna Ci8. Os transformantes desejados que expressam a a-1,2-manosidase activa, convenientemente encaminhada, produzem o interferão β, incluindo N-glicanos com a estrutura Man5GlcNAc2, o qual possui uma massa molecular reduzida comparativamente com a do interferão β da estirpe original. Analisa-se o interferão β purificado por espectroscopia de massa MALDI-TOF e faz-se a identificação das colónias que expressam a forma desejada de interferão β. EXEMPLO 3

Geração de uma estirpe mutante ochl que expressa uma a-1,2-manosidase, GnTI para a produção de uma glicoproteína humanóide

Amplificou-se por PCR a grelha de leitura aberta de 1215 pb do gene OCHl de P. pastoris e também os 2685 pb a montante e os 1175 pb a jusante (ver também o documento WO 02/00879), efectuou-se a sua clonagem no vector pCR2.1-TOPO (invitrogen), e atribuiu-se-lhe a designação de pBK9. Para se criar uma estirpe com ochl desactivado digeriu-se com Sfil marcadores auxotróficos múltiplos e 100 pg de pJN329, que é um plasmideo que contém um alelo mutante ochl::URA3 flanqueado com os locais de restrição Sfil, tendo sido utilizada para transformar estirpes JC308 de P. pastoris (Cereghino et al. (2001) Gene 263: 159-169), por electroporação. Após a incubação em meio definido ao qual lhe faltava uracilo, durante 10 dias à temperatura ambiente, efectuou-se a colheita de 1000 colónias que foram novamente espalhadas em riscas. Os clones URA+ que eram incapazes de 203 crescer a 37°C, mas que se desenvolviam à temperatura ambiente, foram submetidos a PCR de colónias para se testar a integração correcta do alelo mutante ochl::URA3. Um clone que apresentava o padrão esperado de PCR recebeu a designação de YJN153. Utilizou-se o domínio Kringle 3 do plasminogéneo humano (K3) como proteína modelo. Um plasmídeo marcado com NeoR, contendo o gene K3, foi transformado dentro da estirpe YJN153 e a estirpe resultante, que expressa K3, recebeu a designação de BK64-1.

Construiu-se o plasmídeo pPBl03, contendo o gene MNN2-2 de Kluyveromyces lactis que codifica um transportador de UDP-N-acetil-glucosamina do Golgi, fazendo a clonagem de um fragmento BglII-HindIII de extremidades a condizer, a partir do vector pDL02 (Abeijon et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 5963-5968) num pBLADE-SX de extremidades a condizer e digerido com Bgrlll e BamEI, contendo o gene ADE1 de P. pastoris (Cereghino et al. (2001) Gene 263: 159-169). Este plasmídeo foi linearizado com EcoNl e transformado dentro da estirpe BK64-1 por electroporação, tendo sido confirmada por análise por PCR uma estirpe que continha o MNN2-2, que recebeu a designação de PBP1.

Gerou-se uma biblioteca de construção de manosidase contendo as fusões concatenadas dos domínios líderes de diversas proteínas membranares de tipo I ou de tipo II, a partir de S. cerevisiae e de P. pastoris, fundidas com os domínios catalíticos de diversos genes de a-1,2-manosidase de seres humanos, murganhos, moscas, larvas e leveduras (ver, v.g., o documento W002/00879, aqui incorporado por referência). Esta biblioteca foi criada num vector de 204 integração HIS4 de P. pastoris e foi rastreada por linearização com Sall, fazendo a transformação por electroporação na estirpe PBPl e analisando os glicanos libertados a partir da proteina repórter K3. Uma construção activa escolhida era uma quimera constituída pelos nucleótidos 988-1296 (terminal C) do gene SEC12 de levedura fundido com um gene de a-1, 2-manosidase IA de murganho com uma delecção no terminal N (figura 3), a que faltavam os 187 nucleótidos. Uma estirpe de P. pastoris que expressa esta construção recebeu a designação de PBP2.

Gerou-se uma biblioteca de construções de GnTI, constituída por fusões concatenadas da mesma biblioteca lider com os dominios catalíticos dos genes de GnTI de seres humanos, larvas, rãs e moscas (documento WO 02/00879) . Esta biblioteca foi criada num vector de integração ARG4 de P. pastoris e foi rastreada por linearização com Aatll, sendo a transformação feita por electroporação numa estirpe PBP2 tendo sido analisados os glicanos libertados a partir de K3. Uma construção activa escolhida era uma quimera dos primeiros 120 pb do gene NFNN9 de S. cerevisiae fundido com o gene de GnTI humano com uma delecção, ao qual lhe falta os primeiros 154 pb. Uma estirpe de P. pastoris que expressa esta construção recebeu a designação de PBP-3. EXEMPLO 4

Manipulação genética de P. pastoris para a produção de Man561cNAC2 enquanto estrutura predominante de N-glicanos, utilizando uma biblioteca combinatória de ADN 205

Manipulou-se geneticamente um mutante ochl de P. pastoris (ver os exemplos 1 e 3) para expressar e segregar proteínas, tais como o domínio kringle 3 do plasminogéneo humano (K3) sob o controlo do promotor induzível AOXI. Utilizou-se como proteína modelo o domínio kringle 3 do plasminogénio humano (K3). Amplificou-se um fragmento de ADN que codifica ο K3, utilizando polimerase 'Pfu turbo' (Strategene, La Jolla, CA) e clonou-se nos locais de EcoRI e Xbal do pPICZaA (Invitrogen, Carlsbad, CA), daí resultando um identificador 6-His no terminal C. para se melhorar a eficiência de K3 na glicosilação ligada a N (Hayes et al. 1975 J. Arch. Biochem. Biophys. 171, 651-655), substituiu-se a Pro46 com Ser46, recorrendo à mutagénese dirigida ao local. O plasmídeo resultante recebeu a designação de pBK64. A sequência correcta da construção de PCR foi confirmada por sequenciação de ADN.

Construiu-se uma biblioteca combinatória de ADN, ligando in frame os domínios catalíticos a-1,2-manosidase IB (n° 6678787de admissão no Genbank) e IA (n° 6754619 de admissão no Genbank) de murinos, com uma biblioteca secundária que contém as sequências que codificam os péptidos de localização da vesícula Cop II, do RE e do Golgi proximal, de acordo com o quadro 6. Utilizou-se a biblioteca de ADN combinado para gerar construções de fusão individuais que foram depois transformadas dentro do organismo hospedeiro de expressão de K3, daí resultando uma população geneticamente mista em que cada um dos transformantes individuais expressa K3 e também um gene de fusão entre o sinal de localização/manosidase, proveniente da biblioteca. Os transformantes individuais 206 foram criados em cultura e a produção de K3 foi induzida por transferência para um meio contendo metanol. Nestas condições, ao fim de 24 horas de indução, mais de 90% da proteína existente no meio era K3. Purificou-se a proteína repórter K3 a partir do sobrenadante para remoção dos sais e dos contaminantes de pequena massa molecular, por cromatografia por afinidade com Ni. Após a purificação por afinidade, removeu-se os sais de proteína por cromatografia de exclusão dimensional numa coluna carregada com resina 'Sephadex G10' (Sigma, St. Louis, MO) e depois submeteu-se directamente a uma análise por MALDI-TOF, adiante descrita, ou então efectuou-se a remoção dos N-glicanos por digestão com PNGase, conforme adiante descrito (libertação de N-glicanos) e submeteu-se a uma análise por MALDI-TOF, ver Miele et al. (1997) Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 151-157.

Executando esta metodologia, obteve-se um conjunto diversificado de transformantes; alguns não apresentaram nenhuma modificação dos N-glicanos, comparativamente com a estirpe com o ochl desactivado; e outros apresentaram um grau elevado de rectificação da manose (figuras 5D e 5E) . Os transformantes desejados que expressam a a-1,2-manosidase activa, convenientemente encaminhada, produziram K3 com N-glicanos com estrutura molecular Man5GlcNAC2. Isto confere uma massa molecular reduzida à glicoproteína, comparativamente com ο K3 da estirpe original com delecção de ochl, uma diferença que foi facilmente detectada na espectrometria de massa por MALDI-TOF (figura 5) . O quadro 7 indica os níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2. 207

Quadro 7. Biblioteca representativa de ADN combinatório de domínios de sequências de localização/catalíticos que apresentam níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2

Sequências dos péptidos de endereçamento MNS1 (s) MNS1 (m) MNS1(1) SEC12(s) SEC12(m) w 0 Manosidase ΙΑ Δ187 FB4 FB5 FB6 FB7 FB8 u H de murganho ++ + - ++ ++++ H íd Manosidase 1B Δ58 de GB 4 GB 5 GB 6 GB 7 GB8 +j n) 0 murganho ++ + + ++ + w o Manosidase 1B Δ99 de GC4 GC5 GC6 GC7 GC8 r| α 1 murganho - ++ + + + + Manosidase ΙΑ Δ170 GD 4 GD 5 GD 6 GD 7 GD8 de murganho - - - + +

Quadro 8. Outra biblioteca combinatória de ADN de domínios de sequências de localização/catalíticos que apresentam níveis relativos de produção de Man5GlcNAC2

Sequências de péptidos de endereçamento Domínios catalíticos VAN1(s) VAN1(s) VAN1(1) MNN10(s) MNN10(m) MNN10(1) Manosidase 1B Δ180 de C. Elegans BC18-5 +++++ BC-19 ++++ BC-20 ++ + BC-27 +++++ BC-28 +++++ BC-29 +++ Manosidase 1B Δ31 de C. Elegans BB 18 +++++ BB 19 ++++ + BB20 ++++ BB 18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++

Os péptidos de endereçamento foram seleccionados a partir de MNS I (SwissProt P32906) em S. cerevisiae (compridos, médios e curtos) (ver supra, bibliotecas de ácidos nucleicos; bibliotecas combinatórias de ADN de construções de fusão) e SEC12 (SwissProt P11655) em S. 208 cerevisiae (988-1140 nucleótidos: curto) e (988-1296: médio). Embora a maior parte das sequências dos péptidos de endereçamento tivessem delecções no terminal N, algumas sequências de péptidos de endereçamento, tais como a de SEC12, tinham delecções no terminal C. Os domínios catalíticos utilizados nesta experiência foram seleccionados a partir de manosidase IA de murganho com uma delecção de 187 aminoácidos no terminal N e a partir de manosidase 1B de murganho com delecções de 58, 99 e 170 aminoácidos. O número de vezes que aparece o sinal ( + ), tal como aqui utilizado, indica os níveis relativos de produção de Man5GlcNAC2. A notação (-) indica que não houve nenhuma produção evidente de Man5GlcNAc2. A notação ( + ) indica que houve menos de 10% de produção de Man5GlcNAc2. A notação (++) indica que houve uma produção de cerca de 10%-20% de Man5GlcNAc2. A notação (+++) indica que houve uma produção de cerca de 20%-40% de Man5GlcNAc2. A notação (++++) indica que houve uma produção de cerca de 50% de Man5GlcNAc2. A notação (+++++) indica que houve uma produção de Man5GlcNAc2 superior a 50%. O quadro 9 indica as quantidades relativas de Man5GlcNAc2 detectadas na glicoproteína repórter K3 segregada. Foram geradas seiscentas e oito (608) estirpes diferentes de P. pastoris, Aochl, transformando-as com um único construção de uma biblioteca genética combinatória que foi gerada por fusão de dezanove (19) domínios catalíticos de a-1,2-manosidase com trinta e dois (32) líderes do RE fúngico e do cis-Golgi. 209

Quadro 9

Quantidade de Man5GlcNAc2 na proteína K3 Número de construções segregada (% dos glicanos totais) (%) N.D.* 19 (3,1) 0-10% 341 (56,1) 10-20% 50 (8,2) 20-40% 75 (12,3) 40-60% 72 (11,8) Mais de 60% 51 (8,4)+ Total 608 (100) Não foram testados algumas construções de fusão uma vez que os plasmídeos correspondentes não conseguiram propagar-se em E. coli antes da transformação em P. pastoris. + Os clones que revelaram o grau mais elevado de rectificação de Man5GlcNAc2 (30/51) foram ainda objecto de análise para se investigar a actividade de manosidase no sobrenadante do meio. A maior parte (28/30) manifestou uma actividade de manosidase detectável no sobrenadante (v.g., figura 4B) . Apenas duas construções apresentaram níveis elevados de Man5GlcNAc2, embora faltasse actividade de manosidase no meio {v.g., figura 4C). 0 quadro 7 indica duas construções pFB8 e pGC5, entre outros, que permitem que uma célula hospedeira transformada seja capaz de produzir uma glicoproteina K3 que apresente Man5GlcNAc2. O quadro 8 indica uma construção mais preferencial, pBC18-5, uma sequência de um péptido de endereçamento de VAN1{s) de S. cerevisiae (proveniente de SwissProt 23642) ligada in frame a uma manosidase IB de C. elegans (n° CAA98114 de admissão no Genbank) com uma delecção de 80 aminoácidos no terminal N (Vanl(s) de Saccharomyces/ 210 /manosidase IB Δ80 de C. elegans) . A construção de fusão produziu também uma estrutura predominante de Man5GlcNAc2, conforme ilustrado na figura 5E. Comprovou-se que esta construção de fusão de manosidase produz mais de 50% de Man5GlcNAC2 (+++++) .

Geração de uma biblioteca combinatória de localização/ /actividade de manosidase A geração de uma biblioteca combinatória de ADN de dominios cataliticos de a-1,2-manosidase fundidos com péptidos de endereçamento necessitou da amplificação de dominios de manosidase com comprimentos variáveis de delecções no terminal N, provenientes de diversos organismos. Para se conseguir este objectivo as grelhas de leitura aberta de comprimento completo (ORF) de a-1,2- manosidases foram amplificadas por PCR, a partir de ADNc ou a partir de ADNc genómico, provenientes das seguintes fontes: Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus nidulans e Penicillium citrinun. Em cada caso, manteve-se ADN a incubar na presença de iniciadores oligonucleotidicos específicos para a sequência de manosidase desejada conjuntamente com os reagentes necessários para a execução da reacção de PCR. Por exemplo, para se amplificar o ORF da a-1,2-manosidase IA de M. musculus, manteve-se a incubar o iniciador de 5' ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTC-AGTAGC (SEQ ID NO: 23) e o iniciador de 3' TCATTTCTC-TTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEQ ID NO: 24) na presença de polimerase do ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), tendo a amplificação sido feita nas condições recomendadas por 211 'Stratagene', utilizando os seguintes parâmetros de amplificação: 94°C durante 1 minuto (1 ciclo); 94°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos, 72°C durante 3 minutos (30 ciclos). Após a amplificação, manteve-se a incubar a sequência de ADN que codifica o ORF, a 72°C durante 5 minutos com 1U de polimerase ADN de Taq (Promega, Madison, WI), antes da ligação que teve lugar em pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), com uma transformação que teve lugar em TOPIO E. coli quimicamente competente, conforme recomendado por 'Invitrogen'. O produto de PCR clonado foi confirmado por sequenciação abi, utilizando iniciadores específicos para o ORF da manosidase.

Para se gerar os desejados truncamentos no terminal N de cada manosidase, utilizou-se a ORF completa de cada manosidase como molde numa experiência subsequente de reacções de PCR, em que a posição de hibridação do iniciador de 5' foi especifica para o terminal 5' do truncamento desejado e o iniciador de 3' continuou a ser especifico para o terminal 3' original do ORF. Para facilitar a subclonagem do fragmento de manosidase truncado, no vector de expressão de levedura, pJN347 (figura 2C), efectuou-se a modificação genética dos locais de restrição Asei e Pacl em cada produto de truncamento, respectivamente nos terminais 5' e 3'. O número e a posição dos truncamentos no terminal N gerados para cada ORF da manosidase dependeram da posição da região transmembranar (TM) em relação ao domínio catalítico (CD) . Por exemplo, na região formativa localizada entre TM e CD havia menos de 150 pb, pelo que apenas foi gerado um truncamento para esta proteína. No entanto, se a região 212 formativa tivesse mais de 150 pb, então seriam gerados mais um ou dois truncamentos, dependendo isso do comprimento da região formativa.

Descreve-se aqui um exemplo do modo como os truncamentos para a manosidase IA de M. musculus (n° 6678787 de admissão no Genbank) foram gerados, tendo sido utilizada uma metodologia semelhante para outras manosidases. A figura 3 ilustra o ORF de a-1,2-manosidase IA de M. musculus com os dominios previstos transmembranar e catalítico salientados a negrito. Com base nesta estrutura, foram delineados de 5' (as posição de hibridação estão sublinhadas na figura 3) para se gerar as delecções Δ65, Δ105 e Δ187 no terminal N. Utilizando como exemplo a delecção Δ65 no terminal N, utilizou-se o iniciador de 5', designadamente 5'-GGCGCGCCGA-CTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC-3' (SEQ ID NO: 25) (com o local de restrição Asei salientado a negrito) em conjunto com o iniciador de 3', designadamente 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTT-GCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEQ ID NO: 26) (com o local de restrição Paci salientado a negrito). Estes dois iniciadores foram utilizados para amplificar um fragmento de 1561 pb, nas condições indicadas anteriormente para amplificar o ORF de comprimento completo da manosidase IA de M. musculus. Além disso, tal como se fez com o produto obtido para o ORF de comprimento completo, também se manteve o produto truncado a incubar com polimerase de ADN de Taq, ligado dentro do pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), transformado dentro de TOPIO e sequenciado por ABI. Depois de se ter amplificado e confirmado a sequência do fragmento de manosidase truncado, fez-se digerir o plasmídeo resultante, 213 pCR201-A65mMannIAA, com Asei e PacI em tampão n°4 de 'New England Biolabs' (Beverly, MA) durante 16 horas a 37°C. Paralelamente, fez-se digerir o pJN347 (figura 2C) com as mesmas enzimas e manteve-se a incubar conforme descrito anteriormente. Após a digestão, tanto a estrutura principal do pJN347 (figura 2C) como o domínio catalítico truncado foram extraídos com gel e ligado utilizando o estojo de ligação 'Quick Ligation Kit' (New England Biolabs, Beverly, MA), conforme recomendado pelo fabricante, e subsequentemente transformado dentro de células DH5a quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) . utilizou-se a PCR de colónias para se confirmar a geração da construção pJN347-manosidase ΙΑΔ65 de murganho.

Tendo sido feita a geração de uma biblioteca de domínios catalíticos truncados de a-1,2-manosidase no vector de expressão de levedura pJN347 (figura 2C), o outro passo para gerar a biblioteca de péptidos de endereçamento/domínios catalíticos consistiu em clonar in frame as sequências dos péptidos de endereçamento (figura 2). Tanto as construções de pJN347-manosidase (figura 2D) como as construções de pCR2.lTOPO-péptido de endereçamento (figura 2B), tal como foram obtidas, ficaram a incubar de um dia para o outro a 37°C em tampão n°4 de 'New England Biolabs' na presença das enzimas de restrição Notl e Asei. Após a digestão, tanto a estrutura principal de pJN347-manosidase como as regiões do péptido de endereçamento foram extraídas com gel e ligadas utilizando o estojo de ligação 'Quick Ligation Kit' (New England Biolabs, Beverly, MA), em conformidade com as recomendações do fabricante, e transformadas dentro de 214 células DH5a quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Depois disso, efectuou-se a sequenciação por ABI das construções de pJN347-péptido de endereçamento/manosidase, para se confirmar se as fusões geradas estavam concatenadas. A biblioteca final de péptido de endereçamento/a-1,2-manosidase contém uma quantidade estimada superior a 1300 construções geradas pela metodologia descrita supra. A figura 2 ilustra a construção da biblioteca combinatória de ADN.

Manipulação genética de uma estirpe de P. pastoris com OCHl desactivado, com múltiplos marcadores auxotróficos O primeiro passo na construção do plasmídeo consistiu na criação de um conjunto de plasmideos universais contendo regiões de ADN do gene KEXl de P. pastoris (Boehm et al. Yeast, Maio de 1999; 15(7): 563-72), como suportes espaciais para as regiões de 5' e 3' dos genes que se pretende inactivas. Os plasmideos continham também o 'Ura-blaster' de S. cerevisiae (Alani et al. (1987) Genetics 116: 541-545) como suporte espacial para os marcadores auxotróficos, e uma cassete de expressão com um local de clonagem múltipla para a inserção de um gene exógeno. Amplificou-se por PCR um fragmento de 0,9 kb da região KEXI-5' de P. pastoris, utilizando OS iniciadores GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGAT-CATTTGTCCAGCTTCA GA (SEQ ID NO: 27) e GCCCACGTCGACGGATCCGT-TTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEQ ID NO: 28) e ADN genómico de P. pastoris como molde e fez-se a clonagem nos locais Saci, Sall do pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) . Cortou-se o plasmideo resultante com BamHI e Sall e utilizou-se um fragmento de 0,8 kb da região KEXI-3', que 215 havia sido amplificada utilizando os iniciadores CGGGAT-CCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEQ ID NO: 29) e GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGG ATGACTCTTTTC (SEQ ID NO: 30), que foi clonado dentro dos locais abertos para se criar o pJN262. estes plasmideo foi cortado com BamHI e BamHI de 3,8 kb, tendo o fragmento BglII de pNKY51 (Alani et al., Genetics 116: 541-545, 1987) sido inserido com as duas orientações possíveis, daí resultando os plasmídeos pJN263 (figura 4A) e pJN284 (figura 4B).

Criou-se uma cassete de expressão utilizando como locais de clonagem Notl e Paci. Amplificou-se o promotor GAPDH de P. pastoris utilizando os iniciadores CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTT-GTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEQ ID NO: 31) e GGACATGCATGCACT-AGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA (SEQ ID NO: 32) e o plasmideo pGAPZ-A (invitrogen) como molde, tendo a clonagem sido feita nos locais BamHI, Sphl do pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) (figura 4B). O plasmideo resultante foi cortado com Spel e Sphl e a região do terminador transcricional ("TT") CYCl, que havia sido amplificada com os iniciadores CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACG-TCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEQ ID NO: 33) e GGACATGCATGCGGA-TCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATT AAAGCCTTCGAGCGTCCC (SEQ ID NO: 34) e o plasmideo pPlCZ-A (Invitrogen) como molde foi clonado nos locais abertos, criando o pJN261 (figura 4B).

Criou-se um plasmideo inactivado para o gene OCHl de P. pastoris fazendo a digestão de pJN263 com Sall e Spel e um fragmento de ADN de 2,9 kb da região OCHl-5', que havia sido amplificada utilizando os iniciadores GAACCACGTCGA-CGGCCATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATT CAAACACAAGGCATTGC (SEQ ID 216 NO: 35) e CTCCAATACTAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEQ ID NO: 36) e ADN genómico de P. pastoris como molde, foi clonado utilizando os locais abertos (figura 4C). o plasmideo resultante foi cortado com EcoRl e Pmel e inseriu-se um fragmento de ADN de 1,0 kb da região OCHl-3', que havia sido gerada utilizando os iniciadores TGGAAGGTTTAAACAAA-GCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAG ATTAGAGAATG (SEQ ID NO: 37) e AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTT TTCATC (SEQ ID NO: 38), para se gerar o pJN298 (figura 4C). Para permitir a possibilidade de se utilizar simultaneamente o plasmideo para introduzir um novo gene, efectuou-se a clonagem da cassete de expressão BamHl do pJN261 (figura 4B) no local único BamHl do pJN298 (figura 4C) para se criar o pJN299 (figura 4E).

Construiu-se a cassete 'Ura3-blaster' de P. pastoris recorrendo a uma estratégia semelhante à descrita por Lu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 141-146. Inseriu-se um fragmento de 2,0 kb PstI, Spel de URA3 de P. pastoris nos locais PstI, Xbal de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para se criar o pJN306 (figura 4D). Depois efectuou-se a clonagem de um fragmento de ADN de 0,7 kb Saci, PvuII da grelha de leitura aberta de lacZ, nos locais Saci, Smal para se obter o pJN308 (figura 4D). A seguir à digestão de pJN308 (figura 4D) com PstI e tratamento com polimerase de ADN de T4, o fragmento SacI-PvuII de lacZ que havia sido cortado, com as extremidades a condizer, com polimerase de ADN de T4 foi inserido gerando o pJN315 (figura 4D) . a cassete de lacZ/URA3 foi libertada por digestão com Saci e Sphl, cortada, com as extremidades a condizer, com polimerase de ADN de T4 e foi clonado na estrutura principal de pJN299 que 217 havia sido digerido com Pmel e AflII e cortado, com as extremidades a condizer, com polimerase de ADN de T4 . 0 plasmideo resultante que recebeu a designação de pJN329 (figura 4E).

Criou-se o plasmideo de expressão marcado com HIS4, cortando o pJN261 (figura 4F) com EcoICRI (figura 4F) . Um fragmento de 2,7kb do gene HIS4 de Pichia pastoris, que havia sido amplificado utilizando OS iniciadores GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGA-CTGACTCACTGATAATA AAAATACGG (SEQ ID NO: 39) e GGGCGCGTATTTAAA-TACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTA AAATCTCTAA (SEQ ID NO: 40), cortado com NgoMiV e Swal e depois ajustado com as extremidades a condizer utilizando polimerase de ADN de T4, foi então ligado no local aberto. O plasmideo recebeu a designação de pJN337 (figura 4F). Para se construir um plasmideo com um local de clonagem múltiplo adequado para a construção de uma biblioteca de fusão, cortou-se pJN337 com Notl e Pacl e os dois oligonucleótidos GGCCGCCTGCAGATTTAAAT-GAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEQ ID NO: 41) e TAAGGCGCGCCGAATT-CATTTAAATCTGCAGGGC (SEQ ID NO: 42) que haviam sido hibridados in vitro, foram ligados dentro dos locais abertos, criando o pJN347 (figura 4F).

Para se criar uma estirpe com inactivação de ochl, contendo múltiplos marcadores auxotróficos, fez-se digerir 100 pg de pJN329 com Sfil e utilizou-se para transformar a estirpe JC308 de P. pastoris (Cereghino et al. (2001) Gene 263: 159-169), por electroporação. Após a transformação, as placas isentas de URA ficaram a incubar à temperatura ambiente durante 10 dias. Foram retiradas mil (1000) colónias e novamente aplicadas em riscas. Todos 1000 clones foram 218 então aplicados em riscas dobre 2 conjuntos de placas sem URA. Manteve-se um dos conjuntos a incubar à temperatura ambiente, ao passo que o segundo conjunto ficou a incubar a 37°C. Os clones que foram incapazes de crescerem a 37°C, mas que cresceram à temperatura ambiente, foram sujeitos a PCR de colónias para se testar a inactivação correcta de OCHI. Um clone que apresentou o sinal esperado de PCR (cerca de 4,5 kb) recebeu a designação de YJN153. EXEMPLO 5

Caracterização da biblioteca combinatória de localização/ /manosidases

Os transformantes positivos (exemplo 4) rastreados por PCR de colónias que confirmara a integração da construção de manosidase no genoma de P. pastoris ficaram depois a crescer à temperatura ambiente em 50 mL de BMGY (meio complexo com metanol e tamponado, contendo 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6,0, 1,34% de base azotada de levedura, 4X10~S% de biotina e 1% de glicerol, como meio de crescimento) até se obter o valor D06oonm igual a 2-6, momento em que foram lavados com BMMY 10 mol (meio complexo com metanol e tamponado, contendo 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6,0, 1,34% de base azotada de levedura, 4X10“5% de biotina e 1,5% de metanol), antes da indução da proteína repórter durante 24 horas à temperatura ambiente em 5 mL de BMMY. Subsequentemente, isolou-se a proteína repórter e analisou-se conforme descrito no exenqplo 3 para se 219 caracterizar a sua estrutura de glicanos. Utilizando os péptidos de endereçamento do quadro 6, os dominios catalíticos de manosidase localizados quer no RE quer no Golgi, revelaram um nível significativo de rectificação de um glicano que continham predominantemente Man8GlcNAc2 para proporcionar um glicano que continha predominantemente

Man5GlcNAc2. Isto é evidente quando a estrutura de glicano da glicoproteína repórter é objecto de comparação entre a da estirpe de P. pastoris com a inactivação de ochl nas Figuras 5C e 6C e a mesma estirpe transformada com construções de manosidase de M. musculus conforme ilustrado nas figuras 5D, 5E, 6D-6F. As figuras 5 e 6 ilustram a expressão de construções geradas a partir da biblioteca combinatória de ADN que apresenta uma significativa actividade de manosidase em P. pastoris. A expressão de pGC5 (MNS1( m) de

Sacchâromyces/manosidase ib Δ99 de murganho) (figuras 5D e 6E) produziu uma proteína que tem aproximadamente 30% de todos os glicanos rectificados para proporcionarem Man5GlcNAc2, ao passo que a expressão de pFB8 (SEC12(m) de Saccharomyces/ manosidase ΙΑ Δ187 de murganho) (figura 6F) produziu aproximadamente 50% de Man5GlcNAc2 e a expressão de pBC18-5 (VANl(s) de Saccharomyces/manosidase IB Δ80 de C. elegans) (Figura 5E) produziu 70% de Man5GlcNAc2. EXEMPLO 6

Rectificação in vivo pela a-1,2-manosidase 220

Para se garantir que as novas estirpes geneticamente manipuladas do exemplo 4 produziram realmente a desejada estrutura de Man5GlcNAc2 in vivo, foram testados sobrenadantes celulares para se pesquisar a actividade de manosidase (ver as figuras 7-9). Para cada construção/estirpe hospedeira adiante descritos, efectuou-se uma HPLC a 30°C numa coluna de 4,0 mm x 250 mm da 'Altech' (Avondale, PA, USA) carregada com resina Econosil-NH2 (5 pm) com um caudal de 1,0 mL/minuto durante 40 minutos. Nas figuras 7 e 8 mostra-se que ocorreu a degradação da Man9GlcNAc2 [b] padrão, tendo como resultado um pico que está correlacionado com Man8GlcNAc2. Na figura 7, a eluição da Man9GlcNAc2 [b] padrão ocorreu ao fim de 24,61 minutos e a eluição de Man5GlcNAc2 [a] ocorreu ao fim de 18,59 minutos. Na figura 8, a eluição de Man9GlcNAc2 ocorreu ao fim de 21,37 minutos e a eluição de Man5GlcNAc2 ocorreu ao fim de 15,67 minutos. Na figura 9 observa-se que a eluição da Man8GlcNAc2 [b] padrão ocorreu ao fim de 20,88 minutos.

As células de P. pastoris que contêm o plasmideo pFB8 {SEC12{m) de Saccharomyces/manosidase ΙΑ Δ187 de murganho) ficaram a crescer a 30°C em meio BMGY até um valor de D06oo igual a cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para meio BMMY para se induzir a produção de K3 (kringle 3 do plasminogénio humano) sob o controlo de um promotor AOXl. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para se obter um sobrenadante praticamente límpido. Removeu-se uma aliquota do sobrenadante para os ensaios de manosidase e utilizou-se a parte restante para recuperar ο K3 solúvel segregado. Um 221 único passo de purificação, por cromatografia sobre ' CM-sepharose' e com um gradiente de eluição de NaAc 25mM, pH 5,0 para NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1M, permitiu obter um K3 com uma pureza de 95% cuja eluição ocorreu para valores de NaCl entre 300-500 mM. A análise dos N-glicanos obtidos a partir de K3 está ilustrada na figura 6F. Foi testada ainda, a aliquota do sobrenadante retirada mais cedo, para se pesquisar a presença da actividade de manosidase segregada. Acrescentou-se um padrão, existente nos circuitos comerciais, de oligomanose 9A do tipo ligada a N, marcada com 2-aminobenzamida (Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) às seguintes preparações: BMMY (figura 7A), ao sobrenadante da aliquota referida anteriormente (figura 7B) e a BMMY contendo 10 ng, na concentração de 75 mU/mL de a-1,2-manosidase proveniente de Trichoderma reesei (obtida a partir de Contreras et ai., WO 02/00856 A2) (figura 7C) . Após incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, efectuou-se a análise das amostras por HPLC carregada com silica contendo grupos amino, para se determinar a intensidade de rectificação da manosidase.

Foram igualmente desenvolvidas e testadas células de P. pastoris contendo o plasmideo pGC5 (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidase IB Δ99 de murganho). As células desenvolveram-se à temperatura ambiente em meio BMGY até se obter um valor de D060o igual a cerca de 10. Efectuou-se a colheita das células por centrifugação, tendo sido transferidas para meio de BMMY para se induzir a produção de K3 sob o controlo de um promotor AOXl. Após 24 horas de indução, efectuou-se a remoção das células por centrifugação 222 para se obter um sobrenadante praticamente límpido. Removeu-se uma aliquota do sobrenadante para os ensaios de manosidase e utilizou-se a parte restante para recuperar ο K3 solúvel segregado. Um único passo de purificação, por cromatografia sobre ' CM-sepharose' e com um gradiente de eluição de NaAc 25mM, pH 5,0 para NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1M, permitiu obter um K3 com uma pureza de 95% cuja eluição ocorreu para valores de NaCl entre 300-500 mM. A análise dos N-glicanos obtidos a partir de K3 está ilustrada na £igura 5D. Foi testada ainda, a aliquota do sobrenadante retirada mais cedo, para se pesquisar a presença da actividade de manosidase segregada, conforme ilustrado na figura 8B. Acrescentou-se um padrão, existente nos circuitos comerciais, de Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) às seguintes preparações: BMMY (figura 8A) , ao sobrenadante da aliquota referida anteriormente (figura 8B) e a BMMY contendo 10 ng, na concentração de 75 mU/mL de (X-1,2-manosidase proveniente de Trichoderma reesei (obtida a partir de Contreras et al., WO 02/00856 A2) (figura 8C). Após incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, efectuou-se a análise das amostras por HPLC carregada com sílica contendo grupos amino, para se determinar a intensidade de rectificação da manosidase.

Utilizou-se Man9-2-AB como substrato e é evidente que após 24 horas de incubação a actividade de manosidase estava virtualmente ausente no sobrenadante do produto de digestão da estirpe pFB8 (SEC12(m) de Saccharomyces/ manosidase IA Δ187 de murganho) (figura 7B) e do produto de digestão da estirpe pGC5 {MNS1(m) de Saccharomyces/ manosidase IB Δ99 de 223 murganho) (figura 8B), ao passo que o controlo positivo (a-1,2-manosidase purificada, proveniente de T. reesei, obtida em Contreras) proporciona a conversão completa de Man9GlcNAc2 em Man5GlcNAc2 nas mesmas condições, conforme ilustrado nas figuras 7C e 8C. Isto é um resultado conclusivo que mostra a rectificação de manosidase in vivo na estirpe pGC5 de P. pastoris; e também na estirpe pFB8, que é totalmente diferente daquilo que tem sido afirmado até ao momento presente (Contreras et al., WO 02/00856 A2). A figura 9 documenta melhor a localização e a actividade da enzima manosidase. Deixou-se desenvolver uma estirpe de P. pastoris que contém o pBC18-5 (VANl(s) de Saccharomyces/manosidase IB Δ80 de C. elegans) a temperatura ambiente em meio BMGY até se obter um valor de D06oo igual a cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para meio BMMY para se induzir a produção de K3 sob o controlo de um promotor AOXl. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para se obter um sobrenadante praticamente limpido. Removeu-se uma aliquota do sobrenadante para os ensaios de manosidase e utilizou-se a parte restante para recuperar ο K3 solúvel segregado. Um único passo de purificação, por cromatografia sobre ' CM-sepharose' e com um gradiente de eluição de Na Ac 25 mM, pH 5,0 para NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1M, permitiu obter um K3 com uma pureza de 95% cuja eluição ocorreu para valores de NaCl entre 300-500 mM. A análise dos N-glicanos obtidos a partir de K3 está ilustrada na figura 5E. Foi testada ainda, a aliquota do sobrenadante retirada mais cedo, para se 224 pesquisar a presença da actividade de manosidase segregada, conforme ilustrado na figura 9B. Acrescentou-se um padrão, existente nos circuitos comerciais, de ManB-2-AB (Glyko, Novato, CA) às seguintes preparações: BMMY (figura 9A), ao sobrenadante da aliquota anterior de pBC18-5 (VANl(s) de Saccharomyces / manosidase IB Δ80 de C. elegans) (figura 9B), e a BMMY contendo meios provenientes de uma construção de fusão diferente pDD28-3 (MNN10(m)de Saccharomyces (da SwissProt 50108)/manosidase IB Δ99 de H. sapiens) (figura 9C) . Após incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, efectuou-se a análise das amostras por HPLC carregada com sílica contendo grupos amino, para se determinar a intensidade de rectificação da manosidase. A figura 9B ilustra a actividade de manosidase intracelular comparativamente com a de uma construção de fusão pDD28-3 {MNNlO{m) de Saccharomyces / manosidase IB Δ99 de H. sapiens) que apresenta um resultado negativo (figura 9C). EXEMPLO 7

Ensaio de pH óptimo de a-1,2-manosidase manipulada geneticamente

Deixou-se desenvolver células de P. pastoris contendo o plasmídeo pBB27-2 (MNN10(s) de Saccharomyces (da SwissProt 50108)/manosidase IB Δ31 de C. elegans) à temperatura ambiente em meio BMGY até um valor de D06oo igual a cerca de 17. Com cerca de 80 pL destas células fez-se uma inoculação em 600 pL de BMGY, tendo as células ficado a desenvolver-se 225 de um dia para o outro. Depois, efectuou-se a colheita das células por centrifugação, tendo sido transferidas para meio BMMY para se induzir a produção de K3 (kringle 3 do plasminogénio humano) sob o controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de indução, efectuou-se a remoção das células por centrifugação para proporcionar um sobrenadante praticamente limpido (pH 6,43). Removeu-se o sobrenadante para os ensaios de valor óptimo de pH da manosidase. Acrescentou-se Man8GlcNAc2 (0,5 pg), marcado com fluorescência, a 20 pL de sobrenadante ajustado para diversos valores de pH (figura 11) e manteve-se tudo a incubar durante 8 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, analisou-se a amostra por HPLC, utilizando uma coluna de 4,6 mm X 250 mm contendo 'Econosil NH2', esférulas de 5 pm e sílica ligada a grupos amino (Altech, Avondale, PA). Os caudais foram de 1,0 mL/minuto for 40 minutos tendo a coluna sido mantida a 30°C. Após eluição isocrática (68% A:32% B) durante 3 minutos, utilizou-se um solvente em gradiente linear (68% A:32% B até 40% A:60% B) durante 27 minutos para eluição dos glicanos (18) . Solvente A (acetonitrilo) e solvente B (formato de amónio, 50 mM, pH 4,5). Equilibrou-se a coluna com solvente (68% A:32% B) durante 20 minutos entre experiências. EXEMPLO 8

Manipulação genética de P. pastoris para a produção de N-glicanos com a estrutura 61cNAcMan5GlcNAc2 É necessário a actividade da transferase de GlcNAc para a maturação dos N-glicanos complexos e híbridos (patente de 226 invenção norte-americana n° 5 834 251) . A Man5GlcNAc2 pode ser rectificada pela manosidase II, o que é um passo necessário na formação das glicoformas humanas, após a adição de N-acetil-glucosamina ao terminal do residuo a-1,3 manose do tronco principal da trimanose por acção da transferase I da GlcNAc (Schachter, 1991 Glycobiology 1 (5) : 453-461). Assim sendo, preparou-se uma biblioteca combinatória de adn, contendo fragmentos de ADN que codificam domínios catalíticos, adequadamente encaminhados, dos genes da transferase I de GlcNAc provenientes de C. elegans e de Homo sapiens; e sequências de localização provenientes de GLS, MNS, SEC, MNN9, VAN1, ANPl, H0C1, MNN10, MNNll, MNTl, KTR1, KTR2, MNN2, MNN5, YURI, MNNl e MNN6 oriundas de a-1,2-manosil-transferases putativas de S. cerevisiae e de P. pastoris, com base na homologia obtida a partir de S. cerevisiae: D2, D9 e J3, que são homólogos de KTR. 0 quadro 10 compreende, mas sem que isso seja um factor limitativo para as sequências dos péptidos de endereçamento, sequências tais como as de SEC e OCH1, de GnTl de P. pastoris e de K. lactis (ver o quadro 6 e o quadro 10)

Quadro 10. Biblioteca combinatória representativa de domínios catalíticos / sequências de péptidos de endereçamento para a UDP-N-acetil-glucosaminil-transferase I (GnTl) 227 Péptido de endereçamento OCHI(s) OCHI(m) OCHI(1) MNN9(s) MNN9(m) Humano, GnTI, Δ38 PB105 PB106 PB107 PB104 N/A Humano, GnTI, Δ86 NB12 NB13 NB 14 NB 15 NB 0 ϋ C. elegans, GnTI, OA12 OA13 OA14 OA15 OA16 •H J-> Ή Δ88 1—1 rçj C. elegans, GnTI, PAI 2 PAI 3 PAI 4 PAI 5 PAI 6 4-) <c ϋ Δ35 0 C. elegans, GnTI, PB12 PB13 PB14 PB15 PB16 c Ή £ Δ63 0 Q X. leavis, GnTI, QA12 QA13 QA14 QA15 QA16 Δ33 X. leavis, GnTI, QB12 QB13 QB14 QB15 QB16 Δ103

As sequências dos péptidos de endereçamento foram seleccionadas a partir de OCHI em p. pastoris (compridas, médias e curtas) (ver o exemplo 4) e de MNN9 (SwissProt P39107) em S. cerevisiae (curtas e médias). Os domínios catalíticos foram seleccionados a partir de GnTI humana com delecção dos aminoácidos 38 e 86 do terminal N, a partir de GnTI de C. elegans (gli-12) com delecção dos aminoácidos 35 e 63 amino e também a partir de GnTI de C. elegans (gli-14) com delecção do aminoácido 88 do terminal N e ainda a partir de GnTI de X. leavis com delecção dos aminoácidos 33 e 103 do terminal N, respectivamente.

Amplificou-se por PCR uma parte do gene que codifica a N-acetil-glucosaminil-transferase I (mgati, n° de admissão NM002406), ao qual lhe faltam os primeiros 154 pb, utilizando como molde os oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGCGCCTCAGTC- 228 AGCGCTCTCG-3' (SEQ ID NO: 43) e 5'-AGGTTAATTA AGTGCTA-ATTCCAGCTAGG-3' (SEQ ID NO: 44) e o vector pHG4.5 (ATCC n° 79003). O produto de PCR resultante foi clonado em pCR2.1-TOPO e confirmou-se a sequência correcta. Após a digestão com Asei e Pacl inseriu-se o GnTI truncado no plasmideo pJN346 para se criar o pNA. Após a digestão de pJN271 com Notl e Asclf a inserção de 120 pb foi ligada dentro do pNA para se gerar uma fusão concatenada do domínio transmembranar de MNN9 com a GnTI, criando o pNAl5. O organismo hospedeiro é uma estirpe de P. pastoris que é deficiente em hipermanosilação (v.g., é um mutante ochl), proporciona o substrato UDP-GlcNAc no Golgi e/ou no RE (isto é, contém um transportador funcional UDP-GlcNAc) e proporciona N-glicanos de estrutura Man5GlcNAc2 no Golgi e/ou no RE (v.g., pFB8 P. pastoris (SEC12(m) de Saccharomyces / manosidase ΙΑ Δ187 de murganho) referido antes). Em primeiro lugar, transformou-se o pFB8 de P. pastoris com pPBl03 contendo o gene MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AF106080) (que codifica o transportador de UDP-GlcNAc) clonado no local BamHI e BglII do plasmideo pBLADE-SX (Cereghino et al., Gene (2001) 263: 159-169). Depois transformou-se a biblioteca combinatória de ADN supramencionada, que codifica uma combinação de genes de GnTI/localização exógenos ou endógenos, tendo sido feita a selecção de colónias que foram analisadas para se pesquisar a presença da construção de GnTI por PCR de colónias. A eficiência da nossa transformação e da integração está geralmente acima de 80% e o rastreio por PCR pode ser omitido 229 logo que tenham sido estabelecidos parâmetros de transformação robustos.

Dito de forma abreviada, os métodos da invenção geram estirpes de P. pastoris que produzem GlcNAcMan5GlcNAc2 com um elevado rendimento, conforme ilustrado na figura 10B. Pelo menos 60% dos N-glicanos são GlcNAcMan5GlcNAc2. Até ao momento presente, não há nenhum relato que descreva a formação de GlcNAcMan5GlcNAc2 nas glicoproteinas solúveis segregadas em qualquer levedura. Os resultados aqui apresentados comprovam que a adição do transportador de UDP-GlcNAc, conjuntamente com a actividade de GnTl, produzem uma estrutura predominante de GlcNAcMan5GlcNAc2, que é confirmada pelo pico para o valor m/z igual a 1457 (figura 10B).

Construção da estirpe PBP-3 A estirpe de P. pastoris que expressa ο K3 (Aochl, arg-, ade-, his-) foi transformada sucessivamente com os vectores a seguir indicados. Em primeiro lugar, transformou-se o pFB8 (SEC12{m) de Saccharomyces / manosidase ΙΑ Δ1887 de murganho) na estirpe de P. pastoris por electroporação. Em segundo lugar, o pPBl03 que continha o gene MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AF106080) (que codifica o transportador de UDP-GlcNAc), clonado no plasmideo pBLADE-SX (Cereghino et ai. (2001) Gene 263: 159-169), digerido com as enzimas BamHI e

BglII, foi transformado dentro da estirpe de P. pastoris. Em terceiro lugar, o pPBl04 que contém o MNN9{s) de

Saccharomyces/GnTl Δ38 humano que codifica o gene clonado 230 como fragmento de Notl-PacI dentro do pJN336 foi transformado dentro da estirpe de P. pastoris. EXEMPLO 9

Manipulação genética de células de K. lactis para a produção de N-glicanos com a estrutura Man5GlcNAc2

Identificação e desmembramento do gene OCHl de K. lactis O gene OCHl da levedura S. cerevisiae em fase germinativa codifica uma 1,6-manosil-transferase que é responsável pela adição de manose, localizada no Golgi proximal, à estrutura Man8GlcNAc2 dos N-glicanos nas proteínas segregadas (Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem.; 268 (35): 26338-45). Esta transferência de manose é geralmente reconhecida como sendo o passo inicial determinante na polimanosilação, específica de fungos, das estruturas de N-glicanos (Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (35): 26338-26345; Nakayama et al. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19; Morin-Ganet et al., Traffic 1(1): 56-68, (Janeiro de 2000)) . A delecção deste gene em S. cerevisiae tem como resultado uma estrutura de N-glicanos significativamente mais curta, que não inclui esta polimanosilação típica ou um defeito de crescimento a temperaturas elevadas (Nakayama et al. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19).

Efectuou-se o alinhamento da sequência de Ochlp de S. cerevisiae com sequências homólogas de Candida albicans (Genbank, n° de admissão AAL49987) e de P. pastoris conjuntamente com proteínas Hocl de S. cerevisiae (Neiman et 231 al. (1997) Genetics 145(3): 637-45 e K. lactis (base de dados PENDANT EST), que são manosil-transferases congéneres, mas distintas. As regiões de elevada homologia que eram comuns entre os homólogos de Ochlp mas distintas dos homólogos de Hoclp, foram utilizadas para conceber pares de iniciadores degenerados que foram dirigidos contra o ADN genómico da estirpe MGl/2 de K. lactis (Bianchi et al., Current Genetics 12: 185-192 (1987)). A amplificação por PCR, com os iniciadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG) (SEQ ID NO: 45) e RCD34 (CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA) (SEQ ID NO: 46) originou um produto de 302 pb que foi clonado e sequenciado, tendo-se confirmado que a tradução prevista apresentava um grau elevado de homologia com as proteínas Ochl (>55% no caso de Ochl de S. cerevisiae) .

Utilizou-se o produto de PCR de 302 pb como sonda hibridante num Southern blot de ADN genómico proveniente da estirpe (MGl/2) de K. lactis, em condições de restrigência elevada (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Observou-se a hibridação num padrão consistente com um único gene, o que indica que o segmento de 302 pb corresponde a uma parte do genoma de K. lactis e que a estirpe K. lactis (KIOCH1) contém uma única cópia do gene. Para se clonar todo o gene KIOCHl, utilizou-se Southern Blot para mapear o local genómico. Assim sendo, efectuou-se a clonagem de fragmento de 5,2 kb BamRI/PstI, fazendo digerir o ADN genómico e ligando os fragmentos com dimensões da ordem dos 5,2 kb dentro do pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para se criar uma biblioteca subgenómica de K. lactis. Esta 232 biblioteca subgenómica foi transformada dentro de E. coli e foram testadas várias centenas de clones, por PCR de colónias, utilizando os iniciadores RCD 33/34. Efectuou-se a sequenciação do clone de 5,2 kb que contém o gene KI0CH1 previsto e definiu-se uma grelha de leitura aberta de 1362 pb que codifica uma proteina prevista que é 46,5% idêntica ao gene OCHl de S. cerevisiae. Utilizou-se a sequência de 5,2 kb para produzir iniciadores para a construção de um alelo de delecção ochl::KANR, utilizando um método de sobreposição na PCR (Davidson et al. (2002) Microbiol. 148 (Pt 8): 2607-15). Este alelo obtido por delecção foi transformado dentro das estirpes de K. lactis tendo sido seleccionadas as colónias resistentes a G418. Estas colónias foram rastreadas simultaneamente por PCR e pela sensibilidade à temperatura para se obter uma estirpe com delecção de OCHl ORF. Os resultados da experiência mostram estirpes que revelaram um padrão mutante na PCR, as quais foram caracterizadas por análise de crescimento a diversas temperaturas e por análise dos hidratos de carbono dos N-glicanos, efectuadas sobre proteínas das paredes celulares e segregadas, após a digestão com PNGase. A mutação ochl conferiu uma sensibilidade à temperatura que permitiu que as estirpes crescessem a 30°C, mas não a 35°C. A figura 12 ilustra uma análise por MALDI-TOF de uma estirpe de K. lactis de tipo selvagem que produz N-glicanos de estrutura Man8GlcNAc2 [c] e superiores. 233

Identificação, Clonaqem e desmembramento do gene MNNl de K, lactis 0 MNN1 de S. cerevisiae é o gene estrutural para a a-1,3-manosil-transferase do Golgi. 0 produto de MNNl é uma proteína da membrana de tipo II com 7 62 aminoácidos (Yip et al.f Proc Natl Acad Sei USA. 91(7): 2723-7 (1994)). A ambos os oligossacarídeos ligados a Ne ligados a 0, isolados a partir dos mutantes mnnl, faltam-lhes as ligações de (X-1,3-manose (Raschke et al.t J Biol Chem. 248 (13): 4660-66 (10 de Julho de 1973)).

Utilizou-se a sequência de Mnnlp, proveniente de S. cerevisiae, para pesquisar as sequências genómicas traduzidas de K. lactis (PEDANT). Identificou-se uma sequência de ADN de 405 pb que codifica um fragmento de uma proteína putativa com uma similaridade significativa com Mnnlp. Depois utilizou-se um segmento interno desta sequência que foi amplificado por PCR com os iniciadores KMNl (TGCCATCTTTTAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEQ ID NO: 47) e KMN2 (GATCCCACGACGCATCGTATTTCTTTC) (SEQ ID NO: 48), tendo sido utilizado como sonda hibridante num Southern Blot de ADN genómico proveniente da estirpe (MG1/2) de K. lactis. Com base nos dados de hibridação por Southern Blot, efectuou-se a clonagem de um fragmento de 4,2 kb de BamHI-PstI, mediante a geração de uma biblioteca de dimensões seleccionadas, conforme aqui descrito. Um único clone contendo o gene MNNl de K. lactis foi identificado por PCR de colónias, utilizando os iniciadores KMNl (SEQ ID NO: 47) e KMN2 (SEQ ID NO: 48), sendo depois sequenciado. Dentro deste clone foi identificado um ORF de 2241 pb que codifica uma 234 proteína prevista que era 34% idêntica ao gene MNN1 de S. cerevisiae. Os iniciadores foram concebidos para construção de um alelo por delecção mnnl::NATR, utilizando o método de sobreposição da PCR (Davidson et al. (2002) Microbiol. 148 (Pt 8) : 2607-15) .

Este alelo do desmembramento foi transformado dentro de uma estirpe de K. lactis por electroporação, tendo sido seleccionados os transformantes resistentes à nourseotricina, subsequentemente amplificados por PCR para inserção homóloga do alelo de desmembramento., As estirpes que revelaram um padrão de PCR mutante podem ser submetidas a uma análise de hidratos de carbono dos N-glicanos de um gene repórter conhecido. A figura 12B ilustra os N-glicanos provenientes da estirpe de K. lactis, por delecção de ochl mml observada após a digestão com PNGase, pelo método de MALDI-TOF, conforme aqui descrito. O pico predominante para o valor m/z igual a 1908, identificado por [d], é consistente com a massa de Man9GlcNAc2. Há outros métodos e reagentes que podem ser utilizados nos métodos para modificar a glicosilação, descritos na literatura, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° 5 955 422, na patente de invenção norte-americana n° 4 775 622, na patente de invenção norte-americana n° 6 017 743, na patente de invenção norte-americana n° 4 925 796, na patente de invenção norte-americana n° 5 766 910, na patente de invenção norte-americana n° 5 834 251, na patente de invenção norte-americana n° 5 910 570, na patente de invenção norte-americana n° 5 849 904, na patente de invenção norte-americana 235 η° 5 955 347, na patente de invenção norte-americana n° 5 962 294, na patente de invenção norte-americana n° 5 135 854, na patente de invenção norte-americana n° 4 935 349, na patente de invenção norte-americana n° 5 707 828 e na patente de invenção norte-americana n° 5 047 335. É possível obter sistemas de expressão de leveduras adequados a partir de fontes tais como a Colecção Americana de Culturas Tipo, Rockville, MD. Nos circuitos comerciais há vectores disponíveis a partir de diversas fontes. EXEMPLO 10

Estirpes, condições de cultura e reagentes

Na prática dos exemplos seguintes, foram utilizadas as estirpes, as condições de cultura e os reagentes adiante indicados. Nas experiências com adn recombinante foram utilizadas as estirpes TOPIO ou DH5oí de Escherichia coli. A expressão de proteínas foi efectuada à temperatura ambiente de acordo com a metodologia da placa de 96 microcavidades tamponada com meio complexo contendo glicerol (BMGY) constituído por 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, tampão fosfato de potássio 100 mM, a pH 6,0, 1,34% de base azotodada de leveduras, 4 x 10~5% de biotina e 1% de glicerol, que serviu de meio de crescimento. O meio de indução foi tamponado com meio complexo contendo metanol (BMMY), em que havia 1,5% de metanol em vez do glicerol do meio BMGY.

As enzimas de restrição e de modificação foram obtidas em 'New England BioLabs' (Beverly, MA). 236

Os oligonucleótidos foram obtidos nas instituições 'Dartmouth College Core' (Hanover, NH) ou 'Integrated DNA Technologies' (Coralville, IA). EXEMPLO 11

Clonagem e geração de vectores de expressão para a +produção de Man3GlcNAc2

As enzimas de restrição e de modificação foram obtidas em 'New England BioLabs' (Beverly, MA) . 0 vector de trânsito pVM2 foi gerado a partir de pUC19 por PCR inversa (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989), na obra: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press), utilizando respectivamente os iniciadores VJM104 e VJM106 (5'-GCGGCCGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACT-3' (SEQ ID NO: 107) e 5'-GGGGCGCGCCTTAATTAACGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT-3' (SEQ ID NO: 108); os locais de restrição introduzidos NotI, Asei e PacI estão sublinhados). O plasmideo restituído pJN285 é um derivado do plasmideo reactivado pJN266 que foi construído da maneira a seguir indicada. Amplificou-se por PCR um fragmento de 0,9 kb da região PpKEKl-5', utilizando os iniciadores Kex55 (5'-GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCAGA-3’, SEQ ID NO: 27) e Kex53 (5'-GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAG-GCTGACACCGCTACTA-3', SEQ ID NO: 28) obtidos a partir de ADN genómico de Pichia pastoris, tendo sido clonados em pUCl9 digerido com Saci e SalI. 0 plasmideo resultante foi cortado com BamEI e Sall e fez-se a clonagem de um fragmento de 0,8 kb da região KEXl-3', que havia sido amplificada utilizando 237 OS iniciadores Kex35 (5·-CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAG-TGTACAACTCTTCCC ACATGG-3' , SEQ ID NO: 29) e Kex33 (5'-GGACG-CGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGA CTCTTTTC-3' , SEQ ID NO: 30), no pJN262 digerido com as mesmas enzimas. Este plasmideo foi cortado com BamHI e inseriu-se o fragmento de 3,8 kb de pNKY51 (1), obtido com BamRI-BglIIr em cada uma das duas orientações possíveis, daí resultando os plasmídeos pJN263 e pJN264. Para se criar uma cassete de expressão com os locais de clonagem NotI e PacI, amplificou-se o promotor GAPDH de P. pastoris, utilizando os iniciadores Gap5 (5'-CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT-3', SEQ ID NO: 31) e Gap3 (5'-GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA-3' , SEQ ID NO: 32) e O plasmideo pGAPZ-A (Invitrogen) como molde, tendo a clonagem sido feita nos locais BamHi-Sphi do pUCl9. O plasmideo resultante foi cortado com Spel e Sphl e a região do terminador transcricional CYC1 de S. cerevisiae, que havia sido amplificada a partir de pPlCZ-A (Invitrogen), utilizando os iniciadores Cyc5 (5'-CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGC-GGCCCACGGGTCCCA-3', SEQ ID NO: 33) e Cyc3 (5' -GGACATGCATG CGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC CC-3', SEQ ID NO: 34), foi clonada nos locais abertos, criando o pJN261. A cassete de expressão GAPDH/CYCl foi libertada por digestão com BamHI e clonada quer no pJN263 daí resultando o plasmideo pJN265, quer no pJN264, daí resultando os plasmídeos pJN266 e pJN267 (consoante a orientação da inserção). Depois disso, cortou-se o plasmideo pJN266 com NgoM.iv e SwaI para libertar a cassete 'URA-blaster', e efectuou-se a clonagem de um fragmento de NgoMIV-SwaI que continha o gene PpHIS4, que 238 havia sido amplificado a partir do pPIC3.5 (Invitrogen), utilizando os iniciadores JNHIS1 (5'-GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATC-TCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG-3' , SEQ ID NO: 39) e JNHIS2 (5'-GGGCGCGTATTTAAA TACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGT-TAAAATCTCTAA-3', SEQ ID NO: 40), nos locais abertos para se criar o pJN285. O vector de expressão pJN348 baseia-se no plasmideo pBLURA-SX (2). Em primeiro lugar, efectuou-se a clonagem de um fragmento de BamEI, que continha a cassete de expressão GAPDH/CYC1 proveniente do vector pJN261 no pBLURA-SX que havia sido cortado com BamEI e Bglii para se criar o plasmideo pJN338. Subsequentemente, cortou-se este último plasmideo com NotI e PacI e os dois oligonucleótidos ExprI (5'-GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT-3', SEQ ID NO: 41) e Expr2 (5'-TAAGGCGC(^GAATTCATTTAAATCTGCAGGGC-3' (SEQ ID NO: 42), em que o local de restrição Asei está sublinhado) que haviam sido recombinados in vitro, foram ligados nos locais abertos para se criar o pJN348. O vector de expressão pPBl24 foi construído em vários passos, com base no vector pBLADE-SX descrito por Cereghino et al. Gene 263 (2001) 159-169. Em primeiro lugar, efectuou-se a clonagem do fragmento de BamHI, que contém a cassete de expressão GAPDH/CYCl, proveniente do vector pJN261 (conforme descrito por Choi et al. Proc Natl Acad Sei USA., 29 de Abril de 2003; 100(9): 5022-7) no vector pBLADB-SX após digestão com BamHI-BglII. A seguir, substituiu-se o fragmento de Xhol-Notl, contendo o promotor GAPDH de P. pastoris, com o promotor do gene PMAl de P. pastoris que foi amplificado com os iniciadores PMAl (5'-TTCCTCGAGATTCAAGCGAATGAGAATAATG-3', 239 SEQ ID NO: 109) e PMA2 (5'-TTGCGGCCGCGAAG TTTTTAAAGGAAAGAG-ATA-3', SEQ ID NO:110). O vector resultante foi então digerido com as enzimas Xbal-BamHI para remoção do marcador ADE1 e, após a reacção de repleção, foram ligados com 0 fragmento de BglII-SacI cortado com as extremidades a condizer, que continha o marcador da resistência à nourseotricina, proveniente do vector pAG25 (Goldstein e McCusker, Yeast ., Outubro de 1999; 15(14) : 1541 -53) . EXEMPLO 12

Geração das fusões de sinais de localização/domínios catalíticos de manosidase I

Amplificação da manosidase IA de murganho. A sequência do gene que codifica o domínio catalítico da manosidase IA de murganho (Genbank: NM_008548, Lai e Moremen 1994) foi amplificada a partir de ADNc de fígado de murganho (Clontech). Dito de forma abreviada, foram utilizados o iniciador directo mMIAA187-AscI e o iniciador inverso mMlA-Pacl (5'-GGCGCGCCGAGCCCGCTGACGCCACCATCCGTGAGAAGAGG GC~3', (SEQ ID NO: 111) e 5’-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTG TTCACGG-3' (SEQ ID NO: 26), respectivamente, estando sublinhados os locais de restrição Asei e Pacl introduzidos) para amplificar os aminoácidos 188-655 do ORF da manosidase IA de murganho, proveniente do ADNc do fígado de murganho (Clontech) com polimerase do ADN de Pfu (Stratagene) . As condições utilizadas do protocolo de amplificação foram: 94°C durante 1 minuto, 1 ciclo; 94°C durante 30 segundos; 68°C durante 30 segundos, 72°C durante 3 minutos, 30 ciclos. Seguidamente, acrescentou-se 1 pL de polimerase de ADN de Taq 240 (Promega) e manteve-se a mistura de reacção a incubar a 72°C durante 10 minutos, tendo o produto de 1,4 kb sido ligado no pCR.2.1, proporcionando o plasmideo pSH9. Após a confirmação do produto de PCR pela técnica de sequenciação terminal 'Taq DyeDeoxy', fez-se digerir a manosidase IA de murganho com as enzimas de restrição Asei e PacI antes da suclonagem no vector pVM2, digerido com as mesmas enzimas de restrição, gerando o plasmideo pSH21.

Para facilitar a subsequente localização da manosidase IA truncada de murganho no Golgi da levedura, amplificou-se uma região da proteina Secl2 de S. cerevisiae (aminoácidos 331-432 que codificam o dominio transmembranar), com os iniciadores SC125 e SC122 (5' -ATGTGGCGGCGGCCGCCACCA-T GAAC ACTATCCACAT AAT AAAAT T AC CGCTTAACTACGCC-3', (SEQ ID NO: 112) e 5'-GGCGCGCCCCACGCCTAGCACTTTTATGGAATCTACGCTAG GTAC-3' (SEQ ID NO: 113), respectivamente, estão os locais de restrição Notl e Asei sublinhados) na presença de polimerase de ADN de Taq e de ADN genómico de S. cerevisiae, tendo sido produzido o plasmideo pJN305. Após a confirmação do produto de PCR pela técnica de sequenciação terminal 'Taq DyeDeoxy', efectuou-se a subclonagem Secl2, digerido com as enzimas de restrição Notl e Asei, no plasmideo pSH21 digerido com as mesmas enzimas, gerando o plasmideo pSH29. Seguidamente, efectuou-se a subclonagem do fragmento de pSH29 obtido com NotI/PacI, que codifica o fragmento Secl2 concatenadamente com a manosidase IA truncada de murganho, no plasmideo pJN285 digerido com as mesmas enzimas, gerando o plasmideo pFB8. 241 EXEMPLO 13

Geração da construção de manosidase II

Amplificou-se o dominio catalítico de uma manosidase II de Drosophila (GenBank: X77652, Foster e Roberts 1995), que codifica os aminoácidos 75-1108, proveniente do ADNc dos ovários de Drosophila, utilizando polimerase de ADN de ExTaq para as mesmas condições do protocolo de amplificação referidas anteriormente, sendo a hibridação feita a 55°C e com uma duração de 5 minutos. Foram utilizados o iniciador directo dMannIIA74_AscI e o iniciador inverso dMannII_PacI (5'-GGCGCGCCCGCGACGATCCAATAAGACCTCCAC-3' (SEQ ID NO: 69) e 5'-CCTTAATTAATCAGCTTG AGTGACTGCTCACATAAGCGGCGG-3' (SEQ ID NO: 71), respectivamente, os locais de restrição Asei e PacI estão sublinhados). Após a confirmação do produto de PCR pela técnica de sequenciação terminal 'Taq DyeDeoxy', designou-se o plasmideo por pSH214. Seguidamente, removeu-se o fragmento de manosidase II de Drosophila para fora deste plasmideo por digestão com as enzimas de restrição Asei e PacI e fez-se a subclonagem no plasmideo pJN348 digerido com as mesmas enzimas, gerando o plasmideo pSH220.

Para facilitar a localização subsequente do dominio truncado de manosidase II de Drosophila no Golgi, amplificou-se uma região da proteína Mnn2 de S. cerevisiae (aminoácidos 1-36 que codificam o dominio transmembranar) com os iniciadores Mnn25 e Mnn21 (5' -AGTAAAATGCGGCCGCCACCATGCT-GCTTACCAAAAGGTTTTCAAAGC TGTTC-3' (SEQ ID NO: 114) e 5'- GGCGCGCCCCGACGTGTTCTCATCCATGTATTTGTTTGTAA TGAC-3' (SEQ ID NO: 115), respectivamente, os locais de restrição Notl e Asei introduzidos estão sublinhados) na presença de polimerase de 242 ADN de Taq e de ADN genómico de S. cerevisiae, para se obter o plasmídeo pJN281. Após a confirmação do produto de PCR pela técnica de sequenciação terminal 'Tag DyeDeoxy', fez-se digerir o fragmento Mnn2 com as enzimas de restrição Notl e Asei e efectuou-se a subclonagem no plasmídeo pSH220 digerido com as mesmas enzimas, produzindo uma fusão concatenada do sinal de localização de Mnn2 com o domínio catalítico de manosidase II de Drosophila, gerando o plasmídeo pKD53. Determinou-se o pH óptimo deste domínio catalítico de manosidase II de Drosophila com esta manipulação genética e verificou-se que tinha um valor igual a pH 6,2, praticando um ensaio de determinação de pH essencialmente conforme descrito no exemplo 7. EXEMPLO 14

Biblioteca de domínios catalíticos de manosidases II 0 quadro 11 ilustra a biblioteca de domínios catalíticos de manosidases II e de líderes que manifestam actividade. 0 número de sinais ( + ), tal como aqui utilizado, indica os níveis relativos de produção de GlcNAcMan3GlcNA2 como percentagem (%) de glicanos neutros. A notação (-) indica que não houve nenhuma produção aparente de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação ( + ) indica uma produção de menos de 20% de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação ( + + ) indica uma produção de cerca de 20% a 30% de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação (+++) indica uma produção de cerca de 30% a 40% de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação (++++) indica uma produção de cerca de 40% a 50% de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação ( +++++) indica uma produção de mais de 50% de GlcNAcMan3GlcNA2. A notação (NG) indica que não 243 foram detectados nenhuns glicanos a partir das colónias transformadas com a construção de fusão.

Quadro 11. Domínios catalíticos Líderes Manosidase II Δ48 de D. melanogaster Manosidase II Δ99 de D. melanogaster Manosidase II Δ48 de seres humanos Manosidase II Δ74 de D. melanogaster Manosidase II Δ108 de C. elegans Glsl-s ++ - + +++++ +++++ Glsl-m + - - - ++ 244

245

Manojidue ·Γ MariOJ idije II '"Ij Mariojidue II | Hariojidaje II II ώ4δ de D. I Δ33 de D. | Δ4& de jere; I H.?4 de D. elajiígijte r E melariogut-er | Lmíiíjiíj j; melaxiogajter

246

EXEMPLO 15

Geração de construções de expressão de GnTli A construção de um vector (pNAl5) de expressão de GnTI, que contém um gene de GnTI fundido com uma parte do terminal N do gene MNN9 de S. cerevisiae foi descrita anteriormente (Choi et al. Proc Natl Acad Sei USA., 29 de Abril de 2003, 100(9): 5022-27). De uma maneira idêntica, efectuou-se a clonagem do gene de GnTII do rato. O gene de GnTII do rato (GenBank número de admissão U21662) foi amplificado por PCR utilizando polimerase 'Takara EX Taq ' (Panvera) proveniente de uma biblioteca de ADNc de fígado de rato (Clontech) com os 247

iniciadores RATl (5' -TTCCTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3') (SEQ ID NO: 116) e RAT2 (5' -TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3' ) (SEQ ID NO: 117) . O produto da PVCR foi depois clonado dentro do vector pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) e sequenciado. Utilizando este vector como molde, amplificou-se o fragmento de Ascl-PacI de GnTII, que codifica os aminoácidos 88-443, com polimerase 'Pfu Turbo' (Stratagene) com os iniciadores RAT44 e RAT 11 (5' -TTGGCGCGCCTCCCTAGTGTACCAGTTGAACTTTG-3' (SEQ ID NO: 118) e 5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3' (SEQ ID NO: 119) , respectivamente, os locais de restrição Asei e PacI introduzidos estão sublinhados). Após confirmação por sequenciação, o dominio catalítico do GnTII do rato foi então clonado a jusante do promotor PMA1 sob a forma de um fragmento Ascl-PacI no pBPl24. No passo final, o fragmento génico que codifica o sinal de localização de Mnn2 de S. cerevisiae foi clonado a partir do pJN281, sob a forma de um fragmento NotI-AscI, para se gerar uma fusão concatenada com o domínio catalítico de GnTII, para gerar o plasmídeo pTC53. EXEMPLO 16

Expressão da proteína repórter, purificação e libertação de glicanos ligados a N

Utilizou-se o domínio K3, sob o controlo do promotor da álcool-oxidase 1 (A0X1), como modelo de glicoproteína e purificou-se utilizando o identificador hexa-histidina, conforme descrito por Choi et al. Proc Natl Acad Sei USA., 29 de Abril de 2003; 100(9): 5022-7. Os glicanos foram libertados e separados das glicoproteínas mediante uma modificação de um método já anteriormente referenciado (Papac 248 et al. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Depois de as proteínas terem sido reduzidas e carboximetiladas e as membranas terem sido bloqueadas, efectuou-se a lavagem das cavidades três vezes com água. Realizou-se a desglicosilação das proteínas mediante a adição de 30 pL de NH4HCO3 10 mM, a pH 8,3, contendo uma miliunidade de N-glicanase (Glyko). Após incubação durante 16 horas a 37°C, removeu-se por centrifugação a solução que continha os glicanos e evaporou-se até à secura.

Purificação de proteínas

Purificou-se o Kringle 3 utilizando o formato de 96 cavidades de um autómato de manuseamento de amostras 'Beckman BioMek 2000' (Beckman/Coulter Ranch Cucamonga, CA). Purificou-se 0 Kringle 3 a partir dos meios de expressão, utilizando um identificador hexa-histidina no terminal C. A purificação feita pelo autómato é uma adaptação do protocolo criado por Novagen para a sua resina 'HisBind'. Dito de forma abreviada, verte-se um volume de 150 pL de resina nas cavidades de uma placa de 96 cavidades de ligação de lisados, lava-se com 3 volumes de água, carrega-se com 5 volumes de N1SO4 50 mM e lava-se com 3 volumes de tampão de ligação (imidazole 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). Diluiu-se para 3:2 os meios de expressão das proteínas em meios/PBS (P04 60 mM, KC1 16 mM, NaCl 822 mM, pH 7,4) e carrega-se nas colunas. Após o esvaziamento, as colunas são lavadas com 10 volumes de tampão de ligação e com 6 volumes de tampão aquoso (imidazole 30 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9) e faz-se a eluição das proteínas com 6 volumes de tampão de eluição 249 (imidazole 1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9) . As glicoproteínas resultantes da eluição são objecto de evaporação até à secura por liofilização.

Libertação de glicanos ligados a N

Os glicanos foram libertados e separados das glicoproteínas executando uma modificação de um método anteriormente descrito (Papac, et al. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). As cavidades de uma placa de 96 cavidades 'MultiScreen IP' (membrana Immobilon-P) (Millipore) foram humedecidas com 100 pL de metanol, lavadas com 3 X 150 pL de água e 50 pL de tampão ROM (ureia 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6), sendo o escoamento feito sob uma pressão ligeiramente hipobárica após cada adição. As amostras de proteínas secas foram dissolvidas em 30 pL de tampão RCM e transferidas para cavidades contendo 10 pL de tampão RCM. As cavidades foram escoadas e lavadas duas vezes com tampão RCM. Fez-se a redução das proteínas por adição de 60 pL de DTT 0,1 M em tampão RCM durante 1 hora a 37°C. Efectuou-se a lavagem das cavidades três vezes com 300 pL de água e foram sujeitas a uma operação de carboximetilação por adição de 60 pL de ácido iodoacético 0,1 M durante 30 minutos, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Efectuou-se nova lavagem das cavidades três vezes com água e efectuou-se o bloqueio das membranas por adição de 100 pL de PVP 360 a 1% em água durante 1 hora à temperatura ambiente. As cavidades foram escoadas e lavadas três vezes com 300 pL de água e submetidas a uma operação de desglicosilação por adição de 30 pL de NH4HCO3 10 mM a pH 8,3, contendo uma miliunidade de N- 250 glicanase (Glyko). Decorridas 16 horas a 37°C, removeu-se por centrifugação a solução que contém os glicanos e evaporou-se até à secura.

Espectrometria de massa por MALDl/tempo de trânsito (TOF)

Efectuou-se a determinação das massas moleculares dos glicanos utilizando um espectrómetro de massa 'Voyager DE PRO' linear 'MALDI-TOF' (Applied Biosciences), recorrendo à extracção retardada. Os glicanos anidros provenientes de cada cavidade foram dissolvidos em 15 pL de água, tendo sido aplicados salpicos de 0,5 pL sobre placas de amostragem feitas de aço inoxidável, tendo sido tudo misturado com 0,5 pL de molde S-DHB (9 mg/mL de ácido di-hidroxibenzóico, 1 mg/mL de ácido 5-metoxi-salicílico em água/acetonitrilo a 1:1 contendo 0,1% de tfa) e deixou-se secar. Os iões foram gerados por irradiação com um laser de azoto intermitente (337 nm) com períodos dos impulsos de 4 ns. O instrumento foi explorado no modo de extracção retardada com um atraso de 125 ns e com uma tensão de aceleração de 20 kv. A tensão da grelha foi de 93, 00%, a tensão do condutor de guia foi de 0,1%, a pressão interna foi inferior a 5 X 10^7 torr e a passagem de menor massa foi de 875 Da. Os espectros foram gerados a partir da soma de 100-200 impulsos de laser e captados com um digitalizador de 500 MHz. Utilizou-se o oligossacarídeo Man5GlcNAc2 como padrão de massa molecular externo. Todos os espectros foram gerados com o instrumento a trabalhar no modo iónico positivo. 251

Diversos

Separou-se as proteínas por SDS/PAGE em conformidade com o descrito por Laemmli (Laemmli 1970) . EXEMPLO 17

Geração da estirpe de leveduras YSH-1 (Aochl, a-1,2- manosidase, GnTl)

Utilizou-se como estirpe hospedeira a estirpe BK64 de P. pastoris já descrita (Choi et al., Proc Natl Acad Sei USA., 29 de Abril de 2003; 100(9): 5022-7), que é o auxotrofo triplo (ADE, ARG, HIS) que possui a inactivação OCH1 e que expressa o domínio kringle 3 (K3) do plasminogénio humano.

Transformou-se a estirpe BK64 com o plasmídeo pPBl03 linearizado com a enzima de restrição EcoNI para introduzir o transportador de UDP-N-acetil-glucosamina de K. lactis na célula hospedeira, criando-se assim a estirpe PBP-1. Introduziu-se o MnsI de murganho nesta estirpe por transformação com o plasmideo pFB8 linearizado com a enzima de restrição EcoNI, gerando-se a estirpe PBP-2. A análise dos glicanos de K3 das proteínas isoladas a partir da estirpe PBP-2 demonstrou que a glicoforma primária presente era Man5GlcNAC2. A estirpe PBP-2 foi depois transformada com o plasmídeo pNAl5 de GnTI humano, linearizado com a enzima de restrição Aatll gerando a estirpe PBP-3. A análise das glicoformas de K3 produzidas na estirpe PBP-3 demonstrou que o glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2era a estrutura predominante. Para se recuperar o marcador URA3 a partir de PBP-3, deixou-se esta 252 estirpe crescer em meio YPD antes da selecção em meio minimal contendo '5-Fluoroorotic' (5-FOA, BioVectra) e uracilo (Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197: 345-346 (1984)). A estirpe recuperada Ura-menos, produtora de glicoformas GlcNAcMan5GlcNAc2 recebeu a designação de YSH-1. 0 perfil do N-glicano da estirpe YSH-1 está ilustrado na figura 13 e apresenta um pico predominante para o valor m/z igual a 1465, correspondente à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] . EXEMPLO 18

Geração da estirpe de leveduras YSH-37 (P. pastoris que expressa manosidase II)

Transformou-se a estirpe YSH-1 (exemplo 17) com o plasmideo pKD53) de manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/ /MNN2{s) de S. cerevisiae, linearizado com a enzima de restrição Apal, para assim se gerar a estirpe YSH-37. A análise das estruturas dos glicanos de K3 produzidos na estirpe YSH-37 (figura 14) demonstrou que a glicoforma predominante para o valor m/z igual a 1140 corresponde à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e de outras glicoformas GlcNAcMan4GlcNAc2 [C] para m/z igual a 1303 e G1 cNAcManSG1 cNAc2 [d] para m/z igual a 14 65. EXEMPLO 19

Geração da estirpe de leveduras YSH-44

Transformou-se a estirpe YSH-37 (exemplo 18) com um plasmideo pTC53 que codifica um lider GnTII/MNN2 (s) do rato, 253 tendo o plasmídeo sido linearizado com a enzima de restrição EcoRI. A estirpe resultante YSH-44, produziu um N-glicano de K3 que possui uma única glicoforma para o valor m/z igual a 1356, correspondente à massa de GlcNAC2Man3GlcNAC2 [x], conforme determinado por espectrometria de massa por MALDI-TOF em modo positivo (figura 15).

Digestão com β-Ν-acetil-hexosaminidase

Os glicanos provenientes de YSH-44 foram libertados e separados das glicoproteinas mediante uma modificação de um método já anteriormente referenciado (Papac et al. A. j. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Depois de as proteínas terem sido reduzidas e carboximetiladas e as membranas terem sido bloqueadas, efectuou-se a lavagem das cavidades três vezes com água. Realizou-se a desglicosilação das proteínas mediante a adição de 30 pL de NH4HCO3 10 mM, a pH 8,3, contendo uma miliunidade de N-glicanase (Glyko, Novato, CA) . Após digestão durante 16 horas a 37°C, removeu-se por centrifugação a solução que continha os glicanos e evaporou-se até à secura. Os glicanos foram depois excicados num aparelho 'aSC210A Speed Vac' (Thermo Savant, Halbrook, NY) . Os glicanos excicados foram colocados em NH4Ac 50 mM, pH 5,0, a 37°C de um dia para 0 outro e acrescentou-se-lhes 1 mU de 'hexos' (Glyko, Novato, CA) . Os glicanos foram analisados e comprovou-se que havia um único glicano representado na figura 16 para um valor m/z igual a 933, correspondente à massa de Man3GlcNAc2 [a] . 254 EXEMPLO 20

Geração de uma estirpe de levedura sem nenhuma actividade aparente de manosidase II

Transformou-se a estirpe YSH-1 com um plasmídeo que codifica manosidase II ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNN9{m) de S. cerevisiae, o plasmídeo pKDlê, linearizado com a enzima de restrição EcoRl. A estirpe resultante produziu uma única glicoforma para o valor m/z igual a 1464, correspondente à massa de Man5GlcNAc2 [d] conforme comprovado por espectrometria de massa MALDI-TOF em modo positivo (figura 18) . Assim, esta estirpe não expressou nenhuma actividade aparente de manosidase II a partir da construção de fusão manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNS1{1) de S. cerevisiae, pelo menos no que diz respeito à glicosilação da glicoproteína repórter de K3. EXEMPLO 21

Geração de um estirpe de levedura que possui actividade de manosidase II

Transformou-se a estirpe YSH-1 com um plasmídeo que codifica manosidase II ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNN9 (m) de S. cerevisiae, o plasmídeo pKDl6, linearizado com a enzima de restrição EcoRl. O perfil do N-glicano da glicoproteína K3 expressa na estirpe resultante (figura 19) revelou um pico predominante para o valor m/z igual a 1464, correspondente à massa de Man5GlcNAc2 [d] e outros picos correspondentes G1 cNAcMan 3G1 cNAc 2 [b] para o valor m/z igual a 1139 e a

GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] para o valor m/z igual a 1302. Assim, a estirpe de levedura resultante expressou alguma actividade 255 detectável de manosidase II a partir da construção de fusão manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae. EXEMPLO 22

Geração da estirpe de levedura YSH-27 que possui actividade de manosidase II

Transformou-se a estirpe YSH-1 com um plasmideo que codifica manosidase II ΙΙΔ74 de D. melanogaster/GLS1(s) de S. cerevisiae, o plasmideo pKDl, linearizado com a enzima de restrição EcoRI. 0 perfil do N-glicano da glicoproteína K3 expressa na estirpe resultante, YSH-27, revelou um pico predominante para o valor m/z igual a 1139, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] (figura 20) . Assim, a estirpe resultante YSH-27 expressou níveis significativos de actividade de manosidase II a partir da construção de fusão manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/GLS1(1) de S. cerevisiae. EXEMPLO 23

Geração da estirpe de levedura YSH-74 (fraca actividade de manosidase II)

Transformou-se a estirpe YSH-1 com um plasmideo que codifica manosidase II ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNS1(s) de S. cerevisiae, o plasmideo pKD5, linearizado com a enzima de restrição EcoRI. O perfil do N-glicano da glicoproteína K3 expressa na estirpe resultante, YSH-74, revelou um pico predominante para o valor m/z igual a 1140, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e outros picos correspondentes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [C] para o valor m/z igual a 1302 e a GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] para o valor m/z igual a 14 64 (figura 256 21) . A estirpe resultante YSH-74 expressou níveis diminutos de actividade de manosidase II a partir da construção de fusão manosidase ΙΙΔ74 de D. melanogaster/MNSl(m) de S. cerevisiae, pelo menos no que diz respeito à glicosilação da glicoproteína repórter K3. Os glicanos provenientes de YSH-74 foram ainda analisados por digestão com a-1,2-manosidase de A. saitoi (Glyko, Novato, CA), tendo daí resultado glicanos que revelam um pico predominante para o valor m/z igual a 1141, correspondente à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] (figura 22) . EXEMPLO 24

Ensaios com manosidases

Acrescentou-se Man8GlcNAc2 (0,5 pg), identificada com um marcador fluorescente, a 20 pL de sobrenadante e manteve-se tudo a incubar durante 30 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, analisou-se a amostra por HPLC, utilizando uma coluna de sílica com grupos amino ligados, carregada com esférulas de 5 pm 'Econosil NH2', 4, 6 X 250 mm (Altech, Avondale, PA). O caudal foi de 1,0 mL/minuto durante 40 minutos e manteve-se a coluna a 30°C. Após uma eluição isocrática (68% de A:32% de B) durante 3 minutos, utilizou-se um solvente em gradiente linear (68% de A:32% de B até 40% de A: 60% de B) durante 27 minutos para a eluição dos glicanos (Turco, S. J. (1981) Aliai. Biochem. 118, 278-283). O solvente A era acetonitrilo e o solvente B era uma solução aquosa de formato de amónio, 50 mM, a pH 4,5. Equilibrou-se a coluna com o solvente (68% de A:32% de B) durante 20 minutos, entre ensaios. 257 EXEMPLO 25

Transferência de galactose in vitro

Para a transferência de galactose utilizou-se como substrato o glicano GlcNAC2Man3GlcNAC2 ligado a N obtido a partir da estirpe YSH-44. Manteve-se 20 mg deste glicano a incubar com 75 mg de UDP-Gal e 10 mU a 50 mU de β-1,4-galactosil-tranferase (leite de vaca, Calbiochem) em NH4HC03 50 mM, MnCl2 1 mM, a pH 7,5, a 37°C, durante 16-20 horas. A figura 17 ilustra a espectrometria de massa MALDI-TOF em modo positivo em que se observa um pico uniforme para o valor m/z igual a 1665, correspondente à massa de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. Realizou-se um controlo negativo, sem galactosil-transferase, conforme descrito anteriormente, tendo-se verificado que não houve transferência de galactose para o substrato

GlcNAc2Man3GlcNAc2. EXEMPLO 26

Introdução de uma manosidase de classe III em eucariotas inferiores

Amplificou-se um ADNc que codifica uma manosidase de classe III (Jarvis et al. Glycobiology 1997 7:113-127), proveniente de células Sf9 de insectos, utilizando iniciadores específicos para os terminais 5' e 3' . Depois, efectuou-se a subclonagem do ADNc num plasmídeo de integração de leveduras para se investigar o efeito desta proteína sobre o padrão de N-glicosilação de uma proteína repórter segregada. Fora produzidos diversos produtos truncados para se gerar uma biblioteca de construções de manosidases de classe III com diferentes fragmentos líderes de 258 endereçamento, conforme descrito, v.g., no exemplo 14. Para além de serem expressas por si sós numa estirpe hospedeira desejada, as proteínas de fusão resultantes são expressas em combinação com outras enzimas modificadoras da glicosilação para aumentar a produção da estrutura desejada de N-glicanos.

Embora a manosidase de Sf9 seja o único elemento desta classe III clonado até ao momento presente, os genes e os marcadores de sequências de expressão que revelam uma homologia significativa com este ORF e em particular o domínio catalítico (resíduos 273 a 2241 do ORF). Gera-se uma biblioteca de manosidases de classe III que possuem intervalos óptimos de valores de temperatura e de pH. Por sua vez, isto irá permitir a selecção de uma ou várias construções de fusão de manosidases de classe III que são excelentes para modificar o padrão de glicosilação de uma proteína repórter seleccionada para produzir uma estrutura desejada de um N-glicano quando expresso numa estirpe hospedeira desejada, tal como um levedura ou um fungo filamentoso.

Listagem de sequências SEQ ID NO: 1

Sequência de ácidos nucleicos de a-1,2-manosidase IA de M. musculus SEQ ID NO: 2

Sequência codificada de polipéptidos de a-1,2-manosidase IA de M. musculus 259 SEQ ID NO: 3

Iniciador para o gene OCH1 de K. lactis: ccagaagaat tcaattytgy cartgg SEQ ID NO: 4

Iniciador para o gene 0CH1 de K. lactis: cagtgaaaat acctggnccn gtcca SEQ ID NO: 5

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

Im Lys Vai Pite Vai Vai Pro Hk Ser Hk Am Asp Pk> Oly Tip Be Gk Thr Phe GkGkTyrTyr SEQ ID NO: 6

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

Gh m Vai Tto Gly Gíy Tip Vai Met Fm Asp Glu Ala Asa Sor Trp Arg Asb Vai Leu Leu Oto Im liar Gki Oly Oto Thr Τφ Leu Lys Gin Pite Met As» Vai ThrPro Tfer Ala Ser ?.rp A!â Be Asp Pro Pite Gly His Ser Fie Thr Met .Piro Tyr Be Lee SEQ ID NO: 7

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

His Met Met Pm Fite Tyr Ser Tyr Ásp Be Pm His Thr Cys Gly Pro Asp Pro Arg Be Cys Cys Gto Pite Asp Pbe Arg Arg Met Fm Oly Oly Arg SEQ ID NO: 8

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

Leu Im Im Asp Oto Tyr Arg Lys Lys Ser Ou Leu Pbe Arg Thr Am Vai Leu Leu Be Pro Lm Oly Asp Asp Pbe Arg Tyr SEQ ID NO: 9 260

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2 S In % Tfrr leu Ser Aep Ty r Phe Ãee Ais Lõíí SEQ ID NO: 10

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2 L&u S&r Asp Pha Phs TbrTyr Ais Asp Arg Ser Âsp Bis SEQ ID NO: 11

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

Tyr Típ Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Pro Flse Tyr Arg Arg Meí Asp Arg Vai Leu Oiti SEQ ID NO: 12

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2

Ala Arg Arg Glu Lm Giy Im The Gha Hís Hís Asp Ala Be Thr Gly Thr Ala Arg Mp His Vai. Vai Vai Asp Tyr Gly SEQ ID NO: 13

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2 Giy Ajia Tyr ^ im ?m Asg C3l¥ QlíJ Ala SEQ ID NO: 14

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2 Pie Tyr Tfir Asp Lau Asa Q ly Pte <3;?: àtet Sln Lys Arg Arg SEQ ID NO: 15 261

Sequência de aminoácidos conservada de manosidase de classe 2 iys Lei Pro Lei Ola Ala Asa Tyr Tyr Pro Met Pro Ser Met Alá Tyr B© Glu Asp Ala Asa Tta Arg Lei Thr Leu Leu Tfe Gly Ola Pro Leu Gly Vai Ser Ser Lei Ala Ser Gíy Gin Leu 0k Vai Met Lm Asp Aig Arg Leu Mei Ser Asp Asp Am Arg Gíy Leu Gly Gfe Gly Vai Leu Asp Am Lys SEQ ID NO: 16

Iniciador para o gene MNNl de K. lactis: ígcíístcíiit «B-gtte SEQ ID NO: 17

Iniciador para o gene MNNl de K. lactis: gatosscgã $£tf&

SEQ ID NO: 18 Iniciador: ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT SEQ ID NO: 19 Iniciador: TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC SEQ ID NO: 20 Iniciador: ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT SEQ ID NO: 21 Iniciador: GTAATACGACTCACTATAGGGC SEQ ID NO: 22 Iniciador: AATTAACCCTCACTAAAGGG 262 SEQ ID NO: 23 Iniciador: ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC SEQ ID NO: 24 Iniciador: TCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG SEQ ID NO: 25 Iniciador: GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC SEQ ID NO: 26 Iniciador: CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG SEQ ID NO: Iniciador: 27

GGCOÂGCTCGGCCTÂCCCGGCCAAíKjCTGAGATÇATlTGTCCAGCrrCA

GA SEQ ID NO: 28 Iniciador:

GCCCACGTCGACGGATCCGírTTA4ACATCGATTGGAGÀGGCTGACACC GCTÁCTÀ SEQ ID NO: 29 Iniciador:

CGGGATCCACTÂGfAlTrAMlGATÂTGfCSCGÂGfGTÁCÂáCrrCnTCCC

ACATGG 263 SEQ ID NO: 30 Iniciador:

GGACGCGTCGACGÍíCCTACÇÇGGCCíjTACGAGG^VrTTCTCGO

ATGACTCTmC SEQ ID NO: 31 Iniciador: CGGCiATCCCIGGAGAGATCridTiTGTAGAAATGTCnGCírGCCr SEQ ID NO: 32 Iniciador:

<3GACATG€ATGCACTAGTG1XK3CCu€CACGTGA:TAGTTGTTCA

ATTGÁTTGAMTÁGGGACAA SEQ ID NO: 33 Iniciador: CCTTGCTAGCTTAA'rTAACCGÇGGCAÇOTCCGACGGCG<?CCCÁ

CGGGTCCCA SEQ ID NO: 34 Iniciador:

tjGACATGCATCK^GGATCCCITAAGAGCCGGCAGClTCXlAAÁIT

ÁMGCa^CaAGCOfCCC SEQ ID NO: 35 Iniciador: QAÁCCÂcmcmcmccATimmccAÀÂÃCcrrmtcctÂTt

CAAACACAAGGCATTGC 264 SEQ ID NO: 36 Iniciador:

CTCCAATACTAGTCGMGATTATCTTClACGOTGCCTGôACrC SEQ ID NO: 37 Iniciador: tggaagotttaaacaaagctagagtaaaatagatatagcgag ÁTTAGAGÀÁTÕ SEQ ID NO: 38 Iniciador: mgaattcggctggaaggccttgtaccttgatgtagttcccgtt

TTCATC SEQ ID NO: 39 Iniciador: GCCCMOCCGGÇgiMGCOATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATÁ

AAAATACGG SEQ ID NO: 40 Iniciador:

GGGCGCGTAnTAAATACTAGXGGÀICTATCGAATClAAATGTAAG'rTA

AAATCfCTAA SEQ ID NO: 41 Iniciador:

GGÇÇGÇÇTGCAGATTTAAA!'^^rrÇdOOSÇGCCrr'AAT 265 SEQ ID NO: 42 Iniciador:

TAAGGCGPGCCGMTTGAmMATOTQCAGGGG SEQ ID NO: 43 Iniciador: TGGCÂGGCSCG GCTCÂGTCAdCGCTGTCã SEQ ID NO: 44 Iniciador: marram agtsctaattccasctags SEQ ID NO: 45 Iniciador:

CCAGAAQAATTCMTTYTQYCARTSG SEQ ID NO: 46 Iniciador:

CA&T&ÂAMTAGGT&GNCCNGTCCA SEQ ID NO: 47 Iniciador:

TQCGATG-TTTTAGQTCCSASSCCCÍSTTG SEQ ID NO: 48 Iniciador: 0A'^ccAcaAcecÂiGsmTn'CTTTc 266 266 SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase SEQ ID NO: Manosidase 49 II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) 50 II de C. elegans (NM_073594) 51 II de Ciona intestinalis (AK116684) 52 II de Drosophila (X77652) 53 II humana (U31520) 54 II de murganho (X61172) 55 II de rato (XM_218816) 56 IIx humana (D55649) 57 III de células de insecto (AF005034) 58 II lisossómica humana (NM_000528) 267 SEQ ID NO: 59

Manosidase II citoplásmica humana (NM_006715) SEQ ID NO: 60 Iniciador sense 5’'GGCCfCCCCCTCACTCTCTTCC-ACΓTCGílCGTÂCCAGOAC-3,

Asei de ManII d69 de Arabidopsis SEQ ID NO: 61 Iniciador anti-sense S^CCITMTTMTCACrrGm^GGTCGCAGTI-CMGCTTATAAGCTCG1

PacI de ManII de Arabidopsis SEQ ID NO: 62 Iniciador sense 5ί-GG"GCGCG€CTCCK9Tí.7ACCAÂACGA€AAGCAAATGATTTÁCGG“3,

Asei de ManII d31 de C. elegans SEQ ID NO: 63 Iniciador sense S^GGCKÍGCGCCGCTCATATrCATCAAGT.ÀAAGCMCATATCAAGCCG*

Asei de ManII dl08 de C. elegans SEQ ID NO: 64 Iniciador anti-sense 5hCTTAA,rrMTl'AAAATGATACMGMTACrrimUATATCGTTTGG*3<

PacI de ManII de C. elegans 268 SEQ ID NO: 65 Iniciador sense

SdGGCGCGCCACÇOTCJ\A0AÇ%AACTTAOTCT(KjTG'G-3t

Asei de Manll d47 de C. intestinalis SEQ ID NO: 66 Iniciador sense

5^G<}CG€G€CCTÂC€AC'TTATAATGCCCAAGCMTTTG€G

Asei de Manll dlOO de C. intestinalis SEQ ID NO: 67 Iniciador anti-sense 5lHQCTTAATTMmC0TCAGTACTATTn'OTAAG€'TTGTATCTC-3’

Pacl de Manll de C. intestinalis SEQ ID NO: 68 Iniciador sense S^CKjCOCGCCCMTOÁGCFGGAAAATCKjlTrGCACiGÂCKACG-S*

Asei de Manll d48 de D. melanogaster SEQ ID NO: 69 Iniciador sense ^(^GCmCCGCQACGAJCCAÁTAAQACCrCCÂC-y

Asei de Manll d74 de D. melanogaster SEQ ID NO: 70 Iniciador sense S-GGCGCíXCGACGTGCCCMTGTGGATGTACAGATGCIG^'

Asei de Manll d99 de D. melanogaster 269 SEQ ID NO: 71 Iniciador anti-sense

5’-CClTAAlTMTCAGOTGAGTGACTGCTCACÁTAAGCaGCGG.:V

Pacl de Manll de D. melanogaster SEQ ID NO: 72 Iniciador sense 5-GGCGCGCCATAGACCATTTGGAGCOTTTGCTAGCTGAG-3'

Asei de Man2a d53 humana SEQ ID NO: 73 Iniciador sense f-GGCGCC^CGCOCACAMGTCKjAAGTCACMTTCÂGATGTGC^

Asei de Man2 dll8 humana SEQ ID NO: 74 Iniciador anti-sense S^CCCTrA.VFTAATCACGTCAACKKjArrCGGAATGTGCTGArrrCG1

Pacl de Man2A humana SEQ ID NO: 75 Iniciador sense S-GGCGCGCCGÀCCATTTGGAGCGTTTGCTCGCIOAGAACG*

Asei de Man2 d54 de murganho 270 SEQ ID NO: 76 Iniciador sense 5^C^δCGCC:CTG€ÀGGCT€ACCCCAGAGA€TGT4,

Ascl de Man2 dl07 de murganho SEQ ID NO: 77 Iniciador anti-sense S*-

CCCriAAlTAATCAGGTCCAACGC-AAGGGGATAGGGMCGTGCTGArC TC- 3'

Pacl de Man2 de murganho SEQ ID NO: 78 Iniciador sense 5f-GG€GCGCCGGTGÔGAACTT€CCCAG{5AG€CAAATTTGTG*3,

Ascl de Manll d38 de rato SEQ ID NO: 79 Iniciador sense 3'

Ascl de Manll d81 de rato SEQ ID NO: 80 Iniciador anti-sense

StCOTAAlTAACTMCC CÂÁQCÚCAmmGAÁQGTmím*

Pacl de Manll de rato 271 SEQ ID NO: 81 Iniciador sense 5t<^GCG€CCM€ÂCGATCOCÂCCCGÂCA€CÀGAATG-3t

Asei de Manllx d29 humana SEQ ID NO: 82 Iniciador sense 5!'GGCu€GCCGTGCTGGAGCTQACàGCCAACCI^AGÂ(}(3G-3’

Asei de Manllx d74 humana SEQ ID NO: 83 Iniciador sense 5^ΟΟ€(Κ:θ0ς60ΤεΑ€τ,Μ(3€€Α€τΑ(Κ:τα::ΑΟΑΤ0θΤ€ΑΏΌ.3Γ

Asei de Manllx dl23 humana SEQ ID NO: 84 Iniciador anti-sense S^CCTTÃATTMCTMC^CMGCGGACKiCCiÂAAGGTAGCMXaj

PacI de Manllx humana SEQ ID NO: 85 Iniciador sense 5’^€^0€ΰ€ε€ΑΟΑΑ€ΤΑΤΜ€ΑΑ\€€ΑΑΟΑΑΤ€ΑΟΤΤΑϋ€€ΑΟ€€'3’

Asei de ManIII d36 de Sf SEQ ID NO: 86 Iniciador anti-sense 272 S^CCmATTÂATTAAitóCCTGATCTTGTMGTTTlTACCTCCÂTAGCCt-S’

PacI de ManIII de Sf SEQ ID NO: 87 Iniciador sense 57.GG€GCC<;€ATGGGCTACG€GCGGGC:TTCGG-GGGTCTG€G-3'

Asei de Manll lisossómica humana SEQ ID NO: 88 Iniciador sense S^GCCGCGCCCCCCCTCTCTCCirmCCTTTTGTrGCTGG1

Asei de Manll lisossómica d31 humana SEQ ID NO: 89 Iniciador anti-sense S^CCTTAATTAACTAACCATCCACCTCCTTCCATTGAACTGAGG*

PacI de Manll lisossómica humana SEQ ID NO: 90 Iniciador sense S-GGCGCGCCÀTGGCGGCAGCGCCGTTCTTGAAGCACTGGCGCG’

Asei de Manll citossólica humana SEQ ID NO: 91 Iniciador anti-sense fCCITAArrAATTAGCKTGOGOAAGCAGAAATrAOQAGfCCG*

PacI de Manll citossólica humana 273

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pelo requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição wo 0114522 A [0011] JP 8336387 A [0021] [0641] us 5834251 A [0023] [0026] [0541] [0673] [0686] wo 0200856 A2 , Contreras [0025] [0167] [0668] [0669] wo 0200879 A [0031] [0181] [0646] [0648] [0649] EP 1211310 A [0038] us 5595900 A [0160] [0604] [0605] us 6300113 B [0568] us 5955422 A [0686] us 4775622 A [0686] us 6017743 A [0686] us 4925796 A [0686] us 5766910 A [0686] us 5910570 A [0686] us 5849904 A [0686] us 5955347 A [0686] us 5962294 A [0686] us 5135854 A [0686] us 4935349 A [0686] [0670] 274 • US 5707828 A [0686] • US 5047335 A [0686]

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Lisboa, 15/03/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de uma glicoproteína numa célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, o qual compreende o passo que consiste em expressar na célula hospedeira um ácido nucleico que codifique uma enzima quimérica que compreende: (a) um dominio catalitico de manosidase seleccionado a partir do quadro 11, fundido com (b) um péptido de sinal de endereçamento celular seleccionado a partir do quadro 11, em que a referida enzima quimérica representada no quadro 11 é capaz de hidrolisar in vivo mais de 40% das ligações Man a-1,3 e/ou Man a-1,6 de um substrato de GlcNAcMan5GlcNAc2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a glicoproteína compreende N-glicanos seleccionados entre o conjunto constituído por GlcNAcMan3GlcNAc2.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a glicoproteína compreende N-glicanos que possuem a ramificação oligossacarídica Mana-1,3 (Mana-1,6) Manp-l,4-GlcNAcp-l,4-GlcNAc-Asn.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o domínio catalítico de manosidase é capaz de hidrolisar in vivo as duas ligações Mana-1,3 e Mana-1,6 de 2 um substrato oligossacarídico que compreende uma ligação glicosídica Mana-1,3 e uma ligação glicosidica Mana-1,6.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4, em que o substrato oligossacaridico se caracteriza por ser GlcNAcp-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,6 Mana-1,6) Manp-l,4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn; GlcNAc-p-l,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6) Manp-l,4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn; e GlcNAcp-1,2 Mana-1,3 (Mana-1,3 Mana-1,6 Mana-1,6) Manp-l, 4-GlcNAc β-l,4-GlcNAc-Asn.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a actividade de manosidase é sobre-expressa.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o domínio catalítico de manosidase também é capaz de hidrolisar uma ligação Mana-1,2.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a actividade de manosidase possui um pH óptimo compreendido entre cerca de 5,0 e cerca de 8,0.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o domínio catalítico de manosidase está localizado pelo menos no RE, no aparelho de Golgi ou na rede trans-Golgi da célula hospedeira. 3

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o qual compreende também o passo que consiste em isolar a glicoproteina separando-a da célula hospedeira.

11. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que a célula hospedeira é seleccionada entre o conjunto constituído por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célula hospedeira é de Pichia pastoris.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a glicoproteina é uma proteína terapêutica.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a proteína terapêutica é seleccionada entre o conjunto constituído por eritropoietina, citoquinas, factores de coagulação, a cadeia α do receptor de IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinase, quimase, 4 inibidor de tripsina da ureia, proteína de ligação a IGF, factor de crescimento epidérmico, factor de libertação da hormona do crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor 2 do crescimento endotelial vascular, factor 1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegerina, antitripsina a-1, a-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1, isto é, onercept ou proteína 1 de ligação ao TNF, TACI-Ig, isto é, activador transmembranar e modulador do cálcio e interactor do ligando da ciclofilina, FSH, isto é, hormona estimuladora dos folículos, GM-CSF, GLP-1 com e sem FC, isto é, proteína 1 de tipo glucagon, agonista do receptor de il-1, sTNFr, isto é, enbrel ou fusão do Fc com o receptor TNF solúvel, ATUI, rhTrombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig, isto é, antigénio 4 - Ig associado ao linfócito T citotóxico.

15. Enzima quimérica tal como representada no quadro 11, que compreende um domínio catalítico de manosidase fundido na grelha de leitura com um péptido de sinal de endereçamento celular, a qual é capaz, após expressão numa célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, de hidrolisar in vivo GlcNAcM5GlcNAc2 até ao ponto em que mais de 40% das ligações Mana-1,3 e/ou Mana-1,6 do substrato são hidrolisadas in vivo.

16. Enzima quimérica de acordo com a reivindicação 15, a qual também é capaz, após expressão numa célula hospedeira de uma levedura ou de um fungo filamentoso unicelular ou multicelular, de hidrolisar in vivo um substrato oligossacarídico que possui uma ligação glicosídica Mana-1,2 5 até ao ponto em que uma fracçao detectável da ligação Mana-1,2 do substrato é hidrolisada in vivo. 17. Ácido nucleico que codifica uma enzima quimérica de acordo com uma das reivindicações 15 ou 16.

18. Célula hospedeira que compreende uma enzima quimérica de acordo com uma das reivindicações 15 ou 16.

19. Célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17.

20. Composição de glicoproteinas em que as glicoproteinas são produzidas numa célula hospedeira de acordo com uma das reivindicações 18 ou 19, não contêm fucose e possuem pelo menos 40%—50% em moles de GlcNAcMan3GlcNAc2.

21. Composição de glicoproteinas em que as glicoproteinas são produzidas numa célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, não contêm fucose e compreendem pelo menos 40%-50% em moles de GlcNAcMan3GlcNAc2.

22. Composição de glicoproteinas de acordo com as reivindicações 20 ou 21, em que os N-glicanos na glicoproteina se caracterizam por serem uniformes. Lisboa, 15/03/2010 ER GOLGI 1/47 Man a1,2—Man a1,6\ Man a1,6* Man «1,2—Man al/K ^>4_G|cNAc ^J1,4-GlcNAcj?1 -Asn Man ai ,2-Man a1,2-Man a1,3' 1 g-1,2 MANQSIDASE Man a1,2-Man a1,6\ Man αΐ,δν ' Man al/K ^i(4_gicNAc /?1,4-GlcNAcjS1-Asn Man ai ,2-Man a1,2-Man a1,3' MangGIcNAc 2 ManeGIcNAc 2 j a-1,6 MANOSILTRANSFERASE(S) Man a1,2-Man a1,6\ Man αΐ,δν Man a1/K \an ^1,4-GlcNAc jS1,4-GlcNAc^l-Asn INITiATING 1,6 Man a1,2-Man a1,2-Man aí,3 ACTIVITY I Man ai ,6 , J a-1,2 MANOSILTRANSFERASE(S) Man a1,2-Man <*1,6·^ ' Man a1,6v Man a1,3^ \|an ^if4_G|cNAc 01,4-GlcNAcfl-Asn Man a1,2—Man a1,2—Man a1,3' Man a1,2—Man a1,2—Man a1,6 Man. cx1,2—Man a1,2—Man a1,6 Man a1,2—Man a1,2-Man a1,6 Man ai ,2-Man αΐ,δ-^ Man a1,6 v Man a1,3^ \,/ N-GLICANO HIPERMANOSILADO q-1,3 MANOSILTRANSFERASE(S) I MANOSILFOSFATO-TRAN FERASE(S) Man /?1,4—GlcNAc ^1,4—GlcNAc^l —Asn Man ai ,2-Man a1,2-Man «1,3 Man α1,3-Ρ04~Μαη a1,2—Man a1,2—Man a1,6 Man a1,3—Man a1,2-Man a1,2-Man a1,6 Man a1,3—Man a1,2-Man a1,2-Man a1,6 FIG.1A N-GLICANO HIPERMANOSILADO ER < GOLGk Man a1,2-Man α1,6 \ Mana1,2-Mana1,3- Manai,6 Man a1,2-Man a1,2-Man a1,3 Man a1,2-Man a1,6 Mana1,3* Manai,6 Man a1,2-Man a1,2-Man a1,3 2/47 Man pi,4-GlcNAc β1,4-GlcNAcpi-Asn :-1.2-manosidase MangGlcNAc2 Man β1,4-GicNAc p1,4-GlcNAcp1-Asn Man0GlcNAc2 J a1.2-manosidase fIA. IB. IC) Man a1,6 \ Man a1,6v Man a1,3 ^ \an ^ i4_GlcNAc pi,4-G!cNAcp1-Asn Manai,3 ' Man a1,6 \ Man a1,3 Man a1,6 GlcNAc p1,2-Mana1,3‘ Man a1,6 >\ GlcNAc P1,2-Mana1,3' ManjGlcNAc2 2GnTI Man pi,4-GlcNAc pi,4-GlcNAcpi-Asn 1 manosidase Π GlcNAcMangGlcNAc2 / Man pl,4-GlcNAc pl,4-GlcNAcpi-Asn GlcNAcMan ^GlcNAc 2 GlcNAc p 1,2 χ I B1.2 GnTH, B-1.4 GnT IS p-1,4 GnT SI . Jt/lana1,6\ GlcNAc P 1,4"^ \ ^Manp1,4-GlcNAcp1,4-GlcNAcp1-Asn GlcNAc P1l4'-Maria1t3 GlcNAc β1,2 / Gal pi,4-GlcNAc ρΐ,2χ . _,Mana1,6\ Gal p1,4-GlcNAc β1,4-^ \ Gaipi,4-GlcNAcpi,4_ / ..Manai ,3 Galp1,4-GlcNAcp1,2/ j B1.4 GaIT Glicoproteina complexa Man β 1,4-GlcNAc p1,4-GlcNAcpi-Asn Glicoproteina complexa NANA Gal pi,4-GlcNAc pi,2 | a2.3 ST, a2,6ST Man a1,6\ NANA Gal p1,4-GlcNAc β1,4-^'----------\ NANA Gal p1,4-GlcNAc ρΐ,4^„ , , / Manai ,3 NANA Gal pi,4-GlcNAc pi,2^ Man pl,4-GlcNAc pi,4-GlcNAcpi-Asn FIG. 1B Glicoproteina complexa 3/47 Notl Asei Asei PacI * -------- ' ..............-.......( Fragmento de líder da PCR + Fragmento de domínio catalítico da PCR +

4/47 Grelha de leitura aberta de a-1,2-manosidase IA de M. musculus. Os domínios transmembranar e catalítico estão evidenciados a negrito. As sequências dos iniciadores utilizados para gerar os truncamentos no terminal N estão evidenciadas pelo sublinhado e pelo início de cada fragmento de proteína correspondente, indicado por uma seta. 1 a tgcccgtggggggcc tgt tgccgctct Ccagtagccctgggggcggcggcctgggcagtggcctgggcggggggcttggeggcqggaggaagggg 1* Μ P V G G L L PL FSSPGGGGL GSGL G G G L GGGRKG 97 tctggccecgetgcct tcegcctcaccgagaagttcgtgctgctgctggtgtteagcgcattca tcacgototgottcggggcaatc 33FSGPAAFRLTEKFVLLLVFSAF ITLCFGA I 184 t tc t tootgootqac tcctccaagctqctcaqcqqqqtcctqttccactccaaccctqccttqcaqccqccqgcqqaqcacaaqcccqqgctcq 62 ► F F L P Õ SSKLLSGVLFHSNPAIQPPAEHKPGL iniciador d65 1 “ 1 ► 27 B qqqcqcqtqcqqaqqatqccqccqaqqqqaqaqtccqqcaccqcqaqqaaqqcqcqcctqqqqaccctqqaqctqqactqgaaqacaacttaqcca 93 F G A RA EDAA EGRVRHRGEGA PGOPGA GL EDNLA iniciador d 105 ' " ^ 374 ggatccgcgaaaaccacgagcgggctctcagggaagccaaggagâccctgcagaagctgccggag.gagatccaaagagaeattetgctggagaagg 125 >R I RENHERA L REA KETLQKLPEEI QRDI LLEK 470 aaaaqqtqqcccaqqaccaqctqeqtqacaaqqatctqtttBqqqqcttqcccaaqqtqqacttcctqeeccccqteqqgqtaqaqaaceqqqaqc 157 FE K V A QOQL ROKDL F RGL PKVDFL PPVGVENRE iniciador d187 ”” 566 ccqctqacqccaccatceqtqaqaaqaqqqcaaaqatcaaaqaqatqa tgacocatgcttggaataattatsaacgctatgegtgggge 189 Fp A 0 A T I REKRAKI KEMM T H AWN N Y K R Y A WG - FIG.3 5/47 Í5S tta**ee»*Gt9»»®ectat»to*»»eaJ>ae!iBos<: tea»«e»ettt9 Utííciiotto**» g»»(ít»e«»tsít»«»t? »$► l N 6 l K «* tSK 6 8HS.SStF«« I «ÇAT « WO 137 cect ggttiticatet te» fct» teoeaãE0*ã£&et3::» ttt e» aosagetax it cgt03a tt* * ka i* t a t ttaeatttfca* 24t ► A L D T L F t M G Μ K T E F Q e A U B W I K K Y \. D F H •>>5 tç t®*» toc tgiae ttt.çtp tttttçaaetasscatQcget bçpteçç! tooaoteatotcaoectaetattrçtcceçio** J>3 ►VWAÊVSVFÊW X IRPVQGL LSA VVL BQ E Wi o sga t s 111 s« *s i jai *íe*s to-sus;; t totíro tansa ttee tscct acst t te»t »c icectcteo* 11 *cc t tgoec» t ΪΜ* ε« FRKKAVeuaVKtt^AFHTPSOIPWA 9*2 toetd** ta tçaaaagtçpç» £e;regeé0aaetg<!ec«i4r0eoetoiegB3i!eatfea9t*teetet!<ieg*» tt teeaxttc t «eK L N Μ K S β ) β R Η V»* P W A S G β S S S L A £ F 6 T L I9ÊS OOat tt J#a íttt stíííiiít toteeíSiítt* tcseTtaSOítCíg tott tnece» »**S911»101*» »t tconcaiftijtt 5 355 F Kl EFMHL3Hl.SGDPV FA Ef<VMK I RTV l '. (43 anos* a c te stacaaaac» jf «14500 tt ta toe tsae totcte»aee®ene t*9 tea*eajlsfl03fte**s* te* is títoss }S3 ► N K t. D K P E β (, Y P Í5 v t, N P S S <S O W 8 Q Η Η V 8 1129 t tes*gs*ett95*r»c»j6t ttta eja* t* t í tee e tsieíCBteg t tas, se ts ts»«*»a*o*e» totce**300**5*» 4Í&F-V S α i. Q D S F V E Y t t KAWIMSDKT& L ÊAK K Ί 3H éétet*ttt£e»teetgtt:a*eeefiaiteo»3aaee»cttòa&4iooea&ote4aot:5qe3o*tit*¥eetftç»tc3£*e»efcBe «iF Μ V F 0 Ar V Q A I E T H 1 I R K S B » G L Τ V ( A g VV 1JÍJ aiososseo elue tse:**s*e:i*f,» ¢¢¢¢¢88 eeteijte* tsot«! to «ase* S BO»te Kt toeis tiooo<ie*o* togigoSo 4SSF K6flt.LÊH«MeH.|.TCFA«eMFALGA»0A lOS <f« a*»9 esossçjcaea*c*etieettoaiétef®;síie t« laafctgeecBBaett-S te* te»* tcfct»t»*t.«e t*c*fc* te t <K»I* E A RAOHV l ' S l « A £ I ABTCM 6*YN«TY. V ,i553 oa»ot.teoe»ef;eea»’Ooott-Í;ooatttè*teeoeeÍetoo«*getatteeciee»ee8***»teia**otatt*Qft&etta Íi9* K t S f £ A P P F Ο Ο δ V E A IATRQHGKVY í L 2 MS eíocccoioot;· tcs*«*«»t*c»t®t.»e»t®’.'.;<!e;ií e t«*çtciesiOc.-:a»ajl;*eaí*aeetoeeeetea«»aeci.O W* S F S V í Ê TYMYMWR LTHftPKYRTWAWEA ÍT3! t««*e9et«t»f***gte*ot?a*9*gtoa»cgo;>occt*cto*e9ett*a«e««t*ttt*«»lt««««9tg*va9Ct*tt* EA L £ S H C R V W ç β V S S J. Ft Ο V ¥ ! A B E S V 0 1883 eçitf fcReagesaag t eta tt cstooeaoagaeaotssss ta Et t<s taettga t*(t t tnsg* t o» t gaeetts t tee*e t * •®’· * »YQiJ3PPLA6T l, K V t V l l f S D D D L L :P t 18ÍÍ ea *c»ét$e» 4¾¾ tn* íeeouooctei toet cteeeti t*eteatjt jaaoaiiigãõ»»®®»» Jtroatootí9»S4Sm»lí5 «S* £ Η W ! f«t €Af(PFP f tREGKKgl D β K E K

6/47

7/47

BamHI 8/47 Saci

Spel BamHl 9/47

10/47 EcoRI

11/47

FIG. 4F

12/47

A

B C

C

D

Massa (m/z) Fig. 5 E 13/47 Fig.6 100 80 60 40 20 850 1280 1710 2140 2570 3000 100 80 60 40 20 1000 1400 1800 100 c 80 60 1 40 j 20 ' 0 E 2200 2600 3000

1000 1400 1800 2200 2600 3000 c 100 80 60 40 20 0 100 80 9 .1. ,1000 1400 1800 2200 2600 3000 b

850 100 80 60 40 20 0 c i d MAÍÍJuJ r**\**M

1710 2140 2570 3000 Massa (m/z) 850 1280 Intensidade (mV) Intensidade (mV) Intensidade (mV) 14/47

FIG 7A b

FIG. 7B 400 -300 r 200 4 100 a FIG. 7C I ΤΙ·Ι·Ι·|Μ»Π’ΓΠΊ'ΓΙ·ΓΙ·ΓΙΊΊΊΊΊ·ΙΊ,Ι,ΙΊ'ηΊ,Ι·ΙΊ,Γ·|·η·Ι·>·1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tempo de Retenção (minutos) 0 15/47 Intensidade (mV) Intensidade (mV) Intensidade (mV)

16/47 Intensidade (mV) Intensidade (mV) Intensidade (mV)

17/47 INTENSIDADE (%) INTENSIDADE (%) a

Massa (m/z) FIG. 10B 100 i 90 80 70 60 50 · 40 30 20 · 10 0 4-850 1280 1710 Massa (m/z) 2140 2570 3000 18/47 ρΗ ΟΡΤΙΜΟ

ΡΗ F/G. 11 19/47 e Intensidade (%) Intensidade {%) Intensidade (%)

ί*« » Μ d Intensidade <%) «* j t ! Í » í | *h J « i 4| í 1β' 20/47 t---^ISiu" ' ‘ ‘ íiStt" “"‘"οίΞΓ ’ ' 'mu """mí» Massa (m/z) ΪΪ<Λ pá 13 21/47 Intensidade <+.)

FIO. 14 22/47

F1& 1$ 23/47 Intensidade (%)

Fia ie

24/47 tvvmtTrx íw veem wpnpn&on »#&MtidM>ltt*ywa w-«U'

25/47 Intensidade ('+)

Massa (m/z) 26/47

Fia ι$ 27/47 t*t*^Séd*t^vJ&wUW_______ tu£j" ....... h«m *»* Massa <m/z) ;κά 28/47 Intensidade <flj)

29/47 Intensidade (¾)

RG.22 30/47

Ji ttMMentttrâ&iil JKSí-Sâi, fttsp· s //«QrkbemSi„ etísc. sm/ Versiea 3.2 BOXSHADE CoíorCcded Piais of Pw^Íígned StgBggçet \ Seketed Sequeace(s) . Droso MssbIE (7.77652), €.degaiis MíísoII, M-mM ÍXM 2183141), bJ0íiS6 MarmTi (Xfil 172), butnati ManalT (U3152£i:)f CwniMatnfUAK.} 16584), AntbMaaflE, laseel MaaÉ, í&ys3MiraíÍ j£y*Ma^{mjW7H) » FIO. 23 31/47 {(fenV^

»«**»i4*i**-j*4*»·— SrWi*„«Í<jinil.£t:_£X £.« t*e*im„.ít*S,li£ !F«a«UiÍÍ„EX»Cíl.B *>Κα»»ϊ £* jm*4* *«»*ss„«aeslí„0í fcKaaaXX Çi«BaK«i#t t„ [RB arSKX<tJS«Sl£í ΪΒ ·Β*ί.„ί(ΛΒ m ύϊ**„Μ<αΒβ.ί£ Xt-O a-D _K«ai I Γ„ tX £·.,«t***B »„ΚΛΒ&ί rSaBBlI^flííf^aií JsM«®a.t:r*^SS«*S tiOJXfctÍBiittt r*í« l»»«eÍt«íMS££I . „»ivrtttí í_ Cif 8 rií •f-M*ss££<, fX C,«ÍBS«H*J8**jÍ.r ;fstilmíl^raítjl9 ktosuiíIiJiiStií te-» ** .,Ηλ**6Ϊ I„EX S«aaaít Ϊ „ÍW &**με***κ I»»«e*„«eeilí ί£^«Β„Μκ«ηΐΐ )iCytis„HeBB.tí„ gr C ,* í*«A*»..S*»»r ϊ^οβ£Ι*Ε!»ί~ί18 fcWasa.tísjttSSíi.í Kft-iídí^KíiiMítl^tX à$(4£ft£ £ Çi.ítSiíííe.Ç.rfl.-EM- **®Mí<5BbIE * Ssíyi«1-.íf«»&í ϊ* P SiMM^wesXÍ^IX C„* rSaatlí^firtUJlS *KM»SISjtSS«*9 Hí«M:JiU«ieíí„i3È fcfc»™*:í £ λ CaEsKbbb EX ϊβ**ΐί„*ΛΛίϊϊ kiyte^WjíesII fe£^fc*_Í*«í“í£í»íS S t* ·ιϊ.,Μ«ίΐϊιΓ£„£Χ C, e La ««««Kj t.,.rs«caie bSfprçf £ í 2 j <4? R«« *»,»#* saIIwÈ* ΒΚαββΙΙ E S.*ií*S(Aii8lI„ í*£ »p*JsK«bu££ £»* «et^lseíl £ bíty«e„-t<eÉ»í£ IsCs^OwíWifsBÍÍ- í» ***«».«* >*.·** E K^<3EiXO«í|S5AVS»a¥fiBeemK?««6<CÉ»lAiU&tSífKr*oeçVKyfS*SVXSt Μ*Μ*ι««η.·ψ·4^^Μ·Β· w>-íwíiw,» » wtT.t.aKWT.YKT.T.fiwj-.iT »**··«<·*·* #«É»t*:*<*É>*w-*»«e*ep»*h,»,<»ewe<‘»*w**eê4»w «t 9****f»p*wevi| X *** l ~~ 1, —

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35/47 FIGM

I 36/47 Figura 25 Manosidase II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) v» w ρ ψ t « τ * β K » *: * i * t α « « τ a » * * β * i i * t * t « * * * t ' na cfeíTíijiWSMMíWew^^nrrrsíitCTtummwít^çMirííWtsmgfntwtCiWfWTCfíAeííÇTíTTCttertetieJkfTttctt **»* l * * í » * i i u H « (i t Μ I » f »1 * U « I U f Μ l t l F ix* *r iHiMtiinrmM! ******** * # * * t « · « « m* e a * v * í [ τ τ x * i tio íj» *rs*™ssw^Mi*^ixxtótçtTl:^í«ííawTxç7i;xTiiv™Tírre^s5Mi.?T&i™*-eM^^mítMij*iwTW«xtoi;*t· tate |«ΜΙίΧΤίΙίΙΙΜ{|(ΙΙΜΙΙϋΜΗΓ!(ΤίΙ(·Ι*Ι l«* iMtMMMtMlUMlIltMTUDtttOtMM t» wu«mi':^M*ti8íTSMwxwtít*K«t£wTtttnes*^^iss^*m*T{*KiWímitjc«à«jií»«isi?WiíJiwríç.Miex*»,T*e ut* * A n * t * * í í í U t TMMTMIMtMTT* * * f 0 t -tn eFSi^íMWBWSeCF^FiX&tiMíttçwmttímtóawtrsiismxwtFFttrittetmtteMíwwcxra^wtrrewiweeT*» *3** t I > I I t II Π t S V 1 M M * * I I F M T t t t t « t ί 1 « * M xix TXix^ex^itfem^tttwrwCTCAnj^iíctwiáMjiiaiCTncTccisctiuuiijiTCTitxjtWMFíeeflitfMiFíeTeaciseTTtTSiSi* !(|l » f f * í il í « f Η Π «I S 1 X í » * * l I Π * tí · * Μ II I io iííw«u?*TCt»mfiímiT£raOT!rriptç>Tifítxiiiíif^dx^i?ítoiít>fíM-jíSi:tíítiui,trisrtsTiEwm«imíííTEeektif«iw f 1 í l M « * * í f Π ϊ » I t « U S F I M i t t H í M * « » >C*t ixTt^^WÍWtTXSWmóttiCIUJWJrttxct^litMitX-^tFtAFÍMXÍXÍX^tilxllXligATtlil^Í^lSl^tt^yJlXÍÍMJ^IU^TCTaxr «|l| F t Μ l í f » í i » F í I I I 1 í » * S I « » i « U t 4 » I « * I f sim m«t*t*«wi*MfJ*MmnMim<i*«attM*M*rrMwrMtmmK*i«w*MS8icM^^ tn* i * I ni T U I F I S M F I H ( i > t « i C O M T « k | F I « lUt íitWrtiSUFeffXííaiiMOTtíiUftiAMiWtTiSlittTrtí^WntíTTSK^WTCtSlWÍ^MWmWAlíWSlMiitkttaitnçrt^lf* Hll | KM í I I «U X i F I Ϊ it tf f « T Μ I I t tl M » I Μ | hh «SiiítWíTW^FMttítTííiTTfefTTítwíscii^siçnctTJ^tTíeeF^FFteííííWiWXttííitcwçritrjtíifí-TtfciiAeAeCTO W*« V«l««VTtFMll«llfTTil»lt(l**ltMyirV|Mf η» mtx^eçxçmm«?Tíiat«iít*í«iXítim^çíi^FtMí*í«t*w«ífT»*m*ttm*tai)ULTKj>i»«ítóu«trt«**e(i ss*t Hl «Μ «l ( m Mi ( I ·«( FU ITiim t t ( II F 1 «K ( T r u t X X * » M * t M « » H * * *? 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