JP2010220616A - 下等真核生物細胞におけるクラス２マンノシダーゼおよびクラスｉｉｉマンノシダーゼの発現 - Google Patents

下等真核生物細胞におけるクラス２マンノシダーゼおよびクラスｉｉｉマンノシダーゼの発現 Download PDF

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Abstract

【課題】下等真核生物において、Ｍａｎα１，３グリコシル結合およびＭａｎα１，６グリコシル結合に対して基質特異性を有するクラス２α−マンノシダーゼを発現することによってヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法からなる。
【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、米国出願第１０／６１６，０８２号に対する優先権を主張し、この出願は、
２０００年６月２８日に出願された米国仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６
月３０日に出願された米国仮出願第６０／２１５，６３８号、および２００１年３月３０
日に出願された米国仮出願第６０／２７９，９９７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の
利益を主張する、２００１年６月２７日に出願された米国出願第０９／８９２，５９１号
の一部継続出願である、２００３年２月２０日に出願された米国出願第１０／３７１，８
７７号の一部継続出願であり、これらの出願の各々が、その全体が、参考として本明細書
中に援用される。
（発明の分野）
本発明は、下等真核生物におけるタンパク質グリコシル化の分野、具体的には、Ｍａｎ
α１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシル結合の加水分解に対して基質特異性を
有するマンノシダーゼ酵素の導入に関する。本発明は、さらに、マンノシダーゼ酵素、お
よび加水分解の結果として生じたＮ−グリカンまたはＮ−グリカン含有中間体をコードす
る遺伝子を含む新規な宿主細胞に関する。
（発明の背景）
（ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路）
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは糖残
基の結合、グリコシル化として知られるプロセスを含む。異なる生物は異なるグリコシル
化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、利用可能な異
なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル
化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される、宿主系に
依存して異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、その場合でも、
非常に非特異的方法でのみグリコシル化する（Ｍｏｅｎｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｌｅｙ
ｄｅｎ，１９９７ Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（３）：１６９−１７５）。
繊維状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシル
ホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高−マンノース」タイプのグリカン
またはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は
、さらにもう１つの方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等
真核生物においては、裸のオリゴ糖側鎖をトリミングして、いくつかのマンノース残基を
除去し、典型的には、下等真核生物のＮ−グリカンでは見られないさらなる糖残基で延長
される。例えば、Ｒ．Ｋ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１９９９，３０，１９３
−２００；Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ，１９９８，２０，１１７１−１１７７；Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａ
ｌｉａｓｓａｒｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２６７，１６９−
１７３；Ｊａｒｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，９：５２８−５３３；およびＭ Ｔａｋｅｕｃｈｉ，
１ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，１９９７，９，Ｓ２９−Ｓ３５参照。
哺乳動物型のオリゴ糖構造の合成は、一連の系列的反応で開始し、当該タンパク質が宿
主生物における分泌経路に沿って移動する間に、この系列において糖残基が付加および除
去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌された
タンパク質の得られたグリコシル化パターンを決定する。かくして、下等真核生物宿主細
胞で発現されたタンパク質の得られたグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺乳動物
のような高等真核生物で発現されたタンパク質のグリコシル化パターンとは実質的に異な
る（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。典型的な真菌Ｎ−グリカンの構造を図１Ａに示
す。
ヒトグリコシル化の初期の工程は、少なくとも２つの異なる相に分けることができる：
（ｉ）脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜での系
列的な一連の反応によって組み立てられ、（ｉｉ）該脂質からのこのオリゴ糖の移動は、
ドリチルピロホスフェートでデノボ合成されたタンパク質に係留させる。特異的移動の部
位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸で
あり得る）中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌ ａｎｄ
ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９９０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３：４３３−４２）。グリ
コシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなるプロセシングは、裸の糖タンパク質が初
期ゴルジ装置に移動する前にＥＲで起こり、そこで、さらなるマンノース残基はゴルジ特
異的アルファ（α−１，２−）マンノシダーゼによって除去される。タンパク質がゴルジ
を通って進むにつれ、プロセシングは継続する。中間ゴルジにおいて、Ｎ−アセチルグル
コサミルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよび
ＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含めた多数の修飾
酵素が特異的糖残基を付加および除去する。最後にはトランス−ゴルジ（ｔｒａｎｓ−Ｇ
ｏｌｇｉ）において、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトラ
ンスフェラーゼ（ＳＴ）は糖タンパク質構造を生じ、これがゴルジから放出される。それ
は、糖タンパク質にそのヒト特徴を与えるのは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチル
グルコサミンおよび高度の末端シアル酸を含有する、ビ−、トリ−およびテトラ−アンテ
ナ構造によって特徴付けられるこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１
Ｂに示す。
ほとんど全ての真核生物において、糖タンパク質は共通する脂質−結合オリゴ糖前駆体
Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコール−ピロホスフェートに由来する。小胞体内
では、ドリコールピロホスフェート結合オリゴ糖の合成およびプロセシングは全ての公知
の真核生物の間で同一である。しかしながら、真菌細胞、例えば、酵母によるコアオリゴ
糖のさらなるプロセシングは、一旦それがペプチドに移動し、ＥＲを去って、ゴルジに入
れば、それが分泌経路に沿って移動するにつれヒトとは有意に異なり、いくつかのマンノ
ース糖の付加を含む。
酵母においては、これらの工程は、順次にマンノース糖をコアオリゴ糖に加える、Ｏｃ
ｈ１ｐ、Ｍｎｔ１ｐおよびＭｎｎ１ｐのようなゴルジに存在するマンノシル−トランスフ
ェラーゼによって触媒される。得られた構造はヒト−様タンパク質の生産には望ましくな
く、かくして、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除するのが望ましい。
マンノシル−トランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば
、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は、致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖お
いて低下したマンノース含有量を呈することが示されており、かくして、高等真核生物の
オリゴ糖により密接に似ている。
（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末
端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および繊維状真菌で生産される糖タンパク質では見
出されない。ヒトにおいては十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコース等）がサイトゾルで合成され、ゴ
ルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖
に結合される（Ｓｏｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，１９８１ Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；Ｓｏｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃ
ｈｂｅｒｇ １９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；Ｐ
ｅｒｅｚ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ １９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。
グリコシル移動反応は、典型的には、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸である副産
物を生じる。一リン酸はアンティポートメカニズムによってヌクレオチド三リン酸糖に代
えての交換において直接的に輸送することができるが、ジホスホヌクレオシド（例えば、
ＧＤＰ）は、輸送されるに先立って、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって
切断されて、ヌクレオシド一リン酸および無機ホスフェートを生じなければならない。こ
の反応は効果的なグリコシル化に重要であり；例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧＤＰａｓｅは、マンノシル化
に必要であることが判明している。しかしながら、そのＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに向けて
９０％低下活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、典型的にはゴルジに
おいてＵＤＰ−特異的ジホスファターゼ活性を欠く。というのは、それはゴルジ−ベース
の糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、すなわち、ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラ
クトースからの）細胞壁多糖に加えることが判明している酵母は、特異的ＵＤＰａｓｅ活
性を有することが判明しており、これは、そのような酵素についての潜在的要件を示す（
Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１
）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であるこ
とが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおいてグリコ
シル−トランスフェラーゼの阻害を妨げるのに重要であり得る（Ｋｈａｔａｒａ ｅｔ
ａｌ．，１９７４）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ、Ｐ．，ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔ，Ｌ．，ｅｔ
ａｌ．１９９８ Ａｂｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ．２９２：３９７−４１３
参照。
（区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの順次のプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）は ＥＲ
およびゴルジ装置の内部（ルミナル）表面をライニングし、それにより、それがＥＲおよ
びゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とす
る「触媒」表面を提供する。シス、メジアルおよびトランスのゴルジの多数区画ならびに
トランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こ
り得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＥＲにお
ける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特異的炭水化物構造が合成され得
るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼ
に順次に暴露される。これらの酵素をその各オルガネラに保持し、係留する正確なメカニ
ズムを明らかにするために多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、
証拠は、ステム領域、膜にわたる領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して
、酵素を個々のオルガネラの膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその座に局
在化することを示唆する（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．Ａ．（１９９８）Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２参照）。
いくつかの場合において、これらの特異的相互作用は種をまたいで機能することが見出
された。例えば、ラットからのα２，６−ＳＴ（該動物のトランス−ゴルジに局在化する
ことが知られている酵素）の膜にわたるドメインは、酵母ゴルジにおいてやはりレポータ
ー遺伝子（インベルターゼ）を局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ ｅｔ
ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。しか
しながら、全長α２，６−ＳＴの一部としての非常に同一の膜にわたるドメインはＥＲに
保持され、酵母のゴルジにさらには輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０（３）：８０９−１７）。ヒトからの
全長ＧａｌＴは、高い転写レベルが示されているにも拘らず酵母では合成されない。対照
的に、インベルターゼレポーターに融合された同一ヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低い生
産レベルにも拘らず酵母ゴルジへの局在化を指令することができた。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅ
ｋおよび共同研究者は、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＴ１）の２８アミノ酸
、小胞体テイル、膜貫通領域およびステム領域の８つのアミノ酸を含む領域を、ヒトＧａ
ｌＴの触媒領域へ融合させることは、活性なＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを
示した。他のガラクトシルトランスフェラーゼは特定のオルガネラに存在する酵素との相
互作用に依拠するようである。なぜならば、その膜貫通領域の除去の後には、それは依然
として適切に局在化できるからである。
グリコシル化酵素の不適切な局在化は、経路における酵素の適切な機能を妨げかねない
。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ（Ｅａｄｅｓ ａｎｄ Ｈｉｎｔｚ，２０００ Ｇｅｎｅ ２５５（１）：２
５−３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い総じてのレベルにも拘らず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で
形質転換した場合にＧｌｃＮＡｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）
。ＧｎＴＩは、活発に発現されるものの、該酵素がその基質の双方：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃおよび生産的Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質（全てのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が生産
的というのではない；後記参照）と接触しないように不正確に局在化され得る。あるいは
、宿主生物はゴルジにおいて適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供することができ
ないか、または該酵素は適切に局在化されないかも知れないが、それにも拘らず、その新
しい環境で不活性である。加えて、宿主細胞に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、
哺乳動物で見出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓおよび
共同研究者は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから得られたセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）から
のＮ−グリカンの約３分の１がインビトロにてＡ．Ｓａｉｔｏｉ １，２−マンノシダー
ゼよってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされ得ることを見出した。しかしながら、
それらのＮ−グリカンの１％未満がＧｎＴＩに対する生産的基質として働くことができた
。Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１
−７０７。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の単なる存在は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の
さらなるインビボプロセシングを達成できることを保証しない。必要なのは、生産的なＧ
ｎＴＩ−反応性Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の形成である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は細
胞で生産され得るが（約２７モル％）、小さな割合のみがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換
され得る（約５％未満、Ｃｈｉｂａ ＷＯ ０１／１４５２２参照）。
今日、下等真核生物における特定の異種的に発現されたグリコシルトランスフェラーゼ
またはマンノシダーゼが（１）十分に翻訳され、（２）触媒的に活性であり、または（３
）分泌経路内で適切なオルガレラに局在化されるかを予測する信頼できる方法はない。こ
れらの全ての３つは下等真核生物においてグリコシル化パターンに影響する必要があるの
で、現在利用できない、予測ツールの非存在下で酵素の所望の触媒機能および適切な保持
を達成するためのシステム的なスキームが望まれる。
（治療糖タンパク質の生産）
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシ
ル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定７０％がグリコ
シル化され、かくして、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化できる生産システム（す
なわち、宿主細胞）に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が（１）免疫原性、（
２）薬物動態学特性、（３）トラフィッキングおよび（４）治療タンパク質の効率を決定
することにおいて重要な役割を演じることを示している。かくして、製薬産業によるかな
りの努力は、できる限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得る
ためのプロセスを開発することに向けられてきた。今日、ほとんどの糖タンパク質は哺乳
動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化（すなわ
ち、シアル酸の末端添加）の程度を増強させるそのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含
むことができ、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが知られ
ている。別法として、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのヌクレオチド糖（
例えば、２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を用いるそのよ
うな糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良することができる。
ほとんどの高等真核生物は、ヒトで見出されたのと類似のグリコシル化反応を行うが、
前記宿主系で発現された組換えヒトタンパク質は不変的にその「天然」ヒトカウンターパ
ートとは異なる（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １０
（５）：４７７−４８６）。かくして、広範な開発研究が、これらの発現系で作られるタ
ンパク質の「ヒト特性」を改良する方法を見出すことに向けられてきた。これは、醗酵条
件の最適化、およびヒト様グリコ形態の形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入す
ることによる、タンパク質発現宿主の遺伝的修飾を含む。Ｇｏｏｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．
（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９（１２）：１３４７−５５；Ａｎｄｅｒｓ
ｅｎ ａｎｄ Ｇｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．５（５）：５４６−４９；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉ
ｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４８（８）：８７０−８０；Ｗｅｉｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ
．（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１１）：１１１６−２１；Ｙａｎ
ｇ ａｎｄ Ｂｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８；３７０−
８０。全ての哺乳動物発現系に関する固有の問題は解決されていない。
（真核生物微生物を用いる糖タンパク質の生産）
小胞体におけるタンパク質に移動されたコアオリゴ糖構造は基本的には哺乳動物および
下等真核生物で同一であるが、実質的な差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こる
その後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、か
なり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系より
も優れた注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主として
の下等真核生物の使用を妨げてきた。
内因性宿主グリコシル化経路を利用する酵母のような微生物宿主で生産された治療糖タ
ンパク質は、哺乳動物細胞で生産されたものと構造的に異なり、典型的には、大いに低下
した治療効果を示す。そのような糖タンパク質は、典型的には、ヒトにおいては免疫原性
であり、投与の後にはインビボで低下した半減期（従って、低下した生物活性）を示す（
Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，Ｓ２９−Ｓ３５）。ヒトおよび動物における特
異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は末端マンノース残基を認識
し、血流から外来性糖タンパク質の迅速なクリアランスを促進することができる。さらな
る悪影響はタンパク質折畳、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、
輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルギ
ー性の変化を含み得る。
酵母および繊維状真菌は、共に、細胞内および分泌された双方の組換えタンパク質の生
産で首尾よく用いられてきた（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ
２０００ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（ｌ）：４５
−６６；Ｈａｒｋｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７（６）：５９６；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｂｓｔｒ．Ｐ
ａｐｅｒｓ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａ
，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−
２５１）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔ
ｈａｎｏｌｉｃａ，およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのような種々の酵
母は真核生物発現系として特に重要な役割を演じてきた。何故ならば、それらは、高い細
胞密度まで増殖し、大量の組換えタンパク質を分泌できるからである。同様に、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａ
ｓｓａなどのような繊維状真菌は、産業スケールで糖タンパク質を効果的に生産するのに
用いられてきた。しかしながら、前記したように、これらの真核生物微生物のいずれかに
おいて発現される糖タンパク質は、動物におけるものとはＮ−グリカン構造が実質的に異
なる。このことは、多くの治療糖タンパク質のための生産で宿主としての酵母または繊維
状真菌の使用を妨げてきた。
酵母および真菌におけるグルコシリ化はヒトにおけるものと非常に異なるが、いくつか
の共通する要素が共有されている。第一の工程、コアオリゴ糖構造の新成タンパク質への
移動は酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物で高度に保存されている（図
１Ａおよび１Ｂを比較されたし）。しかしながら、コアオリゴ糖のその後のプロセシング
は酵母においてかなり異なり、数個のマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴルジに
存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１、等）
によって触媒され、これはマンノース糖をコアオリゴ糖に順次に付加する。得られた構造
は、ヒューマノイドタンパク質の生産には望ましくなく、かくして、マンノシルトランス
フェラーゼ活性を低下または排除することが望ましい。マンノシルトランスフェラーゼ活
性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）
は致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖において低下したマンノース含有量を呈
することが示されている。また、マンノシルリン酸トランスフェラーゼのような他のオリ
ゴ糖プロセシング酵素もまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに応じて排除し
なければならない。望まない内因性グリコシル化反応を低下させた後、複合体Ｎ−グリカ
ンの形成が宿主系でなされなければならない。これは、数個の酵素および糖ヌクレオチド
トランスポーターの安定な発現を必要とする。さらに、成熟化するグリコシル化構造の順
次のプロセシングが確実になるに、これらの酵素を局在化する必要がある。
哺乳動物治療剤として用いるのにより適した糖タンパク質を提供するために真核生物微
生物のグリコシル化経路を修飾しようとするいくつかの努力がなされてきた。例えば、数
個のグリコシルトランスフェラーゼが別々にクローン化され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）およ
び他の真菌で発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．）（１９９９）Ｇｌｙｃｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ９（１）：５３−８，Ｋａｌｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｌ
ｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。しかしながら、ヒト細胞で作成さ
れたものに似ているＮ−グリカンは得られなかった。
酵母は多様なマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにお
けるＭＮＮ１のような１，３−マンノシルトランスフェラーゼ；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ
Ｅｍｒ，１９９１ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８、１，２−
マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／
ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギ
ュレーター（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、
ならびに内因性グリコシル化反応に関与するさらなる酵素を生産する。これらの遺伝子の
多くは個々に欠失され、改変されたグリコシル化プロフィールを有する生きた生物を生起
する。その例を表１に示す。
日本国特許出願第８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯ
ＣＨ１ホモログの欠失を開示している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨ１は
、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に付加してＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２
を生じさせる１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。次いで、３つの１，
６マンノース残基を含むＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造はインビボにてさらなる１，２−、
１，６−および１，３−マンノシルトランスフェラーゼに対する基質となり、これは、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特徴的であって、典型的には、Ｎ−グリカン当たり３０〜４０
のマンノース残基を有し得る高マンノシル化糖タンパク質に導く。Ｏｃｈ１ｐは１，６マ
ンノースのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コアへの移動を開始する故に、それは、しばしば、そ
れをゴルジにおいて後に作用する他の１，６マンノシルトランスフェラーゼから区別する
ために「開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのｏｃｈ１ ｍｎｎ１ ｍｎｎ４変異体株において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２でグリ
コシル化されたタンパク質が蓄積し、超マンノシル化は起こらない。しかしながら、Ｍａ
ｎ８ＧｌｃＮＡｃ２はヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのような哺乳動物
グリコシルトランスフェラーゼに対する基質ではなく、従って、それ自身での、その変異
体株の使用は、複雑なまたはハイブリッドグリコシル化パターンでの哺乳動物様タンパク
質を生産するのに有用ではない。
Ａ．ｓａｉｔｏｉに由来する真菌マンノシダーゼを小胞体（ＥＲ）内へ操作することに
よって、（インビボにて５０％より高い高効率トリミングは未だ証明されていないが）Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
異性体にトリミングすることができる。このアプローチの欠点は二倍にある：（１）形成
されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が実際に（分泌され、細胞外部でマンノシダーゼによ
ってさらに修飾されたというよりはむしろ）インビボで形成されたか否かは明確ではなく
；そして（２）いずれかの形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、もし実際にインビ
ボで形成されたならばＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるその後のＮ−グリカン修
飾に対する生産的な基質である正しいイソ形態であるかは明らかでない（Ｍａｒａｓ ｅ
ｔ ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。
真菌宿主に由来するよりヒト様糖タンパク質を提供する目的で、米国特許５，８３４，
２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉに由来するハイブリッド糖タンパク
質を生産する方法を開示する。ハイブリッドＮ−グリカンはコアマンノース構造のＭａｎ
α１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１または２の
複雑なアンテナを有する。この構造は有用性を有するが、該方法は、多数の酵素工程をイ
ンビトロで行わなければならず、これは、コスト高で時間を消費する不利を有する。単離
された酵素は調製するのにコスト高であり、コスト高の基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃ）を必要とする。また、該方法は所望のタンパク質上での複雑なグリカンの生成を可
能としない。
（Ｎ−グリカントリミングに関与する細胞内マンノシダーゼ活性）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物において複雑なＮ−グリカン形成のため
の主な中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の
トリミングで必要である。以前の研究は、切形されたマウス、真菌およびヒトα−１，２
−マンノシダーゼがメチロトロピック酵母Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得、Ｍａｎ８
ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミング活性を呈することができる
ことを示した（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ Ｏｃｔ；
８（１０）：９８１−９５；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ １９９８ Ｊｕｎ；８（６）：５８５−９５，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．
（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０３（２−３）：１７３−８）。しかしながら、今
日、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの分泌された糖タンパク質でのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２か
らＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
さらに、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼの単なる存在は、それ自体、Ｍａｎ
８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への適切な細胞内トリミングを保証しない
（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＤＥＬタグ化マンノシダーゼが一義的にＥＲに局在化さ
れ、実質的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が欠失できないインフルエンザヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）レポータータンパク質と共に共発現される、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．ＷＯ
０２／００８５６ Ａ２参照。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ，初期ゴルジお
よびサイトゾルに局在化されたキメラα−１，２−マンノシダーゼ／Ｏｃｈ１ｐ膜貫通ド
メイン融合はマンノシダーゼトリミング活性を有しない、Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１
９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４も参照され
たし）。従って、ＥＲまたはゴルジにおけるマンノシダーゼの単なる局在化は、その標的
化されたオルガネラにおいて各酵素の活性を保証するには不十分である（また、Ｔ．ｒｅ
ｅｓｅｉからのα−１，２−マンノシダーゼが、細胞内に局在化しつつ、マンノシル化の
程度を減少させるよりはむしろ増加させたことを示す、Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．
（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７も参
照されたし）。今日膜貫通局在化配列を用いる、酵母または真菌いずれかにおける活性な
異種α−１，２−マンノシダーゼの細胞内の局在化を示す報告はない。
一次Ｎ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生することができる株を作成
するのは有用であるが、ヒトグリカンにより近く似せるようにこれらの高マンノース前駆
体構造をさらに修飾しようとするいずれの試みもさらなるインビボまたはインビトロ工程
を必要とする。インビトロにて真菌および酵母からのグリカンをさらにヒト化する方法は
米国特許第５，８３４，２５１号（前傾）に記載されている。もし、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ
ｃ２をさらにインビボでヒト化すべきならば、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が、事
実、細胞内で生じ、培地中でのマンノシダーゼ活性の生成物ではないことを保証しなけれ
ばならない。酵母または真菌における複雑なＮ−グリカン形成は、細胞内で生じさせるべ
き高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を必要とする。なぜならば、細胞内Ｍａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２グリカンのみがインビボでハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンにプロセシン
グできるからである。加えて、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の大部分は、実際、Ｇ
ｎＴＩに対する基質であり、ハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンの形成を可能とする
ことを示さなければならない。
従って、非−ヒト真核生物宿主細胞、特に酵母および繊維状真菌においてヒト−様糖タ
ンパク質構造へさらにプロセシングすることができる高細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含
有量によって特徴付けられる糖タンパク質を生産するための方法に対する要望が存在する
。
（クラス２マンノシダーゼ）
多数のクラス２マンノシダーゼ精製され特徴付けられている：マウスマンノシダーゼＩ
Ｉ、ヒトーマンノシダーゼＩＩおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシダーゼＩＩ（図２４
はマンノシダーゼのクラスの系統発生樹を示す）。クラス２マンノシダーゼ酵素は一般に
ゴルジに局在化されたＮ−結合オリゴ糖上のα１，３およびα１，６マンノースグリコシ
ド結合の加水分解を担う。少なくとも５つのタイプのクラス２マンノシダーゼが同定され
ている、すなわち：（１）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ；（２）ゴルジα−マンノシダ
ーゼＩＩｘ；（３）リソソームα−マンノシダーゼ；（４）サイトゾルα−マンノシダー
ゼ；および（５）マウスおよびブタの精子または精巣上体組織から特徴付けられた酵素。
Ｍｏｒｅｍｅｎ Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ
１５７３（２００２）２２５−２３５。
ヒト先天的赤血球造血不全貧血タイプＩＩは、マウスで示されたように、機能的α−マ
ンノシダーゼＩＩ遺伝子欠如と関連付けられている。Ｃｈｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ
１９９７ Ｊｕｌ １１；９０（１）：１５７−６７。この遺伝的欠陥は（陽性酸性化血
清溶解テストでの遺伝的赤芽球多核性）ＨＥＭＰＡＳと呼ばれ、さらなる研究がα−マン
ノシダーゼＩＩの役割を調査中である。例えば、α−マンノシダーゼＩＩをコードする単
一遺伝子の変異は、ヒト全身性エリテマトーデスと同様な全身性自己免疫疾患をもたらす
ことが示されている。Ｃｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ２００１ ９８：１１４２−１１４７。
糖タンパク質形成における酵素活性の重要性はよく確立されている；しかしながら、治
療糖タンパク質の生産のためのそのような活性の効果的な発現は下等真核生物細胞では達
成されていない。
（１）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＥＣ．３．２．１．１１４）は、短いＮ−末端細胞質
テイル、ストークセグメントによって大きなルミナルＣ−末端触媒部分に連結された単一
−スパン膜貫通ドメインから構成される、サイズがほぼ１２５ｋＤａであるＩＩ型膜貫通
タンパク質である。Ｍｏｒｅｍｅｎ ａｎｄ Ｔｏｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２６０，６６５４−６６６２；Ｍｏｒｅｍｅｎ ａｎｄ Ｔｏｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０９４５−１０９５１。マンノシダーゼＩＩの機能は、分
泌経路におけるＮ−グリカンのプロセシングに必須である。哺乳動物細胞においては、こ
の特別な酵素は基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２上のＭａｎα１，３およびＭａ
ｎα１，６グリコシド結合を加水分解することが確立されている。その後のＮ−グリカン
プロセシングは他のグリコシル化酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ）によって触
媒され、その基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−シアル酸）
およびその各トランスポーターとの所望のグリコ形態を生じる。例えば、個々に引用して
その全体が援用される。ＷＯ ０２／００８７９参照。
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩをコードする部分的クローンは、ラット肝臓λｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーから単離されている。Ｍｏｒｅｍｅｎ，ＫＷ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９ Ｊｕｌ；８６（１４）：５２７６−８０。マ
ウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩおよびヒトαマンノシダーゼＩＩもまた特徴付けられ
、ＣＯＳ細胞で発現されている。Ｍｏｒｅｍｅｎ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１ Ｄｅｃ；１１５（６）：１５２１−３４。ゴルジαマンノシダ
ーゼＩＩ酵素で行われた研究は、このクラスの酵素のＣ−末端ドメイン内でかなりの類似
性があることを示している。加えて、基質特異性研究は、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ
酵素によるα１，３および／またはα１，６グリコシド結合の加水分解は、オリゴ糖基質
上の末端ＧｌｃＮＡｃを必要とすることを示す。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ゴルジα−マンノシダーゼＩＩは
マウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩ ｃＤＮＡを用いて単離されており、他のα−マン
ノシダーゼからの領域に対するかなりの類似性を有することが示されている。Ｆｏｓｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １５４（１９９５）１８３−１８６。以前の研究は、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａおよびマウスのｃＤＮＡ配列が４１％同一性および６１％類似性のアミノ
酸配列を翻訳することを示している。ＣＨＯＰ細胞（ポリオーマ大Ｔ−抗原を安定に発現
するＣＨＯ細胞）におけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゴルジα−マンノシダーゼＩＩ配列の発
現は活性であることが示されており、また、主としてゴルジ装置に局在化されることも示
されている。Ｒａｂｏｕｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１９９９ Ｏ
ｃｔ；１１２（Ｐｔ１９）：３３１９−３０。
（２）ゴルジα−マンノシダーゼＩＩｘ
ヒトα−マンノシダーゼＩＩｘ（α−マンノシダーゼＩＩイソタイプ）をコードする遺
伝子が特徴付けられている。Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２４２，４４６−４５３（１９９６）。α−マンノシダーゼＩＩｘ酵素の過剰発現はＣＨ
Ｏ細胞におけるＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２への変換を導く。Ｏｈ
−ｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，１２８０−１２８８（
２００１）。マンノシダーゼの二つのタイプ（ＩＩおよびＩＩｘ）はゴルジにおけるＮ−
グリカンのプロセシングに密接に関連している。このゴルジα−マンノシダーゼＩＩｘは
α−マンノシダーゼＩＩに対する６６％同一性を有し、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖
のＭａｎα１，６およびＭａｎα１，３を加水分解する類似の触媒活性を有する。より最
近の研究は、α−マンノシダーゼＩＩｘ−欠陥雄マウスにおける不妊性の明らかな表現型
を明らかとした。Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００２ Ｄｅｃ １９
；１５７３（３）：３８２−７。一つの研究は、α−マンノシダーゼＩＩｘ−欠陥マウス
精巣が、ＧｌｃＮＡｃ−末端複合体タイプのＮ−グリカンの低下したレベルを示したこと
を見出した。
（３）リソソームα−マンノシダーゼ
もう１つのタイプのクラス２のマンノシダーゼが、真核生物細胞のリソソームに見出さ
れており、糖タンパク質の異化（分解）に関与する。中性ｐＨ最適値を有するゴルジマン
ノシダーゼＩＩ酵素とは異なり、リソソームマンノシダーゼＩＩは低いｐＨ最適値（ｐＨ
４．５）を有し、広い天然基質特異性を有し、合成基質ｐ−ニトロフェニルーα−マンノ
シダーゼに向けて活性であり、スワインソニンによる阻害に対して感受性である。Ｄａｎ
ｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４，５５１−５６６；
Ｍｏｒｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４，１１３−
１２５。構造的には、リソソームα−マンノシダーゼは、ゴルジ酵素の細胞質テイル、膜
貫通ドメイン、およびステム領域の代わりにＮ−末端シグナル配列を有する。Ｍｏｒｅｍ
ｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５７３（
２００２）２２５−２３５。ヒトリソソームα−マンノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２
４）はクローン化されており、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで発現されている。Ｌｉ
ａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６ Ｎｏｖ ８：２７１（４５）
：２８３４８−５８。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍに由来するリ
ソソームα−マンノシダーゼおよびマウスゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（α１，３−／
１．６−マンノシダーゼ活性を処理する糖タンパク質）の間のアミノ酸配列保存の領域に
基づき、マウスリソソームα−マンノシダーゼをコードするｃＤＮＡをクローン化した。
Ｍｅｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７
Ａｕｇ ２９；１３３６（２）：１３２−４６。リソソームα−マンノシダーゼにおける
欠陥は、α−マンノシドーシスといわれるヒト遺伝病をもたらす。
（４）サイトゾルα−マンノシダーゼ
サイトゾルα−マンノシダーゼＩＩは他のクラス２マンノシダーゼとはあまり類似では
なく、触媒活性に対してＺｎ２＋よりもＣｏ２＋を好むようである。Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ
．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５７３（２００２
）２２５−２３５。リソソームα−マンノシダーゼＩＩのように、それは糖タンパク質の
異化に関与する。サイトゾルα−マンノシダーゼＩＩは、タンパク質分解廃棄のために細
胞質へレトロ−移動された（ｒｅｔｒｏ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ）ＥＲのルーメン中
で不適切に折り畳まれた糖タンパク質を異化する。Ｄｕｖｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．３３５（１９９８）３８９−３９６；Ｇｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．３１６（１９９６）７８７−７９２。構造的にはこの酵素は切断可能なシグ
ナル配列または膜貫通ドメインを有しない。
クラス２マンノシダーゼの特徴を呈するさらなるマンノシダーゼは記載されているが、
まだ配列整列による直接的比較のためにクローン化されていない。Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．
Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５７３（２００２）
２２５−２３５。
（クラスＩＩＩマンノシダーゼ）
例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へ変換する、オリゴ糖の
Ｍａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合のトリミングにやはり関与するクラ
スＩＩＩマンノシダーゼが最近クローン化され同定されている。今日、このクラスのタン
パク質の二つのメンバーのみが知られている。同定された最初のメンバーは、古典的なゴ
ルジマンノシダーゼＩＩ活性を欠くが、コアマンノース−１，３分岐でのＧｌｃＮＡｃの
存在とは独立している、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を直接的にＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変
換する別のメカニズムを保有する貧血マウスに由来するものであった（Ｄ．Ｃｈｕｉ，ｅ
ｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９７ ９０：１５７−１６７）。このクラスＩＩＩマンノシダ
ーゼは未だクローン化されるべきであるが、同様の活性を持つタンパク質はＳｆ９細胞か
らクローン化されている（Ｚ．Ｋａｗａｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０
０１ ２７６（１９）：１６３３５−１６３４０）。クローン化し、特徴付けすべきクラ
スＩＩＩマンノシダーゼの唯一のメンバーは、鱗翅目昆虫細胞株Ｓｆ９起源である（Ｄ．
Ｊａｒｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７ ７：１１３−１２７
）。このＳｆ９ゴルジマンノシダーゼＩＩＩはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ３Ｇｌｃ
ＮＡｃ２に変換し、そして、ゴルジマンノシダーゼＩＩとは異なり、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ
５ＧｌｃＮＡｃ２をプロセシングしない。このクラスのマンノシダーゼのユニークな特徴
は、Ｍａｎα１，３／１，６活性を保有することに加えて、それがクラスＩゴルジマンノ
シダーゼのようにα−１，２マンノシダーゼ活性を保有することである。さらに、ゴルジ
マンノシダーゼＩ酵素のように、このＳｆ９マンノシダーゼＩＩＩはＭａｎ９ＧｌｃＮＡ
ｃ２よりも効率的にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングする。
Ｎ−グリカンをプロセシングすることにおけるマンノシダーゼ酵素活性の利用性を仮定
すれば、オリゴ糖についてＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６に対する基質特異性を有
する触媒的に活性なα−マンノシダーゼＩＩを発現する工程を含む、下等真核生物宿主細
胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を有することが望ましい。
（発明の要旨）
本発明は、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生する方法を提供し
、この方法は、クラス２マンノシダーゼ酵素またはクラスＩＩＩマンノシダーゼ酵素の触
媒活性フラグメントを発現する工程を包含する。
本発明の１つの実施形態は、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生
するための方法を提供し、この方法は、その細胞において、Ｍａｎα１，３グリコシド結
合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質を、そ
の基質の少なくとも１０％のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα１，６結合がイ
ンビボで加水分解される程度まで加水分解し得るマンノシダーゼ酵素活性を発現する工程
を包含する。
本発明の別の実施形態は、下等真核生物宿主細胞において所望のＮ−グリカンを産生す
るための方法を提供し、この方法は、その細胞において、Ｍａｎα１，３グリコシド結合
およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質をインビ
ボで加水分解し得るマンノシダーゼ酵素活性を発現する工程を包含し、ここで、所望のＮ
−グリカンは、宿主細胞内で少なくとも１０モル％の収率で産生される。
好ましくは、産生される所望のＮ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。別
の好ましい実施形態において、所望のＮ−グリカンは少なくともオリゴ糖分枝Ｍａｎα１
，３（Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａ
ｓｎを有するものとして特徴付けられる。糖タンパク質は、好ましくは、宿主細胞から単
離される。なお別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ酵素活性は、Ｍａｎα１
，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合を含むオリゴ糖基質のＭａｎα
１，３結合およびＭａｎα１，６結合の両方をインビボで加水分解し得る。
別の好ましい実施形態において、オリゴ糖基質は、Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍ
ａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎ
α１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１
，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ
１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａ
ｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮ
Ａｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ
１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３
（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１
，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２
Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，
４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎまたは高マンナンとして特徴付けられる。
好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、クラス２マンノシダーゼ活性とし
て特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラス２マンノシダーゼ活性はＧｌ
ｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−Ｇ
ｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍ
ａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ；またはＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍ
ａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する
基質特異性を有する。なおより好ましい実施形態において、クラス２マンノシダーゼ活性
は、高等真核生物宿主細胞のゴルジ装置に通常見出されるものである。
別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、クラスＩＩｘマンノシダーゼ
活性として特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラスＩＩｘマンノシダー
ゼ活性はＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡ
ｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）
Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＭａｎα１，２
Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−Ｇｌ
ｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する。
さらに別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性はクラスＩＩＩマンノシダ
ーゼ活性として特徴付けられる。より好ましい実施形態において、クラスＩＩＩマンノシ
ダーゼ活性は（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４
−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮ
Ａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；または高マンナンに対する基質特異性を有する。
上記実施形態のいずれか１つにおいて、マンノシダーゼ活性は好ましくは過剰発現され
る。別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼは、さらに、Ｍａｎα１，２結合を
加水分解し得る。本発明のマンノシダーゼ活性は、好ましくは、約５．０〜約８．０の最
適ｐＨを有する。
別の実施形態において、マンノシダーゼ活性は宿主細胞の分泌経路内に局在化される。
好ましくは、マンノシダーゼ活性は宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジ網
の少なくとも１つの内に局在化されたポリペプチドから発現される。
１つの好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、細胞標的シグナルペプチド
に融合されたマンノシダーゼ触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現
される。より好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、宿主細胞に対して天然
のマンノシダーゼ触媒ドメインをコードする配列を含む核酸から発現される。別のより好
ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、宿主細胞に対して異種であるマンノシ
ダーゼ触媒ドメインをコードする配列を含む核酸から発現される。
別の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ酵素活性は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉ
ｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシ
ダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダー
ゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマ
ンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マンノシダーゼＩＩからなる群より選択される。
別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞に対して天然の標的ペプチ
ドをコードする配列を含む核酸から発現される。
別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、マンノシダーゼ触媒ドメインに対し
て異種である標的ペプチドをコードする配列を含む核酸から発現される。
好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓ
ａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ
、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂ
ｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓ
ｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ
．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍお
よびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される。より好ましい実施
形態において、宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。
本発明は、さらに、上記方法のうちの１つによって産生された糖タンパク質およびＮ−
グリカンを提供する。好ましい実施形態において、糖タンパク質は治療用タンパク質であ
る。より好ましい実施形態において、治療タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイ
ン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロンγ、イン
ターフェロン−ω、および顆粒球−ＣＳＦ）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第Ｉ
Ｘ因子、およびヒトプロテインＣ）、可溶性ＩｇＥレセプターα−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフ
ラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、チマーゼ、および尿素トリプシ
ンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキ
シンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管上皮成長因子−２、骨髄性前駆体阻害因
子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−胎児タンパ
ク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、ａｋａ ＴＮＦ結
合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレー
ターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ
−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦレセプターＦ
ｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ
（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）からなる群より選択される。
本発明は、さらに、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔ）を含む核酸ライブラリーを提供し、ここで、少なくとも別の遺伝子構築物は
、通常は関連しない細胞標的シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントとインフレ
ーム連結したマンノシダーゼクラス２、ＩＩｘまたはＩＩＩ触媒ドメインをコードする核
酸フラグメントを含む。
好ましい実施形態において、マンノシダーゼ触媒ドメインはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏ
ｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａマンノシダ
ーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼ
ＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマン
ノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マンノシダーゼＩＩからなる群より選択される。
別の好ましい実施形態において、細胞標的化ペプチドをコードする核酸フラグメントは
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ
１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃ
ｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｎ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６
からなる群より選択される。
本発明の別の実施形態は、発現制御配列に連結した上記ライブラリーのいずれか１つに
由来する融合構築物を含むベクターを提供し、ここで、上記細胞標的シグナルペプチドは
ＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジ網の少なくとも１つに標的化される。より好ましい
実施形態において、発現制御配列は誘導性または構成的である。なおより好ましい実施形
態において、ベクターは、宿主細胞での発現の際に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ
２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２をインビボで産生することに
関与するマンノシダーゼ活性をコードする。
本発明の別の実施形態は、上記ベクターの少なくとも１つを含む宿主細胞を提供する。
より好ましい実施形態において、ベクターはｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６
およびｐＫＤ１６と称されるベクターの群から選択される。
本発明の別の実施形態は、キメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドは、
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現
の際に、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれか
または両方を含むオリゴ糖基質を、インビボで、基質のＭａｎα１，３結合および／また
はＭａｎα１，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解
し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
本発明の別の実施形態は、キメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドは、
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現
の際に、インビボで、Ｍａｎα１，３グリコシド結合、Ｍａｎα１，６グリコシド結合ま
たはＭａｎα１，２グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、基質のＭａｎα１，３結合、
Ｍａｎα１，６結合またはＭａｎα１，２結合の検出可能な部位がインビボで加水分解さ
れる程度まで、加水分解し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
本発明の別の実施形態は、上記キメラポリペプチドをコードする核酸、または上記キメ
ラポリペプチドを含む宿主細胞を提供する。
本発明の別の実施形態は、上記核酸を含む宿主細胞を提供する。
本発明の別の実施形態は、上記宿主細胞で産生された糖タンパク質を提供する。より好
ましい実施形態において、宿主細胞で産生されたＮ−グリカンが提供される。より好まし
くは、糖タンパク質は一様性（ｕｎｉｆｏｒｍ）として特徴付けられる。
本発明の別の実施形態は、保存領域である配列番号５〜配列番号１５からなる群より選
択される核酸配列を含むか、またはそれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供
する。
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術
用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限
り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技
術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵
素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質化学および核
酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用い
られる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明の方法および技術は、一般には、他に示されない限り、当該分野で周知の従来法
に従って、そして本明細書中に引用されかつ本明細書中にわたって議論される種々の一般
的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅ
ｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補
遺）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ Ｅ．Ｔａｙｌｏ
ｒ，Ｋｕｒｔ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）
；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂ
ｏｉｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｖｏｌ Ｉ １９
７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅ
ｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｖｏｌ ＩＩ １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書中に
記載される分子生物学および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、および医学および
医薬化学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連する命名法、お
よびその実験室的手法および技術は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるもの
である。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許文献および他の参考文献は、参考として援
用される。
以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである
。
本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎ−グリカン」はＮ−結合オリゴ糖（例えば、ポ
リペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合に
よって結合したもの）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の一般的な五糖
コアを有する（「Ｍａｎ」は、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」は、グルコースをいい；そ
して「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンをい
う）。Ｎ−グリカンに関して用いられる用語「トリマンノースコア」はまた、構造Ｍａｎ
３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に付加さ
れた周辺の糖（例えば、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して
異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝した成分に従って分類される（例えば、高マンノース
、複合体またはハイブリット）。
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５以上のマンノース残基を有する。「複合体」型
Ｎ−グリカンは、代表的には、１，３マンノースの結合手に結合した少なくとも別のＧｌ
ｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結合手に結合した少なくとも
別のＧｌｃＮＡｃを有する。複合体Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残
基を有し得、この残基は、必要に応じて、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここ
で、「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、そして「Ａｃ」はアセチルをいう）で修飾され
る。複合体Ｎ−グリカンは、代表的には、例えば：ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃａ２−６
ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡ
ｃａ２−３／６Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−；ＧｌｃＮＡｃａ１−４Ｇａｌｂ１−
（ムチンのみ）；Ｆｕｃａ１−２Ｇａｌｂ１−（血液型Ｈ）のような、オリゴ糖で終わる
少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルはガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧ
ｌｃＮＡｃ残基で生じ、リン酸エステルはマンノース残基で生じ得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅ
ｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）はＯ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（
Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合体Ｎ−グリカンはまた、「分
枝している」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る
。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースの結合手の
末端に少なくとも別のＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結
合手に０またはそれ以上のマンノースを有する。
Ｎ−グリカンの産生に関して用いられる用語「優勢な」または「優勢に」とは、マトリ
ックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって検出さ
れる主要なピークを表す構造をいう。
本明細書中で用いられる略語は、当該分野における共通の用法である（例えば、上記の
糖の略語を参照のこと）。他の共通の略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅ
Ｃ３．２．２．１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼ酵素をいう「ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒ」または「ＧｎＴ」；Ｎ−アセチルノイラミン
酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。
本明細書中で用いられる場合、「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」
とは、３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンがそれに結合しているタンパク質、
および合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビ
ボで操作され得る）を代替的にいう。好ましくは、本発明により産生される糖タンパク質
は、少なくとも一時的には、少なくとも２０モル％、好ましくは２０〜３０モル％、より
好ましくは３０〜４０モル％、さらにより好ましくは４０〜５０モル％、そしてさらに好
ましくは５０〜１００モル％のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２中間体を含む。これ
は、例えば、本発明の宿主細胞を操作して、「優れた」、すなわちより効率的なグリコシ
ル化酵素を発現することによって達成され得る。例えば、マンノシダーゼＩＩは、宿主細
胞中の部位に存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、ここで、タンパク質
はグリコシル化され、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞オルガネラに対して酵素を標
的化することによって、宿主細胞中に導入される。
用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を変化させることに関連して用いられる場合
、少なくとも１つの酵素活性を有する分子をいい、全長酵素、触媒活性フラグメント、キ
メラ、複合体などを含む。酵素の「触媒活性フラグメント」とは、検出可能なレベルの機
能的（酵素的）活性を有するポリペプチドをいう。酵素活性は、その後のプロセシング酵
素が、インビボで所望の糖形態の約５１％を産生する能力を有する場合、「実質的に細胞
内」である。
下等真核生物宿主は、グリコシル化プロフィールと関連して本明細書中で用いられる場
合、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核生物細胞をいい、従って、
いくつかの動物細胞または植物細胞および最も代表的な下等真核生物細胞（単細胞および
多細胞の真菌細胞および藻細胞が挙げられる）を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる場合、用語「分泌経路」とは、種々のグリコシル化酵素の構築
系をいい、この系に対して、脂質結合オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が順に曝露
され、その後新生ポリペプチド鎖の分子が、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置
の区画へ流れる。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に脂質
結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙに対して「上流」にあるか
、または「上流」で作用するといわれ；同様に、酵素Ｙは酵素Ｘから下流」にあるか、ま
たは「下流」に作用する。
本明細書中で用いられる場合、用語「標的化ペプチド」とは、細胞標的シグナルペプチ
ドをコードするヌクレオチドまたはアミノ酸配列をいい、この細胞標的シグナルペプチド
は、細胞下の位置（例えば、オルガネラ）に対する関連配列の局在化（または保持）を媒
介する。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌク
レオチドのポリマー形態をいう。該用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、なら
びに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド間結合、または双方を含むＤＮＡ
またはＲＮＡのアナログを含む。核酸はいずれのトポロジー的立体配座でもあり得る。例
えば、核酸は一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐した、ヘアピンの
、環状の、または南京錠様の立体配座であり得る。この用語は、一本鎖形態または二本鎖
形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および前記
の合成形態および混合ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を共に含むことができる
。当業者に容易に認識されるように、それらは化学的に改変されていても、生化学的に改
変されていてもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでいてもよいし、誘導体化
ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変としては、例えば、標識、メチル
化、アナログでの天然に存在するヌクレオチドの１以上の置換、荷電していない結合（例
えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等
）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダン
ト部位（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン
等）、キレーター、アルキレーターおよび改変された結合（例えば、α芳香族核酸等）の
ようなヌクレオチド間改変が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介
して指定された配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分
子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子の
骨格中のリン酸結合に代えて置き換えるものを含む。
特記しない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その少なくとも一部が（ｉ）配列番
号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。
その２つの間の選択は文脈によって指令される。例えば、もし核酸がプローブとして用い
られれば、その２つの間の選択はプローブが所望の標的に対して相補的であるという要件
によって指令される。
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ
、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然宿主細胞において天然ポリヌクレオチ
ドに天然では伴う他の細胞構成要素、例えば、それに対して天然に会合するリボソーム、
ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離されたものである。該用語は（１）そ
の天然に存在する環境から取り出されてしまっている、（２）「単離されたポリヌクレオ
チド」が天然でそこで見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない、
（３）それに天然では結合していないポリヌクレオチドに操作可能に連結している、また
は（４）天然では起こらない核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」ま
たは「実質的に純粋な」は、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成された
ポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチ
ドアナログに言及して用いることもできる。
しかしながら、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチド
が、その天然の環境から物理的にそれ自体が取り出されてしまっていることは必ずしも必
要としない。例えば、もし異種配列（例えば、内因性核酸配列に天然では隣接しない配列
）が、この内因性核酸配列の発現が改変されるように、この内因性核酸配列に隣接して置
かれるならば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は本明細書中では「単離された」とみな
される。その例として、非天然プロモーター配列は、この遺伝子が改変された発現パター
ンを有するように、ヒト細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターに代えて（例えば、
相同組換えによって）置き換えることができる。この遺伝子は今や「単離された」ものと
なっている。何故ならば、それは、天然ではそれに近接する配列の少なくともいくつかか
ら分離されているからである。
また、もしそれが、ゲノム中の対応する核酸では天然に起こらないいずれかの改変を含
めば、核酸は「単離された」と考えられる。例えば、もし内因性コード配列が、例えば、
ヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失または点変異を含むならば、それは「単
離された」と考えられる、「単離された核酸」としては、異種部位において宿主細胞染色
体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さらに、「
単離された核酸」は他の細胞物質を実質的に含まず、あるいは組換え技術によって生産さ
れた場合には培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合には化学的前
駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
本明細書中で用いるように、参照核酸配列のフレーズ「縮重改変体」は、標準的な遺伝
暗号に従い、翻訳されて参照核酸配列から翻訳されたのと同一なアミノ酸配列を供するこ
とができる核酸配列を含む。
核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」または「同一な」とは、最大対
応性に対して整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較
の長さは少なくとも約６つのヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通
常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より
典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオ
チドのストレッチにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用いる
ことができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラム
であるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いてポリヌクレオチド配列を比較す
ることができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良の重複の領域の整
列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０、本明細書中に参
考として援用される）。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、そのデフォル
トパラメーター（スコアリングマトリックスのための６のワードサイズおよびＮＯＰＡＭ
因子）でＦＡＳＴＡを用い、あるいは本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ６．１で供されたそのデフォルトパラメーターでＧａｐを用いて決定すること
ができる。
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片に言及する
場合、もう１つの核酸（またはその相補鎖）と、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴
って最適に整列させた場合に、前記したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのよ
うないずれかの周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の
少なくとも約５０％、より好ましくは約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には
少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを
示す。
あるいは、核酸またはその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
、もう１つの核酸、もう１つの核酸のストランド、その相補鎖にハイブリダイズする場合
に実施的な相同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の関係では
、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄
条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは
、当業者に容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基
組成、相補的な領域の長さ、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチ
の数のような条件によって影響される。当業者であれば、どのようにしてこれらのパラメ
ーターを変化させ、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するかを
知っている。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、条件の特定の組の下で、
特異的なＤＮＡハイブリッドについての熱融解温度（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行わ
れる。「ストリンジェントな洗浄」は条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッ
ドについてのＴｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマ
ッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用される
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、頁９．５１参照。本明細書中での目的では、「高ストリンジ
ェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、８〜１２時間の６５℃における６
×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ムを含む）、１％ＳＤＳでの水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含
まない）、続いての２０分間の６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回
の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズす
る配列の長さおよびパーセント同一性を含めた多数の因子に応じて異なる速度で起こるこ
とは当業者に認識される。
用語「変異した」は、核酸配列に適用する場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核
酸配列と比較して、挿入され、欠失され、または変化され得ることを意味する。単一の改
変は遺伝子座でなすことができ（点変異）、あるいは多数のヌクレオチドを単一遺伝子座
において挿入し、欠失し、または変化させることができる。加えて、１以上の改変を、核
酸配列内のいずれかの数の遺伝子座で行うことができる。核酸配列は、限定されるもので
はないが、「エラー−傾向ＰＣＲ」（点変異の高い率がＰＣＲ産物の全長に沿って得られ
るように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行うプロセス；例
えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，ｐｐ．１１−１５（１９８
９）およびＣａｌｂｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．＆Ｊｏｙｃｅ Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ａｐｐｌｉｃ．，２，ｐｐ．２８−３３（１９９２））；および「オリゴヌクレオチ
ド指向性変異誘発」（目的のいずれかのクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的
変異の生成を可能とするプロセス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．＆
Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，ｐｐ５３−５７（１９８８）参照
）のような変異誘発技術を含めた当該分野で公知のいずれかの方法によって変異させるこ
とができる。
本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが結合したもう１つの核酸を輸送するこ
とができる核酸分子をいうことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」で
あり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二本鎖Ｄ
ＮＡループをいう。他のベクターはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工
染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここ
に、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる（後により詳細
に議論する）。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製できる
（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細
胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って、宿主ゲノムに沿
って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それに作動可能に連結されるゲ
ノムの発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現
ベクター」（または単に、「発現ベクター」）という。
「作動可能に連結した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子と連続して、
目的の遺伝子を制御する結合、ならびにトランス、またはある距離を置いて作用して目的
の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
本明細書中で用いる用語「発現制御配列」とは、それに作動可能に連結したコード配列
の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の
転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適当な転
写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルのような効果的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化さ
せる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性
を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。その
ような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物の場合には、そのような制御
配列としては、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列が挙
げられる。用語「制御配列」は、最小限、その配列が発現に必須である全ての構成要素を
含むことを意図し、また、その配列が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配
列および融合パートナー配列も含み得る。
本明細書中で用いるように、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、
その中へ組換えベクターのような核酸が導入されている細胞をいうことを意図する。その
ような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をもいうことを意図する
。ある種の改変は変異または環境の影響のいずれかに起因して、継続する世代で起こり得
るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でない可能性があるが、依然として、本
明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離され
た細胞であってよく、あるいは培養で増殖された細胞系であってよく、あるいは生きた組
織または生物中に存在する細胞であってもよい。
本明細書中で用いられる用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的に
は約５０アミノ酸未満の長さ、より典型的には約３０アミノ酸未満の長さのものをいう。
本明細書中で用いられる該用語は、アナログ、ならびに構造および、かくして、生物学的
機能を模倣するミメティックを含む。
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然に存在する、および天然に存在
するものではないタンパク質、および断片、変異体、誘導体およびそのアナログを含む。
ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、その各々
が、１以上の区別される活性を有する多数の異なるドメインを含むことができる。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または
誘導の源により、（１）その天然状態でそれに伴う天然に会合した構成要素に関連しない
、（２）それが天然で見出されない純度で存在する場合、純度を他の細胞物質の存在に関
連して調整できる（例えば、同一種からの他のタンパク質はない）、（３）異なる種から
の細胞によって発現された、または（４）天然で生じない（例えば、それは天然で見出さ
れたポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは天然で見出されないアミノ酸アナログ
または誘導体、あるいは標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリ
ペプチドである。かくして、化学的に合成された、またはそれが天然で由来する細胞とは
異なる細胞系で合成されたペプチドは、その天然に会合した構成要素から「単離」されて
いる。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該分野で周知のタンパク質精製技術を
用いて、単離によって天然に会合した構成要素を実質的に含まないようにすることもでき
る。そのように定義されたように「単離された」は、そのように記載されたタンパク質、
ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されて
しまっていることを必ずしも必要としない。
本明細書中で用いる用語「ポリペプチド断片」とは、全長ポリペプチドと比較してアミ
ノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施
形態において、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列にお
ける対応する位置と同一である連続配列である。断片は、典型的には少なくとも５、６、
７、８，９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８ア
ミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、
３０、３５、４０または４５アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも５０または６０
アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
「改変された誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えば、イ
ンビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含む、あるいは天然ポリペ
プチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはその断片をいう。そのよ
うな改変は、例えば、当業者に容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキ
シル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種での標識、および
種々の酵素的改変を含む。そのような目的で有用なポリペプチドを標識するための多様な
方法、および多様な置換基または標識が当該分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５
Ｓ、および３Ｈのような放射性同位体、標識抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗
体）、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結
合対メンバーとして働くことができる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要な感度、プ
ライマーとの結合体化の容易性、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリ
ペプチドを標識する方法は当該分野で周知である。参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅ
ｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ １９９２，およびｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｓｔｏ ２００２）参照。
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、天然または野生型タン
パク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成または
置換を含むポリペプチドをいう。ムテインはある位置における単一アミノ酸がもう１つの
アミノ酸に変化されている１以上のアミノ酸点置換、１以上のアミノ酸が天然に存在する
タンパク質の配列において、各々、挿入または欠失されている１以上の挿入および／もし
くは欠失、ならびに／またはアミノ末端またはカルボキシ末端いずれかまたは双方におけ
るアミノ酸配列の切形を有することができる。ムテインは天然に存在するタンパク質と比
較して、同一の生物学的活性を有することができるが、好ましくは異なる生物学的活性を
有する。
ムテインはその野生型対応物に対して少なくとも７０％の総じての配列相同性を有する
。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の総じ
ての配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態においては、ムテイ
ンは９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％、なお
より好ましくは９９％の総じての配列同一性を呈する。配列相同性は、ＧａｐまたはＢｅ
ｓｔｆｉｔのようないずれかの一般的な配列分析アルゴリズムによって測定することがで
きる。
好ましいアミノ酸置換は（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸
化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を
改変する、（４）結合親和性または酵素活性を改変する、および（５）そのようなアナロ
グの他の物理化学的または機能的特性を付与する、または改変するものである。
本明細書中で用いるように、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は慣用的用法に従う
。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的ア
ミノ酸、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非慣用的アミノ
酸のような立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた本発明のポリペプチド用の適当な
構成要素であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カ
ルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、
Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジ
ン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およ
びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられる
ポリペプチド表記においては、標準用法および約束に従い、左手方向はアミノ酸末端方向
であって、右手方向はカルボキシ末端方向である。
もしタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類
似の配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して「相同性」を有し、あ
るいはそれに対して「相同」である。あるいは、もし２つのタンパク質が「類似の」アミ
ノ酸配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して相同性を有する（かく
して、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有するこ
とを意味すると定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タ
ンパク質に対して６０％の配列相同性を呈するものであり、より好ましくは７０％配列相
同性である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９
０％配列相同性を呈する相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相
同タンパク質は９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を呈する。本明細書中
で用いるように、（特に、予測された構造類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の
間の相同性は、機能において類似性を意味するものと解釈される。
「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して用いられる場合、同一でない残基位
置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」
は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有するもう１
つのアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ
酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が相
互に保存的置換だけ異なる場合、パーセント配列同一性または相同性の程度は、置換の保
存的性質につき修正するように上方に調整することができる。この調整をなす手段は当業
者に周知である（例えば、本明細書に参考として援用される、Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９
４参照）。
以下の６つの群は、各々、相互に代えての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリ
ン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）ア
スパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソ
ロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、
および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
パーセント配列同一性ともいうポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配
列分析ソフトウエアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｕｒｅ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕ
ｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５参照。タンパク質分析ソフトウエ
アは、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失および他の改変に帰属される相同
性の尺度を用いて類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧは「Ｇａｐ」および「
Ｂｅｓｔ ｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターを用い
て異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの
間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定
することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。
阻害分子配列を、異なる生物からの非常に多数の配列を含むデータベースを比較する場
合の好ましいアルゴリズムはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ
．Ｆ．ら．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈおよ
びＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄ
ｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ
（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメータ
ーは：期待値：１０（デフォルト）：フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開
くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを拡大するためのコスト：１（デフォル
ト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードのサイズ１１：（デフォルト）；記載の
番号：１００（デフォルト）：ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
相同性について比較されたポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミ
ノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には
少なくても約２８残基、好ましくは約３５を超える。非常に多数の異なる生物に由来する
配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ
酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズム
によって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列はＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは
、クエリおよびサーチ配列の間の最良な重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を
提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，本明細書中に参考として援用される）。例えば、
アミノ酸配列の間のパーセント配列同一性は、本明細書中に参考として援用される、ＧＣ
Ｇ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（２の
ワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いて決定することがで
きる。
保存された領域に言及する用語「モチーフ」は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン
（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、
プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、トリプトファン（
ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリ
ン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）
、チロシン（ＴｙｒまたはＹ），アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（Ｇｌｎ
またはＱ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、リ
ジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓま
たはＨ）として慣用的に知られ、タンパク質で通常見出されるアミノ酸残基を示す。
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまた
は断片を含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの
２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので有用である。融
合タンパク質は目的のポリペプチドからの少なくとも１０の連続アミノ酸、より好ましく
は少なくとも２０または３０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、５０または
６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む
。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレ
ームであるポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タ
ンパク質を発現させることによって、組換えにより生産することができる。別法として、
融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をもう一つのタンパク質に架橋させるこ
とによって化学的に生産することができる。
本明細書中で用いる用語「領域」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分を
いう。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によっ
て定義される。
本明細書中で用いる用語「ドメイン」とは、生体分子の公知のまたは疑われる機能に寄
与する生体分子の構造をいう。ドメインは領域またはその部分と共に広がることができ；
ドメインは生体分子の区別される非連続領域を含むこともできる。タンパク質ドメインの
例は、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、お
よび細胞質ドメインを含む。
本明細書中で用いるように、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、ペ
プチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めたいずれかの化合物を意
味し、そのような化合物は天然または合成のものであり得る。
他に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属す
る分野における当業者によって通常理解されるのと同一な意味を有する。例示的な方法お
よび材料は以下に記載するが、本明細書中に記載したのと同様なまたは同等な方法および
材料も本発明の実施で用いることができ、それは当業者に明らかである。本明細書中で言
及する全ての刊行物および他の文献は本明細書にその全体が参考として援用される。矛盾
がある場合、定義を含めた本明細書が優先する。材料、方法および例は説明のためだけの
ものであり、限定する意図のものではない。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」または「を含む」または「含ん
でいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いず
れかの他の整数または整数の群を排除するものではないと理解される。
（下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質
を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に
関与する１以上の酵素を天然では発現しない、またはそれを発現しないようにされている
真核生物宿主細胞は出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、
ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な１以上の酵素、または他の因子を発現するよ
うに作製される。所望の宿主株は、一度に１つ以上の酵素を発現するように操作すること
ができる。加えて、１以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿
主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素（例えば、異種細胞下標
的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素）をコ
ードする核酸分子のライブラリーを（例えば、酵素断片を含むサブ−ライブラリーと細胞
下標的化配列との連結によって）創製し、最も最適な活性を持つ１以上の酵素を有する、
またはほとんどの「ヒト様」糖タンパク質を生産する株は、ライブラリーの１以上のメン
バーで標的宿主細胞を形質転換することによって選択することができる。
特に、本明細書中に記載された方法は、それをさらに改変して複合体Ｎグリカンを得る
目的で少なくとも一次的に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を高い収率でインビボで得るの
を可能とする。下等真核生物のような宿主細胞において適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構
造を適当な収率で得るための成功したスキームは、一般には、２つの平行したアプローチ
：（１）もしあれば、内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性によって作製された高マ
ンノース構造を低下させること、および（２）１、２−α−マンノースをマンノシダーゼ
によって除去して、さらに宿主細胞の内部で反応させて、複合体ヒト−様グリコ形態を形
成することができる高レベルの適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を得ることを含む。
従って、第一の工程は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の作用に
よってインビボＧｌｃＮＡｃを許容することができるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的前
駆体構造を生産することができる真核生物宿主細胞（例えば、下等真核生物）の選択また
は創生を含む。一つの実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに
関して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作
製し、またはそれを用いることを含む。好ましくは、宿主細胞は開始１，６マンノシルト
ランスフェラーゼ活性（後記参照）が枯渇したものである。そのような宿主細胞は、ヒト
様糖タンパク質を生産するのに望ましくない高マンノース構造の生産に関与する１以上の
酵素を欠く。
次いで、１以上の酵素活性を、そのような宿主に導入して、少なくとも３０モル％のＭ
ａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ５」）炭水化物構造を有することによって特徴付けられ
る宿主細胞内でＮ−グリカンを生産する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合体Ｎ−グリ
カン形成に必要であり：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は少なくとも一時的には高い収率で（例
えば、３０％の過剰にて）インビボで形成されなければならない。というのは、引き続い
ての哺乳動物様およびヒト様のグリコシル化反応はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはその誘
導体を必要とするからである。
この工程は、高い収率での、細胞内でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特定の異性体構造の
形成も必要とする。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合体Ｎ−グリカン形成に必要である
が、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｌｃＮＡｃ
トランスフェラーゼＩに対する基質として働くことができる、またはできない異なる異性
体形態で起こり得るからである。殆どのグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグ
リコシル化タンパク質は、一般に、その表面にある範囲の異なる炭水化物構造（すなわち
、グリコ形態）を含む。かくして、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のような特定の構造の微量の
（すなわち、５％未満の）単なる存在は、哺乳動物様またはヒト様糖タンパク質を生産す
るのにほとんど現実的な関連性はない。必要なのは、高い収率での（すなわち、３０％を
超える）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ−許容Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体（図１
Ｂ）の形成である。この中間体の形成は、目的のグリコシル化タンパク質（標的タンパク
質）上の複合体Ｎ−グリカンの引き続いてのインビボでの合成を可能とするのに必要であ
る。
従って、選択された宿主細胞によって生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のいくつかま
たは全ては、哺乳動物グリコシル化経路に沿って酵素活性に対する生産的基質でなければ
ならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性に対する基質としてインビボで
働くことができ、それにより、宿主細胞においてヒト−様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成する。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞に
おいて生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少
なくとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、インビボにてＧｎＴＩに対する生産的基
質である。もし、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が１０％で生産され、Ｍ
ａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が標的タンパク質上で２５％で生産されるならば、一次的に製造さ
れたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の合計量は３５％であることが理解される。なぜならば、Ｇ
ｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産物だからである。は
、
当業者は、天然から宿主細胞、例えば、インビボでかなりのレベルのＭａｎ５ＧｌｃＮ
Ａｃ２を生産する現存する真菌または他の下等真核生物を選択することができる。しかし
ながら、合計Ｎ−グリカンの１．８％過剰でインビボにてそのような構造を供することが
示された下等真核生物は未だない（例えば、Ｍａｒａｓら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボで
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生産するように遺伝子的に作製することができる。米国特
許第５，５９５，９００号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞
または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌク
レオチドトランスポーターの不存在または存在を同定することができる。
（望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活化）
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト−様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパ
ク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリ
ゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは
、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用い
られる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既
に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して作製することができるか、あるい
はそれから得ることができる。かくして、選択された宿主細胞に応じて、非−ヒトグリコ
シル化反応の特徴であることが知られた酵素をコードする１つのまたは多数の遺伝子を欠
失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は多数の下等真
核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎａ
等）において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコ
シルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを供する。これらの
遺伝子はマンノシルトランスフェラーゼ、例えば、１，３マンノシルトランスフェラーゼ
（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１（Ｇｒａｈａｍ、１９９１）１，
２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＫＴＲ／Ｋ
ＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
からのＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅからのＭＮＮ４およびＭＮＮ６）および異常な、すなわち、非
ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの
遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを
持つ生きた表現型を生起させる。その例は、表１（前記）に示される。
必要な操作工程を例示するために本明細書中に記載したように、本発明の好ましい下等
真核生物宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓの過マンノ
シル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物のようにＰ．ｐａｓｔｏ
ｒｉｓは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせるためにα−１，２−マンノシダーゼと共
にＥＲ中にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造を保有する（図１Ａ）。数個のマンノシルトラン
スフェラーゼの作用を介して、次いで、この構造はマンナンとしても知られた過マンノシ
ル化された構造（Ｍａｎ＞９ＧｌｃＮＡｃ２）に変換される。加えて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓは、マンノシルリン酸トランスフェラーゼの作用を介して、非末端リン酸基を炭水化
物構造へ付加することができることが判明した。これは、マンノース糖の付加よりはむし
ろ除去に関係する、哺乳動物細胞で行われる反応とは異なる。存在するＭａｎ８ＧｌｃＮ
Ａｃ２構造を過マンノシル化する真核生物宿主細胞、例えば、真菌の能力を排除するのは
特に重要である。これは、超マンノシル化しない宿主細胞につき選択し、またはそのよう
な細胞を遺伝子工学により作製することによって達成することができる。
超マンノシル化プロセスに関与した遺伝子は、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて
、同定されており、これらの遺伝子中に変異を作り出すことによって、「望ましくない」
グリコ形態の生産を低下させることができる。そのような遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような他の下等真
核生物で見出される現存のマンノシルトランスフェラーゼまたはそれらのレギュレーター
（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４，ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によって、あるい
は宿主株を変異誘発し低下したマンノシル化を持つグリコシル化表現型につき選択するこ
とによって同定することができる。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマンノシ
ルリン酸トランスフェラーゼの間の相同性に基づき、ＰＣＲプライマー（その例は表２に
示され、配列番号６０〜９１はプライマーの更なる例である）を設計することができるか
、そのような酵素をコードする遺伝子または遺伝子断片をプローブとして用いて、標的ま
たは関連生物のＤＮＡライブラリーにおいてホモログを同定することができる。別法とし
て、関連生物において特定のグリコシル化表現型を補うその能力によってバンノシルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する機能的ホモログを同定することができる。
脚注：Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝Ｃまた
はＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｄ＝Ａまた
はＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｎ＝ＧまたはＡまたはＴまたはＣ。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードす
る遺伝子を得るためには、例えば、以下の工程を行う：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣ
Ｈ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度では遅い成長者である。かくして、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡラ
イブラリーで補うことによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＣＨ１の機能的ホモロ
グを同定することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、例えば、Ｓｔａｎｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能でありＲｅｓＧｅｎ、ａｎ Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。上昇した温度にお
いて正常な増殖表現型を呈する変異体はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡライブラリーで形
質転換された後は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを有するようである。その
ようなライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分的
に消化し、制限酵素を不活化した後、消化されたＤＮＡを、適合する制限酵素で消化され
ている適当なベクターに連結することによって作り出すことができる。
適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカー（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，
およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２，１９−２７頁）を含
有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであ
るｐＲＳ３１４、およびＵＲＡ３マーカー（Ｂｏｎｎｅａｕｄ，Ｎ．ら，１９９１，Ｙｅ
ａｓｔ ７，６０９−６１５頁）を含有する改変されたｐＵＣ１９に基づく高コピー（２
μ）プラスミドであるｐＦＬ４４Ｓが挙げられる。そのようなベクターは学術研究者によ
って通常用いられ、同様なベクターは多数の異なる販売業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能で
ある。さらなる例としては、ｐＹＥＳ／ＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２μ複製起点
に基づく酵母発現プラスミド、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＹ
ｅｐ２４クローニングビヒクルが挙げられる。
染色体ＤＮＡおよびベクターの連結の後、ＤＮＡライブラリーを、特定の変異を持つＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し、対応する表現型の修正につき選択することが
できる。野生型表現型を回復することができるＤＮＡフラグメントをサブクローニングし
、配列決定した後、このフラグメントを用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発および
／または組換え技術を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１によってコードされ
た遺伝子産物の活性を排除することができる。
あるいは、もし目的の特定の宿主細胞（例えば、真菌）の全ゲノム配列が知られている
ならば、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのようないくつかの情報源から入手可能な公に入
手可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによってそのような遺伝子を同定するこ
とができる。例えば、与えられたゲノム配列、または公知の１，６マンノシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯＣＨ１）からの配列を含む
データベースを検索することによって、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有
するタンパク質をコードできる（必ずしも必要でない）そのような宿主細胞ゲノムにおい
て高い相同性の遺伝子を同定することができる。しかしながら、核酸配列相同性単独は、
同一の活性を有する酵素をコードするホモログを同定し、単離したことを証明するには十
分ではない。今日まで、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１欠失が非常に重
要な開始１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を排除することを示すデータは存在
しない（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）（Ｄｅｃ
．１９９８）：１１７１−１１７７；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ０２／００８５６ Ａ
２）。かくして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子ホモログがその機能を現実にコ
ードすることを証明するデータはない。その証明はここに初めて提供される。
いくつかのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログ
は、これらのアプローチを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同定されている。相同な
遺伝子は、しばしば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関
与する遺伝子に対して同様な機能を有し、かくして、それらの欠失を用いて、同様なグリ
コシル化経路を持つ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは、同様に、いずれかの他の宿主細胞、
例えば、真菌、植物、昆虫または動物細胞においてグリコシル化パターンを操作すること
ができる。
遺伝子ノック−アウトの創製は、一旦与えられた標的遺伝子配列が決定されると、当該
分野におけるよく確立された技術であり、当業者が行うことができる（例えば、Ｒ．Ｒｏ
ｔｈｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．
１９４，ｐ．２８１参照）。宿主生物の選択は、良好な形質転換および遺伝子破壊技術の
入手可能性によって影響され得る。
もしいくつかのマンノシルトランスフェラーゼがノックアウトされるべきであれば、例
えば、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒによって開発された方法（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１１６：５４１−５４５（１９８７））は、選択マーカー、例えば、酵母におけるＵＲＡ
３マーカーの反復された使用を可能として、全ての望ましくない内因性マンノシルトラン
スフェラーゼ活性を順次に排除することができる。この技術は他者によって改良されてい
るが、基本的には、逆選択マーカーに隣接する２つの反復ＤＮＡ配列の使用への近接を含
む。例えば、ＵＲＡ３をマーカーとして用いて、構築物を取り込んだ形質転換体の選択を
確実とすることができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復物を隣接させることによって、ま
ず、構築物を取り込み、かくして、標的遺伝子を破壊した形質転換体を選択することがで
きる。形質転換体の単離、およびその特徴付けの後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯ
Ａ）に対して抵抗性であるものにつき第二ラウンドにて逆選択することができる。５−Ｆ
ＯＡを含有するプレート上で生存することができるコロニーは、先に述べた反復を含む交
差事象を介して再度ＵＲＡ３マーカーを失っている。このアプローチは、かくして、同一
マーカーの反復された使用を可能とし、さらなるマーカーを必要とすることなく複数遺伝
子の破壊を容易とする。他の選択マーカーおよび逆選択マーカーを持つもう一つの真核生
物宿主細胞で用いるのに適合された遺伝子の順次の排除のための同様な技術も用いること
ができる。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）また
はマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異体を相補する遺伝
子）のような特定のマンノシルトランスフェラーゼ、またはレギュレーター（ＭＮＮ４）
の排除は、この生物の操作された株の創製を可能とし、該株は主にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ
２を合成し、これを用いて、より複雑なグリコ形態構造、例えば、哺乳動物、例えば、ヒ
ト細胞で生産されるものに似るようにグリコシル化パターンをさらに改変することができ
る。この方法の好ましい実施形態は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同様なまたは同一の
生化学的機能を排除して、遺伝子的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で生産された糖
タンパク質のグリコシル化構造を改変するために生化学的グリコシル化活性をコードする
ＤＮＡ配列を利用する。
本明細書中で例示したような酵母におけるグリコシル化経路を操作するのに用いられる
方法は、引き続いての修飾のために好ましい基質を生産するために糸状菌で用いることが
できる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒおよび他の糸状菌におけるグリコシル化経路を改変する
ための戦略は、酵母においてヒト様糖タンパク質を生産するのに、株を操作するための本
明細書中に記載したのと同様なプロトコルを用いて開発することができる。１，２マンノ
シルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥホモログに関与する望まない遺伝
子活性を改変または排除する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は好ましい宿主で
ある。なぜならば、それは１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くからであり、
それゆえ、この宿主において超マンノシル化遺伝子活性、例えば、ＯＣＨ１は予測されな
い。対照的に、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，２−マンノシ
ダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、グリコシルトランスフェラーゼ（Ｇｎ
Ｔ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ
（ＳＴ））は、本発明の標的化方法を用いて宿主に導入される。
（減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作また
は選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−１，６−マンノシルトランスフ
ェラーゼ、すなわちＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造のα−１，３アーム上で外部鎖マン
ノシル化を開始する開始特異的酵素の活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の操作ま
たは使用を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素はＯＣＨ１遺伝子によっ
てコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子の破壊の結果、Ｎ結
合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動
物型グリコシル化を得るための従前のアプローチはＯＣＨ１の不活化を必要とした（例え
ば、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３０４参
照）。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフ
ェラーゼ活性の破壊は、（選択された宿主細胞に応じて）、任意であり得る。というのは
Ｏｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために無傷のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ
２を必要とするからである。かくして、７以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積
する本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Ｏｃｈ１ｐに対する貧弱
な基質であるような低グリコシル化Ｎ−グリカンを生産することができる（例えば、Ｎａ
ｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０参照）。
ＯＣＨ１遺伝子は、記載されているように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（実施例１）および
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（実施例９）からクローン化された。Ｋ．ｌａｃｔｉｓからのＯＣＨ１
遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を配列番号３および配列番号４に記載する。遺伝子
特異的プライマーを用いて、各クローンから構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓお
よびＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＯＣＨ１遺伝子を欠失させた（各々、実施例１および
９）。開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇し、かつＭａｎ５Ｇｌ
ｃＮＡｃ２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを生産するように操作された宿主細胞は、それ
により、得られた（例えば、実施例４および９参照）。
かくして、もう１つの実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝
子（配列番号３）の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なく
とも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含む、またはそれよりなる核酸
配列を有する単離された核酸分子、およびそのホモログ、改変体および誘導体を提供する
。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする
核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド
（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供
される。また、さらに本明細書中で記載するように、本発明の上記核酸分子を含む、発現
ベクターを含めた、ベクターも提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで
形質転換された宿主細胞が提供される。
本発明は、さらに、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、非真菌宿主細胞における同等な酵素
活性を含めたａｌｇ活性）が減少した、または枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し
、または用い、少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する方法を提供す
る。好ましい実施形態において、グリコシダーゼ活性は、宿主細胞内で１以上のマンノシ
ダーゼ活性の発現を引き起こすことによって、例えば、宿主細胞において、マンノシダー
ゼ活性の活性化によって、またはマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって導入
される。
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク
質を生産する方法を提供し、ここで、糖タンパク質はトリマンノースコア構造に結合した
少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
（下等真核生物におけるクラス２マンノシダーゼの発現）
本発明は、加えて、触媒的に活性なクラス２マンノシダーゼ（ＥＣ．３．２．１．１１
４）（そのホモログ、改変体、誘導体および触媒的に活性なフラグメント）をコードする
遺伝子を発現させることによって、下等真核生物宿主細胞においてよりヒト様の糖タンパ
ク質を作製する方法を提供する。
当該分野における公知の技術を用い、遺伝子特異的プライマーは、マンノシダーゼ遺伝
子をＰＣＲ増幅するために、クラス２マンノシダーゼ遺伝子（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒ α−マンノシダーゼＩＩ）の相同領域を相補するように設計される。
クラス２マンノシダーゼをコードする核酸からの細胞における活性なクラス２マンノシ
ダーゼの発現を介して、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、よりヒト様の糖
タンパク質を生産するように操作される（例えば、実施例１７〜２５参照）。
本発明の１つの局面において、α−マンノシダーゼＩＩ酵素のライブラリーを構築する
ことによって下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてヒト様糖タンパク
質を生産する方法が提供される。好ましい実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔ
ｅｒ α−マンノシダーゼＩＩ配列のサブ−ライブラリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号Ｘ７７６５２）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２標的化ペプチド配列のサブ
−ライブラリーに融合させる。本発明のより好ましい実施形態において、Ｄ．ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ Δ７４／ＭＮＮ２を含む融合構築物を、ＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主に形質転換する。ここで
、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１と命名される、上記Ｎ−グリカン構造を有する下等
真核生物においてヒト様糖タンパク質を作製する方法を開示するＣｈｏｉら，Ｐｒｏｓ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２
２−７およびＷＯ ０２／００８７９参照。
もう１つの実施形態において、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ配列はラット、マウス、
ヒト、虫、植物、および昆虫から選択される。そのような配列はＳｗｉｓｓｐｒｏｔおよ
びＧｅｎｂａｎｋのようなデータベースで入手できる。例えば、以下の遺伝子のための配
列がＧｅｎｂａｎｋで見出された：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａマンノシ
ダーゼＩＩ（ＮＭ＿１２１４９９）；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿０
７３５９４）；Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ（ＡＫ１１６
６８４）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ （Ｘ
７７６５２）；ヒトマンノシダーゼＩＩ（Ｕ３１５２０）；マウスマンノシダーゼＩＩ（
Ｘ６１１７２）；ラットマンノシダーゼＩＩ（ＸＭ＿２１８８１６）；ヒトマンノシダー
ゼＩＩｘ（Ｄ５５６４９）；昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）；ヒト
リソソームマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ＿０００５２８）；およびヒトサイトゾルマンノシ
ダーゼＩＩ（ＮＭ＿００６７１５）（各々、図２５〜３５、配列番号４９〜５９）。高い
配列類似性、ならびにＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６活性の存在のため、細胞質マ
ンノシダーゼＩＩおよびリソソームマンノシダーゼＩＩを、本明細書中では、集合的にク
ラス２マンノシダーゼという。
ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ活性を示す他のマンノシダーゼとしては、とりわけ、昆
虫マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）およびヒトマンノシダーゼＩＩｘ（Ｄ５５
６４９）が挙げられる。それゆえ、これらのマンノシダーゼを用いて、触媒的活性な酵素
のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを創製することもできる。
本発明のもう１つの局面において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉ
ａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ
Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ
１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、およびＳ
ａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６よりなる群から選択される標的化ペプチド配列（リー
ダー）のサブ−ライブラリーを、触媒的に活性なマンノシダーゼＩＩドメインをコードす
る配列に融合させる。リーダー／触媒ドメインライブラリーの組合せを表１１（実施例１
４）に示す。
本発明によって作製されたゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物は、α１，３およ
びα１，６マンノシダーゼトリミング活性を示す。例えば、触媒的に活性なマンノシダー
ゼＩＩ融合構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２〜ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に存在するＭａｎα１，３および
Ｍａｎα１，６グリコシド結合を切断する。もう１つの例において、触媒的に活性なマン
ノシダーゼＩＩｘ融合構築物は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２〜Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２に存
在するＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を切断する。
（グリコシド結合のクラス２マンノシダーゼ加水分解）
本発明はまた、クラス２酵素の触媒的に活性なドメインがオリゴ糖、例えば、ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造上のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリ
コシド結合を加水分解して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（下等真核生物におけ
るさらなるＮ−グリカンプロセシングのための所望の中間体）を生成するメカニズムを含
む。最初の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は順次に起こる。該酵素は少な
くとも１つのグリコシド結合を加水分解し、立体配座的に回転して、他のグリコシド結合
を加水分解する。第二の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は同時に起こる。
生じた中間体はさらなるゴルジプロセシングのための基質であり、ここで、Ｎ−アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴｓ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇ
ａｌＴｓ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴｓ）のような他のグリコシル化酵素
は順次にそれを修飾して、所望のグリコ形態を生じ得る。図３６ＡはマンノシダーゼＩＩ
経路を介して生産されたオリゴ糖中間体（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）を示し、図３６ＢはマンノシダーゼＩＩｘ経路
を介して生産されたオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２）を示す。
（マンノシダーゼＩＩ酵素の保存された領域）
マンノシダーゼＩＩ酵素の保存された領域をコードする配列を発現するのは本発明の特
徴である。本発明は、昆虫、哺乳動物、植物および虫を含めた種々の供給源からのマンノ
シダーゼＩＩ遺伝子の保存された領域を含む単離された核酸分子を提供する。
マンノシダーゼＩＩ酵素をコードするいくつかの全長核酸配列は同定され、配列決定さ
れている。マンノシダーゼＩＩ酵素配列は配列番号４９〜配列番号５９に記載されている
。公知のマンノシダーゼＩＩ配列の整列（すなわち、他の昆虫、動物および植物の配列に
対して整列させたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、アミノ酸１４
４〜１６６およびアミノ酸２２２〜２８５の間の高度に保存されたモチーフを示す（図２
３）。従って、もう１つの局面において、本発明はクラス２マンノシダーゼ酵素活性をコ
ードする核酸を宿主細胞に提供する方法に関し、ここで、該核酸は上記保存されたマンノ
シダーゼＩＩ領域を有することによって特徴付けられる。
さらに、配列整列は、さらに、図２３に示されたように、アミノ酸３３８〜３４５およ
びアミノ酸３４６〜３６０の間のいくつかの高度に保存されたシステイン−システインジ
スルフィド架橋を明らかにする。これらのジスルフィド架橋は、例えば、タンパク質構造
を維持することによって、基質の結合および認識に不可欠な役割を演じることができる。
本発明はまた、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する２３アミノ酸
残基よりなる第一のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラグ
メントも提供する：
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４５位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｅ、Ｑ、ＮおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４６位におけるアミノ酸残基は
ＶおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４７位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、Ｉ、ＨおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４８位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ｉ、ＬおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１４９位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ｉ、ＬおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５０位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５１位におけるアミノ酸残基は
ＨおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５２位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、ＴおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５３位におけるアミノ酸残基は
ＨおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５４位におけるアミノ酸残基は
Ｎ、Ｃ、ＤおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５６位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５７位におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５８位におけるアミノ酸残基は
ＷおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１５９位におけるアミノ酸残基は
Ｉ、Ｌ、ＫおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６０位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｍ、ＫおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６１位におけるアミノ酸残基は
ＴおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６２位におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６３位におけるアミノ酸残基は
Ｅ、ＤおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６４位におけるアミノ酸残基は
Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｒ、ＱおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６５位におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の１６６位におけるアミノ酸残基は
Ｙ、ＦおよびＣよりなる群から選択される。
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する５７アミ
ノ酸残基よりなる第二のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフ
ラグメントを提供する：
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２２位におけるアミノ酸残基は
ＥおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２３位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＩおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２４位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ａ、ＴおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２５位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｇ、ＮおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２６位におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２７位におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２８位におけるアミノ酸残基は
ＷおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２２９位におけるアミノ酸残基は
ＶおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３０位におけるアミノ酸残基は
ＭおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３１位におけるアミノ酸残基は
Ｐ、ＴおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３２位におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３３位におけるアミノ酸残基は
ＥおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３４位におけるアミノ酸残基は
ＡおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３５位におけるアミノ酸残基は
Ｎ、Ｔ、ＣおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３６位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、Ａ、Ｐ、ＴおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３７位におけるアミノ酸残基は
ＨおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３８位におけるアミノ酸残基は
Ｗ、Ｙ、ＩおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２３９位におけるアミノ酸残基は
Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｙ、ＧおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４０位におけるアミノ酸残基は
Ｎ、ＳおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４１位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ｍ、Ｌ、ＩおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４２位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、Ｉ、ＶおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４３位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、Ｔ、Ｇ、ＤおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４４位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、ＥおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４５位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、ＭおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４６位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｆ、Ｉ、ＡおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４７位におけるアミノ酸残基は
Ｅ、ＬおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４８位におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２４９位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｍ、ＮおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５０位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＲおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５１位におけるアミノ酸残基は
Ｗ、Ｐ、ＦおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５２位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、Ｉ、ＶおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５３位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｅ、ＮおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５４位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｎ、Ｒ、Ｋ、ＤおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５５位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、Ｈ、ＮおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５６位におけるアミノ酸残基は
Ｍ、Ｉ、ＬおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５７位におけるアミノ酸残基は
ＮおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５８位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ａ、ＧおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２５９位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６０位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６１位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｑ、Ｒ、ＫおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６２位におけるアミノ酸残基は
Ａ、Ｓ、Ｎ、ＴおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６３位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、Ｈ、Ｇ、ＡおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６４位におけるアミノ酸残基は
ＷおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６５位におけるアミノ酸残基は
Ａ、Ｓ、ＨおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６６位におけるアミノ酸残基は
ＩおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６７位におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６８位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２６９位におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７１位におけるアミノ酸残基は
Ｈ、ＬおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７２位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、Ｔ、ＧおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７３位におけるアミノ酸残基は
Ｐ、Ｓ、Ａ、ＲおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７４位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｓ、ＥおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７５位におけるアミノ酸残基は
Ｍ、Ｖ、ＱおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７６位におけるアミノ酸残基は
Ｐ、ＡおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７７位におけるアミノ酸残基は
Ｙ、Ｈ、ＳおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７８位におけるアミノ酸残基は
Ｉ、ＬおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２７９位におけるアミノ酸残基は
ＬおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８０位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｄ、ＡおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８１位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｓ、Ｒ、ＱおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８２位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、ＡおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８３位におけるアミノ酸残基は
Ｇ、ＮおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８４位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＩおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の２８５位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｔ、Ｓ、ＥおよびＤよりなる群から選択される。
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する３３アミノ
酸残基よりなる第三のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフラ
グメントも提供する：
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２５位におけるアミノ酸残基は
Ｈ、ＰおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２６位におけるアミノ酸残基は
Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、ＴおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２７位におけるアミノ酸残基は
Ｍ、Ｑ、ＡおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２８位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３２９位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＬおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３０位におけるアミノ酸残基は
Ｙ、Ｄ、ＦおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３１位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、Ｉ、ＴおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３２位におけるアミノ酸残基は
Ｙ、ＧおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３３位におけるアミノ酸残基は
Ｄ、Ｓ、ＶおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３４位におけるアミノ酸残基は
Ｉ、ＶおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３５位におけるアミノ酸残基は
Ｐ、ＫおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３６位におけるアミノ酸残基は
Ｈ、Ｓ、ＮおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３７位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、ＧおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３８位におけるアミノ酸残基は
Ｃ、ＹおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３３９位におけるアミノ酸残基は
Ｇ、ＮおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４０位におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４１位におけるアミノ酸残基は
Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＰおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４２位におけるアミノ酸残基は
Ｐ、ＲおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４３位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｓ、Ａ、ＮおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４４位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、ＩおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４５位におけるアミノ酸残基は
ＣおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４６位におけるアミノ酸残基は
Ｃ、Ｌ、ＷおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４７位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｓ、ＤおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４８位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＶおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３４９位におけるアミノ酸残基は
Ｄ、ＬおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５０位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＣおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５１位におけるアミノ酸残基は
Ｒ、Ｋ、ＡおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５２位におけるアミノ酸残基は
Ｒ、Ｋ、ＤおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５３位におけるアミノ酸残基は
Ｍ、Ｌ、ＩおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５４位におけるアミノ酸残基は
Ｇ、Ｐ、ＲおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５５位におけるアミノ酸残基は
Ｓ、Ｅ、Ｇよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５６位におけるアミノ酸残基は
Ｆ、ＧおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３５７位におけるアミノ酸残基は
Ｇ、Ｒ、ＫおよびＬよりなる群から選択される。
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列を有する２８アミ
ノ酸残基よりなる第四のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性なフ
ラグメントを提供する：
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８０位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｋ、ＴおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８１位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、Ｉ、ＦおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８２位におけるアミノ酸残基は
Ｖ、Ｙ、Ｌ、ＩおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８３位におけるアミノ酸残基は
Ｄ、Ｅ、ＮおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８４位におけるアミノ酸残基は
Ｑ、Ｅ、ＶおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８５位におけるアミノ酸残基は
Ｗ、ＹおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８６位におけるアミノ酸残基は
Ｒ、Ｄ、ＴおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８７位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｒ、ＡおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８８位におけるアミノ酸残基は
Ｋ、Ｉ、ＱおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３８９位におけるアミノ酸残基は
Ａ、Ｓ、ＧおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９０位におけるアミノ酸残基は
Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、ＳおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９１位におけるアミノ酸残基は
Ｌ、ＹおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９２位におけるアミノ酸残基は
Ｙ、ＦおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９３位におけるアミノ酸残基は
Ｒ、ＰおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９４位におけるアミノ酸残基は
Ｔ、Ｎ、Ｓ、ＨおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい実施形態において、第一の配列の３９５位におけるアミノ酸残基は
Ｎ、Ｓ、Ｋ、ＤおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９６におけるアミノ酸残基は
ＶＴＨおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９７におけるアミノ酸残基は
ＬＩＶＴおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９８におけるアミノ酸残基は
ＬＦＶおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置３９９におけるアミノ酸残基は
ＩＱＶＡおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４００におけるアミノ酸残基は
ＰＩＴおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０１におけるアミノ酸残基は
ＬＭおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０３におけるアミノ酸残基は
ＤＳおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０４におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０５におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０６におけるアミノ酸残基は
ＲおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４０７におけるアミノ酸残基は
ＦＹおよびＲよりなる群から選択される。
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４３８
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ（配列番号：９）
を有する１２アミノ酸残基よりなる第五のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの
触媒的に活性な断片も提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４３８におけるアミノ酸残基は
ＱＫＬおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４３９におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４０におけるアミノ酸残基は
ＧＳおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４１におけるアミノ酸残基は
ＴおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４２におけるアミノ酸残基は
ＬＰおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４３におけるアミノ酸残基は
ＱＳＥＬＡおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４４におけるアミノ酸残基は
ＥＤＣおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４５におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４６におけるアミノ酸残基は
ＦＬおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４７におけるアミノ酸残基は
ＤＫＲＮＷおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４８におけるアミノ酸残基は
ＡＫＴＥおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４４９におけるアミノ酸残基は
ＶＬＭおよびＧよりなる群から選択される。
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４６３
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ（配列番号：１０）
を有する１４アミノ酸残基よりなる第六のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの
触媒的に活性な断片も提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６３におけるアミノ酸残基は
ＬＦおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６４におけるアミノ酸残基は
ＳＫＨおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６５におけるアミノ酸残基は
ＧＤおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６６におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６７におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６８におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４６９におけるアミノ酸残基は
ＴＳＶＰおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７０におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７１におけるアミノ酸残基は
ＡＳおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７２におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７３におけるアミノ酸残基は
ＲＩおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７４におけるアミノ酸残基は
ＳＤＥＱＦＰおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７５におけるアミノ酸残基は
ＤＱＳＨおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７６におけるアミノ酸残基は
ＮＨＤＥおよびＱよりなる群から選択される。
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
４７７
Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ（
配列番号：１１）
を有する２０アミノ酸残基よりなる第７番目のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダー
ゼの触媒的に活性な断片を提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７７におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７８におけるアミノ酸残基は
ＷおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４７９におけるアミノ酸残基は
ＳＴおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８１におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８２におけるアミノ酸残基は
ＹＦおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８３におけるアミノ酸残基は
ＴＶＳおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８４におけるアミノ酸残基は
ＳＴおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８５におけるアミノ酸残基は
ＲおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８７におけるアミノ酸残基は
ＹＦＡおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８８におけるアミノ酸残基は
ＨＹＦＬおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４８９におけるアミノ酸残基は
ＫおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９０におけるアミノ酸残基は
ＲＱＳＭＡおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９１におけるアミノ酸残基は
ＭＬＱＶおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９２におけるアミノ酸残基は
ＤＥおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９４におけるアミノ酸残基は
ＶＩＱおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９５におけるアミノ酸残基は
ＬＭＦＳおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置４９６におけるアミノ酸残基は
ＭＱＥＹおよびＲよりなる群から選択される。
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
５２４
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ（配列番号：１２）
を有する２７アミノ酸残基よりなる第八のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの
触媒的に活性な断片も提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２４におけるアミノ酸残基は
ＡＬおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２５におけるアミノ酸残基は
ＲＮおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２６におけるアミノ酸残基は
ＲＱＥおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２７におけるアミノ酸残基は
ＥＡＴおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２８におけるアミノ酸残基は
ＬおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５２９におけるアミノ酸残基は
ＳＧＡおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３０におけるアミノ酸残基は
ＬおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３１におけるアミノ酸残基は
ＦＬおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３２におけるアミノ酸残基は
ＱおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３４におけるアミノ酸残基は
ＨおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３５におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３６におけるアミノ酸残基は
ＧＡおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３７におけるアミノ酸残基は
ＩＶおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３８におけるアミノ酸残基は
ＴおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５３９におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４０におけるアミノ酸残基は
ＴおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４１におけるアミノ酸残基は
ＡおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４２におけるアミノ酸残基は
ＫＲおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４３におけるアミノ酸残基は
ＴＤＥＳＱおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４４におけるアミノ酸残基は
ＨＡＷＹＳおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４５におけるアミノ酸残基は
ＶおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４６におけるアミノ酸残基は
ＶＭＡおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４７におけるアミノ酸残基は
ＶＬＱおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４８におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５４９におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置５５０におけるアミノ酸残基は
ＥＧＡおよびＣよりなる群から選択される。
また、本発明は、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
７８８
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｌａ（配列番号：１３）
を有する１１アミノ酸残基よりなる第九のアミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの
触媒的に活性な断片も提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７８９におけるアミノ酸残基は
ＡおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９０におけるアミノ酸残基は
ＹおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９１におけるアミノ酸残基は
ＬＩおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９２におけるアミノ酸残基は
ＦおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９３におけるアミノ酸残基は
ＬＫＭＲおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９４におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９５におけるアミノ酸残基は
ＮＤＡおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９６におけるアミノ酸残基は
ＧＮＹＱおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９７におけるアミノ酸残基は
ＰＥＱＮおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置７９８におけるアミノ酸残基は
ＡＧＳＫおよびＴよりなる群から選択される。
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
８６７
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ（配列番号：１４）を有する１４アミノ酸残基よりなる
第十アミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６７におけるアミノ酸残基は
ＦＴおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６８におけるアミノ酸残基は
ＹＦＳおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８６９におけるアミノ酸残基は
ＴＩおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７０におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７１におけるアミノ酸残基は
ＬＴＱＳおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７２におけるアミノ酸残基は
ＮＳおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７３におけるアミノ酸残基は
ＧＴおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７４におけるアミノ酸残基は
ＬＭＦＡＹおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７５におけるアミノ酸残基は
ＱＲおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７６におけるアミノ酸残基は
ＦＭＶＩＹおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７７におけるアミノ酸残基は
ＩＱＳＬおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７８におけるアミノ酸残基は
ＫＰＲＥおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８７９におけるアミノ酸残基は
ＲおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置８８０におけるアミノ酸残基は
ＲＭＴＥＶおよびＹよりなる群から選択される。
本発明は、さらに、保存されたアミノ酸配列領域、特に、以下の配列：
９０４
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ（配列番号：１５）を有する６６アミ
ノ酸残基よりなる第十一アミノ酸配列を含むクラス２マンノシダーゼの触媒的に活性な断
片を提供する。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０４におけるアミノ酸残基は
ＮＴＱＥおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０５におけるアミノ酸残基は
ＴＲＫＨＳＱＭおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０６におけるアミノ酸残基は
ＲＱおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０７におけるアミノ酸残基は
ＬＭおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０８におけるアミノ酸残基は
ＴＳおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９０９におけるアミノ酸残基は
ＬＩおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１０におけるアミノ酸残基は
ＬＨおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１１におけるアミノ酸残基は
ＴＳおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１２におけるアミノ酸残基は
ＧＡＲＮおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１３におけるアミノ酸残基は
ＱＨＲおよびＣよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１４におけるアミノ酸残基は
ＰＡＳおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１５におけるアミノ酸残基は
ＬＱおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１７におけるアミノ酸残基は
ＧＶおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１８におけるアミノ酸残基は
ＳおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９１９におけるアミノ酸残基は
ＳおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２０におけるアミノ酸残基は
ＬＭおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２１におけるアミノ酸残基は
ＡＳＧＫＥＲおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２２におけるアミノ酸残基は
ＳＮＤＥＰおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２４におけるアミノ酸残基は
ＥＱＷＲおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２５におけるアミノ酸残基は
ＬおよびＩよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２６におけるアミノ酸残基は
ＥおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２７におけるアミノ酸残基は
ＩＶＬおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２８におけるアミノ酸残基は
ＭＩＦＶおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９２９におけるアミノ酸残基は
ＱＬＭＶおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３０におけるアミノ酸残基は
ＤＨおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３１におけるアミノ酸残基は
ＲおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３３におけるアミノ酸残基は
ＬＴおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３４におけるアミノ酸残基は
ＡＳＭＶＬおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３５におけるアミノ酸残基は
ＳＱＲＹおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３６におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３７におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３８におけるアミノ酸残基は
ＥＮＧＦおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９３９におけるアミノ酸残基は
ＲおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４０におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４１におけるアミノ酸残基は
ＬＶＩおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４２におけるアミノ酸残基は
ＧＱＥＳおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４３におけるアミノ酸残基は
ＱＥおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４４におけるアミノ酸残基は
ＧおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４５におけるアミノ酸残基は
ＶＬＩおよびＲよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４６におけるアミノ酸残基は
ＬＲＫＨＱＭおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４７におけるアミノ酸残基は
ＤおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４８におけるアミノ酸残基は
ＮおよびＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９４９におけるアミノ酸残基は
ＫＬＲＧおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５０におけるアミノ酸残基は
ＰＲＩＡＳおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５１におけるアミノ酸残基は
ＶＴＭＧおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５２におけるアミノ酸残基は
ＬＶＣＡＰＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５３におけるアミノ酸残基は
ＨＡＮＥＶＦＷおよびＭよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５４におけるアミノ酸残基は
ＩＨＲＬＳＶＱおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５５におけるアミノ酸残基は
ＹＦＮＲおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５６におけるアミノ酸残基は
ＲＶＨＷＧおよびＫよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５７におけるアミノ酸残基は
ＬＩＲおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５８におけるアミノ酸残基は
ＶＬＭＨおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９５９におけるアミノ酸残基は
ＬＩＡＦよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６０におけるアミノ酸残基は
ＥＶおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６１におけるアミノ酸残基は
ＫＰＲＳＬおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６２におけるアミノ酸残基は
ＶＭＲＷＮＬおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６３におけるアミノ酸残基は
ＮＳＴＩＰＤおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６４におけるアミノ酸残基は
ＮＳＬＶＡＧおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６５におけるアミノ酸残基は
ＣＳＭＧＶＩＱおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６６におけるアミノ酸残基は
ＶＳＮＡＴおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６７におけるアミノ酸残基は
ＲＧＰＭＴＡおよびＤよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６８におけるアミノ酸残基は
ＰＮＥＫおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９６９におけるアミノ酸残基は
ＳＫＶＥＡＫおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７０におけるアミノ酸残基は
ＫＱＥＳＲおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７１におけるアミノ酸残基は
ＬＥＱＤＫＮおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７２におけるアミノ酸残基は
ＨＥＳＫＴおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７３におけるアミノ酸残基は
ＰＲＳＫおよびＮよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７４におけるアミノ酸残基は
ＡＶＴＬＰおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７５におけるアミノ酸残基は
ＧＳＡＲおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７６におけるアミノ酸残基は
ＹＦＮおよびＶよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７７におけるアミノ酸残基は
ＬＨおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７８におけるアミノ酸残基は
ＴＳおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９７９におけるアミノ酸残基は
ＳＨＬＭおよびＱよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８０におけるアミノ酸残基は
ＡＶＬおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８１におけるアミノ酸残基は
ＡＧＳＶおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８２におけるアミノ酸残基は
ＨＹＤＬおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８３におけるアミノ酸残基は
ＫＬＭＩＱＹおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８４におけるアミノ酸残基は
ＡＴＳＩＬおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８５におけるアミノ酸残基は
ＳＴＧおよびＥよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８６におけるアミノ酸残基は
ＱＷＭＳＡＲおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８７におけるアミノ酸残基は
ＳＹＦＬＥＨＭおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８８におけるアミノ酸残基は
ＬＭＦＶおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９８９におけるアミノ酸残基は
ＬＨＮおよびＡよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９０におけるアミノ酸残基は
ＤＹＴＡおよびＨよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９１におけるアミノ酸残基は
ＰおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９２におけるアミノ酸残基は
ＬＰＡＦＶＩＱおよびＷよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９３におけるアミノ酸残基は
ＤＶＬＩＲＮおよびＳよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９４におけるアミノ酸残基は
ＫＶＡＰおよびＴよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９５におけるアミノ酸残基は
ＦＭＬおよびＹよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９６におけるアミノ酸残基は
ＩＰＶＡＳおよびＬよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９７におけるアミノ酸残基は
ＦＧＶＬＮＡおよびＰよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９８におけるアミノ酸残基は
ＡＤＡＳＮＫおよびＧよりなる群から選択される。
もう１つの好ましい具体例において、第一の配列の位置９９９におけるアミノ酸残基は
ＥＡＫＲＧＴおよびＳよりなる群から選択される。
（下等真核生物におけるクラスＩＩＩマンノシダーゼの発現）
また、本発明は、Ｍａｎα１，２／Ｍａｎα１，３／Ｍａｎα１，６に対する基質特異
性を有するマンノシダーゼが下等真核生物宿主に導入されることも提供する。
１つの具体例において、Ｍａｎα１，２／Ｍａｎα１，３／Ｍａｎα１，６グリコシド
結合を加水分解することができるクラスＩＩＩマンノシダーゼは下等真核生物宿主で発現
される。インビボにてクラスＩＩＩマンノシダーゼを発現することによって、単独、ある
いは他のＮ−グリカン修飾酵素と組合せて、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対する高マンノー
ス構造の効果的なトリミングが宿主糖タンパク質で得られる。
好ましい具体例において、Ｓｆ９マンノシダーゼＩＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ ｇｉ：２２
４５５６７（Ｄ．Ｊａｒｖｉｓ， ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７
７：１１３−１２７））が、構成的または誘導性プロモーターの制御下で酵母組込プラス
ミドにクローン化される（実施例２６参照）。クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性の量は、
細胞に対する有害な効果を制限しつつ最適化される。これはプロモーターの強度を改変す
ることを含み、誘導性またはそうでなければ調節可能なプロモーターを用いてこれらのタ
ンパク質の発現を最良に制御することも含み得る。
野生型クラスＩＩＩマンノシダーゼを発現することに加え、クラスＩＩＩマンノシダー
ゼの修飾された形態を発現させて、細胞局在化および活性を増強させることができる。こ
れは、本明細書中に記載するように、クラスＩＩＩマンノシダーゼの種々の長さの触媒ド
メインを内因性酵母標的化領域に融合させることによって、本発明のコンビナトーリアル
ＤＮＡライブラリーアプローチを介して達成される。
（グリコシド結合のクラスＩＩＩマンノシダーゼ加水分解）
また、本発明の方法は、クラスＩＩＩ酵素の触媒的に活性なドメインが、オリゴ糖、例
えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造上のＭａｎα１，３お
よび／またはＭａｎα１，６および／またはＭａｎα１，２グリコシド結合を加水分解し
て、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（下等真核生物におけるさらなるＮ−グリカンプロセシング
のための所望の中間体）を生成させるメカニズムも含む。
第一の具体例において、グリコシド結合の加水分解は順次に起こる。酵素は少なくとも
１つのグリコシド結合を加水分解し、立体配座的に回転して、他のグリコシド結合を加水
分解する。
第二の具体例において、Ｍａｎα１，６グリコシド結合およびＭａｎα１，３グリコシ
ド結合の加水分解は同時に起こる。もう１つの具体例において、酵素はＭａｎα１，２グ
リコシド結合を特異的に加水分解する。生じた中間体はさらなるゴルジプロセシングのた
めの基質であり、ここに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴｓ）
、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴｓ）およびシアリルトランスフェラーゼ（
ＳＴｓ）のような他のグリコシル化酵素は順次にそれを修飾して、所望のグリコ形態を生
じさせることができる。図３６Ｃは、マンノシダーゼＩＩＩ経路を介して生産されたオリ
ゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を示す。
（本発明の宿主細胞）
本発明の好ましい宿主細胞は下等真核生物細胞、例えば、酵母、単細胞および多細胞ま
たは繊維状真菌である。しかしながら、広く種々の宿主細胞が本発明の方法で有用である
と考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質
を発現するように操作することができる。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺
乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク
質を発現させることができる。当業者が認識するように、（ヒト細胞を含めた）任意の真
核生物宿主細胞は本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、１以上のキメラタンパク
質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強さ
れる宿主細胞において、細胞下位置、例えば、オルガネラに標的化される。そのようなタ
ンパク質は、好ましくは、必ずしもそうではないが、本明細書中で例示したように、タン
パク質グリコシル化に関与する酵素である。いずれのタンパク質コード配列も標的化し、
本明細書中に記載された方法を用い、真核生物宿主細胞において修飾された活性につき選
択することができることが予測される。
結合されたＮ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を生産すること
ができる下等真核生物が特に有用である。何故ならば、（ａ）高度なマンノシル化を欠き
（例えば、Ｎ−グリカン当たり８マンノースを超え、または特に３０〜４０マンノース）
、それらはヒトにおいて低下した免疫原性を示し；および（ｂ）Ｎ−グリカンは、例えば
、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
ゼＩの作用によって（図１Ｂ；β１，２ＧｎＴＩ）、なおよりヒト様のグリコ形態を形成
するためのさらなるグリコシル化反応のための基質である。収率はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ
２構造を有するＮ−グリカンを持つ３０モル％より大、より好ましくは５０〜１００モル
％糖タンパク質の収率が得られる。好ましい具体例において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構
造の５０％を超えるものが、ＧｎＴＩ活性に対する基質であり、インビボにてそのような
基質として働くことができることが示される。
本発明の好ましい下等真核生物は、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈ
ｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉ
ｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖ
ｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａを含む。
各上記実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で富
化された宿主細胞を作製することに向けられる。これらの構造は望ましい。何故ならば、
それらは、次いで、例えば、Ｍａｒａｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、米国特許第５，
８３４，２５１号の方法を用い、インビトロでの処理によってプロセシングすることがで
きるからである。しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
が富化された前駆体は−−グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコ
シルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で−−インビトロでの少なくとも１つのさ
らなるグリコシル化反応によって処理されて、ヒト−様Ｎ−グリカンを生じる。例えば、
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化されたオリゴ糖前駆体は、好ましくは、Ｘが３、４または
５であり、好ましくは３であるＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するも
のへと処理される。Ｘが３より大きなＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有
するＮ−グリカンは、例えば、適用可能であれば、α−１，３および／またはα−１，６
マンノシダーゼ活性での処理によって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換する
ことができる。グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧ
ｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｇ
ｌｃＮＡｃ２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、グリコシルトラ
ンスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含めたさらな
るグリコシル化酵素の宿主細胞におけるエキソビボ処理によって、または異種発現によっ
て修飾して、ヒト−様Ｎ−グリカンとなることができる。
本発明に従って生産することができる好ましいヒト−様糖タンパク質は、７以下、また
は３以下のマンノシダーゼ残基を有するＮ−グリカンを含む；およびガラクトース、Ｇｌ
ｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースよりなる群から選択される１以上の糖を含むものを
含む。
下等真核生物宿主細胞が好ましいが、上記した特性を有する広く種々の宿主細胞は、本
発明の方法で有用であると考えられる。例えば、宿主細胞は、本発明に従ってヒト−様糖
タンパク質を発現するように作製することができる。同様に、種々の非−ヒト哺乳動物宿
主細胞は、本発明の方法を用い、よりヒト−様の糖タンパク質を発現するように改変する
ことができる。適当な宿主細胞を作製することができるか、あるいは酵母において既に記
載された多くのそのような変異体の１つを用いることができる。本明細書中で例示したよ
うに、本発明の好ましい宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける超マンノシ
ル化−マイナス（ＯＣＨ１）変異体である。
（複合体Ｎ−グリカンの形成）
複合体Ｎ−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖
構造に結合される順次のプロセスである。高等真核生物においては、これは、種々のプロ
セシング酵素に順次に暴露された基質を有することによって達成される。これらの酵素は
、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置において特異的反応を行う。この「
組立てライン」はＥＲ、初期、メディアルおよび後期ゴルジ、およびトランスゴルジネッ
トワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジお
よびＥＲにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素（例
えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランス
ポーター）が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それらの環境な
らびに経路における他の酵素に対して最も効果的に機能するような位置に特異的に標的化
されなければならない。
本明細書中で記載した方法の１つの目標は、産業醗酵プロセスにおいてよく行うことが
できる頑強なタンパク質生産株を達成することにあるので、複数遺伝子の宿主細胞染色体
への組込みは注意深い計画を含む。上記したように、非−ヒトグリコシル化反応に特徴的
であることが知られている酵素をコードする１以上の遺伝子は好ましくは欠失される。作
製された細胞株を、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換し、これ
らの遺伝子は安定に形質転換され、それにより、所望の活性が醗酵プロセスを通じて維持
されるのを保証する。
以下の酵素活性のいずれの組合せも、本発明の方法を用いて単一でまたは複数で宿主中
へ作製することができる：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトラ
ンスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、
ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前
駆体に対するｓｙｎ−およびアンチポートトランスポーター）、オリゴ糖のプロセシング
に関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性
を１以上の核酸分子に導入することができる（上記も参照）。核酸分子は単一でまたは複
数で、例えば、本発明のコンビナトーリアルライブラリーのような核酸ライブラリーの意
味で導入することができる。しかしながら、単一または複数酵素活性を、限定されるもの
ではないが、タンパク質送達方法および／または本発明の核酸ライブラリーまたはコンビ
ナトーリアルライブラリーを必ずしも用いることのない１以上の核酸分子の使用を含めた
いずれかの方法で宿主細胞に導入することができる。
（複合体Ｎ−グリカンを生産するためのグリコシルトランスフェラーゼの発現）
ＤＮＡ配列情報を用い、当業者はＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化する
ことができる（例えば、実施例３）。当業者によく知られた標準的な技術を用い、ＧｎＴ
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶをコードする（またはその触媒的に活性な断片をコード
する）核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択
された宿主細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．のような真菌宿主において転写を駆動することが
できる他の発現制御配列の転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入することができ、
従って、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素の１以上を、ヒト−様複合体糖タンパク質の生産の
ために選択された宿主細胞で活発に発現させることができる（例えば、実施例８、１５、
１７、１９）。
数個の個々のグリコシルトランスフェラーゼがクローン化され、しかしながら、生物の
グリコシル化パターンに対する「ヒト化」の所望の結果を証明することなく、Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（
ＧｎＴＩ）および他の真菌において発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１
９９９） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（１）：５３−８； Ｋａｌｓｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。そのよう
なグリコシルトランスフェラーゼの作用によって糖を許容するのに必要な炭水化物構造は
十分な量で存在せず、それは複合体Ｎ−グリカン形成の欠如に最も寄与したようであると
推測された。
本発明の好ましい方法は、初期、メディアルまたは後期ゴルジ装置における、ＧｎＴＩ
、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（またはＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶＩのような他のＧｎ
Ｔｓおよび上記のいずれかの組合せ）のようなグリコシルトランスフェラーゼの機能的発
現を提供し、ならびに（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現によって
；後記参照）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証する。
（糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ装置に供するための方法）
ゴルジにおいて満足して機能するグリコシルトランスフェラーゼについては、酵素は、
新成糖タンパク質に結合した糖部位の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の
十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば
、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース等）は、一般には、サイトゾルで合成
され、ゴルジに輸送され、そこで、それはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオ
リゴ糖に結合される。
下等真核生物のような非−ヒト宿主細胞においてこのプロセスを複製するためには、糖
ヌクレオシド特異的トランスポーターがゴルジで発現されて、ヌクレオシド糖前駆体の適
切なレベルが確保されなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒ
ｇ（１９８１） Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６； Ｓｏｍ
ｍｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７
（１８）：８１１−８１７； Ｐｅｒｅｚ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ （１９８７
） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。ヌクレ
オチド糖は、例えば、宿主微生物および糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外
因性遺伝子において発現させることによって、適切な区画に供することができる。トラン
スポーター酵素の選択は、用いるべき外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によっ
て影響される。例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトラン
スポーターを必要とするであろうし、フコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−フコースト
ランスポーターを必要とし、ガラクトシルトランスフェラーゼはＵＤＰ−ガラクトースト
ランスポーターを必要とし、シアリルトランスフェラーゼはＣＭＰ−シアル酸トランスポ
ーターを必要とするであろう。
付加されたトランスポータータンパク質はヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ装置
へ運び、そこで、ヌクレオチド糖はグリコシルトランスフェラーゼによって反応して、例
えば、Ｎ−グリカンを延長することができる。この反応はヌクレオシド二リン酸または一
リン酸、例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＭＰを放出する。ヌクレオシド一リン酸は、ア
ンチポードメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換においてゴルジか
ら直接的に輸出することができる。しかしながら、ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、グリ
コシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する。この反応は十分なグリコシル化に
重要に見えるので、ヌクレオチド二リン酸をコードする遺伝子の発現されたコピーを供す
るのがしばしば望ましい。（適切にはＵＤＰまたはＧＤＰに特異的な）ジホスファターゼ
はジホスホのヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を
生じる。
典型的には、哺乳動物起源である適当なトランスポーター酵素は後記する。そのような
酵素は、本発明の方法を用い、選択された宿主細胞に作製することができる。
もう１つの例において、α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼはガ
ラクトース残基をヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でキャップを施
し、糖タンパク質の成熟形態に導く（図１Ｂ）。このプロセシング工程を代謝的に作製さ
れた酵母または真菌へ再度作製することは、酵母の後期ゴルジにおいて、（１）α２，３
−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）ＣＭＰ−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸の十分な供給を必要とするであろう。後期ゴルジにおいて十分なα２，３−
シアリルトランスフェラーゼ活性を得るためには、例えば、（例えば、ヒトからの）公知
のシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、真菌における後期ゴルジに向けられな
ければならない（上記参照）。同様に、トランスポーターは、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸の輸送を可能とするように作製されなければならない。現在、真
菌が十分量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成し、またはそれをゴルジに輸送で
きることを示すものはない。その結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する
基質の適切な供給を確保するためには、真菌へのＣＭＰ−シアル酸の生産を代謝的に作製
しなければならない。
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン
発現された配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性サーチを介して認識さ
れたヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡがクローン化さ
れている（Ｉｓｈｉｄａ，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）
。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、
上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）からのｃＤＮＡでの表現型修正に
よってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。結果は、哺乳動
物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子が、発現され、酵母のゴルジ装置
へ機能的に標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有し、非常に異な
るアミノ酸配列を持つ２つのタンパク質は同一ゴルジ膜内の同一溶質性を輸送することが
できることを示す（Ｇｅｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
従って、例えば、（１）それによって形質転換された構築物が細胞中に維持される領域
（例えば、複製起点、または染色体組込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３またはＴ−
ｕｒｆｌ３ （Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ３１（２）：３０６−１０）または他のよく特徴付けられた選択−マーカー（例
えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ ｂｌｅ等）のような逆選択可能およびリサイクル可能マ
ーカーを含めた、形質転換されている細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子、（３）（
例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓからの、（Ａｂｅｉｊｏｎ， （１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）、またはＨ．ｓａｐ
ｉｅｌｓからの（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔ
ｏｋｙｏ） １２０（６）：１０７８−８）、および（４）上記した局在化／触媒ドメイ
ン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーターを含むことができる核酸構築
物によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を宿主細胞に取込むことがで
きる。図８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ−３においてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトラン
スポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝
子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）の付加を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは
、各々、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター無しのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株、および
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（ＰＢＰ−３）を持つＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｎ−グリカンプロフィールを比較する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｐ
ＢＰ−３は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する１
４５７（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークを呈する。
ＧＤＰ−フコース
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．
ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ （Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ、１９９９ Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００）によって同定され、精製され
ている。対応する遺伝子は同定されていないが、Ｎ−末端配列決定は、対応する遺伝子に
特異的なヌクレオチドプローブの設計で用いることができる。これらのオリゴヌクレオチ
ドはプローブとして用いて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をク
ローン化することができる。
ＵＤＰ−ガラクトース
２つの異種遺伝子、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅからのアル
ファ１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファ１，２ ＧａｌＴ）をコードす
るｇｍａｌ２（＋）、およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポー
ターをコードする（ｈＵＧＴ２）は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために
、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシ
ル化およびＵＤＰ−ガラクトース輸送活性の間の修正は、アルファ１，２ＧａｌＴよりは
むしろＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターの外因的供給がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけ
る十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ
， １９９９ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（２）： １３３−１４１）。同様に、Ｓ
．ｐｏｍｂｅからのＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターがクローン化された（Ｓｅｇ
ａｗａ，１９９９ Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５１（３）：２９５−２９８）。
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸）
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）はクローン化され、Ｌｅｃ８ Ｃ
ＨＯ細胞で発現されている（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．（Ｔｏｋｙｏ）１２６（５）：９４０−５０； Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（１
９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−９２）。マウスＣＭＰ−
シアル酸トランスポーターの機能的発現はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅで達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−９）。シアル酸はいくつかの真菌で見出されて
いるが、選択された宿主系が十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給できるかは明らかで
ない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに
供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。
（ジホスファターゼの発現）
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖
ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレ
オシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホノ
ヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）はホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切
断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなけれ
ばならない。この反応は十分なグリコシル化で重要であるように見える。というのは、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＧＤＰａｓｅはマンノシル化で重要であることが判明して
いるからである。しかしながら、この酵素はＵＤＰに向けての活性の１０％を有するに過
ぎない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ−
特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タンパ
ク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞
壁多糖に加える酵母は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、
さらに、そのような酵素についての要件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰは
グリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であることが知られており、このグリコシ
ル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨
げるのに重要である。
（組換えベクター）
種々の発現ベクターを用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現することができる（例
えば、実施例１３参照）。この配列は、宿主細胞の形質転換用の適当なベクター中の発現
制御配列に操作可能に結合させることができる。１つの実施形態において、本発明の配列
は、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＮｏｔＩ ＡｓｃＩ ＰａｃＩ制限部位カセット、Ｃｙｃ
ＩＩ転写ターミネーター、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１（Ａｍｐｒ）における発現
用のｕｒａ３選択カセットを含むｐＪＮ３４８と命名されたベクターに操作可能に連結さ
れている。
好ましい実施形態において、ベクターは上記にて記載したようにマンノシダーゼＩＩ酵
素の触媒的に活性な断片を含む。酵母および繊維状真菌で用いられる他の適当な発現ベク
ターは当該分野でよく知られている。
（核酸分子からの標的化酵素活性を発現させることにより宿主においてＮ−グリカンを
改変するための方法）
本発明は、さらに、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の生産のための酵素または複
数酵素をコードする１以上の核酸分子を非−ヒト宿主細胞に取込む工程を含む、この細胞
においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。１つの好ましい実施形態にお
いて、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡ
ｃ２の生産に関与する１以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入す
る。本発明は、加えて、１以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿
主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法
に関する。好ましい酵素活性はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリル
トランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトースト
ランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポータ
ー、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施
形態において、宿主は、１つの活性の産物がもう１つの活性、例えば、グリコシルトラン
スフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃトランスポーター活性の基質レベルを増加させる２以上の酵素活性を発現するよ
うに選択されるか、または作製される。もう１つの好ましい実施形態において、宿主は、
引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例えば、Ｕ
ＤＰ−またはＧＤＰ−特異的ジホスファターゼ活性を発現するように選択されるかまたは
作製される。
本発明の好ましい方法は、宿主細胞において核酸分子からの１以上の酵素活性を発現さ
せることを含み、酵素の触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチド、例えば、通常
は触媒ドメインに連結またはそれに会合していない異種シグナルペプチドを含む融合タン
パク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞下位置（例えば
、オルガネラ）へ標的化する工程を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル
化酵素）、またはその触媒的に活性な断片をコードする核酸断片へ同一翻訳リーディング
フレームにて連結された（「イン−フレーム」）細胞標的化シグナルペプチドをコードす
る核酸断片を含む少なくとも１つの遺伝子構築物（「融合構築物」）によってコードされ
る。
融合構築物またはタンパク質の標的化シグナルペプチド成分は、好ましくは、ＥＲまた
はゴルジの膜−結合タンパク質、検索シグナル、タイプＩＩ膜タンパク質、タイプＩタン
パク質、膜スパンニングヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルト
ランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノ
シルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来する。
融合構築物またはタンパク質の触媒ドメイン成分は、好ましくは、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩ
Ｉ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフ
ェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来するグリコシダ
ーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性に由来する。触媒ドメイ
ンは、好ましくは、酵素が局在化されたオルガネラにおける他の代表的な酵素の平均ｐＨ
最適値の１．４ｐＨユニット内にｐＨ最適値を有するか、あるいは５．１および８．０の
間のｐＨにおいて最適活性を有する。好ましい実施形態において、触媒ドメインはＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．
ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼ
ＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼ
ＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノ
シダーゼＩＩＩよりなる群から選択されるマンノシダーゼをコードする。
（グリコシル化酵素の選択：ｐＨ最適値および細胞下位置）
本発明の１つの実施形態において、ヒト−様糖タンパク質は、標的化細胞下区画におい
て他の酵素のｐＨ最適値と同様なｐＨ最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素
を細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的
に作製される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性
はほとんどの酵素は、約６．５および７．５の間にあるｐＨ最適値を有する（表３参照）
。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ＥＲおよ
びゴルジの内部ｐＨもまた約６〜８の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換
えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、
ｐＨ５．０程度のｐＨ最適値を有する酵素を導入した（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．
（１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７、
およびＣｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）
：２６２９８−２６３０４）。ｐＨ７．０において、それらのマンノシダーゼのインビト
ロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、Ｎ−グリカン上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の
効果的なインビボ生産のための、ＥＲおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるよう
な１０％未満まで低下される。
従って、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒
ドメイン）、例えば、α−マンノシダーゼを宿主細胞における細胞下位置（例えば、オル
ガネラ）へ標的化し、そこで、酵素またはドメインのｐＨ最適値は、同一オルガネラに局
在化された他の代表的なマーカー酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にある。
特異的オルガネラへ標的化されるべき酵素のｐＨ最適値は、同一オルガネラで見出された
他の酵素のｐＨ最適値とマッチングさせて、得られた単位酵素当たりの活性を最大化すべ
きである。表３は、種々の源からのマンノシダーゼの活性およびそれらの各ｐＨ最適値を
まとめる。表４は、それらの典型的な細胞下位置をまとめる。
好ましい実施形態において、特定の酵素または触媒ドメインは、通常は酵素ドメインに
会合していない細胞標的化シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構
築物によって、宿主細胞中の細胞下位置に標的化される。好ましくは、酵素またはドメイ
ンは宿主細胞のＥＲ、初期、メディアルまたは後期ゴルジ、またはトランスゴルジ装置に
標的化される。
より好ましい実施形態において、標的化グリコシル化酵素はマンノシダーゼ、グリコシ
ルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、マ
ンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこで、グリコシル化の初期
反応が起こる。この方法は非−ヒト宿主細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産するの
に有用であるが、この方法は、ヒト宿主細胞を含めたいずれかの真核生物宿主細胞におい
て糖タンパク質の炭水化物プロフィールを修飾するのにより一般的には有用でもあること
を認識されるであろう。
宿主細胞分泌経路のある種のオルガネラにおいてタンパク質の滞留を媒介する標的化配
列は周知であり、標的化配列および標的化された酵素の選択用のライブラリーに関して後
により詳細に議論するように、科学文献および公のデータベースに記載されている。その
ような細胞下標的化配列は、単独、または組合せて用いて、選択されたグリコシル化酵素
（またはその触媒ドメイン）を宿主細胞、すなわち、そこで酵素が、ｐＨ最適値または他
の同様な因子の存在に基づいて増強されたまたは最適な活性を有するであろうものにおけ
る特定の細胞下位置に標的化することができる。
高マンノース構造をトリミングして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような宿主細胞のＥ
Ｒまたはゴルジ装置においてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせようと試みる場合、例え
ば、（１）十分に近いｐＨ最適値（すなわち、ｐＨ５．２およびｐＨ７．８の間）を有し
、および（２）単独で、または協力し合って、ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃの引き続いて
の付加を許容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を作り出すことが
知られているいずれかの酵素または酵素の組合せを選択することができる。インビトロに
てＧｎＴＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる構造を
作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せは、適当な選択を構成す
るであろう。この知識は、科学的文献から、あるいは実験的に得ることができる。
例えば、潜在的マンノシダーゼがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ（２−アミノベンズ
アミド）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＢに変換することができるかを判断することがで
き、次いで、得られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ構造がＧｎＴＩおよびＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃに対する基質として働いて、インビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ
２を与えることができることを証明することができる。ヒトまたはマウス源からのマンノ
シダーゼＩＡは、例えば、適切な選択であろう（例えば、実施例４参照）。本明細書中に
記載した例は、２−アミノベンズアミド標識Ｎ−結合オリゴマンノース、続いての、この
判断をなすためのＨＰＬＣ分析を利用する。
従って、本発明に従って用いられるα−１，２−マンノシダーゼ酵素のようなグリコシ
ル化酵素は、５．１および８．０の間のｐＨにおいて最適な活性を有する。好ましい実施
形態において、この酵素は５．５および７．５の間のｐＨにおいて最適な活性を有する。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ酵素は、例えば、本発明の方法でよく働き、約５．５
の見掛けのｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼは適当なｐＨ最適値を有する表
３にリストしたもの、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐ
ｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、
マウスＩＢ（ゴルジ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓを含む。
α−１，２−マンノシダーゼ酵素についてのｐＨ最適値を示す実験を実施例７に記載す
る。培地に遺漏するキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ３１）を種々のｐＨ範囲に
付して、酵素の最適活性を決定した。実験の結果は、α−１，２−マンノシダーゼはその
機能に対して約５．５の最適ｐＨを有することを示す（図１１）。
好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子は宿主生物におい
て発現される。しかしながら、いくつかの場合、数個の異なるマンノシダーゼ遺伝子、ま
たは１つの特定の遺伝子の数個のコピーを発現させて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の適切な
生産を達成するのが望ましいであろう。複数遺伝子を用いる場合、コードされたマンノシ
ダーゼは、好ましくは、全て、約５．１〜約８．０、または特に約５．５および約７．５
の間の好ましい範囲内にｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼ活性はマウス、ヒ
ト、Ｌｅｐｉｂｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉ
ｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓまたはＡ．ｎｉｂｕｌａｎｓに由来するα−１，２−マ
ンノシダーゼを含む。
（コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを用いる宿主細胞グリコシル化のインビボ改
変）
本発明のある種の方法は、好ましくは（必ずしも必要ではないが）、１以上の核酸ライ
ブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトーリアル核酸ライブラリーの例示的特徴
は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパ
ク質（例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素ま
たはその触媒ドメイン）をコードする配列を含むことである。
１つの実施形態において、コンビナトーリアル核酸ライブラリーは（ａ）異なる細胞標
的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列；および（ｂ）標的化すべ
きポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。もう１つの実施形態にお
いて、コンビナトーリアル核酸ライブラリーは（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコー
ドする少なくとも１つの核酸配列、および（ｂ）宿主細胞へ標的化すべきポリペプチドを
コードする少なくとも２つの核酸配列を含む。後にさらに記載するように、（ａ）に由来
する核酸配列、および（ｂ）に由来する核酸配列を連結させて、注目するポリペプチドド
メインに機能的に連結した細胞標的化シグナルペプチドをコードする１以上の融合構築物
を生じさせる。機能的結合の１つの例は、細胞標的化シグナルペプチドが同一翻訳リーデ
ィングフレームにて（「イン−フレーム」）注目するポリペプチドドメインに連結される
場合である。
好ましい実施形態において、コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメ
インにイン−フレーム連結した細胞標的化シグナルペプチドを含む１以上の融合タンパク
質を発現させる。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンの哺乳動物
−またはヒト−様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい実施形態にお
いて、触媒ドメインは、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および１以上
の標的化シグナルペプチドにイン−フレームに連結した他のグリコシダーゼよりなる群か
ら選択される酵素に由来する。酵素ドメインは宿主細胞に対して外因性および／または内
因性であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジへの輸送を受けるタ
ンパク質に通常は会合したものである。
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、哺乳動物Ｎ−グリカン修飾または
ヒト−様Ｎ−グリカン修飾に関与するインビボ酵素を生産し、局在化するのに用いること
ができる。コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が
、そこで、それが注目する糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを生産することに関与す
る宿主細胞のＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークに局在化されるように作
製される。本発明のＮ−グリカン修飾酵素の局在化は、アンカリングメカニズムを介して
、またはタンパク質−タンパク質相互作用を介して達成され、ここに、コンビナトーリア
ルＤＮＡライブラリーから構築した局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴル
ジネットワークのような分泌経路の所望のオルガネラに局在化される。
十分に、かつヒト−様（複合体）グリコシル化反応によってさらなる修飾用の十分な量
が生産される有用なＮ−グリカンの例はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。十分な量のＭａ
ｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、インビボでのさらなるヒト−様プロセシングのために注目する糖
タンパク質に必要とされる（例えば、３０モル％より大）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間
体は、さらなるＮ−グリカン修飾用の基質として用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮ
Ａｃ２を生産することができる（図１Ｂ；上記参照）。従って、本発明のコンビナトーリ
アルＤＮＡライブラリーを用いて、引き続いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、
または所望の複合体Ｎ−グリカンを適当な量で生産する酵素を生産することができる。
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを用いて生産された融合構築物のさら
なる態様は、それらが、作製された宿主細胞において十分かつしばしば完全に近い細胞内
Ｎ−グリカントリミング活性を可能とすることである。本発明のコンビナトーリアルＤＮ
Ａライブラリーによって生産された好ましい融合構築物はグリコシル化酵素、例えば、マ
ンノシダーゼをコードし、これは、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在化され、それによ
り、細胞外活性をほとんど好ましくは全く呈しない。マンノシダーゼ酵素をコードする本
発明の好ましい融合構築物はＮ−グリカンが修飾される場所、すなわち、ＥＲおよびゴル
ジに局在化されることが示されている。本発明の融合酵素は分泌経路中のそのような特定
のオルガネラに標的化され、そこでは、それらは局在化され、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の
ようなＮ−グリカンに作用して、注目する糖タンパク質上でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生
産する。
本発明のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーによって生産された酵素は、各々、図
５および６に示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたＫ３またはＩＦＮ−
βタンパク質につき示されたように、注目する糖タンパク質上でＮ−グリカンを修飾する
ことができる（また、実施例２および４参照）。しかしながら、限定されるものではない
が、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロ
ン−γ、インターフェロン−ωのようなサイトカイン、および顆粒球−ＣＳＦ、第ＶＩＩ
Ｉ因子、第ＩＸ因子のような凝固因子、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α
−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、およ
び尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出
因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系
先祖阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−
フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパ
ク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベータおよびカルシウムモジュレーターおよび
シクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体
アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ
、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリン
パ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めた他のタイプの糖タンパク質もこのようにしてグリコシル
化することができるのが認識される。
（融合構築物のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーの構築）
融合構築物のコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーは、一般に、（例えば、Ｃ−末端
欠失を作製することによって、天然タンパク質のＮ−末端ドメインに由来する１以上の細
胞標的シグナルペプチド（「標的化ペプチド」）を特徴とする。しかしながら、いくつか
の標的化ペプチドは天然タンパク質（例えば、ＳＥＣ１２）のＣ−末端に由来する。ＥＲ
またはゴルジの膜−結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源
として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル（ｃｔ）
、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これ
らの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび／または他の局在化されたタ
ンパク質との比較（例えば、疎水性プロットの比較）によって認識可能である。
標的化ペプチドはここではタイプＩＩ膜の一部に対して短い（ｓ）、中程度（ｍ）およ
び長い（ｌ）として示される。短い（ｓ）と示された標的化ペプチド配列は膜−結合タン
パク質の膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と示された標的化ペプチド配
列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中程度（ｍ
）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ
）の長さのほぼ半分に対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル
化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。
（サブライブラリー）
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝
子または野生型遺伝子から直接組立てることができる。好ましい実施形態において、上記
ＤＮＡライブラリーは、２以上のサブライブラリーの融合から組立てられる。サブライブ
ラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン（例えば、
グリコシル化活性を有するもの）をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製す
ることが、可能である。
（グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー）
１つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、グリ
コシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよ
びシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメイ
ンは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選
択され得る。哺乳動物酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素
は、全て有用であり、これは、最適温度および最適ｐＨに関して広いスペクトルの生化学
特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、
そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードする断片を得る。内因性標的化配列を除
去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現
させ得る。
そのような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが引き続いて活性であるべき特定
の環境についての知識によって誘導され得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴ
ルジにおいて活性であり、かつ後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定の
ｐＨ最適値を有するか、あるいは後期ゴルジが特定のｐＨを有することが公知である場合
、上記したように、そのｐＨにおいて十分な（好ましくは最大の）活性を示す触媒ドメイ
ンを、選択する。
（標的化ペプチド配列サブライブラリー）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内
の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、
核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他
の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、
３つのカテゴリー：（１）一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜（腔膜）に
係留させる、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域
（ｓｒ）の一部またはステム領域の全てをコードする、Ｎ末端配列；（２）ＨＤＥＬテト
ラペプチド（配列番号１０５）またはＫＤＥＬテトラペプチド（配列番号１０６）のよう
なＣ末端で一般に見出される検索シグナル；および（３）ゴルジ中に局在化することが知
られている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通
領域；に入る。
最初の場合において、標的化ペプチドが種々のエレメント（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）
からなる場合、上記ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が提示
されるように設計される。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実
施形態は、ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列および／
またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合、種々の長さのｓｒ配列を持つサブライブラリー
を提供することが、望ましいものであり得る。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮ
Ａの５’末端に結合するプライマーを用い、かつステム領域の種々の部分に結合する一連
の対向プライマーを使用するＰＣＲによって、達成され得る。
標的化ペプチド配列のさらに他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向
輸送されるタンパク質のＣ末端において代表的には見出される、検索シグナルペプチド（
例えば、テトラペプチドＨＤＥＬ（配列番号１０５）またはＫＤＥＬ（配列番号１０６）
）が挙げられる。標的化ペプチド配列のさらに他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タン
パク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（ｃ）ゴルジに局在化される膜貫通ヌクレオチド糖
トランスポーター、および（ｄ）表５において言及される配列、が挙げられる。
（表５ 有用な区画標的化配列の供給源）
いずれの場合においても、特定の酵素活性に適する標的化ペプチド配列を選択して、所
望のグリコシル化反応の系列内で最適に機能することが、非常に好ましい。例えば、新生
Ｎ−グリカンの末端シアル化（ヒトにおいて後期ゴルジで起こるプロセス）が可能な改変
された宿主微生物を開発するにおいて、後期ゴルジタンパク質に由来する標的化ペプチド
配列のサブライブラリーを利用することが、望ましい。同様に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
を与えるようにα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミング
することは、ヒトにおける複合体Ｎ−グリカン形成における初期工程である（図１Ｂ）。
従って、この反応を、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが
、望ましい。ＥＲ滞留シグナルおよび初期ゴルジ滞留シグナルをコードするサブライブラ
リーが、使用される。
次いで、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリ
ー）が、１つまたは一連の標的化ペプチド配列を、触媒ドメインをコードする１つまたは
一連の配列に機能的に連結させることによって構築する。好ましい実施形態において、こ
れは、標的化ペプチド配列（上記）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーを、グリ
コシル化酵素または触媒的に活性なその断片（後記参照）をコードするＤＮＡを含むサブ
ライブラリーへとイン−フレーム連結することよって、達成される。
得られたライブラリーは、標的化ペプチド配列を含有する融合タンパク質をコードする
合成遺伝子を含む。いくつかの場合、融合タンパク質のＮ末端に、あるいは他の場合には
Ｃ末端に、標的化ペプチド配列を提供することが、望ましい。いくつかの場合、標的化ペ
プチド配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り
畳まれたドメインのタンパク質構造は、破壊されないものとする。各タイプの融合タンパ
ク質は、（段階的指向性様式または半ランダム様式にて）構築され、最適な構築物は、本
発明の方法を用いて、宿主細胞の形質転換、および形質転換された細胞におけるグリコシ
ル化パターンの特徴付けに基づいて、選択され得る。
（さらなる配列多様性の生成）
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー）
が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも１つの形質転換体が、望まれる表現
型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖
タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る（Ｒｏｍｅｒｏら（２０００）Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１５）：１１０７１−４）。従って、形質転換に先立ち
、ＤＮＡライブラリーまたは構成サブライブラリーが、１つ以上の技術に供されて、さら
なる配列多様性が生成され得る。例えば、１回以上の遺伝子シャッフリング、エラープロ
ーンＰＣＲ、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構
築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
（発現制御配列）
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列（例えば、プロモ
ーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への
融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必
要であり得るような他の機能的配列）を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一
般には好ましい。
適切なベクター構成要素（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモータ
ー、エンハンサー、ターミネーター等）および必要に応じて、宿主細胞における自律複製
に必要な配列が、どの特定の宿主細胞が選択されるかの関数として選択される。特定の哺
乳動物または下等真核生物宿主細胞で用いるための適切なベクター構成要素についての選
択基準は、慣用的である。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈ
ａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａ
ｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏ
ｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ
、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅ
ｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃ
ｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎ
ｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅ
ｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる
。宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例
えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＰ
４０プロモーターが挙げられる。
（選択マーカー）
少なくとも１つの選択マーカー（薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完す
るための遺伝子）を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は
、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、ＵＲＡ３遺
伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１８遺伝子、ＢＬＡ遺伝子、またはＳＨ
ＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細
胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物
宿主細胞で用いるために利用可能である。
（形質転換）
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、Ｄ
ＮＡ移入のための任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法
、またはスフェロプラスト法）が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞におい
て、従来の方法としては、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクト
ロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養（例え
ば、酵母における発酵）に適した安定な株を生成するために、上記ＤＮＡライブラリー構
築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは
、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、ＤＮＡライブラ
リーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして
、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規
定された部位で起こる。
特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体における望まれな
い遺伝子の部位中に組み込まれ、その遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣ
Ｈ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子またはＭＮＮ４遺伝子の部位への組込みは、糖タンパク質の
酵母超マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に関与する酵素の発現を
妨げつつ、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能とする。他の実施形態において、ライ
ブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは
レトロウイルスベクター）、染色体を介して宿主中に導入され得、自律核酸分子としてか
、または宿主ゲノム中への相同組み込みもしくはランダム組込みによって、導入され得る
。いずれの場合においても、一般には、安定に形質転換された宿主生物の容易な選択を可
能とするために、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を各ライブラリーＤＮＡ構築物と
ともに含ませることが、一般に望ましい。そのために、またはそれに抗して選択され得る
再生可能なマーカー遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）は、特に適切である。
（スクリーニングおよび選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示
す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出
方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および／または除去工程によって行われ得る
。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用い
て、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上
にタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。
細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞につき、例えば、または最高末
端ＧｌｃＮＡｃ含有量にてタンパク質を分泌する細胞につき、スクリーニングし得る。そ
のようなスクリーニングは、染色手順のような目に見える方法、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ
結合抗体またはマーカー結合体化レクチン（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）に結合する
能力、特異的レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の低下、インビトロで放射性
標識糖を取り込む能力、染料または荷電表面への改変された結合に基づいてスクリーニン
グされ得るか、あるいは発蛍光団標識レクチンまたは発蛍光団標識抗体と組み合せた蛍光
支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを用いることによって達成され得る（Ｇｕｉ
ｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）
：７８８８−７８９２）。
従って、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に細胞を暴露する
ことによって、無傷細胞が、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る
。広汎な種類のオリゴ糖特異的レクチンは、（例えば、ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから）商業的に入手可能である。あるいは、特異的ヒトＮ−
グリカンに対する抗体または動物Ｎ−グリカンに対する抗体は、商業的に入手できるか、
あるいは標準技術を用いて製造され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子
（例えば、発色団、発蛍光団、放射性同位体、または発色性基質を有する酵素）に結合体
化され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
次いで、スクリーニングは、分析方法（例えば、分光測定法、蛍光比色法、蛍光活性化
細胞ソーティング、またはシンチレーションカウンティング）を用いて実施され得る。他
の場合には、形質転換された細胞からの単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分
析することが、必要であり得る。タンパク質単離は、当該分野で公知の技術によって行わ
れ得る。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が、培地に分泌され、アフィ
ニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーまたは
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアフィニティークロマトグラフィー）によって精
製される。単離されたＮ−グリカンが好ましい場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｄｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような酵素を用いて、糖タンパク質からＮ
−グリカンが切断され得る。次いで、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質
量分析法、または他の適切な手段によって、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンが
、分析され得る。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖質構造を持つ細胞
を同定し得るいくつかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ質量分析法を用いて、切断されたＮ−グリカンが分析される。
所望の形質転換体の選択に先立ち、望まない表現型を有する細胞の形質転換された集団
を除去することが、望ましいものであり得る。例えば、その方法を用いて機能的マンノシ
ダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞糖タンパク質において、
より低レベルのマンノースを有する。培地中のマンノースの致死的放射性同位体への形質
転換された集団の暴露は、望まない表現型（すなわち、高レベルの取り込まれたマンノー
ス）を有する形質転換体の集団を除去する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ ＴＣおよびＲｏｂｂｉｎ
ｓ ＰＷ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８３ Ｄｅｃ；８０（
２４）：７４６６−７０）。あるいは、細胞傷害性レクチンまたは望ましくないＮ−グリ
カンに対する抗体を用いて、望まない表現型の形質転換集団を除去し得る（例えば、Ｓｔ
ａｎｌｅｙ ＰおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ Ｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅ
ｎｅｔ １９７７ Ｊｕｌ；３（４）：３９１−４０５）。米国特許第５，５９５，９０
０号は、望まれる細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。こ
の戦略を反復して行うと、下等真核生物において、より多くの複合グリカンの連続操作が
可能となる。
高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をその表
面に有する宿主細胞を検出するためには、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効
果的な転移を可能とする形質転換体につき選択し得る。このスクリーニングは、寒天プレ
ート上での選択圧下で形質転換されたライブラリーを保有する細胞を増殖させること、個
々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって、実施され得る
。細胞を増殖させた後、細胞は遠心分離され、細胞は、緩衝液中に再懸濁され、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩの添加の後、ＵＤＰの放出が、ＨＰＬＣまたはＵＤＰにつ
いての酵素連結アッセイによって、測定される。あるいは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
ＡｃおよびＧｎＴＩＩを用い得、細胞を洗浄し得、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼによって放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索し得る。これはすべて、手動により行って
も、あるいは高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化されてもよい。第
一のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出する形質転換体、または第二のアッセイに
おいてより多くの放射性標識ＧｌｃＮＡｃを放出する形質転換体は、その表面により高い
程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、従って、所望の表現型を構成すると
予測される。同様なアッセイもまた、同様に、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを見るよ
うに適合され得る。
あるいは、形質転換細胞の表面上の改変されたグリコシル化パターンを明らかにし得る
他の適切な任意のスクリーニング（例えば、レクチン結合アッセイ）を用い得る。この場
合、末端マンノースに対して特異的なレクチンの結合減少は、適切な選択ツールであり得
る。Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的
に結合し、これは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジに存在すれ場合には低下する
ことが、予測される。また、高い末端マンノース含有量を含む細胞の除去を可能とするク
ロマトグラフィー分離工程を行うことによって、所望の形質転換体を富化し得る。この分
離工程は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を
持つ細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎ
ｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行う
。
加えて、異なる下等真核生物宿主において活性な炭水化物改変酵素の局在化についての
さらなる情報は科学文献にて入手可能となるので、そのような融合タンパク質構築物を直
接作製し得る。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、その触媒活性を保
有しつつゴルジ装置に局在化され得ることが、公知である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら．（
１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような知見を全体的
戦略に直接的に組み込んで、そのような宿主から複合Ｎ−グリカンを取得し得る。Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓにおけるいくつかのそのような遺伝子断片が同定されており、これらはＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグリコシルトランスフェラーゼに関連する。従って、こ
れらは、その目的で使用され得る。
（コンビナトリアルライブラリーからの融合構築物を用いる宿主細胞グリコシル化の改
変）
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築が、図２に模式的に示され、実施
例４に記載される。その融合構築物は、多数のベクター（例えば、当該分野で周知の発現
ベクター）に作動可能に連結され得る。広く種々のそのような融合構築物が、表６に示し
たような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド／触媒ドメインの組合せは
、本発明に従って、ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マ
ンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用い
るために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチ
ドのタイプに応じ、Ｎ−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有
さないものであり得る（例えば、表７、実施例４）。
（マンノシダーゼＩ融合構築物）
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の
代表的な例は、ｐＦＢ８であり、これは、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ ＡＮ ６６７８７８７）の１８７Ｎ末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結し
た短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰ
ｒｏｔ Ｐ１１６５５からのＳＥＣ１２の９８８〜１２９６ヌクレオチド）を有する。従
って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン
領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ
１８７と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を
保持しつつ、ＳＥＣ１２標的化ペプチド配列によってＥＲに局在化し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮ
Ａｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である（実施例４；図６Ｆおよび
７Ｂ）。
融合構築物ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシ
ダーゼＩＢΔ９９）は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の
例である（実施例４；図５Ｄおよび８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）は、
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である効率的な
融合構築物のさらに別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物およ
び他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作
製することによって、当業者は、最適細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低
い活性を持つかまたは活性を全く持たない構築物から区別し、そしてそれを選択し得る。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノ
シダーゼ融合構築物のみが、特に望ましいＮ−グリカンをインビボで生成し得るので、有
利である。
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的で
あり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同
等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じさせ得るというわ
けではないことが、さらに理解されるべきである。従って、目的のタンパク質は、コンビ
ナトリアルＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた宿主細胞に導入されて、目的の
タンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され
得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプロー
チを用い、最適な融合構築物を生じさせて選択することが可能であり得る。
さらに、局在化された活性なマンノシダーゼ触媒ドメイン（またはより一般的には、任
意の酵素のドメイン）を示す他のそのような融合タンパク質は、実施例４に例示される技
術および本明細書中に記載された技術のような技術を用いて、生成され得ることが、明ら
かである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成しそれを用いて、例えば
、特定の宿主細胞中に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリー
からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験であ
る。
（グリコシルトランスフェラーゼ融合構築物）
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、本発
明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性に由来
する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てら
れ、マーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造
の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成につき選択された。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８
）生じることが示された融合構築物（ｐＰＢ１０４）、が同定された（実施例８）。広く
種々のそのようなＧｎＴＩ融合構築物を、組み立てた（実施例８、表１０）。標的化ペプ
チド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生
成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示
す他のそのような融合構築物は、実施例８に示すように生成され得ることが、当業者にと
って明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を
用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、Ｇ
ｌｎＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験
である。
マンノシダーゼ融合構築物につき上記したように、全ての標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触
媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、本明細書中に記載するように目的の糖タン
パク質上で適切なグリコシル化を生じるというわけではない。しかしながら、当業者は、
本明細書中に記載したＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生成し
てそれを選択することが可能である。実施例８は、標的化ペプチドと、優勢なＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を持つ糖タンパク質の生成に関与するＧｎＴＩ触媒ドメイ
ン融合構築物とを含む、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態を示す
。
（宿主細胞グリコシル化を改変するための多重融合構築物の使用）
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例に
おいて、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現するＯＣＨ１欠失を持つＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質
転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに変換した（実施例８）。ま
ず、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ
）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）を、１，６開始マンノシルトランスフェラーゼ
活性を欠くＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（すなわち、ｏｃｈ１欠失；実施例１）に形質転換し
た。第二に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ
ＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構
築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなる生成を増加させた。ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、図１０Ｂに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株
においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を有意に増加させた。第３に、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を
、この株に導入した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を「ＰＢＰ−３」という。
上記した酵母株のような宿主細胞は、１以上の発現ベクターで順次に形質転換および／
または共形質転換され得ることが、当業者によって理解される。また、形質転換の順番は
、目的の糖タンパク質を生成するのに特には関係しないことも、理解される。当業者は、
本明細書中に開示された手法の慣用的改変は、目的の糖タンパク質の生成において改良さ
れた結果を提供し得ることを認識する。
特定の触媒ドメイン配列を持つ特定の標的化ペプチド配列を用いることの重要性は、本
明細書中に記載された実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリ
ーは、ヒト様糖タンパク質を生成するのに特に有用な、目的の糖タンパク質上でのＮ−グ
リカンの改変に関与する酵素融合物を構築するためのツールを提供する。（しかしながら
、本発明のライブラリーおよび方法を用い、任意の酵素融合物が、選択され得る）。適切
に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５
Ｄおよび５Ｅに示されたように、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを持つＫ３
を生じる。これは、図５ＣにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されたよう
に、親ＯＣＨ１欠失株のＫ３と比較して、切断されたグリカンに減少した分子質量を与え
る。
同様に、同じアプローチを用いて、別の分泌型糖タンパク質（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
を優勢に含むＩＦＮ−β）を生成した。このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＰＮＧａｓｅ消
化によって除去し（Ｐａｐａｃら．，１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５
−４５４）によって除去し、図６Ａ〜６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１
２５４（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークは、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）および図６Ｆ（ｐ
ＦＢ８）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ
Δ１８７）において、ＩＦＮ−β上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を確認する。さ
らに、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダー
ゼＩＡ Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒ
トＧｎＴＩ Δ３８）およびｐＰＢ１０３（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子）を
含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ−３において、ハイブリッドＮ−グリカンＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）
。
高度なマンノーストリミングで形質転換体を同定した後、さらなる実験を行って、マン
ノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで起こり、これは、優勢には、増殖培地中での
細胞外活性の結果ではないことを確認した（実施例６；図７〜９）。
（ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物）
本発明の方法によって提供されるように、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩのコンビナト
リアルＤＮＡライブラリーを、数個のマンノシダーゼＩＩ酵素の触媒ドメインを一群の細
胞標的化ペプチドシグナルに融合させることによって、生成した（実施例１４）。得られ
た５００個を超えるコンビナトリアル融合構築物を、レポーターＫ３上で複合グリコシル
化のヒト前駆体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ ＹＳＨ−１（実施例１７）
を生成し得るＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に導入した。ほんの少数の株（約＜５％）のみが、
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へと定量的
に変換し得た。これらの株を単離し、引き続いて、数百個のＧｎＴＩＩ／リーダーペプチ
ド融合物のコンビナトリアルライブラリーで形質転換した。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ２の存在についてのスクリーニングは、株ＹＳＨ−４４によって例示されるよう
に、均一な複合グリカンを分泌することが可能である株の単離を可能とした（実施例１９
）。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩ
Ｉ融合構築物の代表的な例は、ｐＫＤ５３であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端
アミノ酸欠失物にインフレーム連結した短縮型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ
）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３８０６９からのＭＮＮ２の１〜１０８ヌク
レオチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペ
プチド／触媒ドメイン領域を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／Ｄ．ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ Δ７４という。コードされた融合タンパク質は
、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＭＮＮ２（ｓ）標的化ペプチド配
列によってゴルジに局在化し、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する
Ｎ−グリカンをインビボで生成し得る（実施例１８）。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩ
Ｉ融合構築物の別の例は、ｐＫＤ１であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴル
ジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ
酸欠失物にインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１（ｓ）標
的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ５３００８からのＧＬＳ１の １〜１０２ヌクレ
オチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプ
チド／触媒ドメイン領域をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１（ｓ）／Ｄ．ｍｅｌａ
ｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４という。コードされた融合タンパク質は、マ
ンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＧＬＳ１（ｓ）標的化ペプチド配列によっ
てゴルジに局在化し、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリ
カンをインビボで生成し得る（実施例２２）。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するゴルジα−マンノシダーゼＩ
Ｉ融合構築物の別の例は、ｐＫＤ５であり、これは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴル
ジα−マンノシダーゼＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ
酸欠失物にインフレーム連結された短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）
標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３２９０６からのＭＮＳ１の１〜２４６ヌクレ
オチド）である。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプ
チド／触媒ドメイン領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／Ｄ．ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ Δ７４という。コードされた融合タンパク質は
、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＭＮＳ１（ｍ）標的化ペプチド配
列によってゴルジに局在化し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グ
リカンをインビトロで生成し得る（実施例２３）。ＹＳＨ−２７に存在するＮ−グリカン
の均一性とは異なり、図２１は、Ｎ−グリカンの不均一混合物がＹＳＨ−７４を生じたこ
とを示す。しかしながら、このマンノシダーゼＩＩ酵素の見掛けの普通のトリミング活性
は、図２３に示唆されるようなＭａｎα１，２付加物としての不均一性を示し、ここで、
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ピークは、Ａ．ｓａｉｔｏｉ α−１，２−マンノ
シダーゼでのＹＳＨ−７４の消化の後に出現する。本発明によりこれらのマンノシダーゼ
融合構築物および他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡラ
イブラリーを生成することによって、当業者は、最適な細胞内トリミング活性を有する構
築物を、比較的低い活性を有するかまたは全く活性を有さない構築物から区別してそれを
選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された
少数のマンノシダーゼ融合構築物のみがインビボにて特に望ましいＮ−グリカンを生成し
得るので、有利である。
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的で
あり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同
等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じ得るというわけで
はないことが、さらに理解されるべきである。図１８は、本発明のコンビナトリアルＤＮ
ＡライブラリーｐＫＤ１６（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒゴルジα−マンノシダーゼＩ
Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ Ｘ７７６５２）の７４Ｎ末端アミノ酸欠失物にインフレーム
連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｍ）標的化ペプチド（Ｓｗｉｓ
ｓＰｒｏｔ Ｐ３９１０７からのＭＮＮ９の１〜２７３ヌクレオチド）である）に由来す
るゴルジα−マンノシダーゼＩＩ融合構築物で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｙ
ＳＨ−１において、見掛けの活性がないことを示す。従って、目的のタンパク質は、コン
ビナトリアルＤＮＡライブラリーで形質転換された宿主細胞に導入されて、目的のタンパ
ク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され得る。
当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用
い、最適な融合構築物を生成してそれを選択し得る。
（宿主細胞）
本発明をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主
の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト
様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主
細胞グリコシル化遺伝子（例えば、ＯＣＨ１）の同定および破壊のための本明細書中に記
載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよ
び／または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが
、理解される。実施例９に記載されたように、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１遺伝子が、Ｋ．ｌａｃ
ｔｉｓから欠失されて、１，２−マンノシダーゼによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと完
全に変換されるＮ−グリカンに導く宿主細胞を操作した（図１２Ｃ）。
ＭＮＮ１遺伝子を、実施例９に記載されたようにＫ．ｌａｃｔｉｓからクローン化した
。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、配列
番号１６および配列番号１７に示される。遺伝子特異的プライマーを用い、Ｋ．ｌａｃｔ
ｉｓのゲノムからＭＮＮ１遺伝子を欠失するように、構築物を操作した（実施例９）。ｏ
ｃｈ１活性およびｍｎｎ１活性を除去した宿主細胞は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物
構造を有するＮ−グリカンを生じる（例えば、図１０参照）。そのような宿主細胞は、例
えば、本発明の方法およびライブラリーを用いてさらに操作して、哺乳動物様糖タンパク
質またはヒト様糖タンパク質を生成され得る。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子（配列
番号１６）の少なくとも４５ヌクレオチド残基、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド
残基、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド残基、最も好ましくは７５のヌクレオ
チド残基以上を含む核酸配列を有する単離された核酸分子、またはそれらのヌクレオチド
残基からなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそれらのホモログ、改変体お
よび誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子
にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードさ
れた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、断片、誘導体およびアナログを含
む）が提供される。加えて、さらに本明細書中で記載するような、本発明の核酸分子を含
むベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベク
ターで形質転換された宿主細胞が、提供される。
従って、本発明の別の局面は、ヒト細胞によって生成されるものと似ている改変された
Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する、非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、
酵母細胞および真菌細胞以外の種における本発明の方法の実行が、企図され、これは本発
明に含まれる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを用いて、任意の真核生物宿
主細胞系におけるグリコシル化経路を改変する構築物を選択し得ることが、企図される。
例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、植物、藻類および昆虫、ならびに他
の真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む）で用いて、宿主細胞分泌経路
に沿った望む位置において、タンパク質（グリコシル化酵素またはその触媒ドメインを含
む）を局在化し得る。好ましくは、グリコシル化酵素または触媒ドメインなどは、宿主細
胞分泌経路に沿って亜細胞位置に標的化され、その場所で、それらの酵素は、機能化膿で
あり、好ましくは、それらが最も効率的に機能するように設計または選択される。
本発明の好ましい宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋ
ｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏ
ｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌ
ｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃ
ａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ
ｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよび
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。
植物および昆虫細胞をまた、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用い
、発現されたタンパク質のグリコシル化を改変するように作成し得る。さらに、ヒト細胞
を含めた哺乳動物細胞におけるグリコシル化はまた、本発明のコンビナトリアルライブラ
リーおよび方法を用いて修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリー
および方法を用いて、特定の酵素活性を最適化するか、あるいは哺乳動物宿主細胞におい
て作成された種々のＮ−グリカンの相対的割合を修飾することが可能であり得る。
本発明のこの実施形態に従った方法を用いて作用され得るグリコシル化に対する修飾の
例は：（１）Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのマンノース残基をトリミングして、Ｍａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを生じるように真核生物宿主細胞を操作する工程；（２）Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）残基をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加するように真核生物宿主細胞を操作する工程；
（３）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴ
ＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランス
フェラーゼ（ＦＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）またはシアリルトラ
ンスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核生物宿主細胞を操作
する工程である。
この方法を反復することによって、徐々に複雑なグリコシル化経路を、下等真核生物微
生物のような標的宿主に操作し得る。１つの好ましい実施形態において、宿主微生物は、
グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで２回以上形質転換する。
所望の表現型の選択は、各ラウンドの形質転換の後に、あるいは、数回の形質転換が生じ
た後に行われ得る。複合グリコシル化経路はこのようにして迅速に操作され得る。
（一連のグリコシル化反応）
好ましい具体例において、そのような標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、
高等真核生物において、グリコシル化反応の一連の性質についての既存の情報を組み込む
ように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、
そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはＥＲの初期部分に標的化する工程を必要と
する。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
へのトリミングは、複合体Ｎ−グリカン形成における初期の工程である。タンパク質プロ
セシングはＥＲで開始され、次いで、初期、中間および後期ゴルジを通じて進行するので
、この反応はＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼ
Ｉ局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ＥＲおよび初期ゴルジ標的化シ
グナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
（組込み部位）
この遺伝子工学の試みの１つの最終的な目標は、産業醗酵プロセスにおいて首尾よく実
行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への複数遺伝
子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺
伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換さ
れて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならないで
あろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性（例えば、シアリルトラ
ンスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランス
フェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲお
よびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体に
ついてのｓｙｎおよびアンチポートトランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与
する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のよう
な活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）のいずれかの組合せを真菌タンパ
ク質発現宿主中に作製し得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような下等真核生物宿
主細胞においてグリコシル化を修飾するための好ましい方法の例を表６に示す。
（表６．下等真核生物微生物においてグリコシル化を修飾するためのいくつかの好まし
い具実施形態）
下等真核生物のような宿主細胞への複合体Ｎ−グリカンの形成を操作するためのいずれ
かの戦略は特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性の除去ならびに付加の両方を含むの
で、包括的なスキームは、両方の要件を協調させる試みであろう。望ましくない酵素をコ
ードする遺伝子は、望ましい遺伝子についての潜在的組込み部位として働く。例えば、１
，６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの既知の下等真核生物におけるグリコシ
ル化の特徴である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣ
Ｈ１）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化され、この遺伝子における変異は低下
したマンノシル化と共に生存可能な表現型を生じる。従って、α−１，６マンノシルトラ
ンスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコー
ドする遺伝子の組込み用のプライミング標的である。同様に、その遺伝子座における遺伝
子破壊事象に基づいて、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改良し
、（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を改良し、（３）外来性タンパク質のタンパク
質分解を低減させ、そして（４）その精製または醗酵プロセスを容易にするプロセスの他
の特徴を改良することが期待されるある範囲の他の染色体組込み部位を選択し得る。
（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられ
る糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、
例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−６
−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャ
イエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数
種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様
に、グリカン側鎖への１以上のシアル酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タン
パク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞（例えば、下等真核生物または哺乳動物
）は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増加させるように
遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切
な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組
成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒ
ト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る（Ｗｅｉｋｅｒｔら、（１９９９
）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１１１６−１１２１；Ｗｅｒｎｅ
ｒら、（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（８）：８７０
−８８０；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５４６−５４９；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。モノクローナル
抗体への特異的グリカン修飾（例えば、二分されたＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性
細胞傷害性を改良することが示されており（Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０）、これは、抗体または他の治療タンパク質
の生成に望ましくあり得る。
治療タンパク質は、代表的には、注射、経口、または肺もしくは他の手段によって投与
される。本発明に従って生成され得る適した糖タンパク質の例としては、エリスロポエチ
ン、サイトカイニン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェ
ロンγ、インターフェロンω）、および顆粒球−ＣＦＳ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ
因子、第ＩＸ因子）、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｇフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン類、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素ト
リプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子
、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻
害因子１、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、α−１抗トリプ
シン、ＤＮａｓｅＩＩ、αフェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、
別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウ
ムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激
ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様プロテ
イン１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦ受
容体Ｆｃ融合物）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ
４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。
（その後のグリコシルトランスフェラーゼ活性：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ）
本発明のさらなる局面において、ゴルジαマンノシダーゼ酵素によって産生された新し
く形成されたグリカンは、その後のグリコシル化反応のための基質である。１つの実施形
態において、ＧｎＴ ＩＩ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび、必要に応じてＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃトランスポーターは、ＧｌｃＮＡｃを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−３
７で生産されたオリゴ糖の新しく形成されたＭａｎα１，６分枝をキャップして、Ｇｌｃ
ＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を形成する（実施例１９）。別の実施形態において、他
のＧｎＴ（例えば、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ）は、一過性ＧｌｃＮＡ
ｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２基質と反応する。この基質は、今度は、ガラクトシルトラン
スフェラーゼのための基質となり（実施例２５）、そしてさらなるプロセシングがシアリ
ルトランスフェラーゼを用いて生じる。
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明する。これらの実施例は限定するも
のとして解釈されるべきではなく：実施例は説明の目的のみのために含まれる。
（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１遺伝子のクローニングおよび破壊）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号）
に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
（配列番号１８）および
（配列番号１９）を用いて、推定α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐ ＯＲＦを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓゲノムＤＮＡ（Ｘ−３３株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から増
幅した。その後、ＯＣＨ１遺伝子における内部オリゴヌクレオチド
（配列番号２０）、およびライブラリー担持プラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格における
（配列番号２１）および
（配列番号２２）オリゴヌクレオチドを用いて、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの２６８５ｂｐ
上流および１１７５ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリー（Ｂｏ
ｅｈｍ，Ｔ．ら、Ｙｅａｓｔ １９９９ ５月；１５（７）：５６３−７２）から増幅し
た。得られた５０７５ｂｐフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。
ＨＩＳ４抵抗性遺伝子でＯＣＨ１リーディングフレームを置換した遺伝子ノックアウト
構築物を構築した後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換し、コロニーを３７℃における温
度感受性についてスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温
度感受性であり、上昇した温度における成長が遅い。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
のＯＣＨ１変異体に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを補完
することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的ホモログを同定する
ことができる。約２０の温度感受性株を、さらに、コロニーＰＣＲスクリーニングに供し
て、欠失したｏｃｈ１遺伝子でコロニーを同定した。数個のｏｃｈ１欠失を得た。
ＰｉｃｈｉａＨＩＳ４遺伝子を保有するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂ上流配列
および１．５ｋｂ下流配列を有する直線化ｐＢＫ９．１を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＢＫ
１［ＡＯＸ１遺伝子座においてヒトＩＦＮ−β遺伝子を保有するＧＳ１１５（ｈｉｓ４
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］に形質転換して、野
生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトした。形質転換体の初期スクリーンニングは、ヒスチ
ジンドロップ−アウト培地を用いて行い、その後、レプリカプレーティングを行って、温
度感受性コロニーを選択した。２００のヒスチジン−陽性コロニーのうち２０が、３７℃
における温度感受性表現型を示した。ＰｉｃｈｉａゲノムへのｐＢＫ９．１のランダムな
組込みを除去するために、２０の温度−感受性単離体を、組込み部位の上流配列、および
ＨＩＳ４ ＯＲＦに特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニ
ーのうち２つはｏｃｈ１障害性であり、サザンブロットおよびウェスタンブロットを用い
てさらに分析し、これは、ｏｃｈ１ノック−アウト構築物による機能性ｏｃｈ１破壊を示
す。２つの別々の制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いてゲノムＤＮＡを消化して、
ｏｃｈ１のノックアウトを確認し、オープンリーディングフレームにおける組込みを確認
した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａにおいてＧＳ１１５野生型で生じた区別さ
れるバンドを欠如するｏｃｈ１変異体を示した。
（実施例２）
（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−含有ＩＦＮ−β前駆体を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓのα―１，２−マンノシダーゼを用いた操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングして、複合体Ｎ
−グリカン形成のための必須の中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るのに必要であ
る。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび
複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特
異的異性体は、ＧｎＴＩについての基質であってもなくてもよいからである。Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体は、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌されるヒトインター
フェロンβを発現するように操作される。ＤＮＡライブラリーは、ヒトマンノシダーゼＩ
Ｂ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびＥＲ局在化ペプ
チドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築され
る。次いで、ＤＮＡライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体
が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発
現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インター
フェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、９０％を超え
る分泌されたタンパク質はグリコシル化インターフェロンβである。
上澄みを精製して、Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって塩および低分子量夾
雑物を除去する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現される所
望の形質転換体は、親株のインターフェロンβと比較して低下した分子質量を有する、構
造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを生成する。精製さ
れたインターフェロンβはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、インターフェロ
ンβの所望の形態を発現するコロニーを同定する。
（実施例３）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩを発現す
るｏｃｈ１変異体株の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＨＣ１遺伝子の１２１５ｂｐのオープンリーディングフレー
ムならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流をＰＣＲによって増幅し（ＷＯ ０
２／００８７９も参照のこと）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ
１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９、ＳｆｉＩ制限部位が隣
接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含むプラスミドをＳｆｉＩで消化し、こ
れを用いて、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃ
ｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換した。
室温における１０日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続
き、１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。３７℃では増殖できないが、室温
では増殖したＵＲＡ＋クローンをコロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体
対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたＰＣＲパターンを呈した１つの
クローンをＹＪＮ１５３と命名した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメ
インをモデルタンパク質として用いた。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲでマークしたプラスミ
ドを株ＹＪＮ１５３に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と命名した
。
ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）からの平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＤＥ１遺伝子（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、
（２００１）Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９）を含むＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消
化した平滑末端ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸにクローン化することによって、ゴルジＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミントランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子を含むプラスミドｐＰＢ１０３を構築した。このプラスミ
ドをＥｃｏＮＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＢＫ６４−１に形質転換
し、１つの株はＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むと確認され、これをＰＢＰ１と命名
した。
ヒト、マウス、ハエ、虫および酵母源からの数個のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子
の触媒ドメインと融合させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓから
の数個のＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのイン−フレーム融合物を含
むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ ０２／００８７９を
参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。このライブラリーをＰ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４組込みベクターにおいて作製し、ＳａｌＩで線状化し、エレク
トロポレーションによって株ＰＢＰ１に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出
されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。１つの活性な選択された構
築物は、１８７ヌクレオチドを失った、マウスα―１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子（
図３）のＮ−末端欠失と融合させた酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８−１２９６ヌクレオチ
ド（Ｃ−末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢ
Ｐ２と命名した。
ヒト、虫、カエルおよびハエ源からのＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリー
ダーライブラリーのイン−フレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製し
た（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ４組
込みベクターにおいて作製し、そして、ＡａｔＩＩで直線化し、エレクトロポレーション
によって株ＰＢＰ２に形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによって
スクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４ｂｐが失われた、
ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子の最初
の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ
３と命名した。
（実施例４）
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる優勢なＮ−グリカン構造としてのＭａ
ｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイ
ン（Ｋ３）のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
のｏｃｈ１変異体（実施例１および３を参照のこと）を作成した。ヒトプラスミノーゲン
のクリングル３ドメイン（Ｋ３）をモデルタンパク質として用いた。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、Ｋ３をコー
ドするＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化し、Ｃ−末端６−Ｈｉｓ
タグが得られた。Ｋ３のＮ−結合グリコシル化効率を改良する（Ｈａｙｅｓら、１９７５
Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１，６５１−６５５）ために、
部位特異的変異誘発を用いてＰｒｏ４６をＳｅｒ４６で置き換えた。得られたプラスミド
をｐＢＫ６４と命名した。ＰＣＲ構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認し
た。
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、表６に従って、Ｃｏｐ ＩＩ小胞、ＥＲ、お
よび初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、マウスα−
１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）およびＩＡ（Ｇ
ｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６７５４６１９）触媒ドメインとのイン−フレーム連結によって構
築した。組み合わされたＤＮＡライブラリーを用いて、個々の融合構築物を生成し、次い
で、これをＫ３発現宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体各々がＫ３なら
びにライブラリーからの局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に
混合された集団が得られた。個々の形質転体を培養し、Ｋ３の産生を、メタノール含有培
地への移動によって誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後に、９０％を超える
倍地中のタンパク質はＫ３であった。Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製して、Ｎ
ｉ―アフィニティークロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去した。ア
フィニティー精製に続き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、後記する
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に直接的に供するか、あるいはＮ−グリカンを後記するようなＰ
ＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｎ−グリカンの放出）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供し
た（Ｍｉｅｌｅら、１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５
，１５１−１５７）。
このアプローチに続き、多様な組の形質転換体が得られた；いくつかはｏｃｈ１ノック
アウト株と比較してＮ−グリカンの修飾を示さず；他のものは高度なマンノーストリミン
グを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダー
ゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを有する
Ｋ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比較して、糖タンパク質に対して低
下した分子質量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって容易に検出され
た（図５）。表７は、相対的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生レベルを示す。
（表７ Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す局在化配列／触媒ドメイン
の代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
（表８ Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの
別のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
標的化ペプチドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（長、中程度および短）（前出を参照の
こと、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ
ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）におけるＭＮＳ
Ｉ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３２９０６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（９８８〜１
１４０ヌクレオチド：短）および（９８８〜１２９６：中程度）におけるＳＥＣ１２（Ｓ
ｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５）から選択した。標的化ペプチド配列の大部分はＮ末端
欠失であったが、ＳＥＣ１２のようないくつかの標的化ペプチド配列はＣ末端欠失であっ
た。この実験で用いた触媒ドメインは、１８７アミノ酸Ｎ−末端欠失を含むマウスマンノ
シダーゼ１Ａ；および５８、９９および１７０アミノ酸欠失を含むマウスマンノシダーゼ
１Ｂから選択した。本明細書中で使用される場合、（＋）の数は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ
２産生の相対的レベルを示す。表示（−）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の明白な産生が無
いことを示す。表示（＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の１０％未満の産生を示す。表示
（＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約１０〜２０％の産生を示す。表示（＋＋＋）は
、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約２０〜４０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ
５ＧｌｃＮＡｃ２の約５０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡ
ｃ２の５０％を超える産生を示す。
表９は、分泌されたＫ３レポーター糖タンパク質で検出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
の相対的な量を示す。１９のα−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ、
およびシス−ゴルジリーダーに融合させることによって作製されたコンビナトリアル遺伝
子ライブラリーからの単一構築物で各々を形質転換することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ（Δｏｃｈ１）の６０８の異なる株を作製した。
（表９）
＊数個の融合構築物は試験しなかった。なぜなら、対応するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓへの形質転換の前にＥ．ｃｏｌｉ中で増殖し得なかったからである。
＋最高程度のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２トリミング（３０／５１）を有するクローンを、培
地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分（２８／３０）は、上
清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した（例えば図４Ｂ）。２つの構築物のみが倍
地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２レベルを示した（
例えば、図４Ｃ）。
表７は、とりわけ、形質転換された宿主細胞がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示すＫ３糖タ
ンパク質を作製することを可能にする２つの構築物ｐＦＢ８およびｐＧＣ５を示す。表８
は、８０アミノ酸Ｎ−末端欠失を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖａｎ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８
０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＣＡＡ９８１１４）にインフレーム連結したより好ましい
構築物、ｐＢＣ１８−５、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド配
列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２由来）を示す。この融合構築物はまた、図５Ｅに示す
ように、優勢なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。このマンノシダーゼ融合構築物
は、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成することが示された（＋＋＋＋＋）。
（コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製：）
標的化ペプチドに融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリア
ルＤＮＡライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのＮ−末端欠失を含むマン
ノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−１，２
−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の源：Ｈｏｍ
ｏ ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍから得られたｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかからＰＣＲ増幅した。各場合において、ＰＣＲ反応
を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーの存在下でＤＮＡをインキュベートした。例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α
−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを増幅するために、５’−プライマー
（配列番号２３）および３’−プライマー
（配列番号２４）をＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）の存在下でインキュベートし、循環パラメーター：９４℃で１分間（１サイ
クル）；９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間（３０サイクル）を用い
るＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅に続いて、ＯＲＦを
コードするＤＮＡ配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）への連結の前に１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に７２℃にて５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
によって推奨されるように、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転
換した。クローン化されたＰＣＲ産物は、マンノシダーゼＯＲＦに特異的なプライマーを
用いるＡＢＩ配列決定によって確認した。
各マンノシダーゼの所望のＮ−末端短縮形を作製するために、各マンノシダーゼの完全
なＯＲＦを、ＰＣＲ反応の後のラウンドでテンプレートとして用い、ここで、５’プライ
マーのアニーリング位置は所望の短縮形の５’末端に特異的であり、３’プライマーはＯ
ＲＦの元来の３’末端に特異的なままであった。酵母発現ベクターへの短縮形マンノシダ
ーゼフラグメントのサブクローニングを容易にするために、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）Ａｓ
ｃＩおよびＰａｃＩ制限部位をそれぞれ、５’および３’末端において、各短縮産物に作
成した。各マンノシダーゼＯＲＦについて作製されたＮ−末端短縮形の数および位置は、
触媒ドメイン）（ＣＤ）に関して膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭお
よびＣＤの間に位置したステム領域が１５０ｂｐ未満である場合、そのタンパク質につい
ての１つの短縮形のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０ｂｐよりも長い場合
、ステム領域の長さに応じて１以上の短縮形が作製された。
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）
についての短縮形をいかにして作製したかの例を本明細書に記載し、同様なアプローチを
他のマンノシダーゼについて用いた。図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マン
ノシダーゼＩＡのＯＲＦを示し、予測された膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを太字で
強調した。この構造に基づいて、３つの５’プライマーを設計して（図３において下線を
施したアニーリング位置）、Δ６５−、Δ１０５−およびΔ１８７−Ｎ−末端欠失を作製
した。Δ６５Ｎ−末端欠失を例として用いた、使用された５’プライマーは、３’プライ
マー
（配列番号２６）（ＰａｃＩ制限部位は太字で強調する）と組み合わせた
（配列番号２５）（ＡｓｃＩ制限部位は太字で強調する）であった。これらのプライマー
の両方を用いて、全長Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ１Ａ ＯＲＦを増幅するため
の上記にて概説した条件下で１５６１ｂｐ断片を増幅した。さらに、全長ＯＲＦで得られ
た産物のように、短縮産物もまたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、
ＴＯＰ１０に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。短縮マンノシダーゼ断片の配列を増幅し
、確認した後に、得られたプラスミド、ｐＣＲ２．１−Δ６５ｍＭａｎｎＩＡを、３７℃
にて１６時間、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）中でＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。平行して、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）を同
一酵素で消化し、上記のようにインキュベートした。消化後、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）骨
格および短縮触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように
、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。コロニーＰＣＲを用いて、
ｐＪＮ３４７−マウスマンノシダーゼＩＡΔ６５構築物の生成を確認した。
酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）において短縮α−１，２−マンノシダーゼ触
媒ドメインのライブラリーを生成し、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーの生成
における残りの工程は、標的化ペプチド配列（図２）をイン−フレームクローン化するこ
とであった。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）およびｐＣＲ２．１ＴＯＰ
Ｏ−標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）両方を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの存在下
で、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中で３７℃において一晩インキ
ュベートした。消化に続き、ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ骨格および標的化ペプチド領
域の双方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。引き続いて、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マン
ノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定して、生成された融合がイン−フレームであることを
確認した。最終標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズ
は、上記アプローチによって生成された１３００を超える構築物を含む。図２は、コンビ
ナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。
（複数栄養要求性マーカーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１ノックアウト株の
操作）
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の５’および３’領
域についてのスペースホールダー（ｓｐａｃｅ ｈｏｌｄｅｒ）としての、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ １９９９年５月；１５（７）：５６３−７２）の
ＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含し
た。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｕｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６
，５４１−５４５．１９８７）、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を
有する発現カセットを含んだ。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂ
のフラグメントは、プライマー
（配列番号２７）および
（配列番号２８）、およびテンプレートとしてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用
いるＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミド
をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマー
（配列番号２９）および
（配列番号３０）を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂのフラグメントを
開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切
断し、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−５４５．１９
８７）の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを可能な双方の向きに挿入し
、その結果、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）およびｐＪＮ２８４（図４Ｂ）が得られ
た。
発現カセットをクローニング部位としてのＮｏｔＩおよびＰａｃＩを用いて作製した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマー
（配列番号３１）および
（配列番号３２）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ部位にクローン化した（図４Ｂ）。得られ
たプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマー
（配列番号３３）および
（配列番号３４）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）を用いて増幅したＣＹＣ１転写ターミネーター領域（「ＴＴ」）を開いた部位
にクローン化し、ｐＪＮ２６１を作製した（図４Ｂ）。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドをｐＪＮ２
６３をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化することによって作製し、プライマー
（配列番号３５）および
（配列番号３６）およびテンプレートとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いて
増幅したＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを開いた部位にクローン
化した（図４Ｃ）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断し、プライマ
ー
（配列番号３７）および
（配列番号３８）を用いて生成したＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂのＤＮＡフラグメン
トを挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した（図４Ｃ）。プラスミドを同時に用いて新しい遺
伝子を導入する可能性を可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図
４Ｂ）をｐＪＮ２９８（図４Ｃ）の固有のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ２９
９を作製した（図４Ｅ）。
Ｌｕら、（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：
１４１−１４６に記載されている同様な戦略を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｕｒａ３−
ブラスターカセットを構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３の２．０ｋｂのＰｓｔ
Ｉ、ＳｐｅＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ，ＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＪＮ３０６を作製した（
図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂのＳａｃＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントをＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ３０
８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８（図４Ｄ）の消化、およびＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼでの処理に続いて、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｌａｃＺ由
来のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを挿入し、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。
ｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩでの消化によって放出し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９の骨格にクローン化した。得られたプラス
ミドをｐＪＮ３２９と命名した（図４Ｅ）。
ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩで切断することによって、ＨＩＳ４でマーク
した発現プラスミドを作製した（図４Ｆ）。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断したプラ
イマー
（配列番号３９）および
（配列番号４０）を用いて増幅し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端
化したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂのフラグメントを
、次いで、開いた部位に連結した。このプラスミドをｐＪＮ３３７と命名した（図４Ｆ）
。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築する
ために、ｐＪＮ３３７をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングし
た２つのオリゴヌクレオチド
（配列番号４１）および
（配列番号４２）を開いた部位に連結し、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。
複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇ
のｐＪＮ３２９をＳｆｉＩで消化し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８
（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポ
レーションによって形質転換した。形質転換に続いて、ＵＲＡドロップアウトプレートを
室温で１０日間インキュベートした。１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。
次いで、全ての１０００のクローンを２組のＵＲＡドロップアウトプレート上で画線培養
した。１つの組を室温にてインキュベートし、他方、第二の組を３７℃でインキュベート
した。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供して
、正しいＯＣＨ１ノックアウトについて試験した。予測されたＰＣＲシグナル（約４．５
ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。
（実施例５）
（コンビナトーリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの特徴付け）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロ
ニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性形質転換体（実施例４）を、１％酵母抽出物
、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベ
ース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての５０
ｍｌのＢＭＧＹ緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてＯＤ６００ｎｍ
２−６まで増殖し、その時点で、５ｍｌのＢＭＭＹ中での室温での２４時間のレポーター
タンパク質の誘導に先立ち、１０ｍｌのＢＭＭＹ（増殖培地としての１％酵母抽出物、２
％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース
、４×１０−５ビオチン、および１．５％メタノールよりなる 緩衝化メタノール−複合
培地）で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例３に記載したよう
に分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表６中の標的化ペプチドを用い、ＥＲまた
はゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ
２を圧倒的に含有するグリカンに対してＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を圧倒的に含有するグリ
カンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカ
ン構造を、図５Ｃおよび６ＣにおけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｏｃｈ１ノックアウトのそ
れと、図５Ｄ、５Ｅ、６Ｄ〜６Ｆに示したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ構築物で
形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図５および６は、Ｐ．ｐａｓ
ｔｉｒｉｓにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトーリアルＤＮＡライブラ
リーから創製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｓ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９（図５Ｄおよび６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされた全てのグリカンのほぼ３０％を有するタンパク質を生
じ、他方、ｐＦ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダ
ーゼＩＡΔ１８７）（図６Ｆ）の発現はほぼ５０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じ、ｐ
ＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマン
ノシダーゼＩＢΔ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じた。
（実施例６）
（アルファ−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング）
実施例４の新規な作製された株が、事実、インビボにて所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２
構造を生じたことを確認するために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストした
（図７〜９参照）。後記した各構築物／宿主株については、ＨＰＬＣを１．０ｍｌ／分の
流速にて、Ａｌｔｅｃｈの４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ，Ｕ
ＳＡ） Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ２樹脂（５μｍ）を用いて３０℃にて４０分間行った。
図７および８において、標準的なＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の分解は、Ｍａｎ８Ｇｌ
ｃＮＡｃ２二関連するピークを生じるように起こることが示された。図７において、Ｍａ
ｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］
は１８．５９分で溶出した。図８において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は２１．３７分で溶
出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は１５．６７分で溶出した。図９において、標準Ｍａｎ８
ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。
プラスミドｐＦＤ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノ
シダーゼＩＡ Δ１８７）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、３０℃にてＢＭＧＹ中で
約１０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心によって細胞を収穫し、ＢＭＭＹに移して、Ａ
ＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生
産を誘導した。誘導から２４時間後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄
を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために除去し、残りを選択された
可溶性Ｋ３の回収で用いた。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ Ｎ
ａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出グラジエ
ントを用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％
純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析は図６Ｆに示す。上澄のよ
り早く除去されたアリコートを、さらに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテ
ストした。２−アミノベンズアミド−標識Ｎ−結合−型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−
２−ＡＢ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（
図７Ａ）、上記アリコートからの上澄（図７Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ
ａｌ．，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅ
ｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭ
Ｙ（図７Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリ
カＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
プラスミドｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシ
ダーゼＩＢ Δ９９）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を同様に増殖させ、アッセイした
。細胞を室温にてＢＭＧＹ中で約１０のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を遠心によって
収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３の生産を誘導した。誘
導から２４時間後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のア
リコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回
収で用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、
ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出グラジエントを用
いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ
３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｄに示す。上澄のより早く除
去されたアリコートを、さらに、図８Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の
存在につきテストした。Ｍａｎ９−２−ＡＢ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業
的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記アリコートからの上澄（図８Ｂ）、およ
び（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−
マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベ
ーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミン
グの程度を測定した。
Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として用い、インキュベーションの２４時間後に、マンノシ
ダーゼ活性はｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノ
シダーゼＩＡ Δ１８７）株消化物（図７Ｂ）およびｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）株消化物（図８Ｂ）の上澄
に実質的に存在しないことは明らかであり、他方、陽性コントロール（Ｃｏｎｔｒｅｒａ
ｓから得られたＰ．ｒｅｅｓｅｉからの精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）は、図
７Ｃおよび８Ｃに示すように、同一条件下でＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２への完全な変換に導く。これは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＧＣ５株；およびｐ
ＦＢ８株におけるインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータであり、これ
は、今日までに報告されているものとは区別可能に異なる（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ
ａｌ．ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２）。
図９は、さらに、マンノシダーゼ酵素の局在化および活性を立証する。ｐＢＣ１８−５
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｍ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩ
Ｂ Δ８０）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓをＢＭＧＹ中で室温にて約１０のＯＤ６００ま
で増殖させた。細胞を遠心によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの
制御下でのＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導の後、細胞を遠心によって除去して、
実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出
し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収のために用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロ
マトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．
０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出グラジエントを用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３を得た。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン
分析を図５Ｅに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、図９Ｂに示すよ
うに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ８−２−ＡＢ（Ｇ
ｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）の商業的に入手可能な標準をＢＭＭＹ（図９Ａ）、上記
アリコートｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）からの上澄（図９Ｂ）、および異なる融合構築物
ｐＤＤ２８−３（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）からの培地を含
有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料
をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を決定した
。図９Ｂは、陰性結果を呈する融合構築物ｐＤＤ２８−３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）と比較した細胞
内マンノシダーゼ活性を示す（図９Ｃ）。
（実施例７）
（作製されたα−１，２−マンノシダーゼのｐＨ最適アッセイ）
プラスミドｐＢＢ２７−２（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）を
含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を室温にてＢＭＧＹ中で約１７のＯＤ６００まで増殖させ
た。これらの細胞の約８０μＬを６００μＬのＢＭＧＹ中に接種し、一晩増殖させた。引
き続いて、細胞を遠心によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御
下のＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。インキュベー
ションの２４時間の後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄（ｐＨ６．４
３）を得た。上澄をマンノシダーゼｐＨ最適アッセイのために取り出した。蛍光−標識Ｍ
ａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を、種々のｐＨに調整された２０μＬの上澄に加え
（図１１）、室温にて８時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｅｃｏｎｏ
ｓｉｌ ＮＨ２ ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（
Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｎｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって試料を分析した。流
速は４０分間で１．０ｍｌ／分であり、カラムは３０℃に維持した。３分間のイソクラフ
ィック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒グラジエント（６８％Ａ：３２％Ｂ〜
４０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカン（１８）を溶出させた。
溶媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）。
カラムをランの間の２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化した。
（実施例８）
（構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓの作製）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複合体およびハイブリッドＮ−グリカンの
成熟化に必要である（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は単
にマンノシダーゼＩＩによってトリミングでき、これは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
ゼＩによるＮ−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−１，３マンノ
ース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である（Ｓｃｈａｃ
ｈｔｅｒ， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １（５）：４５３−４６１）。従っ
て、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ遺伝子の適当に
標的化された触媒ドメイン；およびＫＴＲホモログであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｄ
２、Ｄ９およびＪ３からのホモログに基づき、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ推定α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼからのＧＬＳ、ＭＮＳ、Ｓ
ＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、
ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１、ＭＮＮ１、およびＭＮＮ６からの
局在化配列をコードするＤＮＡ断片を含むコンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを調製
した。図１０は、限定されるものではないが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔ
ｉｓ ＧｎＴＩからのＳＥＣおよびＯＣＨ１のような標的化ペプチド配列を含む（表６お
よび表１０参照）。
標的化ペプチド配列はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（長、中程度および短）におけるＯＣＨ１
（実施例４参照）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ短および中程度におけるＭＮＮ９（Ｓ
ｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３９１０７）から選択した。触媒ドメインは、各々、３８および８
６アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つヒトＧｎＴＩ、３５および６３アミノ酸欠失を持つＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩならびに８８アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩおよび３３および１０３アミノ酸Ｎ−末端欠失を
持つＸ．ｌｅａｖｉｓ ＧｎＴＩから選択された。
最初の１５４ｂｐを欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍ
ＧＡＴＩ、受託番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を、オリゴヌクレオチ
ド
および
および鋳型としてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ番号７９００３）を用いるＰＣＲに
よって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、正しい
配列を確認した。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化に続き、切形ＧｎＴＩをプラスミドｐ
ＪＮ３４６に挿入して、ｐＮＡを創製した。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の
消化の後、１２０ｂｐインサートをｐＮＡに連結して、ＭＮＮ９膜貫通ドメインのＧｎＴ
Ｉとのイン−フレーム融合を作製し、ｐＮＡ１５を得た。
宿主生物はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株であり、これは超マンノシル化を欠損し（例えば
、ＯＣＨ１変異体）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提
供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み）、ゴルジおよび
／またはＥＲにおける構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを供する（例えば、上
記からのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（
ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７））。まず、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミド
（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）
のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランス
ポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝
子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３でＰ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ ｐＦＢ８を形質転換した。次いで、外因性または内因性ＧｎＴＩ／局在化遺伝
子の組合せをコードする上記コンビナトーリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロ
ニーを選択し、コロニーＰＣＲによってＧｎＴＩ構築物の存在につき分析した。我々の形
質転換および組込み効率は、一般には、８０％を超え、ＰＣＲスクリーニングは、一旦頑
強な形質転換パラメーターが確立されれば省略することができる。
要約すれば、本発明の方法は、図１０Ｂに示すように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮ
Ａｃ２を高い収率で生産するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株を生じる。Ｎ−グリカンの少なく
とも６０％はＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。今日、いずれかの酵母におけ
る分泌された可溶性糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を記
載する報告は存在しない。本明細書中に提示した結果は、ＧｎＴＩ活性と共にＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、１４５７（ｍ／ｚ）におけるピークによって確認
される支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じることを示す（図１０Ｂ
）。
（株ＰＢＰ−３の構築）
Ｋ３を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（Δｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−
）を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を、エレクトロポレー
ションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第二に、ＢａｍＨＩお
よびＢｇｌＩＩ酵素で消化されたｐＢＬＡＤＸ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）にクローン化された（Ｕ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有する
ｐＰＢ１０３をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第三に、ＮｏｔＩ−Ｐａ
ｃＩ断片としてｐＪＮ３３６にクローン化された遺伝子をコードするＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ株に形質転換した。
（実施例９）
（構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＫ．ｌａｃｔｉｓ
細胞の作製）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の同定および破壊
出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭ
ａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う１
，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ
ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６８（３５）：２６３３８
−４５）。このマンノース移動は、一般には、Ｎ−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノ
シル化における鍵となる最初の工程として認識される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄ
ｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３５）：２６３３８−
２６３４５； Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７
）：２５１１−１９；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｆｆｉｃ １（１）
：５６−６８．（Ｊａｎ ２０００））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこの遺伝子
の欠失の結果、かなり短いＮ−グリカン構造がもたらされ、これは、上昇した温度におい
てこの典型的なポリマンノシル化または増殖欠陥を含まない（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ
ａｌ．（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−１９）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯｃｈ１ｐ配列を、関連するが区別されるマンノシル
トランスフェラーゼであるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号
ＡＡＬ４９９８７）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ｎｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．
， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５（３）：６３７−４５（Ｍａｒ １９９７）およびＫ．ｌ
ａｃｔｉｓ （ＰＥＮＤＥＮＴ ＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質と共にＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓからの公知のホモログと整列させた。Ｏｃｈ１ｐホモログの間では共通
するが、Ｈｏｃ１ｐホモログからは区別される高相同性の領域を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉ
ｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１２，１８５−１９２（１９８７））からのゲノムＤＮＡに対して向けられた縮重プラ
イマーの対を設計した。プライマーＲＣＤ３３
およびＲＣＤ３４
でのＰＣＲ増幅の結果、３０２ｂｐ産物が得られ、これをクローン化し、配列決定し、予
測された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対して高度な相同性を有することが示された（Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｏｃｈ１ｐに対して＞５５％）。
３０２ｂｐ ＰＣＲ産物を用いて、高ストリンジェンシーでのＫ．ｌａｃｔｉｓ株（Ｍ
Ｇ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザーンブロットをプローブした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ，１９８９
）。ハイブリダイゼーションは単一遺伝子と合致するパターンで観察され、これは、この
３０２ｂｐセグメントがＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムの一部に対応し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ （
ＫｌＯＣＨ１）がこの遺伝子の単一コピーを含むことを示す。全ＫｌＯＣＨ１遺伝子をク
ローン化するために、サザーンブロットを用いて、ゲノム遺伝子座をマッピングした。従
って、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２ｋｂの範囲の断片をｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブ
ゲノムライブラリーを作ることによって、５．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片をクロ
ーン化した。このサブゲノムライブラリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローン
をＲＣＤ３３／３４を用いるコロニーＰＣＲによってテストした。予測されたＫｌＯＣＨ
１遺伝子を含む５．２ｋｂクローンを配列決定し、予測されたタンパク質をコードする１
３６２ｂｐのオープンリーディングフレームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺
伝子と４６．５％同一である。５．２ｋｂ配列を用いて、ＰＣＲ重複方法を用い、ｏｃｈ
１：：ＫＡＮＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを作製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１
５）。この欠失対立遺伝子を２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、Ｇ４１８抵抗性コ
ロニーを選択した。これらのコロニーを双方のＰＣＲによって、および温度感受性につき
スクリーニングして、ＯＣＨ１ ＯＲＦが欠失した株を得た。実験の結果は、変異体ＰＣ
Ｒパターンを明らかにする株を示し、これは、種々の温度における増殖の分析、およびＰ
ＮＧａｓｅ消化の後における分泌されたおよび細胞壁タンパク質のＮ−グリカン炭水化物
分析によって特徴付けした。ｏｃｈ１変異は、株を３０℃では増殖させるが、３５℃では
増殖させない温度感受性を付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および
それより高次のＮ−グリカンを生産する野生型Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
分析を示す。
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニングおよび破壊）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１はゴルジα−１，３−マンノシルトランスフェラ
ーゼについての構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は７６２−アミノ酸タイプＩＩ膜タン
パク質である（Ｙｉｐ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ．９１（７）：２７２３−７．（１９９４））。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ−結
合およびＯ−結合オリゴ糖双方はα−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２４８（１３）：４６６０−６．（Ｊｕｌ
１０，１９７３））。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭｎｎｌｐ配列を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ翻訳ゲノ
ム配列（ＰＥＤＡＮＴ）をサーチした。Ｍｎｎｌｐに対して有意な類似性の推定タンパク
質断片をコードする１つの４０５ｂｐのＤＮＡ配列を同定した。この配列の内部セグメン
トを、引き続いて、プライマーＫＭＮ１
およびＫＭＮ２
でＰＣＲ増幅し、これを用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡ
のサザーンブロットをプローブした。サザーンハイブリダイゼーションデータに基づき、
４．２Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、本明細書中に記載したように、サイズ−選択
ライブラリーを作ることによってクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子を
含む単一クローンを、プライマーＫＭＮ１（配列番号４７）およびＫＭＮ２（配列番号４
８）を用いる全コロニーＰＣＲによって同定し、配列決定した。このクローン内で、Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子に３４％同一である予測されたタンパク質をコー
ドする２２４１ｂｐ ＯＲＦが同定された。ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２６０７−１５）を用い、
ｍｎｎ１：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築のためにプライマーを設計した。
エレクトロポレーションによって、この破壊対立遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓの株に形質
転換し、ヌーセオトリシン抵抗性形質転換体を選択し、破壊対立遺伝子の相同挿入のため
にＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株は、公知のレポーター遺伝子
のＮ−グリカン炭水化物分析に付すことができる。
図１２Ｂは、本明細書中に記載されたように、ＰＮＧａｓｅ消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに
続いて観察されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失株からのＮ−グリカンを示
す。［ｄ］として示される１９０８（ｍ／ｚ）における支配的ピークはＭａｎ９ＧｌｃＮ
Ａｃ２の質量と合致する。
グリコシル化を修飾するための方法で用いることができるさらなる方法および試薬は米
国特許第５，９５５，４２２号、米国特許第４，７７５，６２２号、米国特許第６，０１
７，７４３号、米国特許第４，９２５，７９６号、米国特許第５，７６６，９１０号、米
国特許第５，８３４，２５１号、米国特許第５，９１０，５７０号、米国特許第５，８４
９，９０４号、米国特許第５，９５５，３４７号、米国特許第５，９６２，２９４号、米
国特許第５，１３５，８５４号、米国特許第４，９３５，３４９号、米国特許第５，７０
７，８２８号および米国特許第５，０４７，３３５号のような文献に記載されている。適
当な酵母発現系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤのような源から得ることができる。ベクターは種々の源
から商業的に入手可能である。
（実施例１０）
（株、培養条件および試薬）
以下の実施例では、以下の株、培養条件および試薬を用いた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ 株ＴＯＰ１０またはＤＨ５αを組換えＤＮＡ作業で用いた。
タンパク質発現は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセ
ロールよりなる増殖培地としての緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）での９６−
ウェルプレートフォーマットにて室温で行った。誘導培地は、ＢＭＧＹ中のグリセロール
の代わりに１．５％メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）であっ
た。
制限および修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）からのものであった。
オリゴヌクレオチドはＤａｒｔｍｏｕｔｈ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉ
ｔｙ （Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＨ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ （Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から得た。
（実施例１１）
（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生産するための発現ベクターのクローニングおよび創製）
制限および修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ
）からのものであった。シャトルベクターｐＶＭ２は、プライマーＶＪＭ１０４およびＶ
ＪＭ１０６（各々、
および
導入された制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩは下線を施す）を用いる逆ＰＣＲ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．（１９８９） Ｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ．）によってＰｕｃ１９から創製した。
ロール−インプラスミドｂＪＮ２８５は、以下のようにして構築されたノック−インプ
ラスミドｐＪＮ２６６の誘導体である。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡか
らのプライマーＫｅｘ５５
およびＫｅｘ５３
を用いるＰＣＲによって、ＰｐＫＥＸ１−５’領域の０．９−ｋｂ断片を増幅し、Ｓａｃ
ＩおよびＳａｌＩで消化したｐＵＣ１９にクローン化した。得られたプラスミドをＢａｍ
ＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマーＫｅｘ３５
およびＫｅｘ３３
を用いて増幅してあるＫＥＸ１−３’領域の０．８−ｋｂ断片を、同酵素で消化したｐＪ
Ｎ２６２にクローン化した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｐＮＫＹ５１（１）
の３．８−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を２つの可能な向きの各々に挿入し、プラ
スミドｐＪＮ２６３およびｐＪＮ２６４を得た。ＮｏｔＩおよびＰａｃＩクローニング部
位を持つ発現カセットを作り出すために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモータ
ーを、プライマーＧａｂ５
およびＧａｐ３
および鋳型としてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し
、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをＳｐ
ｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマーＣｙｓ５
およびＣｙｓ３
を用いてｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅してあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６１を
得た。ＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットをＢａｍＨＩ消化によって放出し、ｐＪＮ２６
３にクローン化して、プラスミドｐＪＮ２６５が得られ、あるいは（インサートの向きに
応じて）ｐＪＮ２６４にクローン化して、プラスミドｐＪＮ２６６およびｐＪＮ２６７を
得た。引き続いて、プラスミドｐＪＮ２６６をＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断して、
ＵＲＡ−ブラスターカセットを放出し、プライマーＪＮＨＩＳ１
およびＪＮＨＩＳ２
を用いてｐＰＩＣ３．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅してある、ＰｐＨＩＳ４遺伝
子を含むＮｇｏＭＩＶ−ＳｗａＩ断片を開いた部位にクローン化して、ｐＪＮ２８５を得
た。
ｐＪＮ３４８発現ベクターはプラスミドｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ（２）に基づく。まず、ベク
ターｐＪＮ２６１からのＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットを含むＢａｍＨＩ断片を、Ｂ
ａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断してあるｐＢＬＵＲＡ−ＳＸにクローン化して、プラス
ミドｐＪＮ３３８を得た。引き続いて、後者のプラスミドをＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切
断し、インビトロでアニーリングしてある２つのオリゴヌクレオチドＥｘｐｒＩ
およびＥｘｐｒ２
（制限部位ＡｓｃＩには下線を施す）を開いた部位に連結して、ｐＪＮ３４８を得た。
ｐＰＢ１２４発現ベクターは、Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２６３（
２００１）１５９−１６９によって記載されたｐＢＬＡＤＥ−ＳＸベクターに基づいて数
工程で構築した。まず、（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２２−７）からのＧＡＰＤ
Ｈ／ＣＹＣ１発現カセットを含むＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ消化後にｐ
ＢＬＡＤＥ−ＳＸベクターにクローン化した。次に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＡＰＤＨ
プロモーターを含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＰＭＡ１
およびＰＭＡ２
プライマーで増幅したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＭＡ１遺伝子のプロモーターで置き換え
た。次いで、得られたベクターをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ酵素で消化して、ベクターｐＡＧ
２５（Ｇｏｌｄｓｔｉｎ ａｎｄ ＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｙｅａｓｔ．１９９９ Ｏｃｔ；
１５（１４）：１５４１−５３）からのヌルセオトリシン抵抗性マーカーを含む平滑末端
ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片で連結したフル−イン反応の後にＡＤＥ１マーカーを除去した
。
（実施例１２）
（局在化シグナル／マンノシダーゼＩ触媒ドメイン融合の創製）
マウスマンノシダーゼＩＡの増幅。マウスマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｎ
００８５４８， Ｌａｌ ＆ Ｍｏｒｅｍｅｎ １９９４）の触媒ドメインをコードする
遺伝子配列をマウス肝臓ｃＤＮＡ（ｃＬＯＮＴＥＣＨ）から増幅した。簡単に述べれば、
順方向プライマーｍＭＩＡΔ１８７−ＡｓｃＩおよび逆方向プライマーｍＭＩＡ−Ｐａｃ
Ｉ（各々、
および
；導入されたＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）を用いて、Ｐｆｕ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）で、マウス肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
からのマウスマンノシダーゼＩＡ ＯＲＦのアミノ酸１８８〜６５５を増幅した。熱サイ
クリングで用いた条件は一分間の９４℃、１サイクル；３０秒間の９４℃、３０秒間の６
８℃、３分間の７２℃、３０サイクルであった。引き続いて、１μｌのＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、反応物をさらに７２℃にて１０分間インキュベー
トし、１．４Ｋｂ産物をｐＣＲ２．１に連結して、プラスミドｐＳＨ９を得た。Ｔａｑ
ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後、ベクターｐＶＭ２へのサブ
クローニングに先立って、マウスマンノシダーゼＩＡを制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ
で消化し、同制限酵素で消化し、プラスミドｐＳＨ２１を得た。
切形マウスマンノシダーゼＩＡの酵母ゴルジへの引き続いての局在化を容易とするため
に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓｅｃ１２タンパク質の領域（膜貫通ドメインをコード
するアミノ酸３３１〜４３２）を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅゲノムＤＮＡの存在下で、プライマーＳＣ１２５およびＳＣ１２２
および
；導入されたＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅し、プラスミドｐ
ＪＮ３０５を得た。Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後
、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化されたＳｅｃ１２断片を、同酵素で消化された
ｐＳＨ２１にサブクローンし、プラスミドｐＳＨ２９を得た。引き続いて、切形マウスマ
ンノシダーゼＩＡと枠内のＳｅｃ１２断片をコードするｐＳＨ２９のＮｏｔＩ／ＰａｃＩ
断片を、同酵素で消化したｐＪＮ２８５にサブクローンし、プラスミドｐＦＢ８を得た。
（実施例１３）
（マンノシダーゼＩＩ構築物の創製）
アミノ酸７５〜１１０８をコードするショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ（ＧｅｎＢ
ａｎｋ：Ｘ７７６５２， Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９５）の触媒ド
メインを、５５℃にてアニーリングし、５分間延長することによって、上記で概説した熱
サイクリング条件下でＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ショウジョウバエ卵巣ｃ
ＤＮＡから増幅した。順方向プライマーｄＭａｎｎＩＩΔ７４ ＡｓｃＩおよび逆方向プ
ライマーｄＭａｎｎＩＩ ＰａｃＩ（各々、
および
；導入されたＡｓｉＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）を用いた。Ｔａｑ Ｄｙ
ｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認に続き、プラスミドをｐＳＨ２１４と
命名した。引き続いて、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化によって、ショウジョ
ウバエマンノシダーゼＩＩ断片をこのプラスミドから取り出し、同酵素で消化されたｐＪ
Ｎ３４８にサブクローンし、プラスミドｐＳＨ２２０を得た。
切形ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩドメインのゴルジへの引き続いての局在化を
容易とするために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｎｎ２タンパク質の領域（膜貫通ドメ
インをコードするアミノ酸１〜３６）を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡの存在下で、プライマーＭｎｎ２５およびＭｎｎ２１（各々
、
および
；導入されたＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅し、プラスミドｐ
ＪＮ２８１を得た。Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ末端配列決定によるＰＣＲ産物の確認の後
、Ｍｎｎ２断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化し、同酵素で消化されたｐＳＨ
２２０にサブクローンし、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインとＭｎｎ２
局在化シグナルとのイン−フレーム融合が得られ、プラスミドｐＫＤ５３を得た。この作
製されたショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインのｐＨ最適値は、実施例７に
実質的に記載されたｐＨアッセイを用いてｐＨ６．２であると決定された。
（実施例１４）
（マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインライブラリー）
活性を示すマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインおよびリーダーのライブラリーを表１１に
以下に示す。本明細書中で用いるように、（＋）の数は％中性グリカンのＧｌｃＮＡｃＭ
ａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２生産の相対的レベルを示す。表示（−）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇ
ｌｃＮＡｃ２の見掛けの生産がないことを示す。表示（＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ２の２０％未満の生産を示す。表示（＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡ
ｃ２の約２０〜３０％の生産を示す。表示（＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡ
ｃ２の約３０〜４０％の生産を示す。表示（＋＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮ
Ａｃ２の約４０〜５０％の生産を示す。表示（＋＋＋＋＋）はＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ２の５０％を超える生産を示す。表示（ＮＧ）は、融合構築物で形質転換された
いずれのコロニーからも見掛けのグリカンは検出されないことを示す。
（実施例１５）
（ＧｎＴＩＩ発現構築物の創製）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子のＮ−末端部分と融合したヒトＧｎＴＩ遺
伝子を含むＧｎＴＩ発現ベクター（ｐＮＡ１５）の構築は従前に記載されている（Ｃｈｏ
ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， ２００３
Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２２−７）。同様にして、ラットＧｎＴＩＩ遺伝子を
クローン化した。ラットＧｎＴＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２１６６２）を、
ＲＡＴ１
およびＲＡＴ２
プライマーにて、ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＴａｋａｒａ
ＥＸ ＴａｑＴＭポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅｒａ）を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、
配列決定した。鋳型としてこのベクターを用い、アミノ酸８８〜４４３をコードするＧｎ
ＴＩＩのＡｓｉＩ−ＰａｃＩ断片をＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅ
ｎｅ）およびプライマーＲＡＴ４４およびＲＡＴ１１（各々、
および
；導入されたＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位には下線を施す）で増幅した。配列決定に
よる確認の後、次いで、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインを、ｐＢＰ１２４におけるＡｓｃＩ−
ＰａｃＩ断片としてＰＭＡ１プロモーターの下流にクローン化した。最終工程において、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｎｎ２局在化シグナルをコードする遺伝子断片を、Ｎｏｔ
Ｉ−ＡｓｃＩ断片としてｐＪＮ２８１としてクローン化して、ＧｎＴＩＩの触媒ドメイン
とのイン−フレーム融合を生じさせて、プラスミドｐＴＣ５３を得た。
（実施例１６）
レポータータンパク質の発現、Ｎ−結合グリカンの精製および放出
アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下で、Ｋ３ドメインをモデ
ル糖タンパク質として用い、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２２−７）に報告されて
いるように、ヘキサヒスチジンタグを用いて精製した。グリカンを放出させ、従前に報告
されている方法（Ｐａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８） Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の修飾によって、糖タンパク質から分離した。糖タ
ンパク質を還元し、カルボキシメチル化した後、膜をブロックし、ウェルを水で３回洗浄
した。タンパク質を、１ミリユニットのＮ−グルカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する３０
μｌの１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７
℃における１６時間のインキュベーションの後、グリカンを含有する溶液を遠心によって
取り出し、蒸発乾固した。
（タンパク質の精製）
クリングル３は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００試料−取扱ロボット（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒａｎｃｈ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）にて９６−ウェ
ルフォーマットを用いて精製した。クリングル３は、Ｃ−末端ヘキサ−ヒスチジンタグを
用い、発現から精製した。ロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇ
ｅｎによって供されたプロトコルの適合であった。簡単に述べれば、１５０ｕＬ（μＬ）
の沈降した容量の樹脂を９６−ウェル溶解物−結合プレートのウェルに注ぎ、３容量の水
で洗浄し、５容量の５０ｍＭ ＮｉＳＯ４を充填し、３容量の結合緩衝液（５ｍＭイミダ
ゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ７．９）で洗浄した。タンパ
ク質発現培地を３：２の培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ ＰＯ４、１６ｍＭ ＫＣｌ、８２２ｍ
Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）希釈し、カラムに負荷した。排出の後、カラムを１０容量の
結合緩衝液および６容量の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．９）で洗浄し、タンパク質を６容量の溶出緩衝液（１Ｍ
イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．９）で溶出させ
た。溶出した糖タンパク質を凍結乾燥によって蒸発固化させた。
（Ｎ−結合グリカンの放出）
従前に報告されている方法（Ｐａｐａｃ，ｅｔ ａｌ．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８） Ｇ
ｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の修飾によって、グリカンを放出させ、
糖タンパク質から分離した。９６−ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｏｎ−Ｐｍｅｍｂｒａｎ）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを１００ｕＬのメ
タノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６
０ｍＭトリス、３．２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．６）で洗浄し、各添加の後に、温和な真
空にて排出した。乾燥したタンパク質試料を３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液に溶解させ、１０ｕ
ＬのＲＣＭ緩衝液を含有するウェルに移した。ウェルを排出させ、ＲＣＭ緩衝液で２回洗
浄した。タンパク質を、３７℃における１時間の、ＲＣＭ緩衝液中の６０ｕＬの０．１Ｍ
ＤＴＴの希釈によって減少させた。ウェルを３００ｕＬの水で３回洗浄し、６０ｕＬの
０．１Ｍヨードー酢酸の添加によって、室温にて暗所で３０分間カルボキシメチル化した
。ウェルを水で３回洗浄し、室温にて１時間、１００ｕＬの水中の１％ＰＢＰ３６０の添
加によって膜をブロックした。ウェルを排出し、３００ｕＬの水で３回洗浄し、１ミリユ
ニットのＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する３０ｕＬの１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ
３ ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７℃における１６時間の後、グリ
カンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させた。
ＭＡＬＤＩ／時間飛行（ＴＯＦ）質量分析
グリカンの分子量は、遅延抽出を用いるＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ直線ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。各ウェルから
の乾燥したグリカンを１５μｌの水に溶解させ、０．５μｌをステンレス鋼で試料プレー
トにスポットし、０．５μｌのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１水／アセトニトリル０．
１％ＴＦＡ中の９ｍｇ／ｍｌのジヒドロ安息香酸、１ｍｇ／ｍｌの５−メトキシサリチル
酸）と混合し、乾燥させた。４ｎｓパルス時間でのパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）で
の照射によってイオンを発生させた。機器を、１２５ｎｓ遅延および２０ｋＶの加速電圧
での遅延抽出モードにて操作した。グリッド電圧は９３．００％であり、ガイドワイヤー
電圧は０．１％であり、内部圧力は５×１０−７トール未満であり、低質量ゲートは８７
５Ｄａであった。スペクトルは１００〜２００レーザーパルスの合計から発生させ、５０
０ＭＨｚディジタイザーで獲得した。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を外部分子量標準
として用いた。全てのスペクトルは陽性イオンモードの機器で発生させた。
（雑：）
タンパク質はＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０）に従ってＳＤＳ／ＰＡＧＥ
によって分離した。
（実施例１７）
（酵母株ＹＳＨ−１（Δｏｃｈ１、α１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ）の創製）
以前に報告されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＫ６４（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：
５０２２−７）、ＯＣＨ１ノック−アウトを保有し、かつヒトプラスミノーゲンのクリン
グル３ドメイン（Ｋ３）を発現するトリプル栄養要求株（ＡＤＥ、ＡＲＧ、ＨＩＳ）を宿
主株として用いた。ＢＫ６４を制限酵素ＥｃｏＮＩで線状化したプラスミドｐＰＢ１０３
で形質転換して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポータ
ーを宿主細胞に導入し、このようにして、株ＰＢＰ−１を得た。制限酵素ＥｃｏＮＩで線
状化したプラスミドｐＦＢ８での形質転換によってマウスＭｎｓＩをこの株に導入し、株
ＰＢＰ−２を得た。株ＰＢＰ−２から単離したタンパク質からのＫ３グリカンの分析は、
存在する一次グリコ形態がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であったことを示した。
引き続いて、ＰＢＰ−２を、制限酵素ＡａｔＩＩで線状化したヒトＧｎＴＩプラスミド
ｐＮＡ１５で形質転換し、株ＰＢＰ−３を得た。株ＰＢＰ−３で生産されたＫ３グリコ形
態の分析は、ハイブリッドグリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は支配的構造で
あることを示した。ＵＲＡ３マーカーをＰＢＰ−３から回収するために、５−フルオロオ
ロチン酸（５−ＦＯＡ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａ）およびウラシル（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６（１９８４））を含有する最
小培地での選択に先立って、この株をＹＰＤ中で増殖させた。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５Ｇｌ
ｃＮＡｃ２グリコ形態を生産する回収されたＵｒａ−マイナス株をＹＳＨ−１と命名した
。株ＹＳＨ−１からのＮ−グリカンプロフィールを図１３に示し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６５ｍ／ｚにおいて支配的なピークを呈する
。
（実施例１８）
（酵母株ＹＳＨ−３７（マンノシダーゼＩＩを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の創製
）
ＹＳＨ−１（実施例１７）を、制限酵素ＡｐａＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）プラスミ
ド（ｐＫＤ５３）で形質転換し、株ＹＳＨ−３７を得た。株ＹＳＨ−３７（図１４）で生
産されたＫ３グリカン構造の分析は、１１４０ｍ／ｚにおける支配的グリコ形態が、１３
０３ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および他のグリコ形態Ｇ
ｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６５ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭ
Ａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応することを示す。
（実施例１９）
（酵母株ＹＳＨ−４４の創製）
株ＹＳＨ−３７（実施例１８）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したラットＧｎＴＩＩ
／ＭＮＮ２（ｓ）リーダー、ｐＴＣ５３をコードするプラスミドで形質転換した。得られ
た株ＹＳＨ−４４は、陽性モードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、ＧｌｃＮＡｃ２
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］に対応する、１３５６ｍ／ｚにおける単一グリコ形態を有
するＫ３ Ｎ−グリカンを生産した（図１５）。
（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化）
従前に報告されている方法（Ｐａｐａｃ， ｅｔ ａｌ．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）
Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の修飾によって、ＹＳＨ−４４からの
グリカンを放出し、糖タンパク質から分離した。タンパク質を還元させ、カルボキシメチ
ル化し、かつ膜をブロックした後、ウェルを水で３回洗浄した。タンパク質を、１ミリユ
ニットのＮ−グルカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含有する３０μｌの１
０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ｐＨ８．３の添加によって脱グリコシル化した。３７℃におけ
る１６時間の消化の後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させ
た。次いで、グリカンをｓＳＣ２１０Ａ ｓｐｅｅｄ ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓａｖａ
ｎｔ， Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で乾燥した。乾燥したグリカンを３７℃の５０ｍＭ
ＮＨ４Ａｃ ｐＨ５．０に一晩いれ、１ｍＵのヘキソース（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，
ＣＡ）を加えた。グリカンを分析し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する９
３３ｍ／ｚにおいて図１６に示した単一グリカンを含有することが示された。
（実施例２０）
（見掛けのマンノシダーゼＩＩ活性を持たない酵母株の創製）
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノ
シダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９（ｍ）をコードするプラスミ
ド、プラスミドｐＫＤ１６で形質転換した。得られた株は、陽性モードのＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ質量分析によると、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する１４６４ｍ／ｚにおい
て単一のグリコ形態を生じた（図１８）。この株は、このようにして、少なくともＫ３レ
ポーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノ
シダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（ｌ）融合構築物からの見掛
けのマンノシダーゼＩＩ活性を発現しなかった。
（実施例２１）
（マンノシダーゼＩＩ活性を有する酵母株の創製）
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノ
シダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（１）をコードするプラスミ
ド、プラスミド（ｐＫＤ６）で形質転換した。得られた株（図１９）で発現されたＫ３糖
タンパク質のＮ−グリカンプロフィールは、Ｍａｌ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応
する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピーク、および１１３９ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃ
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭＡｎ４Ｇｌ
ｃＮＡｃ２［ｃ］に対応する他のピークを呈した。得られた酵母株は、このようにして、
Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＭＮＳ１（１）融合構築物からのいくらかの検出可能なマンノシダーゼＩＩ活性を発現し
た。
（実施例２２）
（マンノシダーゼＩＩ活性を有する酵母株ＹＳＨ−２７の創製）
ＹＳＨ−１は、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノ
シダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＬＳ１（ｓ）プラスミド（ｐＫＤ１
）で形質転換した。得られた株ＹＳＨ−２７で発現されたＫ３糖タンパク質のＮ−グリカ
ンプロフィールは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１３
９ｍ／ｚにおいて支配的なピークを呈した（図２０）。得られた株ＹＳＨ−２７は、この
ようにして、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＧＬＳ１（ｓ）融合構築物からの有意なレベルのマンノシダーゼＩＩ活性を
呈した。
（実施例２３）
（酵母株ＹＳＨ−７４の創製（低マンノシダーゼＩＩ活性））
ＹＳＨ−１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノ
シダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（ｍ）プラスミド（ｐＫＤ５
）で形質転換した。得られた株ＹＳＨ−７４で発現されたＫ３糖タンパク質のＮ−グリカ
ンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにお
ける支配的なピーク、および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ
２［ｃ］および１４６４ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対
応する他のピークを呈した（図２１）。得られた株ＹＳＨ−７４は、少なくともＫ３レポ
ーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシ
ダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（ｍ）融合構築物からのマンノ
シダーゼＩＩ活性の普通のレベルを発現した。ＹＳＨ−７４からのグリカンを、ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４１ｍ／ｚで支配的ピークを呈
するグリカンをもたらすＡ．ｓａｉｔｏｉ α−１，２マンノシダーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎ
ｅｖａｔｏ，ＣＡ）での消化によってさらに分析した。
（実施例２４）
（マンノシダーゼアッセイ）
蛍光標識Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を２０μＬの上澄に添加し、室温にて
３０時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ Ｎ
Ｈ２ ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃ
ｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）でのＨＰＬＣによって分析した。流速は４０分間１．０ｍ
ｌ／分であり、カラムを３０℃に維持した。３分間のイソクラティック溶出（６８％Ａ：
３２％Ｂ）の後、直線溶媒グラジエント（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４０％Ａ：６０％Ｂ）を
２７分間にわたって使用して、グリカンを溶出させた（Ｔｕｒｃｏ，Ｓ．Ｊ．（１９８１
）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，２７８−２８３）。溶媒Ａ（アセトニトリル）お
よび溶媒Ｂはギ酸アンモニウムの水溶液、５０ｍＭ、ｐＨ４．５であった。カラムをラン
の間２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化させた。
（実施例２５）
（インビトロガラクトース移動）
株ＹＳＨ−４４から得られたＮ−結合グリカンＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
をガラクトース移動に対する基質として用いた。２０ｍｇのこのグリカンを、３７℃にて
１０〜２０時間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５中の７５
ｍｇ ＵＤＰ−Ｇａｌおよび１０〜５０ｍＵのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（ウシ乳、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にインキュベートした。図１７は、Ｇａｌ２
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１６６５ｍ／ｚにおけるユニ形
態ピークを呈する陽性モードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。陰性コントロール、マ
イナスガラクトシルトランスフェラーゼは上記したように行い、基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａ
ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へのグルコースの移動は示さなかった。
（実施例２６）
（クラスＩＩＩマンノシダーゼの下等真核生物への導入）
昆虫Ｓｆ９細胞からのクラスＩＩＩマンノシダーゼ（Ｊａｒｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｌ
ｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７ ７：１１３−１２７）をコードするｃＤＮＡを、５’
および３’末端に特異的なプライマーを用いて増幅した。引き続いて、ｃＤＮＡを酵母組
込みプラスミドにサブクローンして、分泌されたレポータータンパク質のＮ−グリコシル
化パターンに対するこのタンパク質の効果を調べた。多数の切形産物が生産されて、例え
ば実施例１４に記載されているように、異なる標的化リーダー断片を持つクラスＩＩＩマ
ンノシダーゼ構築物のライブラリーを得た。所望の宿主株において単独で発現されること
に加え、得られた融合タンパク質は他のグリコシル化修飾酵素と組み合わせて発現させて
、所望のＮ−グリカン構造の生産を増強させる。
Ｓｆ９マンノシダーゼは今日このクラスＩＩＩのただ１つのクローン化されたメンバー
であるが、遺伝子およびＥＳＴは、このＯＲＦ、特に、触媒ドメイン（ＯＲＦの残基２７
３〜２２４１）に対する有意な相同性を示す。ある範囲の温度およびｐＨ最適値を保有す
るクラスＩＩＩマンノシダーゼのライブラリーが創製される。今度は、これは、選択され
たレポータータンパク質のグリコシル化パターンを修飾するにおいて最適に実行されて、
酵母および繊維状真菌のような所望の宿主株で発現された場合に所望のＮ−グリカン構造
を生産する１以上のクラスＩＩＩマンノシダーゼ融合構築物の選択を可能とするであろう
。
図１Ａは、代表的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の模式図である。 図１Ｂは、代表的なヒトＮ−グリコシル化経路の模式図である。 図２は、融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構成を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への、標的化ペプチドフラグメントの挿入を示す。図２Ｂは、制限部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する産生された標的化ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変されたｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への、触媒ドメイン領域の挿入を示す。図２Ｄは、制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する、産生された触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、標的化ペプチドサブライブラリーおよび触媒ドメインサブライブラリーから産生された１つの特定の融合構築物を示す。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号１）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号２）を示す。Ｎ−末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号１）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号２）を示す。Ｎ−末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。示したＮ−グリカンは以下の通りである：Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生を生じるｏｃｈ１欠失を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のインビボトリミングの後の、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する１２５３の質量（ｍ／ｚ）を有するピークによって示される。 図６Ａ〜６Ｆは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の産生を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］および標準物質としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］；Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生するｏｃｈ１ノックアウト；およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の非産生を示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］〜Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうちで、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が相対的に少量であることを示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）によって産生された他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対して、有意な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）による分泌糖タンパク質ＩＦＮ−βにおける、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生を示す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と一致する１２５４の質量（ｍ／ｚ）を含むピークによって示される。 図７は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換されたΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露の後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図８は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図９は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）培地Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＤＤ２８−３で形質転換されたΔｏｃｈ１）の上清であり、これは、上清中の活性を示す（ポジティブコントロール）。 図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のいくらかの産生を生じるが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の支配的産生を生じるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターなしに、ヒトＧｎＴＩで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩで形質転換された株（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。１４５７における質量（ｍ／ｚ）の単一の突出したピークは、図１０Ｂに示されるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。 図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたｐＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）によってコードされた異種マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを示す。 図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの無細胞抽出物から取り出されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む、野生型細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示し、これは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としてのその同定と一致する１９０８における質量（ｍ／ｚ）の明瞭なピークを示す。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致するピークに対応するインビトロα−１，２−マンノシダーゼ消化後の、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。 図１３は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６５ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１（α−マンノシダーゼおよびＧｎＴＩで形質転換されたｏｃｈ１欠失変異体）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。 図１４は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１３０３ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６５ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを示す。この株は、ＹＳＨ−３７と命名された。 図１５は、ラットＧｎＴ ＩＩ／ＭＮＮ２（ｓ）リーダーで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−３７において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応する１３５６ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。この株は、ＹＳＨ−４４と命名された。 図１６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４において産生されたクリングル３糖タンパク質に由来するＮ−グリカン（図１５に示されたように産生されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化後に、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する９３３ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。 図１７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４で産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカン（図１５に示されたように産生されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、インビトロでのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後の、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応する１６６５ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。 図１８は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９（ｍ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。 図１９は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（ｌ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する１４６４ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１１３９ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］および１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］に対応する他のピークを示す。 図２０は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＬＳ１（ｓ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｌ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１３９ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。この株は、ＹＳＨ−２７と命名ｓれた。 図２１は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１（ｍ）において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４０ｍ／ｚにおける支配的ピーク、ならびに１３０２ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］および１４６４ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを示す。この株は、ＹＳＨ−７４と命名された。 図２２は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ／Ａ．ｓａｉｔｏｉα−１，２マンノシダーゼで消化されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−７４において産生されたクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示し、これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する１１４１ｍ／ｚにおける支配的ピークを示す。 図２３は、公知かつ仮想のマンノシダーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩｘおよびクラスＩＩＩマンノシダーゼ（出現する順序で、それぞれ、配列番号９６、９２、９３、９９、９８、９７、９４、９５、および１００〜１０２）のＢＬＡＳＴ配列比較を示す。 図２４は、マンノシダーゼのクラスの系統樹を示す。 図２５は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ １２１４９９）ヌクレオチド配列（配列番号４９）およびコードされたタンパク質（配列番号９５）を示す。 図２６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ０７３５９４）ヌクレオチド配列（配列番号５０）およびコードされたタンパク質（配列番号９２）を示す。 図２７は、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓマンノシダーゼＩＩ（ＡＫ１１６６８４）ヌクレオチド配列（配列番号５１）およびコードされたタンパク質（配列番号９４）を示す。 図２８は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ（Ｘ７７６５２）ヌクレオチド配列（配列番号５２）およびコードされたタンパク質（配列番号９６）を示す。 図２９は、ヒトマンノシダーゼＩＩ（Ｕ３１５２０）ヌクレオチド配列（配列番号５３）およびコードされたタンパク質（配列番号９７）を示す。 図３０は、マウスマンノシダーゼＩＩ（Ｘ６１１７２）ヌクレオチド配列（配列番号５４）およびコードされたタンパク質（配列番号９８）を示す。 図３１は、ラットマンノシダーゼＩＩ（ＸＭ ２１８８１６）ヌクレオチド配列（配列番号５５）およびコードされたタンパク質（配列番号９３）を示す。 図３２は、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ（Ｄ５５６４９）ヌクレオチド配列（配列番号５６）およびコードされたタンパク質（配列番号９９）を示す。 図３３は、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ（ＡＦ００５０３４）ヌクレオチド配列（配列番号５７）およびコードされたタンパク質（配列番号１００）を示す。 図３４は、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ０００５２８）ヌクレオチド配列（配列番号５８）およびコードされたタンパク質（配列番号１０１）を示す。 図３５は、ヒト細胞質マンノシダーゼＩＩ（ＮＭ ００６７１５）ヌクレオチド配列（配列番号５９）およびコードされたタンパク質（配列番号１０２）を示す。 図３６は、マンノシダーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩｘおよびマンノシダーゼＩＩＩ活性を用いて産生されたオリゴ糖中間体を示す。

Claims (54)

  1. 細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
    かまたは双方を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１
    ，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度まで加水分解できるマンノ
    シダーゼ酵素活性を発現させる工程を含む、下等真核生物宿主細胞においてヒト−様糖タ
    ンパク質を生産する方法。
  2. 細胞中で、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
    かまたは双方を含むオリゴ糖基質をインビボで加水分解できるマンノシダーゼ酵素活性を
    発現させる工程を含む下等真核生物宿主細胞において所望のＮ−グリカンを生産する方法
    であって、該所望のＮ−グリカンは少なくとも１０モル％の収率で該宿主細胞内で生産さ
    れる方法であって、Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３Ｇｌ
    ｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２よりなる群から選択される、請求項２に記載の
    方法。
  3. 前記所望のＮ−グリカンが少なくともオリゴ糖分岐Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６）Ｍ
    ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを有することを特徴とする
    請求項２記載の方法。
  4. 前記マンノシダーゼ酵素活性が、Ｍａｎα１，３およびＭａｎα１，６グリコシド結合を
    含むオリゴ糖基質のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６双方の結合をインビボで加水分
    解することができる、請求項１または２記載の方法。
  5. 前記オリゴ糖基質がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−
    ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎ
    α１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡ
    ｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮ
    Ａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎα
    １，３ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
    ｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
    ４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，
    ３（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
    β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａ
    ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
    ｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４
    −ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａ
    ｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａ
    ｓｎまたは高マンナンとして特徴付けられる請求項１または２記載の方法。
  6. 前記マンノシダーゼ活性がクラス２マンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項１ま
    たは２記載の方法。
  7. クラス２マンノシダーゼ活性がＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍ
    ａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｇｌｃ
    ＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−Ｇｌ
    ｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；またはＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３
    （Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，
    ４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性を有する請求項６記載の方法。
  8. 前記クラス２マンノシダーゼ活性が、より高等な真核生物宿主細胞のゴルジ装置で通常見
    出されるものである請求項６記載の方法。
  9. 前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩｘマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
    １または２記載の方法。
  10. クラスＩＩｘマンノシダーゼ活性がＭａｎα１，３（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍ
    ａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；Ｍａｎα１，３（Ｍａｎ
    α１，３Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
    ｎ；またはＭａｎα１，２Ｍａｎα１，３（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，
    ６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎに対する基質特異性
    を有する請求項９記載の方法。
  11. 前記マンノシダーゼ活性がクラスＩＩＩマンノシダーゼ活性として特徴付けられる請求項
    １または２記載の方法。
  12. 前記クラスＩＩＩマンノシダーゼ活性が（Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，
    ４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６）
    Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ；または高マンナンに対
    する基質特異性を有する請求項１１記載の方法。
  13. 前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される請求項１または２記載の方法。
  14. 前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
    記載の方法。
  15. 前記マンノシダーゼ活性が約５．０〜約８．０のｐＨ最適値を有する請求項１または２記
    載の方法。
  16. 前記マンノシダーゼが、さらに、Ｍａｎα１，２結合を加水分解できる請求項１または２
    記載の方法。
  17. 前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞の分泌経路内に局在化された請求項１または２記載
    の方法。
  18. 前記マンノシダーゼ活性が宿主細胞のＥＲ、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワー
    クのうちの少なくとも１つ内に局在化されたポリペプチドから発現される請求項１または
    ２記載の方法。
  19. 前記マンノシダーゼ活性が、細胞標的化シグナルペプチドに融合したマンノシダーゼ触媒
    ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸から発現される請求項１または２記載の方
    法。
  20. 前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して天然であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
    コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
  21. 前記マンノシダーゼ活性が、宿主細胞に対して異種であるマンノシダーゼ触媒ドメインを
    コードする配列を含む核酸から発現される請求項１９記載の方法。
  22. 前記マンノシダーゼ酵素活性がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｙａｎａマンノシダー
    ゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉ
    ｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
    、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩｘ、
    昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞質マ
    ンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
  23. 前記ポリペプチドが、宿主細胞に対して天然である標的ペプチドをコードする配列を含む
    核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
  24. 前記ポリペプチドが、マンノシダーゼ触媒ドメインに対して異種である標的ペプチドをコ
    ードする配列を含む核酸から発現される請求項１または２記載の方法。
  25. さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む請求項１または２記載の方法。
  26. 前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ
    、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃ
    ｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃ
    ｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃ
    ｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔ
    ｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒ
    ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓ
    ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖ
    ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
    ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
    ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
    ｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
    ｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
    ｒａｓｓａよりなる群から選択される請求項１または２記載の方法。
  27. 宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項２６記載の方法。
  28. 該糖タンパク質が治療タンパク質である、請求項１または２記載の方法であって、該治療
    タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ｉｇｅ受容体α−鎖、
    ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプ
    シン阻害剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキ
    シンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄系先祖阻害因子
    −１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、
    ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（
    膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドイン
    ターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／および
    ｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エ
    ンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセ
    レブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）より
    なる群から選択される請求項２８記載の方法。
  29. 少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、ここに少なくとも１つの遺伝子構築物が、
    通常は関連しない細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片とイン−フレーム連
    結したマンノシダーゼクラス２、ＩＩｘまたはＩＩＩ触媒ドメインをコードする核酸断片
    を含む、核酸ライブラリー。
  30. 前記マンノシダーゼ触媒ドメインがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａマンノシ
    ダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａ
    ｌｉｓマンノシダーゼＩＩ、ショウジョウバエマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼ
    ＩＩ、マウスマンノシダーゼＩＩ、ラットマンノシダーゼＩＩ、ヒトマンノシダーゼＩＩ
    ｘ、昆虫細胞マンノシダーゼＩＩＩ、ヒトリソソームマンノシダーゼＩＩおよびヒト細胞
    質マンノシダーゼＩＩよりなる群から選択される請求項２９記載のライブラリー。
  31. 細胞標的化ペプチドをコードする核酸断片がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓ
    ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉ
    ｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａ
    ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃ
    ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈ
    ｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｎ
    ＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５
    、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、お
    よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６よりなる群から選択される請求項２９記載の
    ライブラリー。
  32. 発現制御配列に作動可能に連結した請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のライブラリ
    ーに由来する融合構築物を含むベクターであって、ここに、該細胞標的化シグナルペプチ
    ドがＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークのうちの少なくとも１つに標的化
    された、ベクター。
  33. 前記発現制御配列が誘導性または構成的である請求項３２記載のベクター。
  34. 宿主細胞における発現に際して、インビボにてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａ
    ｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与するマンノシダーゼ活性
    をコードする請求項３２記載のベクター。
  35. 請求項３４記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
  36. ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６と命名されたベクターの群
    から選択される少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
  37. 標的化シグナルペプチドにイン−フレームに融合し、かつ下等真核生物宿主細胞での発現
    に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合およびＭａｎα１，６グリコシド結合のいずれ
    かまたは双方を含むオリゴ糖基質を該基質のＭａｎα１，３結合および／またはＭａｎα
    １，６結合の少なくとも１０％がインビボで加水分解される程度までインビボで加水分解
    できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプチド。
  38. 標的化シグナルベプチドにイン−フレームに融合し、下等真核生物宿主細胞における発現
    に際して、Ｍａｎα１，３グリコシド結合、Ｍａｎα１，６グリコシド結合、またはＭａ
    ｎα１，２グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、該基質のＭａｎα１，３結合、Ｍａｎ
    α１，６結合またはＭａｎα１，２結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程
    度まで、インビボで加水分解できるマンノシダーゼ触媒ドメインを含む、キメラポリペプ
    チド。
  39. 請求項３７記載のキメラポリペプチドをコードする核酸。
  40. 請求項３７記載のキメラポリペプチドを含む宿主細胞。
  41. 請求項３９記載の核酸を含む宿主細胞。
  42. 請求項４０または４１記載の宿主細胞において生産された糖タンパク質。
  43. 請求項４０または４１記載の宿主細胞で生産されたＮ−グリカン。
  44. 前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４３記載のＮ−グリカン。
  45. 請求項１または２記載の方法によって生産された糖タンパク質。
  46. 請求項１または請求項２記載の方法によって生産されたＮ−グリカン。
  47. 前記Ｎ−グリカンが均一であることを特徴とする請求項４６記載のＮ−グリカン。
  48. （ａ）配列番号９２（図２３からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）；
    （ｂ）配列番号９２のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
    約９０％類似；
    （ｃ）配列番号９３と少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
    くとも９９％または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
    （ｄ）配列番号９２のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
    配列；
    （ｅ）配列番号９２に少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
    くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
    も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
    （ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９２にハイブリダイズする核酸配列；およ
    び
    （ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの断
    片を含む核酸配列；
    よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる単離されたポリヌクレ
    オチド。
  49. （ａ）配列番号９３（図２３からのラット）；
    （ｂ）配列番号９３のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
    ９５％類似；
    （ｃ）配列番号９３に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
    少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
    （ｄ）配列番号９３のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
    配列；
    （ｅ）配列番号９３に少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
    少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
    （ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９３にハイブリダイズする核酸配列：およ
    び
    （ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
    断片を含む核酸配列；
    よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
    レオチド。
  50. （ａ）配列番号９４からのＣｉｏｎａ）；
    （ｂ）配列番号９４のドナーヌクレオシチド結合部位のアミノ酸残基に少なくとも約９
    ０％類似；
    （ｃ）配列番号９４に少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少な
    くとも９９％または少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
    （ｄ）配列番号９４のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
    配列；
    （ｅ）配列番号９４に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
    くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくと
    も９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
    （ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９４にハイブリダイズする核酸配列；およ
    び
    （ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つの
    断片を含む核酸配列；
    よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
    レオチド。
  51. （ａ）配列番号９５（図２３からのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；
    （ｂ）配列番号９５のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基に対して少なくとも
    約９５％類似；
    （ｃ）配列番号９５に少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
    少なくとも９９．９％同一の核酸配列；
    （ｄ）配列番号９５のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコードする核酸
    配列；
    （ｅ）配列番号９５に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または
    少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
    （ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号９５にハイブリダイズする核酸配列；およ
    び
    （ｇ）長さが少なくとも６０連続ヌクレオチドである（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの
    断片を含む核酸配列；
    よりなる群から選択される核酸配列を含むか、またはそれよりなる、単離されたポリヌク
    レオチド。
  52. 配列番号５〜配列番号１５の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含むか
    、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、コードされたポリ
    ペプチドはオリゴ糖のＭａｎα１，３および／またはＭａｎα１，６グリコシド結合の加
    水分解に関与する、修飾されたポリヌクレオチド。
  53. 配列番号４９〜配列番号５９の保存された領域よりなる群から選択される核酸配列を含む
    か、またはそれよりなる修飾されたポリヌクレオチドであって、ここに、該コードされた
    ポリペプチドは、オリゴ糖のＭａｎα１，３グリコシド結合および／またはＭａｎα１，
    ６グリコシド結合の加水分解に関与する、修飾されたヌクレオチド。
  54. ｐＫＤ５３、ｐＫＤ１、ｐＫＤ５、ｐＫＤ６およびｐＫＤ１６なる群から選択されたベク
    ター。
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