CN103827134A - 多肽分离方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了使用包含Fc受体的介质分离多肽糖型的方法和组合物。在某些实施方案中,介质包含Fc受体,所述Fc受体包含FcγRIII受体的胞外部分。
Description
相关申请
本申请要求2011年7月20日提交的美国临时申请号61/509,746的权益,所述文献通过引用的方式完整并入本文。
背景
大部分膜蛋白和分泌性蛋白是糖基化的。在许多情况下,寡聚糖的存在和特征影响糖蛋白的折叠、稳定性、位置、配体相互作用和生物活性。例如,抗体一般具有复杂N-连接寡聚糖。这些寡聚糖由于复杂寡聚糖链中岩藻糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或唾液酸水平的变动而可能高度异质(Jefferis,Trends Pharm.Sci.30(7):356-362,2009)。
血清和重组抗体一般含有混合糖型。已经观察到某些抗体糖型对白细胞上的Fc受体如FcγRI、FcγRII、FcγRIII和C1q具有较高亲和力,这转而可以改变效应子功能。具有寡聚甘露糖型寡聚糖的抗体显示增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和减少的C1q结合作用(Crispin等人,J.Mol.Biol.387:1061-1066,2009)。消除半乳糖基化减少C1q结合作用和与其他Fc受体的结合(Crispin等人,上文;Kobata,Biochim.Biophys.Acta1780:472-478,2008)。已经显示末端唾液酸减少抗体对Fcγ受体的亲和力(Jefferis,Nat.Rev.Drug.Disc.8:226-234,2009;Walsh等人,Nat.Biotech.24(10):1241-1252,2006)。
与核心岩藻糖化形式相比,在主要核心N-乙酰葡糖胺上缺少岩藻糖的抗体形式对FcγRIIIa具有增加的亲和力并且还具有增加的ADCC触发能力(Jefferis,Exp.Opin.Biol.Ther.7(9):1401-1413,2007;Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249,2004;Shibata-Koyama等人,Glycobiol.19(2):126-134,2009)。与岩藻糖化形式相比,非岩藻糖化形式对抗原、C1q、FcγRI、新生Fc受体(FcRn)具有相当的亲和力并且对FcγRIIa和FcγRIIb具有略微较高的亲和力(Jefferis,Exp.Opin.Biol.Ther.7(9):1401-1413,2007;Satoh等人,Exp.Opin.Biol.Ther.6(11):1161-1173,2006;Kobata,上文)。非岩藻糖化形式的利妥昔单抗和曲妥珠单抗具有增强的体外和离体ADCC(Jefferis,Exp.Opin.Biol.Ther.7(9):1401-1413,2007;Jefferis,Trends Pharm.Sci.30(7):356-362,2009;Satoh,上文)。已经报道FcγRI、FcγRII、FcγRIII和C1q受体与Fc多肽的铰合部或铰合部近端区域的相互作用。非岩藻糖化IgG Fc对FcγRIII的增加的亲和力可能归因于Fc中的构象变化,这种构象变化减少了对结合的立体抑制作用(Kobata,上文;Satoh,上文)。
概述
本公开尤其提供了用于分离多肽糖型的方法和组合物。在本文提供的方法的多种实施方案中,使用偏好地结合一种或多种多肽糖型的Fc受体媒介(media)分离具有Fc受体结合部分的多肽。多肽糖型的分离具有多种应用,如在制备性方法,例如用于制备具有所需糖型谱的组合物、用于富集拥有所需生物活性和/或治疗活性的特定糖型的方法,和分析方法,例如,可以表征多肽制备物的方法中。
糖基化涉及多肽生物化学的功能、稳定性和其他重要方面。由本发明技术提供的益处可以影响多肽产物的开发、生产和使用(例如,治疗性使用)。分离糖型的能力可以更多地控制可变的产物品质属性,这转而促进一致的制造、临床/监管分析,并且在一些情况下,影响治疗功效。
因此,在一个方面,本公开提供一种分离加载流体中多肽糖型的方法。该方法包括例如(a)提供包含免疫球蛋白Fc受体的介质;(b)使该介质与包含多肽的加载流体在使该多肽与免疫球蛋白Fc受体结合的条件下接触,其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc受体结合部分,其中该加载流体包含该多肽的多种糖型,并且其中所述Fc受体偏好地结合一种或多种糖型;(c)使介质与洗脱溶液在使结合多肽从介质洗脱的条件下接触;和(d)回收从介质洗脱的结合多肽,从而产生洗脱物。
在一些实施方案中,Fc受体与第一糖型以下述亲和力结合,所述亲和力比所述Fc受体与另一种糖型结合的亲和力高至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或150倍。
在一些实施方案中,该方法包括在使介质与洗脱溶液接触之前,使介质与一种或多种洗涤溶液接触。
在多种实施方案中,方法包括回收流过介质的多肽。
在一些实施方案中,将介质以其多肽容量的1-3000%(例如,5-1900%、5-100%或100-1900%)加载。可以将介质(medium)以可以从与该介质结合的糖型的流过物(flow through)选择性耗尽的容量加载。例如,在一些实施方案中,流过物级分中某些糖型的水平,例如,具有降低的岩藻糖水平的糖型(例如,非岩藻糖化糖型),小于加载物质中95%、90%、75%、50%、25%、10%、或5%的水平。
加载流体可以来自多种来源。在一些实施方案中,加载流体包含细胞培养基(例如,粗制或过滤的细胞培养基、包含细胞的细胞培养基或从中移除细胞的细胞培养基)。在一些实施方案中,加载流体包含一种流体,所述流体已经由一个或多个离子交换层析法(例如,阳离子交换法、阴离子交换法)、蛋白A层析法、UF/DF、病毒清除过滤法、疏水相互作用层析法、羟基磷灰石层析法、混合模式层析法、凝集素层析法或其组合纯化。在其他实施方案中,加载流体包含药用药品(drug product)或药物(drug substance)。
免疫球蛋白Fc受体结合部分可以包括例如免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中,Fc受体结合部分包括天然免疫球蛋白Fc区或其保留Fc受体结合能力的部分或变体。
在一些实施方案中,免疫球蛋白Fc受体选自:FcγRIIIa V176、FcγRIIIaF176、FcγRIIIb NA1、FcγRIIIb NA2、FcγRIIa H131、FcγRIIa R131、FcγRIIb I232和FcγRIIb T232。
方法可以用来分离多种多肽的糖型。在一些实施方案中,使用某方法分离的多肽包括抗体(例如,单克隆抗体、人单克隆抗体、人IgG、人IgG1)。在一些实施方案中,多肽包括Fc融合蛋白(例如,具有人Fc区的Fc融合蛋白)。根据本文中方法分离的多肽包括单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、胞内抗体、小模块免疫药物(SMIP)、IgG-scFv双特异性抗体、抗体-肽结合物、抗体-药物结合物和病毒或病毒衣壳上的Fc受体结合多肽。
在一些实施方案中,用于分离的多肽在哺乳动物细胞中产生。在一些实施方案中,在真菌细胞(例如,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞或植物细胞中产生多肽。在一些实施方案中,在CHO细胞(例如,GS-CHO、CHO-K1或CHO-K1SV)、NS0细胞或Sp2/0细胞中产生多肽。
Fc受体是偏好地与一种或多种糖型结合的一种受体。在一些实施方案中,Fc受体偏好地与具有减少的岩藻糖的糖型(例如,非岩藻糖化糖型,例如,具有减少的核心N-岩藻糖的糖型)结合。
在一些实施方案中,Fc受体偏好地与具有增加的高甘露糖寡聚糖的多肽糖型结合。
在一些实施方案中,Fc受体是糖基化的。例如,Fc可以是N-糖基化的。
在一些实施方案中,Fc受体包括FcγRIII多肽(例如,FcγRIIIa多肽或FcγRIIIb多肽)或FcγRIV多肽的Fc结合部分。
例如,Fc受体包括FcγRIII多肽或FcγRIV多肽的胞外结构域;例如,Fc受体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸残基21-209至少85%相同的序列。在一些实施方案中,FcγRIII多肽的胞外结构域是V176同种异型。
在一些实施方案中,Fc受体包括全长FcγRIII多肽。
在本文提供的方法的多种实施方案中,加载流体包含偏好地与Fc受体结合的第一糖型,并且洗脱物中第一糖型的百分数相对于加载流体增加至少20%,例如,洗脱物中第一糖型的百分数相对于加载流体增加至少50%、100%、2倍、5倍、10倍或20倍,。
某种方法可以富集糖型,从而洗脱物含有至少给定的百分数。例如,在一些实施方案中,洗脱物中第一糖型的百分数是至少5%、10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。
在一些实施方案中,第一糖型是具有减少的岩藻糖的糖型(例如,非岩藻糖化糖型)。
在一些实施方案中,第一糖型是糖型具有减少的唾液酸化的糖型(例如,非唾液酸化糖型)。
在一些实施方案中,第一糖型是半乳糖化糖型。
在一些实施方案中,第一糖型是具有高甘露糖寡聚糖的糖型。
可以将洗脱物收集或分成级分,所述级分的一个或多个可以针对特定糖型富集。
在方法的一些实施方案中,加载流体包含不偏好地与Fc受体结合的第二糖型,并且洗脱物中第二糖型的百分数相对于加载流体减少(例如,其中第二糖型被岩藻糖化、唾液酸化和/或是高甘露糖糖型的情况下)。
在一些实施方案中,洗脱物中多肽的生物活性相对于加载流体中多肽的活性改变(增加或减少)。在一些实施方案中,生物活性包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在方法的一些实施方案中,ADCC增加(例如,ADCC增加至少20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍或50倍)。
在一些实施方案中,已经流过介质的多肽的生物活性相对于加载流体中多肽的活性改变(增加或减少)。
可以使用多种媒介的任一种。在一些实施方案中,介质包括珠、膜、块状物(monoliths)、纤维基质、多孔媒介或凝胶。在一些实施方案中,基质包括琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)(poly(azolactone))。
Fc受体可以借助交联剂与介质连接。
在一些实施方案中,Fc受体借助二硫键、金属螯合、溴化氰、NHS连接、组氨酸标签、缩水甘油醚、环氧、三氟代乙烷磺酰氯连接、甲苯磺酰氯连接、EAH连接、ECH连接、活化巯基连接或硫丙基连接与介质连接。
介质例如,以0.01至15mg/ml的浓度包含Fc受体。在一些实施方案中,介质以2-10mg/ml的浓度(例如,3-7.5mg/ml、3-5mg/ml或5-7.5mg/ml)包含Fc受体。
在一些实施方案中,在使介质与加载流体接触之前用平衡溶液平衡介质。在许多实施方案中,平衡溶液以3.5至10的pH包含1至500mM的缓冲剂(例如,Tris、MES、HEPES、磷酸盐、组氨酸)和0至2000mM的盐(例如,NaCl、CaCl2)。
在多种实施方案中,加载流体以0.001至100mg/ml的浓度包含多肽。与介质接触的多肽的量可以是0.1至25,000mg多肽/mL介质。
在一些实施方案中,在方法中使用的一种或多种洗涤溶液以3.5至10的pH包含1至500mM的缓冲剂(例如,Tris、MES、HEPES、磷酸盐、组氨酸)和0至2000mM的盐(例如,NaCl,CaCl2)和/或添加物(例如,胍、脲、蔗糖)和/或溶剂(例如,乙醇、乙腈、聚乙二醇)。
在一些实施方案中,洗脱溶液具有2至5的pH和或0至2000mM的盐(例如,NaCl、CaCl2)和/或添加物(例如,胍、脲、蔗糖)和/或溶剂(例如,乙醇、乙腈、聚乙二醇)。
在一些实施方案中,使介质与一种或多种洗脱溶液在施加pH梯度(例如,从pH5.0至pH3.0的pH梯度)的条件下接触。
方法还可以包括中和洗脱物。
分离方法可以与其他分离方法联合使用。因而,在一些实施方案中,方法进一步包括使洗脱物与第二介质与接触,并且回收流过第二介质或从中洗脱的多肽。示例性第二介质可以包括离子交换介质、羟基磷灰石介质、蛋白A介质、疏水相互作用介质、固定的金属亲和介质、合成介质(生物模拟物)、凝集素或其组合。
方法还可以包括从洗脱物中的多肽或从已经流过介质的多肽产生药物组合物。
方法还可以包括分析从介质洗脱的多肽的特征。在一些实施方案中,分析来自多肽的寡聚糖(例如,通过从多肽切下N-寡聚糖、标记该寡聚糖并且检测标记的寡聚糖种类,分析N-连接寡聚糖)。
在一些实施方案中,分析多肽的生物活性。
在一些实施方案中,分析毒性、稳定性(例如,半寿期、货架期),或功效中的一者或多者(例如,与加载流体中的多肽、已经流过介质的多肽比较,或与参考比较)。
分析还可以包括分析加载流体中的多肽和/或已经流过介质的多肽(例如,为了与洗脱的多肽比较)。
可选地或额外地,方法还可以包括分析已经流过介质的多肽。
在一些实施方案中,分析多肽上的寡聚糖。
在一些实施方案中,分析毒性、稳定性(例如,半寿期、货架期),或功效中的一者或多者(例如,与加载流体中的多肽、已经从介质洗脱的多肽比较,或与参考比较)。
在一些实施方案中,分析多肽的生物活性。
本公开还特征在于一种组合物,其包含通过本文所述的方法回收的多肽。
在另一个方面,本公开提供一种方法,所述方法包括:(a)提供包含Fc受体的介质,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽的Fc结合部分;(b)使该介质与包含多肽的加载流体在使所述多肽与介质结合的条件下接触,其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc区;(c)使介质与洗脱溶液在使结合多肽从介质洗脱的条件下接触;和(d)回收从介质洗脱的结合多肽,从而产生洗脱物。
在一些实施方案中,Fc受体包含FcγRIII多肽的胞外结构域。
该方法可以包括本文所述的额外特征。
在上文概述的方法的一些实施方案中,加载流体可以包含血清IgG。
在又一个方面,本公开提供一种包含与固相支持物连接的Fc受体的介质,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽的Fc结合部分。
在一些实施方案中,固相支持物包括琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)。
在一些实施方案中,固相支持物包括珠、膜、块状物、纤维基质、多孔媒介或凝胶。
在另一个方面,本公开提供一种试剂盒,所述试剂盒包含(a)包含与固相支持物连接的免疫球蛋白Fc受体的介质,其中所述免疫球蛋白Fc受体包含选自FcγRI多肽、FcγRII多肽、FcγRIII多肽和FcγRIV多肽的Fc结合部分中的Fc结合部分;和(b)根据上文概述的任一种方法(如根据本公开的一个方面的分离加载流体中多肽糖型方法)的使用说明书。
在一些实施方案中,该试剂盒的固相支持物包括琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)。固相支持物可以包括珠、膜、块状物、纤维基质、多孔媒介或凝胶。
在附图和以下说明书中描述了本公开的某些实施方案的细节。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书和附图并且从权利要求书中显而易见。引用的全部专利和专利申请及参考文献通过引用的方式完整并入用于全部目的。
附图简述
图1是描述单克隆抗体制备物(顶部小图)和已经从FcγRIIIa受体介质洗脱的制备物(底部小图)的聚糖图的一组图。具有以‘F’结尾的标记物的全部峰均是岩藻糖化的并且具有不以‘F’结尾的标记物的全部峰均是非岩藻糖化的。
定义
“相应”:如本文所用,与参考序列中的氨基酸(或核苷酸)“相对应”的氨基酸(或核苷酸)占据与该参考序列中的位点同源的位点。可以通过比对相关序列来鉴定相应的氨基酸和核苷酸。使用本领域技术人员熟知的算法如BLAST、FASTA、ClustalW,序列可以与公共数据库中可获得的蛋白质序列比较。
如本文所用,“洗脱物”指已经暴露于介质并具有从该介质洗脱的产物的流体。
如本文所用,“免疫球蛋白Fc受体”或“Fc受体”指可以与免疫球蛋白Fc区(例如,天然Fc区)相互作用的多肽。Fc受体一般以至少105M-1(例如,至少106-109M-1)的亲和力(KA)与Fc区结合。在一些实施方案中,Fc受体包含天然Fcγ受体或其与天然Fcγ受体具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的变体的胞外部分。
如本文所用,“免疫球蛋白Fc受体结合部分”或“Fc受体结合部分”指包含可以与免疫球蛋白Fc受体相互作用的氨基酸的部分。在一些实施方案中,Fc受体结合部分包括Fc区。Fc区是免疫球蛋白重链的C端区域,并且通常包括免疫球蛋白(例如,IgG、IgA或IgD)的最后两个恒定区结构域或IgE或IgM的最后三个恒定区结构域。骆驼抗体缺少轻链,但是具有与常见免疫球蛋白相当的Fc区。Fc区也可以包括免疫球蛋白的恒定区结构域N端的柔性铰链区。人IgG重链Fc区通常限定为从第C226或P230位置(根据Kabat编号;见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列),第5版。公共卫生署,国家健康研究所,Bethesda,Md.(1991))至分子C末端的片段,虽然Fc区的界限可以变动。众多Fc区的氨基酸序列和核酸序列都是本领域已知的。
在多种实施方案中,Fc受体结合部分包括天然Fc结构域(例如,天然人Fc结构域)和其与Fc受体结合的部分和变体(例如,与天然Fc结构域具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的变体)。抗体和Fc融合蛋白是包含Fc受体结合部分的多肽的例子。
如本文所用,“负载”指含有目的产物的任何物质。“加载流体”指含有与介质接触的加载物质的液体(例如,用于流过含有该介质的柱的液体)。在一些实施方案中,加载流体是细胞培养基。可以将细胞培养基澄清(例如,以除去细胞或细胞残片)。在一些实施方案中,加载流体是源自层析步骤(例如,蛋白A层析步骤)的部分纯化的中间体。在一些实施方案中,加载流体是纯化的制备物。
如本文所用,“介质”指可以作为Fc受体的支持物用于分离多肽糖型的任何物质。
如本文所用,例如“偏好地结合”指Fc受体与Fc受体结合部分的糖型相互作用,意指该受体与一种糖型结合比它将与另一种糖型结合更容易(例如,与给定多肽的一种糖型结合比与相同多肽的另一种糖型结合更容易)。“偏好地与给定糖型结合”的受体将与另一种糖型相比更可能与该糖型结合,即便这种受体可以与另一种糖型结合。例如,如果某受体与多肽的第一糖型以这样的亲和力结合,所述亲合力比该受体结合该多肽的第二糖型的亲和力高至少50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍,则可以将该受体视为偏好地与该糖型结合。
术语“表位”指抗原或半抗原上与特定B细胞和/或T细胞反应的位点。该术语还与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换地使用。可以在简单的免疫测定法中鉴定出识别相同表位的抗体,所述免疫测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。
术语“核酸”涵盖DNA、RNA(例如,mRNA、tRNA)、异双链体和能够编码多肽的合成分子,并且包括本领域普通技术人员认为能够替换天然存在的核苷酸和其骨架的全部类似物和骨架取代物如PNA。核酸可以是单链或双链的,并且可以是化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用。因为遗传密码子是简并的,故多于一种密码子可以用来编码特定的氨基酸,并且本发明的组合物和方法包括编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。
除非另外说明,核酸从左至右以5'至3'方向书写;氨基酸序列从左至由以氨基至羧基方向书写。
如本文所用,术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义,并且互换使用。在此类氨基酸序列显示活性的情况下,可以称它们为“酶”。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。
如本文中所用,“合成”分子由体外化学合成或酶促合成产生而不由生物产生。
如本文中所用,术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
“基因”指编码多肽或RNA的DNA区段。
“分离的”多核苷酸或多肽是基本上不含在其天然环境中与之结合的物质的多核苷酸或多肽。基本上不含意指至少50%、有利地至少70%、更有利地至少80%并且甚至更有利地至少90%不含这些物质。
“分离”的核酸分子是一种核酸分子,其与该分子在自然界中存在的完整器官分离和分开;或是一种核酸分子,其完全或部分地缺少在自然界中通常与它结合的序列;或是一种序列,其如它在自然界中那样存在,但是具有与之结合的异源序列。
“天然”蛋白或多肽指从该蛋白质天然存在的来源分离的蛋白质或多肽。“重组”多肽指通过重组DNA技术产生的多肽;例如,从由编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞产生。“合成”多肽包括通过化学合成制备的那些多肽以及上文描述的合成抗原。
某些实施方案的详细描述
除非另外说明,本发明的实施方案可以采用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA和免疫学的常规技术,这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。此类技术在文献中有解释。见,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3本,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M等人(1995和定期更新;Current Protocols in Molecular Biology,第9、13和16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons;M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press;以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press.这些通用教材的每一本通过引用的方式并入本文。
用于分离的多肽
本文提供的方法和组合物可以用于分离多肽糖型。可以分离的多肽一般包括Fc受体结合部分(例如,免疫球蛋白Fc区或其与Fc受体结合的部分)。在一些实施方案中,用于分离的多肽包括抗体(例如,单克隆、多克隆、嵌合、人源化或人抗体)、Fc融合蛋白、抗体-药物结合物、单结构域抗体、小模块免疫药物(SMIP)、大抗体(maxibody)、微型抗体、胞内抗体、scFv、IgG-scFv双特异性抗体或含有Fc的微型抗体。也可以分离其他类型的与Fc受体结合的多肽、结合Fc受体的病毒多肽。
在多种实施方案中,本文提供的方法和组合物用于分离单克隆抗体制备物中的多肽糖型。在一些实施方案中,分离治疗性单克隆抗体。本公开适用的一个类别的治疗性多肽是认为其治疗功效至少部分地依赖ADCC或CDC触发能力的多肽。在一些实施方案中,治疗性多肽包括人IgG抗体。在一些实施方案中,人IgG抗体是IgG1。在一些实施方案中,人IgG抗体是IgG3。在一些实施方案中,人IgG抗体是IgG34。在一些实施方案中,多肽包含人抗体的Fc区,例如人IgG抗体(例如,IgG1、IgG3或IgG4抗体)的Fc区。在一些实施方案中,多肽是用来治疗癌症的多肽(例如,抗体)。
根据本文提供的方法分离的多肽(例如,抗体)包括与以下一种或多种靶分子特异性结合的多肽(以结合这些靶的多肽为例):淀粉样前体蛋白的Aβ片段(见,例如,美国专利7625560;例如,巴匹珠单抗(bapineuzumab));HER2/neu受体(例如,曲妥珠单抗(trastuzumab));CD20(例如,利妥昔单抗,奥法木单抗(ofatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、托西莫单抗(tositumomab));B细胞活化因子(BAFF)(例如,belimumab);TNFα(例如,阿达木单抗(adalimumab)、英夫单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab));CD52(例如,阿伦珠单抗(alemtuzumab));CD25(例如,巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab));VEGF(例如,贝伐珠单抗(bevacizumab));EGFR(例如,西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitimumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab));CD11a(例如,依法珠单抗(efalizumab));CD33(例如,吉妥珠单抗(gemtuzumab));CD3;α-4整联蛋白(例如,那他珠单抗(natalizumab));IgE(例如,奥马珠单抗(omalizumab));GDF-8(见,例如,美国专利公开号20040142382);IL-12R/IL-23R(p40)(例如,优特克单抗(ustekinumab));B7(例如,CTLA4-Ig,例如,阿巴西普(abatacept));补体C5(例如,依库珠单抗(eculizumab));血小板GpIIb/IIIa(例如,阿昔单抗(abciximab));磷脂酰丝氨酸(例如,巴维昔单抗(bavituximab));和pF-RSV(帕利珠单抗(palivizumab))。
根据本文所述的方法分离的多肽可以来自许多来源的任一种,所述来源包括但不限于源自培养表达多肽的重组细胞系的条件培养基、多肽生产细胞的细胞提取物、血清(例如,免疫的受试者的血清、已经暴露于感染介质的受试者的血清、(例如,通过免疫接种或天然暴露)已经形成针对感染介质的免疫力的受试者的血清、原初受试者的血清、人血清)、腹水、杂交瘤或骨髓瘤上清液,市售多肽制备物(例如,药品)和其他来源。在本公开的一个实施方案中,从多种产生多肽的重组细胞的条件化细胞培养基分离部分纯化的多肽。
在一些实施方案中,通过在重组细胞中表达产生了用于分离的多肽或用于根据本文描述的方法分离多肽的Fc受体。可以将编码用于分离的多肽或Fc受体的核苷酸序列插入载体中。术语“载体”由本领域普通技术人员广泛地使用并理解,并且如本文所用,术语“载体”以本领域普通技术人员相一致的含义使用。例如,术语“载体”常由本领域普通技术人用来指能够或促进核酸分子从一种环境转移至另一种环境或能够或促进核酸分子操作的载具。
例如,载体是另一个DNA区段可以与之连接从而引起所连接区段复制的复制子,如质粒、噬菌体或粘粒。“复制子”是在体内作为自主DNA复制单位发挥作用的任何遗传元件;即,能够在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如,质粒、染色体、病毒)。“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。“表达控制序列”是控制并调节另一个DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA,后者随后翻译成编码序列编码的蛋白质时,编码序列是“有效连接”的并且“处于细胞中转录控制序列及翻译控制序列的控制下”。
通常而言,表达载体与宿主结合使用,所述表达载体含有促进插入的DNA片段有效转录和翻译的启动子序列。表达载体一般含有复制起点,启动子、终止子以及能够在转化的细胞中提供表型选择的特定基因。当多核苷酸编码聚蛋白片段时,有利地是在载体中,起始密码子(ATG)置于可读框的5'处并且终止密码子置于3'处。可以具有用于控制表达的其他元件,如增强子序列、稳定序列和允许蛋白质分泌的信号序列。转化的宿主可以根据本领域已知的手段发酵和培养以实现最佳细胞生长。
根据本发明的实施方案可以使用允许本公开的多肽表达的任何载体。在某些实施方案中,本公开的多肽可以体外使用(如使用无细胞表达系统)和/或在体外培育的培养细胞中使用。对于这类应用,可以使用允许多肽在体外和/或在培养的细胞中表达的任何载体。
DNA“编码序列”是当置于适宜调节序列控制下时在体内转录并翻译成多肽的双链DNA序列。该编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括,但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如,哺乳动物)DNA的基因组DNA序列,和甚至合成的DNA序列。多聚腺苷化信号和转录终止序列将通常位于编码序列的3'。“cDNA”定义为副本DNA或互补DNA,其是来自mRNA转录物的逆转录反应产物。
转录控制序列和翻译控制序列是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列,如启动子、增强子、核糖体结合位点、上游调节结构域、多聚腺苷化信号、终止子等。“顺式作用元件”是与可以上调或下调特定基因座表达的其他蛋白质相互作用的核苷酸序列,还称作“共有序列”或“基序”。也可以随编码序列一起包含“信号序列”。这种序列编码多肽N端的信号肽,所述信号肽与宿主细胞沟通并且指引多肽至适宜的细胞位置。可以找到与原核生物和真核生物的多种天然蛋白质结合的信号序列。在重组载体中并不总是需求全部这些控制序列,只要能够转录和翻译所需的基因。
“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3'方向)编码序列转录的DNA调节区。启动子序列一般在其3'末端结合转起始位点并且向上游(5'方向)延伸以包括为了以高于背景的可检测水平启动转录所需要的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内部是转录起始位点,以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子经常,但是不总是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外,原核启动子还含有Shine-Dalgarno序列。
如本文中所用,术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”指在特定核苷酸序列处或其附近切割双链DNA的酶。
“重组DNA技术”指用于联合两个异源DNA分子的技术,通常是体外连接来自不同生物的DNA的结果。重组DNA分子通常由基因工程的实验产生。同义术语包括“基因剪接”、“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物产生“重组”或“重组分子”。
当外源或异源DNA导入细胞时,则细胞已经用此类DNA“转化”或“转染”。转化用DNA可以整合或可以不整合(共价连接)入细胞的基因组中。例如,在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中,转化用DNA可以维持在附加型元件如载体或质粒上。就真核细胞而言,稳定转化的细胞是这样一种细胞,其中转化用DNA已经整合至染色体中,从而该DNA由子代细胞借助染色体复制继承。这种稳定性由真核细胞建立细胞系或克隆的能力展示,其中所述细胞系或克隆由含有转化用DNA的子代细胞群体组成。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或祖细胞衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞克隆。已经用外源DNA转化的生物,如植物或动物,称作“转基因”。
DNA构建体的“异源”区域是较大DNA分子中的可辨认DNA区段,所述可辨认DNA区段在自然界中不与较大分子结合。因此,当异源区域编码哺乳动物基因时,基因将通常旁侧分布有在来源生物的基因组中不在哺乳动物基因组DNA旁侧分布的DNA。在另一个例子中,编码序列是一种在天然环境下于其中没有发现的构建体(例如,cDNA,基因组编码序列含有内含子,或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不产生如本文定义的异源DNA区域。例如,多核苷酸可以通过基因工程技术置于从不同来源衍生的质粒或载体中并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并与非天然序列的编码序列有效连接的启动子是异源启动子。
如本文所用,“片段”或“部分”如适用于基因或多肽时,将通常具有至少10个残基,更一般至少20残基并优选地至少30个(例如,50个)残基长度,但是小于完整的整序列。这些基因的片段可以由本领域技术人员已知的方法产生,例如,通过限制酶切消化天然存在的或重组的纤维基因或fibritin基因,通过重组DNA技术使用编码纤维基因或fibritin基因的给定片段的载体,或通过化学合成产生。
多种类型的细胞都可以用来产生重组蛋白。可以用重组DNA转化以表达目的蛋白(例如,单克隆抗体)的任何细胞都可以用于本公开的方法中。细胞可以来自多个物种,例如,真核物种,包括植物、酵母、线虫、蠕虫、昆虫、两栖类或哺乳动物,例如,人、灵长类、羊、牛、猪、马、猫、犬或啮齿类来源。在具体的实施方案中,细胞来自人或啮齿类。在具体的实施方案中,细胞来自仓鼠(例如,中国仓鼠卵巢细胞)。可以使用的哺乳动物细胞的例子包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/I,ECACC No:85110503);SP2/0;Balb/c3T3;人视网膜母细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,荷兰));由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL1651);人胚肾系(293细胞或经亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞,Graham等人,J.Gen Virol.,36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL10);中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc Natl Acad Sci USA,77:4216(1980));GS-CHO、CHO-K1、CHO-K1SV、CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-DUXB11、CHO-S);小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980));大鼠杂交瘤YB2/0(Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473,2003);猴肾细胞(CV1,ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL75);人肝细胞(Hep G2,HB8065);小鼠乳腺瘤(MMT060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982));MRC5细胞;FS4细胞和人肝瘤细胞系(Hep G2)。许多合适的细胞系都可以从保藏机构获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州。可以使用的植物细胞的例子包括青萍(Lemmna minor)(浮萍)细胞、拟南芥(Arabidopsis thalania)细胞和展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)(苔藓)细胞。可以使用的昆虫细胞的例子包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9和Sf21)细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(Tni和BTI-Tn5B1-4)细胞和甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)(Mb)细胞。可用的真菌细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。
本文所述的方法可以允许从具有任何样式的糖型表达的初始制备物中选择并富集多肽糖型,不需要选择专用宿主细胞或使用非常规条件或制备性步骤。然而,在一些情况下,可能有益的是采用多种方法以分离其中糖型表达改变的制备物,例如,从而以增加所需糖型的表达和/或减少不期望的糖型的表达。促进目的糖型富集的条件和分离模式组合可以允许以更高纯度水平或以比先前可能的更少步骤分离糖型。在一些实施方案中,通过宿主细胞对宿主的遗传操作使得参与糖基化途径(例如,催化添加或剪除糖部分的酶)的酶的表达增加或减少,从而改变糖型表达。这修饰可以包括导入、缺失和/或敲减编码糖基转移酶(例如,α-1,6-岩藻糖基转移酶)或糖苷酶的基因。通过破坏FUT8基因而缺少α-1,6-岩藻糖基转移酶表达的细胞例如在Yamani-Ohnuki等人,Biotechnol.Bioeng.87(5):614-622,2004和WO2009/009086中描述。已经描述了产生岩藻糖化减少的多肽的细胞变体(例如,CHO Lec13细胞,Shields等人,J.Biol.Chem.277(30):26733-26740,2002;和CHO Ms704,Kanda等人,Biotech.Bioeng.94(4):680-688,2006)。
低等真核生物(例如,真菌细胞)可以经工程化以产生具有作为哺乳动物细胞之特征的复杂糖基化的多肽。见例如Hamilton等人,Science313:1441-1443,2006,所述文献描述了经工程化以产生复杂末端唾液酸化糖蛋白的巴斯德毕赤酵母。还参见WO2002/000879、WO2004/074458、WO2004/074499、WO2004/074498和WO2005/100584。植物细胞(例如,青萍(Lemnaminor)或苔藓)可以经工程化以产生具有所需糖型(例如,缺少植物糖基化)的多肽(见,例如,Cox等人,Nat.Biotech.24:1591-1597,2006和Nechansky等人,Mol.Immunol.44:1815-1817,2007。
在一些实施方案中,在细胞中在改变糖基化的条件下产生多肽。例如,在细胞培养基中加入10-600nM锰可以产生更广泛的糖基化模式(美国专利公开2008/0081356)。在一些实施方案中,在细胞中在调节糖基化的物质存在的情况下产生多肽。例如,在一些实施方案中,使用糖修饰酶的抑制剂或激动剂。在一些实施方案中,抑制剂是核酸拮抗剂(例如,siRNA)。可以在体外(例如,细胞外部)酶促地改变多肽的糖基化,例如,通过用糖基转移酶或糖苷酶处理。
结合介质
Fc受体
根据本公开可以使用的Fc受体包括偏好地与一种或多种多肽糖型结合的受体。偏好地与一种或多种多肽糖型结合的受体的结合亲和力以比该受体与多肽的另一种糖型结合的亲和力高至少50%、100%、2倍(例如,5、10、20、30、40、50、75、100、150或200倍)。在一些实施方案中,Fc受体偏好地与缺少岩藻糖或具有减低水平岩藻糖的糖型结合(例如,具有低水平核心N-岩藻糖化或不存在核心N-岩藻糖化的糖型;例如,在一条或两条重链上缺少岩藻糖的抗体糖型)。例如,Fc受体可以包括FcγRIII多肽(例如,FcγRIIIa多肽或FcγRIIIb多肽)的胞外部分。在一些实施方案中,Fc受体偏好地结合唾液酸减少的糖型。在一些实施方案中,Fc受体偏好地结合含有高甘露糖的糖型。在一些实施方案中,Fc受体偏好地结合半乳糖化糖型。
在某些其他实施方案中,根据本公开使用的Fc受体包括以下述Fc受体:所述Fc受体与缺少岩藻糖或具有减低水平岩藻糖的多肽糖型(例如,具有低水平核心N-岩藻糖化或不存在核心N-岩藻糖化的糖型;例如,在一条或两条重链上缺少岩藻糖的抗体糖型)结合的KD比该Fc受体对岩藻糖化形式多肽的KD低3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。对于用在本发明的一些实施方案中的合适Fc受体的这类结合亲和力,见,例如,Herbst,R等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335(1):213-222(2010)和Shibata-Koyama,M等人,Exp.Hematol.37:309-321(2007)。
因此,申请人令人惊讶地发现,与某些糖型多肽(如非岩藻糖化多肽)结合时Fc受体的Koff率比与其他糖型仅高约5至10倍的Fc受体可以用于亲和纯化方法中以纯化糖型多肽,例如,从不同糖型多肽的混合物纯化非岩藻糖化多肽形式。在一个特定实施方案中,Fc受体如FcγRIIIa对非岩藻糖化抗体形式具有这样的结合亲和力,其涉及非岩藻糖化抗体与Fc受体的Koff速率,所述Koff速率并不必然地导致抗体的亲和纯化,例如通过包括使非岩藻糖化抗体结合Fc受体的亲和层析。在这些实施方案中,非岩藻糖化多肽保持与Fc受体结合,从而在用例如PBS缓冲液洗涤期间,它一般不掉落,但是当暴露于更严格的条件(例如pH梯度)时将脱落。对于根据本发明的一些实施方案令人惊讶地使得通过亲和层析纯化成为可能的Fc受体和糖型抗体结合Koff速率的例子,见Li,P等人,J.Biol.Chem.282(9):6210-6221(2007)。
FcγRIIIa(也称作CD16a或FCGR3A蛋白)是天然表达为膜蛋白和由蛋白酶剪切所产生的可溶解性受体的I型膜蛋白。全长FcγRIIIa在其胞外区内具有两个Ig样C2型结构域。FcγRIIIa与IgG的Fc区结合。已经表征了人FcγRIII多肽与人IgG1Fc结构域多肽的结构性结合(Sondermann等人,Nature406:267-273,2000)。FcγRIIIa结合复合的、聚集的和单体的IgG。FcγRIIIa介导抗体依赖性细胞毒性和其他抗体依赖性反应如吞噬。消除IgG1的岩藻糖增强了它对FcγRIIIa的亲和力并增强了它引起ADCC的能力(Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249,2004)。在一项研究中,IgG1以Ka=1.87x106M-1与FcγRIIIa(V176同种异型)结合,并且去岩藻糖化形式的IgG1以Ka=58.3x106M-1结合,根据使用BIAcoreTM生物传感器测量的结果,对于去岩藻糖化的IgG2、IgG3和IgG4也观察到了增强的FcγRIIIa亲和力和ADCC(Jefferis,Trends Pharm.Sci.30(7):356-362,2009)。FcγRIIIa的寡聚糖结构有助于其与去岩藻糖化抗体的增强结合作用。
在SEQ ID NO:1中显示全长人FcγRIIIa多肽的示例性氨基酸序列(还见万维网uniprot.org/uniprot/P08637,登录号P08637)。信号肽在约氨基酸1-16处。胞外结构域在氨基酸17-208之间。Ig样结构域存在于氨基酸24-105和107-189之间。残基230-254属于胞质。N-连接糖基化可以在残基56、63、92、180和187处出现。当移除第180位置处的寡聚糖时,受体对岩藻糖化IgG Fc和非岩藻糖化IgG Fc具有相同的亲和力(Jefferis,Nat.Rev.Drug.Disc.8:226-234,2009;Shibata-Koyama,上文)。仅移除FcγRIIIa的第63位置处糖基化增加了其对非岩藻糖化IgG的亲和力。移除除第180位之外的全部糖基化增加了对非岩藻糖化IgG的亲和力(Shibata-Koyama,上文)。移除除第180和63位之外的全部糖基化导致对非岩藻糖化IgG的亲和力高于针对野生型FcγRIIIa的亲和力,但是低于仅第180位置处糖基化时的亲和力(Shibata-Koyama,上文)。
表1.示例性全长FcγRIIIa氨基酸序列
FcγRIIIa的翻译后修饰包括高甘露糖和复杂寡聚糖(例如,在SEQ IDNO:1的残基56、63、92、180和187处)。FcγRIIIa具有多态性。天然氨基酸同种异型的例子包括在SEQ ID NO:1中具有以下氨基酸变化的多肽:L66H、L66R、G147D、Y158H、F176V和F203S。在第176位置处具有缬氨酸的同种异型比具有苯丙氨酸的同种异型更强烈地结合于IgG1、IgG3和IgG4(Koene等人,Blood90(3):1109-1114,1997;Wu等人,J.Clin.Inv.100(5):1059-1070,1997)。与携带FcγRIIIa F176的细胞相比,IgG1通过携带FcγRIIIa V176的细胞更有效的介导ADCC(Jeffries等人,Exp.Opin.Biol.Ther.7(9):1401-1413,2007)。
已经鉴定到人FcγRIIIa的直向同源物,例如,在黑猩猩(P.troglodytes)(见GenBank登录号XP_001174052.1)、猕猴(M.mulatta)(见GenBank登录号NP_001041713.1)、食蟹猴(M.fascicularis)(见GenBank登录号NP_001106117.1)、绿狒狒(P.anubis)(见GenBank登录号NP_001106117.1)、小家鼠(M.musculus)(见GenBank登录号NP_653142.1)、褐家鼠(R.norvegicus)(见GenBank登录号NP_997486.1)、家牛(B.Taurus)(见GenBank登录号NP_001070870.1)、狼(C.lupus)(见GenBank登录号XP_536141.2)、白顶白眉猴(Cercocebus torquatus atys)(红冠白眉猴(Red-crowned mangabey))(乌白眉猴(Sooty mangabey))(见GenBank登录号DQ423376mRNA.翻译:ABD83656.1)、东非狒狒(Papio anubis)(橄榄狒狒)(见GenBank登录号DQ423378mRNA.翻译:ABD83658.1)和其他物种中鉴定到。
用于如本文所述的介质中的Fc受体可以包括保留了与含有Fc的多肽的糖型的结合能力的FcγRIIIa多肽的胞外部分。例如,Fc受体可以具有与SEQID NO:1中所示序列的胞外结构域相同至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列,或与其部分(例如,包含SEQ ID NO:1的氨基酸21-209、氨基酸17-208、氨基酸21-192、氨基酸21-169或氨基酸106-169的部分)相同至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列。在多种实施方案中,Fc受体具有与FcγRIIIa序列的这些部分之一在至少1个氨基酸位置、但是不多于15个氨基酸位置上不同的序列(例如,该序列与SEQID NO:1的氨基酸21-209在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸位置处不同)。在多种实施方案中,Fc受体在与SEQ ID NO:1中N180相对应的位点处糖基化。在多种实施方案中,Fc受体在与SEQ IDNO:1中N63相对应的位点处缺少糖基化(例如,因置换天冬酰胺残基所致)。在多种实施方案中,Fc受体包含SEQ ID NO:1的氨基酸21-192,其中F176变成V176。在多种实施方案中,Fc受体包含SEQ ID NO:1的氨基酸21-192,其中将N63置换为另一种氨基酸(例如,置换成谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸)。
FcγRIIIb(也称作CD16b或FCGR3B蛋白)是与FcγRIIIa共有序列相似性的糖蛋白。全长RIIIb在其胞外区内具有两个Ig样C2型结构域。FcγRIIIb天然地表达为GPI锚定形式和通过蛋白酶剪切释放的分泌形式。岩藻糖化降低一些抗体对FcγRIIIb的亲和力(Bruhns等人,Blood113(16):3716-3725,2008)。
在SEQ ID NO:2中显示全长人FcγRIIIb多肽的示例性氨基酸序列(还见万维网uniprot.org/uniprot/O75015,登录号O75015)。信号肽在约氨基酸1-16位处。胞外结构域在氨基酸17-200之间。Ig样结构域存在于氨基酸40-96和121-179之间。氨基酸201-233可以在成熟形式中移除。N-连接糖基化可以在残基56、63、82、92、180和187处出现。脂化可以在氨基酸200处出现。
表2.示例性全长FcγRIIIb氨基酸序列
天然氨基酸同种异型的例子包括在SEQ ID NO:2中具有以下氨基酸变化的多肽:S36R、S65N、A78D、N82D、I106V。其他FcγRIIIb同种异型包括NA1和NA2。
用于如本文所述的媒介中的Fc受体可以包括保留了与含有Fc的多肽的糖型的结合能力的FcγRIIIb多肽的胞外部分。例如,Fc受体可以具有与SEQID NO:2中所示序列的胞外结构域相同至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列,或与其部分(例如,包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-208、氨基酸20-192、氨基酸21-169或氨基酸106-169的部分)相同至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列。在多种实施方案中,Fc受体具有与FcγRIIIb序列的这些部分之一在至少1个氨基酸位置、但是不多于15个氨基酸位置不同的序列(例如,该序列与SEQ ID NO:2的氨基酸20-208在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸位置处不同)。在多种实施方案中,Fc受体在与SEQ ID NO:2中N180相对应的位点处糖基化。在多种实施方案中,Fc受体在与SEQ ID NO:2中N63相对应的位点处缺少糖基化(例如,因置换天冬酰胺残基所致)。在一个实施方案中,Fc受体包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-192。在多种实施方案中,Fc受体包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-192,其中将N63置换为另一种氨基酸(例如,置换成谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸)。
FcγRIV是适用于本发明的一些实施方案中的另一种Fc受体并且在综述文章Nimmerjahn,F和Ravetch,J V Immunity24:19-28(2006)中描述。FcγRIV蛋白质序列的例子包括小鼠(登录号Q8R2R4)、大鼠(登录号Q6XPU4)和猕猴(登录号Q8SPW2)的那些蛋白质序列。如Nimmerjahn和Ravetch中所述,FcγRIV需要γ链用于其表面表达。FcγRIV在嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞上高度表达。它可以因炎性刺激如LPS和TH-1细胞因子如IFN-γ上调并且可以由TH-2细胞因子如IL-4和IL-10或TGF-β下调。见Nimmerjahn,F和Ravetch,JV Immunity24:19-28(2006)。小鼠FcγRIV具有对人FcγRIIIA相似的亲和力特性,其针对非岩藻糖化IgG的KD大约比针对岩藻糖化抗体的KD小十倍。见Herbs等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335(1):213-222(2010)。因而,FcγRIV受体是在根据本发明一些实施方案的方法用作亲和配体时用于富集非岩藻糖化种类的合适Fc受体的例子。
用于本文方法中的Fc受体可以在以下述形式产生受体的哺乳动物细胞或其他类型的细胞(例如,真核细胞如酵母细胞或昆虫细胞;见上文用于产生蛋白质的示例性宿主细胞)中表达,其中所述Fc受体形式保留了与Fc结合并偏好性结合糖型的能力。在某些实施方案中,Fc受体在原核细胞如细菌细胞,如大肠杆菌(E.coli.)中产生。在Fc受体在原核细胞如大肠杆菌中产生的实施方案中,可以修饰Fc受体,从而使它保留与Fc结合并偏好性结合糖型的能力,但是Fc受体本身不糖基化。Fc受体也可以从商业来源如R&DSystems(Minneapolis,MN)和Sino Biologicals,Inc.(北京,中国)获得。Fc受体可以随有利于纯化和/或偶联于介质的部分一起表达和/或用该部分修饰。在一些实施方案中,受体具有肽标签,例如,多组氨酸标签或HA标签。在一些实施方案中,受体在末端具有一个或多个氨基酸残基以促进偶联。在一些实施方案中,受体具有介导偶联的酶的识别基序,如由葡萄球菌分选酶A识别的LPXTG(SEQ ID NO:3)基序。在一些实施方案中,末端(例如,N末端)包含赖氨酸或半胱氨酸。可以包含将末端残基与Fc受体分隔的氨基酸接头。接头可以例如长1-20个氨基酸,例如长1、2、3、5、7、9、10、12、15或20个氨基酸。在多种实施方案中,接头包括3、4或5个相邻甘氨酸残基,任选地后续或前接丝氨酸残基。
受体可以在其N末端处包含KGGG(SEQ ID NO:4)或CGGG(SEQ IDNO:5)基序。
在一个例子中,Fc受体包含以下氨基酸序列:
KGGGEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQV(SEQID NO:6)。
在另一个例子中,Fc受体包含以下氨基酸序列:CGGGEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQV(SEQ IDNO:7)。
本公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸,它们具有指定的序列或与其基本上相同或相似的序列,例如,与指定序列相同至少85%、90%、95%或更高的序列。在氨基酸序列的情况下,术语“基本上相同”在本文中用来指第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列含有足够或最少数目的i)与第二氨基酸序列中对齐的氨基酸残基相同或ii)作为其保守性置换的氨基酸残基,从而第一和第二氨基酸序列可以具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如,将含有与指定序列具有至少约85%、90%。91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的共同结构域的氨基酸序列称作基本上相同的。
在核苷酸序列的情况下,术语“基本上相同”在本文中用来指第一核苷酸序列,所述第一核苷酸序列含有足够或最小数目的与第二核苷酸序列中对齐的核苷酸相同的核苷酸,从而第一和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽,或编码共同结构的多肽结构域或共同功能的多肽活性。例如,将与指定序列具有至少约85%、90%。91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列称作基本上相同的。
如下进行序列之间同源性或序列同一性(这些术语在本文中互换地使用)的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数,将所述序列出于最佳比较目的比对(例如,可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位,并且可以为比较目的而不考虑非同源序列)。在一个优选实施方案中,为比较目的所比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30%、优选地至少40%、更优选地至少50%、60%和甚至更优选地至少70%、80%、90%、100%。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则所述分子在这个位置处是相同的(如本文所用,氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。
考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度,两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的数目的函数。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中,使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得),使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中,使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得),使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
可以利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法((1989)CABIOS,4:11-17),使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12,空位罚分4,确定两个氨基酸序列和核苷酸序列之间的同一性百分数。
可以使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库进行检索,以例如鉴定其他家族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序,评分=100、字长度=12执行以获得与本发明一些实施方案的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明一些实施方案的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时,可以使用相应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
与本文所述序列的天然等位变体、同源物、直向同源物或其他相关序列(例如,旁系同源物)相对应的核酸分子可以基于它们与编码本文中公开的氨基酸序列的核酸的同源性进行分离,例如通过使用已知序列的全部或一部分作为探针,进行标准或严格杂交反应来分离。用于核酸杂交和克隆的这类方法是本领域熟知的。
如本文中提供的肽的同源物一般与这类肽具有结构相似性。多肽的同源物包含一个或多个保守性氨基酸置换,所述保守性氨基酸置换可以选自氨基酸所属类别的相同或不同成员。
在一个实施方案中,序列也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换,这产生沉默改变并且产生功能性等同的物质。可以基于残基极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性本质的相似性进行人为氨基酸置换,只要此物质的二级结合活性仍保留。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有相似亲水性值的具有不带电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明的一些实施方案还涵盖可能出现的保守性置换(置换和替换在本文中均用来意指现存氨基酸残基与可选残基的互换),例如,同质置换(like-for-like substitution)如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性置换等。非保守性置换也可以出现,例如,来自一个类别的残基对另一种残基的置换或可选地涉及引入非天然氨基酸如鸟氨酸(下文称作Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称作B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称作O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。保守性置换可以例如在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、脂族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)组内部做出。
产生Fc受体的介质
Fc受体可以通过多种技术的任一种与介质(例如,固相支持物)连接。在一些实施方案中,受体通过一个或多个共价键(例如,通过受体或介质上官能团的反应形成)与介质连接。官能团的例子包括羟基、胺基、巯基、硫丙基、羰基、N-羟琥珀酰亚胺(NHS)酯、环氧化物(例如表氯醇)、羰基二咪唑(CDI)活化酯、氰(溴化氰(CNBr))、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或醛。在一些实施方案中,Fc受体借助二硫键偶联。在一些实施方案中,使用金属螯合作用使Fc受体与介质连接。在一些实施方案中,使用组氨酸标签偶联Fc受体。可用于偶联的其他化合物包括甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、ECH连接(例如,使用ECH-赖氨酸琼脂糖凝胶4Fast Flow,GE Healthcare)或EAH连接(例如,使用4B,GE Healthcare)。在某些实施方案中,Fc受体通过其C末端与介质(例如,固相支持物)偶联。在某些实施方案中,Fc受体通过其N末端与介质(例如,固相支持物)偶联。
受体可以直接与介质连接或经接头间接地偶联。多种接头的任一种均适于使介质与受体偶联。在一些实施方案中,接头包括碳、氧和氮原子的链,例如,线性、分支或环状链,例如,具有1-30个碳原子的链。
使多肽与媒介偶联的方法例如在WO90/09237;Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,1992;美国专利号5,260,373;5,874,165;3,932,557;4,772,635;4,210,723;5,250,613;5,543,054;6,399,750;EP1352957A1和WO2004/074471中描述。
在一些实施方案中,受体与包含具有官能团如CNBr或NHS的琼脂糖和任选地接头的介质连接。在一些实施方案中,受体借助伯氨基与NHS活化的4Fast Flow偶联。在一个示例性方法中,通过以下方式偶联受体:用1mM HCl洗涤NHS活化的4Fast Flow介质,将该介质与受体混合,使偶联进行(例如,通过在室温温育1-4小时),用100mM Tris洗涤该介质以猝灭未反应的基团,。
酶介导的偶联作用可以用来将受体连接至介质(见,例如,Chan等人,PLoS ONE2(11):e1164,2007)。例如,可以将受体设计成包含识别转肽酶如葡萄球菌分选酶A的基序。由分选酶A识别并在LPXTG基序处切割产生了与可用甘氨酸或氨基亚甲基反应的酰基-酶中间体。如果具有识别基序的受体被分选酶A切割,则它与具有反应性位点的介质连接。在一个例子中,经修饰以包含一个、两个、三个或四个甘氨酸残基的珠通过分选酶A介导的连接作用与具有C端LPXTG基序的受体连接。
合适类型的媒介包括珠、膜、矩阵、多孔媒介、凝胶、平板、柱和块状物。介质可以由物质如琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)组成。
Fc受体介质与某个浓度的Fc受体偶联,所述浓度足以与含有Fc的多肽结合。在一些实施方案中,介质具有0.01-15mg/ml的Fc受体(例如,0.1-15mg/ml或1-15mg/ml)。在一些实施方案中,介质具有2-10mg/ml(例如,3-7.5mg/ml)之间的Fc受体。
分离方法
为分离多肽糖型,使加载流体与如本文所述的Fc受体介质在使所述多肽与该介质结合的条件下接触。将介质任选地洗涤,并且接触用于洗脱与介质结合的多肽的溶液。在一些实施方案中,回收从介质洗脱的多肽。在一些实施方案中,回收流过介质的多肽(例如,不被介质结合的多肽)。
加载流体可以例如是含有目的多肽的细胞培养基(例如,包含细胞的培养基,或从中移除细胞的培养基)、细胞提取物、血清、腹水、从细胞培养物、提取物、血清等纯化或部分纯化的制备物或配制的药品或药物。在一个特定实施方案中,加载流体包含血清IgG。在一些实施方案中,加载流体是蛋白A柱的洗脱物。加载流体可以含有浓度在0.001-500mg/ml(例如,0.001-100mg/ml、0.001-30mg/ml、0.001-10mg/ml)之间的多肽。多肽可以与浓度为每25,000ml介质0.1mg多肽的介质接触。
在使介质与加载流体接触之前,如果需要,可以调节参数如pH、离子强度和温度。可以通过将介质用溶液(例如,用于调节pH、离子强度等或用于引入洗涤剂的缓冲液)洗涤以对其进行平衡,从而获得允许或促进多肽结合和/或分离的特征。
在一些实施方案中,将Fc受体介质在与多肽接触之前用一种或多种溶液冲洗并平衡。这类溶液可以包含例如缓冲剂(例如,Tris、MES、HEPES、组氨酸或磷酸盐,例如在1-500mM、25-100mM或50mM),和/或盐(例如,NaCl、NaPO4、乙酸钠或CaCl2,例如,在0-2M或5-250mM)。平衡溶液的pH通常在3.5-10(例如,在pH6.0-8.0)。在一些实施方案中,平衡缓冲液含有10mM至约50mM的Tris或MES和10-200mM的盐(例如,150mM NaCl或20mM CaCl2)。
在Fc受体介质与加载流体接触后,可以洗涤结合的介质。洗涤溶液可以包含缓冲剂(例如,Tris、MES、HEPES、磷酸盐或组氨酸,例如,在1至500mM),和/或盐(例如,NaCl、CaCl2、NaPO4或乙酸钠,例如,在0至2M)和/或添加物(例如胍、脲、蔗糖、精氨酸或精氨酸衍生物)和/或溶剂(例如,乙醇、乙腈或聚乙二醇)。洗涤溶液通常具有3.5至10的pH(例如,4.5-8.0的pH)。
在一些实施方案中,将介质用与平衡介质所用相同的溶液洗涤。在一些实施方案中,将介质用1mM HEPES洗涤。
可以利用pH、盐类型、盐浓度、溶剂类型、溶剂浓度、置换剂类型、置换剂浓度或其组合的步骤或梯度变化,从Fc受体介质洗脱多肽。可以使用含有Fc区的蛋白质、其他蛋白质、与Fc区同源的小多肽、去垢剂、疏水性溶质、聚电解质、氨基酸、抗生素、糖、葡聚糖、ficoll、树枝状聚合物等作为置换剂。通常而言,为了从Fc受体介质洗脱多肽,使介质与洗脱缓冲液接触。在一些实施方案中,洗脱缓冲液含有盐(例如,NaCl或CaCl2,例如,0-2M,例如,10-100mM)。在一些实施方案中,洗脱缓冲液可以含有甘氨酸、乙酸或柠檬酸(例如,20mM-250mM,例如,150mM)。洗脱缓冲液也可以含有缓冲剂(例如,HEPES,例如,10-100mM)。洗脱缓冲液也可以含有乙酸(例如,20mM至约50mM)、添加物(例如胍、脲或蔗糖)和/或溶剂(例如,乙醇、乙腈、聚乙二醇,例如,1-10%溶剂,例如,5%溶剂)。洗脱缓冲液的pH可以是从约2.0至约4.0。在一些实施方案中,可以改变(例如,逐步)pH以产生梯度洗脱(例如,从H5.0至pH3.0的梯度洗脱)。在一个实施方案中,洗脱缓冲液的pH是约3.0。可以中和洗脱物,例如,从介质回收后,通过调节pH至6.0-8.0(在所用低pH洗脱的情况下)。
在洗脱多肽后,可以任选地清洁介质,即,剥离并再生。这可以定期地进行以使杂质在固相表面上的积累最小化和/或对基质消毒以避免产物被微生物污染。
可以根据本领域普通技术人员的知识调节溶液组分。下文实施例中提供样品溶液组成范围。并非全部溶液或步骤均是必需的,而提供以便说明。
使用Fc受体介质的分离可以单独或与其他技术组合进行。在一些实施方案中,使用一种或多种方法来制备加载流体,例如,以减少杂质或不纯物的加载负荷(load challenge)。在一些实施方案中,使用一种或多种方法来处理Fc受体介质的洗脱物或流过物。
可以与本文所述的Fc受体方法组合实施的纯化/分离技术包括深层过滤、透滤、超滤、病毒清除过滤、蛋白A层析、蛋白G层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、大小排阻层析、疏水相互作用层析、固定金属亲和层析、羟基磷灰石层析、凝集素层析、生物模拟物亲和层析、混合模式层析及它们的组合。本文的技术可以按柱、膜和/或扩张床吸附样式实施。在某些实施方案中,一种或多种色谱技术以弱区分模式运行(见美国公开号2007/0060741和Kelley BD,Tobler SA,Brown P,Coffman JL,Godavarti R,Iskra T,Switzer M,Vunnum S.Biotechnol Bioeng.2008Oct15;101(3):553-66)。
市售的蛋白A层析柱例如包括PROSEP-ATM柱(Millipore,英国)、蛋白A琼脂糖凝胶FAST FLOWTM柱(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)、TOYOPEARLTM650M蛋白A柱(TosoHass Co.,费城,Pa.)和MabSelectTM柱(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。
可以使用的阴离子交换树脂包括具有取代基如二乙基氨乙基(DEAE)、三甲基氨乙基(TMAE)、季氨乙基(QAE)和季胺(O)基的树脂。
可以使用的阳离子交换树脂包括具有取代基如羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)和磺酸基(S)的树脂。
在一些实施方案中,使用纤维素离子交换树脂(例如,从Whatman Ltd.Maidstone,Kent,UK可获得的DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32或CM-52)。用于纯化的基于Sephadex的交联离子交换剂例如包括DEAE-、QAE-、CM-和SP-Sephadex以及DEAE-、Q-、CM-和S-琼脂糖凝胶和琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)。DEAE和CM衍生化的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物如TOYOPEARLTM DEAE-650S或M和TOYOPEARLTMCM-650S或M从Toso Haas Co.,Philadelphia,Pa.可获得。
在一些实施方案中,疏水相互作用层析(HIC)树脂用于纯化。HIC基于疏水性分离分子。通常,将高盐缓冲液中的样品分子加载到HIC树脂上。缓冲液中的盐与水分子相互作用以减少溶液中的分子溶解,从而暴露样品分子中的疏水性区域,这些区域随后被HIC介质吸附。分子疏水性越强,促进结合所需要的盐越少。产物分子和HIC介质之间的结合相互作用因此取决于条件如介质的pH、离子强度和盐浓度。可以使用的市售HIC树脂包括包含与疏水性配体(例如,烷基或芳基)偶联的基体基质(base matrix)(例如,交联琼脂糖或合成性共聚物物质)的树脂。例子包括苯基SEPHAROSETM、6FAST FLOTM(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,瑞典);苯基SEPHAROSETMHighPerformance(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,瑞典);辛基SEPHAROSETMHigh Performance(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,瑞典);FractogelTMEMD丙基或FRACTOGELTMEMD苯基(E.Merck,德国);MACRO-PREPTM甲基或MACRO-PREPTM叔丁基支持物(Bio-Rad,CA);WP HI-丙基(C3)TM(J.T.Baker,N.J.);和TOYOPEARLTM醚,苯基或丁基(TosoHaas,Pa.)。HIC可以按弱区分模式进行。
在一些实施方案中,将羟基磷灰石层析用于纯化。羟基磷灰石层析利用式[Ca10(PO4)6(OH)2]的不溶性羟化磷酸钙作为基质和配体。官能团由成对带正电荷的钙离子(C-位点)和成簇带负电荷的磷酸酯基团(P-位点)组成。产物和羟基磷灰石介质之间的结合相互作用取决于多种条件,如介质的pH、离子强度和赋形剂浓度,如磷酸根浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度。市售多种羟基磷灰石层析树脂。羟基磷灰石层析可以按弱区分模式进行。
在一些实施方案中,将固定金属亲和层析(IMAC)树脂用于纯化。IMAC基于固定在树脂上的螯合过渡金属离子和加标签的目的产物上组氨酸残基的咪唑侧链之间的相互作用。分子的分离因加标签的目的产物和IMAC树脂上金属基团的反配体之间的竞争而发生。产物和金属-带电荷IMAC介质之间的结合相互作用取决于多种条件如介质的反配体水平(如咪唑浓度)和离子强度。市售多种IMAC树脂。IMAC可以按弱区分模式进行。
在一些实施方案中,将凝集素层析用于纯化(见,例如,Tojo等人,Biol.Pharm.Bull.32(9):1604-1608,2009;和Shinkawa等人,上文)。
多肽的表征
可以对使用本文所述的Fc受体媒介分离的多肽分析任何类型的特征,如聚糖量和/或结构、稳定性(例如,半寿期、货架期)、毒性和生物活性。可以分析处于分离过程任何阶段的多肽,例如,洗脱物和/或通过级分。可以例如通过将加载流体和洗脱物比较、或通过将加载流体和流过物比较,或通过相对于参比样品比较洗脱物,对糖型进行评估。
可以应用检测和表征聚糖的任何可用技术。例如,可以通过质谱法(MS)、色谱方法、电泳方法、核磁共振(NMR)及它们的组合分析聚糖结构。色谱方法可以包括高效液相色谱、液相色谱、超高效液相色谱、薄层层析和/或酰胺柱层析。MS可以包括串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸附电离MS(MALDI-MS)和/或电子转移解离MS(ETD-MS)。电泳方法可以包括毛细管电泳法,凝胶电泳(例如,在采用或不采用蛋白质印迹法检测聚糖和/或多肽结构物)。NMR可以包括1D-NMR、2D-NMR、相关性光谱法NMR、异核单量子相干NMR、异核多量子相干NMR、转动核奥氏核效应频谱NMR和/或奥氏核效应频谱NMR。
已经描述了用于分析聚糖的多种技术。见,例如Bigge等人(Anal.Biochem.230:229-238,1995),该文献描述了用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和2-邻氨基苯甲酸(2-AA)标记岩藻糖化和非岩藻糖化聚糖以便通过色谱手段和质谱分光光度手段检测的条件。还见Anamula等人,Anal.Biochem.350(1):1-23,2006;Townsend,R.R.Carbohydrate Analysis"High Performance LiquidChromatography and Capillary Electrophoresis.,编者Z.El Rassi,第181-209页,1995;和Ruhaak等人,Anal Bioanal Chem.397(8):3457-81,2010。
细胞中表达的多肽显示出异质性糖基化。给定多肽的分子可以在给定糖残基的数目和类型方面变动。本公开提供了用于分离糖型例如以便富集具有增加或减少的特定残基水平的多肽的媒介和方法。在一些实施方案中,如果岩藻糖残基的数目少于参考糖型上残基数目,糖型具有“降低”的特定糖(例如,岩藻糖)水平。在一些实施方案中,参考糖型是具有平均或最大数目的在给定细胞类型中表达的多肽上所观察到的特定糖残基的糖型。例如,如果CHO细胞中表达的抗体多肽具有最多两个核心岩藻糖残基,则具有0或1个核心岩藻糖的糖型具有“降低”的水平。
同样地,如果糖的数目高于参考糖型上残基的数目,糖型具有“增加”的特定糖水平。在一些实施方案中,参考糖型是具有平均或最少数目的特定糖残基的糖型。
可以通过任何可获得的手段检测用于评价分离的糖型,并且可以涉及分析加载流体、洗脱物、流过物、洗液或其组合中任一者的聚糖。
在一些实施方案中,Fc受体介质的洗脱物或流过物中糖型的百分数相对于加载流体改变(例如,增加或减少)至少20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中,Fc受体介质的洗脱物或流过物中糖型的比例增加到总量的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。例如,在一些实施方案中,使用本文所述的FcγRIII受体介质分离重组抗体样品产生了具有至少40%非岩藻糖化物质的洗脱物,而未经分离的样品(例如,加载流体)一般可以具有5-7%非岩藻糖化物质(取决于用于表达的细胞系统和其他因素)。
可以分析根据本文提供的方法所分离的多肽的结合作用。在一些实施方案中,分析与靶蛋白的结合作用(例如,抗体与抗原结合)。在一些实施方案中,分析与Fc受体的结合作用。用于评价结合相互作用的方法是已知的并且例如包括ELISA、BIACoreTM生物传感器分析、荧光共振能量转移(FRET)和其他。
可以使用评价多肽生物活性的任何可获得方法。在一些实施方案中,评价糖型特异性生物活性。可以通过已知的方法分析ADCC(见,例如,Shinkawa等人,上文)。作为使用本文介质分离的结果的一种或多种多肽糖型的相对比例的变化可以导致生物活性变化,如相对于加载流体或参比样品中多肽的活性,ADCC增加例如至少20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、或100倍。
产品和用途
本文中用于分离多肽的方法和组合物具有众多应用。多种方法都可以制备具有所需糖型谱的多肽。在一些实施方案中,多种方法用来富集目的糖型(例如,具有增强生物活性的糖型)。在一些实施方案中,多种方法用来归一化糖型谱(例如,在批次之间,或由不同方法产生的分子之间)。在一些实施方案中,多种方法用来提供糖型汇集物,其中可以对所述糖型汇集物评价任何所需的特征,如生物活性。控制糖型谱的能力可以实现对生产工艺的更大控制和灵活性。本发明技术是用于实现给定产品的批次间一致性的额外工具。它还可用于例如比较由不同方法和/或不同制造商制造的产品。另外,制造商可以使用该技术以匹配另一位制造商的产品的质量属性,例如,在开发生物类似产品时,或以改变(例如,增加或增强)后续产品的质量属性。
本公开还涉及根据本文所述方法制备的产物。在一些情况下,需要进一步分离和/或纯化根据本公开所分离的多肽并且根据标准方法将它们配制用于药物用途。见例如Protein Purification Principles and Practice第2版,Springer-Verlag,New York,1987;Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编著),以及Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编著),Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,第182卷),Academic Press,1997,所述文件通过引用的方式并入本文。本领域普通技术人员理解,使用的确切技术将根据多肽的特征而变动。具有药理活性的多肽将可用于制备药物。这些药物可以施用至受试者或可以首先配制以便通过任何可用途径递送,所述途径包括但不限于肠胃外(例如,静脉内)、皮内、皮下、口服、经鼻、支气管、眼、经皮(局部)、透粘膜、直肠和阴道途径。
根据本领域已知方法,将产物的药物组合物配制成与其预期施用途径相容,见例如,Remington:The Science&Practice of Pharmacy,第19版,Williams&Williams,(1995),和the Physician's Desk Reference,第52版,MedicalEconomics,Montvale,N.J.(1998)。在一些实施方案中,使用无菌水(例如,SWFI)、缓冲盐水(例如,磷酸盐缓冲盐水)、多元醇(例如,丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇)或其合适的混合物配制产物。
实施例
实施例1.
这个实施例描述FcγRIIIa受体介质的制备和使用mAb1(CHO细胞中产生的人源化IgG1单克隆抗体)的该介质的用途。
在HEK-293细胞中瞬时表达具有以下氨基酸序列的Fc-γRIIIa-176V(缬氨酸)同种异型受体胞外结构域:
EDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:8)
将受体连同细胞加工期间被切除的信号肽一起表达。在C端表达一个用于纯化的10-his标签,使用镍亲和柱进行所述纯化。
将Fc-γ受体(PBS中0.85mg/ml1.25ml)添加到活化的NHS琼脂糖凝胶TM4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)至0.73ml并允许在室温反应80分钟。将反应用100mM TRIS pH8.3猝灭。使用大小排阻层析法确定偶联效率是100%。将树脂装填到0.5cm内径(ID)柱(GE Healthcare)中至0.63mL并且用10ml100mM Tris pH8.3,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mMNaCl冲洗。将这种冲洗重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mM Tris pH7.7中。
将柱用50mM Tris150mM NaCl pH7.2冲洗并且以0.25ml/分钟(2.5分钟停留时间)用50ml在PBS缓冲液中的0.34mg/ml mAb1(27.0mg蛋白质/ml树脂)加载。用使用蛋白A层析柱和阴离子交换层析柱的双柱纯化工艺制备mAb1物质。在Fc受体柱上加载mAb1物质后,将该柱用12ml PBS以0.5ml/分钟冲洗并且用50mM HEPES pH3.0以0.5ml/分钟洗脱。收集mAb1(7.5ml中0.1mg),通过280nm处的吸光度和大小排阻层析测定。
为促进聚糖分析,使用16.5微升蛋白A树脂(GE MabSelect,17-5199-03),将洗脱的mAb1样品浓缩至115微升0.45mg/ml。使用96孔平板、PBS洗涤缓冲液、150mM甘氨酸洗脱缓冲液(pH3.0)和MES中和缓冲液(pH6.8),以分批模式进行蛋白A浓缩。
为确定非岩藻糖化mAb1的百分数,将大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。使用Xbridge酰胺HILIC-HPLC在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。
起始mAb1物质具有7%非岩藻糖化的Fc。在使用Fc受体柱富集后,mAb1物质具有61%非岩藻糖化的IgG Fc。图1显示mAb1的常见寡聚糖谱(顶部小图)和使用Fc受体柱富集后mAb1的图谱(底部小图)的例子。图1中具有以‘F’结尾的标记物的全部峰均是岩藻糖化的并且具有不以‘F’结尾的标记物的全部峰均是非岩藻糖化的。
实施例2
使用实施例1中描述的装填Fc受体柱来富集第二单克隆抗体mAb2(其为CHO细胞中产生的人源化IgG1)的非岩藻糖化糖型。mAb2物质从超滤汇集物获得,所述超滤汇集物来自使用以下条件的纯化过程:蛋白A层析柱、阴离子交换层析柱、病毒留置滤器(例如,Planova20滤器(Asahi KaseiCorporation,东京,日本))和超滤器。
将Fc受体柱用平衡缓冲液(50mM MES,含20mM CaCl2,pH6.5)冲洗并且以0.25ml/分钟(2.5分钟停留时间)用平衡缓冲液(142.9mg蛋白质/ml树脂)中的50ml1.80mg/ml mAb2加载。该柱随后以0.5ml/分钟用12ml平衡缓冲液冲洗并且以0.5ml/分钟用pH3.4的150mM甘氨酸洗脱。收集mAb2(9.25ml中0.12mg),通过280nm处的吸光度确定。用pH6.8的1MMES中和缓冲液使峰达到pH6.6。为促进聚糖分析,使用AmiconUltra-410,000kD MWCO装置(Millipore UFC801024),将mAb2样品浓集至100微升中0.87mg/ml。
使用实施例1中描述的方法确定非岩藻糖化的mAb2的百分数。起始mAb2物质具有约5%非岩藻糖化的Fc。在使用Fc受体柱富集后,mAb2物质具有48.7%非岩藻糖化的IgG Fc。
使用多个循环并且以较低加载负荷运行以最小化加工时间和物质废弃,使用与如上文相似的方法富集显著量的mAb2。将柱用平衡缓冲液(PBS)冲洗并以0.25ml/分钟(2.5分钟停留时间)加载平衡缓冲液中的1ml1.89mg/mlMAb2(3.0mg蛋白质/ml树脂)。该柱随后以0.5ml/分钟用12ml平衡缓冲液冲洗并且以0.5ml/分钟用pH3.4的150mM甘氨酸洗脱。这个过程重复39次,总计40个循环。使用15%v/v pH10.41M MES中和缓冲液,使总峰达到大致pH6.5。收集总计4.4mg的mAb2,通过280nm处的吸光度确定。为促进聚糖分析,使用Amicon Ultra-410,000kD MWCO装置(MilliporeUFC801024),将mAb2样品浓集至1.9ml中2.3mg/ml。
使用实施例1中描述的方法确定非岩藻糖化的mAb2的百分数。起始mAb2物质具有5.9%非岩藻糖化的IgG Fc和2.3%甘露糖化的IgG Fc。在使用Fc受体柱富集后,与媒介结合的mAb2物质具有41.8%非岩藻糖化的IgGFc和6.3%甘露糖化的IgG Fc。流过该柱的mAb2物质具有4.3%非岩藻糖化的IgG Fc和2.0%甘露糖化的IgG Fc。
实施例3
如实施例1中所述制备以Fc受体介质装填的柱。这种介质用来分析Fc受体和具有三重突变L234A、L235A和G237A的Fc融合蛋白之间的结合相互作用,其中已知所述三重突变阻止抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的诱导(第234、235、237氨基酸位置依据Kabat编号系统)。Fc融合蛋白物质从使用以下的三种柱纯化工艺获得:蛋白A层析柱、阴离子交换层析柱和具有阳离子特性和HIC特性的混合式层析柱。
将Fc受体柱用50mM MES150mM NaCl pH6.5冲洗并以0.25ml/分钟(3.0分钟停留时间)用50mM MES150mM NaCl pH6.5中的5ml2.0mg/mlFc融合物加载(15.6mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml50mM MES150mM NaCl pH6.5冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH3.0洗脱。将峰用15%尖峰(spike)的1M MES pH10.4中和。这个过程用不具有相应三重突变的MAb2重复,随后用三重突变Fc融合蛋白再次重复。比较由280nm处的吸光度测量的色谱图清晰地显示,低pH洗脱时的Fc融合物物质相对于未突变的MAb2不产生明显的峰。因此,三重突变蛋白不显著地与FcγRIIIA结合。
实施例4
这个实施例描述FcγRIIa受体介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
FcγRIIa受体与IgG1和其他IgG亚类结合。FcγRIIa受体的胞外结构域从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。该受体在NSO(鼠骨髓瘤)衍生的细胞中表达并且含有在C端表达的10-his标签。FcγRIIa受体的这个部分具有以下氨基酸序列(还见GenBank登录号#AAA35827):
AAPPK AVLKLEPPWI NVLQEDSVTL TCQGARSPES DSIQWFHNGNLIPTHTQPSY RFKANNNDSG EYTCQTGQTS LSDPVHLTVLSEWLVLQTPH LEFQEGETIM LRCHSWKDKP LVKVTFFQNGKSQKFSHLDP TFSIPQANHS HSGDYHCTGN IGYTLFSSKP VTITVQVPSMGSSSPMGI (SEQ ID NO:9)
将受体连同要被移除的N端信号肽一起表达并且分子的剩余部分是胞外结构域(Ala36至Ile218)。
将Fcγ受体(PBS中0.82mg/ml1.23ml)添加至0.82ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE Healthcare)并允许在室温反应60分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。使用大小排阻层析法确定的偶联效率是94%。将树脂装填到0.5cm ID柱(GE Healthcare)中至0.72mL并且用10ml100mM Tris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mMTris pH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.25ml/分钟(2.9分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml2.0mg/ml MAb2(13.9mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH2.6洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。将这个过程重复9次并且汇集十个峰以产生95.4μg mAb2,通过280nm处的吸光度和大小排阻层析测定。为促进聚糖分析,使用30kD MWCO超速离心膜,将mAb2样品浓集至150微升中0.51mg/ml。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。与加载物质相比,样品中岩藻糖化糖型的比例没有改变。加载物质和洗脱峰均具有约5%的岩藻糖化物质。
实施例5
这个实施例描述FcγRIIb/c受体介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
FcγRIIB/C受体与IgG1和其他IgG亚类结合。FcγRIIb/c受体的胞外结构域从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。该受体在NSO衍生的细胞中表达并且含有C端10-his标签,并具有以下氨基酸序列(还见GenBank登录号#P31994):
APPKA VLKLEPQWIN VLQEDSVTLT CRGTHSPESD SIQWFHNGNLIPTHTQPSYR FKANNNDSGE YTCQTGQTSL SDPVHLTVLSEWLVLQTPHL EFQEGETIVL RCHSWKDKPL VKVTFFQNGKSKKFSRSDPN FSIPQANHSH SGDYHCTGNI GYTLYSSKPV TITVQAP(SEQ ID NO:10)
将受体连同在N末端被切除的信号肽一起表达,并且分子的剩余部分是胞外结构域(Ala46至Pro217)。
将Fcγ受体(PBS中1.16mg/ml0.87ml)添加至0.82ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应60分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。使用大小排阻层析法确定的偶联效率是95%。将树脂装填到0.5cm ID柱(GE Healthcare)中至0.72mL并且用10ml100mMTris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mM Tris pH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.25ml/分钟(2.9分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml2.0mg/ml MAb2(13.9mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH2.3洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。将这个过程重复9次并且汇集十个峰以产生93.0μg mAb2,通过280nm处的吸光度和大小排阻层析测定。为允许聚糖分析,使用30kD MWCO超速离心膜,将mAb2样品浓集至100微升中0.74mg/ml。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。与加载物质相比,样品中岩藻糖化糖型的比例没有改变。加载物质和洗脱峰均具有约5%的岩藻糖化物质。
实施例6
这个实施例描述FcγRI受体介质的制备和具有mAb2的该介质的用途。
FcγRI受体与IgG1和其他IgG亚类结合。FcγRI受体的胞外结构域从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。在NSO衍生的细胞中表达的含有C端6-his标签的该受体具有以下氨基酸序列(还见GenBank登录号P12314):QVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNGTATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVSSRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWNSNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFPAPVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFYMGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVLKRSPELELQV LGLQLPTP(SEQ ID NO:11)
将Fc受体与从N末端切割的信号肽一起表达,并且剩余分子是在C末端上少4个残基的胞外结构域(Gln16Pro288)。
将Fc-γ受体(PBS中0.483mg/ml2.09ml)添加至0.42ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应180分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。使用大小排阻层析法确定的偶联效率是95%。将树脂装填到0.5cm ID GE healthcare柱中至0.38mL并且用10ml100mM Tris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mM TrispH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.15ml/分钟(2.5分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml2.0mg/ml MAb2(26.3mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH2.6和6ml150mM甘氨酸pH2.3洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。最终汇集物含有38.6μg mAb2,通过280nm处的吸光度测定。为进行聚糖分析,使用30kD MWCO超速离心膜,将mAb2样品浓集至100微升中0.39mg/ml。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。与加载物质相比,样品中岩藻糖化糖型的比例没有改变。加载物质和洗脱峰均具有约5%的岩藻糖化物质。
实施例7
这个实施例描述C1q介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
C1q是与IgG和IgM结合的补体蛋白。从血清制备的天然人C1q以纯的形式购买自EMD Biosciences,San DiegoCA(CAS编号80295-33-6)。
将C1q(PBS中1.17mg/ml0.85mll)添加至0.72ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应120分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。偶联效率不能通过大小排阻层析测定,原因在于C1q聚集的倾向性。将树脂装填到0.5cm ID柱(GE Healthcare)中至0.64mL并且用10ml100mM Tris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mMNaCl50mM Tris pH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.25ml/分钟(2.6分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml2.0mg/ml MAb2(15.6mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH3.0洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。最终汇集物含有7.5μg mAb2,通过280nm处的吸光度和大小排阻层析测定。由于产生的物质的量低,未进行聚糖分析。
实施例8
这个实施例描述DC-SIGN介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
一些文献显示DC-SIGN蛋白可以偏好地结合抗体的唾液酸化糖型(DC-SIGN andα2,6-sialylated IgG Fc interaction is dispensable for theanti-inflammatory activity of IVIg on human dendritic cells,Bayry,K Bansal,MD Kazatchkine,SV Kaveri;PNAS20091069E24)。在NSO衍生的细胞中表达的重组人DC-SIGN以纯的形式购自R&D Systems。表达胞外部分(Lys62Ala404)(见GenBank登录号Q9NNX6)。
将DC-SIGN(PBS中0.94mg/ml1ml)添加至0.82ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应60分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。使用大小排阻层析法确定的偶联效率是95%。将树脂装填到0.5cm ID柱(GE Healthcare)中至0.74mL并且用10ml100mMTris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mM Tris pH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.25ml/分钟(2.9分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml2.0mg/ml MAb2(13.9mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH3.0洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。将这个过程重复4次并且汇集5个峰以产生128.0μg mAb2,通过280nm处的吸光度和大小排阻层析测定。为进行聚糖分析,使用30kD MWCO超速离心膜,将mAb2样品浓集至125微升中1.02mg/ml。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。与加载物质相比,样品中岩藻糖化糖型的比例没有改变。加载物质和洗脱峰均具有约5%的岩藻糖化物质。
给定的DC-SIGN具有Ca++依赖性结合结构域,尝试分析荷载中的钙是否可能影响mAb2的结合作用。将Fc受体柱用50mM MES,150mM NaCl pH6.520mM CaCl2冲洗并以0.25ml/分钟(3.0分钟停留时间)用50mM MES150mM NaCl pH6.520mM CaCl2中的5ml2.0mg/ml mAb2加载(13.5mg蛋白质/ml树脂)。随后将柱以1ml/分钟用9ml50mM MES150mM NaCl pH6.520mM CaCl2冲洗。尝试以1ml/分钟进行三种洗脱:6ml50mM MES150mMNaCl pH6.5;6ml50mM MES150mM NaCl pH6.520mMEDTA和6ml150mM甘氨酸pH2.3。可选的洗脱条件均没有比采用150mM甘氨酸pH3.0所获得的峰更大的峰。因而,荷载中钙的存在和洗脱条件的变动在这项研究中不影响结合或回收。
实施例9
这个实施例描述FcγRIIIa受体介质的制备和使用具有mAb2的该介质对配体密度的优化。
FcγRIIIa从R&D Systems获得。该受体具有以下序列和6-His标签(还见GenBank登录号AAH17865,P08637[UniParc]):
GMRT EDLPKAVVFL EPQWYRVLEK DSVTLKCQGA YSPEDNSTQWFHNESLISSQ ASSYFIDAAT VDDSGEYRCQ TNLSTLSDPV QLEVHIGWLLLQAPRWVFKE EDPIHLRCHS WKNTALHKVT YLQNGKGRKYFHHNSDFYIP KATLKDSGSY FCRGLFGSKN VSSETVNITI TQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHH(SEQ ID NO:12)
在NSO衍生的细胞系中表达受体。该多肽不具有信号肽(残基1-16)并具有胞外残基Gly17-Gln208。
使用FcγRIIIA,进行微升规模的配体偶联实验以优化配体密度。将六等分试样的25μl活化NHS琼脂糖凝胶TM4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)添加至在底部具有0.45μm聚丙烯滤膜的96孔平板的800μl孔(SeahorseLabware F20023)。将树脂洗涤并用700μl1mM HCl活化并以1200x G离心3分钟。重复该过程总计三个洗涤循环。将不同体积的0.66μg/μl Fcγ RIIIA添加至每个孔中的25μl活化树脂以评价1.5-9.6μg FcγRIIIA/μl-NHS树脂的配体密度,包括其中不添加FcγRIIIA(原初树脂)的对照孔。在反应期间,将平板在室温在Tecan Teshake上以1200转/分钟振动2小时。
在反应后,将树脂用700μl100mM Tris pH8.3洗涤。将这种过程重复总计2个循环。在Tris洗涤后,使用700μl100mM乙酸盐pH4.0。随后将700μl100mM Tris pH8.3再次添加至每个孔以进一步猝灭反应,并且将平板冷却至2-8℃保存。在大约15小时后,将树脂用700μl1mM HEPES pH7.3洗涤两次。使用事先使用较大规格0.6mL柱富集至大约45%非岩藻糖化物的mAb2作为批结合实验的加载物质,其中所述柱用固定在活化NHS琼脂糖凝胶TM4Fast Flow树脂上的FcγRIIIA装填。将大约100μl0.88μg/μl mAb2添加至每个孔,并且将混合物在Teshake上以1200转/分钟振动20分钟。在加载步骤后,将平板离心并收集流过物。随后将树脂用700μl1mM HEPES pH7.2洗涤。随后将树脂用100μl150mM甘氨酸pH3.0洗脱3次。将负载物、流过物、洗液和洗脱级分用96孔板收集并使用UV在280nm和320nm测量。
表3中显示结果。如预期,原初树脂不显示明显的蛋白质结合。微孔树脂制备物的mAb2容量类似于装填柱中使用的较大树脂体积制备物(0.17μg/μl对0.20μg/μl)。通过以下方式计算利用百分数:首先将测量的MAb2容量除以FcγRIIIA配体密度,并且随后将这个值除以饱和容量时的理论值。如果一种抗体在每个FcγRIIIA分子上都结合,则每μg FcγRIIIA将结合3.5μg抗体。最佳利用率是大约10%。最佳配体密度就总mAb2容量/μl树脂而言和就利用百分数而言在3-7.5μg/μl。在一些实施方案中,制备介质并如此使用,从而使容量最大化(例如,以从加载流体获得大部分物质)。在一些实施方案中,制备介质并用来使Fc受体利用最大化。在一些实施方案中,制备介质并如此使用,从而使容量和利用率均最大化。
表3.使用微升树脂制备物的FcγRIIIA媒介优化。
实施例10
这个实施例描述FcγRIIIb受体介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
FcγRIIIB受体与IgG1和其他IgG亚类结合。FcγRIIIB受体的胞外结构域从R&D Systems获得。这种受体在NSO衍生的细胞中表达并且包含C端10-his标签。这种受体具有以下氨基酸序列(还见GenBank登录号#O75015;该序列包括Thr20-Gln208):
T EDLPKAVVFL EPQWYSVLEK DSVTLKCQGA YSPEDNSTQWFHNESLISSQ ASSYFIDAAT VNDSGEYRCQ TNLSTLSDPV QLEVHIGWLLLQAPRWVFKE EDPIHLRCHS WKNTALHKVT YLQNGKDRKYFHHNSDFHIP KATLKDSGSY FCRGLVGSKN VSSETVNITI TQGLAVSTISSFSPPGYQ(SEQ ID NO:13)
将PBS中的Fcγ受体(1.87mg/ml0.54ml)添加至0.54ml活化的NHS琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应60分钟。将反应用100mM TRIS pH8.5猝灭。将树脂装填到0.5cm ID柱(GE Healthcare)中至0.5mL并且用10ml100mM Tris pH8.5,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这个过程重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mM Tris pH7.7中。
将柱用PBS冲洗并以0.25ml/分钟(2.0分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的5ml1.96mg/ml MAb2(19.6mg蛋白质/ml树脂)。随后将该柱以1ml/分钟用9ml PBS冲洗并且以1ml/分钟用12ml150mM甘氨酸pH3.0洗脱。将峰用15%尖峰的1M MES pH10.4中和。将这个过程重复3次并且汇集4个峰以产生78μg MAb2,通过280nm处的吸光度测定。为进行聚糖分析,使用30kD MWCO超速离心膜,将mAb2样品浓集至200微升中0.39mg/ml。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。起始mAb2物质具有5.9%非岩藻糖化的IgG。在使用Fc受体柱富集后,mAb2物质具有约39.3%非岩藻糖化的IgG。
实施例11
这个实施例描述FcγRIIIa受体介质的制备和利用mAb2的该介质的用途。
FcγRIIIa从R&D Systems获得。该受体具有以下序列和6-His标签(还见GenBank登录号AAH17865,P08637[UniParc]):
GMRT EDLPKAVVFL EPQWYRVLEK DSVTLKCQGA YSPEDNSTQWFHNESLISSQ ASSYFIDAAT VDDSGEYRCQ TNLSTLSDPV QLEVHIGWLLLQAPRWVFKE EDPIHLRCHS WKNTALHKVT YLQNGKGRKYFHHNSDFYIP KATLKDSGSY FCRGLFGSKN VSSETVNITI TQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHH(SEQ ID NO:14)
在NSO衍生的细胞系中表达受体。该多肽不具有信号肽(残基1-16)并具有胞外残基Gly17-Gln208。
将Fc-γ受体(PBS中0.81mg/ml1.3ml)添加至0.64ml活化的NHS琼脂糖凝胶TM4Fast Flow树脂(17-0906-01,GE)并允许在室温反应65分钟。将反应用100mM TRIS pH8.3猝灭。使用大小排阻层析法确定的偶联效率是93%。将树脂装填到0.5cm内径(ID)柱(GE Healthcare)中至0.55mL并且用10ml100mM Tris pH8.3,随后用10ml100mM乙酸盐pH4.0连同500mM NaCl冲洗。将这种冲洗重复2次并且将柱保存在16%乙醇、150mM NaCl50mMTris pH7.7中。
将柱用PBS以1.0ml/分钟冲洗并以0.15ml/分钟(3.7分钟停留时间)加载PBS缓冲液中的1.0ml0.77mg/ml MAb2(1.4mg蛋白质/ml树脂)。mAb2物质从常规超滤汇集物获得,所述超滤汇集物来自使用以下条件的完全纯化过程:蛋白A层析柱、阴离子交换层析柱、病毒留置滤器(例如,Planova20滤器(Asahi Kasei Corporation,东京,日本))和超滤器。
随后将Fc受体柱以1.0ml/分钟用12ml PBS冲洗并且以1.0ml/分钟用150mM甘氨酸pH洗脱。重复这个过程28次。总洗脱汇集物具有1.8mg并且流过物具有15.6mg,通过280nm处的吸光度测定。
为确定mAb2的聚糖谱,大约35μg来自流过物汇集物的IgG在37℃用PNGase F消化16小时以释放Fc-寡聚糖。将释放的N-连接寡聚糖在65℃用2-AB标记3小时。使用丙酮沉淀法移除残余2-AB。在Xbridge酰胺HILIC-HPLC上在45℃于线性甲酸铵梯度范围内采用荧光检测进行寡聚糖分析。
起始mAb2物质具有5.4%非岩藻糖化的Fc和1.9%甘露糖化的Fc。Fc受体柱偏好地结合非岩藻糖化的IgG Fc和甘露糖化的IgG Fc。流过该柱的mAb2耗尽非岩藻糖化和甘露糖化的IgG Fc。MAb2流过物具有2.1%非岩藻糖化的IgG Fc和1.1%甘露糖化的IgG Fc。在这种情况下未测量与Fc受体柱结合的物质的聚糖谱。
利用不超出常规的实验,本领域那些普通技术人员会认识到,或将能够确定与本文中所述的本公开具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不意在限于上述说明书。替代性方法和材料和额外的应用将对本领域技术人员是显而易见的,并且意在涵盖于以下权利要求范围内。
Claims (75)
1.一种分离加载流体中多肽糖型的方法,所述方法包括:
(a)提供包含免疫球蛋白Fc受体的介质;
(b)使所述介质与包含多肽的加载流体在使所述多肽与免疫球蛋白Fc受体结合的条件下接触,其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc受体结合部分,其中所述加载流体包含所述多肽的多种糖型,并且其中所述Fc受体偏好地结合一种或多种糖型;
(c)使介质与洗脱溶液在使结合多肽从介质洗脱的条件下接触;和
(d)回收从介质洗脱的结合多肽,从而产生洗脱物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体与第一糖型以下述亲和力结合,所述亲和力比所述Fc受体与另一种糖型结合的亲和力高至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或150倍。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法包括在使介质与洗脱溶液接触之前,使介质与一种或多种洗涤溶液接触。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法包括回收流过介质的多肽。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述方法包括将介质以其多肽容量的5-1900%加载。
6.根据权利要求1所述的方法,其中加载流体包含细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的方法,其中加载流体包含已经通过一种或多种离子交换层析法纯化的流体。
8.根据权利要求1所述的方法,其中加载流体包含药用药品或药物。
9.根据权利要求1所述的方法,其中免疫球蛋白Fc受体结合部分包含免疫球蛋白Fc区。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽包括抗体。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽包括Fc融合蛋白。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽包括选自以下的一种或多种多肽:单结构域抗体、大抗体、微型抗体、胞内抗体、小模块免疫药物(SMIPs)、IgG-scFv双特异性抗体、抗体-肽结合物、抗体-药物结合物和病毒或病毒衣壳上Fc受体结合多肽。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽在哺乳动物细胞中产生。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽在真菌细胞中产生。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽在昆虫细胞中产生。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽在植物细胞中产生。
17.根据权利要求13所述的方法,其中所述多肽在CHO细胞中产生。
18.根据权利要求13所述的方法,其中所述多肽在NS0细胞中产生。
19.根据权利要求13所述的方法,其中所述多肽在Sp2/0细胞中产生。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体偏好地与具有减少的岩藻糖的糖型结合。
21.根据权利要求20所述的方法,其中Fc受体偏好地与具有减少的核心N-岩藻糖的多肽糖型结合。
22.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体偏好地与具有增加的高甘露糖寡聚糖的多肽糖型结合。
23.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体糖基化。
24.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽或FcγRIV多肽的Fc结合部分。
25.根据权利要求21所述的方法,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽或FcγRIV多肽的胞外结构域。
26.根据权利要求24所述的方法,其中所述Fc受体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸残基21-209相同至少85%的序列。
27.根据权利要求25所述的方法,其中FcγRIII多肽的胞外结构域是V176同种异型。
28.根据权利要求25所述的方法,其中所述Fc受体包含全长FcγRIII多肽。
29.根据权利要求1所述的方法,其中所述加载流体包含偏好地与Fc受体结合的第一糖型,并且其中洗脱物中第一糖型的百分数相对于加载流体中增加至少20%。
30.根据权利要求29所述的方法,其中洗脱物中第一糖型的百分数相对于加载流体中增加至少50%、100%、2倍、5倍、10倍或20倍。
31.根据权利要求29所述的方法,其中洗脱物中第一糖型的百分数是至少20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。
32.根据权利要求29所述的方法,其中第一糖型是非岩藻糖化糖型。
33.根据权利要求29所述的方法,其中第一糖型是缺少唾液酸化的糖型或具有减少的唾液酸化的糖型。
34.根据权利要求29所述的方法,其中第一糖型是半乳糖化糖型。
35.根据权利要求29所述的方法,其中第一糖型是具有高甘露糖寡聚糖的糖型。
36.根据权利要求1所述的方法,其中所述洗脱物包含从介质洗脱的结合多肽的一个或多个级分。
37.根据权利要求1所述的方法,还包括将洗脱物分级。
38.根据权利要求1所述的方法,其中所述加载流体包含不偏好地与Fc受体结合的第二糖型,并且其中洗脱物中第二糖型的百分数相对于加载流体中而减少。
39.根据权利要求1所述的方法,其中洗脱物中多肽的生物活性相对于加载流体中多肽的活性发生了改变。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述生物活性包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),并且其中ADCC增加。
41.根据权利要求4所述的方法,其中已经流过介质的多肽的生物活性相对于加载流体中多肽的活性发生了改变。
42.根据权利要求1所述的方法,其中所述介质包括珠、膜、块状物、纤维基质、多孔媒介或凝胶。
43.根据权利要求1所述的方法,其中所述介质包括琼脂糖、纤维素、或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)。
44.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体通过交联剂或酶介导偶联作用与介质连接。
45.根据权利要求1所述的方法,其中所述Fc受体通过二硫键、金属螯合、溴化氰、NHS连接、组氨酸标签、缩水甘油醚、环氧、三氟代乙烷磺酰氯连接、甲苯磺酰氯连接、EAH连接、ECH连接、活化巯基连接或硫丙基连接与介质连接。
46.根据权利要求1所述的方法,其中所述介质包含浓度为0.1至15mg/ml的Fc受体。
47.根据权利要求1所述的方法,其中在使所述介质与加载流体接触之前,所述介质用包含1至500mM的缓冲剂和0至2000mM的盐、pH为3.5至10的平衡溶液平衡。
48.根据权利要求1所述的方法,其中所述加载流体包含浓度为0.001至100mg/ml的多肽。
49.根据权利要求1所述的方法,其中与介质接触的多肽的量是0.1至25,000mg多肽/mL介质。
50.根据权利要求3所述的方法,其中所述一种或多种洗涤溶液pH为3.5至10,包含1至500mM的缓冲剂和0至2000mM的盐,和/或添加物和/或溶剂。
51.根据权利要求1所述的方法,其中洗脱溶液具有2至5的pH和/或0至2000mM的盐,和/或添加物和/或溶剂。
52.根据权利要求1所述的方法,其中所述介质在施加pH梯度的条件下与一种或多种洗脱溶液接触。
53.根据权利要求1所述的方法,还包括中和洗脱物。
54.根据权利要求1所述的方法,还包括使洗脱物与第二介质接触,和回收流过第二介质或从中洗脱的多肽。
55.根据权利要求54所述的方法,其中第二介质包含离子交换介质、羟基磷灰石介质、蛋白A介质、疏水相互作用介质、固定的金属亲和介质、合成介质(生物模拟物)、凝集素或其组合。
54.根据权利要求1所述的方法,还包括从洗脱物中的多肽产生药物组合物。
55.根据权利要求4所述的方法,还包括从已经流过介质的多肽产生药物组合物。
56.根据权利要求1所述的方法,还包括分析从介质洗脱的多肽的特征。
57.根据权利要求56所述的方法,其中分析来自多肽的寡聚糖。
58.根据权利要求56所述的方法,其中分析多肽的生物活性。
59.根据权利要求56所述的方法,其中分析毒性、稳定性或功效的一者或多者。
60.根据权利要求56所述的方法,其中分析进一步包括分析加载流体中的多肽和/或已经流过介质的多肽。
61.根据权利要求4所述的方法,其中所述方法包括分析已经流过介质的多肽。
62.根据权利要求61所述的方法,其中分析多肽上的寡聚糖。
63.根据权利要求61所述的方法,其中分析毒性、稳定性或功效的一者或多者。
64.根据权利要求61所述的方法,其中分析多肽的生物活性。
65.组合物,其包含通过权利要求1所述的方法回收的多肽。
66.一种方法,包括:
(a)提供包含Fc受体的介质,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽的Fc结合部分;
(b)使介质与包含多肽的加载流体在使所述多肽与介质结合的条件下接触,其中所述多肽包含免疫球蛋白Fc区;
(c)使介质与洗脱溶液在使结合多肽从介质洗脱的条件下接触;和
(d)回收从介质洗脱的结合多肽,从而产生洗脱物。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽的胞外结构域。
68.一种包含与固相支持物连接的Fc受体的介质,其中所述Fc受体包含FcγRIII多肽的Fc结合部分。
69.根据权利要求68所述的介质,其中所述固相支持物包括琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)。
70.根据权利要求68所述的介质,其中固相支持物包括珠、膜、块状物、纤维基质、多孔媒介或凝胶。
71.根据权利要求1或66所述的方法,其中加载流体包含血清IgG。
72.根据权利要求1所述的方法,其中所述免疫球蛋白Fc受体选自由以下组成的组:FcγRIIIa V176、FcγRIIIa F176、FcγRIIIb NA1、FcγRIIIb NA2、FcγRIIa H131、FcγRIIa R131、FcγRIIb I232和FcγRIIb T232。
73.一种试剂盒,其包含(a)包含与固相支持物连接的免疫球蛋白Fc受体的介质,其中所述免疫球蛋白Fc受体包含选自FcγRI多肽、FcγRII多肽、FcγRIII多肽和FcγRIV多肽的Fc结合部分中的Fc结合部分;和(b)根据权利要求1所述方法的使用说明书。
74.根据权利要求73所述的试剂盒,其中所述固相支持物包括琼脂糖、纤维素或葡聚糖、陶瓷、金属、玻璃、尼龙、特富龙、尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、氟烃(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯基醚))、聚乙烯、聚丙烯酸酯或聚(噁唑酮)。
75.根据权利要求73所述的试剂盒,其中固相支持物包括珠、膜、块状物、纤维基质、多孔媒介或凝胶。
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