KR20140062469A - 폴리펩티드 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 Fc 수용체를 포함하는 매질을 사용하여 폴리펩티드 당형태(glycoform)를 분리하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 매질은 Fc 감마 RIII 수용체의 세포외 부분을 포함하는 Fc 수용체를 포함한다.

Description

폴리펩티드 분리 방법{POLYPEPTIDE SEPARATION METHODS}

관련 출원

본원은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는, 2011년 7월 20일자로 출원된 미국 가출원 제61/509,746호의 이익을 주장한다.

대다수의 막 단백질 및 분비 단백질은 글리코실화된다. 많은 경우, 올리고사카라이드의 존재 및 특징은 당단백질의 폴딩, 안정성, 위치, 리간드 상호작용 및 생물학적 활성에 영향을 미친다. 예를 들면, 항체는 전형적으로 복잡한 N-연결된 올리고사카라이드를 갖는다. 이들은 복잡한 올리고사카라이드 쇄의 푸코스, 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민 및/또는 시알산의 수준에서의 변경으로 인해 고도로 불균질할 수 있다(Jefferis, Trends Pharm. Sci. 30(7):356-362, 2009).

혈청 및 재조합 항체는 전형적으로 당형태(glycoform)들의 혼합물을 함유한다. 일부 항체 당형태는 백혈구 상의 Fc 수용체, 예컨대, Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, Fc 감마 RIII 및 C1q에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 것으로 관찰되었고, 이러한 친화성은 이펙터 기능을 변경시킬 수 있다. 올리고만노스 유형 올리고사카라이드를 갖는 항체는 향상된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 감소된 C1q 결합을 나타낸다(Crispin et al., J. Mol. Biol. 387:1061-1066, 2009). 갈락토실화의 제거는 C1q 결합 및 다른 Fc 수용체와의 결합을 감소시킨다(상기 문헌(Crispin et al.); Kobata, Biochim. Biophys. Acta 1780:472-478, 2008). 말단 시알산은 Fc 감마 수용체에 대한 항체의 친화성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Jefferis, Nat. Rev. Drug. Disc. 8:226-234, 2009; Walsh et al., Nat. Biotech. 24(10):1241-1252, 2006).

일차 코어 N-아세틸글루코스아민 상의 푸코스를 결여하는 항체 형태는 코어 푸코실화된 형태에 비해 Fc 감마 RIIIa에 대한 증가된 친화성을 갖고, ADCC를 유발하는 증가된 능력도 갖는다(Jefferis, Exp. Opin. Biol. Ther. 7(9):1401-1413, 2007; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Shibata-Koyama et al., Glycobiol. 19(2): 126-134, 2009). 비푸코실화된(afucosylated) 형태는 푸코실화된 형태에 비해 항원, C1q, Fc 감마 RI 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 필적할만한 친화성을 갖고 Fc 감마 RIIa 및 Fc 감마 RIIb에 대한 약간 더 큰 친화성을 갖는다(Jefferis, Exp. Opin. Biol. Ther. 7(9):1401-1413, 2007; Satoh et al., Exp. Opin. Biol. Ther. 6(11):1161-1173, 2006; 상기 문헌(Kobata)). 리툭시맙 및 트라스투주맙의 비푸코실화된 형태는 향상된 시험관내 및 생체외 ADCC를 갖는다(Jefferis, Exp. Opin. Biol. Ther. 7(9):1401-1413, 2007; Jefferis, Trends Pharm. Sci. 30(7):356-362, 2009; 상기 문헌(Satoh)). Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, Fc 감마 RIII 및 C1q 수용체는 Fc 폴리펩티드의 힌지 영역 또는 힌지 인접 영역과 상호작용하는 것으로 보고되어 있다. Fc 감마 RIII에 대한 비푸코실화된 IgG Fc의 증가된 친화성은 결합의 입체 억제를 감소시키는 Fc의 입체구조적 변화에 기인할 수 있다(상기 문헌(Kobata); 상기 문헌(Satoh)).

요약

본 개시내용은 특히, 폴리펩티드 당형태를 분리하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에서 제공된 방법의 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합하는 Fc 수용체 매질을 사용하여 Fc 수용체 결합 모이어티(moiety)를 갖는 폴리펩티드를 분리한다. 폴리펩티드 당형태의 분리는 다양하게, 예컨대, 원하는 당형태 프로파일을 갖는 조성물을 제조하는 방법, 원하는 생물학적 및/또는 치료 활성을 보유하는 특정 당형태를 농축하는 방법, 및 예를 들면, 폴리펩티드 제제의 특징규명을 허용하는 분석 방법에서 적용된다.

글리코실화는 기능, 안정성, 및 폴리펩티드 생화학의 다른 중요한 양태와 관련되어 있다. 본 기술에 의해 제공된 이점은 폴리펩티드 생성물의 개발, 제조 및 용도(예를 들면, 치료 용도)에 영향을 미칠 수 있다. 당형태를 분리하는 능력은 생성물 가변 품질 속성에 대한 보다 큰 조절을 가능하게 하여, 일관된 제조 및 임상/규제 분석을 용이하게 하고 몇몇 경우 치료 효능에 영향을 미친다.

따라서, 한 양태에서, 본 개시내용은 적재(load) 유체에서 폴리펩티드 당형태를 분리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들면, (a) 면역글로불린 Fc 수용체를 포함하는 매질을 제공하는 단계; (b) 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 수용체에 결합하는 조건 하에 상기 매질을 상기 폴리펩티드를 포함하는 적재 유체와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 수용체 결합 모이어티를 포함하고, 상기 적재 유체가 상기 폴리펩티드의 복수의 당형태들을 포함하고, 상기 Fc 수용체가 상기 당형태들 중 하나 이상에 우선적으로 결합하는 것인 단계; (c) 결합된 폴리펩티드가 상기 매질로부터 용출되는 조건 하에 상기 매질을 용출 용액과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 매질로부터 용출되는 결합된 폴리펩티드를 회수하여 용출물을 생성하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 또 다른 당형태에 결합하는 친화성보다 2배, 5배, 10배, 20배, 30배 이상, 40배, 50배, 100배 또는 150배 이상 더 큰 친화성으로 제1 당형태에 결합한다.

몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 매질을 용출 용액과 접촉시키기 전에 상기 매질을 하나 이상의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 상기 방법은 매질을 관통하여 유동하는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 매질은 그의 폴리펩티드 용량의 1% 내지 3000%(예를 들면, 5% 내지 1900%, 5% 내지 100% 또는 100% 내지 1900%)로 적재된다. 매질은 관통 유동물로부터 상기 매질에 결합하는 당형태의 선택적 고갈을 가능하게 하는 용량으로 적재될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 관통 유동물 분획 중의 일부 당형태, 예를 들면, 감소된 수준의 푸코스를 갖는 당형태(예를 들면, 비푸코실화된 당형태)의 수준은 적재물 중의 상기 수준의 95%, 90%, 75%, 50%, 25%, 10% 또는 5% 미만이다.

적재 유체는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 세포 배양 배지(예를 들면, 미정제 또는 여과된 세포 배양 배지, 세포를 포함하는 세포 배양 배지, 세포가 제거된 세포 배양 배지)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환, 음이온 교환), 단백질 A 크로마토그래피, UF/DF, 바이러스 감소 여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 또는 이들의 조합에 의해 정제된 유체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 적재 유체는 약학 약품 또는 약물을 포함한다.

면역글로불린 Fc 수용체 결합 모이어티는 예를 들면, 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체 결합 모이어티는 천연 면역글로불린 Fc 영역, 또는 Fc 수용체에 결합하는 능력을 보유하는 이의 부분 또는 변이체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 수용체는 Fc 감마 RIIIa V176, Fc 감마 RIIIa F176, Fc 감마 RIIIb NA1, Fc 감마 RIIIb NA2, Fc 감마 RIIa H131, Fc 감마 RIIa R131, Fc 감마 RIIb I232 및 Fc 감마 RIIb T232로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 방법은 다양한 폴리펩티드의 당형태를 분리하는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법의 사용을 통해 분리되는 폴리펩티드는 항체(예를 들면, 단일클론 항체, 인간 단일클론 항체, 인간 IgG, 인간 IgG1)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질(예를 들면, 인간 Fc 영역을 갖는 Fc 융합 단백질)을 포함한다. 본원의 방법에 따라 분리될 폴리펩티드는 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 작은 모듈 면역약제(SMIP; small modular immunopharmaceutical), IgG-scFv 이중특이적 항체, 항체-펩티드 접합체, 항체-약물 접합체, 및 바이러스 또는 바이러스 캡시드 상의 Fc 수용체 결합 폴리펩티드를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 분리될 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 제조된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 진균 세포(예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris)), 곤충 세포 또는 식물 세포에서 제조된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 CHO 세포(예를 들면, GS-CHO, CHO-K1 또는 CHO-K1SV), NS0 세포 또는 Sp2/0 세포에서 제조된다.

Fc 수용체는 하나 이상의 당형태에 우선적으로 결합하는 Fc 수용체이다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 감소된 푸코스를 갖는 당형태(예를 들면, 비푸코실화된 당형태, 예를 들면, 감소된 코어 N-푸코스를 갖는 당형태)에 우선적으로 결합한다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 증가된 고 만노스 올리고사카라이드를 갖는 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합한다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 글리코실화된다. 예를 들면, Fc는 N-글리코실화될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 Fc 감마 RIII 폴리펩티드(예를 들면, Fc 감마 RIIIa 폴리펩티드 또는 Fc 감마 RIIIb 폴리펩티드) 또는 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함한다.

예를 들면, Fc 수용체는 Fc 감마 RIII 폴리펩티드 또는 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들면, Fc 수용체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 21 내지 209와 85% 이상 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 세포외 도메인은 V176 동종이형(allotype)이다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 전장 Fc 감마 RIII 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 제공된 방법의 다양한 실시양태에서, 적재 유체는 Fc 수용체에 우선적으로 결합하는 제1 당형태를 포함하고, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율은 적재 유체에 비해 20% 이상 증가되고, 예를 들면, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율은 적재 유체에 비해 50%, 100%, 2배, 5배, 10배 또는 20배 이상 증가된다.

상기 방법은 용출물이 제시된 백분율 이상의 당형태를 함유하도록 당형태를 농축할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.

몇몇 실시양태에서, 제1 당형태는 감소된 푸코스를 갖는 당형태(예를 들면, 비푸코실화된 당형태)이다.

몇몇 실시양태에서, 제1 당형태는 감소된 시알릴화를 갖는 당형태(예를 들면, 비시알릴화된 당형태)이다.

몇몇 실시양태에서, 제1 당형태는 갈락토실화된 당형태이다.

몇몇 실시양태에서, 제1 당형태는 고 만노스 올리고사카라이드를 갖는 당형태이다.

용출물은 수집될 수 있거나 분획들로 나누어질 수 있고, 이들 분획들 중 하나 이상이 특정 당형태에 대해 농축될 수 있다.

상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 Fc 수용체에 우선적으로 결합하지 않는 제2 당형태를 포함하고, 용출물 중의 제2 당형태의 백분율은 적재 유체에 비해 감소된다(예를 들면, 이때 제2 당형태는 푸코실화된, 시알릴화된 및/또는 고 만노스 당형태이다).

몇몇 실시양태에서, 용출물 중의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 적재 유체 중의 상기 폴리펩티드의 활성에 비해 변경된다(예를 들면, 증가되거나 감소된다). 몇몇 실시양태에서, 생물학적 활성은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, ADCC는 증가된다(예를 들면, ADCC는 20%, 50%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배 또는 50배 이상 증가된다).

몇몇 실시양태에서, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드의 생물학적 활성은 적재 유체 중의 상기 폴리펩티드의 활성에 비해 변경된다(예를 들면, 증가되거나 감소된다).

다양한 매질들 중 임의의 매질이 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 비드, 막, 모노리쓰(monolith), 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본(예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함한다.

Fc 수용체는 가교연결제를 통해 매질에 연결될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 이황화 결합, 금속 킬레이트화, 브롬화시아노겐, NHS 연결, 히스티딘 태그, 글리시딜 에테르, 에폭시, 염화트레실 연결, 염화토실 연결, EAH 연결, ECH 연결, 활성화된 티올 연결 또는 티오프로필 연결을 통해 매질에 연결된다.

매질은 예를 들면, 0.01 mg/㎖ 내지 15 mg/㎖의 농도로 Fc 수용체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 2 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖(예를 들면, 3 mg/㎖ 내지 7.5 mg/㎖, 3 mg/㎖ 내지 5 mg/㎖, 또는 5 mg/㎖ 내지 7.5 mg/㎖)의 농도로 Fc 수용체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 매질은 이 매질과 적재 유체의 접촉 전에 평형화 용액으로 평형화된다. 많은 실시양태에서, 평형화 용액은 3.5 내지 10의 pH에서 1 mM 내지 500 mM의 완충제(예를 들면, 트리스, MES, HEPES, 포스페이트, 히스티딘) 및 0 mM 내지 2000 mM의 염(예를 들면, NaCl, CaCl₂)을 포함한다.

다양한 실시양태에서, 적재 유체는 0.001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖의 농도로 폴리펩티드를 포함한다. 매질과 접촉되는 폴리펩티드의 양은 매질 ㎖ 당 0.1 mg 내지 25,000 mg 폴리펩티드일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 하나 이상의 세척 용액은 3.5 내지 10의 pH에서 1 mM 내지 500 mM의 완충제(예를 들면, 트리스, MES, HEPES, 포스페이트, 히스티딘) 및 0 mM 내지 2000 mM의 염(예를 들면, NaCl, CaCl₂), 및/또는 첨가제(예를 들면, 구아니딘, 우레아, 수크로스) 및/또는 용매(예를 들면, 에탄올, 아세토니트릴, 폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 용출 용액은 2 내지 5의 pH 및/또는 0 mM 내지 2000 mM의 염(예를 들면, NaCl, CaCl₂), 및/또는 첨가제(예를 들면, 구아니딘, 우레아, 수크로스) 및/또는 용매(예를 들면, 에탄올, 아세토니트릴, 폴리에틸렌 글리콜)를 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 매질은 pH 구배(예를 들면, pH 5.0부터 pH 3.0까지의 pH 구배)가 적용되는 조건 하에 하나 이상의 용출 용액과 접촉된다.

상기 방법은 용출물을 중화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

분리 방법은 다른 분리 방법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 용출물을 제2 매질과 접촉시키는 단계, 및 제2 매질을 관통하여 유동하거나 제2 매질로부터 용출되는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적 제2 매질은 이온 교환 매질, 하이드록시아파타이트 매질, 단백질 A 매질, 소수성 상호작용 매질, 고정된 금속 친화성 매질, 합성 매질(바이오미메틱(biomimetic)), 렉틴, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 방법은 용출물 중의 폴리펩티드 또는 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드로부터 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법은 매질로부터 용출된 폴리펩티드의 특징을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드로부터의 올리고사카라이드가 분석된다(예를 들면, 폴리펩티드로부터 N-올리고사카라이드를 절단하고 상기 올리고사카라이드를 표지하고 표지된 올리고사카라이드 종을 검출함으로써 N-연결된 올리고사카라이드를 분석한다).

몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 분석된다.

몇몇 실시양태에서, 독성, 안정성(예를 들면, 반감기, 저장 수명) 또는 효능 중 하나 이상이 (예를 들면, 적재 유체 중의 폴리펩티드에 비해, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드에 비해, 또는 기준물에 비해) 분석된다.

분석은 (용출된 폴리펩티드와의 비교를 위해) 적재 유체 중의 폴리펩티드 및/또는 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드의 분석을 추가로 포함할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 상기 방법은 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드를 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 상의 올리고사카라이드가 분석된다.

몇몇 실시양태에서, 독성, 안정성(예를 들면, 반감기, 저장 수명) 또는 효능 중 하나 이상이 (예를 들면, 적재 유체 중의 폴리펩티드에 비해, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드에 비해, 또는 기준물에 비해) 분석된다.

몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 분석된다.

본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 회수된 폴리펩티드를 포함하는 조성물도 특징으로 한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) Fc 수용체를 포함하는 매질을 제공하는 단계로서, 이때 Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 단계; (b) 폴리펩티드가 상기 매질에 결합하는 조건 하에 상기 매질을 상기 폴리펩티드를 포함하는 적재 유체와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인 단계; (c) 결합된 폴리펩티드가 상기 매질로부터 용출되는 조건 하에 상기 매질을 용출 용액과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 매질로부터 용출되는 결합된 폴리펩티드를 회수하여 용출물을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함한다.

상기 방법은 본원에 기재된 추가 특징을 포함할 수 있다.

상기 요약된 방법들의 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 혈청 IgG를 포함할 수 있다.

추가 양태에서, 본 개시내용은 고체 지지체에 연결된 Fc 수용체를 포함하는 매질로서, 이때 상기 Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 매질을 제공한다.

몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본(예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 비드, 막, 모노리쓰, 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 고체 지지체에 연결된 면역글로불린 Fc 수용체를 포함하는 매질로서, 이때 상기 면역글로불린 Fc 수용체가 Fc 감마 RI 폴리펩티드, Fc 감마 RII 폴리펩티드, Fc 감마 RIII 폴리펩티드 및 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 Fc 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 매질; 및 (b) 상기 요약된 방법들 중 임의의 방법, 예컨대, 본 개시내용의 한 양태에 따라 적재 유체 중의 폴리펩티드 당형태를 분리하는 방법에 따른 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

몇몇 실시양태에서, 상기 키트의 고체 지지체는 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본(예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함한다. 상기 고체 지지체는 비드, 막, 모노리쓰, 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 일부 실시양태의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 기재되어 있다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명확해질 것이다. 모든 인용된 특허, 및 특허출원 및 참고문헌은 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 도입된다.

도 1은 단일클론 항체 제제(상부 패널) 및 Fc 감마 RIIIa 수용체 매질로부터 용출된 제제(하부 패널)의 글리칸 프로파일을 도시하는 그래프 세트이다. 'F'로 종결되는 표지를 갖는 모든 피크들은 푸코실화되어 있고, 'F'로 종결되지 않는 표지를 갖는 모든 피크들은 비푸코실화되어 있다.

정의

"상응하는": 본원에서 사용된 바와 같이, 기준 서열의 아미노산(또는 뉴클레오티드)에 "상응하는" 아미노산(또는 뉴클레오티드)은 기준 서열의 부위에 대한 상동성을 갖는 부위를 점유한다. 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드는 관련된 서열들의 정렬에 의해 확인될 수 있다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 알고리즘, 예컨대, BLAST, FASTA 또는 ClustalW를 사용하여 서열을 공개 데이터베이스에서 입수될 수 있는 단백질 서열과 비교할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "용출물"은 매질에 노출되고 매질로부터 용출된 생성물을 갖는 유체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "면역글로불린 Fc 수용체" 또는 "Fc 수용체"는 면역글로불린 Fc 영역(예를 들면, 천연 Fc 영역)과 상호작용할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 수용체는 전형적으로 10⁵ M^-1(예를 들면, 적어도 10⁶ M^-1 내지 10⁹ M^-1)의 친화성(K_A)으로 Fc 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 천연 Fc 감마 수용체, 또는 천연 Fc 감마 수용체에 대한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 세포외 부분을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "면역글로불린 Fc 수용체 결합 모이어티" 또는 "Fc 수용체 결합 모이어티"는 면역글로불린 Fc 수용체와 상호작용할 수 있는 아미노산을 포함하는 모이어티를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체 결합 모이어티는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역은 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역이고, 일반적으로 면역글로불린, 예를 들면, IgG, IgA 또는 IgD의 마지막 2개 불변 영역 도메인, 또는 IgE 또는 IgM의 마지막 3개 불변 영역 도메인을 포함한다. 낙타과 항체는 경쇄를 결여하지만 전형적인 면역글로불린에 필적할만한 Fc 영역을 갖는다. Fc 영역은 면역글로불린의 불변 영역 도메인의 N 말단에 있는 유연성 힌지 영역도 포함할 수 있다. Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226부터 P230까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다(카바트(Kabat) 넘버링에 따름; 문헌(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 참조). 다수의 Fc 영역들의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 당분야에서 공지되어 있다.

다양한 실시양태에서, Fc 수용체 결합 모이어티는 천연 Fc 도메인(예를 들면, 천연 인간 Fc 도메인), 및 Fc 수용체에 결합하는 이의 부분 및 변이체(예를 들면, 천연 Fc 도메인에 대한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체)를 포함한다. 항체 및 Fc 융합 단백질은 Fc 수용체 결합 모이어티를 포함하는 폴리펩티드의 예이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "적재물"은 관심 있는 생성물을 함유하는 임의의 물질을 지칭한다. "적재 유체"는 매질과 접촉될 적재물을 함유하는 액체(예를 들면, 매질을 함유하는 컬럼을 통과할 액체)를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 세포 배양 배지이다. 세포 배양 배지는 (예를 들면, 세포 또는 세포 데브리스를 제거하도록) 정화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 크로마토그래피 단계(예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피 단계)로부터 유래된 부분적으로 정제된 중간체이다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 정제된 제제이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "매질"은 폴리펩티드 당형태의 분리를 위해 Fc 수용체의 지지체로서 사용될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, Fc 수용체와 Fc 수용체 결합 모이어티의 당형태 사이의 상호작용을 지칭하기 위한 "우선적으로 결합한다"는 상기 수용체가 또 다른 당형태에 결합하는 것보다 더 용이하게 한 당형태에 결합한다는 것(예를 들면, 제시된 폴리펩티드의 또 다른 당형태에 결합하는 것보다 더 용이하게 상기 제시된 폴리펩티드의 한 당형태에 결합한다는 것)을 의미한다. 제시된 당형태에 "우선적으로 결합하는" 수용체는 비록 이러한 수용체가 다른 당형태에 결합할 수 있을지라도 또 다른 당형태보다 상기 제시된 당형태에 결합할 가능성이 더 높을 것이다. 예를 들면, 수용체는 폴리펩티드의 제2 당형태에 결합하는 친화성보다 50%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배 또는 50배 이상 더 큰 친화성으로 상기 폴리펩티드의 제1 당형태에 결합하는 경우 한 당형태에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.

용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 햅텐 상의 부위를 지칭한다. 또한, 상기 용어는 "항원성 결정인자" 또는 "항원성 결정인자 부위"와 상호교환가능하게 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체들은 또 다른 항체와 표적 항원의 결합을 차단하는 한 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역어세이에서 확인될 수 있다.

용어 "핵산"은 DNA, RNA(예를 들면, mRNA, tRNA), 이종이중체, 및 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 합성 분자를 포괄하고, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자가 천연 발생 뉴클레오티드 및 이의 골격을 치환시킬 수 있는 것으로서 인정하는 모든 유사체 및 골격 치환체, 예컨대, PNA를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 화학적 변경물일 수 있다. 용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 유전 코드가 축퇴성을 갖기 때문에, 하나 초과의 코돈이 특정 아미노산을 코딩하는 데에 사용될 수 있고, 본 조성물 및 방법은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포괄한다.

달리 표시되어 있지 않은 한, 핵산은 5'부터 3' 배향으로 좌측부터 우측으로 기재되어 있고, 아미노산 서열은 아미노부터 카복시 방향으로 좌측부터 우측으로 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"와 동의어이고 상호교환적으로 사용된다. 이러한 아미노산 서열들이 활성을 나타내는 경우, 이들은 "효소"로서 지칭될 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1-문자 또는 3-문자 코드가 본원에서 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "합성" 분자는 유기체에 의해 제조되기보다는 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열을 기초로 제조되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 전사 및 번역 둘다를 포함한다.

"유전자"는 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 DNA 절편을 지칭한다.

"단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그의 천연 환경에서 그 자신과 회합되어 있는 물질을 실질적으로 갖지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 실질적으로 갖지 않는다는 것은 이들 물질의 50% 이상, 유리하게는 70% 이상, 보다 유리하게는 80% 이상, 훨씬 더 유리하게는 90% 이상을 갖지 않는다는 것을 의미한다.

"단리된" 핵산 분자는 이 분자가 천연 상태에서 발견되는 전체 유기체로부터 분리된 별개의 핵산 분자; 천연 상태에서 그 자신과 통상적으로 회합된 서열의 전부 또는 일부를 결여하는 핵산 분자; 또는 천연 상태에서 존재하는 바와 같되 그와 회합된 이종 서열을 갖는 서열이다.

"천연" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질이 천연적으로 발생하는 공급원으로부터 단리된 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭하다. "재조합" 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 폴리펩티드, 예를 들면, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 외생성 DNA 구축물에 의해 형질전환된 세포로부터 제조된 폴리펩티드를 지칭한다. "합성" 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 제조된 폴리펩티드뿐만 아니라 전술된 합성 항원도 포함한다.

일부 실시양태의 상세한 설명

달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시양태는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌들(J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press)을 참조한다. 이들 일반적인 교재들 각각은 본원에 참고로 도입된다.

분리될 폴리펩티드

본원에서 제공된 방법 및 조성물은 폴리펩티드 당형태의 분리를 위해 사용될 수 있다. 분리될 수 있는 폴리펩티드는 전형적으로 Fc 수용체 결합 모이어티(예를 들면, 면역글로불린 Fc 영역, 또는 Fc 수용체에 결합하는 이의 부분)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 분리될 폴리펩티드는 항체(예를 들면, 단일클론, 다중클론, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체), Fc 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 단일 도메인 항체, 작은 모듈 면역약제(SMIP), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, scFv, IgG-scFv 이중특이적 항체, 또는 Fc 함유 미니바디를 포함한다. Fc 수용체에 결합하는 다른 유형의 폴리펩티드인 Fc 수용체 결합 바이러스 폴리펩티드도 분리될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 조성물은 단일클론 항체 제제 중의 폴리펩티드 당형태의 분리를 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단일클론 항체가 분리된다. 본 개시내용이 적용될 수 있는 한 클래스의 치료 폴리펩티드는 치료 효능이 ADCC 또는 CDC를 유발하는 능력에 적어도 부분적으로 의존하는 것으로 생각되는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, 치료 폴리펩티드는 인간 IgG 항체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 인간 IgG 항체는 IgG1이다. 몇몇 실시양태에서, 인간 IgG 항체는 IgG3이다. 몇몇 실시양태에서, 인간 IgG 항체는 IgG4이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 항체, 예를 들면, 인간 IgG 항체(예를 들면, IgG1, IgG3 또는 IgG4 항체)의 Fc 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 암의 치료에 사용되는 폴리펩티드(예를 들면, 항체)이다.

본원에서 제공된 방법에 따라 분리될 폴리펩티드(예를 들면, 항체)는 하기 표적 분자들(이들 표적들에 결합하는 폴리펩티드의 예가 함께 기재되어 있음) 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함한다: 아밀로이드 전구체 단백질의 Aβ 단편(예를 들면, 미국 특허 제7625560호 참조; 예를 들면, 바피뉴주맙); HER2/neu 수용체(예를 들면, 트라스투주맙); CD20(예를 들면, 리툭시맙, 오파투무맙, 아푸투주맙, 토시투모맙); B 세포 활성화 인자(BAFF)(예를 들면, 벨리무맙); TNFα(예를 들면, 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타네르셉트, 골리무맙); CD52(예를 들면, 알렘투주맙); CD25(예를 들면, 바실릭시맙, 다클리주맙); VEGF(예를 들면, 베바시주맙); EGFR(예를 들면, 세툭시맙, 파니티무맙, 니모투주맙); CD11a(예를 들면, 에팔리주맙); CD33(예를 들면, 겜투주맙); CD3; 알파-4 인테그린(예를 들면, 나탈리주맙); IgE(예를 들면, 오말리주맙); GDF-8(예를 들면, 미국 특허 공보 제20040142382호 참조); IL-12R/IL-23R(p40)(예를 들면, 우스테키누맙); B7(예를 들면, CTLA4-Ig, 예를 들면, 아바타셉트); 보체 C5(예를 들면, 에쿨리주맙); 혈소판 GpIIb/IIIa(예를 들면, 애브식시맙); 포스파티딜세린(예를 들면, 바비툭시맙); 및 pF-RSV(팔리비주맙).

본원에 기재된 방법에 따라 분리될 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포주의 배양으로부터 유래된 컨디셔닝된 배지, 폴리펩티드 생성 세포의 세포 추출물, 혈청(예를 들면, 면역화된 대상체의 혈청, 감염성 물질에 노출된 대상체의 혈청, (예를 들면, 면역화 또는 천연 노출에 의해) 감염성 물질에 대한 면역을 발달시킨 대상체의 혈청, 무자극 대상체의 혈청, 인간 혈청), 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상청액, 상업적으로 입수될 수 있는 폴리펩티드 제제(예를 들면, 약품), 및 다른 공급원을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 공급원들 중 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, 다양한 폴리펩티드 생성 재조합 세포들의 컨디셔닝된 세포 배양 배지로부터 부분적으로 정제된 폴리펩티드가 분리된다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 분리될 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드를 분리하는 데에 사용될 Fc 수용체는 재조합 세포에서의 발현에 의해 제조된다. 분리될 폴리펩티드 또는 Fc 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 사용되고 이해되고, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 그의 의미와 일치되게 사용된다. 예를 들면, 용어 "벡터"는 한 환경으로부터 또 다른 환경으로의 핵산 분자의 전달을 가능하게 하거나 용이하게 하거나, 핵산 분자의 조작을 가능하게 하거나 용이하게 하는 비히클을 지칭하기 위해 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 사용된다.

예를 들면, 벡터는 부착된 절편의 복제를 야기하도록 또 다른 DNA 절편에 부착될 수 있는 레플리콘, 예컨대, 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자율 유닛으로서 기능하는, 즉 그 자신의 조절 하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. "복제기점"은 DNA 합성에 참여하는 DNA 서열을 지칭한다. "발현 조절 서열"은 또 다른 서열의 전사 및 번역을 조절하고 제어하는 DNA 서열이다. 코딩 서열은 RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA로 전사한 후, 이 mRNA가 상기 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역되는 경우 세포에서 전사 및 번역 조절 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있고 이러한 조절 서열의 "조절 하에" 있다.

일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효율적인 전사 및 번역을 용이하게 하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터가 숙주와 함께 사용된다. 발현 벡터는 전형적으로 복제기점, 프로모터(들), 종결요소(들)뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자도 함유한다. 폴리뉴클레오티드가 폴리단백질 단편을 코딩하는 경우, 유리하게는 벡터에서 개시 코돈(ATG)은 판독 프레임의 5'에 놓여 있고 정지 코돈은 3'에 놓여 있다. 발현을 조절하기 위한 다른 요소, 예컨대, 인핸서 서열, 안정화 서열, 및 단백질의 분비를 허용하는 신호 서열이 존재할 수 있다. 형질전환된 숙주는 최적 세포 생장을 달성하도록 당분야에서 공지된 수단에 따라 발효될 수 있고 배양될 수 있다.

본 개시내용의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 임의의 벡터가 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 시험관내에서(예컨대, 세포 무함유 발현 시스템의 사용), 및/또는 시험관내에서 생장된 배양된 세포에서 사용될 수 있다. 이러한 적용을 위해, 시험관내에서 및/또는 배양된 세포에서 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 임의의 벡터가 사용될 수 있다.

DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 조절 하에 놓여 있을 때 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고 번역되는 이중 가닥 DNA 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카복실) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들면, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다. "cDNA"는 카피 DNA 또는 상보적 DNA로서 정의되고, mRNA 전사체로부터의 역전사 반응의 생성물이다.

전사 및 번역 조절 서열은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 업스트림 조절 도메인, 폴리아데닐화 신호, 종결요소 등이다. "시스-요소"는 특정 유전자 좌위의 발현을 상향조절할 수 있거나 하향조절할 수 있는 다른 단백질과 상호작용하는, "컨센서스 서열" 또는 "모티프"로도 지칭되는 뉴클레오티드 서열이다. "신호 서열"도 코딩 서열과 함께 포함될 수 있다. 이 서열은 숙주 세포와 소통하여 폴리펩티드를 적절한 세포내 위치로 향하게 하는, 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 신호 펩티드를 코딩한다. 신호 서열은 원핵생물 및 진핵생물에 천연적으로 존재하는 다양한 단백질들과 회합된 상태로 발견될 수 있다. 원하는 유전자가 전사되고 번역될 수 있는 한, 이들 조절 서열들 전부가 항상 재조합 벡터에 존재할 필요는 없다.

"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 중합효소에 결합하여 다운스트림(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위에 의해 그의 3' 말단에서 결합되고 배경을 초과하는 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는 데에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 뻗어 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐만 아니라, RNA 중합효소의 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)도 존재한다. 진핵 프로모터는 항상은 아니지만 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유한다. 원핵 프로모터는 -10 컨센서스 서열 및 -35 컨센서스 서열 이외에 샤인-달가노 서열을 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한효소"는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 이러한 뉴클레오티드 서열 근처에서 이중 가닥 DNA를 절단하는 효소를 지칭한다.

"재조합 DNA 기술"은 통상적으로 상이한 유기체들로부터의 DNA의 시험관내 라이게이션의 결과로서 2개의 이종 DNA 분자들을 통합하는 기법을 지칭한다. 재조합 DNA 분자는 통상적으로 유전공학 실험에 의해 제조된다. 동의어는 "유전자 스플라이싱", "분자 클로닝" 및 "유전공학"을 포함한다. 이들 조작의 생성물은 "재조합체" 또는 "재조합 분자"를 발생시킨다.

세포는 외생성 또는 이종 DNA가 세포 내부로 도입되었을 때 이러한 DNA로 "형질전환"되어 있거나 "형질감염"되어 있다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈 내로 삽입(공유적으로 연결)될 수 있거나 삽입되지 않을 수 있다. 원핵생물, 효모 및 포유동물 세포에서, 예를 들면, 형질전환 DNA는 에피좀 요소, 예컨대, 벡터 또는 플라스미드 상에서 유지될 수 있다. 진핵 세포와 관련하여, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체 복제를 통해 딸세포에 의해 유전되도록 염색체 내로 삽입되어 있는 세포이다. 이 안정성은 형질전환 DNA를 함유하는 딸세포의 집단으로 구성된 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵 세포의 능력에 의해 입증된다. "클론"은 유사분열에 의해 단일 세포 또는 조상세포로부터 유래된 세포의 집단이다. "세포주"는 많은 세대 동안 시험관내에서 안정하게 생장할 수 있는 일차 세포의 클론이다. 외생성 DNA로 형질전환된 유기체, 예컨대, 식물 또는 동물은 "형질전환" 식물 또는 동물로서 지칭된다.

DNA 구축물의 "이종" 영역은 천연 상태에서 보다 큰 분자와 회합된 상태로 발견되지 않는, 상기 보다 큰 DNA 분자 내의 확인가능한 DNA 절편이다. 따라서, 이종 영역이 포유동물 유전자를 코딩하는 경우, 상기 유전자는 통상적으로 공급원 유기체의 게놈에서 포유동물 게놈 DNA를 플랭킹하지 않는 DNA에 의해 플랭킹될 것이다. 또 다른 예에서, 코딩 서열은 코딩 서열 자체가 천연 상태에서 발견되지 않는 구축물(예를 들면, 게놈 코딩 서열이 인트론, 또는 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열을 함유하는 cDNA)이다. 대립형질 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 정의된 DNA의 이종 영역을 발생시키지 않는다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 상이한 공급원으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 유전공학 기법에 의해 위치될 수 있고 이종 폴리뉴클레오티드이다. 그의 천연 코딩 서열로부터 제거되고 천연 서열 이외의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 또는 폴리펩티드에 적용된 "단편" 또는 "부분"은 통상적으로 길이에 있어서 10개 이상의 잔기, 보다 전형적으로 20개 이상의 잔기, 바람직하게는 30개 이상(예를 들면, 50개)의 잔기를 가질 것이지만 전체 온전한 서열보다 짧을 것이다. 이들 유전자의 단편은 당업자에게 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 천연 발생 또는 재조합 섬유 또는 피브리틴(fibritin) 유전자의 제한 분해, 섬유 또는 피브리틴 유전자의 정의된 단편을 코딩하는 벡터를 사용하는 재조합 DNA 기법, 또는 화학적 합성에 의해 발생될 수 있다.

매우 다양한 세포들이 재조합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 관심 있는 단백질(예를 들면, 단일클론 항체)을 발현하도록 재조합 DNA로 형질전환될 수 있는 임의의 세포가 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. 세포는 다양한 종, 예를 들면, 식물, 효모, 선충, 벌레, 곤충, 양서류 또는 포유동물, 예를 들면, 인간, 영장류, 양, 소, 돼지, 말, 고양이, 개 또는 설치류 공급원을 포함하는 진핵생물 종으로부터 유래될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 인간 또는 설치류로부터 유래된다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 햄스터(예를 들면, 중국 햄스터 난소 세포)로부터 유래된다. 사용될 수 있는 포유동물 세포의 예로는 하기 세포들이 있다: BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/I, ECACC 번호: 85110503); SP2/0; Balb/c 3T3; 인간 망막모세포(PER.C6(크루셀(CruCell), 네덜란드 레이덴 소재); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포, 또는 현탁 배양에서의 생장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포+/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980); GS-CHO, CHO-K1, CHO-K1SV, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-DUXB11, CHO-S); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 래트 하이브리도마 YB2/0(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주(Hep G2). 다수의 적합한 세포주들이 수탁기관, 예컨대, 어메리카 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 입수될 수 있다. 사용될 수 있는 식물 세포의 예로는 렘나 마이너(Lemmna minor)(좀개구리밥), 아라비돕시스 탈라니아(Arabidopsis thalania), 및 파이스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)(이끼) 세포가 있다. 사용될 수 있는 곤충 세포의 예로는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9 및 Sf21), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(Tni 및 BTI-Tn 5B1-4), 및 마메스트라 브라시캐(Mamestra brassicae)(Mb) 세포가 있다. 유용한 진균 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포를 포함한다.

본원에 기재된 방법은 전문화된 숙주 세포를 선택하거나 비전형적 조건 또는 제조 단계를 사용할 필요 없이 임의의 패턴의 당형태 발현을 갖는 초기 제제로부터 폴리펩티드 당형태를 선택하고 농축하게 할 수 있다. 그러나, 많은 경우, 예를 들면, 원하는 당형태의 발현을 증가시키고/시키거나 원치 않는 당형태의 발현을 감소시키도록 당형태의 발현이 변경되어 있는 제제의 분리에 상기 방법을 적용하는 것이 유리할 수 있다. 관심 있는 당형태의 농축에 유리한 조건과 분리 방식의 조합은 보다 높은 수준의 순도로 또는 이전에 가능했던 것보다 더 적은 단계로 당형태를 단리하는 것을 가능하게 할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당형태 발현은 글리코실화 경로에 참여하는 효소(예를 들면, 탄수화물 모이어티의 추가 또는 트리밍(trimming)을 촉진하는 효소)의 증가된 또는 감소된 발현을 갖도록 숙주 세포를 유전적으로 조작함으로써 변경된다. 이러한 변경은 글리코실트랜스퍼라제, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 또는 글리코시다제를 코딩하는 유전자의 도입, 결실 및/또는 넉다운을 포함할 수 있다. FUT8 유전자의 파괴에 의해 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 발현을 결여하는 세포는 예를 들면, 문헌(Yamani-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioeng. 87(5):614-622, 2004) 및 국제 특허출원 공보 제WO2009/009086호에 기재되어 있다. 감소된 푸코실화를 갖는 폴리펩티드를 생성하는 세포 변이체가 기재되어 있다(예를 들면, CHO Lec13 세포(Shields et al., J. Biol. Chem. 277(30):26733-26740, 2002); 및 CHO Ms704(Kanda et al. Biotech. Bioeng. 94(4):680-688, 2006)).

하등 진핵생물(예를 들면, 진균 세포)은 포유동물 세포의 복잡한 글리코실화 특징을 갖는 폴리펩티드를 생성하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 복잡한 말단 시알릴화된 당단백질을 생성하도록 조작된 피키아 파스토리스를 기술하는 문헌(Hamilton et al., Science 313:1441-1443, 2006)을 참조한다. 국제 특허출원 공보 제WO2002/000879호, 제WO2004/074458호, 제WO2004/074499호, 제WO2004/074498호 및 제WO2005/100584호를 참조한다. 식물 세포(예를 들면, 렘나 마이너 또는 이끼)는 원하는 당형태를 갖는, 예를 들면, 식물 유사 글리코실화를 결여하는 폴리펩티드를 생성하도록 조작될 수 있다(예를 들면, 문헌(Cox et al., Nat. Biotech. 24:1591-1597, 2006) 및 문헌(Nechansky et al., Mol. Immunol. 44:1815-1817, 2007) 참조).

몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화를 변경하는 조건 하에 세포에서 제조된다. 예를 들면, 10 nM 내지 600 nM의 망간을 세포 배양 배지에 포함시키는 것은 보다 광범위한 글리코실화 패턴을 발생시킬 수 있다(미국 특허 공보 제2008/0081356호). 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화를 조절하는 물질의 존재 하에 세포에서 제조된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 탄수화물 변경 효소의 억제제 또는 작용제가 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 억제제는 핵산 길항제(예를 들면, siRNA)이다. 폴리펩티드의 글리코실화는 예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코시다제를 사용한 처리에 의해 시험관내에서(예를 들면, 세포 외부에서) 효소적으로 변경될 수 있다.

결합 매질

Fc 수용체

본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 Fc 수용체는 하나 이상의 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합하는 수용체를 포함한다. 하나 이상의 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합하는 수용체는 상기 폴리펩티드의 또 다른 당형태에 결합하는 친화성보다 50%, 100% 또는 2배 이상(예를 들면, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배, 150배 또는 200배) 더 큰 친화성으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 푸코스를 결여하거나 감소된 수준의 푸코스를 갖는 당형태(예를 들면, 낮은 수준의 코어 N-푸코실화를 갖거나 코어 N-푸코실화를 결여하는 당형태; 예를 들면, 중쇄들 중 하나 또는 둘다 상에서 푸코스를 결여하는 항체 당형태)에 우선적으로 결합한다. 예를 들면, Fc 수용체는 Fc 감마 RIII 폴리펩티드(예를 들면, Fc 감마 RIIIa 폴리펩티드, 또는 Fc 감마 RIIIb 폴리펩티드)의 세포외 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 감소된 시알산을 갖는 당형태에 우선적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 고 만노스를 함유하는 당형태에 우선적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 갈락토실화된 당형태에 우선적으로 결합한다.

일부 추가 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 Fc 수용체는 폴리펩티드의 푸코실화된 형태에 대한 상기 Fc 수용체의 K_D보다 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 작은 K_D로 푸코스를 결여하거나 감소된 수준의 푸코스를 갖는 폴리펩티드 당형태(예를 들면, 낮은 수준의 코어 N-푸코실화를 갖거나 코어 N-푸코실화를 결여하는 당형태; 예를 들면, 중쇄들 중 하나 또는 둘다 상에서 푸코스를 결여하는 항체 당형태)에 결합하는 Fc 수용체를 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서 사용되기에 적합한 Fc 수용체의 이러한 결합 친화성의 예에 대해서는 예를 들면, 문헌(Herbst, R et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 335(1):213-222 (2010)) 및 문헌(Shibata-Koyama, M et al. Exp. Hematol. 37:309-321 (2007))을 참조한다.

따라서, 본 출원인은 놀랍게도 다른 당형태보다 단지 약 5배 내지 10배 더 높은 K_off 속도로 일부 당형태 폴리펩티드, 예컨대, 비푸코실화된 폴리펩티드에 결합하는 Fc 수용체가 당형태 폴리펩티드를 정제하는, 예를 들면, 상이한 당형태 폴리펩티드들의 혼합물로부터 비푸코실화된 폴리펩티드 형태를 정제하는 친화성 정제 방법에서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체, 예컨대, Fc 감마 RIIIa는 예를 들면, 비푸코실화된 항체와 Fc 수용체의 결합을 수반하는 친화성 크로마토그래피에 의한 항체의 친화성 정제에 반드시 적합하지는 않은, Fc 수용체에 대한 비푸코실화된 항체의 K_off 속도를 수반하는 비푸코실화된 항체 형태에 대한 결합 친화성을 갖는다. 이들 실시양태에서, 비푸코실화된 폴리펩티드는 전형적으로 예를 들면, PBS 완충제를 사용한 세척 동안 떨어지지 않지만 보다 엄격한 조건, 예를 들면, pH 구배에 노출되었을 때 떨어지도록 Fc 수용체에 결합된 상태로 남아 있다. 놀랍게도 본 발명의 몇몇 실시양태에 따라 친화성 크로마토그래피에 의한 정제에 적합한, Fc 수용체와 당형태 항체의 결합의 K_off 속도의 예에 대해서는 문헌(Li, P et al. J. Biol. Chem. 282(9):6210-6221 (2007))을 참조한다.

(CD16a 또는 FCGR3A 단백질로서도 공지되어 있는) Fc 감마 RIIIa는 막 단백질 및 단백질용해성 절단에 의해 생성된 가용성 수용체 둘다로서 천연적으로 발현되는 I형 막 단백질이다. 전장 Fc 감마 RIIIa는 그의 세포외 영역에서 2개의 Ig 유사 C2형 도메인을 갖는다. Fc 감마 RIIIa는 IgG의 Fc 영역에 결합한다. 인간 Fc 감마 RIII 폴리펩티드와 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드의 구조적 회합은 특징규명되어 있다(Sondermann et al., Nature 406:267-273, 2000). Fc 감마 RIIIa는 복합체화된 IgG, 응집된 IgG 및 단량체 IgG에 결합한다. Fc 감마 RIIIa는 항체 의존적 세포 매개 독성 및 다른 항체 의존적 반응, 예컨대, 식균작용을 매개한다. IgG1로부터의 푸코스의 고갈은 Fc 감마 RIIIa에 대한 그의 친화성을 향상시키고 ADCC를 야기하는 그의 능력을 향상시킨다(Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004). 한 연구에서, 비아코어(BIAcore)™ 바이오센서를 이용하여 측정하였을 때 IgG1은 1.87 x 10⁶ M^-1의 K_a로 Fc 감마 RIIIa(V176 동종이형)에 결합하고 IgG1의 탈푸코실화된 형태는 58.3 x 10⁶ M^-1의 K_a로 결합한다. 향상된 Fc 감마 RIIIa 친화성 및 ADCC는 탈푸코실화된 IgG2, IgG3 및 IgG4의 경우에도 관찰되었다(Jefferis, Trends Pharm. Sci. 30(7):356-362, 2009). Fc 감마 RIIIa의 올리고사카라이드 구조는 탈푸코실화된 항체에 대한 그의 향상된 결합에 기여한다.

전장 인간 Fc 감마 RIIIa 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다(전세계적 웹(uniprot.org/uniprot/P08637) 상의 유니프롯(UniProt)의 등록번호 P08637 또한 참조). 신호 펩티드는 약 아미노산 1 내지 16이다. 세포외 도메인은 아미노산 17 내지 208이다. Ig 유사 도메인은 아미노산 24 내지 105와 아미노산 107 내지 189 사이에서 발견된다. 잔기 230 내지 254는 세포질 도메인이다. N-연결된 글리코실화는 잔기 56, 63, 92, 180 및 187에서 일어날 수 있다. 위치 180의 올리고사카라이드가 제거되어 있을 때, 상기 수용체는 푸코실화된 및 비푸코실화된 IgG Fc에 대한 동일한 친화성을 갖는다(Jefferis, Nat. Rev. Drug. Disc. 8:226-234, 2009; 상기 문헌(Shibata-Koyama)). Fc 감마 RIIIa의 위치 63에서의 글리코실화만의 제거는 비푸코실화된 IgG에 대한 그의 친화성을 증가시킨다. 위치 180에서의 글리코실화를 제외한 모든 글리코실화의 제거는 비푸코실화된 IgG에 대한 친화성을 증가시킨다(상기 문헌(Shibata-Koyama) 참조). 위치 180 및 63에서의 글리코실화를 제외한 모든 글리코실화의 제거는 야생형 Fc 감마 RIIIa보다 더 높지만 위치 180에서만 글리코실화를 갖는 경우의 친화성보다 더 낮은, 비푸코실화된 IgG에 대한 친화성을 발생시킨다(상기 문헌(Shibata-Koyama)).

Fc 감마 RIIIa의 번역 후 변경은 (예를 들면, 서열번호 1의 잔기 56, 63, 92, 180 및 187에서) 고 만노스 및 복잡한 올리고사카라이드를 포함한다. Fc 감마 RIIIa는 다형성을 갖는다. 천연 아미노산 동종이형의 예로는 서열번호 1에서 하기 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드가 있다: L66H, L66R, G147D, Y158H, F176V 및 F203S. 위치 176에서 발린을 갖는 동종이형은 페닐알라닌을 갖는 동종이형보다 IgG1, IgG3 및 IgG4에 더 강하게 결합한다(Koene et al., Blood 90(3):1109-1114, 1997; Wu et al., J. Clin. Inv. 100(5):1059-1070, 1997). IgG1은 Fc 감마 RIIIa F176 보유 세포보다 Fc 감마 RIIIa V176 보유 세포를 통한 ADCC의 매개에 있어서 더 효율적이다(Jeffries et al. Exp. Opin. Biol. Ther. 7(9):1401-1413, 2007).

인간 Fc 감마 RIIIa의 오르톨로그(ortholog)는 예를 들면, 피. 트로글로다이테스(P. troglodytes)(진뱅크 등록번호 XP_001174052.1 참조), 엠. 뮬라타(M. mulatta)(진뱅크 등록번호 NP_001041713.1 참조), 엠. 파시큘라리스(M. fascicularis)(진뱅크 등록번호 NP_001106117.1 참조), 피. 아누비스(P. anubis)(진뱅크 등록번호 NP_001106117.1 참조), 엠. 머스큘러스(M. musculus)(진뱅크 등록번호 NP_653142.1 참조), 알. 노르베기쿠스(R. norvegicus)(진뱅크 등록번호 NP_997486.1 참조), 비. 타우루스(B. Taurus)(진뱅크 등록번호 NP_001070870.1 참조), 씨. 루푸스(C. lupus)(진뱅크 등록번호 XP_536141.2 참조), 서코세부스 토르쿠아투스 아티스(Cercocebus torquatus atys)(붉은관 망가베이(Red-crowned mangabey))(검댕 망가베이)(진뱅크 등록번호 DQ423376 mRNA, 번역: ABD83656.1 참조), 파피오 아누비스(Papio anubis)(올리브 개코원숭이(진뱅크 등록번호 DQ423378 mRNA, 번역: ABD83658.1 참조) 및 다른 종에서 확인되었다.

본원에 기재된 매질에서 사용될 Fc 수용체는 Fc 함유 폴리펩티드의 당형태에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 감마 RIIIa 폴리펩티드의 세포외 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체는 서열번호 1에 제시된 서열의 세포외 도메인과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열, 또는 이의 부분(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 21 내지 209, 아미노산 17 내지 208, 아미노산 21 내지 192, 아미노산 21 내지 169, 또는 아미노산 106 내지 169를 포함하는 부분)과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 1개 이상의 아미노산 위치 내지 15개 이하의 아미노산 위치에서 Fc 감마 RIIIa 서열의 이들 부분들 중 하나와 상이한 서열(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 위치에서 서열번호 1의 아미노산 21 내지 209와 상이한 서열)을 갖는다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 1의 N180에 상응하는 부위에서 글리코실화된다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 (예를 들면, 아스파라긴 잔기의 치환으로 인해) 서열번호 1의 N63에 상응하는 부위에서 글리코실화를 결여한다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 192를 포함하고, 이때 F176은 V176으로 변화된다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 192를 포함하고, 이때 N63은 또 다른 아미노산(예를 들면, 글루타민, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환된다.

(CD16b 또는 FCGR3B 단백질로서도 공지되어 있는) Fc 감마 RIIIb는 Fc 감마 RIIIa와의 서열 유사성을 공유하는 당단백질이다. 전장 Fc 감마 RIIIb는 그의 세포외 영역에서 2개의 Ig 유사 C2형 도메인을 갖는다. Fc 감마 RIIIb는 GPI-고착된 형태, 및 단백질용해성 절단에 의해 방출된 분비된 형태로서 천연적으로 발현된다. 푸코실화는 Fc 감마 RIIIb에 대한 몇몇 항체의 친화성을 감소시킨다(Bruhns et al., Blood 113(16): 3716-3725, 2008).

전장 인간 Fc 감마 RIIIb 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다(전세계적 웹(uniprot.org/uniprot/O75015)) 상의 유니프롯의 등록번호 O75015 또한 참조). 신호 펩티드는 약 아미노산 1 내지 16이다. 세포외 도메인은 아미노산 17 내지 200이다. Ig 유사 도메인은 아미노산 40 내지 96과 아미노산 121 내지 179 사이에서 발견된다. 아미노산 201 내지 233은 성숙 형태로 제거될 수 있다. N-연결된 글리코실화는 잔기 56, 63, 82, 92, 180 및 187에서 일어날 수 있다. 지질화는 아미노산 200에서 일어날 수 있다.

천연 아미노산 동종이형의 예로는 서열번호 2에서 하기 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드가 있다: S36R, S65N, A78D, N82D, I106V. 다른 Fc 감마 RIIIb 동종이형은 NA1 및 NA2를 포함한다.

본원에 기재된 매질에서 사용될 Fc 수용체는 Fc 함유 폴리펩티드의 당형태에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 감마 RIIIb 폴리펩티드의 세포외 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체는 서열번호 2에 제시된 서열의 세포외 도메인과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열, 또는 이의 부분(예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 20 내지 208, 아미노산 20 내지 192, 아미노산 21 내지 169 또는 아미노산 106 내지 169를 포함하는 부분)과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 1개 이상의 아미노산 위치 내지 15개 이하의 아미노산 위치에서 Fc 감마 RIIIb 서열의 이들 부분들 중 하나와 상이한 서열(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 위치에서 서열번호 2의 아미노산 20 내지 208과 상이한 서열)을 갖는다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 2의 N180에 상응하는 부위에서 글리코실화된다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 (예를 들면, 아스파라긴 잔기의 치환으로 인해) 서열번호 2의 N63에 상응하는 부위에서 글리코실화를 결여한다. 한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 2의 아미노산 20 내지 192를 포함한다. 다양한 실시양태에서, Fc 수용체는 서열번호 2의 아미노산 20 내지 192를 포함하고, 이때 N63은 또 다른 아미노산(예를 들면, 글루타민, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 치환된다.

Fc 감마 RIV는 본 발명의 몇몇 실시양태에서 사용되기에 적합한 또 다른 Fc 수용체이고 논문(Nimmerjahn, F and Ravetch, JV Immunity 24:19-28 (2006))에 기재되어 있다. Fc 감마 RIV 단백질 서열의 예로는 마우스(등록번호, Q8R2R4), 래트(등록번호, Q6XPU4) 및 마카크(등록번호, Q8SPW2)에 대한 Fc 감마 RIV 단백질 서열이 있다. 상기 논문(Nimmerjahn and Ravetch)에 기재된 바와 같이, Fc 감마 RIV는 그의 표면 발현을 위해 감마 쇄를 필요로 한다. Fc 감마 RIV는 호중구, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 고도로 발현된다. 이것은 염증 자극, 예컨대, LPS 및 TH-1 사이토카인, 예컨대, IFN-감마에 의해 상향조절될 수 있고 TH-2 사이토카인, 예컨대, IL-4 및 IL-10 또는 TGF-베타에 의해 하향조절될 수 있다. 문헌(Nimmerjahn, F and Ravetch, JV Immunity 24:19-28 (2006))을 참조한다. 마우스 Fc 감마 RIV는 비푸코실화된 IgG에 대한 K_D가 푸코실화된 항체에 대한 K_D보다 대략 10배 더 작다는 점에서 인간 Fc 감마 RIIIA와 유사한 친화성을 갖는다. 문헌(Herbst, R et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 335(1):213-222 (2010))을 참조한다. 따라서, Fc 감마 RIV 수용체는 본 발명의 몇몇 실시양태의 방법에 따라 친화성 리간드로서 사용될 때 비푸코실화된 종의 농축에 적합한 Fc 수용체의 한 예이다.

본원의 방법에서 사용될 Fc 수용체는 Fc에 결합하는 능력 및 당형태에 우선적으로 결합하는 능력을 보유하는 형태로 상기 수용체를 생성하는 포유동물 세포 또는 다른 유형의 세포(예를 들면, 진핵 세포, 예컨대, 효모 세포 또는 곤충 세포; 상기 단백질의 제조를 위한 예시적 숙주 세포 참조)에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 원핵 세포, 예컨대, 세균 세포, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli)에서 제조된다. Fc 수용체가 원핵 세포, 예컨대, 이. 콜라이에서 제조되는 실시양태에서, Fc 수용체는 Fc에 결합하는 능력 및 당형태에 우선적으로 결합하는 능력을 보유하되 Fc 수용체 자체가 글리코실화되지 않도록 변경될 수 있다. Fc 수용체는 상업적 공급원, 예컨대, 알앤드디 시스템스(R&D Systems)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 시노 바이올로지칼스 인코포레이티드(Sino Biologicals, Inc.)(중국 베이징 소재)로부터 입수될 수도 있다. Fc 수용체는 정제 및/또는 매질과의 커플링을 용이하게 하도록 모이어티와 함께 발현될 수 있고/있거나 모이어티로 변경될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 수용체는 펩티드 태그, 예를 들면, 폴리히스티딘 태그 또는 HA 태그를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 수용체는 커플링을 용이하게 하도록 말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 수용체는 커플링을 매개하는 효소에 대한 인식 모티프, 예컨대, 스타필로코커스 소르타제(Sortase) A에 의해 인식되는 LPXTG(서열번호 3) 모티프를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 말단(예를 들면, N 말단)은 라이신 또는 시스테인을 포함한다. Fc 수용체로부터 말단 잔기를 분리하는 아미노산 연결제가 포함될 수 있다. 연결제는 예를 들면, 1개 내지 20개 아미노산 길이, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 5개, 7개, 9개, 10개, 12개, 15개 또는 20개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, 연결제는 3개, 4개 또는 5개의 인접 글리신 잔기를 포함하고, 임의적으로 이 글리신 잔기 뒤에서 또는 앞에서 세린 잔기를 포함한다.

수용체는 그의 N 말단에서 KGGG(서열번호 4) 또는 CGGG(서열번호 5) 모티프를 포함할 수 있다.

한 예에서, Fc 수용체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

또 다른 예에서, Fc 수용체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

본 개시내용의 방법 및 조성물은 특정된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 또는 유사한 서열, 예를 들면, 상기 특정된 서열과 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포괄한다. 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열이 공통된 구조적 도메인 및/또는 공통된 기능적 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열의 정렬된 아미노산 잔기와 i) 동일하거나 ii) 이러한 정렬된 아미노산 잔기의 보존적 치환인 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, 특정된 서열과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 공통된 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 실질적으로 동일하다고 지칭된다.

뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통된 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 공통된 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통된 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록 제2 핵산의 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 또는 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, 특정된 서열과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 동일하다고 지칭된다.

서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성(이들 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다.

2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 핵산 서열들의 % 동일성을 측정하기 위해, 최적 비교를 목적으로 서열들을 정렬한다(예를 들면, 최적 정렬을 위해 갭을 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘다에 도입할 수 있고, 비교를 목적으로 비상동성 서열들을 무시할 수 있다). 바람직한 실시양태에서, 비교를 목적으로 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 또는 60% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상이다. 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치가 제2 서열의 상응하는 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다(본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다).

2개 서열들 사이의 % 동일성은 상기 2개 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 상기 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다.

2개의 서열들 사이의 서열 비교 및 % 동일성의 측정은 수학 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열들 사이의 % 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(웹(http://www.gcg.com)에서 입수가능함)의 GAP 프로그램 내로 도입된 문헌(Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)의 알고리즘을 이용함으로써 측정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열들 사이의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(웹(http://www.gcg.com)에서 입수가능함)의 GAP 프로그램을 이용함으로써 측정된다. 특히 바람직한 파라미터 세트(및 달리 특정되어 있지 않은 경우 사용되어야 하는 파라미터 세트)는 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티 및 5의 프레임변동 갭 페널티를 갖는 블로섬 62 점수화 매트릭스이다.

2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들 사이의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 도입된 문헌(E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 이용함으로써 측정될 수 있다.

본원에 기재된 핵산 서열 및 단백질 서열은 예를 들면, 다른 패밀리 구성원 또는 관련된 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대해 검색을 수행하기 위한 "질의(query) 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용함으로써 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 100의 점수 및 12의 단어길이를 사용하여 본 발명의 몇몇 실시양태의 핵산 분자에 대한 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 수득함으로써 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 50의 점수 및 3의 단어길이를 사용하여 본 발명의 몇몇 실시양태의 단백질 분자에 대한 상동성을 갖는 아미노산 서열을 수득함으로써 수행될 수 있다. 비교를 목적으로 하는 갭을 갖는 정렬을 수득하기 위해, 갭을 갖는 BLAST를 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭을 갖는 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 웹(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 참조한다.

본원에 기재된 서열의 천연 대립형질 변이체, 상동체, 오르톨로그 또는 다른 관련된 서열(예를 들면, 파랄로그)에 상응하는 핵산 분자는 예를 들면, 공지된 서열의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하는 표준 또는 엄격한 혼성화 반응을 수행함으로써 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 대한 그의 상동성을 기초로 단리될 수 있다. 이러한 핵산 혼성화 및 클로닝 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다.

본원에서 제공된 펩티드의 상동체는 전형적으로 이러한 펩티드와의 구조적 유사성을 갖는다. 폴리펩티드의 상동체는 아미노산이 속하는 클래스의 동일한 또는 상이한 구성원들로부터 선택될 수 있는, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.

한 실시양태에서, 서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적 등가 물질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환도 가질 수 있다. 물질의 이차 결합 활성이 보유되는 한, 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성을 기초로 의도적 아미노산 치환을 만들 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고, 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고, 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 일어날 수 있는 보존적 치환(치환 및 교체는 기존 아미노산 잔기를 대안적 잔기로 교환하는 것을 의미하기 위해 본원에서 둘다 사용됨), 예를 들면, 유사한 잔기에 의한 유사한 잔기의 치환, 예컨대, 염기성 잔기에 의한 염기성 잔기의 치환, 산성 잔기에 의한 산성 잔기의 치환, 극성 잔기에 의한 극성 잔기의 치환 등도 포괄한다. 비보존적 치환, 예를 들면, 한 클래스의 잔기로부터 또 다른 클래스의 잔기로의 치환, 또는 대안적으로 비천연 아미노산, 예컨대, 오르니틴(이하, Z로서 지칭됨), 디아미노부티르산 오르니틴(이하, B로서 지칭됨), 노르류신 오르니틴(이하, O로서 지칭됨), 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신의 포함을 수반하는 치환도 일어날 수 있다. 만들어질 수 있는 보존적 치환은 예를 들면, 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 하이드록실 아미노산(세린, 쓰레오닌), 큰 아미노산(페닐알라닌 및 트립토판) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌)의 군 내에 있다.

Fc 수용체 매질의 제조

Fc 수용체는 다양한 기법들 중 임의의 기법에 의해 매질(예를 들면, 고체 지지체)에 커플링될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 수용체는 예를 들면, 수용체 또는 매질 상의 작용기의 반응에 의해 형성된 하나 이상의 공유결합에 의해 매질에 커플링된다. 작용기의 예로는 하이드록실 기, 아민 기, 티올 기, 티오프로필 기, 카보닐 기, N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스테르, 에폭사이드(예를 들면, 에피클로로하이드린), 카보닐디이미다졸(CDI) 활성화된 에스테르, 시아노겐(브롬화시아노겐(CNBr)), N,N-디석신이미딜카보네이트(DSC) 또는 알데하이드가 있다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 이황화 결합을 통해 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 금속 킬레이트화의 이용을 통해 매질에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체는 히스티딘 태그의 사용을 통해 커플링된다. 커플링에 유용한 다른 화합물은 염화토실, 염화트레실, ECH 연결(예를 들면, ECH-라이신 세파로스 4 패스트 플로우의 사용, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 또는 EAH 연결(예를 들면, EAH-세파로스^® 4B의 사용, 지이 헬쓰케어)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 그의 C 말단을 통해 매질(예를 들면, 고체 지지체)에 커플링된다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 그의 N 말단을 통해 매질(예를 들면, 고체 지지체)에 커플링된다.

수용체는 직접적으로 매질에 커플링될 수 있거나 연결제를 통해 간접적으로 커플링될 수 있다. 다양한 연결제들 중 임의의 연결제가 매질을 수용체에 커플링시키는 데에 적합하다. 몇몇 실시양태에서, 연결제는 탄소, 산소 및 질소 원자로 구성된 쇄, 예를 들면, 직쇄, 분지쇄 또는 환형쇄, 예를 들면, 1개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 쇄를 포함한다.

폴리펩티드를 매질에 커플링시키는 방법은 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 90/09237호; 문헌(Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992); 미국 특허 제5,260,373호, 제5,874,165호, 제3,932,557호, 제4,772,635호, 제4,210,723호, 제5,250,613호, 제5,543,054호 및 제6,399,750호; 유럽 특허 제1352957 A1호; 및 국제 특허출원 공보 제WO 2004/074471호에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 수용체는 작용기, 예컨대, CNBr 또는 NHS, 및 임의적으로 연결제를 갖는 아가로스를 포함하는 매질에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 수용체는 일차 아미노 기를 통해 NHS 활성화된 세파로스^® 4 패스트 플로우에 커플링된다. 한 예시적 방법에서, 수용체는 NHS 활성화된 세파로스^® 4 패스트 플로우 매질을 1 mM HCl로 세척하고 상기 매질을 수용체와 혼합하고 (예를 들면, 실온에서 1시간 내지 4시간 동안 항온처리하여) 커플링이 일어나게 하고 상기 매질을 100 mM 트리스로 세척하여 비반응된 기를 켄칭함으로써 커플링된다.

효소 매개 커플링을 이용하여 수용체를 매질에 연결할 수 있다(예를 들면, 문헌(Chan et al., PLoS ONE 2(11):e1164, 2007) 참조). 예를 들면, 수용체는 트랜스펩티다제, 예컨대, 스타필로코커스 소르타제 A에 대한 인식 모티프를 포함하도록 디자인될 수 있다. 소르타제 A에 의한 LPXTG 모티프에서의 인식 및 절단은 이용가능한 글리신 또는 아미노메틸렌과 반응하는 아실-효소 중간체를 발생시킨다. 인식 모티프를 갖는 수용체가 소르타제 A에 의해 절단되는 경우, 상기 수용체는 반응성 부위를 갖는 매질에 연결되게 된다. 한 예에서, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 글리신 잔기를 포함하도록 변경된 비드는 소르타제 A 매개 라이게이션에 의해 C 말단 LPXTG 모티프를 갖는 수용체에 연결된다.

적합한 유형의 매질은 비드, 막, 매트릭스, 다공성 매질, 겔, 플레이트, 컬럼 및 모노리쓰를 포함한다. 매질은 물질, 예컨대, 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본, 예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)으로 구성될 수 있다.

Fc 수용체 매질은 Fc 함유 폴리펩티드와의 결합에 충분한 농도의 Fc 수용체에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 0.01 mg/㎖ 내지 15 mg/㎖(예를 들면, 0.1 mg/㎖ 내지 15 mg/㎖, 또는 1 mg/㎖ 내지 15 mg/㎖)의 Fc 수용체를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 2 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖(예를 들면, 3 mg/㎖ 내지 7.5 mg/㎖)의 Fc 수용체를 갖는다.

분리 방법

폴리펩티드 당형태를 분리하기 위해, 폴리펩티드가 매질에 결합하는 조건 하에 적재 유체를 본원에 기재된 Fc 수용체 매질과 접촉시킨다. 매질은 임의적으로 세척되고, 매질에 결합된 폴리펩티드를 용출하는 용액과 접촉된다. 몇몇 실시양태에서, 매질로부터 용출되는 폴리펩티드는 회수된다. 몇몇 실시양태에서, 매질을 관통하여 유동하는 폴리펩티드(예를 들면, 매질에 의해 결합되지 않는 폴리펩티드)는 회수된다.

적재 유체는 예를 들면, 관심 있는 폴리펩티드를 함유하는 세포 배양 배지(예를 들면, 세포를 포함하는 배지, 또는 세포가 제거된 배지), 세포 추출물, 혈청, 복수, 세포 배양물로부터 정제된 또는 부분적으로 정제된 제제, 추출물, 혈청 등, 또는 제제화된 약품 또는 약물일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 적재 유체는 혈청 IgG를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 적재 유체는 단백질 A 컬럼의 용출물이다. 적재 유체는 0.001 mg/㎖ 내지 500 mg/㎖(예를 들면, 0.001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖, 0.001 mg/㎖ 내지 30 mg/㎖, 또는 0.001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖)의 농도로 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 매질 25,000 ㎖ 당 0.1 mg 폴리펩티드의 농도로 매질과 접촉될 수 있다.

매질을 적재 유체와 접촉시키기 전, 필요한 경우 파라미터, 예컨대, pH, 이온 강도 및 온도를 조절할 수 있다. 매질을 용액(예를 들면, pH, 이온 강도 등을 조절하기 위한, 또는 세제의 도입을 위한 완충제)으로 세척하여 폴리펩티드의 결합 및/또는 분리를 가능하게 하거나 용이하게 하는 특징을 발생시킴으로써 상기 매질을 평형화시킬 수 있다

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체 매질을 폴리펩티드와 접촉시키기 전에 하나 이상의 용액으로 세척하고 평형화시킨다. 이러한 용액은 예를 들면, 완충제(예를 들면, 트리스, MES, HEPES, 히스티딘, 또는 포스페이트, 예를 들면, 1 mM 내지 500 mM, 25 mM 내지 100 mM, 또는 50 mM), 및/또는 염(예를 들면, NaCl, NaPO₄, 아세트산나트륨, 또는 CaCl₂, 예를 들면, 0 M 내지 2 M, 또는 5 mM 내지 250 mM)을 포함할 수 있다. 평형화 용액의 pH는 일반적으로 3.5 내지 10(예를 들면, pH 6.0 내지 8.0)이다. 몇몇 실시양태에서, 평형화 완충제는 10 mM 내지 약 50 mM의 트리스 또는 MES 및 10 mM 내지 200 mM의 염(예를 들면, 150 mM NaCl 또는 20 mM CaCl₂)을 함유한다.

Fc 수용체 매질을 적재 유체와 접촉시킨 후, 결합된 매질을 세척할 수 있다. 세척 용액은 완충제(예를 들면, 트리스, MES, HEPES, 포스페이트, 또는 히스티딘, 예를 들면, 1 mM 내지 500 mM), 및/또는 염(예를 들면, NaCl, CaCl₂, NaPO₄, 또는 아세트산나트륨, 예를 들면, 0 M 내지 2 M), 및/또는 첨가제(예를 들면, 구아니딘, 우레아, 수크로스, 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체), 및/또는 용매(예를 들면, 에탄올, 아세토니트릴, 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 세척 용액은 일반적으로 3.5 내지 10의 pH(예를 들면, 4.5 내지 8.0의 pH)를 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 매질은 이 매질을 평형화시키는 데에 사용된 용액과 동일한 용액으로 세척된다. 몇몇 실시양태에서, 매질은 1 mM HEPES로 세척된다.

pH, 염 유형, 염 농도, 용매 유형, 용매 농도, 이탈제(displacer) 유형, 이탈제 농도 또는 이들의 조합의 단계 또는 구배 변화를 이용하여 Fc 수용체 매질로부터 폴리펩티드를 용출할 수 있다. Fc 영역을 함유하는 단백질, 다른 단백질, Fc 영역에 대한 상동성을 갖는 작은 폴리펩티드, 세제, 소수성 용질, 폴리전해질, 아미노산, 항생제, 당, 덱스트란, 피콜, 수지상 중합체 등이 이탈제로서 사용될 수 있다. 일반적으로, Fc 수용체 매질로부터 폴리펩티드를 용출하기 위해, 상기 매질을 용출 완충제와 접촉시킨다. 몇몇 실시양태에서, 용출 완충제는 염(예를 들면, NaCl 또는 CaCl₂, 예를 들면, 0 M 내지 2 M, 예를 들면, 10 mM 내지 100 mM)을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 용출 완충제는 글리신, 아세트산 또는 시트르산(예를 들면, 20 mM 내지 250 mM, 예를 들면, 150 mM)을 함유할 수 있다. 용출 완충제는 완충제(예를 들면, HEPES, 예를 들면, 10 mM 내지 100 mM)도 함유할 수 있다. 용출 완충제는 아세트산(예를 들면, 20 mM 내지 약 50 mM), 첨가제(예를 들면, 구아니딘, 우레아, 또는 수크로스), 및/또는 용매(예를 들면, 에탄올, 아세토니트릴, 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, 1% 내지 10% 용매, 예를 들면, 5% 용매)도 함유할 수 있다. 용출 완충제의 pH는 약 2.0 내지 약 4.0일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, pH는 구배 용출(예를 들면, pH 5.0부터 pH 3.0까지의 구배 용출)을 생성하도록 (예를 들면, 점차적으로) 변화될 수 있다. 한 실시양태에서, 용출 완충제의 pH는 약 3.0이다. 용출물은 예를 들면, 매질로부터의 회수 후 pH를 6.0 내지 8.0(낮은 pH가 용출을 위해 사용되는 경우)으로 조절함으로써 중화될 수 있다.

매질은 폴리펩티드의 용출 후 임의적으로 세정될, 즉 스트립핑되고 재생될 수 있다. 이것은 고체상의 표면 상에서의 불순물의 축적을 최소화하고/하거나 미생물에 의한 생성물의 오염을 피하도록 매트릭스를 멸균하기 위해 정기적으로 수행될 수 있다.

용액 성분은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자의 지식에 따라 조절될 수 있다. 샘플 용액 조성 범위는 하기 실시예에서 제공되어 있다. 모든 용액 또는 단계가 필요하지는 않지만, 설명을 위해 제공된다.

Fc 수용체 매질을 사용한 분리는 단독으로 또는 다른 기법과 함께 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 과정이 적재 유체를 준비하기 위해, 예를 들면, 오염물질 또는 불순물의 적재 챌린지를 감소시키기 위해 이용된다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 과정이 Fc 수용체 매질의 용출물 또는 관통 유동물을 프로세싱하기 위해 이용된다.

본원에 기재된 Fc 수용체 방법과 함께 실시될 수 있는 정제/분리 기법은 심층여과, 정용여과, 한외여과, 바이러스 제거 여과, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 바이오미메틱 친화성 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함한다. 본원의 기법은 컬럼, 막 및/또는 팽창된 층 흡착 포맷으로 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 크로마토그래피 기법이 약한 분할 방식으로 작동된다(미국 특허 공보 제2007/0060741호 및 문헌(Kelley BD, Tobler SA, Brown P, Coffman JL, Godavarti R, Iskra T, Switzer M, Vunnum S. Biotechnol Bioeng. 2008 Oct 15; 101(3): 553-66) 참조).

상업적으로 입수될 수 있는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼은 예를 들면, 프로셉(PROSEP)-A™(밀리포어(Millipore), 영국 소재), 단백질 A 세파로스 패스트 플로우™(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 토요펄(TOYOPEARL)™ 650M 단백질 A(토소하스 컴파니(TosoHass Co.), 미국 펜실베니아주 필라델피아 소재), 및 맙셀렉트(MabSelect)™ 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 포함한다.

사용될 수 있는 음이온 교환 수지는 치환기를 갖는 수지, 예컨대, 다이에틸아미노에틸(DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 사차 아미노에틸(QAE) 및 사차 아민(O) 기를 포함한다.

사용될 수 있는 양이온 교환 수지는 치환기를 갖는 수지, 예컨대, 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 셀룰로스성 이온 교환 수지(예를 들면, 와트만 리미티드(Whatman Ltd.; 영국 켄트 메이드스톤 소재)로부터 입수될 수 있는 DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 또는 CM-52)가 사용된다. 정제를 위해 사용되는 세파덱스 계열의 이온 교환제 및 가교연결된 이온 교환제는 예를 들면, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-세파덱스, 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로스, 및 세파로스(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다. DEAE 및 CM 유도체화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예컨대, 토요펄™ DEAE-650S 또는 M 및 토요펄™ CM-650S 또는 M은 미국 펜실베니아주 필라델피아에 소재하는 토소하스 컴파니로부터 입수될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지가 정제를 위해 사용된다. HIC는 소수성을 기초로 분자를 분리한다. 일반적으로, 높은 염 완충제 중의 샘플 분자는 HIC 수지 상에 적재된다. 상기 완충제 중의 염은 물 분자와 상호작용하여 용액 중의 분자의 용해를 감소시킴으로써, 결과적으로 HIC 매질에 의해 흡수되는 샘플 분자의 소수성 영역을 노출시킨다. 분자의 소수성이 높을수록, 결합을 촉진하는 데에 필요한 염이 적어진다. 따라서, 생성물 분자와 HIC 매질 사이의 결합 상호작용은 조건, 예컨대, 매질의 pH, 이온 강도 및 염 농도에 의존한다. 사용될 수 있는, 상업적으로 입수될 수 있는 HIC 수지는 소수성 리간드(예를 들면, 알킬 또는 아릴 기)에 커플링되어 있는 염기 매트릭스(예를 들면, 가교연결된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)을 포함하는 수지를 포함한다. 예로는 페닐 세파로스™, 6 FAST FLO™(파마샤 엘케이비 바이오테크놀로지 아베(Pharmacia LKB Biotechnology, AB), 스웨덴 소재); 페닐 세파로스™ 고성능(파마샤 엘케이비 바이오테크놀로지 아베, 스웨덴 소재); 옥틸 세파로스™ 고성능(파마샤 엘케이비 바이오테크놀로지 아베, 스웨덴 소재); 프락토겔(Fractogel)™ EMD 프로필 또는 프락토겔™ EMD 페닐(이. 머크(E. Merck), 독일 소재); 마크로-프렙(MACRO-PREP)™ 메틸 또는 마크로-프렙™ t-부틸 지지체(바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 소재); WP HI-프로필(C₃)™(J. T. Baker, N.J.); 및 토요펄™ 에테르, 페닐 또는 부틸(토소하스, 미국 펜실베니아주 소재)이 있다. HIC는 약한 분할 방식으로 수행될 수 있다.

몇몇 실시양태에서 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 정제를 위해 사용된다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 매트릭스 및 리간드로서 화학식 [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]의 불용성 하이드록실화된 인산칼슘을 사용한다. 작용기는 양으로 하전된 칼슘 이온의 쌍(C 부위) 및 음으로 하전된 포스페이트 기의 클러스터(P 부위)로 구성된다. 생성물과 하이드록시아파타이트 매질 사이의 결합 상호작용은 조건, 예컨대, 매질의 pH, 이온 강도 및 부형제 농도, 예컨대, 포스페이트 농도, 칼슘 농도, 아르기닌 농도, 글리신 농도 및 HEPES 농도에 의존한다. 다양한 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 수지가 상업적으로 입수될 수 있다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 약한 분할 방식으로 수행될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지가 정제를 위해 사용된다. IMAC는 수지 상에 고정된 킬레이트화된 전이 금속 이온과 관심 있는 태깅된 생성물 상의 히스티딘 잔기의 이미다졸 측쇄 사이의 상호작용을 기초로 한다. 분자의 분리는 관심 있는 태깅된 생성물과 IMAC 수지 상의 금속 기에 대한 반대리간드 사이의 경쟁의 결과로서 일어난다. 생성물과 금속 하전된 IMAC 매질 사이의 결합 상호작용은 조건, 예컨대, 반대리간드 수준, 예컨대, 이미다졸 농도 및 매질의 이온 강도에 의존한다. 다양한 IMAC 수지들이 상업적으로 입수될 수 있다. IMAC는 약한 분할 방식으로 수행될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 렉틴 크로마토그래피가 정제를 위해 사용된다(예를 들면, 문헌(Tojo et al., Biol. Pharm. Bull. 32(9):1604-1608, 2009); 및 상기 문헌(Shinkawa et al.) 참조).

폴리펩티드의 특징규명

본원에 기재된 Fc 수용체 매질을 사용하여 분리한 폴리펩티드는 임의의 유형의 특징, 예컨대, 글리칸 양 및/또는 구조, 안정성(예를 들면, 반감기, 저장 수명), 독성 및 생물학적 활성에 대해 분석될 수 있다. 분리 과정의 임의의 단계, 예를 들면, 용출물 및/또는 관통 유동물 부분에서 폴리펩티드가 분석될 수 있다. 당형태의 평가는 예를 들면, 적재 유체와 용출물의 비교에 의해, 적재 유체와 관통 유동물의 비교에 의해, 또는 용출물과 기준 샘플의 비교에 의해 수행될 수 있다.

글리칸을 검출하고 특징규명하기 위한 임의의 이용가능한 기법이 적용될 수 있다. 예를 들면, 글리칸 구조는 질량 분광측정(MS), 크로마토그래피 방법, 전기영동 방법, 핵 자기 공명(NMR), 및 이들의 조합에 의해 분석될 수 있다. 크로마토그래피 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 초고성능 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 및/또는 아미드 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. MS는 직렬 S, LC-MS, LC-MS/MS, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 MS(MALDI-MS) 및/또는 전자 전달 해리 MS(ETD-MS)를 포함할 수 있다. 전기영동 방법은 (예를 들면, 글리칸 및/또는 폴리펩티드 구조를 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅과 함께 또는 이러한 웨스턴 블롯팅 없이) 모세관 전기영동 및 겔 전기영동을 포함할 수 있다. NMR은 1D-NMR, 2D-NMR, 상관관계 분광법 NMR, 이종핵 단일 양자 결맞음 NMR, 이종핵 다중 양자 결맞음 NMR, 회전 핵 오버하우저(overhauser) 효과 분광법 NMR, 및/또는 핵 오버하우저 효과 분광법 NMR을 포함할 수 있다.

글리칸을 분석하는 다양한 기법들이 기재되어 있다. 예를 들면, 크로마토그래피 및 질량 분광광도측정 수단에 의한 검출을 위해 푸코실화된 글리칸 및 비푸코실화된 글리칸을 2-아미노 벤즈아미드(2-AB) 및 2-안쓰라닐산(2-AA)으로 표지하는 조건을 기술하는 문헌(Bigge et al., Anal. Biochem. 230:229-238, 1995)을 참조한다. 문헌(Anamula et al., Anal. Biochem. 350(1):1-23, 2006); 문헌(Townsend, R.R. Carbohydrate Analysis" High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis., Ed. Z. El Rassi, pp 181-209, 1995); 및 문헌(Ruhaak et al., Anal Bioanal Chem. 397(8):3457-81, 2010)도 참조한다.

세포에서 발현된 폴리펩티드는 이종 글리코실화를 나타낸다. 제시된 폴리펩티드의 분자는 제시된 당 잔기의 수 및 유형에서 달라질 수 있다. 본 개시내용은 예를 들면, 증가된 또는 감소된 수준의 특정 잔기를 갖는 폴리펩티드를 농축하기 위해 당형태를 분리하는 매질 및 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 푸코스 잔기의 수가 기준 당형태 상의 잔기의 수보다 더 적은 경우 당형태는 "감소된" 수준의 특정 당(예를 들면, 푸코스)을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 기준 당형태는 제시된 유형의 세포에서 발현된 폴리펩티드 상에서 관찰된 특정 당의 평균 또는 최대 수의 잔기를 갖는 당형태이다. 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체 폴리펩티드가 최대 2개의 코어 푸코스 잔기를 갖는 경우, 0개 또는 1개의 코어 푸코스를 갖는 당형태는 "감소된" 수준을 갖는다.

마찬가지로, 당의 수가 기준 당형태 상의 잔기의 수보다 더 높은 경우 당형태는 "증가된" 수준의 특정 당을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 기준 당형태는 특정 당의 평균 또는 최소 수의 잔기를 갖는 당형태이다.

분리의 평가를 위한 당형태의 검출은 임의의 이용될 수 있는 수단에 의해 수행될 수 있고, 임의의 적재 유체, 용출물, 관통 유동물, 세척물 또는 이들의 조합의 글리칸 분석을 수반할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, Fc 수용체 매질의 용출물 또는 관통 유동물 중의 당형태의 백분율은 적재 유체에 비해 20%, 50%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상 변경된다(예를 들면, 증가되거나 감소된다). 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체 매질의 용출물 또는 관통 유동물 중의 당형태의 비율은 전체의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상 증가된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 감마 RIII 수용체 매질을 사용한 재조합 항체 샘플의 분리는 40% 이상의 비푸코실화된 물질을 갖는 용출물을 발생시키는 반면, 분리되지 않은 샘플(예를 들면, 적재 유체)은 전형적으로 (발현을 위한 세포 시스템 및 다른 인자에 따라) 5% 내지 7%의 비푸코실화된 물질을 가질 수 있다.

본원에서 제공된 방법에 따라 분리된 폴리펩티드의 결합이 분석될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 단백질과의 결합(예를 들면, 항체와 항원의 결합)이 분석된다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체와의 결합이 분석된다. 결합 상호작용을 평가하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들면, ELISA, 비아코어™ 바이오센서 분석, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 등을 포함한다.

폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하는 임의의 이용가능한 방법이 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당형태 특이적 생물학적 활성이 평가된다. ADCC는 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다(예를 들면, 상기(Shinkawa et al.) 참조). 본원에서 매질을 사용한 분리의 결과로서 하나 이상의 폴리펩티드 당형태의 상대적 비율의 변화는 적재 유체 또는 기준 샘플 중의 폴리펩티드의 활성에 비해 예를 들면, 20%, 50%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상까지 생물학적 활성을 변화, 예컨대, ADCC를 증가시킬 수 있다.

생성물 및 용도

폴리펩티드를 분리하는 본원의 방법 및 조성물은 다양하게 적용된다. 상기 방법은 원하는 당형태 프로파일을 갖는 폴리펩티드의 제조를 가능하게 한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 관심 있는 당형태(예를 들면, 향상된 생물학적 활성을 갖는 당형태)를 농축하는 데에 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 (예를 들면, 회분 사이에, 또는 상이한 과정에 의해 생성된 분자들 사이에) 당형태 프로파일을 표준화하는 데에 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 임의의 원하는 특징, 예컨대, 생물학적 활성에 대해 평가될 수 있는 당형태 풀(pool)을 제공하는 데에 사용된다. 당형태 프로파일을 조절하는 능력은 제조 과정에서 보다 높은 조절 및 유연성을 허용한다. 본 기술은 제시된 생성물에 대한 회분-대-회분 균일성을 달성하기 위한 추가 수단이다. 본 기술은 예를 들면, 상이한 과정들 및/또는 상이한 제조자들에 의해 제조된 생성물들의 비교에도 유용하다. 나아가, 제조자는 예를 들면, 생물유사 생성물의 개발에 있어서 상기 기술을 이용하여 또 다른 제조자의 생성물의 품질 속성을 일치시킬 수 있거나 후속 생성물의 품질 속성을 변경시킬 수 있다(예를 들면, 증가시킬 수 있거나 향상시킬 수 있다).

또한, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 생성물에 관한 것이다. 몇몇 경우, 본 개시내용에 따라 단리된 폴리펩티드들을 더 단리하고/하거나 정제하고 표준 방법에 따라 약학적 용도를 위해 이들을 제제화하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌(Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987); 및 문헌(Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), and Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997)을 참조한다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 이용되는 정확한 기법이 폴리펩티드의 특징에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드들은 약제의 제조에 유용할 것이다. 이들은 대상체에게 투여될 수 있거나, 비경구(예를 들면, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 코, 기관지, 눈, 경피(국소), 경점막, 직장 및 질을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 이용될 수 있는 경로에 의한 전달을 위해 먼저 제제화될 수 있다.

생성물의 약학 조성물은 당분야에서 공지된 방법에 따라 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다(예를 들면, 문헌(Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19th ed., Williams & Williams, (1995)) 및 문헌(Physician's Desk Reference, 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)) 참조). 몇몇 실시양태에서, 멸균수(예를 들면, SWFI), 완충된 식염수(예를 들면, 포스페이트 완충된 식염수), 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 이들의 적합한 혼합물을 사용하여 생성물을 제제화한다.

예시

실시예 1

본 실시예는 Fc 감마 RIIIa 수용체 매질의 제조, 및 CHO 세포에서 제조된 인간화된 IgG1 단일클론 항체인 mAb1과 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

하기 아미노산 서열을 갖는 Fc 감마 RIIIa-176V(발린) 동종이형 수용체의 세포외 도메인을 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현하였다:

세포내 프로세싱 동안 절단되는 신호 펩티드를 갖는 수용체를 발현하였다. 니켈 친화성 컬럼을 사용하여 수행하는 정제를 위해 10-his 태그를 C 말단에서 발현하였다.

Fc 감마 수용체(0.85 mg/㎖의 PBS 중의 1.25 ㎖)를 0.73 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스™ 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 80분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.3)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 100%이었다. 상기 수지를 0.5 cm 내부 직경(ID) 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.63 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.3)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이 세척을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 50 mM 트리스 및 150 mM NaCl(pH 7.2)로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.5분 체류시간)의 속도로 50 ㎖의 PBS 완충제 중의 0.34 mg/㎖ mAb1(27.0 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. mAb1 물질을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 및 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 사용된 2개 컬럼 정제 과정으로 준비하였다. mAb1 물질을 Fc 수용체 컬럼 상에 적재한 후, 상기 컬럼을 0.5 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 PBS로 세척하고 0.5 ㎖/분의 속도로 50 mM HEPES(pH 3.0)로 용출하였다. 280 nm에서의 흡광도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인되었을 때 mAb1이 수집되었다(7.5 ㎖ 중의 0.1 mg).

글리칸 분석을 용이하게 하기 위해, 16.5 ㎕의 단백질 A 수지(지이 맙셀렉트, 17-5199-03)를 사용하여 용출된 mAb1 샘플을 115 ㎕ 중의 0.45 mg/㎖까지 농축하였다. 96웰 플레이트, PBS 세척 완충제, 150 mM 글리신 용출 완충제(pH 3.0) 및 MES 중화 완충제(pH 6.8)를 사용하여 단백질 A 농축을 회분 방식으로 수행하였다.

비푸코실화된 mAb1의 백분율을 측정하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-아미노 벤즈아미드(2-AB)로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지(Xbridge) 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 출발 mAb1 물질은 7%의 비푸코실화된 Fc를 가졌다. Fc 수용체 컬럼을 사용한 농축 후, mAb1 물질은 61%의 비푸코실화된 IgG Fc를 가졌다. 도 1은 mAb1의 전형적인 올리고사카라이드 프로파일(상부 패널) 및 Fc 수용체 컬럼을 사용한 농축 후 mAb1의 프로파일(하부 패널)의 예를 보여준다. 도 1에서 'F'로 종결되는 표지를 갖는 모든 피크들은 푸코실화되어 있고 'F'로 종결되지 않는 표지를 갖는 모든 피크들은 비푸코실화되어 있다.

실시예 2

실시예 1에 기재된 채워진 Fc 수용체 컬럼을 사용하여 CHO 세포에서 제조된 인간화된 IgG1인 제2 단일클론 항체 mAb2의 비푸코실화된 당형태를 농축하였다. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 바이러스 보유 필터(예를 들면, 플라노바(Planova) 20 필터(아사히 가세이 코포레이션(Asahi Kasei Corporation), 일본 도교 소재)), 및 한외필터를 이용한 정제 과정으로부터 발생된 한외여과 풀로부터 mAb2 물질을 수득하였다.

Fc 수용체 컬럼을 평형화 완충제(20 mM CaCl₂을 갖는 50 mM MES(pH 6.5))로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.5분 체류시간)의 속도로 50 ㎖의 평형화 완충제 중의 1.80 mg/㎖ mAb2(142.9 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 0.5 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 평형화 완충제로 세척하고 0.5 ㎖/분의 속도로 150 mM 글리신(pH 3.4)으로 용출하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 확인되었을 때 mAb2가 수집되었다(9.25 ㎖ 중의 0.12 mg). pH 6.8의 1 M MES 중화 완충제를 사용하여 피크를 pH 6.6에 도달하게 하였다. 글리칸 분석을 용이하게 하기 위해, 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-4 10,000 kD MWCO 장치(밀리포어 UFC801024)를 이용하여 mAb2 샘플을 100 ㎕ 중의 0.87 mg/㎖까지 농축하였다.

실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 비푸코실화된 mAb2의 백분율을 측정하였다. 출발 mAb2 물질은 약 5%의 비푸코실화된 Fc를 가졌다. Fc 수용체 컬럼을 사용한 농축 후, mAb2 물질은 48.7%의 비푸코실화된 IgG Fc를 가졌다.

다회 주기를 이용하고 보다 낮은 적재 챌린지에서 런닝하여 충분한 양의 mAb2를 농축함으로써 과정 시간 및 폐기물을 최소하기 위해 상기 절차와 유사한 절차를 이용하였다. 컬럼을 평형화 완충제(PBS)로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.5분 체류시간)의 속도로 1 ㎖의 평형화 완충제 중의 1.89 mg/㎖ mAb2(3.0 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 0.5 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 평형화 완충제로 세척하고 0.5 ㎖/분의 속도로 150 mM 글리신(pH 3.4)으로 용출하였다. 이 절차를 총 40회 주기 동안 39회 반복하였다. 15%(부피/부피)의 1 M MES 중화 완충제(pH 10.4)를 사용하여 총 피크가 대략 pH 6.5에 도달하게 하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 확인되었을 때 총 4.4 mg의 mAb2가 수집되었다. 글리칸 분석을 용이하게 하기 위해, 아미콘 울트라-4 10,000 kD MWCO 장치(밀리포어 UFC801024)를 이용하여 mAb2 샘플을 1.9 ㎖ 중의 2.3 mg/㎖까지 농축하였다.

실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 비푸코실화된 mAb2의 백분율을 측정하였다. 출발 mAb2 물질은 5.9%의 비푸코실화된 IgG Fc 및 2.3%의 만노실화된 IgG Fc를 가졌다. Fc 수용체 컬럼을 사용한 농축 후, mAb2 물질은 41.8%의 비푸코실화된 IgG Fc 및 6.3%의 만노실화된 IgG Fc를 가졌다. 상기 컬럼을 관통하여 유동한 mAb2 물질은 4.3%의 비푸코실화된 IgG Fc 및 2.0%의 만노실화된 IgG Fc를 가졌다.

실시예 3

Fc 수용체 매질로 채워진 컬럼을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이 매질을 사용하여, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유도를 방해하는 것으로 공지되어 있는 삼중 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 갖는 Fc 융합 단백질(234, 235 및 237 아미노산 위치는 카바트 넘버링 시스템에 따름)과 Fc 수용체 사이의 결합 상호작용을 분석하였다. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 및 양이온성 및 HIC 특징을 갖는 혼합 방식 크로마토그래피 컬럼을 사용하는 3개 컬럼 정제 과정으로부터 상기 Fc 융합 단백질 물질을 수득하였다.

Fc 수용체 컬럼을 50 mM MES 및 150 mM NaCl(pH 6.5)로 세척하고 0.25 ㎖/분(3.0분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 50 mM MES 및 150 mM NaCl(pH 6.5) 중의 2.0 mg/㎖ Fc 융합체(15.6 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 50 mM MES 및 150 mM NaCl(pH 6.5)로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크(spike)의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 상응하는 삼중 돌연변이를 갖지 않는 mAb2를 사용한 후 삼중 돌연변이체 Fc 융합 단백질을 다시 사용하여 이 절차를 반복하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 크로마토그램의 비교는 낮은 pH 용출물 중의 Fc 융합 물질이 비돌연변이된 mAb2에 비해 유의한 피크를 생성하지 않는다는 것을 명확히 보여주었다. 따라서, 삼중 돌연변이체 단백질은 Fc 감마 RIIIA에 유의하게 결합하지 않는다.

실시예 4

본 실시예는 Fc 감마 RIIa 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

Fc 감마 RIIa 수용체는 IgG1 및 다른 IgG 서브클래스에 결합한다. Fc 감마 RIIa 수용체의 세포외 도메인은 알앤드디 시스템스(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수되었다. 상기 수용체는 NSO(뮤린 골수종) 유래의 세포에서 발현되었고 C 말단에서 발현된 10-his 태그를 함유한다. Fc 감마 RIIa 수용체의 부분은 하기 아미노산 서열을 갖는다(진뱅크 등록번호 AAA35827 참조):

제거되는 N 말단 신호 펩티드를 갖고 분자의 나머지 부분이 세포외 도메인(Ala36 내지 Ile218)인 수용체를 발현하였다.

Fc 감마 수용체(0.82 mg/㎖의 PBS 중의 1.23 ㎖)를 0.82 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, 지이 헬쓰케어)에 첨가하고 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 94%이었다. 상기 수지를 0.5 cm ID 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.72 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.9분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(13.9 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 2.6)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 이 절차를 9회 반복하고, 10개의 피크를 풀링하여, 280 nm에서의 흡광도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인되었을 때 95.4 ㎍의 mAb2를 생성하였다. 글리칸 분석을 용이하게 하기 위해, 30 kD MWCO 한외원심분리 막을 이용하여 mAb2 샘플을 150 ㎕ 중의 0.51 mg/㎖까지 농축하였다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 적재물의 푸코실화된 당형태의 비율에 비해 샘플 중의 푸코실화된 당형태의 비율의 변경은 없었다. 적재물 및 용출된 피크 둘다가 약 5%의 푸코실화된 물질을 가졌다.

실시예 5

본 실시예는 Fc 감마 RIIb/c 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

Fc 감마 RIIB/C 수용체는 IgG1 및 다른 IgG 서브클래스에 결합한다. Fc 감마 RIIb/c 수용체의 세포외 도메인은 알앤드디 시스템스(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수되었다. 상기 수용체는 NSO 유래의 세포에서 발현되었고 C 말단 10-his 태그를 함유하고 하기 아미노산 서열을 갖는다(진뱅크 등록번호 P31994 참조):

N 말단으로부터 절단되는 신호 펩티드를 갖고 분자의 나머지 부분이 세포외 도메인(Ala46 내지 Pro217)인 수용체를 발현하였다.

Fc 감마 수용체(1.16 mg/㎖의 PBS 중의 0.87 ㎖)를 0.82 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 95%이었다. 상기 수지를 0.5 cm ID 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.72 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.9분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(13.9 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 2.3)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 이 절차를 9회 반복하고, 10개의 피크를 풀링하여, 280 nm에서의 흡광도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인되었을 때 93.0 ㎍의 mAb2를 생성하였다. 글리칸 분석을 가능하게 하기 위해, 30 kD MWCO 한외원심분리 막을 이용하여 mAb2 샘플을 100 ㎕ 중의 0.74 mg/㎖까지 농축하였다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 적재물의 푸코실화된 당형태의 비율에 비해 샘플 중의 푸코실화된 당형태의 비율의 변경은 없었다. 적재물 및 용출된 피크 둘다가 약 5%의 푸코실화된 물질을 가졌다.

실시예 6

본 실시예는 Fc 감마 RI 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

Fc 감마 RI 수용체는 IgG1 및 다른 IgG 서브클래스에 결합한다. Fc 감마 RI 수용체의 세포외 도메인은 알앤드디 시스템스(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수되었다. 이 수용체는 NSO 유래의 세포에서 발현되었고 C 말단 6-his 태그를 함유하고 하기 아미노산 서열을 갖는다(진뱅크 등록번호 P12314 참조):

N 말단으로부터 절단되는 신호 펩티드를 갖고 나머지 분자가 C 말단 상에서 4개 잔기를 덜 갖는 세포외 도메인(Gln16 내지 Pro288)인 수용체를 발현하였다.

Fc 감마 수용체(0.483 mg/㎖의 PBS 중의 2.09 ㎖)를 0.42 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 180분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 95%이었다. 상기 수지를 0.5 cm ID 지이 헬쓰케어 컬럼 내에 0.38 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.15 ㎖/분(2.5분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(26.3 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 3.0) 및 6 ㎖의 150 mM 글리신(2.3)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 최종 풀은 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었을 때 38.6 ㎍의 mAb2를 함유하였다. 글리칸 분석을 가능하게 하기 위해, 30 kD MWCO 한외원심분리 막을 이용하여 mAb2 샘플을 100 ㎕ 중의 0.39 mg/㎖까지 농축하였다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 적재물의 푸코실화된 당형태의 비율에 비해 샘플 중의 푸코실화된 당형태의 비율의 변경은 없었다. 적재물 및 용출된 피크 둘다가 약 5%의 푸코실화된 물질을 가졌다.

실시예 7

본 실시예는 C1q 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

C1q는 IgG 및 IgM에 결합하는 보체 단백질이다. 혈청으로부터 준비된 천연 인간 C1q는 이엠디 바이오사이언시스(EMD Biosciences)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)(CAS 번호 80295-33-6)로부터 순수한 형태로 구입되었다.

C1q(1.17 mg/㎖의 PBS 중의 0.85 ㎖)를 0.72 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 120분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 커플링 효율은 C1q가 응집하는 경향으로 인해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정될 수 없었다. 상기 수지를 0.5 cm ID 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.64 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.6분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(15.6 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 최종 풀은 280 nm에서의 흡광도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었을 때 7.5 ㎍의 mAb2를 함유하였다. 생성된 물질의 낮은 양으로 인해, 글리칸 분석을 수행하지 않았다.

실시예 8

본 실시예는 DC-SIGN 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

몇몇 문헌들은 DC-SIGN 단백질이 항체의 시알릴화된 당형태에 우선적으로 결합할 수 있다는 것을 암시한다(문헌(DC-SIGN and α2,6-sialylated IgG Fc interaction is dispensable for the anti-inflammatory activity of IVIg on hman dendritic cells, Bayry, K Bansal, MD Kazatchkine, SV Kaveri; PNAS 2009 106 9 E24)). NSO 유래의 세포에서 발현된 재조합 인간 DC-SIGN을 알앤드디 시스템스로부터 순수한 형태로 구입하였다. 세포외 부분(Lys62 내지 Ala404)을 발현하였다(진뱅크 등록번호 Q9NNX6 참조).

DC-SIGN(0.94 mg/㎖의 PBS 중의 1 ㎖)을 0.82 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 95%이었다. 상기 수지를 0.5 cm ID 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.74 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.9분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(13.9 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 이 절차를 4회 반복하고 5개의 피크를 풀링하여, 280 nm에서의 흡광도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었을 때 128.0 ㎍의 mAb2를 생성하였다. 글리칸 분석을 가능하게 하기 위해, 30 kD MWCO 한외원심분리 막을 사용하여 mAb2 샘플을 125 ㎕ 중의 1.02 mg/㎖까지 농축하였다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 적재물의 푸코실화된 당형태의 비율에 비해 샘플 중의 푸코실화된 당형태의 비율의 변경은 없었다. 적재물 및 용출된 피크 둘다가 약 5%의 푸코실화된 물질을 가졌다.

DC-SIGN이 Ca⁺⁺ 의존적 결합 도메인을 갖는다는 점을 고려하여, 적재물 중의 칼슘이 mAb2의 결합에 영향을 미칠 수 있는지를 분석하고자 시도하였다. 상기 컬럼을 50 mM MES, 150 mM NaCl(pH 6.5) 및 20 mM CaCl₂로 세척하고 0.25 ㎖/분(3.0분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 50 mM MES, 150 mM NaCl(pH 6.5) 및 20 mM CaCl₂ 중의 2.0 mg/㎖ mAb2(13.5 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 50 mM MES, 150 mM NaCl(pH 6.5) 및 20 mM CaCl₂로 세척하였다. 1 ㎖/분의 속도로 3회 용출을 시도하였다: 6 ㎖의 50 mM MES 및 150 mM NaCl(pH 6.5); 6 ㎖의 50 mM MES, 150 mM NaCl(pH 6.5) 및 20 mM EDTA; 및 6 ㎖의150 mM 글리신(pH 2.3). 상기 대안적 용출 조건들 중 어느 조건도 150 mM 글리신(pH 3.0)을 사용하여 수득한 피크보다 더 큰 피크를 갖지 않았다. 따라서, 적재물 중의 칼슘의 존재 및 용출 조건의 변경은 본 연구에서 결합 또는 회수에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다.

실시예 9

본 실시예는 Fc 감마 RIIIa 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질을 사용한 리간드 밀도 최적화를 기술한다.

Fc 감마 RIIIa를 알앤드디 시스템으로부터 입수하였다. 상기 수용체는 하기 서열 및 6-His 태그를 갖는다(진뱅크 등록번호 AAH17865, P08637 [UniParc] 참조):

상기 수용체를 NS0 유래의 세포주에서 발현하였다. 폴리펩티드는 신호 펩티드(잔기 1 내지 16)를 갖지 않고 세포외 잔기 Gly17 내지 Gln208을 갖는다.

㎕ 규모의 리간드 커플링 실험을 수행함으로써 Fc 감마 RIIIA를 사용하여 리간드 밀도를 최적화하였다. 25 ㎕의 활성화된 NHS 세파로스™ 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)의 6개 분취물을, 바닥 상에 0.45 ㎛ 폴리프로필렌 필터를 갖는 96웰 플레이트(시호스 랩웨어(Seahorse Labware) F20023)의 800 ㎕ 웰에 첨가하였다. 상기 수지를 700 ㎕의 1 mM HCl로 세척하고 활성화시키고 1200xG에서 3분 동안 회전하였다. 이것을 총 3회 세척 주기 동안 반복하였다. 다양한 부피의 0.66 ㎍/㎕ Fc 감마 RIIIA를 각각의 웰 내의 25 ㎕ 활성화된 수지에 첨가하여, NHS 수지 ㎕ 당 1.5 ㎍ 내지 9.6 ㎍ Fc 감마 RIIIA의 리간드 밀도를 평가하였다(Fc 감마 RIIIA가 첨가되지 않은 대조군 웰(무자극 수지)을 포함함). 반응 동안, 플레이트를 실온에서 테칸 테쉐이크(Tecan Teshake) 상에서 1200 rpm으로 2시간 동안 교반하였다.

반응 후, 상기 수지를 700 ㎕의 100 mM 트리스(pH 8.3)로 세척하였다. 이것을 총 2회 주기 동안 반복하였다. 트리스 세척 후, 700 ㎕의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)를 사용하였다. 그 다음, 700 ㎕의 100 mM 트리스(pH 8.3)를 각각의 웰에 다시 첨가하여 반응을 더 켄칭하고, 저장을 위해 플레이트를 2℃ 내지 8℃로 냉각시켰다. 대략 15시간 후, 상기 수지를 700 ㎕의 1 mM HEPES(pH 7.3)로 2회 세척하였다. 활성화된 NHS 세파로스™ 4 패스트 플로우 수지 상에 고정된 Fc 감마 RIIIA로 채워진 보다 큰 크기의 0.6 ㎖ 컬럼을 사용하여 대략 45%의 비푸코실화된 종까지 미리 농축시킨 mAb2를 회분-결합 실험용 적재물로서 사용하였다. 대략 100 ㎕의 0.88 ㎍/㎕ mAb2를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 테쉐이크 상에서 1200 rpm으로 20분 동안 교반하였다. 적재 단계 후, 플레이트를 회전시키고 관통 유동물을 수집하였다. 그 다음, 상기 수지를 700 ㎕의 1 mM HEPES(pH 7.2)로 세척하였다. 그 다음, 상기 수지를 100 ㎕의 150 mM 글리신(pH 3.0)으로 3회 용출하였다. 적재물, 관통 유동물, 세척물 및 용출 분획을 96웰 플레이트로 수집하고, 280 nm 및 320 nm에서 UV를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 3에 제시되어 있다. 예측된 바와 같이, 무자극 수지는 유의한 단백질 결합을 나타내지 않았다. 마이크로 웰 수지 제제의 mAb2 용량은 채워진 컬럼에서 사용된 보다 큰 수지 부피 제제의 mAb2 용량과 유사하였다(0.17 ㎍/㎕ 대 0.20 ㎍/㎕). 측정된 mAb2 용량을 Fc 감마 RIIIA 리간드 밀도로 먼저 나눈 후 이 값을 포화 용량에서의 이론 값으로 나누어 % 사용률을 계산하였다. 한 항체가 각각의 Fc 감마 RIIIA 분자 상에 결합된 경우, Fc 감마 RIIIA ㎍ 당 3.5 ㎍의 항체가 결합되었을 것이다. 가장 우수한 사용률은 대략 10%이었다. 수지 ㎕ 당 총 mAb2 용량 및 % 사용률의 관점에서 최적 리간드 밀도는 3 ㎍/㎕ 내지 7.5 ㎍/㎕이다. 몇몇 실시양태에서, 용량을 최대화하도록(예를 들면, 적재 유체로부터 대다수의 물질을 수득하도록) 매질을 제조하고 사용한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 수용체의 사용률을 최대화하도록 매질을 제조하고 사용한다. 몇몇 실시양태에서, 용량 및 사용률 둘다를 최대화하도록 매질을 제조하고 사용한다.

실시예 10

본 실시예는 Fc 감마 RIIIb 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

Fc 감마 RIIIB 수용체는 IgG1 및 다른 IgG 서브클래스에 결합한다. Fc 감마 RIIIB 수용체의 세포외 도메인을 알앤드디 시스템스로부터 입수하였다. 이 수용체는 NSO 유래의 세포에서 발현되었고 C 말단 10-his 태그를 포함한다. 이 수용체는 하기 아미노산 서열을 갖는다(진뱅크 등록번호 O75015 참조; 서열은 Thr20 내지 Gln208을 포함한다):

PBS 중의 Fc 감마 수용체(1.87 mg/㎖의 0.54 ㎖)를 0.54 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.5)로 켄칭하였다. 상기 수지를 0.5 cm ID 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.5 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.5)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이것을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 PBS로 세척하고 0.25 ㎖/분(2.0분 체류시간)의 속도로 5 ㎖의 PBS 완충제 중의 1.96 mg/㎖ mAb2(19.6 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 그 후, 상기 컬럼을 1 ㎖/분의 속도로 9 ㎖의 PBS로 세척하고 1 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 150 mM 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 피크를 15% 스파이크의 1 M MES(pH 10.4)로 중화하였다. 이 절차를 3회 반복하고 4개의 피크를 풀링하여, 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정되었을 때 78 ㎍의 mAb2를 생성하였다. 글리칸 분석을 가능하게 하기 위해, 30 kD MWCO 한외원심분리 막을 사용하여 mAb2 샘플을 200 ㎕ 중의 0.39 mg/㎖까지 농축하였다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 대략 35 ㎍을 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다. 출발 mAb2 물질은 5.9%의 비푸코실화된 IgG를 가졌다. Fc 수용체 컬럼을 사용한 농축 후, mAb2 물질은 약 39.3%의 비푸코실화된 IgG를 가졌다.

실시예 11

본 실시예는 Fc 감마 RIIIa 수용체 매질의 제조, 및 mAb2와 함께 상기 매질의 사용을 기술한다.

Fc 감마 RIIIa를 알앤드디 시스템스로부터 입수하였다. 이 수용체는 하기 서열 및 6-His 태그를 갖는다(진뱅크 등록번호 AAH17865, P08637 [UniParc] 참조):

상기 수용체는 NSO 유래의 세포주에서 발현되었다. 폴리펩티드는 신호 펩티드(잔기 1 내지 16)를 갖지 않고 세포외 잔기 Gly17 내지 Gln208을 갖는다.

Fc 감마 수용체(0.81 mg/㎖의 PBS 중의 1.3 ㎖)를 0.64 ㎖의 활성화된 NHS 세파로스™ 4 패스트 플로우 수지(17-0906-01, GE)에 첨가하고 실온에서 65분 동안 반응시켰다. 반응을 100 mM 트리스(pH 8.3)로 켄칭하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정한 커플링 효율은 93%이었다. 상기 수지를 0.5 cm 내부 직경(ID) 컬럼(지이 헬쓰케어) 내에 0.55 ㎖까지 채우고 10 ㎖의 100 mM 트리스(pH 8.3)로 세척한 후 500 mM NaCl을 갖는 10 ㎖의 100 mM 아세테이트(pH 4.0)로 세척하였다. 이 세척을 2회 반복하고 상기 컬럼을 16% 에탄올, 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스(pH 7.7)에서 저장하였다.

상기 컬럼을 1.0 ㎖/분의 속도로 PBS로 세척하고 0.15 ㎖/분(3.7분 체류시간)의 속도로 1.0 ㎖의 PBS 완충제 중의 0.77 mg/㎖ mAb2(1.4 mg 단백질/㎖ 수지)로 적재하였다. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 바이러스 보유 필터(예를 들면, 플라노바 20 필터(아사히 가세이 코포레이션, 일본 도교 소재)), 및 한외필터를 이용한 전체 정제 과정으로부터 발생된 통상적인 한외여과 풀로부터 mAb2 물질을 수득하였다.

Fc 수용체 컬럼을 1.0 ㎖/분의 속도로 12 ㎖의 PBS로 세척하고 1.0 ㎖/분의 속도로 150 mM 글리신으로 용출하였다. 이 절차를 28회 반복하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 확인되었을 때, 총 용출 풀은 1.8 mg을 가졌고 관통 유동물은 15.6 mg을 가졌다.

mAb2의 글리칸 프로파일을 확인하기 위해, 관통 유동물 풀로부터 대략 35 ㎍의 IgG를 37℃에서 16시간 동안 PNGase F로 분해하여 Fc-올리고사카라이드를 방출하였다. 방출된 N-연결된 올리고사카라이드를 65℃에서 2-AB로 3시간 동안 표지하였다. 아세톤 침전을 이용하여 잔류 2-AB를 제거하였다. 선형 포름산암모늄 구배에 걸친 45℃에서의 엑스브리지 아미드 HILIC-HPLC를 형광 검출과 함께 이용하여 올리고사카라이드 분석을 수행하였다.

출발 mAb2 물질은 5.4%의 비푸코실화된 Fc 및 1.9%의 만노실화된 Fc를 가졌다. Fc 수용체 컬럼은 비푸코실화된 IgG Fc 및 만노실화된 IgG Fc에 우선적으로 결합하였다. 컬럼을 관통하여 유동하는 mAb2에는 비푸코실화된 IgG Fc 및 만노실화된 IgG Fc가 대폭 감소되어 있었다. mAb2 관통 유동물은 약 2.1%의 비푸코실화된 IgG Fc 및 1.1%의 만노실화된 IgG Fc를 가졌다. Fc 수용체 컬럼에 결합된 물질의 글리칸 프로파일은 이 경우 측정되지 않았다.

당업자는 본 개시내용의 구체적인 실시양태들에 대한 많은 등가물들이 본원에 기재되어 있다는 것을 인식할 것이거나 과도한 실험을 이용하지 않고 확인할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 범위는 상기 설명을 한정하기 위한 것이 아니다. 대안적 방법 및 물질, 및 추가 적용은 당업자에게 명확해질 것이고 하기 특허청구범위 내에 포함되기 위한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> ZEPTEON, INCORPORATED <120> POLYPEPTIDE SEPARATION METHODS <130> 339007-2000.WO <140> PCT/US2012/047699 <141> 2012-07-20 <150> 61/509,746 <151> 2011-07-20 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile 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Claims (77)

1. 적재(load) 유체에서 폴리펩티드 당형태(glycoform)를 분리하는 방법으로서,
   (a) 면역글로불린 Fc 수용체를 포함하는 매질을 제공하는 단계;
   (b) 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 수용체에 결합하는 조건 하에 상기 매질을 상기 폴리펩티드를 포함하는 적재 유체와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 수용체 결합 모이어티(moiety)를 포함하고, 상기 적재 유체가 상기 폴리펩티드의 복수의 당형태를 포함하고, 상기 Fc 수용체가 상기 당형태들 중 하나 이상에 우선적으로 결합하는 것인 단계;
   (c) 결합된 폴리펩티드가 상기 매질로부터 용출되는 조건 하에 상기 매질을 용출 용액과 접촉시키는 단계; 및
   (d) 상기 매질로부터 용출되는 결합된 폴리펩티드를 회수하여 용출물을 생성하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 또 다른 당형태에 결합하는 친화성보다 2배, 5배, 10배, 20배, 30배 이상, 40배, 50배, 100배 또는 150배 이상 더 큰 친화성으로 제1 당형태에 결합하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 매질을 용출 용액과 접촉시키기 전에 상기 매질을 하나 이상의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 매질을 관통하여 유동하는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 매질을 그의 폴리펩티드 용량의 5% 내지 1900%로 적재하는 단계를 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 적재 유체가 세포 배양 배지를 포함하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 적재 유체가 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 유체를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 적재 유체가 약학 약품 또는 약물을 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 수용체 결합 모이어티가 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 항체를 포함하는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 작은 모듈 면역약제(SMIP; small modular immunopharmaceutical), IgG-scFv 이중특이적 항체, 항체-펩티드 접합체, 항체-약물 접합체, 및 바이러스 또는 바이러스 캡시드 상의 Fc 수용체 결합 폴리펩티드로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 제조되는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 진균 세포에서 제조되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 곤충 세포에서 제조되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 식물 세포에서 제조되는 것인 방법.
17. 제13항에 있어서, 폴리펩티드가 CHO 세포에서 제조되는 것인 방법.
18. 제13항에 있어서, 폴리펩티드가 NS0 세포에서 제조되는 것인 방법.
19. 제13항에 있어서, 폴리펩티드가 Sp2/0 세포에서 제조되는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 감소된 푸코스를 갖는 당형태에 우선적으로 결합하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, Fc 수용체가 감소된 코어 N-푸코스를 갖는 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합하는 것인 방법.
22. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 증가된 고 만노스 올리고사카라이드를 갖는 폴리펩티드 당형태에 우선적으로 결합하는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 글리코실화되는 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드 또는 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 방법.
25. 제21항에 있어서, Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드 또는 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, Fc 수용체가 서열번호 1의 아미노산 잔기 21 내지 209와 85% 이상 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 세포외 도메인이 V176 동종이형(allotype)인 방법.
28. 제25항에 있어서, Fc 수용체가 전장 Fc 감마 RIII 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
29. 제1항에 있어서, 적재 유체가 Fc 수용체에 우선적으로 결합하는 제1 당형태를 포함하고, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율이 적재 유체에 비해 20% 이상 증가되는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율이 적재 유체에 비해 50%, 100%, 2배, 5배, 10배 또는 20배 이상 증가되는 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 용출물 중의 제1 당형태의 백분율이 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상인 방법.
32. 제29항에 있어서, 제1 당형태가 비푸코실화(afucosylated)된 당형태인 방법.
33. 제29항에 있어서, 제1 당형태는 시알릴화가 결여되거나 감소된 당형태인 방법.
34. 제29항에 있어서, 제1 당형태가 갈락토실화된 당형태인 방법.
35. 제29항에 있어서, 제1 당형태가 고 만노스 올리고사카라이드를 갖는 당형태인 방법.
36. 제1항에 있어서, 용출물이 매질로부터 용출된 결합된 폴리펩티드의 하나 이상의 분획을 포함하는 것인 방법.
37. 제1항에 있어서, 용출물을 분획화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
38. 제1항에 있어서, 적재 유체가 Fc 수용체에 우선적으로 결합하지 않은 제2 당형태를 포함하고, 용출물 중의 제2 당형태의 백분율이 적재 유체에 비해 감소되는 것인 방법.
39. 제1항에 있어서, 용출물 중의 폴리펩티드의 생물학적 활성이 적재 유체 중의 상기 폴리펩티드의 활성에 비해 변경되는 것인 방법.
40. 제39항에 있어서, 생물학적 활성이 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 포함하고, 이때 ADCC가 증가되는 것인 방법.
41. 제4항에 있어서, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드의 생물학적 활성이 적재 유체 중의 상기 폴리펩티드의 활성에 비해 변경되는 것인 방법.
42. 제1항에 있어서, 매질이 비드, 막, 모노리쓰(monolith), 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함하는 것인 방법.
43. 제1항에 있어서, 매질이 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본, 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함하는 것인 방법.
44. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 가교연결제 또는 효소 매개 커플링을 통해 매질에 연결되는 것인 방법.
45. 제1항에 있어서, Fc 수용체가 이황화 결합, 금속 킬레이트화, 브롬화시아노겐, NHS 연결, 히스티딘 태그, 글리시딜 에테르, 에폭시, 염화트레실 연결, 염화토실 연결, EAH 연결, ECH 연결, 활성화된 티올 연결 또는 티오프로필 연결을 통해 매질에 연결되는 것인 방법.
46. 제1항에 있어서, 매질이 0.1 mg/㎖ 내지 15 mg/㎖의 농도로 Fc 수용체를 포함하는 것인 방법.
47. 제1항에 있어서, 매질이 이 매질과 적재 유체의 접촉 전에 3.5 내지 10의 pH에서 1 mM 내지 500 mM의 완충제 및 0 mM 내지 2000 mM의 염을 포함하는 평형화 용액으로 평형화되는 것인 방법.
48. 제1항에 있어서, 적재 유체가 0.001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖의 농도로 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
49. 제1항에 있어서, 매질과 접촉되는 폴리펩티드의 양이 매질 ㎖ 당 0.1 mg 내지 25,000 mg 폴리펩티드의 범위인 방법.
50. 제3항에 있어서, 하나 이상의 세척 용액이 3.5 내지 10의 pH에서 1 mM 내지 500 mM의 완충제 및 0 mM 내지 2000 mM의 염, 및/또는 첨가제 및/또는 용매를 포함하는 것인 방법.
51. 제1항에 있어서, 용출 용액이 2 내지 5의 pH 및/또는 0 mM 내지 2000 mM의 염, 및/또는 첨가제 및/또는 용매를 갖는 것인 방법.
52. 제1항에 있어서, 매질이 pH 구배가 적용되는 조건 하에 하나 이상의 용출 용액과 접촉되는 것인 방법.
53. 제1항에 있어서, 용출물을 중화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
54. 제1항에 있어서, 용출물을 제2 매질과 접촉시키는 단계, 및 제2 매질을 관통하여 유동하거나 제2 매질로부터 용출되는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
55. 제54항에 있어서, 제2 매질이 이온 교환 매질, 하이드록시아파타이트 매질, 단백질 A 매질, 소수성 상호작용 매질, 고정된 금속 친화성 매질, 합성 매질(바이오미메틱(biomimetic)), 렉틴, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
56. 제1항에 있어서, 용출물 중의 폴리펩티드로부터 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
57. 제4항에 있어서, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드로부터 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
58. 제1항에 있어서, 매질로부터 용출된 폴리펩티드의 특징을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 폴리펩티드로부터의 올리고사카라이드가 분석되는 것인 방법.
60. 제58항에 있어서, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 분석되는 것인 방법.
61. 제58항에 있어서, 독성, 안정성 또는 효능 중 하나 이상이 분석되는 것인 방법.
62. 제58항에 있어서, 분석하는 단계가 적재 유체 중의 폴리펩티드 및/또는 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드를 분석하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
63. 제4항에 있어서, 매질을 관통하여 유동한 폴리펩티드를 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
64. 제63항에 있어서, 폴리펩티드 상의 올리고사카라이드가 분석되는 것인 방법.
65. 제63항에 있어서, 독성, 안정성 또는 효능 중 하나 이상이 분석되는 것인 방법.
66. 제63항에 있어서, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 분석되는 것인 방법.
67. 제1항의 방법에 의해 회수된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
68. (a) Fc 수용체를 포함하는 매질을 제공하는 단계로서, 이때 Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 단계;
    (b) 폴리펩티드가 상기 매질에 결합하는 조건 하에 상기 매질을 상기 폴리펩티드를 포함하는 적재 유체와 접촉시키는 단계로서, 이때 상기 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인 단계;
    (c) 결합된 폴리펩티드가 상기 매질로부터 용출되는 조건 하에 상기 매질을 용출 용액과 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 매질로부터 용출되는 결합된 폴리펩티드를 회수하여 용출물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
69. 제68항에 있어서, Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
70. 고체 지지체에 연결된 Fc 수용체를 포함하는 매질로서, 이때 상기 Fc 수용체가 Fc 감마 RIII 폴리펩티드의 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 매질.
71. 제70항에 있어서, 고체 지지체가 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본(예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함하는 것인 매질.
72. 제70항에 있어서, 고체 지지체가 비드, 막, 모노리쓰, 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함하는 것인 매질.
73. 제1항 또는 제68항에 있어서, 적재 유체가 혈청 IgG를 포함하는 것인 방법.
74. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 수용체가 Fc 감마 RIIIa V176, Fc 감마 RIIIa F176, Fc 감마 RIIIb NA1, Fc 감마 RIIIb NA2, Fc 감마 RIIa H131, Fc 감마 RIIa R131, Fc 감마 RIIb I232 및 Fc 감마 RIIb T232로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
75. (a) 고체 지지체에 연결된 면역글로불린 Fc 수용체를 포함하는 매질로서, 이때 상기 면역글로불린 Fc 수용체가 Fc 감마 RI 폴리펩티드, Fc 감마 RII 폴리펩티드, Fc 감마 RIII 폴리펩티드 및 Fc 감마 RIV 폴리펩티드의 Fc 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 결합 부분을 포함하는 것인 매질; 및 (b) 제1항의 방법에 따른 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트.
76. 제75항에 있어서, 고체 지지체가 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란, 세라믹, 금속, 유리, 나일론, 테플론, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 설폰, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 플루오로카본(예를 들면, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)), 폴리에틸렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리(아졸락톤)을 포함하는 것인 키트.
77. 제75항에 있어서, 고체 지지체가 비드, 막, 모노리쓰, 섬유 매트릭스, 다공성 매질 또는 겔을 포함하는 것인 키트.

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