JP4875486B2 - 改変されたｎ−グリカンを下等真核生物において産生するためのコンビナトリアルｄｎａライブラリー - Google Patents

改変されたｎ−グリカンを下等真核生物において産生するためのコンビナトリアルｄｎａライブラリー Download PDF

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Description

（連邦により支援された研究に関する言及）
本発明は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの政府の助成金（ＮＩＨ Ｐｈａｓｅ Ｉ 助成金番号１Ｒ４３ＧＭ６６６９０−１）、およびＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅからの助成金（ＮＩＳＴ−ＡＴＰ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ認可番号７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０４６）により資金援助された。従って、米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
（関連出願の引用）
本出願は、米国出願第１０／３７１，８７７号に対する優先権を主張し、この出願は、２０００年６月２８日に出願された米国仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６月３０日に出願された米国仮出願第６０／２１５，６３８号、および２００１年３月３０日に出願された米国仮出願第６０／２７９，９９７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張する、２００１年６月２７日に出願された米国出願第０９／８９２，５９１号の一部継続出願である；これらの出願の各々は、その全体が、参考として本明細書中に援用される。
（発明の分野）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞（例えば、真菌細胞または他の真核生物細胞）が、動物細胞（特に、ヒト細胞）によって産生される糖タンパク質と類似のグリコシル化パターンを有するグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を産生するように遺伝的に改変され得る、方法および組成物に関する。これは、ヒトまたは動物の治療剤として有用である。
（発明の背景）
（ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路）
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは、グリコシル化として知られるプロセスである、糖残基の結合を含む。異なる生物は異なるグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して、異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、そしてグリコシル化する場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する（Ｍｏｅｎｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，１９９７ Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（３）：１６９−１７５）。繊維状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高マンノース」型のグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、なお別の方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等真核生物においては、発生期のオリゴ糖側鎖がトリミングされて、いくつかのマンノース残基が除去され得、下等真核生物のＮ−グリカンでは典型的には見られないさらなる糖残基で延長され得る。例えば、Ｒ．Ｋ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１９９９，３０，１９３−２００；Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，２０，１１７１−１１７７；Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａｌｉａｓｓａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２６７，１６９−１７３；Ｊａｒｖｉｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，９：５２８−５３３；およびＭ Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，９，Ｓ２９−Ｓ３５参照。
哺乳動物型のオリゴ糖構造の合成は、一連の系列的反応で開始し、この系列の経過において、当該タンパク質が宿主生物における分泌経路に沿って移動する間に、糖残基が付加および除去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンを決定する。従って、下等真核生物宿主細胞で発現されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺乳動物のような高等真核生物で発現されたタンパク質のグリコシル化パターンとは実質的に異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。典型的な真菌Ｎ−グリカンの構造を図１Ａに示す。
ヒトグリコシル化の初期の工程は、少なくとも２つの異なる段階に分けることができる：（ｉ）脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜での系列的な一連の反応によって組み立てられ、そして（ｉｉ）該脂質からのこのオリゴ糖の移動は、ドリチルピロホスフェートを、デノボ合成されたタンパク質に係留させる。特異的移動の部位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌ，１９９０）。グリコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなるプロセシングは、発生期の糖タンパク質が初期ゴルジ装置に移動する前にＥＲで起こり、そこで、さらなるマンノース残基はゴルジ特異的アルファ（α）−１，２−マンノシダーゼによって除去される。タンパク質がゴルジを通って進むにつれ、プロセシングは継続する。ゴルジ中間嚢において、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含めた多数の修飾酵素が、特定の糖残基を付加および除去する。最後にはトランス−ゴルジ（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ）において、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は糖タンパク質構造を生じ、これがゴルジから放出される。糖タンパク質にそのヒト特徴を与えるものは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび高度の末端シアル酸を含有する、ビ−アンテナ構造、トリ−アンテナ構造およびテトラ−アンテナ構造によって特徴付けられるこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１Ｂに示す。
ほとんど全ての真核生物において、糖タンパク質は共通する脂質結合オリゴ糖前駆体Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコール−ピロホスフェートに由来する。小胞体内では、ドリコールピロホスフェート結合オリゴ糖の合成およびプロセシングは全ての公知の真核生物の間で同一である。しかしながら、真菌細胞（例えば、酵母）によるコアオリゴ糖のさらなるプロセシングは、一旦それがペプチドに移動し、ＥＲを去って、ゴルジに入れば、それが分泌経路に沿って移動するにつれヒトとは有意に異なり、いくつかのマンノース糖の付加を含む。
酵母においては、これらの工程は、順次にマンノース糖をコアオリゴ糖に加える、Ｏｃｈ１ｐ、Ｍｎｔ１ｐおよびＭｎｎ１ｐのようなゴルジに存在するマンノシル−トランスフェラーゼによって触媒される。得られる構造はヒト様タンパク質の生産には望ましくなく、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除するのが望ましい。マンノシル−トランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は、致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖おいて低下したマンノース含有量を呈することが示されている。他のオリゴ糖プロセシング酵素（例えば、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ）はまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに依存して、排除されなければならないかもしれない。
（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および繊維状真菌で生産される糖タンパク質では見出されない。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）がサイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ １９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；ＰｅｒｅｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ １９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。
グリコシル移動反応は、典型的には、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸である副産物を生じる。一リン酸は交互輸送機構によってヌクレオチド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸送することができるが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送されるに先立って、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、ヌクレオシド一リン酸および無機ホスフェートを生じなければならない。この反応は効率的なグリコシル化に重要であり；例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要であることが判明している。しかしながら、そのＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに向けて９０％低下した活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、典型的にはゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を欠く。なぜなら、それはゴルジ−ベースの糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加えることが判明している酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、そのような酵素についての潜在的要件を示す（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら，１９９４）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの管腔においてグリコシルトランスフェラーゼの阻害を妨げるのに重要であり得る（Ｋｈａｔａｒａら，１９７４）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ、Ｐ．ら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔ，Ｌ．ら，１９９８ Ａｂｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ．２９２：３９７−４１３参照。
（区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの順次のプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）はＥＲおよびゴルジ装置の内部（ルミナル）表面をライニングし、それにより、それがＥＲおよびゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触媒」表面を提供する。シス、ゴルジ中間嚢およびトランスのゴルジの多数区画ならびにトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＥＲにおける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特異的炭水化物構造が合成され得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各細胞小器官に保持し、係留する正確な機構を明らかにするために多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証拠は、ステム領域、膜貫通領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素を個々の細胞小器官の膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその遺伝子座に局在化することを示唆する（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．Ａ．（１９９８）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２参照）。
いくつかの場合において、これらの特異的相互作用は種をまたいで機能することが見出された。例えば、ラット由来のα２，６−ＳＴ（該動物のトランス−ゴルジに局在化することが知られている酵素）の膜貫通ドメインは、酵母ゴルジにおいてやはりレポーター遺伝子（インベルターゼ）を局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，１９９５）。しかしながら、全長α２，６−ＳＴの一部としての非常に同一の膜貫通ドメインはＥＲに保持され、酵母のゴルジにさらには輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎら，１９９４）。ヒト由来の全長ＧａｌＴは、高い転写レベルにも拘らず、酵母では合成さえされなかった。対照的に、インベルターゼレポーターに融合された同じヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低い生産レベルにも拘らず酵母ゴルジへの局在化を方向付けることができた。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者は、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＴ１）の２８アミノ酸、小胞体テイルを含む領域、膜貫通領域およびステム領域の８つのアミノ酸を、ヒトＧａｌＴの触媒領域へ融合させることは、活性なＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを示した。他のガラクトシルトランスフェラーゼは特定の細胞小器官に存在する酵素との相互作用に依拠するようである。なぜならば、その膜貫通領域の除去の後には、それは依然として適切に局在化できるからである。
グリコシル化酵素の不適切な局在化は、その経路における酵素の適切な機能を妨げ得る。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＥａｄｅｓおよびＨｉｎｔｚ，２０００ Ｇｅｎｅ ２５５（１）：２５−３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い総じてのレベルにも拘らず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で形質転換した場合にＧｌｃＮＡｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅｒら，１９９５）。ＧｎＴＩは、活発に発現されるものの、該酵素がその基質の双方：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび生産的Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質（全てのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が生産的というのではない；後記参照）と接触しないように不正確に局在化され得る。あるいは、宿主生物はゴルジにおいて適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供することができないか、または該酵素は適切に局在化されないかも知れないが、それにも拘らず、その新しい環境で不活性である。加えて、宿主細胞に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、哺乳動物で見出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓおよび共同研究者は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから得られたセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）からのＮ−グリカンの約３分の１がインビトロにてＡ．Ｓａｉｔｏｉ １，２−マンノシダーゼよってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされ得ることを見出した。しかしながら、それらのＮ−グリカンの１％未満がＧｎＴＩに対する生産的基質として働くことができた。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の単なる存在は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングを達成できることを保証しない。必要なのは、生産的なＧｎＴＩ反応性Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の形成である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は細胞で生産され得るが（約２７モル％）、小さな割合のみがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（約５％未満、Ｃｈｉｂａ ＷＯ ０１／１４５２２参照）。
現在まで、下等真核生物における特定の異種的に発現されたグリコシルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼが（１）十分に翻訳され、（２）触媒的に活性であり、または（３）分泌経路内で適切な細胞小器官に局在化されるかを予測する信頼できる方法はない。これらの全ての３つは下等真核生物においてグリコシル化パターンに影響する必要があるので、現在利用できない、予測ツールの非存在下で酵素の所望の触媒機能および適切な保持を達成するためのシステム的なスキームが望まれる。
（治療糖タンパク質の生産）
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定７０％がグリコシル化され、従って、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化できる生産システム（すなわち、宿主細胞）に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が（１）免疫原性、（２）薬物動態学特性、（３）トラフィッキングおよび（４）治療タンパク質の効率を決定することにおいて重要な役割を演じることを示している。従って、製薬産業によるかなりの努力は、できる限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロセスを開発することに向けられてきた。今日、ほとんどの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化（すなわち、シアル酸の末端添加）の程度を増強させるそのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含むことができ、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが知られている。別法として、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのヌクレオチド糖（例えば、２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良することができる。
ほとんどの高等真核生物は、ヒトで見出されたのと類似のグリコシル化反応を行うが、前記宿主系で発現された組換えヒトタンパク質は、不変的に、その「天然」ヒト対応物とは異なる（Ｒａｊｕ，２０００）。従って、広範な開発研究が、これらの発現系で作られるタンパク質の「ヒト特性」を改良する方法を見出すことに向けられてきた。これは、醗酵条件の最適化、およびヒト様グリコ形態の形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の遺伝的修飾を含む（Ｗｅｒｎｅｒ，１９９８；Ｗｅｉｋｅｒｔ，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，１９９４；Ｙａｎｇ，２０００）。全ての哺乳動物発現系に関する固有の問題は解決されていない。
哺乳動物細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞、マウス細胞またはヒト細胞）に基づく醗酵プロセスは、例えば、非常に遅い傾向があり（１週間を超える醗酵時間は、通常ではない）、しばしば、低い産生力かを生じ、高価な栄養および補因子（例えば、ウシ胎仔血清）を必要とし、プログラムされた細胞視（アポトーシス）によって制限され、そしてしばしば、特定の治療的に価値のあるタンパク質を発現し得ない。より重要なことには、哺乳動物細胞は、ヒト病原体である可能性があるウイルスの影響を受けやすく、そしてストリンジェントな品質管理が、生成物の安全性を保証するために必要とされる。このことは、多くのこのようなプロセスが、動物由来の複雑かつ温度感受性の培地構成要素（例えば、仔ウシ血清）（これらは、ヒトに対して病原性である因子（例えば、ウシ海面状脳症（ＢＳＥ）のプリオンまたはウイルス）を運び得る）の添加を必要とするので、特に問題である。さらに、治療化合物の生成は、好ましくは、十分に制御された滅菌環境中で実施される。動物の農場は、どのように清浄に維持されようとも、このような環境を構成せず、従って、高体積の治療タンパク質を製造するためのトランスジェニック動物の使用において、さらなる問題を構成する。
従って、全てではなければほとんどの、現在生成されている治療糖タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現され、そして多くの努力が、これらの組換えタンパク質のグリコシル化パターンを改善する（すなわち、「ヒト化する」）ことに向けられている。培地の組成の変化、および非とグリコシル化に関与する酵素をコードする遺伝子の同時発現が、首尾よく使用されている（例えば、Ｗｅｉｋｅｒｔ，１９９９を参照のこと）。
（真核生物微生物を用いる糖タンパク質の生産）
適切な哺乳動物発現系がないことは、治療用途のための組換えヒト糖タンパク質の低費用かつ安全な産生に対する重大な障害である。哺乳動物（例えば、ヒト）の対応物に類似の組換えタンパク質を、下等真核生物（真菌および酵素）において産生することが望ましい。微生物の醗酵を介する糖タンパク質の産生は、既存の系より優れた多数の利点を与える。例えば、醗酵に基づくプロセスは、以下を提供し得る：（ａ）高濃度のタンパク質の迅速な産生；（ｂ）滅菌された、十分に制御された産生条件を使用する能力；（ｃ）単純な、化学的に規定された（タンパク質を含まない）増殖培地を使用する能力；（ｄ）遺伝子操作の容易さ；（ｅ）汚染するウイルスのようなヒトまたは動物の病原体の非存在；（ｆ）広範な種々のタンパク質（毒性などに起因して、細胞中では乏しくしか発現されないタンパク質を含む）を発現する能力；および（ｇ）タンパク質の回収の容易さ（例えば、培地中への分泌を介する）。さらに、醗酵は、酵母および真菌が、一般に、細胞培養が容易にするよりもはるかに低費用で、構築することを容易にする。小胞体におけるタンパク質に移動されたコアオリゴ糖構造は基本的には哺乳動物および下等真核生物で同一であるが、実質的な差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こるその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よりも優れた注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。
内因性宿主グリコシル化経路を利用する酵母のような微生物宿主で生産された治療糖タンパク質は、哺乳動物細胞で生産されたものと構造的に異なり、典型的には、大いに低下した治療効果を示す。そのような糖タンパク質は、典型的には、ヒトにおいては免疫原性であり、投与の後にはインビボで低下した半減期（従って、低下した生物活性）を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９７）。ヒトおよび動物における特異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は末端マンノース残基を認識し、血流から外来性糖タンパク質の迅速なクリアランスを促進することができる。さらなる悪影響はタンパク質折畳、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルギー性の変化を含み得る。
酵母および繊維状真菌は、共に、細胞内および分泌された双方の組換えタンパク質の生産で首尾よく用いられてきた（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ ２０００ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：４５−６６；Ｈａｒｋｋｉ，Ａ．ら，１９８９ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６）：５９６；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．ら，１９９２ Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａ，Ｍ．ら，２０００ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−２５１）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのような種々の酵母は真核生物発現系として特に重要な役割を演じてきた。何故ならば、それらは、高い細胞密度まで増殖し、大量の組換えタンパク質を分泌できるからである。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａなどのような繊維状真菌は、産業スケールで糖タンパク質を効果的に生産するのに用いられてきた。しかしながら、前記したように、これらの真核生物微生物のいずれかにおいて発現される糖タンパク質は、動物におけるものとはＮ−グリカン構造が実質的に異なる。このことは、多くの治療糖タンパク質のための生産で宿主としての酵母または繊維状真菌の使用を妨げてきた。
酵母および真菌におけるグルコシリ化はヒトにおけるものと非常に異なるが、いくつかの共通する要素が共有されている。第一の工程、コアオリゴ糖構造の新成タンパク質への移動は酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物で高度に保存されている（図１Ａおよび１Ｂを比較のこと）。しかしながら、コアオリゴ糖のその後のプロセシングは酵母においてかなり異なり、数個のマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴルジに存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１など）によって触媒され、これはマンノース糖をコアオリゴ糖に順次に付加する。得られた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産には望ましくなく、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除することが望ましい。マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖において低下したマンノース含有量を呈することが示されている。また、マンノシルリン酸トランスフェラーゼのような他のオリゴ糖プロセシング酵素もまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに応じて排除しなければならない。望まない内因性グリコシル化反応を低下させた後、複合Ｎ−グリカンの形成が宿主系でなされなければならない。これは、数個の酵素および糖ヌクレオチドトランスポーターの安定な発現を必要とする。さらに、成熟化するグリコシル化構造の順次のプロセシングが確実になるように、これらの酵素を局在化する必要がある。
哺乳動物治療剤として用いるのにより適した糖タンパク質を提供するために真核生物微生物のグリコシル化経路を修飾しようとするいくつかの努力がなされてきた。例えば、数個のグリコシルトランスフェラーゼが別々にクローン化され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌で発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａら，１９９９，Ｇ，Ｋａｌｓｎｅｒら，１９９５ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０，Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら，１９９５）。しかしながら、ヒト細胞で作製されたものに似ているＮ−グリカンは得られなかった。
酵母は多様なマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１のような１，３−マンノシルトランスフェラーゼ；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｅｍｒ，１９９１ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８）、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギュレーター（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、ならびに内因性グリコシル化反応に関与するさらなる酵素を生産する。これらの遺伝子の多くは個々に欠失され、改変されたグリコシル化プロフィールを有する生きた生物を生起する。その例を表１に示す。
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 日本国特許出願第８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１ホモログの欠失を開示している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨ１は、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に付加してＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせる１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。次いで、３つの１，６マンノース残基を含むＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造はインビボにてさらなる１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、１，６−マンノシルトランスフェラーゼおよび１，３−マンノシルトランスフェラーゼに対する基質となり、これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特徴的であって、典型的には、Ｎ−グリカン当たり３０〜４０のマンノース残基を有し得る高マンノシル化糖タンパク質に導く。Ｏｃｈ１ｐは１，６マンノースのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コアへの移動を開始する故に、それは、しばしば、それをゴルジにおいて後に作用する他の１，６マンノシルトランスフェラーゼから区別するために「開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１ ｍｎｎ１ ｍｎｎ４変異体株において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２でグリコシル化されたタンパク質が蓄積し、超マンノシル化は起こらない。しかしながら、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２はヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのような哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼに対する基質ではなく、従って、それ自身での、その変異体株の使用は、哺乳動物様タンパク質（すなわち、複雑なまたはハイブリッドグリコシル化パターンを有する）を生産するのに有用ではない。
日本国特許出願公開番号８−３３６３８７は、減少したマンノシル化表現型を示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体を得る方法を開示するが、この文献は、ＯＣＨ１によってコードされると考えられる１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が減少したのか排除されたのかに関するデータを提供しない。真菌遺伝学の分野において、遺伝子のホモログは、しばしば、そのそれぞれの宿主生物において、同じ役割を果たさないことが、十分に確立されている。例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｒｃａ−１遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌｂＤ胞子形成変異体に相補性であるが、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ胞子形成において、同定可能な役割を有さない。Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８；１４８（３）：１１０３１−４１。より最近、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ（ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２）は、Ｐ．ｐａｓｔｒｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体において、細胞壁グリカンの少なくとも５０％が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされ得ないことを示す（ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２の図１１を参照のこと）。その野生型は、非常に類似のグリコシル化パターンを示すので（ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２の図１０のパネル２を参照のこと）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１遺伝子は、初期の１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードしないかもしれず、従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける遺伝的ホモログとは異なるようである。従って、現在まで、初期のα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体において排除されているという証拠が存在せず、これはさらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのグリコシル化経路が有意に異なるという概念を支持する。
Ｍａｒｔｉｎｅｔら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８，２０（１２），１１７１−１１７７）は、α−１，２−マンノシダーゼの、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中のＴ．ｒｅｅｓｅｉからの発現を報告した。モデルタンパク質のＮ−グリカンから切り取られたいくつかのマンノースが、観察された。しかし、このモデルタンパク質は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（これは、複雑なＮ−グリカンの生成のための中間体として必要である）を有するＮ−グリカンを有さなかった。従って、この系は、複雑な、または構成したグリコシルパターンを有するタンパク質を産生するためには、有用ではない。
同様に、Ｃｈｉｂａら（１９９８）は、α−１，２−マンノシダーゼを、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉから発現させた。シグナルペプチド配列（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）（配列番号５）が、小胞体におけるその保持を促進するように、外因性マンノシダーゼに操作された。さらに、この酵母宿主は、タンパク質の過剰マンノシル化に関連する酵素活性を欠く変異体であった：１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ｏｃｈ１）；１，３−マンノシルトランスフェラーゼ（ｍｎｎ１）；およびマンノシルホスフェートトランスフェラーゼのレギュレーター（ｍｎｎ４）。この三重変異体宿主のＮ−グリカンは、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて見出される高マンノース形態ではなく、主として、構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からなった。この操作されたマンノシダーゼの存在下で、モデルタンパク質のＮ−グリカン（カルボキシペプチダーゼＹ）がトリミングされて、２７モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、２２モル％のＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、２２モル％のＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、および２９モル％のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からなる混合物を与えた。細胞壁糖タンパク質のトリミングは、効率がより低く、１０モル％のみのＮ−グリカンが、所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有した。
全てのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンが、ＧｎＴＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転換され得る正しいＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であった場合でさえも、上記系は、ヒト様グリコシル化パタンーを有するタンパク質の産生のためには、十分ではない。いくつかのグリコシル化部位が、所望のタンパク質において存在する場合、このようなタンパク質を正しい形態で得る確率（Ｐ）は、Ｐ＝（Ｆ）ｎの関係に従う。ここで、ｎは、グリコシル化部位の数に等しく、そしてＦは、所望の糖形態の割合である。３つのグリコシル化部位を有する糖タンパク質は、その全てのグリコシル化部位に対する複雑かつ構成したＮ−グリカンプロセシングのために適切な前駆体を提供する、０．１％の機会を有する。従って、単一のＮ−グリコシル化部位を有する糖タンパク質を作製するために、Ｃｈｉｂａの系を使用することは、少なくとも７３モル％が、正しくない構造を有する。２つまたは３つのＮ−グリコシル化部位を有する糖タンパク質については、それぞれ、９３モル％または９８モル％が、正しくない構造を有する。転換のこのような低い効率は、治療剤の産生のために不満足である。なぜなら、特に、異なる糖形態を有するタンパク質の分離は、代表的に、費用がかかり、そして困難であるからである。
Ｃｈｉｂａら（ＷＯ ０１／１４５２２）は、高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を、組換え線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生された、分泌された可溶性糖タンパク質）上で示した。しかし、検出されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、宿主細胞の内部で（すなわち、インビボで）産生されたことは、明らかではない。なぜなら、α−１，２マンノシダーゼは、ＨＤＥＬ（配列番号５）局在タグとの融合（漏出性であることが公知の機構）によって標的化されたからである（Ｐｅｌｈａｍ Ｈ．Ｒ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．７，９１３−９１８）。ＦＧＦが培地中に分泌され、次いでそこで、ＨＤＥＬ（配列番号５）回収機構を逃れてその培地中に漏出したα−１，２マンノシダーゼによってプロセシングされたことが、より確率が高い。上述のように、同じ株において発現される細胞内タンパク質（ＣＰＹ）は、主として、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびそれより大きいグリカン（７３％より多く）を含んだ。従って、ＦＧＦのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の大部分は、エキソビボで産生されるようである。さらに、産生されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造がＧｎＴＩに対する生産性基質であるか否かは、明らかではない。
上記研究が実証するように、Ａ．ｓａｉｔｏｉに由来する真菌マンノシダーゼを小胞体（ＥＲ）内へ操作することによって、（インビボにて５０％より高い高効率トリミングは未だ証明されていないが）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２異性体にトリミングすることができる。このアプローチの欠点は二倍にある：（１）形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が実際に（分泌され、細胞外部でマンノシダーゼによってさらに修飾されたというよりはむしろ）インビボで形成されたか否かは明確ではなく；そして（２）いずれかの形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、もし実際にインビボで形成されたならばＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるその後のＮ−グリカン修飾に対する生産的な基質である正しいイソ形態であるかは明らかでない（Ｍａｒａｓら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。
真菌宿主に由来するよりヒト様糖タンパク質を提供する目的で、米国特許５，８３４，２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉに由来するハイブリッド糖タンパク質を生産する方法を開示する。ハイブリッドＮ−グリカンはコアマンノース構造のＭａｎα１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１または２の複雑なアンテナを有する。この構造は有用性を有するが、該方法は、多数の酵素工程をインビトロで行わなければならず、これは、コスト高で時間を消費する不利を有する。単離された酵素は調製するのにコスト高であり、コスト高の基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を必要とする。また、該方法は所望のタンパク質上での複雑なグリカンの生成を可能としない。
（Ｎ−グリカントリミングに関与する細胞内マンノシダーゼ活性）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物において複雑なＮ−グリカン形成のための主な中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングで必要である。以前の研究は、切形されたマウス、真菌およびヒトα−１，２−マンノシダーゼがメチロトロピック酵母Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミング活性を呈することができることを示した（Ｌａｌら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ Ｏｃｔ；８（１０）：９８１−９５；Ｔｒｅｍｂｌａｙら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ Ｊｕｎ；８（６）：５８５−９５，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら，２００１）。しかしながら、今日、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの分泌された糖タンパク質でのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
一次Ｎ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生することができる株を作製するのは有用であるが、ヒトグリカンにより近く似せるようにこれらの高マンノース前駆体構造をさらに修飾しようとするいずれの試みもさらなるインビボまたはインビトロ工程を必要とする。インビトロにて真菌および酵母からのグリカンをさらにヒト化する方法は米国特許第５，８３４，２５１号（前出）に記載されている。もし、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をさらにインビボでヒト化すべきならば、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が、事実、細胞内で生じ、培地中でのマンノシダーゼ活性の生成物ではないことを保証しなければならない。酵母または真菌における複雑なＮ−グリカン形成は、細胞内で生じさせるべき高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を必要とする。なぜならば、細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンのみがインビボでハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンにプロセシングできるからである。加えて、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の大部分は、実際、ＧｎＴＩに対する基質であり、ハイブリッドおよび複雑なＮ−グリカンの形成を可能とすることを示さなければならない。
さらに、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼの単なる存在は、それ自体、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への適切な細胞内トリミングを保証しない（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＤＥＬ（配列番号５）タグ化マンノシダーゼが一義的にＥＲに局在化され、実質的にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が欠失できないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）レポータータンパク質と共に共発現される、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２参照。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ，初期ゴルジおよびサイトゾルに局在化されたキメラα−１，２−マンノシダーゼ／Ｏｃｈ１ｐ膜貫通ドメイン融合はマンノシダーゼトリミング活性を有しない、Ｃｈｉｂａら，１９９８（前出）も参照されたし）。従って、ＥＲまたはゴルジにおけるマンノシダーゼの単なる局在化は、その標的化された細胞小器官において各酵素の活性を保証するには不十分である（また、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのα−１，２−マンノシダーゼが、細胞内に局在化しつつ、マンノシル化の程度を減少させるよりはむしろ増加させたことを示す、Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９８），前出も参照されたし）。今日膜貫通局在化配列を用いる、酵母または真菌いずれかにおける活性な異種α−１，２−マンノシダーゼの細胞内の局在化を示す報告はない。
従って、非ヒト真核生物宿主細胞、特に酵母および繊維状真菌においてヒト様糖タンパク質構造へさらにプロセシングすることができる高細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有量によって特徴付けられる糖タンパク質を生産するための方法に対する要望が存在する。
（発明の要旨）
遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する、宿主細胞および細胞株が開発された。この経路は、これらの細胞が、哺乳動物（特に、ヒト）における糖タンパク質のプロセシングを模倣する、一連の酵素反応を起こすことを可能にする。これらの操作された宿主において発現された組換えタンパク質は、それらの哺乳動物（例えば、ヒト）対応物と実質的に同一でなければより類似した糖タンパク質を生じる。培養物中で増殖中の、本発明の宿主細胞（例えば、下等真核生物微生物および他の非ヒト真核生物宿主細胞）は、ヒトグリコシル化経路に沿って賛成されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２または他の構造のようなＮ−グリカンを産生するように改変される。これは、操作された株および／または株の選択の組み合わせを使用して達成される。この組み合わせは、真菌糖タンパク質に特徴的な所望でな構造を作製する特定の酵素を発現せず；活性が達成される宿主細胞中に存在する条件下で最適な活性を有するように選択された異種酵素を発現し；またはこの組み合わせであり；ここで、遺伝的に操作された真核生物は、「ヒト様」糖タンパク質を産生するために必要な、少なくとも１つの異種酵素活性を発現する。本発明の宿主細胞は、１つ以上の活性（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ）の異種発現によって、哺乳動物（例えば、ヒト）の治療用糖タンパク質の産生のための株になるように、さらに改変され得る。
従って、本発明は、（１）化糖真核生物宿主（例えば、単細胞真菌もしくは線状真菌）、または（２）ヒトとは異なるグリコシル化パターンを有する任意の非ヒト真核生物生物を使用して、宿主生物（「宿主細胞」）において作製されるタンパク質のグリコシル化組成および構造を、哺乳動物（例えば、ヒト）タンパク質において見出される炭水化物構造により近く類似するように改変する、糖タンパク質産生方法を提供する。このプロセスは、任意の望ましい遺伝子（例えば、グリコシルに関与する遺伝子）を発現および標的化するために使用され得る、操作された宿主細胞を、科学文献において十分に確立された、タンパク質発現の分野の当業者に一般的に公知の方法によって、得ることを可能にする。改変されたオリゴ糖を有する宿主細胞が、分泌または選択される。これらの操作された宿主細胞において作製されるＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有し、このコア構造が次いで、１種以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ）の異種発現によってさらに改変され、ヒト様糖タンパク質を与え得る。治療用タンパク質の産生のために、この方法は、所望のグリコシル化構造が得られ得る細胞株を操作するために適合され得る。
従って、１つの実施形態において、本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供する。本発明の宿主細胞は、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇するように（この活性は、枯渇しなければ、糖タンパク質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加する）選択または操作される。１つ以上の酵素（酵素活性）が、宿主細胞に導入され、これが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造を高収率で、例えば、少なくとも３０モル％での産生を可能にする。より好ましい実施形態において、宿主細胞において産生されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の少なくとも１０％が、ＧｎＴＩに対する産生性基質であり、従って、哺乳動物（特に、ヒト）において形成されたものと類似または同一の、仕上げられたＮ−グリカンを産生する、インビボおよび／またはインビトロでのさらなるグリコシル化反応に対する、産生性基質である。
さらなる実施形態において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の産生のための１種以上の酵素をコードする核酸分子が、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を枯渇するように選択または操作された宿主細胞に、導入される。１つの好ましい実施形態において、宿主細胞に導入される少なくとも１種の酵素は、この炭水化物構造が産生される細胞下位置のｐＨにおいて、最適な活性を有するように選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１種の酵素は、この酵素と通常は会合しない細胞標的化シグナルペプチドを含むキメラタンパク質によって、この酵素が最適な活性を有する宿主細胞下細胞小器官に標的化される。
本発明は、Ｐ．ａｓｔｒｏｓｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓから単離された、初期のα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする単離された核酸分子、およびこのような分子を含むベクターをさらに提供する。これらの核酸分子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子に対して相同である配列を含む。これらの配列およびホモログ配列は、糖タンパク質のＮ−グリカンを過剰にマンノシル化しない宿主細胞を構築するために、有用である。
別の実施形態において、この宿主細胞は、異種グリコシダーゼを発現するように、例えば、グリコシダーゼをコードする１種以上の核酸分子をこの宿主細胞に導入することによって、操作される。好ましくは、この核酸分子は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からの、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生に関与する、１種以上のマンノシダーゼ活性をコードする。好ましい実施形態において、コードされるマンノシダーゼ活性のうちの少なくとも１つは、マンノシダーゼ活性が局在する細胞小器官における他の代表的な酵素の最適な平均ｐＨの１．４ｐｈ単位以内の最適ｐＨを有するか、または約５．１と約８．０との間、好ましくは、約５．５と約７．５との間のｐＨで最適な活性を有する。好ましくは、異種酵素は、宿主生物の小胞体、ゴルジ装置またはＥＲとゴルジ体との間の輸送小胞体に標的化され、ここで、Ｎ−グリカン（例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）をトリミングして、高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じる。１つの実施形態において、この酵素は、この酵素の触媒ドメインと細胞標的化シグナルペプチドとの間での融合タンパク質の形成によって、例えば、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントの、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントでのインフレームでのライゲーションによって、標的化される。
なお別の実施形態において、宿主のグリコシル家計路は、糖ヌクレオチドトランスポーターを発現するように改変される。好ましい実施形態において、ヌクレオチドジホスファターゼ酵素もまた、発現される。これらのトランスポーターおよびジホスファターゼは、グリコシル化酵素のための適切な基質を適切な区画で提供し、競合産生阻害を減少させ、そしてヌクレオチド二リン酸の除去を促進することによって、操作されたグリコシル化工程の効率を改善する。
本発明はまた、所望のタンパク質またはポリペプチドフラグメント（例えば、グリコシル化に関与する酵素またはその触媒ドメイン）を、宿主細胞の選択された細胞下領域に標的化させ得る、融合構築物を作製するために有用な、コンビナトリアル核酸ライブラリーを提供する。１つの好ましい実施形態において、この組換え核酸ライブラリーは、以下を含む：（ａ）異なる細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸分子、および（ｂ）標的化されるべき異なるポリペプチドをコードする核酸配列。（ａ）および（ｂ）由来の核酸配列またはそれら由来の核酸配列が、一緒にライゲーションされた、融合構築物を賛成し、これらのうちの少なくとも１つが、異種細胞標的化シグナルペプチド（すなわち、通常は会合しないペプチド）にインフレームでライゲーションした機能的タンパク質ドメイン（例えば、酵素の触媒ドメイン）をコードする。
本発明はまた、グリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼを含むＮ−グリカンの修飾に関与する酵素を使用して、宿主細胞（例えば、ヒト宿主細胞を含む、任意の真核生物宿主細胞）のグリコシル化経路を、この宿主細胞を本発明の核酸（例えば、コンビナトリアル）ライブラリーで形質転換して、少なくとも１つ、そして好ましくは２つ異常の異なるキメラグリコシル化酵素（この酵素は、通常はこの酵素と会合しない細胞標的化シグナルペプチドにインフレームでライゲーションされた触媒ドメインを有する）を発現する、遺伝的に混合された細胞集団を産生することによって、改変するための方法を提供する。所望のグリコシル化表現型を有する宿主細胞は、必要に応じて、集団から選択され得る。本発明のライブラリー歩呼び関連する方法を使用して改変された宿主細胞は、例えば、哺乳動物（特に、ヒト）において産生されるものと類似または同一のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するために、有用である。
別の局面において、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、触媒活性なグリコシル化酵素の１つまたは組み合わせを産生することを可能にし、この酵素は、これらがグリコシル化／分泌経路において効率的に機能する細胞下区画に、首尾よく局在する。好ましい酵素は、Ｍａｎ５（α−１，２−Ｍａｎ）３−９ＧｌｃＮＡｃ２を、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に、高効率でインビボで転換する。さらに、本発明は、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２および／またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生し得る、真核生物宿主株、および特に、酵母、真菌、昆虫、植物、植物細胞、藻類および昆虫細胞の宿主を提供する。
本発明はまた、コンビナトリアル核酸ライブラリー由来の組換え分子；このような組換え分子を含むベクター（発現ベクターを含む）；これらの組換え分子およびベクターによってコードされるタンパク質；これらの組換え分子またはベクターで形質転換された宿主細胞；このような形質転換された宿主から産生される糖タンパク質；ならびにこのコンビナトリアルライブラリーを使用して、主として適切なグリコシル化部位に共有結合した、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンまたはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する、糖タンパク質中間体または産物をインビボで産生するための方法を提供する。
本発明のさらなる局面としては、糖タンパク質上のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２および／またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の存在または非存在が検出され得る、診断用途および治療用途のための方法、組成物およびキットが挙げられる。
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質化学および核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明の方法および技術は、一般には、他に示されない限り、当該分野で周知の従来法に従って、そして本明細書中に引用されかつ本明細書中にわたって議論される種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補遺）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋｕｒｔ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｏｉｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｖｏｌ Ｉ １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｖｏｌ ＩＩ １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される分子生物学および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、および医学および医薬化学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連する命名法、およびその実験室的手法および技術は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許文献および他の参考文献は、参考として援用される。
以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである。
本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎ−グリカン」はＮ−結合オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合したもの）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の一般的な五糖コアを有する（「Ｍａｎ」は、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」は、グルコースをいい；そして「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンをいう）。Ｎ−グリカンに関して用いられる用語「トリマンノースコア」はまた、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に付加された周辺の糖（例えば、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝した成分に従って分類される（例えば、高マンノース、複合体またはハイブリット）。
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５以上のマンノース残基を有する。「複合体」型Ｎ−グリカンは、代表的には、１，３マンノースの結合手に結合した少なくとも別のＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結合手に結合した少なくとも別のＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得、この残基は、必要に応じて、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで、「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、そして「Ａｃ」はアセチルをいう）で修飾される。複合Ｎ−グリカンは、代表的には、例えば：ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃａ２−６ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃａｌ−；ＮｅｕＡｃａ２−３／６Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−；ＧｌｃＮＡｃａ１−４Ｇａｌｂ１−（ムチンのみ）；Ｆｕｃａ１−２Ｇａｌｂ１−（血液型Ｈ）のような、オリゴ糖で終わる少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルはガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃ残基で生じ、リン酸エステルはマンノース残基で生じ得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）はＯ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「分枝している」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースの結合手の末端に少なくとも別のＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースの結合手に０またはそれ以上のマンノースを有する。
Ｎ−グリカンの産生に関して用いられる用語「優勢な」または「優勢に」とは、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって検出される主要なピークを表す構造をいう。
本明細書中で用いられる略語は、当該分野における共通の用法である（例えば、上記の糖の略語を参照のこと）。他の共通の略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素をいう「ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒ」または「ＧｎＴ」；Ｎ−アセチルノイラミン酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。
本明細書中で用いられる場合、「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」とは、３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンがそれに結合しているタンパク質、および合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビボで操作され得る）を代替的にいう。好ましくは、本発明により産生される糖タンパク質は、少なくとも一時的には、少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０〜１００モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体を含む。これは、例えば、本発明の宿主細胞を操作して、「優れた」、すなわちより効率的なグリコシル化酵素を発現することによって達成され得る。例えば、マンノシダーゼは、宿主細胞中の部位に存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、ここで、タンパク質はグリコシル化され、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞の細胞小器官に対して酵素を標的化することによって、宿主細胞中に導入される。
用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を変化させることに関連して用いられる場合、少なくとも１つの酵素活性を有する分子をいい、全長酵素、触媒活性フラグメント、キメラ、複合体などを含む。酵素の「触媒活性フラグメント」とは、検出可能なレベルの機能的（酵素的）活性を有するポリペプチドをいう。
下等真核生物宿主は、グリコシル化プロフィールと関連して本明細書中で用いられる場合、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核生物細胞をいい、従って、いくつかの動物細胞または植物細胞および最も代表的な下等真核生物細胞（単細胞および多細胞の真菌細胞および藻細胞が挙げられる）を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる場合、用語「分泌経路」とは、種々のグリコシル化酵素の構築系をいい、この系に対して、脂質結合オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が順に曝露され、その後新生ポリペプチド鎖の分子が、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画へ流れる。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に脂質結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙに対して「上流」にあるか、または「上流」で作用するといわれ；同様に、酵素Ｙは酵素Ｘから下流」にあるか、または「下流」に作用する。
本明細書中で用いられる場合、用語「標的化ペプチド」とは、細胞標的シグナルペプチドをコードするヌクレオチドまたはアミノ酸配列をいい、この細胞標的シグナルペプチドは、細胞下の位置（例えば、細胞小器官）に対する関連配列の局在化（または保持）を媒介する。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。該用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド間結合、または双方を含むＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む。核酸はいずれのトポロジー的立体配座でもあり得る。例えば、核酸は一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐した、ヘアピンの、環状の、または南京錠様の立体配座であり得る。この用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および前記の合成形態および混合ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を共に含み得る。当業者に容易に認識されるように、それらは化学的に改変されていても、生化学的に改変されていてもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでいてもよいし、誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、アナログでの天然に存在するヌクレオチドの１以上の置換、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部位（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレーター、アルキレーターおよび改変された結合（例えば、α芳香族核酸等）のようなヌクレオチド間改変が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合に代えて置き換えるものを含む。
特記しない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その少なくとも一部が（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。その２つの間の選択は文脈によって指令される。例えば、もし核酸がプローブとして用いられれば、その２つの間の選択はプローブが所望の標的に対して相補的であるという要件によって指令される。
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然宿主細胞において天然ポリヌクレオチドに天然では伴う他の細胞構成要素、例えば、それに対して天然に会合するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離されたものである。該用語は（１）その天然に存在する環境から取り出されてしまっている、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然でそこで見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない、（３）それに天然では結合していないポリヌクレオチドに操作可能に連結している、または（４）天然では起こらない核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」または「実質的に純粋な」は、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチドアナログに言及して用いることもできる。
しかしながら、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチドが、その天然の環境から物理的にそれ自体が取り出されてしまっていることは必ずしも必要としない。例えば、もし異種配列（例えば、内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、この内因性核酸配列の発現が改変されるように、この内因性核酸配列に隣接して置かれるならば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は本明細書中では「単離された」とみなされる。その例として、非天然プロモーター配列は、この遺伝子が改変された発現パターンを有するように、ヒト細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターに代えて（例えば、相同組換えによって）置き換えることができる。この遺伝子は今や「単離された」ものとなっている。何故ならば、それは、天然ではそれに近接する配列の少なくともいくつかから分離されているからである。
また、もしそれが、ゲノム中の対応する核酸では天然に起こらないいずれかの改変を含めば、核酸は「単離された」と考えられる。例えば、もし内因性コード配列が、例えば、ヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失または点変異を含むならば、それは「単離された」と考えられる、「単離された核酸」としては、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さらに、「単離された核酸」は他の細胞物質を実質的に含まず、あるいは組換え技術によって生産された場合には培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
本明細書中で用いるように、参照核酸配列のフレーズ「縮重改変体」は、標準的な遺伝暗号に従い、翻訳されて参照核酸配列から翻訳されたのと同一なアミノ酸配列を供することができる核酸配列を含む。
核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」または「同一な」とは、最大対応性に対して整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは少なくとも約６つのヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用いることができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良の重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０、本明細書中に参考として援用される）。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトパラメーター（スコアリングマトリックスのための６のワードサイズおよびＮＯＰＡＭ因子）でＦＡＳＴＡを用い、あるいは本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で供されたそのデフォルトパラメーターでＧａｐを用いて決定することができる。
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片に言及する場合、もう１つの核酸（またはその相補鎖）と、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列させた場合に、前記したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのようないずれかの周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
あるいは、核酸またはその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、もう１つの核酸、もう１つの核酸のストランド、その相補鎖にハイブリダイズする場合に実施的な相同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の関係では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的な領域の長さ、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数のような条件によって影響される。当業者であれば、どのようにしてこれらのパラメーターを変化させ、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するかを知っている。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについての熱融解温度（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについてのＴｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲、頁９．５１参照。本明細書中での目的では、「高ストリンジェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、８〜１２時間の６５℃における６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳでの水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いての２０分間の６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよびパーセント同一性を含めた多数の因子に応じて異なる速度で起こることは当業者に認識される。
用語「変異した」は、核酸配列に適用する場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入され、欠失され、または変化され得ることを意味する。単一の改変は遺伝子座でなすことができ（点変異）、あるいは多数のヌクレオチドを単一遺伝子座において挿入し、欠失し、または変化させることができる。加えて、１以上の改変を、核酸配列内のいずれかの数の遺伝子座で行うことができる。核酸配列は、限定されるものではないが、「エラー−傾向ＰＣＲ」（点変異の高い率がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行うプロセス；例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，ｐｐ．１１−１５（１９８９）およびＣａｌｂｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．＆Ｊｏｙｃｅ Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．，２，ｐｐ．２８−３３（１９９２））；および「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発」（目的のいずれかのクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の生成を可能とするプロセス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．＆Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，ｐｐ５３−５７（１９８８）参照）のような変異誘発技術を含めた当該分野で公知のいずれかの方法によって変異させることができる。
本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが結合したもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいうことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここに、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる（後により詳細に議論する）。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それに作動可能に連結されるゲノムの発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）という。
「作動可能に連結した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子と連続して、目的の遺伝子を制御する結合、ならびにトランス、またはある距離を置いて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
本明細書中で用いる用語「発現制御配列」とは、それに作動可能に連結したコード配列の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効果的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物の場合には、そのような制御配列としては、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最小限、その配列が発現に必須である全ての構成要素を含むことを意図し、また、その配列が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
本明細書中で用いるように、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中へ組換えベクターのような核酸が導入されている細胞をいうことを意図する。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をもいうことを意図する。ある種の改変は変異または環境の影響のいずれかに起因して、継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でない可能性があるが、依然として、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離された細胞であってよく、あるいは培養で増殖された細胞系であってよく、あるいは生きた組織または生物中に存在する細胞であってもよい。
本明細書中で用いられる用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸未満の長さ、より典型的には約３０アミノ酸未満の長さのものをいう。本明細書中で用いられる該用語は、アナログ、ならびに構造および、従って、生物学的機能を模倣するミメティックを含む。
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然に存在する、および天然に存在するものではないタンパク質、および断片、変異体、誘導体およびそのアナログを含む。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、その各々が、１以上の区別される活性を有する多数の異なるドメインを含み得る。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導の源により、（１）その天然状態でそれに伴う天然に会合した構成要素に関連しない、（２）それが天然で見出されない純度で存在する場合、純度を他の細胞物質の存在に関連して調整できる（例えば、同一種からの他のタンパク質はない）、（３）異なる種からの細胞によって発現された、または（４）天然で生じない（例えば、それは天然で見出されたポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは天然で見出されないアミノ酸アナログまたは誘導体、あるいは標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成された、またはそれが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたペプチドは、その天然に会合した構成要素から「単離」されている。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に会合した構成要素を実質的に含まないようにすることもできる。そのように定義されたように「単離された」は、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されてしまっていることを必ずしも必要としない。
本明細書中で用いる用語「ポリペプチド断片」とは、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列における対応する位置と同一である連続配列である。断片は、典型的には少なくとも５、６、７、８，９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
「改変された誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含む、あるいは天然ポリペプチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはその断片をいう。そのような改変は、例えば、当業者に容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種での標識、および種々の酵素的改変を含む。そのような目的で有用なポリペプチドを標識するための多様な方法、および多様な置換基または標識が当該分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈのような放射性同位体、標識抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合体化の容易性、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野で周知である。参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２）参照。
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、天然または野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成または置換を含むポリペプチドをいう。ムテインはある位置における単一アミノ酸がもう１つのアミノ酸に変化されている１以上のアミノ酸点置換、１以上のアミノ酸が天然に存在するタンパク質の配列において、各々、挿入または欠失されている１以上の挿入および／もしくは欠失、ならびに／またはアミノ末端またはカルボキシ末端いずれかまたは双方におけるアミノ酸配列の切形を有することができる。ムテインは天然に存在するタンパク質と比較して、同一の生物学的活性を有することができるが、好ましくは異なる生物学的活性を有する。例えば、ムテインは、増加したか減少した、ニューロン結合活性またはＮｇＲ結合活性を有し得る。本発明の好ましい実施形態において、ムテインであるＭＡＧ誘導体（例えば、ＭＡＧ Ｉｇ様ドメイン５において）は、内因性または可溶性の野生型ＭＡＧと比較して、低下したニューロン増殖阻害活性を有する。
ムテインはその野生型対応物に対して少なくとも７０％の総じての配列相同性を有する。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の総じての配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態においては、ムテインは９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％、なおより好ましくは９９％の総じての配列同一性を呈する。配列相同性は、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔのようないずれかの一般的な配列分析アルゴリズムによって測定することができる。
好ましいアミノ酸置換は（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変する、（４）結合親和性または酵素活性を改変する、および（５）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与する、または改変するものである。
本明細書中で用いるように、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は慣用的用法に従う。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的アミノ酸、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非慣用的アミノ酸のような立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた本発明のポリペプチド用の適当な構成要素であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記においては、標準用法および約束に従い、左手方向はアミノ酸末端方向であって、右手方向はカルボキシ末端方向である。
もしタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して「相同性」を有し、あるいはそれに対して「相同」である。あるいは、もし２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して相同性を有する（従って、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して６０％の配列相同性を呈するものであり、より好ましくは７０％配列相同性である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％配列相同性を呈する相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同タンパク質は９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を呈する。本明細書中で用いるように、（特に、予測された構造類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性は、機能において類似性を意味するものと解釈される。
「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して用いられる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有するもう１つのアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が相互に保存的置換だけ異なる場合、パーセント配列同一性または相同性の程度は、置換の保存的性質につき修正するように上方に調整することができる。この調整をなす手段は当業者に周知である（例えば、本明細書に参考として援用される、Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９４参照）。
以下の６つの群は、各々、相互に代えての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
パーセント配列同一性ともいうポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウエアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｕｒｅ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５参照。タンパク質分析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失および他の改変に帰属される相同性の尺度を用いて類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧは「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターを用いて異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。
阻害分子配列を、異なる生物からの非常に多数の配列を含むデータベースを比較する場合の好ましいアルゴリズムはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは：期待値：１０（デフォルト）：フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを拡大するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードのサイズ１１：（デフォルト）；記載の番号：１００（デフォルト）：ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
相同性について比較されたポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくても約２８残基、好ましくは約３５を超える。非常に多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列はＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリおよびサーチ配列の間の最良な重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，本明細書中に参考として援用される）。例えば、アミノ酸配列の間のパーセント配列同一性は、本明細書中に参考として援用される、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いて決定することができる。
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので有用である。融合タンパク質は目的のポリペプチドからの少なくとも１０の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームであるポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換えにより生産することができる。別法として、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をもう一つのタンパク質に架橋させることによって化学的に生産することができる。
本明細書中で用いる用語「領域」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分をいう。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。
本明細書中で用いる用語「ドメイン」とは、生体分子の公知のまたは疑われる機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは領域またはその部分と共に広がることができ；ドメインは生体分子の区別される非連続領域を含むこともできる。タンパク質ドメインの例は、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。
本明細書中で用いるように、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めたいずれかの化合物を意味し、そのような化合物は天然または合成のものであり得る。
他に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一な意味を有する。例示的な方法および材料は以下に記載するが、本明細書中に記載したのと同様なまたは同等な方法および材料も本発明の実施で用いることができ、それは当業者に明らかである。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は本明細書にその全体が参考として援用される。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が優先する。材料、方法および例は説明のためだけのものであり、限定する意図のものではない。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、いずれかの他の整数または整数の群を排除するものではないと理解される。
（ヒト様Ｎ−グリカンの産生のための、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で修飾されたオリゴ糖を有する宿主細胞を生産する方法）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を天然では発現しない、またはそれを発現しないように操作されている真核生物宿主細胞は出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な１以上の酵素、または他の因子を発現するように操作される。所望の宿主株は、一度に１つ以上の酵素を発現するように操作することができる。加えて、１以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素（例えば、異種細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素）をコードする核酸分子のライブラリーを（例えば、酵素断片を含むサブ−ライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって）創製し、最適な活性を持つ１以上の酵素を有する、またはほとんどの「ヒト様」糖タンパク質を生産する株は、ライブラリーの１以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって選択することができる。
特に、本明細書中に記載された方法は、それをさらに改変して複合体Ｎグリカンを得る目的で少なくとも一時的に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を高い収率でインビボで得るのを可能とする。下等真核生物のような宿主細胞において適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を適当な収率で得るための成功したスキームは、一般には、２つの平行したアプローチ：（１）もしあれば、内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性によって作製された高マンノース構造を低下させること、および（２）１、２−α−マンノースをマンノシダーゼによって除去して、さらに宿主細胞の内部で反応させて、複合体ヒト様グリコ形態を形成することができる高レベルの適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を得ることを含む。
従って、第一の工程は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の作用によってインビボでＧｌｃＮＡｃを許容することができるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的前駆体構造を生産することができる真核生物宿主細胞（例えば、下等真核生物）の選択または創生を含む。一つの実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに関して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し、またはそれを用いることを含む。好ましくは、宿主細胞は開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性（後記参照）が枯渇したものである。そのような宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するのに望ましくない高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を欠く。
次いで、１以上の酵素活性を、そのような宿主細胞に導入して、少なくとも３０モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ５」）炭水化物構造を有することによって特徴付けられる宿主細胞内でＮ−グリカンを生産する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合Ｎ−グリカン形成に必要であり：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は少なくとも一時的には高い収率で（例えば、３０％の過剰にて）インビボで形成されなければならない。なぜなら、引き続いての哺乳動物様およびヒト様のグリコシル化反応はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはその誘導体を必要とするからである。
この工程は、高い収率での、細胞内でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特定の異性体構造の形成も必要とする。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合Ｎ−グリカン形成に必要であるが、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩに対する基質として働くことができる、またはできない異なる異性体形態で起こり得るからである。殆どのグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグリコシル化タンパク質は、一般に、その表面にある範囲の異なる炭水化物構造（すなわち、グリコ形態）を含む。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のような特定の構造の微量の（すなわち、５％未満の）単なる存在は、哺乳動物様またはヒト様糖タンパク質を生産するのにほとんど現実的な関連性はない。必要なのは、高い収率での（すなわち、３０％を超える）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ−許容Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体（図１Ｂ）の形成である。この中間体の形成は、目的のグリコシル化タンパク質（標的タンパク質）上の複合Ｎ−グリカンの引き続いてのインビボでの合成を可能とするのに必要である。
従って、選択された宿主細胞によって生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のいくつかまたは全ては、哺乳動物グリコシル化経路に沿って酵素活性に対する生産的基質でなければならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性に対する基質としてインビボで働くことができ、それにより、宿主細胞においてヒト様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成する。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞において生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、インビボにてＧｎＴＩに対する生産的基質である。もし、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が１０％で生産され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が標的タンパク質上で２５％で生産されるならば、一次的に製造されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の合計量は３５％であることが理解される。なぜならば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産物だからである。
当業者は、天然から宿主細胞、例えば、インビボでかなりのレベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する現存する真菌または他の下等真核生物を選択することができる。しかしながら、合計Ｎ−グリカンの１．８％過剰でインビボにてそのような構造を供することが示された下等真核生物は未だない（例えば、Ｍａｒａｓら，１９９７）。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生産するように遺伝子的に作製することができる。米国特許第５，５９５，９００号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌクレオチドトランスポーターの不存在または存在を同定することができる。
（望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活化）
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いられる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して作製することができるか、あるいはそれから得ることができる。従って、選択された宿主細胞に応じて、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが知られた酵素をコードする１つのまたは多数の遺伝子を欠失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は多数の下等真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎａ等）において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを提供する。これらの遺伝子はマンノシルトランスフェラーゼ、例えば、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１（Ｇｒａｈａｍ、１９９１）、１，２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅからのＭＮＮ４およびＭＮＮ６）および異常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを持つ生きた表現型を生起させる。その例は、表１に示される。
必要な操作工程を例示するために本明細書中に記載したように、本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓの過マンノシル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物のようにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせるためにα−１，２−マンノシダーゼと共にＥＲ中にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造を保有する（図１Ａ）。数個のマンノシルトランスフェラーゼの作用を介して、次いで、この構造はマンナンとしても知られた過マンノシル化された構造（Ｍａｎ＞９ＧｌｃＮＡｃ２）に変換される。加えて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、マンノシルリン酸トランスフェラーゼの作用を介して、非末端リン酸基を炭水化物構造へ付加することができることが判明した。これは、マンノース糖の付加よりはむしろ除去に関係する、哺乳動物細胞で行われる反応とは異なる。存在するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造を過マンノシル化する真核生物宿主細胞、例えば、真菌の能力を排除するのは特に重要である。これは、超マンノシル化しない宿主細胞につき選択し、またはそのような細胞を遺伝子工学により作製することによって達成することができる。
超マンノシル化プロセスに関与した遺伝子は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、同定されており、これらの遺伝子中に変異を作り出すことによって、「望ましくない」グリコ形態の生産を低下させることができる。そのような遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような他の下等真核生物で見出される現存のマンノシルトランスフェラーゼまたはそれらのレギュレーター（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４，ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によって、あるいは宿主株を変異誘発し低下したマンノシル化を持つグリコシル化表現型につき選択することによって同定することができる。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマンノシルリン酸トランスフェラーゼの間の相同性に基づき、ＰＣＲプライマー（見られる順に、左から右へそれぞれ、配列番号７、８、４７および４）（その例は表２に示される）を設計することができるか、そのような酵素をコードする遺伝子または遺伝子断片をプローブとして用いて、標的または関連生物のＤＮＡライブラリーにおいてホモログを同定することができる。別法として、関連生物において特定のグリコシル化表現型を補うその能力によってバンノシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的ホモログを同定することができる。
Figure 0004875486
 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を得るためには、例えば、以下の工程を行う：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度では遅い成長者である。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーで補うことによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能でありＲｅｓＧｅｎ、ａｎ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。上昇した温度において正常な増殖表現型を呈する変異体はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡライブラリーで形質転換された後は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを有するようである。そのようなライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分的に消化し、制限酵素を不活化した後、消化されたＤＮＡを、適合する制限酵素で消化されている適当なベクターに連結することによって作り出すことができる。
適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカー（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２，１９−２７頁）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであるｐＲＳ３１４、およびＵＲＡ３マーカー（Ｂｏｎｎｅａｕｄ，Ｎ．ら，１９９１，Ｙｅａｓｔ ７，６０９−６１５頁）を含有する改変されたｐＵＣ１９に基づく高コピー（２μ）プラスミドであるｐＦＬ４４Ｓが挙げられる。そのようなベクターは学術研究者によって通常用いられ、同様なベクターは多数の異なる販売業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能である。さらなる例としては、ｐＹＥＳ／ＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２μ複製起点に基づく酵母発現プラスミド、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＹｅｐ２４クローニングビヒクルが挙げられる。
染色体ＤＮＡおよびベクターの連結の後、ＤＮＡライブラリーを、特定の変異を持つＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し、対応する表現型の修正につき選択することができる。野生型表現型を回復することができるＤＮＡフラグメントをサブクローニングし、配列決定した後、このフラグメントを用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発および／または組換え技術を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１によってコードされた遺伝子産物の活性を排除することができる。
あるいは、もし目的の特定の宿主細胞（例えば、真菌）の全ゲノム配列が知られているならば、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのようないくつかの情報源から入手可能な公に入手可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによってそのような遺伝子を同定することができる。例えば、与えられたゲノム配列、または公知の１，６マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯＣＨ１）からの配列を含むデータベースを検索することによって、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードできる（必ずしも必要でない）そのような宿主細胞ゲノムにおいて高い相同性の遺伝子を同定することができる。しかしながら、核酸配列相同性単独は、同一の活性を有する酵素をコードするホモログを同定し、単離したことを証明するには十分ではない。今日まで、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１欠失が非常に重要な開始１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を排除することを示すデータは存在しない（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）（Ｄｅｃ．１９９８）：１１７１−１１７７；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ０２／００８５６ Ａ２）。従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子ホモログがその機能を現実にコードすることを証明するデータはない。その証明はここに初めて提供される。
いくつかのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログは、これらのアプローチを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同定されている。相同な遺伝子は、しばしば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関与する遺伝子に対して同様な機能を有し、従って、それらの欠失を用いて、同様なグリコシル化経路を持つ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは、同様に、いずれかの他の宿主細胞、例えば、真菌、植物、昆虫または動物細胞においてグリコシル化パターンを操作することができる。
遺伝子ノック−アウトの創製は、一旦与えられた標的遺伝子配列が決定されると、当該分野におけるよく確立された技術であり、当業者が行うことができる（例えば、Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，ｐ．２８１参照）。宿主生物の選択は、良好な形質転換および遺伝子破壊技術の入手可能性によって影響され得る。
もしいくつかのマンノシルトランスフェラーゼがノックアウトされるべきであれば、例えば、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒによって開発された方法（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６：５４１−５４５（１９８７））は、選択マーカー、例えば、酵母におけるＵＲＡ３マーカーの反復された使用を可能として、全ての望ましくない内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性を順次に排除することができる。この技術は他者によって改良されているが、基本的には、逆選択マーカーに隣接する２つの反復ＤＮＡ配列の使用への近接を含む。例えば、ＵＲＡ３をマーカーとして用いて、構築物を取り込んだ形質転換体の選択を確実とすることができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復物を隣接させることによって、まず、構築物を取り込み、従って、標的遺伝子を破壊した形質転換体を選択することができる。形質転換体の単離、およびその特徴付けの後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に対して抵抗性であるものにつき第二ラウンドにて逆選択することができる。５−ＦＯＡを含有するプレート上で生存することができるコロニーは、先に述べた反復を含む交差事象を介して再度ＵＲＡ３マーカーを失っている。このアプローチは、従って、同一マーカーの反復された使用を可能とし、さらなるマーカーを必要とすることなく複数遺伝子の破壊を容易とする。他の選択マーカーおよび逆選択マーカーを持つもう一つの真核生物宿主細胞で用いるのに適合された遺伝子の順次の排除のための同様な技術も用いることができる。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）またはマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異体を相補する遺伝子）のような特定のマンノシルトランスフェラーゼ、またはレギュレーター（ＭＮＮ４）の排除は、この生物の操作された株の創製を可能とし、該株は主にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を合成し、これを用いて、より複雑なグリコ形態構造、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト細胞で生産されるものに似るようにグリコシル化パターンをさらに改変することができる。この方法の好ましい実施形態は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同様なまたは同一の生化学的機能を排除して、遺伝子的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で生産された糖タンパク質のグリコシル化構造を改変するために生化学的グリコシル化活性をコードするＤＮＡ配列を利用する。
本明細書中で例示したような酵母におけるグリコシル化経路を操作するのに用いられる方法は、引き続いての修飾のために好ましい基質を生産するために糸状菌で用いることができる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒおよび他の糸状菌におけるグリコシル化経路を改変するための戦略は、酵母においてヒト様糖タンパク質を生産するのに、株を操作するための本明細書中に記載したのと同様なプロトコルを用いて開発することができる。１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥホモログに関与する望まない遺伝子活性を改変または排除する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は好ましい宿主である。なぜならば、それは１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くからであり、それゆえ、この宿主において超マンノシル化遺伝子活性、例えば、ＯＣＨ１は予測されない。対照的に、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ））は、本発明の標的化方法を用いて宿主に導入される。
（減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、すなわちＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造のα−１，３アーム上で外部鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素の活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の操作または使用を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素はＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子の破壊の結果、Ｎ結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチはＯＣＨ１の不活化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａ，１９９８参照）。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、（選択された宿主細胞に応じて）、任意であり得る。というのはＯｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために無傷のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を必要とするからである。従って、７以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Ｏｃｈ１ｐに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化Ｎ−グリカンを生産することができる（例えば、Ｎａｋａｙａｍａ，１９９７参照）。
ＯＣＨ１遺伝子は、記載されているように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（実施例１）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ（実施例１６）からクローン化された。Ｋ．ｌａｃｔｉｓからのＯＣＨ１遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を配列番号４１および配列番号４２に記載する。遺伝子特異的プライマーを用いて、各クローンから構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＯＣＨ１遺伝子を欠失させた（各々、実施例１および１６）。開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇し、かつＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを生産するように操作された宿主細胞は、それにより、得られた（例えば、図５および６；実施例１１および１６参照）。
従って、もう１つの実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子（配列番号４１）の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含む、またはそれよりなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供される。また、さらに本明細書中で記載するように、本発明の上記核酸分子を含む、発現ベクターを含めた、ベクターも提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
（本発明の宿主細胞）
本発明の好ましい宿主細胞は下等真核生物細胞、例えば、酵母、単細胞および多細胞または繊維状真菌である。しかしながら、広く種々の宿主細胞が本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質を発現するように操作することができる（実施例１７および１８）。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク質を発現させることができる。当業者が認識するように、（ヒト細胞を含めた）任意の真核生物宿主細胞は本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、１以上のキメラタンパク質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿主細胞において、細胞下位置、例えば、細胞小器官に標的化される。そのようなタンパク質は、好ましくは、必ずしもそうではないが、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵素である。いずれのタンパク質コード配列も標的化し、本明細書中に記載された方法を用い、真核生物宿主細胞において修飾された活性につき選択することができることが予測される。
結合されたＮ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を生産することができる下等真核生物が特に有用である。何故ならば、（ａ）高度なマンノシル化を欠き（例えば、Ｎ−グリカン当たり８マンノースを超え、または特に３０〜４０マンノース）、それらはヒトにおいて低下した免疫原性を示し；および（ｂ）Ｎ−グリカンは、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によって（図１Ｂ；β１，２ＧｎＴＩ）、なおよりヒト様のグリコ形態を形成するためのさらなるグリコシル化反応のための基質である。収率はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを持つ３０モル％より大、より好ましくは５０〜１００モル％糖タンパク質の収率が得られる。好ましい具体例において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の５０％を超えるものが、ＧｎＴＩ活性に対する基質であり、インビボにてそのような基質として働くことができることが示される。
本発明の好ましい下等真核生物は、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａを含む。
各上記実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化された宿主細胞を作製すること関する。これらの構造は望ましい。何故ならば、それらは、次いで、例えば、Ｍａｒａｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、米国特許第５，８３４，２５１号の方法を用い、インビトロでの処理によってプロセシングされ得るからである。しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化された前駆体は−−グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で−−インビトロでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応によって処理されて、ヒト様Ｎ−グリカンを生じる。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化されたオリゴ糖前駆体は、好ましくは、Ｘが３、４または５であり、好ましくは３であるＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するものへと処理される。Ｘが３より大きなＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮ−グリカンは、例えば、適用可能であれば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，６マンノシダーゼ活性での処理によって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る。グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、エキソビボ処理によって、またはグリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含めたさらなるグリコシル化酵素の宿主細胞における異種発現によって、修飾してヒト様Ｎ−グリカンとなり得る。
本発明に従って生産し得る好ましいヒト様糖タンパク質は、７以下、または３以下のマンノシダーゼ残基を有するＮ−グリカンを含むヒト様糖タンパク質；およびガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアリン酸、およびフコースよりなる群から選択される１以上の糖を含むヒト様糖タンパク質を含む。
（複合Ｎ−グリカンの形成）
複合Ｎ−グリカン合成の形成は、特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構造に結合される順次のプロセスである。高等真核生物においては、これは、種々のプロセシング酵素に順次に暴露された基質を有することによって達成される。これらの酵素は、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置に依存して特異的反応を行う。この「組立てライン」はＥＲ、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢および後期ゴルジ、およびトランスゴルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジおよびＥＲにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター）が発現され、これらの細胞小器官へ、好ましくは、それらが、それらの環境ならびに経路における他の酵素に関して最も効率的に機能するような位置に特異的に標的化されなければならない。
本明細書中で記載した方法の１つの目標は、産業醗酵プロセスにおいてよく行うことができる頑強なタンパク質生産株を達成することにあるので、複数遺伝子の宿主細胞染色体への組込みは注意深い計画を含む。上記したように、非ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが知られている酵素をコードする１以上の遺伝子は好ましくは欠失される。操作された細胞株を、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換し、これらの遺伝子は安定に形質転換され、それにより、所望の活性が醗酵プロセスを通じて維持されるのを保証する。
以下の酵素活性のいずれの組合せも、本発明の方法を用いて単一でまたは複数で宿主中へ操作し得る：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲ特異的トランスポーターおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体に対するｓｙｎトランスポーターおよび交互輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性を１以上の核酸分子に導入する（上記も参照）。核酸分子は単一でまたは複数で、例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーのような核酸ライブラリーの状況で導入され得る。しかしながら、単一または複数の酵素活性を、限定されるものではないが、タンパク質送達方法および／または本発明の核酸ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーを必ずしも用いることのない１以上の核酸分子の使用を含めたいずれかの方法で、宿主細胞に導入し得る。
（複合Ｎ−グリカンを生産するためのグリコシルトランスフェラーゼの発現）
ＤＮＡ配列情報を用い、当業者はＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化することができる（例えば、実施例３）。当業者に周知の標準的な技術を用い、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶまたはＧｎＴＶをコードする（またはその触媒的に活性な断片をコードする）核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーターと本発明の選択された宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．のような真菌宿主）において転写を駆動することができる他の発現制御配列との転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入し得、従って、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素の１以上を、ヒト様複合糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させ得る（例えば、実施例１５、１７および１８）。
数個の個々のグリコシルトランスフェラーゼがクローン化され、しかしながら、生物のグリコシル化パターンに対する「ヒト化」の所望の結果を証明することなく、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌において発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａ、１９９５）。そのようなグリコシルトランスフェラーゼの作用によって糖を受容するのに必要な炭水化物構造は十分な量で存在せず、それは複合Ｎ−グリカン形成の欠如に最も寄与したようであると推測された。
本発明の好ましい方法は、初期ゴルジまたはゴルジ中間嚢における、ＧｎＴ（例えば、ＧｎＴＩ）の機能的発現を提供し、ならびに（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現によって；後記参照）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証する。
（糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ装置に供するための方法）
ゴルジにおいて満足して機能するグリコシルトランスフェラーゼについては、この酵素は、新成糖タンパク質に付加された糖部分の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース等）は、一般には、サイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される。
下等真核生物のような非ヒト宿主細胞においてこのプロセスを複製するためには、糖ヌクレオシド特異的トランスポーターがゴルジで発現されて、ヌクレオシド糖前駆体の適切なレベルが確保されなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９８１；Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９８２；Ｐｅｒｅｚ，１９８７）。ヌクレオチド糖は、例えば、宿主微生物において糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外因性遺伝子を発現させることによって、適切な区画に供され得る。トランスポーター酵素の選択は、用いるべき外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によって影響される。例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを必要とし得、フコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−フコーストランスポーターを必要とし得、ガラクトシルトランスフェラーゼはＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを必要とし得、シアリルトランスフェラーゼはＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを必要とし得る。
付加されたトランスポータータンパク質はヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ装置へ運び、そこで、ヌクレオチド糖はグリコシルトランスフェラーゼによって反応して、例えば、Ｎ−グリカンを伸長し得る。この反応はヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸（例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＭＰ）を放出する。ヌクレオシド一リン酸は、アンチポード機構によってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換においてゴルジから直接的に輸出することができる。しかしながら、ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、グリコシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する。この反応は十分なグリコシル化に重要に見えるので、ヌクレオチド二リン酸をコードする遺伝子の発現されたコピーを供するのがしばしば望ましい。（適切にはＵＤＰまたはＧＤＰに特異的な）ジホスファターゼは、ジホスホヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じる。
典型的には、哺乳動物起源である適当なトランスポーター酵素を、後記する。そのような酵素は、本発明の方法を用い、選択された宿主細胞に操作され得る（実施例７〜１０もまた参照のこと）。
もう１つの例において、α２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６−シアリルトランスフェラーゼは、ガラクトース残基をヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でキャップを施し、糖タンパク質の成熟形態に導く（図１Ｂ）。このプロセシング工程を代謝的に操作された酵母または真菌へ再度操作することは、酵母の後期ゴルジにおいて、（１）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給を必要とする（実施例６）。後期ゴルジにおいて十分なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を得るためには、例えば、（例えば、ヒトからの）公知のシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、真菌における後期ゴルジに向けられなければならない（上記参照）。同様に、トランスポーターは、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可能とするように操作されなければならない。現在、真菌が十分量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成し、またはそれをゴルジに輸送できることを示すものはない。その結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確保するためには、真菌へのＣＭＰ−シアル酸の生産を代謝的に操作しなければならない。
（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）
発現配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性サーチを介して認識されたヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡがクローン化されている（Ｉｓｈｉｄａ，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）からのｃＤＮＡでの表現型修正によってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎ，１９９８）。結果は、哺乳動物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子が、発現されて酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有すること、および非常に異なるアミノ酸配列を持つ２つのタンパク質は同一ゴルジ膜内の同一溶質性を輸送し得ることを示す（Ｇｅｕｌｌｅｎ，１９９８）。
従って、例えば、（１）形質転換された構築物が細胞中に維持される領域（例えば、複製起点、または染色体組込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３またはＴ−ｕｒｆｌ３ （Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ，２００１）または他のよく特徴付けられた選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ ｂｌｅ等）のような逆選択可能マーカーおよびリサイクル可能マーカーを含めた、形質転換されている細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子、（３）機能的ＵＤＰ−Ｇｌｃ Ｎａｃトランスポーターをコードする遺伝子またはそのフラグメント（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓからの、（Ａｂｅｉｊｏｎ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）、またはＨ．ｓａｐｉｅｌｓからの（Ｉｓｈｉｄａ，１９９６）、および（４）上記した局在化／触媒ドメイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーターを含み得る核酸構築物によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を宿主細胞に取込み得る。
（ＧＤＰ−フコース）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．およびＣ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ （Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ、１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００）によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていないが、Ｎ末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計のために用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
（ＵＤＰ−ガラクトース）
２つの異種遺伝子（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅからのα１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，２ ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２（＋）、およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターをコードする（ｈＵＧＴ２））は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化およびＵＤＰ−ガラクトース輸送活性の間の修正は、α１，２ＧａｌＴよりはむしろＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターの外因的供給がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ， １９９９ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（２）： １３３−１４１）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅからのＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターがクローン化された（Ａｏｋ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １２６（５）：９４０−９５０；Ｓｅｇａｗａ，１９９９ Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５１（３）：２９５−２９８）。
（ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸））
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）はクローン化され、Ｌｅｃ８ ＣＨＯ細胞で発現されている（Ａｏｋｉ，１９９９；Ｅｃｋｈａｒｄｔ，１９９７）。マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９７）。シアル酸はいくつかの真菌で見出されているが、選択された宿主系が十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給できるかは明らかでない。シアル酸は、培地に供給し得るか、または別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路を宿主ゲノムに組込むこともできる。
（ジホスファターゼの発現）
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸いずれかが糖ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸は交互輸送機構によってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）はホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければならない。この反応は十分なグリコシル化で重要であるように見える。なぜなら、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要であることが判明しているからである。しかしながら、この酵素はＵＤＰに向けての活性の１０％を有するに過ぎない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有しない。なぜなら、それらはゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加える酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの管腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるのに重要である（Ｋｈａｔａｒａら．１９７４）。
（核酸分子からの標的化酵素活性を発現させることにより宿主においてＮ−グリカンを改変するための方法）
本発明は、さらに、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の生産のための酵素または複数酵素をコードする１以上の核酸分子を非ヒト宿主細胞に取込む工程を含む、この細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与する１以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、１以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、１つの活性の産物がもう１つの活性（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）および対応する糖トランスポーター（例えば、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性）の基質レベルを増加させる２以上の酵素活性を発現するように選択されるか、または操作される。もう１つの好ましい実施形態において、宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害し得る産物を除去する活性（例えば、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼまたはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性）を発現するように選択されるかまたは操作される。
本発明の好ましい方法は、宿主細胞において核酸分子からの１以上の酵素活性を発現させることを含み、酵素の触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチド（例えば、通常は触媒ドメインに連結またはそれに会合していない異種シグナルペプチド）を含む融合タンパク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞下位置（例えば、細胞小器官）へ標的化する工程を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル化酵素）、またはその触媒的に活性な断片をコードする核酸断片へ同一翻訳リーディングフレームにて連結された（「インフレーム」）細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸断片を含む、少なくとも１つの遺伝子構築物（「融合構築物」）によってコードされる。
融合構築物またはタンパク質の標的化シグナルペプチド成分は、好ましくは、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、検索シグナル、タイプＩＩ膜タンパク質、タイプＩタンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来する。
融合構築物またはタンパク質の触媒ドメイン成分は、好ましくは、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ活性、マンノシダーゼ活性またはグリコシルトランスフェラーゼ活性に由来する。触媒ドメインは、好ましくは、酵素が局在化された細胞小器官における他の代表的な酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨ単位内にｐＨ最適値を有するか、あるいは５．１と８．０との間のｐＨにおいて最適活性を有する。好ましい実施形態において、触媒ドメインはＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩよりなる群から選択されるマンノシダーゼをコードする。
（グリコシル化酵素の選択：ｐＨ最適値および細胞下位置）
本発明の１つの実施形態において、ヒト様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において他の酵素のｐＨ最適値と同様なｐＨ最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞の細胞下区画に導入することによって、非ヒト真核生物宿主細胞において効率的に作製される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性はほとんどの酵素は、約６．５と７．５との間にあるｐＨ最適値を有する（表３参照）。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ＥＲおよびゴルジの内部ｐＨもまた約６〜８の範囲にあるようである。しかしながら、真菌宿主における組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、ｐＨ５．０程度のｐＨ最適値を有する酵素を導入した（Ｍａｒｔｉｎｅｔ，１９９８、およびＣｈｉｂａ，１９９８）。ｐＨ７．０において、それらのマンノシダーゼのインビトロで決定した活性は、それらの使用点［すなわち、ＥＲおよび初期ゴルジにおいてＮ−グリカン上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の効率的なインビボ生産のために］不十分な活性であるような１０％未満まで低下される。
従って、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）（例えば、α−マンノシダーゼ）を宿主細胞における細胞下位置（例えば、細胞小器官）へ標的化し、そこで、酵素またはドメインのｐＨ最適値は、同一細胞小器官に局在化された他の代表的なマーカー酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨ単位内にある。特異的細胞小器官へ標的化されるべき酵素のｐＨ最適値は、同一細胞小器官で見出された他の酵素のｐＨ最適値とマッチングさせて、得られた単位酵素当たりの活性を最大化すべきである。表３は、種々の源からのマンノシダーゼの活性およびそれらの各ｐＨ最適値をまとめる。表４は、それらの典型的な細胞下位置をまとめる。
Figure 0004875486
 好ましい実施形態において、特定の酵素または触媒ドメインは、通常は酵素ドメインに会合していない細胞標的化シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構築物によって、宿主細胞中の細胞下位置に標的化される。好ましくは、酵素またはドメインは宿主細胞のＥＲ、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢または後期ゴルジ、またはトランスゴルジ装置に標的化される。
より好ましい実施形態において、標的化グリコシル化酵素は、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこで、グリコシル化の初期反応が起こる。この方法は非ヒト宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産するのに有用であるが、この方法は、ヒト宿主細胞を含めたいずれかの真核生物宿主細胞において糖タンパク質の炭水化物プロフィールを修飾するのにより一般的には有用でもあることを認識される。
宿主細胞分泌経路のある種の細胞小器官においてタンパク質の滞留を媒介する標的化配列は周知であり、標的化配列および標的化された酵素の選択用のライブラリーに関して後により詳細に議論するように、科学文献および公のデータベースに記載されている。そのような細胞下標的化配列は、単独、または組合せて用いて、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）を宿主細胞（すなわち、特に、酵素が、ｐＨ最適値または他の同様な因子の存在に基づいて増強された活性または最適な活性を有するであろう細胞）における特定の細胞下位置に標的化し得る。
高マンノース構造をトリミングして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置においてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせようと試みる場合、例えば、（１）十分に近いｐＨ最適値（すなわち、ｐＨ５．２とｐＨ７．８との間）を有し、および（２）単独で、または協力し合って、ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃの引き続いての付加を許容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せを選択し得る。インビトロにてＧｎＴＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる構造を作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せは、適当な選択を構成する。この知識は、科学的文献から、あるいは実験的に獲得し得る。
例えば、潜在的マンノシダーゼがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ（２−アミノベンズアミド）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＢに変換することができるかを判断し得、次いで、得られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ構造がＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する基質として働いて、インビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えることができることを証明し得る。ヒトまたはマウス源からのマンノシダーゼＩＡは、例えば、適切な選択である（例えば、実施例１１参照）。本明細書中に記載した例は、２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合オリゴマンノース、続いての、この判断をなすためのＨＰＬＣ分析を利用する。
Figure 0004875486
 従って、本発明に従って用いられるα−１，２−マンノシダーゼ酵素のようなグリコシル化酵素は、５．１と８．０との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。好ましい実施形態において、この酵素は５．５と７．５との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ酵素は、例えば、本発明の方法でよく働き、約５．５の見掛けのｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼは、適当なｐＨ最適値を有する表３にリストしたもの、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、マウスＩＢ（ゴルジ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓを含む。
α−１，２−マンノシダーゼ酵素についてのｐＨ最適値を示す実験を実施例１４に記載する。培地に遺漏するキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ３１）を種々のｐＨ範囲に供して、酵素の最適活性を決定した。実験の結果は、α−１，２−マンノシダーゼはその機能について最適ｐＨ約５．５を有することを示す（図１１）。
好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子が、宿主生物において発現される。しかしながら、いくつかの場合、数個の異なるマンノシダーゼ遺伝子、または１つの特定の遺伝子の数個のコピーを発現させて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の適切な生産を達成するのが望ましくあり得る。複数遺伝子を用いる場合、コードされたマンノシダーゼは、好ましくは、全て、約５．１〜約８．０、または特に約５．５と約７．５との間の好ましい範囲内にｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼ活性は、マウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓまたはＡ．ｎｉｂｕｌａｎｓに由来するα−１，２−マンノシダーゼを含む。
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる宿主細胞グリコシル化のインビボ改変）
本発明のある種の方法は、好ましくは（必ずしも必要ではないが）、１以上の核酸ライブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク質（例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素またはその触媒ドメイン）をコードする配列を含むことである。
１つの実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）異なる細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列；および（ｂ）標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。もう１つの実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、および（ｂ）宿主細胞へ標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。後にさらに記載するように、（ａ）に由来する核酸配列、および（ｂ）に由来する核酸配列を連結させて、注目するポリペプチドドメインに機能的に連結した細胞標的化シグナルペプチドをコードする１以上の融合構築物を生じさせる。機能的結合の１つの例は、細胞標的化シグナルペプチドが同一翻訳リーディングフレームにて（「インフレーム」）注目するポリペプチドドメインに連結される場合である。
好ましい実施形態において、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメインにインフレーム連結した細胞標的化シグナルペプチドを含む１以上の融合タンパク質を発現させる。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンの哺乳動物様修飾またはヒト様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい実施形態において、触媒ドメインは、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および１以上の標的化シグナルペプチドにインフレームに連結した他のグリコシダーゼよりなる群から選択される酵素に由来する。酵素ドメインは、宿主細胞に対して外因性および／または内因性であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジへの輸送を受けるタンパク質に通常は会合したものである。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、哺乳動物Ｎ−グリカン修飾またはヒト様Ｎ−グリカン修飾に関与するインビボ酵素を生産し、局在化するのに用い得る。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が、それが注目する糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを生産することに関与する宿主細胞のＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークに局在化されるように操作される。本発明のＮ−グリカン修飾酵素の局在化は、アンカリング機構を介して、またはタンパク質−タンパク質相互作用を介して達成され、ここに、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーから構築した局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークのような分泌経路の所望の細胞小器官に局在化される。
十分に、かつヒト様（複合）グリコシル化反応によってさらなる修飾用の十分な量が生産される有用なＮ−グリカンの例は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。十分な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、インビボでのさらなるヒト様プロセシングのために注目する糖タンパク質に必要とされる（例えば、３０モル％より大）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体は、さらなるＮ−グリカン修飾用の基質として用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産し得る（図１Ｂ；上記参照）。従って、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて、引き続いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、または所望の複合Ｎ−グリカンを有用な量で生産する酵素を生産し得る。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて生産された融合構築物のさらなる局面は、それらが、操作された宿主細胞において十分かつしばしば完全に近い細胞内Ｎ−グリカントリミング活性を可能とすることである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生産された好ましい融合構築物は、グリコシル化酵素（例えば、マンノシダーゼ）をコードし、これは、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在化され、それにより、細胞外活性をほとんど、好ましくは全く呈しない。マンノシダーゼ酵素をコードする本発明の好ましい融合構築物は、Ｎ−グリカンが修飾される場所（すなわち、ＥＲおよびゴルジ）に局在化されることが示されている。本発明の融合酵素は分泌経路中のそのような特定の細胞小器官に標的化され、そこでは、それらは局在化され、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンに作用して、注目する糖タンパク質上でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生産された酵素は、各々、図５および６に示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたＫ３またはＩＦＮ−βタンパク質につき示されたように、注目する糖タンパク質上でＮ−グリカンを修飾することができる（また、実施例２および１１参照）。しかしながら、限定されるものではないが、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωのようなサイトカイン、および顆粒球−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子のような凝固因子、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、セイメース、および尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄系先祖阻害因子１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベータおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）を伴うか伴わないＧＬＰ−１、ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めた他のタイプの糖タンパク質も、このようにしてグリコシル化され得るのが認識される。
（融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築）
融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、一般に、（例えば、Ｃ末端欠失を作製することによって）天然タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１以上の細胞標的シグナルペプチド（「標的化ペプチド」）を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的化ペプチドは、天然タンパク質（例えば、ＳＥＣ１２）のＣ末端に由来する。ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これらの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび／または他の局在化されたタンパク質との比較（例えば、疎水性プロットの比較）によって認識可能である。
標的化ペプチドはここではタイプＩＩ膜の一部に対して短い（ｓ）、中程度（ｍ）および長い（ｌ）として示される。短い（ｓ）と示された標的化ペプチド配列は膜−結合タンパク質の膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中程度（ｍ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の長さのほぼ半分に対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。
（サブライブラリー）
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝子または野生型遺伝子から直接構築することができる。好ましい実施形態において、上記ＤＮＡライブラリーは、２以上のサブライブラリーの融合から構築される。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン（例えば、グリコシル化活性を有するもの）をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製することが、可能である。
（グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー）
１つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメインは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。哺乳動物酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は、全て有用であり、これは、最適温度および最適ｐＨに関して広いスペクトルの生化学特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードする断片を得る。内因性標的化配列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現させ得る。
そのような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが引き続いて活性であるべき特定の環境についての知識によって誘導され得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴルジにおいて活性であり、かつ後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定のｐＨ最適値を有するか、あるいは後期ゴルジが特定のｐＨを有することが公知である場合、上記したように、そのｐＨにおいて十分な（好ましくは最大の）活性を示す触媒ドメインを、選択する。
（標的化ペプチド配列サブライブラリー）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、３つのカテゴリー：（１）一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜（腔膜）に係留させる、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の一部またはステム領域の全てをコードする、Ｎ末端配列；（２）ＨＤＥＬテトラペプチド（配列番号５）またはＫＤＥＬテトラペプチド（配列番号６）のようなＣ末端で一般に見出される検索シグナル；および（３）ゴルジ中に局在化することが知られている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通領域；に分類される。
最初の場合において、標的化ペプチドが種々のエレメント（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）からなる場合、上記ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が提示されるように設計される。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列および／またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合、種々の長さのｓｒ配列を持つサブライブラリーを提供することが、望ましいものであり得る。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するプライマーを用い、かつステム領域の種々の部分に結合する一連の対向プライマーを使用するＰＣＲによって、達成され得る。
標的化ペプチド配列のさらに他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向輸送されるタンパク質のＣ末端において代表的には見出される、検索シグナルペプチド（例えば、テトラペプチドＨＤＥＬ（配列番号５）またはＫＤＥＬ（配列番号６））が挙げられる。標的化ペプチド配列のさらに他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（ｃ）ゴルジに局在化される膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、および（ｄ）表５において言及される配列、が挙げられる（列１におけるＨＤＥＬシグナル、セル８は、配列番号５に示される）。
Figure 0004875486
Figure 0004875486
 いずれの場合においても、特定の酵素活性に適する標的化ペプチド配列を選択して、所望のグリコシル化反応の系列内で最適に機能することが、非常に好ましい。例えば、新生Ｎ−グリカンの末端シアル化（ヒトにおいて後期ゴルジで起こるプロセス）が可能な改変された宿主微生物を開発するにおいて、後期ゴルジタンパク質に由来する標的化ペプチド配列のサブライブラリーを利用することが、望ましい。同様に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えるようにα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングすることは、ヒトにおける複合Ｎ−グリカン形成における初期工程である（図１Ｂ）。従って、この反応を、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが、望ましい。ＥＲ滞留シグナルおよび初期ゴルジ滞留シグナルをコードするサブライブラリーが、使用される。
次いで、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリー）が、１つまたは一連の標的化ペプチド配列を、触媒ドメインをコードする１つまたは一連の配列に機能的に連結させることによって構築する。好ましい実施形態において、これは、標的化ペプチド配列（上記）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーを、グリコシル化酵素または触媒的に活性なその断片（後記参照）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーへとイン−フレーム連結することよって、達成される。
得られたライブラリーは、標的化ペプチド配列を含有する融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。いくつかの場合、融合タンパク質のＮ末端に、あるいは他の場合にはＣ末端に、標的化ペプチド配列を提供することが、望ましい。いくつかの場合、標的化ペプチド配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り畳まれたドメインのタンパク質構造は、破壊されないものとする。各タイプの融合タンパク質は、（段階的指向性様式または半ランダム様式にて）構築され、最適な構築物は、本発明の方法を用いて、宿主細胞の形質転換、および形質転換された細胞におけるグリコシル化パターンの特徴付けに基づいて、選択され得る。
（さらなる配列多様性の生成）
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー）が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも１つの形質転換体が、望まれる表現型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る（Ｒｏｍｅｒｏら（２０００））。従って、形質転換に先立ち、ＤＮＡライブラリーまたは構成サブライブラリーが、１つ以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、１回以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
（発現制御配列）
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列（例えば、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必要であり得るような他の機能的配列）を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一般には好ましい。
適切なベクター構成要素（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）および必要に応じて、宿主細胞における自律複製に必要な配列が、どの特定の宿主細胞が選択されるかの関数として選択される。特定の哺乳動物または下等真核生物宿主細胞で用いるための適切なベクター構成要素についての選択基準は、慣用的である。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＰ４０プロモーターが挙げられる。
（選択マーカー）
少なくとも１つの選択マーカー（薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完するための遺伝子）を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１８遺伝子、ＢＬＡ遺伝子、またはＳＨ ＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物宿主細胞で用いるために利用可能である。
（形質転換）
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、ＤＮＡ移入のための任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法）が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞において、従来の方法としては、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養（例えば、酵母における発酵）に適した安定な株を生成するために、上記ＤＮＡライブラリー構築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、ＤＮＡライブラリーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規定された部位で起こる。
特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体における望まれない遺伝子の部位中に組み込まれ、その遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣＨ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子またはＭＮＮ４遺伝子の部位への組込みは、糖タンパク質の酵母超マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に関与する酵素の発現を妨げつつ、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能とする。他の実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）、染色体を介して宿主中に導入され得、自律核酸分子としてか、または宿主ゲノム中への相同組み込みもしくはランダム組込みによって、導入され得る。いずれの場合においても、一般には、安定に形質転換された宿主生物の容易な選択を可能とするために、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を各ライブラリーＤＮＡ構築物とともに含ませることが、一般に望ましい。そのために、またはそれに抗して選択され得る再生可能なマーカー遺伝子（例えば、ｕｒａ３）は、特に適切である。
（スクリーニングおよび選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および／または除去工程によって行われ得る。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用いて、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上にタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。
例えば、細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞につき、または最高末端ＧｌｃＮＡｃ含有量にてタンパク質を分泌する細胞につき、スクリーニングし得る。そのようなスクリーニングは、染色手順のような目に見える方法、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体またはマーカー結合体化レクチン（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）に結合する能力、特異的レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の低下、インビトロで放射性標識糖を取り込む能力、染料または荷電表面への改変された結合に基づいてスクリーニングされ得るか、あるいは発蛍光団標識レクチンまたは発蛍光団標識抗体と組み合せた蛍光支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを用いることによって達成され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら（１９９８））。
従って、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に細胞を暴露することによって、無傷細胞が、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る。広汎な種類のオリゴ糖特異的レクチンは、（例えば、ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから）商業的に入手可能である。あるいは、特異的ヒトＮ−グリカンに対する抗体または動物Ｎ−グリカンに対する抗体は、商業的に入手できるか、あるいは標準技術を用いて製造され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子（例えば、発色団、発蛍光団、放射性同位体、または発色性基質を有する酵素）に結合体化され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
次いで、スクリーニングは、分析方法（例えば、分光測定法、蛍光比色法、蛍光活性化細胞ソーティング、またはシンチレーションカウンティング）を用いて実施され得る。他の場合には、形質転換された細胞からの単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分析することが、必要であり得る。タンパク質単離は、当該分野で公知の技術によって行われ得る。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が、培地に分泌され、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアフィニティークロマトグラフィー）によって精製される。単離されたＮ−グリカンが好ましい場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｄｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような酵素を用いて、糖タンパク質からＮ−グリカンが切断され得る。次いで、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析法、または他の適切な手段によって、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンが、分析され得る。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、切断されたＮ−グリカンが分析される。
所望の形質転換体の選択に先立ち、望まない表現型を有する細胞の形質転換された集団を除去することが、望ましいものであり得る。例えば、その方法を用いて機能的マンノシダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞糖タンパク質において、より低レベルのマンノースを有する。培地中のマンノースの致死的放射性同位体への形質転換された集団の暴露は、望まない表現型（すなわち、高レベルの取り込まれたマンノース）を有する形質転換体の集団を除去する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ ＴＣおよびＲｏｂｂｉｎｓ ＰＷ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８３ Ｄｅｃ；８０（２４）：７４６６−７０）。あるいは、細胞傷害性レクチンまたは望ましくないＮ−グリカンに対する抗体を用いて、望まない表現型の形質転換集団を除去し得る（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ ＰおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ Ｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ １９７７ Ｊｕｌ；３（４）：３９１−４０５）。米国特許第５，５９５，９００号は、望まれる細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。この戦略を反復して行うと、下等真核生物において、より多くの複合グリカンの連続操作が可能となる。
高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をその表面に有する宿主細胞を検出するためには、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効果的な転移を可能とする形質転換体につき選択し得る。このスクリーニングは、寒天プレート上での選択圧下で形質転換されたライブラリーを保有する細胞を増殖させること、個々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって、実施され得る。細胞を増殖させた後、細胞は遠心分離され、細胞は、緩衝液中に再懸濁され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩの添加の後、ＵＤＰの放出が、ＨＰＬＣまたはＵＤＰについての酵素連結アッセイによって、測定される。あるいは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩを用い得、細胞を洗浄し得、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索し得る。これはすべて、手動により行っても、あるいは高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化されてもよい。第一のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出する形質転換体、または第二のアッセイにおいてより多くの放射性標識ＧｌｃＮＡｃを放出する形質転換体は、その表面により高い程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、従って、所望の表現型を構成すると予測される。同様なアッセイもまた、同様に、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを見るように適合され得る。
あるいは、形質転換細胞の表面上の改変されたグリコシル化パターンを明らかにし得る他の適切な任意のスクリーニング（例えば、レクチン結合アッセイ）を用い得る。この場合、末端マンノースに対して特異的なレクチンの結合減少は、適切な選択ツールであり得る。Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的に結合し、これは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジに存在する場合には低下することが、予測される。また、高い末端マンノース含有量を含む細胞の除去を可能とするクロマトグラフィー分離工程を行うことによって、所望の形質転換体を富化し得る。この分離工程は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を持つ細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行う。
加えて、異なる下等真核生物宿主において活性な炭水化物改変酵素の局在化についてのさらなる情報は科学文献にて入手可能となるので、そのような融合タンパク質構築物を直接作製し得る。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、その触媒活性を保有しつつゴルジ装置に局在化され得ることが、公知である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら．（１９９５））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような知見を全体的戦略に直接的に組み込んで、そのような宿主から複合Ｎ−グリカンを取得し得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるいくつかのそのような遺伝子断片が同定されており、これらはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグリコシルトランスフェラーゼに関連する。従って、これらは、その目的で使用され得る。
（コンビナトリアルライブラリーからの融合構築物を用いる宿主細胞グリコシル化の改変）
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築が、図２に模式的に示され、実施例４に記載される。その融合構築物は、多数のベクター（例えば、当該分野で周知の発現ベクター）に作動可能に連結され得る。広く種々のそのような融合構築物が、表６に示したような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド／触媒ドメインの組合せは、本発明に従って、ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドのタイプに応じ、Ｎ−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さないものであり得る（例えば、表７、実施例１１）。
（マンノシダーゼ融合構築物）
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の代表的な例は、ｐＦＢ８であり、これは、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）の１８７Ｎ末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５からのＳＥＣ１２の９８８〜１２９６ヌクレオチド）を有する。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＳＥＣ１２標的化ペプチド配列によってＥＲに局在化し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である（実施例１１；図６Ｆおよび７Ｂ）。
融合構築物ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９）は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の例である（実施例１１；図５Ｄおよび８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である効率的な融合構築物のさらに別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物および他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製することによって、当業者は、最適細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低い活性を持つかまたは活性を全く持たない構築物から区別し、そしてそれを選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノシダーゼ融合構築物のみが、特に望ましいＮ−グリカンをインビボで生成し得るので、有利である。
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的であり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じさせ得るというわけではないことが、さらに理解されるべきである。従って、目的のタンパク質は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた宿主細胞に導入されて、目的のタンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生じさせて選択することが可能であり得る。
さらに、局在化された活性なマンノシダーゼ触媒ドメイン（またはより一般的には、任意の酵素のドメイン）を示す他のそのような融合構築物は、実施例１１に例示される技術および本明細書中に記載された技術のような技術を用いて、生成され得ることが、明らかである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成しそれを用いて、例えば、特定の宿主細胞中に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリーからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
（グリコシルトランスフェラーゼ融合構築物）
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、本発明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性に由来する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てられ、マーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成につき選択された。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８）生じることが示された融合構築物（ｐＰＢ１０４）、が同定された（実施例１５）。広く種々のそのようなＧｎＴＩ融合構築物を、組み立てた（実施例１５、表１０）。標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例１５に示すように生成され得ることが、当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、ＧｌｎＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
マンノシダーゼ融合構築物につき上記したように、全ての標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、本明細書中に記載するように目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じるというわけではない。しかしながら、当業者は、本明細書中に記載したＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生成してそれを選択することが可能である。実施例８は、標的化ペプチドと、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を持つ糖タンパク質の生成に関与するＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物とを含む、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態を示す。
（宿主細胞グリコシル化を改変するための多重融合構築物の使用）
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例において、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現するＯＣＨ１欠失を持つＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに変換した（実施例１５）。まず、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）を、１，６開始マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（すなわち、ｏｃｈ１欠失；実施例１）に形質転換した。第二に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなる生成を増加させた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、図１０Ｂに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を有意に増加させた。第３に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、この株に導入した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を「ＰＢＰ−３」という。
上記した酵母株のような宿主細胞は、１以上の発現ベクターで順次に形質転換および／または共形質転換され得ることが、当業者によって理解される。また、形質転換の順番は、目的の糖タンパク質を生成するのに特には関係しないことも、理解される。当業者は、本明細書中に開示された手法の慣用的改変は、目的の糖タンパク質の生成において改良された結果を提供し得ることを認識する。
特定の触媒ドメイン配列を持つ特定の標的化ペプチド配列を用いることの重要性は、本明細書中に記載された実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ヒト様糖タンパク質を生成するのに特に有用な、目的の糖タンパク質上でのＮ−グリカンの改変に関与する酵素融合物を構築するためのツールを提供する。（しかしながら、本発明のライブラリーおよび方法を用い、任意の酵素融合物が、選択され得る）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５Ｄおよび５Ｅに示されたように、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを持つＫ３を生じる。これは、図５ＣにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されたように、親ＯＣＨ１欠失株のＫ３と比較して、切断されたグリカンに減少した分子質量を与える。
同様に、同じアプローチを用いて、別の分泌型糖タンパク質（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を優勢に含むＩＦＮ−β）を生成した。このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｐａｐａｃら．，１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）によって除去し、図６Ａ〜６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１２５４（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークは、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）および図６Ｆ（ｐＦＢ８）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）において、ＩＦＮ−β上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を確認する。さらに、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８）およびｐＰＢ１０３（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ−３において、ハイブリッドＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）。
高度なマンノーストリミングで形質転換体を同定した後、さらなる実験を行って、マンノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで起こり、これは、優勢には、増殖培地中での細胞外活性の結果ではないことを確認した（実施例１３；図７〜９）。
（宿主細胞）
本発明をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子（例えば、ＯＣＨ１）の同定および破壊のための本明細書中に記載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよび／または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが、理解される。実施例１６に記載されたように、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１遺伝子が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから欠失されて、１，２−マンノシダーゼによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと完全に変換されるＮ−グリカンに導く宿主細胞を操作した（図１２Ｃ）。
ＭＮＮ１遺伝子を、実施例１６に記載されたようにＫ．ｌａｃｔｉｓからクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、配列番号４３および配列番号４４に示される。遺伝子特異的プライマーを用い、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＭＮＮ１遺伝子を欠失するように、構築物を操作した（実施例１６）。ｏｃｈ１活性およびｍｎｎ１活性を除去した宿主細胞は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造を有するＮ−グリカンを生じる（例えば、図１０参照）。そのような宿主細胞は、例えば、本発明の方法およびライブラリーを用いてさらに操作して、哺乳動物様糖タンパク質またはヒト様糖タンパク質を生成され得る。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子（配列番号４３）の少なくとも４５ヌクレオチド残基、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド残基、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド残基、最も好ましくは７５のヌクレオチド残基以上を含む核酸配列を有する単離された核酸分子、またはそれらのヌクレオチド残基からなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそれらのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、断片、誘導体およびアナログを含む）が提供される。加えて、さらに本明細書中で記載するような、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が、提供される。
従って、本発明の別の局面は、ヒト細胞によって生成されるものと似ている改変されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する、非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、酵母細胞および真菌細胞以外の種における本発明の方法の実行が、企図され、これは本発明に含まれる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを用いて、任意の真核生物宿主細胞系におけるグリコシル化経路を改変する構築物を選択し得ることが、企図される。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、植物、藻類および昆虫、ならびに他の真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む）で用いて、宿主細胞分泌経路に沿った望む位置において、タンパク質（グリコシル化酵素またはその触媒ドメインを含む）を局在化し得る。好ましくは、グリコシル化酵素または触媒ドメインなどは、宿主細胞分泌経路に沿って亜細胞位置に標的化され、その場所で、それらの酵素は、機能可能であり、好ましくは、それらが最も効率的に機能するように設計または選択される。
実施例１７および１８に記載されるように、植物および昆虫細胞を、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用い、発現されたタンパク質のグリコシル化を改変するように作製し得る。さらに、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞におけるグリコシル化はまた、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて、特定の酵素活性を最適化するか、あるいは哺乳動物宿主細胞において作製された種々のＮ−グリカンの相対的割合を修飾することが可能であり得る。
本発明のこの実施形態に従った方法を用いて作用され得るグリコシル化に対する修飾の例は：（１）Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのマンノース残基をトリミングして、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを生じるように真核生物宿主細胞を操作する工程；（２）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加するように真核生物宿主細胞を操作する工程；（３）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）またはシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核生物宿主細胞を操作する工程である。
この方法を反復することによって、徐々に複雑なグリコシル化経路を、下等真核生物微生物のような標的宿主に操作し得る。１つの好ましい実施形態において、宿主微生物は、グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで２回以上形質転換する。所望の表現型の選択は、各ラウンドの形質転換の後に、あるいは、数回の形質転換が生じた後に行われ得る。複合グリコシル化経路はこのようにして迅速に操作され得る。
（一連のグリコシル化反応）
好ましい具体例において、そのような標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物において、グリコシル化反応の一連の性質についての既存の情報を組み込むように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはＥＲの初期部分に標的化する工程を必要とする。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングは、複合Ｎ−グリカン形成における初期の工程である。タンパク質プロセシングはＥＲで開始され、次いで、初期、中間および後期ゴルジを通じて進行するので、この反応はＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼＩ局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ＥＲおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
（組込み部位）
この遺伝子工学の試みの１つの最終的な目標は、産業醗酵プロセスにおいて首尾よく実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への複数遺伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならないであろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体についてのｓｙｎおよび交互輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）のいずれかの組合せを真菌タンパク質発現宿主中に作製し得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような下等真核生物宿主細胞においてグリコシル化を改変するための好ましい方法の例を表６に示す（第３蘭の２行目のＨＤＥＬシグナルペプチドおよびＫＤＥＬシグナルペプチドは、それぞれ、配列番号５および６に示される）。
（表６．下等真核生物微生物においてグリコシル化を修飾するためのいくつかの好ましい具実施形態）
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 下等真核生物のような宿主細胞への複合Ｎ−グリカンの形成を操作するためのいずれかの戦略は特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性の除去ならびに付加の両方を含むので、包括的なスキームは、両方の要件を協調させる試みであろう。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ましい遺伝子についての潜在的組込み部位として働く。例えば、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの既知の下等真核生物におけるグリコシル化の特徴である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化され、この遺伝子における変異は低下したマンノシル化と共に生存可能な表現型を生じる。従って、α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子の組込み用のプライミング標的である。同様に、その遺伝子座における遺伝子破壊事象に基づいて、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改良し、（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を改良し、（３）外来性タンパク質のタンパク質分解を低減させ、そして（４）その精製または醗酵プロセス自体を容易にするプロセスの他の特徴を改良することが期待されるある範囲の他の染色体組込み部位を選択し得る。
（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられる糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−６−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャイエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様に、グリカン側鎖への１以上のシアル酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞（例えば、下等真核生物または哺乳動物）は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増加させるように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る（Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１１１６−１１２１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｎｏｅら、（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（８）：８７０−８８０；Ｗｅｉｋｅｒｔ，Ｐａｐａｃら、１９９９；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５４６−５４９；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。モノクローナル抗体への特異的グリカン修飾（例えば、二分されたＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性細胞傷害性を改良することが示されており（Ｕｍａｎａ Ｐら、１９９９）、これは、抗体または他の治療タンパク質の生成に望ましくあり得る。
治療タンパク質は、代表的には、注射、経口、肺または他の手段によって投与される。本発明に従って生成され得る適した標的糖タンパク質の例としては、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω）、および顆粒球−ＣＳＦ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン類、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、αフェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様プロテイン１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明する。これらの実施例は限定するものとして解釈されるべきではなく：実施例は説明の目的のみのために含まれる。
（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１遺伝子のクローニングおよび破壊）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
Figure 0004875486
 を用いて、推定α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードするＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐ ＯＲＦを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ（Ｘ−３３株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から増幅した。その後、ＯＣＨ１遺伝子における内部オリゴヌクレオチド
Figure 0004875486
 、ならびにライブラリー担持プラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格における
Figure 0004875486
 オリゴヌクレオチドを用いて、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリー（Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．ら、Ｙｅａｓｔ １９９９ ５月；１５（７）：５６３−７２）から増幅した。得られた５０７５ｂｐフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。
ＨＩＳ４抵抗性遺伝子でＯＣＨ１リーディングフレームを置換した遺伝子ノックアウト構築物を構築した後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換し、コロニーを３７℃における温度感受性についてスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度における成長が遅い。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを補完することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。約２０の温度感受性株を、さらに、コロニーＰＣＲスクリーニングに供して、欠失したｏｃｈ１遺伝子でコロニーを同定した。数個のｏｃｈ１欠失を得た。
ＰｉｃｈｉａＨＩＳ４遺伝子を保有するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂ上流配列および１．５ｋｂ下流配列を有する直線化ｐＢＫ９．１を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＢＫ１［ＡＯＸ１遺伝子座においてヒトＩＦＮ−β遺伝子を保有するＧＳ１１５（ｈｉｓ４ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］に形質転換して、野生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトした。形質転換体の初期スクリーンニングは、ヒスチジンドロップ−アウト培地を用いて行い、その後、レプリカプレーティングを行って、温度感受性コロニーを選択した。２００のヒスチジン−陽性コロニーのうち２０が、３７℃における温度感受性表現型を示した。ＰｉｃｈｉａゲノムへのｐＢＫ９．１のランダムな組込みを排除するために、２０の温度−感受性単離体を、組込み部位の上流配列、およびＨＩＳ４ ＯＲＦに特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニーのうち２つはｏｃｈ１障害性であり、サザンブロットおよびウェスタンブロットを用いてさらに分析し、これは、ｏｃｈ１ノック−アウト構築物による機能性ｏｃｈ１破壊を示す。２つの別々の制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いてゲノムＤＮＡを消化して、ｏｃｈ１のノックアウトを確認し、オープンリーディングフレームにおける組込みを確認した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａにおいてＧＳ１１５野生型で生じた区別されるバンドを欠くｏｃｈ１変異体を示した。
（実施例２）
（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−含有ＩＦＮ−β前駆体を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのα―１，２−マンノシダーゼを用いた操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングして、複合Ｎ−グリカン形成のための必須の中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るのに必要である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的異性体は、ＧｎＴＩについての基質であってもなくてもよいからである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体は、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフェロンβを発現するように操作される。ＤＮＡライブラリーは、ヒトマンノシダーゼＩＢ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびＥＲ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される。次いで、ＤＮＡライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、９０％を超える分泌されたタンパク質はグリコシル化インターフェロンβである。
上澄みを精製して、Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現される所望の形質転換体は、親株のインターフェロンβと比較して低下した分子質量を有する、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを生成する。精製されたインターフェロンβはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、インターフェロンβの所望の形態を発現するコロニーを同定する。
（実施例３）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現するｏｃｈ１変異体株の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＨＣ１遺伝子の１２１５ｂｐのオープンリーディングフレームならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流をＰＣＲによって増幅し（ＷＯ ０２／００８７９も参照のこと）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。複数の栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９、ＳｆｉＩ制限部位が隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含むプラスミドをＳｆｉＩで消化し、これを用いて、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換した。室温における１０日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続き、１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したＵＲＡ＋クローンをコロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたＰＣＲパターンを呈した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメインをモデルタンパク質として用いた。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲでマークしたプラスミドを株ＹＪＮ１５３に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と命名した。
ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）からの平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＤＥ１遺伝子（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、（２００１）Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９）を含むＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化した平滑末端ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸにクローン化することによって、ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子を含むプラスミドｐＰＢ１０３を構築した。このプラスミドをＥｃｏＮＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＢＫ６４−１に形質転換し、１つの株はＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むと確認され、これをＰＢＰ１と命名した。
ヒト、マウス、ハエ、虫および酵母源からの数個のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの数個のＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのインフレーム融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ ０２／００８７９を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４組込みベクターにおいて作製し、ＳａｌＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ１に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。１つの活性な選択された構築物は、１８７ヌクレオチドを失った、マウスα―１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子（図３）のＮ末端欠失と融合させた酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８−１２９６ヌクレオチド（Ｃ末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ２と命名した。
ヒト、虫、カエルおよびハエ源からのＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ４組込みベクターにおいて作製し、そして、ＡａｔＩＩで直線化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ２に形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４ｂｐが失われた、ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子の最初の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ３と命名した。
ヒトおよびラット源からのＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインを有するリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーを、薬物ノロセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する抵抗性を与えるＮＳＴＲ遺伝子を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組込みベクターにおいて作製した。これらのライブラリープラスミドを、ＥｃｏＲＩで継代し、エレクトロポレーションによって株ＲＤＰ２７内に形質転換し、そしてこの得られた株を、精製したＫ３から放出されるグリカンの分析によって、スクリーニングした。
（以下の反応のための材料）
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａ製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であった。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα２，６−シアリルトランスフェラーゼ、および牛乳由来のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製であった。ＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓ製であった。金属キレート化「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。９６ウェル溶解−清浄化プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製であった。塩および緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。ＭＡＬＤＩマトリックスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）製であった。
（タンパク質の精製）
Ｋｒｉｎｇｌｅ ３を、９６ウェル形式で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００サンプル取り扱いロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒａｎｃｈ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で精製した。Ｋｒｉｎｇｌｅ ３を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂について提供されるプロトコルの適合である。簡単に言えば、１５０ｕＬ（μＬ）の沈降した体積の樹脂を、９６ウェルの溶解−結合プレートのウェルに注ぎ、３倍体積の水で洗浄し、そして５倍体積の５０ｍＭ ＮｉＳＯ４を充填し、そして３倍体積の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９））で洗浄する。このタンパク質発現培地を、３：２で、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ ＰＯ４，１６ｍＭ ＫＣｌ、８２２ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で希釈し、そしてカラムに充填する。排液後、このカラムを、１０倍体積の結合緩衝液および６倍体積の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄し、そしてタンパク質を、６倍体積の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で溶出する。溶出した糖タンパク質を、凍結乾燥によって、蒸発乾固させる。
（Ｎ−連結グリカンの放出）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から放出させ、そして分離する。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００ｕＬのメタノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ，３．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で排液する。乾燥したタンパク質サンプルを、３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液に溶解し、そして１０ｕＬのＲＣＭ緩衝液を含むウェルに移す。これらのウェルを排液し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。ＲＣＭ緩衝液中６０ｕＬの０．１Ｍ ＤＴＴの添加によって、３７℃で１時間、タンパク質を還元する。これらのウェルを、３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして６０ｕＬの０．１Ｍヨード酢酸の添加によって、室温で暗所で３０分間カルボキシメチル化する。これらのウェルを、水で再度３回洗浄し、そしてその膜を、水中１％のＰＶＰ ３６０（１００ｕＬ）の添加によって、室温で１時間ブロックする。これらのウェルを排液し、そして３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして１ミリ単位のＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）の添加によって、脱グリコシル化する。３７℃で１６時間後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、そして蒸発乾固させた。
（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法）
グリカンの分子量を、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析計を使用して、遅延抽出を用いて決定した。各ウェルからの乾燥したグリカンを、１５ｕＬの水に溶解し、そして０．５ｕＬをステンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして０．５ｕＬのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１の水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ中９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍＬの５−メトキシサリチル酸）と混合し、そして乾燥させた。
イオンを、４ｎｓのパルス時間のパルス化窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いて照射することによって、生成させた。この器具を、１１２５ｎｓの遅延および２０ｋＶの加速電圧を用いて、遅延抽出モードで操作した。格子電圧は、９３．００％であり、格子ワイヤ電圧は、０．１０％であり、内圧は、５×１０−７トル未満であり、そして低質量ゲートは８７５Ｄａであった。スペクトルを、１００〜２００のレーザーパルスの合計から生成し、そして２ＧＨｚデジタイザーで獲得した。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を、外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードでこの器具を用いて生成した。このスペクトルの推定質量精度は、０．５％であった。
（実施例４）
（ガラクトシルトランスフェラーゼを産生するための株の操作）
（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応）
約２ｍｇのタンパク質（ｒ−Ｋ３：ｈＰｇ［ＰＢＰ６−５］）を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、０．１％ＴＦＡに対して徹底的に透析し、そして凍結乾燥により乾固させた。このタンパク質を、１５０μＬの５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２（ｐＨ７．４）に再溶解した。３２．５μｇ（５３３ｎｍｏｌ）のＵＤＰ−ガラクトースおよび４ｍＵのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後、このサンプルを３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法のために、０．１％ＴＦＡに対して透析した。
ガラクトシルトランスフェラーゼと反応したタンパク質のスペクトルは、酵素なしでインキュベートされた類似のタンパク質サンプルのスペクトルと比較すると、２つのガラクトース部分の付加に一致する、質量の増加を示した。タンパク質サンプルを、次に還元し、カルボキシメチル化し、そしてＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化した。回収されたＮ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。タンパク質と反応したガラクトシルトランスフェラーゼ由来の優勢なグリカンの質量は、２つのガラクトース部分（３２５．４Ｄ）の付加に一致する質量だけ、コントロールグリカンの質量より大きかった。
（実施例５：機能的および活性なマンノシダーゼＩＩを発現するための株の操作）
ヒト様グリコ形態を精製するために、微生物を、構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から２つの残りの末端マンノースを除去するマンノシダーゼＩＩ酵素を発現するように操作する（図１Ｂを参照のこと）。シスおよび内側（ｍｅｄｉａｌ）のゴルジ局在シグナルをコードする配列を含むＤＮＡライブラリーを、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードするライブラリーにインフレームで融合する。宿主生物は、過マンノシル化が欠損した株（例えば、酵母）（例えば、ｏｃｈ１変異体）であり、ゴルジおよび／またはＥＲにおいて構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＮ−グリカンを提供する。形質転換後、望ましいグリコシル化表現型を有する生物を選択する。インビトロアッセイを、一方法において使用する。望ましい構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（しかし、望ましくない構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ではない）は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの基質である（図１Ｂを参照のこと）。従って、単一のコロニーを、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下でインビトロでこの酵素を使用してアッセイし得る。ＵＤＰの放出は、ＨＰＬＣまたはＵＤＰについての酵素アッセイのいずれかによって決定される。あるいは、放射活性標識したＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが使用され得る。
前述のインビトロアッセイは、ハイスループットスクリーニング装置を用いて個々のコロニーに対して従来通り行われる。あるいは、レクチン結合アッセイが使用される。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの結合の減少により、望ましい表現型を有する形質転換体の選択が可能になる。例えば、Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３−マンノースに特異的に結合し、この濃度は、作動可能に発現されたマンノシダーゼＩＩ活性の存在下で減少される。１つの適切な方法において、固体アガロース支持体に結合したＧ．ｎｉｖａｌｉｓレクチン（Ｓｉｇｍａ Ｖｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている）は、高レベルの末端α−１，３−マンノースを有する細胞の形質転換された集団を除去するために使用される。
（実施例６：シアリルトランスフェラーゼを発現するための株の操作）
酵素α２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα２，６−シアリルトランスフェラーゼは、生成しているヒトＮ−グリカンにおけるガラクトース残基に末端シアル酸を付加して、成熟糖タンパク質をもたらす（図１Ｂにおける「α２，３ ＳＴおよびα２，６ ＳＴ」を参照のこと）。ヒト細胞において、トランスゴルジまたはＴＧＮにおいてその反応が起こる。従って、ＤＮＡライブラリーを、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをコードする配列と、トランスゴルジまたはＴＧＮ局在シグナルをコードする配列とをインフレームで融合することによって構築する（Ｍａｌｉｓｓａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊａｎ ７；２６７（１）：１６９−７３；Ｂｏｒｓｉｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９５ Ｍａｙ ５；２１０（１）：１４−２０）。宿主生物は、過マンノシル化が欠損し（例えば、ｏｃｈ１変異体）、後期ゴルジまたはＴＧＮにおいて末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンを提供する株（例えば、酵母）であり、後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＣＭＰ−シアル酸の十分な濃度を提供する。形質転換後、例えば、末端シアル酸を有するＮ−グリカンに特異的な蛍光抗体を使用して、望ましい表現型を有する形質転換体を選択する。
（シアリルトランスフェラーゼ反応）
１０μＬの５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に（ガラクトシルトランスフェラーゼを反応させた）（実施例４）タンパク質を再懸濁した後、同じ緩衝液１５μＬ中に溶解した３００μｇ（４８８ｎｍｏｌ）のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）、および５μＬ（２ｍＵ）の組換えα−２，６シアリルトランスフェラーゼを添加した。３７℃で１５分間インキュベートした後、さらに２００μｇのＣＭＰ−ＮＡＮＡおよび１ｍＵのシアリルトランスフェラーゼを添加した。そのタンパク質サンプルを、さらに８時間インキュベートし、次いで透析し、上記のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。シアリルトランスフェラーゼと反応した糖タンパク質のスペクトルは、出発物質（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応後のタンパク質）のものと比較した場合、質量が増加していた。そのＮ−グリカンを遊離させ、上記のように分析した。優勢なグリカンの２つのイオン−付加物の質量増加は、２つのシアル酸残基の付加と一致する（５８０および５８３Ｄａ）。
（実施例７：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを発現するための株の操作）
ヒトゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターのｃＤＮＡは、Ｉｓｈｉｄａおよび共同研究者によりクローニングされた（Ｉｓｈｉｄａ，Ｎ．ら １９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。Ｇｕｉｌｌｅｎおよび共同研究者は、ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターが欠損したＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ変異体の表現型矯正によって、イヌ腎臓ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをクローニングした（Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｅ．ら．１９９８）。従って、哺乳動物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子は、酵母のゴルジ装置に機能的に発現および標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有する。これらおよび他のクローニングされたトランスポーター遺伝子は、宿主のゴルジおよび／またはＥＲにおける効率的なＧｎＴ反応のためのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ基質を提供するように、宿主細胞に操作され得る。図１０Ｂは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを発現する株の効果を実証する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを欠いている図１０Ａとの比較において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを付加する効果は、ＧＩｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２．の生成において劇的な増加を示す。
（実施例８：ＧＤＰ−フコーストランスポーターを発現するための株の操作）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ． ａｎｄ Ｃ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ １９９９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００によって同定および精製された。その対応する遺伝子は、標準的な技術（例えば、Ｎ末端配列決定および縮重ＤＮＡプローブを使用したサザンブロッティング）を使用して同定され得る。そのインタクトな遺伝子は、次いで、フコシルトランスフェラーゼもまた発現する宿主微生物において発現される。
（実施例９：ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを発現するための株の操作）
ヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターはクローニングされ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて活性であることが示された（Ｋａｉｎｕｍａ，Ｍ．ら．１９９９ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（２）：１３３−１４１）。第２のヒトＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（ｈＵＧＴｌ）はクローニングされ、チャイニーズハムスター卵巣細胞において機能的に発現された。Ａｏｋｉ，Ｋ．ら，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（５）：９４０−９５０。同様に、Ｓｅｇａｗａおよび共同研究者は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅからＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターをクローニングした（Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．ら，１９９９ Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５１（３）：２９５−２９８）。ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性をコードするこれらまたは他の配列は、宿主細胞に直接導入されてもよいし、増大したＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を有する株を操作するために、本発明のサブライブラリーの成分として使用されてもよい。
（実施例１０：ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現するための株の操作）
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）は、Ａｏｋｉおよび共同研究者（１９９９）によってクローニングされ、Ｌｅｅ ８ ＣＨＯ細胞において発現された。ハムスターＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの分子クローニングもまた達成された（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄｙ Ｓｃｈａｈｎ １９９７ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−１９２）。マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現は、Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，Ｐ．ら，１９９７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−１２６１９によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて達成された。ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性をコードするこれらまたは他の配列は、宿主細胞に直接導入されてもよいし、増大したＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性を有する株を操作するために、本発明のサブライブラリーの成分として使用されてもよい。
（実施例１１）
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる優勢なＮ−グリカン構造としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体（実施例１および３を参照のこと）を作成した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）をモデルタンパク質として用いた。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、Ｋ３をコードするＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化し、Ｃ−末端６−Ｈｉｓタグが得られた。Ｋ３のＮ−結合グリコシル化効率を改良する（Ｈａｙｅｓら、１９７５ Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１，６５１−６５５）ために、部位特異的変異誘発を用いてＰｒｏ４６をＳｅｒ４６で置き換えた。得られたプラスミドをｐＢＫ６４と命名した。ＰＣＲ構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、表６に従って、Ｃｏｐ ＩＩ小胞、ＥＲ、および初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）およびＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６７５４６１９）触媒ドメインとのイン−フレーム連結によって構築した。組み合わされたＤＮＡライブラリーを用いて、個々の融合構築物を生成し、次いで、これをＫ３発現宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体各々がＫ３ならびにライブラリーからの局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が得られた。個々の形質転体を培養し、Ｋ３の産生を、メタノール含有培地への移動によって誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後に、９０％を超える倍地中のタンパク質はＫ３であった。Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製して、Ｎｉ―アフィニティークロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去した。アフィニティー精製に続き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、後記するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に直接的に供するか、あるいはＮ−グリカンを後記するようなＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｎ−グリカンの放出）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した（Ｍｉｅｌｅら、１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，１５１−１５７）。
このアプローチに続き、多様な組の形質転換体が得られた；いくつかはｏｃｈ１ノックアウト株と比較してＮ−グリカンの修飾を示さず；他のものは高度なマンノーストリミングを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを有するＫ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比較して、糖タンパク質に対して低下した分子質量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって容易に検出された（図５）。表７は、相対的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生レベルを示す。
（表７ Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
Figure 0004875486
 （表８ Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの別のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
Figure 0004875486
 標的化ペプチドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（長、中程度および短）（前出を参照のこと、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）におけるＭＮＳＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３２９０６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（９８８〜１１４０ヌクレオチド：短）および（９８８〜１２９６：中程度）におけるＳＥＣ１２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５）から選択した。標的化ペプチド配列の大部分はＮ末端欠失であったが、ＳＥＣ１２のようないくつかの標的化ペプチド配列はＣ末端欠失であった。この実験で用いた触媒ドメインは、１８７アミノ酸Ｎ−末端欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ａ；および５８、９９および１７０アミノ酸欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ｂから選択した。本明細書中で使用される場合、（＋）の数は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す。表示（−）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の明白な産生が無いことを示す。表示（＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の１０％未満の産生を示す。表示（＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約１０〜２０％の産生を示す。表示（＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約２０〜４０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約５０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の５０％を超える産生を示す。
表９は、分泌されたＫ３に対するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な量を示す。１９のα−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ、およびシス−ゴルジリーダーに融合させることによって作製されたコンビナトリアル遺伝子ライブラリーからの単一構築物で各々を形質転換することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｏｃｈ１）の６０８の異なる株を作製した。
（表９）
Figure 0004875486
 ＊数個の融合構築物は試験しなかった。なぜなら、対応するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへの形質転換の前にＥ．ｃｏｌｉ中で増殖し得なかったからである。
＋最高程度のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２トリミング（３０／５１）を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分（２８／３０）は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した（例えば図４Ｂ）。２つの構築物のみが倍地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２レベルを示した（例えば、図４Ｃ）。
表７は、とりわけ、形質転換された宿主細胞がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示すＫ３糖タンパク質を作製することを可能にする２つの構築物ｐＦＢ８およびｐＧＣ５を示す。表８は、８０アミノ酸Ｎ−末端欠失を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖａｎ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＣＡＡ９８１１４）にインフレーム連結したより好ましい構築物、ｐＢＣ１８−５、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２由来）を示す。この融合構築物はまた、図５Ｅに示すように、優勢なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。このマンノシダーゼ融合構築物は、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成することが示された（＋＋＋＋＋）。
（コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製：）
標的化ペプチドに融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのＮ−末端欠失を含むマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−１，２−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の源：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍから得られたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかからＰＣＲ増幅した。各場合において、ＰＣＲ反応を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でＤＮＡをインキュベートした。例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを増幅するために、５’−プライマー
Figure 0004875486
 （配列番号１２）および３’−プライマー
Figure 0004875486
 （配列番号１３）をＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下でインキュベートし、循環パラメーター：９４℃で１分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間（３０サイクル）を用いるＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅に続いて、ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への連結の前に１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に７２℃にて５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるように、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。クローン化されたＰＣＲ産物は、マンノシダーゼＯＲＦに特異的なプライマーを用いるＡＢＩ配列決定によって確認した。
各マンノシダーゼの所望のＮ−末端短縮形を作製するために、各マンノシダーゼの完全なＯＲＦを、ＰＣＲ反応の後のラウンドでテンプレートとして用い、ここで、５’プライマーのアニーリング位置は所望の短縮形の５’末端に特異的であり、３’プライマーはＯＲＦの元来の３’末端に特異的なままであった。酵母発現ベクターへの短縮形マンノシダーゼフラグメントのサブクローニングを容易にするために、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位をそれぞれ、５’および３’末端において、各短縮産物に作成した。各マンノシダーゼＯＲＦについて作製されたＮ−末端短縮形の数および位置は、触媒ドメイン）（ＣＤ）に関して膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭおよびＣＤの間に位置したステム領域が１５０ｂｐ未満である場合、そのタンパク質についての１つの短縮形のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０ｂｐよりも長い場合、ステム領域の長さに応じて１以上の短縮形が作製された。
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）についての短縮形をいかにして作製したかの例を本明細書に記載し、同様なアプローチを他のマンノシダーゼについて用いた。図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを示し、予測された膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを太字で強調した。この構造に基づいて、３つの５’プライマーを設計して（図３において下線を施したアニーリング位置）、Δ６５−、Δ１０５−およびΔ１８７−Ｎ−末端欠失を作製した。Δ６５Ｎ−末端欠失を例として用いた、使用された５’プライマーは、３’プライマー
Figure 0004875486
 （配列番号１４）（ＰａｃＩ制限部位は太字で強調する）と組み合わせた
Figure 0004875486
 （配列番号１５）（ＡｓｃＩ制限部位は太字で強調する）であった。これらのプライマーの両方を用いて、全長Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ１Ａ ＯＲＦを増幅するための上記にて概説した条件下で１５６１ｂｐ断片を増幅した。さらに、全長ＯＲＦで得られた産物のように、短縮産物もまたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、ＴＯＰ１０に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。短縮マンノシダーゼ断片の配列を増幅し、確認した後に、得られたプラスミド、ｐＣＲ２．１−Δ６５ｍＭａｎｎＩＡを、３７℃にて１６時間、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中でＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。平行して、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）を同一酵素で消化し、上記のようにインキュベートした。消化後、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）骨格および短縮触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。コロニーＰＣＲを用いて、ｐＪＮ３４７−マウスマンノシダーゼＩＡΔ６５構築物の生成を確認した。
酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）において短縮α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのライブラリーを生成し、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーの生成における残りの工程は、標的化ペプチド配列（図２）をイン−フレームクローン化することであった。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）およびｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）両方を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの存在下で、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中で３７℃において一晩インキュベートした。消化に続き、ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ骨格および標的化ペプチド領域の双方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。引き続いて、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マンノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定して、生成された融合がイン−フレームであることを確認した。最終標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズは、上記アプローチによって生成された１３００を超える構築物を含む。図２は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。
（複数栄養要求性マーカーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１ノックアウト株の操作）
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の５’および３’領域についてのスペースホールダー（ｓｐａｃｅ ｈｏｌｄｅｒ）としての、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ １９９９年５月；１５（７）：５６３−７２）のＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含した。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｕｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−５４５．１９８７）、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を有する発現カセットを含んだ。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂのフラグメントは、プライマー
Figure 0004875486
 、およびテンプレートとしてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマー
Figure 0004875486
 を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂのフラグメントを開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−５４５．１９８７）の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを可能な双方の向きに挿入し、その結果、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）およびｐＪＮ２８４（図４Ｂ）が得られた。
発現カセットをクローニング部位としてのＮｏｔＩおよびＰａｃＩを用いて作製した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマー
Figure 0004875486
 およびテンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ部位にクローン化した（図４Ｂ）。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマー
Figure 0004875486
 およびテンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅したＣＹＣ１転写ターミネーター領域（「ＴＴ」）を開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６１を作製した（図４Ｂ）。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドをｐＪＮ２６３をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化することによって作製し、プライマー
Figure 0004875486
 およびテンプレートとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いて増幅したＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを開いた部位にクローン化した（図４Ｃ）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断し、プライマー
Figure 0004875486
 を用いて生成したＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した（図４Ｃ）。プラスミドを同時に用いて新しい遺伝子を導入する可能性を可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図４Ｂ）をｐＪＮ２９８（図４Ｃ）の固有のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ２９９を作製した（図４Ｅ）。
Ｌｕら、（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１４１−１４６に記載されている同様な戦略を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｕｒａ３−ブラスターカセットを構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３の２．０ｋｂのＰｓｔＩ、ＳｐｅＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ，ＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＪＮ３０６を作製した（図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂのＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントをＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ３０８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８（図４Ｄ）の消化、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理に続いて、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｌａｃＺ由来のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを挿入し、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。ｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩでの消化によって放出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９の骨格にクローン化した。得られたプラスミドをｐＪＮ３２９と命名した（図４Ｅ）。
ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩで切断することによって、ＨＩＳ４でマークした発現プラスミドを作製した（図４Ｆ）。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断したプライマー
Figure 0004875486
 を用いて増幅し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂのフラグメントを、次いで、開いた部位に連結した。このプラスミドをｐＪＮ３３７と命名した（図４Ｆ）。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築するために、ｐＪＮ３３７をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングした２つのオリゴヌクレオチド
Figure 0004875486
 を開いた部位に連結し、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。
複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９をＳｆｉＩで消化し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換に続いて、ＵＲＡドロップアウトプレートを室温で１０日間インキュベートした。１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。次いで、全ての１０００のクローンを２組のＵＲＡドロップアウトプレート上で画線培養した。１つの組を室温にてインキュベートし、他方、第二の組を３７℃でインキュベートした。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供して、正しいＯＣＨ１ノックアウトについて試験した。予測されたＰＣＲシグナル（約４．５ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。
（実施例１２：コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの特徴付け）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性形質転換体（実施例４）を、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての５０ｍｌのＢＭＧＹ緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてＯＤ６００ｎｍ２−６まで増殖し、その時点で、５ｍｌのＢＭＭＹ中での室温での２４時間のレポータータンパク質の誘導に先立ち、１０ｍｌのＢＭＭＹ（増殖培地としての１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５ビオチン、および１．５％メタノールよりなる 緩衝化メタノール−複合培地）で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、質量分析およびＨＰＬＣにより分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表６中の標的化ペプチドを用い、ＥＲまたはゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を主に含有するグリカンに対してＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を主に含有するグリカンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を、図５Ｃおよび６ＣにおけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｏｃｈ１ノックアウトのそれと、図５Ｄ、５Ｅ、６Ｄ〜６Ｆに示したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ構築物で形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図５および６は、Ｐ．ｐａｓｔｉｒｉｓにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから創製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９（図５Ｄおよび６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされた全てのグリカンのほぼ３０％を有するタンパク質を生じ、他方、ｐＦ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）（図６Ｆ）の発現はほぼ５０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じ、ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じた。
（Ｎ−グリカンの遊離）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら．１９９８ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から遊離させ、分離した。そのタンパク質を還元し、カルボキシメチル化し、その膜をブロッキングし、ウェルを３回水で洗浄した。３０μｌの１ｍＵのＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含む１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）を添加することによってそのタンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後、そのグリカンを含むその溶液を、遠心分離によって除去し、乾燥するまでエバポレートした。
（マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）
Ｎ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた後、そのＮ−グリカンを、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって分析した。そのグリカンの分子量を、遅延抽出を用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析計を使用して決定した。各ウェルからのその乾燥させたグリカンを、１５μｌの水に溶解し、０．５μｌをｍステンレス鋼サンプルプレートにスポットし、０．５μｌのＳ−ＤＨＢマトリクス（１：１の水／アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ中に９ｍｇ／ｍｌのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍｌの５−メトキシサリチル酸）と混合し、乾燥させた。イオンを、４ｎｓパルス時間で、パルス状窒素レーザー（３３７ｎｍ）で照射することによって生成した。その機器を、１２５ｎｓ遅延および加速電圧２０ｋＶで、遅延抽出モードで作動させた。そのグリッド電圧は、９３．００％であり、ガイドワイヤ電圧は、０．１％であり、内部圧は、５×１０−７トル未満であり、低質量ゲートは、８７５Ｄａであった。１００〜２００レーザーパルスの合計からスペクトルを生成し、５００ＭＨｚディジタイザーで獲得した。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を、外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを、ポジティブイオンモードの器具を用いて生成した。
（実施例１３）
（α−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング）
実施例１１の新規な操作された株が、事実、インビボにて所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じたことを確実にするために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストした（図７〜９参照）。後記した各構築物／宿主株については、ＨＰＬＣを１．０ｍｌ／分の流量にて、Ａｌｔｅｃｈの４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ） Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ２樹脂（５μｍ）を用いて３０℃にて４０分間行った。図７および８において、標準的なＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の分解は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークを生じるように起こることが示された。図７において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］は１８．５９分で溶出した。図８において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は２１．３７分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は１５．６７分で溶出した。図９において、標準Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。
プラスミドｐＦＤ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、３０℃にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。遠心分離によって細胞を収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の生産を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために除去し、残りを選択された可溶性Ｋ３の回収に用いた。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析は図６Ｆに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−２−ＡＢ）の商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図７Ａ）、上記アリコートからの上澄（図７Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図７Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
プラスミドｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を同様に増殖させ、アッセイした。細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収で用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｄに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、図８Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ９−２−ＡＢの商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記アリコートからの上澄（図８Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として用い、２４時間のインキュベーション後に、マンノシダーゼ活性は、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）株消化物（図７Ｂ）およびｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）株消化物（図８Ｂ）の上澄に実質的に存在しなかったことは明らかであり、他方、陽性コントロール（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓから得られたＰ．ｒｅｅｓｅｉからの精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）は、図７Ｃおよび８Ｃに示すように、同一条件下でＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への完全な変換を導く。これは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＧＣ５株；およびｐＦＢ８株におけるインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータであり、これは、今日までに報告されているものとは区別可能に異なる（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら、ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２）。
図９は、さらに、マンノシダーゼ酵素の局在化および活性を立証する。ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｍ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、ＢＭＧＹ中で室温にてＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導の後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収のために用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３を得た。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｅに示す。上澄のより早く除去されたアリコートを、さらに、図９Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ８−２−ＡＢの商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図９Ａ）、上記アリコートｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）からの上澄（図９Ｂ）、および異なる融合構築物ｐＤＤ２８−３（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）からの培地を含有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を決定した。図９Ｂは、陰性結果を呈する融合構築物ｐＤＤ２８−３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）と比較した細胞内マンノシダーゼ活性を示す（図９Ｃ）。
（実施例１４）
（操作されたα−１，２−マンノシダーゼのｐＨ最適アッセイ）
プラスミドｐＢＢ２７−２（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００-＝約１７まで増殖させた。これらの細胞の約８０μＬを６００μＬのＢＭＧＹ中に接種し、一晩増殖させた。引き続いて、細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄（ｐＨ６．４３）を得た。上澄をマンノシダーゼｐＨ最適アッセイのために取り出した。蛍光標識Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を、種々のｐＨに調整された２０μＬの上澄に加え（図１１）、室温にて８時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ ＮＨ２ ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｎｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって試料を分析した。流量は４０分間で１．０ｍｌ／分であり、カラムは３０℃に維持した。３分間のイソクラフィック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒勾配（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカン（１８）を溶出させた。溶媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）。カラムをランの間の２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化した。
（実施例１５）
（構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複合Ｎ−グリカンおよびハイブリッドＮ−グリカンの成熟化に必要である（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は単にマンノシダーゼＩＩによってトリミングされ得、これは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるＮ−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−１，３マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １（５）：４５３−４６１）。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ遺伝子の適切に標的化された触媒ドメインと；ＫＴＲホモログであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｄ２、Ｄ９およびＪ３からの相同性に基づき、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの推定α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼからのＧＬＳ、ＭＮＳ、ＳＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１、ＭＮＮ１、およびＭＮＮ６からの局在化配列とをコードするＤＮＡ断片を含むコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを調製した。図１０は、限定されるものではないが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｕｃｔｉｓ ＧｎＴＩからのＳＥＣおよびＯＣＨ１のような標的化ペプチド配列を含む（表６および表１０参照）。
Figure 0004875486
 標的化ペプチド配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（長、中程度および短）におけるＯＣＨ１（実施例１１参照）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ短および中程度におけるＭＮＮ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３９１０７）から選択した。触媒ドメインは、各々、３８および８６アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つヒトＧｎＴＩ、３５および６３アミノ酸欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩならびに８８アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩおよび３３および１０３アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＸ．ｌｅａｖｉｓ ＧｎＴＩから選択された。
最初の１５４ｂｐを欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＭＧＡＴＩ、登録番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を、オリゴヌクレオチド
Figure 0004875486
 および鋳型としてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ番号７９００３）を用いるＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、正しい配列を確認した。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化に続き、短縮型ＧｎＴＩをプラスミドｐＪＮ３４６に挿入して、ｐＮＡを創製した。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の消化の後、１２０ｂｐインサートをｐＮＡに連結して、ＭＮＮ９膜貫通ドメインとＧｎＴＩとのイン−フレーム融合物を作製し、ｐＮＡ１５を得た。
宿主生物はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株であり、これは超マンノシル化を欠損し（例えば、ＯＣＨ１変異体）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを提供する（例えば、上記からのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７））。まず、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８を形質転換した。次いで、外因性または内因性のＧｎＴＩ／局在化遺伝子の組合せをコードする上記コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロニーを選択し、コロニーＰＣＲによってＧｎＴＩ構築物の存在につき分析した。我々の形質転換および組込み効率は、一般には、８０％を超え、ＰＣＲスクリーニングは、一旦頑強な形質転換パラメーターが確立されれば省略することができる。
（タンパク質精製）
Ｋ３は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００試料−取扱ロボットにて９６ウェルフォーマットを用いてＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から精製した。ロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって供されたプロトコルの適合であった。別のスクリーニング方法は、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体または末端ＧｌｃＮＡｃに結合するレクチン（例えば、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃｏｌｉａ由来のＧＳＩＩレクチン）（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）を使用して行われ得る。これらのスクリーニングは、ＦＩＴＣのような蛍光標識で改変されたレクチンまたは抗体を使用することによって自動化し得るか、あるいはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析され得る。
分泌されたＫ３は、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得、定量され得、等量のタンパク質が、高タンパク質結合型９６ウェルプレートに結合され得る。ＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、ＧＳＩＩ−ＦＡＣＳレクチンでプローブし得、最大蛍光応答についてスクリーニングした。上記の糖タンパク質を検出する好ましい方法は、９６ウェル培養形質転換体の上清から分泌Ｋ３をアフィニティー精製した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってスクリーニングすることを含む。形質転換されたコロニーは拾い上げられ、３０℃において、ＢＭＧＹ中、２ｍｌの９６ウェルプレートにおいて１０のＯＤ６００にまで増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、ＢＭＭＹで洗浄し、２５０μｌのＢＭＭＹで再懸濁した。２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって除去し、その上清を回収し、Ｋ３を上清からＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。そのＮ−グリカンを遊離させ、本明細書に記載のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ遅延抽出質量分析によって分析した。
まとめると、本発明の方法は、図１０Ｂに示されるように、高収率でＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を精製するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を生成する。そのＮ−グリカンの６０％は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。今日までに、いずれの酵母においても分泌された可溶性形態でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を記載した報告は存在しない。本明細書に示される結果は、ＧｎＴＩ活性とともにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加が、１４５７（ｍ／ｚ）におけるピークによって確認される、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成することを示す。
（株ＰＢＰ−３の構築）
Ｋ３を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（Δｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−）を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第二に、ＢａｍＨＩ酵素およびＢｇｌＩＩ酵素で消化されたｐＢＬＡＤＸ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第三に、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片としてｐＪＮ３３６にクローン化された遺伝子をコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換した。
（実施例１６）
（構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞の操作）
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の同定および破壊）
出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６８（３５）：２６３３８−４５（Ｄｅｃ １５，１９９３））。このマンノース転移は、一般には、Ｎ−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化における鍵となる最初の工程として認識される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３５）：２６３３８−２６３４５； Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−１９；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅｔら，Ｔｒａｆｆｉｃ １（１）：５６−６８．（Ｊａｎ ２０００））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこの遺伝子の欠失の結果、かなり短いＮ−グリカン構造がもたらされ、これは、高温におけるこの典型的なポリマンノシル化も増殖欠損も含まない（Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−９（Ｊｕｌ １９９２））。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯｃｈ１ｐ配列を、関連するが区別されるマンノシルトランスフェラーゼであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ｎｅｉｍａｎら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５（３）：６３７−４５（Ｍａｒ １９９７）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ （ＰＥＮＤＥＮＴ ＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質と共に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＬ４９９８７）、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの公知のホモログと整列させた。Ｏｃｈ１ｐホモログの間では共通するが、Ｈｏｃ１ｐホモログからは区別される高相同性の領域を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，１８５−１９２（１９８７））からのゲノムＤＮＡに対する縮重プライマーの対を設計した。プライマーＲＣＤ３３
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 （配列番号３４）およびＲＣＤ３４
Figure 0004875486
 （配列番号３５）でのＰＣＲ増幅の結果、３０２ｂｐ産物が得られ、これをクローン化し、配列決定し、予測された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対して高度な相同性を有することが示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｏｃｈ１ｐに対して＞５５％）。
３０２ｂｐ ＰＣＲ産物を用いて、高ストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）でのＫ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。ハイブリダイゼーションが、単一遺伝子と合致するパターンで観察され、これは、この３０２ｂｐセグメントがＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムの一部に対応し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ （ＫｌＯＣＨ１）がこの遺伝子の単一コピーを含むことを示す。全ＫｌＯＣＨ１遺伝子をクローン化するために、サザンブロットを用いて、ゲノム遺伝子座をマッピングした。従って、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２ｋｂの範囲の断片をｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作ることによって、５．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片をクローン化した。このサブゲノムライブラリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローンをＲＣＤ３３／３４を用いるコロニーＰＣＲによってテストした。予測されたＫｌＯＣＨ１遺伝子を含む５．２ｋｂクローンを配列決定し、予測されたタンパク質をコードする１３６２ｂｐのオープンリーディングフレームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺伝子と４６．５％同一である。この５．２ｋｂ配列を用いて、ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５）を用い、ｏｃｈ１：：ＫＡＮＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを作製した。この欠失対立遺伝子を２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、Ｇ４１８耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを双方のＰＣＲによって、および温度感受性につきスクリーニングして、ＯＣＨ１ ＯＲＦが欠失した株を得た。実験の結果は、変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株を示し、これは、種々の温度における増殖の分析、およびＰＮＧａｓｅ消化の後における分泌されたタンパク質および細胞壁タンパク質のＮ−グリカン糖質分析によって特徴付けした。ｏｃｈ１変異は、株を３０℃では増殖させるが３５℃では増殖させない、温度感受性を付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびそれより高次のＮ−グリカンを生産する野生型Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニングおよび破壊）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１は、ゴルジα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は、７６２アミノ酸タイプＩＩ膜タンパク質である（Ｙｉｐら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１（７）：２７２３−７．（１９９４））。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ結合オリゴ糖およびＯ結合オリゴ糖双方はα−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， ２４８（１３）：４６６０−６．（Ｊｕｌ１０，１９７３））。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭｎｎｌｐ配列を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ翻訳ゲノム配列（ＰＥＤＡＮＴ）をサーチした。Ｍｎｎｌｐに対して有意な類似性の推定タンパク質断片をコードする１つの４０５ｂｐのＤＮＡ配列を同定した。この配列の内部セグメントを、引き続いて、プライマーＫＭＮ１
Figure 0004875486
 （配列番号３６）およびＫＭＮ２
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 （配列番号３７）でＰＣＲ増幅し、これを用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。サザンハイブリダイゼーションデータに基づき、４．２Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、本明細書中に記載したように、サイズで選択されたライブラリーを作ることによってクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子を含む単一クローンを、プライマーＫＭＮ１（配列番号３６）およびＫＭＮ２（配列番号３７）を用いる全コロニーＰＣＲによって同定し、配列決定した。このクローン内で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子に３４％同一である予測されたタンパク質をコードする２２４１ｂｐ ＯＲＦが同定された。ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２））を用い、ｍｎｎ１：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築のためにプライマーを設計した。
エレクトロポレーションによって、この破壊対立遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓの株に形質転換し、ヌーセオトリシン抵抗性形質転換体を選択し、破壊対立遺伝子の相同挿入のためにＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株は、公知のレポーター遺伝子のＮ−グリカン糖質分析に付すことができる。
図１２Ｂは、本明細書中に記載されたように、ＰＮＧａｓｅ消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに続いて観察されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失株からのＮ−グリカンを示す。［ｄ］として示される１９０８（ｍ／ｚ）における支配的ピークはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の質量と合致する。
（実施例１７：ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼまたはガラクトシルトランスフェラーゼを発現するための植物細胞の操作）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶは、ヒトの複合型Ｎ−グリカンにおいて、β１，４ ＧｌｃＮＡｃをα−１，６マンノース残基およびα−１，３マンノース残基へ付加するために必要とされる。これまで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶが植物から検出されても、抽出されてもいない。ヒト様Ｎ−グリカンを付加し得るトランスジェニック植物は、従って、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを発現するように操作されなければならない。従って、その植物宿主細胞またはトランスジェニック植物はまた、発現されるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを、その酵素がβ１，４ＧｌｃＮＡｃを適切なマンノース残基に付加し得るように、宿主中の正確な細胞内区画に位置づけなければならない。
哺乳動物および植物に由来するグリコシルトランスフェラーゼは、類似の標的化シグナルを有するといういくつかの証拠がある。例えば、全長ラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、トランスジェニックシロイヌナズナにおけるトランスゴルジネットワークに正確に位置することが示されたが、 必ずしも活性ではなかった（Ｗｅｅ Ｅら．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８ Ｏｃｔ；１０（１０）：１７５９−６８）。緑色蛍光レポータータンパク質（ＧＦＰ）に融合したα−２，６−シアリルトランスフェラーゼに由来する５２個のＮ末端アミノ酸を有する融合構築物もまた、植物ゴルジに正確に位置することが示された（Ｂｏｅｖｉｎｋら．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９８ Ａｕｇ；１５（３）：４４１−７）。２つの哺乳動物タンパク質（ＴＧＮ３０およびフリン）およびＡｔＥＬＰ（シロイヌナズナ内膜タンパク質）（Ｓａｎｄｅｒｆｏｏｔら．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ Ａｕｇ １８；９５（１７）：９９２０−５）（これは、トランスゴルジネットワークに位置する）は、各々、チロシンテトラペプチドモチーフを含み、このモチーフは、おそらく、原形質膜を介する再循環機構によって、ゴルジにこれらのタンパク質を標的化する。哺乳動物および植物は、タンパク質標的化に関連したいくつかの共通な機構を共有するようであるが、にもかかわらず、外因性グリコシラーゼは、植物細胞において正確に標的化されないことがある。しかし、位置づけは、必ずしも等しい酵素活性を生じなくてもよい。よって、このことは、複合型のヒト様Ｎ−グリカンの形成に関与する植物細胞にこれらの酵素および／または他の酵素を正確に標的化するための多様な手段に必須になる。
グリコシル化酵素は、小胞体およびゴルジ装置に存在する内膜タンパク質である。その標的化および位置づけシグナルは、通常、細胞質ドメインおよび／または膜貫通ドメインに含まれ、いくらかの場合には、いくつかのルミナルアミノ酸に含まれる。例えば、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼの膜貫通ドメインを構成する５２個のアミノ酸、９つの細胞質アミノ酸、および２６個のルミナルアミノ酸は、ＧＦＰをトランスゴルジネットワークに標的化することが必要とされる（Ｂｏｅｖｉｎｋら．Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９８ Ａｕｇ；１５（３）：４４１−７）。
従って、小胞体およびゴルジ特異的タンパク質の単に細胞質ドメインと膜貫通ドメインまたは細胞質ドメイン、膜貫通ドメインとルミナルドメインのいずれかを含む細胞質細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列のライブラリーは、実施例１１に記載されるように生成される。その標的化ペプチド配列は、ＥＲおよびゴルジが内在する植物、酵母または動物のタンパク質から選択され得る。グリコシル化関連タンパク質（例えば、グリコシラーゼまたは内膜酵素のような酵素（またはその触媒ドメイン））は、標的化ペプチド配列のライブラリーにインフレームで融合され得、植物に導入され得る（図１３）。植物標的化ペプチド配列は、ＥＲおよびゴルジにキメラ酵素を位置づけるにあたって最も効率的であり得るが、真菌および哺乳動物に由来する標的化ペプチド配列もまた、効率的であり得る。例えば、タバコＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩに由来するＮ末端の７７個のアミノ酸は、レポータータンパク質をゴルジに正確に標的化することが示された（Ｅｓｓｌ Ｄ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９９ Ｊｕｎ １８；４５３（１−２）：１６９−７３）。一実施形態において、これら７７個のアミノ酸（またはこれらアミノ酸のサブセット）を含む１以上のＮ末端フラグメントは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶの触媒ドメインを含む１以上のフラグメントに融合される。少なくとも１つの得られた融合タンパク質は、存在するレポーター糖タンパク質のグリコシル化状態をモニターすることによって実証されるか、または本明細書に記載の技術を使用して植物宿主細胞に導入されるように、機能的ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを植物細胞におけるゴルジ装置に正確に位置づける。
ゴルジに局在化することが示されている別の植物酵素は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩである（Ｓｔｒａｓｓｅｒ Ｒら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９９ Ｄｅｃ；１６（１２）：７８７〜９１）。従って、別の実施形態において、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ標的化ペプチドの１つ以上の異なるフラグメントを、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ触媒ドメインに融合し、融合構築物を生成し、そして上記のように試験する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の植物特異的β１，２−キシロシルトランスフェラーゼは、ゴルジに局在化する別のタンパク質であり、ゴルジにおけるその局在化および保持は、その細胞質配列および膜貫通配列に依存する。（Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２ Ｓｅｐ；５０（２）：２７３〜８１）。従って、別の実施形態において、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの細胞質配列と膜貫通配列とを含む、１つ以上のフラグメントを、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ触媒ドメインを含む１つ以上のフラグメントに融合し、生じる融合構築物を、植物細胞中に形質転換し、そしてそれらの融合構築物が、その植物細胞中でヒト様Ｎ−グリカンを生成し、さもなければグリコシル化を調節する能力について試験する。
ある生物に由来するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶまたはガラクトシルトランスフェラーゼは、別の生物に由来するものよりも、特定の植物宿主において効率的に機能し得るので、種々の真核生物に由来するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ（または触媒ドメイン）を含むフラグメントを、小胞体（ＥＲ）標的化ペプチド配列とゴルジ標的化ペプチド配列とのライブラリーにインフレームで融合し、その後、植物中に導入する。種々の種から単離または誘導された酵素ドメインをコードする核酸のライブラリーの使用は、効率的なグリコシル化の機会を増加し、それに加え、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶによる局在化およびグリコシル化を矯正する。
本発明の方法およびコンビナトリアル核酸ライブラリーを使用して、ヒト様Ｎ−グリカンを含む植物細胞においてタンパク質をグリコシル化するために必要な複数の酵素を、連続的にかまたは一括して、導入して局在化し得る。種々の植物種は、異なる増殖条件を必要とし得るので、形質転換のためのプロトコルは、形質転換される種に依存して変化し得る（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ「Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ」Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ １９９０；１５４：１９８〜２０８；考察２０８〜１２）。トランスジェニック植物を生成するために一般的に使用される方法としては、アグロバクテリウム媒介性形質転換、粒子ボンバードメント（Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１９９０，７９：２０６〜２０９）およびエレクトロポレーションが挙げられる。
（アグロバクテリウム方法）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶの触媒ドメインを、植物中でタンパク質をＥＲおよびゴルジへと標的化することが公知である複数の種々の標的化ペプチド配列にインフレームで融合する。これらの融合構築物の各々を、遍在的に発現されるプロモーター（３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター、ユビキチンプロモーターまたはアクチンプロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターなど）の制御下で導入する。植物特異的ターミネーター領域もまた、使用される。このカセット（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ：：ターミネーター）を、アグロバクテリウム媒介性形質転換のために適切なベクター中にクローニングする（図１３）。このベクターはまた、形質転換植物を選択することを可能にする、選択マーカーを含む。使用される一般的な選択マーカーとしては、カナマイシン耐性を生じる選択マーカー、ハイグロマイシン耐性を生じる選択マーカー、およびバスタ（ｂａｓｔａ）耐性を生じる選択マーカーが挙げられる。上記構築物を、十分に確立された形質転換方法（これらは、当該分野で利用可能である）を介して導入する。ゴルジに標的化されたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶのアグロバクテリウムライブラリーを、そのようにして生成する。
胚性組織およびメリステム組織を、形質転換し得、そしてトランスジェニック植物を再生し得る。組織を形質転換するために、組織外植片（これらは、発芽した種子からの幼芽または根であり得る）を、まず、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物に浸漬してこれでコーティングする。その後、これらを、その接種物を含むプレート上で培養して、カルスと呼ばれる未分化細胞塊を形成する。形質転換植物細胞を、その培地に適切なカナマイシン、ハイグロマイシン、またはバスタ（上記構築物にて使用される選択マーカーに依存する）を添加することによって選択する。上記形質転換植物細胞を、培養中で増殖して未分化のままにし得るか、またはそれらの細胞を、苗条再生および苗条伸長用の培地で処理し得る。分化する外植片を、定着培地上に移して、トランスジェニック植物を生成する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓなどの数種の植物を、アグロバクテリウム溶液中に花を浸漬することにより、形質転換し得る。形質転換した植物由来の種子を、適切な除草剤選択または抗生物質選択を含むプレート上で発芽させる。トランスジェニック植物は、その選択培地上で増殖する植物である。その後、そのトランスジェニック植物を、植物抽出物から糖タンパク質を単離すること、そして本明細書中のどこかに記載されるようにして（例えば、特異的な抗体またはレクチンを使用することにより）糖タンパク質パターンを分析することによって、適切にグリコシル化されたタンパク質（すなわち、複合ヒト様Ｎ−グリカンを有するタンパク質）についてスクリーニングする。アグロバクテリウム方法は、経済的かつ単純であるが、特定の植物種に限定される。従って、アグロバクテリウムを使用して形質転換し得ない植物を、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法またはエレクトロポレーションによって、形質転換し得る。
（粒子ボンバードメント法およびエレクトロポレーション）
アグロバクテリウム媒介性形質転換と比較して、これらの方法は、ゲノム中に複数コピーの導入遺伝子を挿入するために、より大きな傾向を有する。これは、遺伝子サイレンシングおよび共抑制を生じ得る。しかし、アグロバクテリウム媒介性形質転換とは異なり、これらの方法は、種に限定されず、従って、トランスジェニック植物を生成するためにアグロバクテリウム法が使用し得ない場合に、有用である。粒子ボンバードメント法において、培養植物細胞を、ＤＮＡ（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ−ターミネーター：：選択マーカー）（図１３）（ｒｂおよびｌｂは、必要ではない）でコーティングされた非常に小さいタングステン粒子または金粒子でボンバードメントする。一方、エレクトロポレーション方法において、ＤＮＡ（プロモーター：：標的化ペプチド−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶ−ターミネーター：：選択マーカー）溶液中の植物細胞を、その細胞を穿孔処理する電気パルスで処理して、その細胞にＤＮＡを取り込ませる。その後、その細胞を培養して回復させる。適切な形質転換体を、適切な選択培地上で植物を培養して再生することによって選択する。
（ダイズ子葉節アグロバクテリウム媒介性形質転換系を使用して、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを発現するようにダイズを操作すること）
ゴルジに標的化されたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶのアグロバクテリウムライブラリーを、上記に記載されるように生成する。ダイズ外植片を、Ｈｉｎｃｈｅｅら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８８．６：９１５）により記載されるプロトコルを使用して、そのライブラリーで形質転換する。レポータータンパク質を、Ｈｉｓタグとともに発現させ、精製し、その後分析する。トランスジェニック植物を、例えば、質量分析法を使用して、α―１，６−マンノース残基およびα−１，３−マンノース残基を有するタンパク質についてアッセイする。
（粒子ボンバードメントを使用して、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを発現するようにエンドウを操作すること）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶプラスミドライブラリーを、タングステン粒子または金粒子上にコーティングし、それを微小発射体として使用して、記載される（Ｍｏｌｎａｒら、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ４−１１，１９９９、Ｓｔａｒａ Ｌｅｓｎａ，Ｓｌｏｖａｋ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）ようなエンドウ胚組織から誘導したカルスにボンバードメントする。レポータータンパク質を、Ｈｉｓタグとともに発現させ、精製し、その後分析する。トランスジェニック植物を、例えば、ＭＡＬＤＩを使用して、α―１，６−マンノース残基およびα−１，３−マンノース残基を有するタンパク質についてアッセイする。
（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを発現するように植物を操作すること）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩは、末端α−１，３マンノース残基にＧｌｃＮＡｃを付加してＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成すること（これは、複合Ｎ−グリカンの成熟における必須段階である）に関与する。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩは、植物から単離されており、これは、その哺乳動物ホモログと同じ機能を有するようであるが、哺乳動物タンパク質または外因性タンパク質のグリコシル化のために最も効率的な酵素ではないかもしれず、どの植物種においても見出されるわけではないかもしれない。末端α−１，３−マンノース残基にＧｌｃＮＡｃを添加することは、哺乳動物グリコシル化経路における制御段階であるので、この段階を効率的に実行し得るトランスジェニック植物を有することは、有利である。複合Ｎ−グリカンの形成を促進するように効率的に機能し得るＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを発現するトランスジェニック植物を生成するために、種々の生物から単離または誘導されたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのライブラリーを、本明細書中に記載される方法に従って、複数の植物ゴルジ標的化ペプチド配列にインフレームに融合する。そのようにして生成したコンビナトリアルライブラリーを、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶについて上記されたように植物細胞または植物生物中に導入する。
（粒子ボンバードメントを使用して、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを発現するようにトウモロコシを操作すること）
トランスジェニックトウモロコシを、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶを発現するエンドウを生成するために使用されるプロトコルと類似する方法を使用して、獲得し得る。ここで、上記ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＶプラスミドライブラリーを、タングステン粒子または金粒子上にコーティングし、それを使用して、例えば、トランスジェニックトウモロコシの生成について特異的なプロトコル（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ＷＪら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９０ Ｊｕｌ；２（７）：６０３〜６１８）を使用して、トウモロコシ胚性組織に由来するカルスにボンバードメントする。トランスジェニック植物を、例えば、特異的抗体を使用するか、または特定のレクチンへのＮ−グリカン結合の減少をアッセイすることによるか、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用することによって、末端α−１，３マンノース残基上にＧｌｃＮＡｃを有するタンパク質についてアッセイする。
本発明に従う植物宿主細胞についての他の有用な参考文献としては、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｓｅｐ；３５（１〜２）：１９７〜２０３；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ＧＭら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５ Ｆｅｂ；３（１）：１７〜２３；Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２ Ｓｅｐ；５０（２）：２７３〜８１；Ｆｒａｍｅ ＢＲら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００２ Ｍａｙ；１２９（１）：１３〜２２；Ｇｏｍｏｒｄ Ｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ １９９９ Ｊｕｎ；８１（６）：６０７〜１８；Ｌａｕｒｓｅｎ ＣＭら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９４ Ｊａｎ；２４（１）：５１〜６１；Ｏｒｃｉ Ｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｓｅｐ １８：１５０（６）：１２６３〜７０；Ｎｅｗｅｌｌ ＣＡ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１６（１）：５３〜６５；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ Ｗら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９６ Ａｕｇ；６（１）：１７〜３０；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＨＥら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９３ Ｍａｒ；１０１（３）：７５１〜７５７；Ｓｏｒｏｋｉｎ，ＡＰら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０００ Ｊｕｌ ２８；１５６（２）：２２７〜２３３；Ｓｔｒａｓｓｅｒ Ｒら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １９９９ Ｄｅｃ；１６（１２）：７８７〜９１；およびＴｏｍｅｓ ＤＴら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０ Ｆｅｂ；１４（２）：２６１〜８が挙げられる。
（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを生成するように細胞を操作すること）
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、植物中には存在しない重要なヒトグリコシルトランスフェラーゼである。Ｌｅｒｏｕｇｅ Ｐら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８ Ｓｅｐ；３８（１〜２）：３１〜４８。哺乳動物において、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゴルジに局在化され、これは、複合Ｎ−グリカンのコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の末端Ｎ−アセチルグルコサミンへとガラクトース残基を転移することを担う。植物において、このＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コアは、β１，２−キシロース残基およびα１，３−フコース残基を含み、β１，４−ガラクトースを欠く。そのキシロースの修飾およびフコースの修飾は、アレルギーと関係付けられ、抗原性エピトープとして作用し、従って、治療タンパク質の望ましい改変ではない。
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより実行されるガラクトース修飾は、上記治療タンパク質の適切な機能のために重要であり得る。哺乳動物において、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼＩおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの後に作用し、これは、複合Ｎ−グリカンの分岐を開始することが示されている。Ｌｅｒｏｕｇｅ Ｐら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８ Ｓｅｐ；３８（１〜３）：３１〜４８。Ｐａｌａｃｐａｃ Ｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４６９２〜７。タバコ細胞において、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、フコース修飾およびキシロース修飾が減少しているガラクトシル化Ｎ―グリカンを生じることが、示されている。Ｂａｋｋｅｒ Ｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｆｅｂ ２７；９８（５）：２８９９〜９０４；Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００１ Ｎｏｖ ３０；２８９（２）：５５３〜７。Ｐａｌａｃｐａｃ Ｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４６９２〜７。これらの研究において、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの１．２ｋｂフラグメントが、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）の下流にクローニングされ、バイナリーベクターｐＧＡ４８２中に導入され、最後にタバコ細胞中に導入された。Ｐａｌａｃｐａｃ Ｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４６９２〜７。
タバコ細胞は、Ｒｅｍｐｅｒらにより記載されるアグロバクテリウム方法（Ｒｅｍｐｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．４（３）：１９９〜２０７）を使用して形質転換された。タバコ細胞の形質転換はまた、記載されている（Ａｎ，Ｇ １９８５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７９：５６８〜５７０）。３５ＳＣａＭＶの下でのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、タバコ細胞におけるその遺伝子の遍在的発現を生じた。ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコ細胞は、ガラクトシル化Ｎ−グリカンの存在を示した。（Ｐａｌａｃｐａｃ Ｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ａｐｒ １３；９６（８）：４６９２〜７）。Ｂａｋｋｅｒらは、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコ植物を、マウス抗体の重鎖および軽鎖を発現する植物を交配させると、その抗体が３０％ガラクトシル化を示す植物を生じることを示した（Ｂａｋｋｅｒ Ｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｆｅｂ ２７；９８（５）：２８９９〜９０４）。
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、ガラクトース残基の付加のためのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ系を獲得するために構築し得る。このコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ガラクトース残基の付加においてより効率的な系を有効に生成し得る。一旦、そのような系が生成されると、その系は、他のグリコシル化酵素を発現する系および治療タンパク質を発現する系に容易に交配して、ヒト様グリコシル化を伴う治療タンパク質を生成し得る。その後、最終系を植物として増殖させ得、収集してタンパク質を抽出し得るか、または懸濁培養において植物細胞として培養して、バイオリアクターにおいてタンパク質を生成し得る。シグナルペプチドのライブラリーを使用して治療タンパク質を発現することによって、その細胞内に治療タンパク質を保持すること、またはそれを培地中に分泌させることが、可能である。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコ細胞は、ガラクトシル化Ｎ−グリカンを分泌する（Ｒｙｏ Ｍｉｓａｋｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２ Ｄｅｃ １７；１０：１０９３）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコ植物において発現される西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイムＣは、キシロース修飾およびフコース修飾を含んだが、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコ細胞（ＧＴ６細胞）において発現される西洋ワサビペルオキシダーゼＣにおいては、キシロース修飾もフコース修飾も検出され得なかった。（Ｆｕｊｉｙａｍａ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００１ Ｎｏｖ ３０；２８９（２）：５５３〜７）。これは、全植物体の代わりに細胞系において治療タンパク質を発現させることが、有利であり得ることを示す。
（シアリルトランスフェラーゼを生成するように植物を操作すること）
哺乳動物において、シアリルトランスフェラーゼは、グリコシル化ポリペプチドに末端シアリン酸を付加するトランスゴルジ酵素である。これまで、末端シアリン酸残基は、植物において検出されていない（Ｗｅｅ Ｅら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８ Ｏｃｔ；１０（１０）：１７５９〜６８）。Ｗｅｅらは、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現し、この酵素は、ゴルジに適切に局在化されて機能性であったことを示した。Ｗｅｅらは、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された膜は、ＣＭＰ−３Ｈ−シアリン酸およびアシアロフェチュインアクセプターとともにインキュベートされた場合に、シアリン酸残基の付加をもたらしたが、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された膜は、この付加を生じなかったことを示した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現すると、シアリン酸残基を組み込むことが可能な機能性酵素を生じたが、哺乳動物酵素であるα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを、上記の本発明のライブラリーアプローチを使用して種々の輸送ペプチドに融合すると、他の植物種においてより効率的なシアリル化を生じ得る。Ｗｅｅ Ｅらは、膜を単離して、その膜をＣＭＰ−３Ｈ−シアリン酸およびアシアロフェリチンアクセプターとともにインキュベートしなければならなかった。なぜなら、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、ＣＭＰ−シアリン酸もそのトランスポーターも有さないからである。この付加工程を克服し、植物においてシアリン酸を得るために、ＣＭＰ―シアリン酸生合成経路およびＣＭＰ−シアリン酸トランスポーターを、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック植物において同時発現し得る。代替法として、ＣＭＰ−シアリン酸トランスポーターを、懸濁培養中で増殖させた植物細胞においてα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼと、その培地に供給されたＣＭＰ−シアリン酸または他のＣＭＰ−シアリン酸前駆体とともに、同時発現し得る。
（ウキクサ（ｌｅｍｎａ）におけるα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現）
米国特許第６，０４０，４９８号に記載されるように、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）を、アグロバクテリウム法およびバリスティック法の両方を使用して、形質転換し得る。上記特許に記載されるプロトコルを使用して、ウキクサを、ゴルジに標的化されたα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼのライブラリーならびに哺乳動物ＣＭＰ−シアリン酸トランスポーターライブラリーで形質転換する。トランスジェニック植物を、末端シアリン酸残基を有するタンパク質についてアッセイし得る。
（タバコ細胞におけるα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現）
α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよび／または哺乳動物ＣＭＰ−シアリン酸トランスポーターライブラリーはまた、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼについて記載されたように懸濁培養において増殖させたタバコ中に導入し得る。ＣＭＰ−シアリン酸を、その培地に添加し得る。上記細胞および培養培地（分泌タンパク質）の両方を、末端シアリン酸残基を有するタンパク質についてアッセイし得る。
（実施例１８：グリコシルトランスフェラーゼを生成するように昆虫細胞を操作すること）
昆虫細胞は、糖タンパク質を生成するための別の機構を提供するが、生じる糖タンパク質は、複合ヒト様糖タンパク質ではない。Ｍａｒｚら、１９９５，Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ２９：５４３〜５６３；Ｊａｒｖｉｓ １９９７ Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ３８９〜４３１。昆虫細胞において酵素を提供することは、本発明の別の特徴である。この酵素は、分泌経路において小器官に標的化される。好ましい実施形態において、酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびシアリルトランスフェラーゼ）を、鱗翅目昆虫細胞（Ｓｆ９）においてＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークへと標的化する。哺乳動物β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｓｆ９細胞において示されている。Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８ ８（５）：；４７３〜４８０。これらの酵素を、その酵素と通常は関連していない細胞標的化シグナルペプチドを含むキメラタンパク質によって、標的化する。このキメラタンパク質は、本明細書中に記載されるような標的化配列とグリコシル化酵素とを含む核酸ライブラリーを構築することによって、生成する。昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現が、昆虫細胞において哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを付加するための安定な形質転換のために一般的に使用される。Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１ １１（１）：１〜９。
（表１１：ＤＮＡ配列リソースおよびタンパク質配列リソース）
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 グリコシル化を改変するための方法において使用され得るさらなる方法および試薬が、文献に記載されており、その文献は、例えば、
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 である。適切な酵母発現系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤなどの供給源から入手し得る。ベクターは、種々の供給源から市販されている。
（配列表）
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（参考文献）
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図１Ａは、代表的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の模式図である。 図１Ｂは、代表的なヒトＮ−グリコシル化経路の模式図である。 図２は、融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構成を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への、標的化ペプチドフラグメントの挿入を示す。図２Ｂは、制限部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する産生された標的化ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変されたｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への、触媒ドメイン領域の挿入を示す。図２Ｄは、制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する、産生された触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、標的化ペプチドサブライブラリーおよび触媒ドメインサブライブラリーから産生された１つの特定の融合構築物を示す。 図３（見られる順で、配列番号４５〜４６）は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列を示す。Ｎ末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図３（見られる順で、配列番号４５〜４６）は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列を示す。Ｎ末端切断を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）糖タンパク質のクリングル３ドメインの生成を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。示したＮ−グリカンは以下の通りである：Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生を生じるｏｃｈ１欠失を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のインビボトリミングの後の、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する１２５３の質量（ｍ／ｚ）を有するピークによって示される。 図６Ａ〜６Ｆは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の産生を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］および標準物質としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型から放出されたグリカンであるＰＮＧａｓｅを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］；Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生するｏｃｈ１ノックアウト；およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の非産生を示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］〜Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうちで、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が相対的に少量であることを示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）によって産生された他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対して、有意な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）による分泌糖タンパク質ＩＦＮ−βにおける、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生を示す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と一致する１２５４の質量（ｍ／ｚ）を含むピークによって示される。 図７は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換されたΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露の後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図８は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図９は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）に由来する培養培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）培地Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＤＤ２８−３で形質転換されたΔｏｃｈ１）の上清であり、これは、上清中の活性を示す（ポジティブコントロール）。 図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のいくらかの産生を生じるが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の支配的産生を生じるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターなしに、ヒトＧｎＴＩで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の支配的産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩで形質転換された株（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。１４５７における質量（ｍ／ｚ）の単一の突出したピークは、図１０Ｂに示されるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。 図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたｐＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）によってコードされた異種マンノシダーゼ酵素の最適ｐＨを示す。 図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの無細胞抽出物から取り出されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む、野生型細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示し、これは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としてのその同定と一致する１９０８における質量（ｍ／ｚ）の明瞭なピークを示す。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致するピークに対応するインビトロα−１，２−マンノシダーゼ消化後の、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から放出されたＮ−グリカンを示す。 図１３は、異なるリーダー配列にインフレームで融合したグリコシル化酵素の触媒ドメインを有する、Ｔ−ＤＮＡカセットを示す。このＴ−ＤＮＡの末端は、右境界（ｒｂ）および左境界（ｌｂ）によって印を付けられている。種々のプロモーターおよびターミネーターもまた、使用され得る。植物の選択マーカーもまた、変化され得る。右境界および左境界は、アグロバクテリウム媒介性形質転換のためにのみ必要とされ、そして粒子ボンバードメントのためにもエレクトロポレーションのためにも必要とされない。

Claims (28)

  1. 糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない糸状真菌または酵母宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生する方法であって、該方法は、該宿主細胞に、ＳＥＣ１２、ＶＡＮ１またはＭＮＮ１０細胞標的化シグナルペプチドにＮ末端で融合するα−１，２−マンノシダーゼの触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を導入する工程を含み、宿主細胞による改変型糖タンパク質の産生の際、それに結合するＮ−グリカンの３０モル％以上が、インビボでＮ―アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの基質として働くことができるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造に変換される、方法。
  2. 前記α−１，２−マンノシダーゼが、５．１および８．０の間のｐＨにおいて、最適な活性を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記α−１，２−マンノシダーゼが、５．５および７．５の間のｐＨにおいて、最適な活性を有する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記α−１，２−マンノシダーゼが、５．５のｐＨにおいて、最適な活性を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、６個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、３個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記糖タンパク質が、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、およびフコースからなる群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記糖タンパク質が、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、）、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、）、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、）、アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびノイロスポラ・クロッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記宿主細胞が、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される１種以上の酵素の活性を欠損している、請求項１に記載の方法。
  11. 前記宿主細胞が、１，６マンノシルトランスフェラーゼ；１，３マンノシルトランスフェラーゼ；および１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現しない、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｏｃｈ１変異体である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記宿主細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記宿主細胞が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記単離された糖タンパク質を、前記宿主細胞からの単離に引き続いて、インビトロでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応に供する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記コードされるα−１，２−マンノシダーゼが、５．１と８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記マンノシダーゼが、５．５と７．５との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記α−１，２−マンノシダーゼ活性が、マウス、ヒト、鱗翅目、アスペルギルス・ニドウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、またはバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｐ．シトリナム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、またはＸ．ラエビス（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）由来である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記宿主細胞が、さらに、Ｎ―アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群より選択されるメンバー由来のグリコシダーゼ活性、マンノシダーゼ活性、またはグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする触媒ドメインをコードする核酸を含み、そして該触媒ドメインが、５．１と８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項１に記載の方法。
  21. 前記マンノシダーゼが、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＡ、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、Ｐ．シトリナム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）マンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニドウランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＡ、Ａ．ニドウランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＢ、Ａ．ニドウランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）マンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）マンノシダーゼＩＩ、ヒト(Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ)マンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記宿主細胞が、Ｎ―アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記宿主細胞が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項２０に記載の方法。
  25. 請求項１の方法に用いられる宿主細胞であって、糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない糸状真菌または酵母宿主細胞に、ＳＥＣ１２、ＶＡＮ１またはＭＮＮ１０細胞標的化シグナルペプチドにＮ末端で融合するα−１，２−マンノシダーゼの触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を導入した宿主細胞。
  26. 前記細胞標的化シグナルペプチドが、ＳＥＣ１２細胞標的化シグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
  27. 前記細胞標的化シグナルペプチドが、ＭＮＮ１０細胞標的化シグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
  28. 前記細胞標的化シグナルペプチドが、ＶＡＮ１細胞標的化シグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
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