BRPI0711898A2 - composiÇço de proteÍna da eritropoietina substancialmente homogÊnea, composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodos de aumentar hematàcrito em um mamÍfero, e de produzir uma composiÇço de eritropoietina - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇçO DE PROTEINA DA ERITROPOJETINA SUBSTANCIALMENTE HOMOGÊNEA, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS DE AUMENTAR HEMATOCRITO EM UM MAMÍFERO, E DE PRODUZIR UMA COMPOSIÇçO DE ERITROPOIETIINA Métodos e materiais são fornecidos para a produção de composições de proteína da eritropoietina, em que as ditas composições compreendem um padrão de glicosilação ligado em N pré selecionado como a glicoforma N predominante.

Description

"COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNA DA ERITROPOIETINA SUBSTANCIALMENTE HOMOGÊNEA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS DE AUMENTAR HEMATÓCRITO EM UM MAMÍFERO, E DE PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO DE ERITROPOIETINA"

Este pedido reivindica os benefícios dos Pedidos Provisórios US 60/801.688 depositado em 19 de maio de 2006 e 60/905.770 depositado em 07 de março de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao campo da biologia molecular, em particular a invenção fornece materiais e métodos para a produção de composições homogêneas de eritropoietina PEGuilada com as glicoformas N desejadas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A produção de glicoproteínas recombinante tem sido uma área de enorme atividade para a indústria da biotecnologia. Uma desvantagem das glicoproteínas recombinantes tem sido a heterogeneidade de glicosilação produzida pelo hospedeiro celular habitualmente usado tal como as células CHO. Ao contrário, a presente invenção fornece células hospedeiras eucarióticas inferiores que foram engendradas para produzir eritropoietinas recombinantes que compreendem as estruturas de N-glicano desejadas pré selecionadas. As composições de eritropoietinas recombinantes produzidas a partir destas são significantemente maiores em uniformidade de glicoformas do que aquelas produzidas em células CHO.

A eritropoietina é um hormônio de proteína que foi amplamente usado para indicações terapêuticas que requerem a formação aumentada de células sangüíneas vermelhas incluindo a anemia devida à insuficiência renal ou tratamento de quimioterapia. Por causa da enorme demanda quanto à eritropoietina segura e eficaz, a eritropoietina humana recombinante tem se tornado o produto de proteína humana recombinante de venda mais ampla.

A eritropoietina humana nativa contém quatro cadeias de carboidrato (três ligadas em N e uma ligada em O). A proteína requer N- glicanos sialilados tri- e tetra-antenários para a eficácia máxima in vivo.

Entretanto, a ligação de receptor in vitro e os ensaios com base em célula revelaram que as eritropoietinas com glicanos sialilados multi-ramificados e eritropoietinas com sítios de N-glicosilação adicionais exibem ligação diminuída em relação à eritropoietina enzimaticamente desglicosilada. Este paradoxo pode ser explicado considerando-se a depuração do sistema circulatório. A eritropoietina sialilada tetra-antenárias e a darbepoetina exibem meias-vidas séricas mais longas comparadas com a eritropoietina bi- antenárias sialiladas e não glicosiladas. (As vias principais de depuração para eritropoietina são por intermédio da filtração renal, através da ligação ao receptor de asialoglicoproteína, captação de célula endotelial e internalização pela célula alvo através do receptor da eritropoietina).

As formas correntemente comercializadas de eritropoietina recombinante incluem Epogen com três estruturas de N-glicano tetra- antenárias e Aranesp, eritropoietinas engendradas para conter dois sítios de N- glicosilação adicionais para um total de cinco estruturas de N-glicano tetra- antenárias. A adição destes sítios de ligação de N-glicano extras tem resultado em uma meia-vida sérica mais longa e consequentemente uma atividade in vivo aumentada do hormônio. Estas eritropoietinas são produzidas a partir de células CHO e secretadas com uma mistura heterogênea de estruturas de N- glicano. O desenvolvimento do processo é usado para enriquecer quanto a glicoforma sialilada tetra-antenária (ver a Fig 1).

Esforços anteriores para melhorar as propriedades da eritropoietina incluíram esforços para alterar a glicosilação, por exemplo pela adição de sítios de glicosilação, assim como esforços para conjugar a proteína aos polímeros, tais como polietileno glicóis. Ver, por exemplo a EP 0640619; WO 00/32772 WO 01/02017 e WO 03/029291. A despeito destas tentativas, permanece uma necessidade quanto à eritropoietina recombinante tendo propriedades melhoradas tais como maior facilidade de administração; regimes de dosagem menos rigorosos; farmacocinéticas e biodisponibilidade melhoradas; e fabricação menos cara. Em particular, processos robustos e materiais úteis para produzir composições de eritropoietina que possuam estas qualidades a partir de células eucarióticas inferiores tem permanecido uma meta evasiva e desejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Consequentemente, a presente invenção fornece métodos e materiais para a produção de vetores e células hospedeiras que são capazes de expressar a eritropoietina humana recombinante com a N-glicosilação especificamente direcionada, assim como composições de glicoproteínas recombinantemente engendradas que foram quimicamente modificadas, por exemplo, pela PEGuilação.

A presente invenção fornece cepas engendradas de eucariotes inferiores, particularmente, Pichia pastoris, que são capazes de produzir EPO recombinante totalmente sialilados com estruturas de N-glicano bi-antenárias.

A presente invenção também fornece uma EPO PEGuilada com glicanos bi-antenários. Estas composições de glicoproteína recombinante exibem a bio-atividade in vivo realçada anteriormente observada in vitro enquanto mantendo a meia vida sérica aumentada.

Assim, a presente invenção fornece métodos e materiais para a produção de composições de proteína de eritropoietina PEGuilada, a dita composição compreendendo uma pluralidade de glicoformas ligadas em N que compreendem pelo menos um glicano ligado em N ligado a esta. Em formas de realização preferidas a composição compreende uma pluralidade de glicanos ligados em N em que mais do que 25 porcento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consiste essencialmente de uma estrutura de glicano ligada em N desejada selecionada do grupo que consiste de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2; GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2;

GlcNAc2Man3GlcNAc2; GlcNAc2Man3; GlcNAc2Man5GlcNAc-GalNANA; GlcNAc2Man5GlcNAcGal; GlcNAc2Man5GlcNAc; e GlcNAe2Man5.

Em outras formas de realização preferidas, a estrutura de glicanos ligadas em N desejada compreende mais do que 50 por cento em mol; 75 por cento em mol ou 80 por cento em mol das ditas estruturas de glicano ligadas em N.

Em uma forma de realização preferida, a estrutura de glicano ligada em N desejada consiste essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

Em outras formas de realização preferidas, a composição de proteína de eritropoietina PEGuilada que compreende uma pluralidade de glicoformas, cada glicoforma compreendendo pelo menos um glicano ligado em N ligado a ela, em que a composição de glicoproteína desse modo compreende uma pluralidade de glicanos ligados em N em que mais do que 25 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligado em N ligados consiste essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

Em outras formas de realização preferidas, a presente invenção compreende composições em que mais do que 50 por cento em mol; 75 por cento em mol ou 80 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

Em outras formas de realização preferidas, a presente invenção compreende composições de eritropoietina PEGuilada em que o glicano ligado em N GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2 está presente em um nível de cerca de 5 por cento em mol a cerca de 80 por cento em mol mais do que a estrutura de glicano ligado em N mais predominante seguinte da dita pluralidade de glicanos ligados em N. Uma outra glicoforma preferida da presente invenção consiste essencialmente da estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2. Em formas de realização preferidas, a composição de proteína de eritropoietina PEGuilada que compreende uma pluralidade de glicoformas, cada glicoforma compreendendo pelo menos um glicano ligado em N ligado a ela, em que a composição de glicoproteína desse modo compreende uma pluralidade de glicanos ligados em N em que mais do que 25 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N ligados consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2.

Em outras formas de realização preferidas, a presente invenção compreende composições em que mais do que 50 por cento em mol, mais do que 75 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2.

Em outras formas de realização preferidas, a presente invenção compreende composições de eritropoietina PEGuilada em que o glicano ligado em N GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2 está presente em um nível de cerca de 5 por cento em mol a cerca de 80 por cento em mol mais do que a estrutura de glicano ligado em N mais predominante seguinte da dita pluralidade de glicanos ligados em N.

Em composições preferidas da presente invenção, uma porção de polietileno glicol e o resíduo de aminoácido de terminal N de proteína da eritropoietina podem ser ligados, diretamente ou por intermédio de um ligador.

Em formas de realização preferidas da invenção, a porção de polietileno glicol pode ter um peso molecular de cerca de 5 a cerca de 100 kD; mais preferivelmente de cerca de 20 kD a cerca de 60 kD; peso de cerca de 30 kD a cerca de 40 kb.

A presente invenção também fornece métodos terapêuticos que utilizam as eritropoietinas recombinantes. Em formas de realização preferidas a eritropoietina recombinante é administrada a um paciente humano em necessidade de tratamento para aliviar uma anemia. Em outras formas de realização preferidas, o paciente é tratado para a anemia induzida pela insuficiência renal, quimioterapia ou câncer.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

As Figuras IAalD ilustram a criação escalonada da cepa P. pastoris YGLY3159 que secreta EPO recombinante humana em que o N- glicano predominante é um glicano totalmente sialilado, representado como: GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

A Figura 2 Painéis AaO mostram mapas dos vetores plasmídicos aludidos na Figura 1 que foram usados para gerar YGLY3159.

A Figura 3 ilustra um processo de separação cromatográfíca de tres etapas usado para purificar EPO humana.

As Figuras 4A a 4D mostram a caracterização de EPO purificada pelo Painel 4A) SDSPAGE, mostrando a pureza global da amostra Painel 4B) cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) mostrando um pico único uniforme demonstrando a falta de degradação e falta de agregação Painel 4C) fase reversa (RP)-HPLC demonstrando integridade de EPO e Painel 4D) LC-MS demonstrando qualidade de produto na EPO tratada com PNGase F.

A Figura 5 mostra a análise de SDS PAGE da amostra de hEPO purificada conjugada a um PEG linear de 30 kDa, 40 kDa ou 60 kDa ou um PEG ramificado de 45 kDa.

A Figura 6 mostra a análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC HPLC) de quatro produtos de EPO PEGuilada diferentes.

A Figura 7 mostra cromatogramas líquidos de alto desempenho dos glicanos ligados em N liberados de EPO não PEGuilada e quatro produtos de EPO PEGuilada diferentes pelo tratamento com PNGase-F e rotulados com 2-aminobenzidina (2-AB). Os cromatogramas demonstram a predominância da glicoforma bisialilada GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

A Figura 8 mostra que camundongos injetados com quatro versões diferentes de conjugados de PEG-EPO demonstram um aumento em hematócrito em relação ao Aranesp comercialmente adquirido. Os camundongos C57B6 foram dosados duas vezes por semana por um total de cinco injeções (a dosagem foi interrompida depois de 2,5 semanas). Os camundongos foram sangrados semanalmente e valores de hematócrito foram determinados.

As Figuras 9A e 9B mostram glicoformas ligadas em N preferidas de eritropoietina que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção.

A Figura 10 mostra uma visão geral de uma estratégia de purificação para EPO humana recombinante.

A Figura 11 mostra um gel tingido com Coomassie de EPO humana recombinante purificada.

A Figura 12 mostra representações esquemáticas de químicas de PEGuilação. Tirada da Dow Pharma www.sda.com.

A Figura 13 mostra o efeito da dosagem de PEG-EPO uma vez por semana sobre o aumento de hematócrito relativo em camundongos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS SEQÜÊNCIAS

SEQÜÊNCIA ID NO: 1 Uma seqüência de DNA que codifica uma eritropoietina humana.

SEQUENCIA ID NO: 2 Seqüência de aminoácido que codifica uma eritropoietina humana.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que de outro modo aqui definido, os termos e frases científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são habitualmente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Além disso, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir o plural e os termos plurais devem incluir o singular. No geral, as nomenclaturas usadas em conexão com e as técnicas de bioquímica, enzimologia, biologia molecular e celular, microbiologia, genéticas e proteína e a química de ácido nucléico e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e habitualmente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são no geral realizadas de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e debatidas por todo o presente relatório descritivo a menos que de outro modo indicado. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 e Suplementos para 2002); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1990); Taylor e Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).

Todas as publicações, patentes e outras referências aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Os seguintes termos, a menos que de outro modo indicado, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

Como aqui usados, os termos "N-glicano" e "glicoforma" são usados intercambiavelmente e referem-se a um oligossacarídeo ligado em N, por exemplo, um que esteja ligado por uma ligação de asparagina-N- acetilglicosamina a um resíduo de asparagina de um polipeptídeo. As glicoproteínas ligadas em N contêm um resíduo de N-acetilglicosamina ligado ao nitrogênio da amida de um resíduo de asparagina na proteína. Os açúcares predominantes encontrados nas glicoproteínas são glicose, galactose, manose, fucose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglicosamina (GlcNAc) e ácido siálico (por exemplo, ácido N-acetil-neuramínico (NANA)). O processamento dos grupos de açúcar ocorre co-translacionalmente no lúmen do ER e continua pós-translacionalmente no aparelho de Golgi para glicoproteínas ligadas em N.

N-glicanos têm um núcleo de pentassacarídeo comum de Man3GlcNAc2 ("Man" refere-se a manose; "Glc" refere-se a glicose; e "NAc" refere-se a N-acetila; GlcNAc refere-se a N-acetilglicosamina). Os N-glicanos diferem com respeito ao número de ramos (antenas) que compreendem açúcares periféricos (por exemplo, GlcNAc, galactose, fucose e ácido siálico) que são adicionados à estrutura de núcleo Man3GlcNAc2 ("Man3") que também é aludida como o "núcleo de triamnose", o "núcleo de pentassacarídeo" ou o "núcleo de paucimanose". Os N-glicanos são classificados de acordo com os seus constituintes ramificados (por exemplo, alta manose, complexa ou híbrida). Um N-glicano do tipo de "alta manose" tem cinco ou mais resíduos de manose. Um N-glicano tipo "complexo" tipicamente tem pelo menos um GlcNAc ligado ao ramo 1,3 manose e pelo menos um GlcNAc ligado ao ramo 1,6 manose de um núcleo de "trimanose".

Os N-glicanos complexos também podem ter resíduos de galactose ("Gal") ou N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que são opcionalmente modificados com ácido siálico ou derivados (por exemplo, "NANA" ou "NeuAc", onde "Neu" refere-se ao ácido neuramínico e "Ac" refere-se a acetila). Os N-glicanos complexos também podem ter substituições intracadeia que compreendem "bisseccionar" GlcNAc e fucose de núcleo ("Fuc"). Os N-glicanos complexos também podem ter antenas múltiplas no núcleo de "trimanose," freqüentemente aludido como "glicanos antenários múltiplos." Um N-glicano "híbrido" tem pelo menos um GlcNAc no terminal do ramo de 1,3 manose do núcleo de trimanose e zero ou mais manoses no ramo 1,6 manose do núcleo de trimanose. Os vários N-glicanos também são aludidos como "glicoformas."

As abreviações aqui usadas são de uso comum na técnica, ver, por exemplo, as abreviações de açúcares, acima. Outras abreviações comuns incluem "PNGase", ou "glicanoase" ou "glicosidase" que referem-se todas à N-glicosidase F peptídica (EC 3.2.2.18).

Um ácido nucléico ou polinucleotídeo "isolado", "purificado" ou "substancialmente puro" (por exemplo, um RNA, DNA ou um polímero misto) é um que é substancialmente separado de outros componentes celulares que naturalmente acompanham o polinucleotídeo nativo na sua célula hospedeira natural, por exemplo, ribossomas, polimerases e seqüências genômicas com as quais o mesmo está naturalmente associado. O termo abrange um ácido nucléico ou polinucleotídeo que (1) foi removido do seu ambiente que ocorre naturalmente, (2) não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (3) é operativãmente ligado a um polinucleotídeo que não está ligado na natureza, ou (4) não ocorrem na natureza. O termo "isolado", purificado ou "substancialmente puro" também pode ser usado em referência aos isolados de DNA recombinantes ou clonados, análogos de polinucleotídeo quimicamente sintetizados, ou análogos de polinucleotídeo que são biologicamente sintetizados pelos sistemas heterólogos.

Entretanto, "isolado" não necessariamente requer que o ácido nucléico ou polinucleotídeo assim descritos tenham sido eles próprios fisicamente removidos do seu ambiente nativo. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico endógena no genoma de um organismo é aqui julgado "isolado" se uma seqüência heteróloga é colocada adjacente à seqüência de ácido nucléico endógeno, tal que a expressão desta seqüência de ácido nucléico endógena seja alterada. Neste contexto, uma seqüência heteróloga é uma seqüência que não está naturalmente adjacente à seqüência de ácido nucléico endógena, seja a própria seqüência heteróloga endógena ou não (originando da mesma célula hospedeira ou sua progênie) ou exógena (originando de uma célula hospedeira diferente ou sua progênie). Por via de exemplo, uma seqüência promotora pode ser substituída (por exemplo, pela recombinação homóloga) no lugar do promotor nativo de um gene no genoma de uma célula hospedeira, tal que este gene tenha um padrão de expressão alterado. Este gene tornar-se-ia agora "isolado" porque o mesmo está separado de pelo menos algumas das seqüências que naturalmente o flanqueiam.

Um ácido nucléico também é considerado "isolado" se o mesmo contém quaisquer modificações que não ocorrem naturalmente para o ácido nucléico correspondente em um genoma. Por exemplo, uma seqüência codificadora endógena é considerada "isolada" se a mesma contém uma inserção, deleção ou uma mutação pontual introduzida artificialmente, por exemplo, pela intervenção humana. Um "ácido nucléico isolado" também inclui um ácido nucléico integrado em um cromossoma de célula hospedeira em um sítio heterólogo e uma construção de ácido nucléico presente como um epissoma. Além disso, um "ácido nucléico isolado" pode ser substancialmente livre de outro material celular, ou substancialmente livre de meio de cultura quando produzido pelas técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.

Como aqui usada, a frase "variante degenerada" em referência à seqüência de ácido nucléico abrange seqüências de ácido nucléico que podem ser traduzidas, de acordo com o código genético, para fornecer uma seqüência de aminoácido idêntica àquela traduzida da seqüência de ácido nucléico de referência. O termo "oligonucleotídeo degenerado" ou "iniciador degenerado" é usado para significar um oligonucleotídeo capaz de hibridizar com as seqüências de ácido nucléico alvo que não são necessariamente idênticas na seqüência mas que são homólogas entre si dentro de um ou mais segmentos particulares.

O termo "identidade de seqüência percentual" ou "idêntica" no contexto de seqüências de ácido nucléico refere-se aos resíduos nas duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para a correspondência máxima. O comprimento da comparação da identidade de seqüência pode ser em um trecho de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos e preferivelmente pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, as seqüências de polinucleotídeo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas em Wisconsin Package Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA fornece alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências dúvidas e de pesquisa. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990) (aqui incorporada por referência em sua totalidade). Por exemplo, a identidade de seqüência percentual entre as seqüências de ácido nucléico podem ser determinadas usando FASTA com seus parâmetros de padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de contagem) ou usando Gap com seus parâmetros de padrão como fornecidos em GCG Versão 6.1, aqui incorporada por referência. Alternativamente, as seqüências podem ser comparadas usando o programa de computador BLAST (Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang e Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especialmente blastp ou tblastn (Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)).

O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial," quando da referência a um ácido nucléico ou fragmento deste, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriados com um outro ácido nucléico (ou seu filamento complementar), existe identidade de seqüência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 50 %, mais preferivelmente 60 % das bases de nucleotídeo, usualmente pelo menos cerca de 70 %, mais usualmente pelo menos cerca de 80 %, preferivelmente pelo menos cerca de 90 % e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases de nucleotídeo, como medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de seqüência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como debatido acima.

Alternativamente, a homologia substancial ou similaridade existe quando um ácido nucléico ou fragmento deste hibridiza a um outro ácido nucléico, a um filamento de um outro ácido nucléico, ou ao seu filamento complementar, sob condições de hibridização severa. "Condições de hibridização severa" e "condições de lavagem severa" no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucléico depende de vários parâmetros físicos diferentes. A hibridização de ácido nucléico será afetada por condições tais como a concentração salina, temperatura, solventes, a composição base da espécie hibridizadora, comprimento das regiões complementares e o número de desemparelhamentos de base de nucleotídeo entre os ácidos nucléicos hibridizadores, como será prontamente avaliado por aqueles habilitados na técnica. Uma pessoa tendo habilidade comum na técnica sabe como variar estes parâmetros para se obter uma severidade particular de hibridização.

No geral, a "hibridização severa" é realizada a cerca de 25°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para o híbrido de DNA específico sob um conjunto particular de condições. A "lavagem severa" é realizada em temperaturas de cerca de 5 0C mais baixas do que a Tm para o híbrido de DNA específico o híbrido de DNA específico sob um conjunto particular de condições. A Tm é a temperatura na qual 50 % da seqüência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente emparelhada. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1989), página 9.51, por meio deste incorporada porO referência. Para os propósitos aqui, "condições severas" são definidas para a hibridização em fase de solução como hibridização aquosa (isto é, isenta de formamida) em 6X SSC (onde 20X SSC contém 3,0 M de NaCl e 0,3 M de citrato de sódio), 1 % de SDS a 65 0C por 8 a 12 horas, seguido por duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 65 0C por 20 minutos, será avaliado pelo técnico habilitado que a hibridização a 65 0C ocorrerá em taxas diferentes dependendo de vários fatores incluindo o comprimento e a identidade percentual das seqüências que são hibridizadoras.

O termo "mutado" quando aplicado às seqüências de ácido nucléico significa que os nucleotídeos em uma seqüência de ácido nucléico podem ser inseridas, deletadas ou trocadas comparadas com uma seqüência de ácido nucléico de referência. Uma única alteração pode ser feita em um local (uma mutação pontual) ou nucleotídeos múltiplos podem ser inseridos, deletados ou trocados em um único local. Além disso, uma ou mais alterações podem ser feitas em qualquer número de locais dentro de uma seqüência de ácido nucléico. Uma seqüência de ácido nucléico pode ser mutada por qualquer método conhecido na técnica incluindo mas não limitado às técnicas de mutagênese tais como "PCR propensa a erro" (um processo para realizar a PCR sob condições onde a fidelidade de cópia da DNA polimerase é baixa, tal que uma alta taxa de mutações pontuais seja obtida ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR; ver, por exemplo, Leung et al., Technique, lill- 15(1989) e Caldwell e Joyce, PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)); e "oligonucleotide-directed mutagenesis" (um processo que possibilita a geração de mutações específicas de sitio em qualquer segmento de DNA clonado de interesse de interesse; ver, por exemplo, Reidhaar-Olson e Sauer, Science 241: 53-57(1988)).

O termo "vetor" como aqui usado é intencionado a referir-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual o mesmo foi ligado em uma célula hospedeira. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outros vetores incluem cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e cromossomas artificiais de levedura (YAC). Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral (debatido em mais detalhes abaixo). Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores tendo uma origem de replicação que funciona na célula hospedeira). Outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e são desse modo replicados juntos com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores preferidos são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são aqui aludidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão").

Como aqui usados, o termo "seqüência de interesse" ou "gene de interesse" referem-se a uma seqüência de ácido nucléico, tipicamente que codifica uma proteína de interesse ou um polipeptídeo de interesse, que não é normalmente expressado na célula hospedeira. Uma seqüência ou gene de interesse incluem genes e seqüências que são heterólogas à célula hospedeira. As proteínas e polipeptídeos de interesse também são freqüentemente heterológos à célula hospedeira. Os métodos aqui divulgados permitem que uma ou mais seqüências de interesse ou genes de interesse sejam estavelmente integradas em um genoma da célula hospedeira. Os exemplos não limitantes de seqüências de interesse incluem seqüências que codificam um ou mais polipeptídeos de interesse tendo uma atividade enzimática, por exemplo, uma enzima que afeta a síntese de N-glicano em um hospedeiro tal como manosiltransferases, N-acetilglicosaminiltransferases, transportadores da UDP-N-acetil-glicosamina, galactosiltransferases, UDP-N- acetilgalactosiltransferase, sialiltransferases e fucosiltransferases.

Os termos "seqüência marcadora" ou "gene marcador" referem-se a uma seqüência de ácido nucléico capaz de expressar uma atividade que permita a seleção positiva ou negativa quanto a presença ou ausência da seqüência dentro de uma célula hospedeira. Por exemplo, o gene URA5 de P. pastoris é um gene marcador porque a sua presença pode ser selecionada pela capacidade das células que contenham o gene para crescer na ausência de uracila. A sua presença também pode ser selecionada pela incapacidade de células contendo o gene para crescer na presença de 5-FOA. As seqüências marcadoras ou genes não precisam necessariamente demonstrar seletividade tanto positiva quanto negativa. Os exemplos não limitantes de seqüências ou genes marcadores de P. pastoris incluem ADE1, ARG4, HIS4 e URA3. Para genes marcadores da resistência a antibiótico, os genes de resistência à canamicina, neomicina, geneticina (ou G418), paromomicina e higromicina são habitualmente usados para permitir o crescimento na presença destes antibióticos.

Seqüências de controle de expressão "operativamente ligadas" referem-se a uma ligação em que a seqüência de controle de expressão é contígua com o gene de interesse para controlar o gene de interesse, assim como as seqüências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

O termo "seqüência de controle de expressão" como aqui usado refere-se às seqüências de polinucleotídeo que influenciam a expressão de seqüências codificadoras às quais os mesmos estão operativamente ligados.

As seqüências de controle de expressão são seqüências que controlam a transcrição, eventos pós transcricionais e tradução de seqüências de ácido nucléico. As seqüências de controle de expressão incluem o início, término, seqüências promotoras e realçadoras de transcrição apropriados; sinais de processamento de RNA eficiente tais como os sinais de junção e poliadenilação; as seqüências que estabilizam o mRNA citoplásmico; as seqüências que realçam a eficiência de tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossoma); seqüências que realçam a estabilidade da proteína; e quando desejado, seqüências que realçam a secreção de proteína. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais seqüências de controle no geral incluem promotor, sítio de ligação de ribossômica e seqüência de terminação de transcrição. O termo "seqüências de controle" é intencionado a incluir, em um mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e também podem incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüências parceiras de fusão.

Os termos "célula hospedeira recombinante" ("célula hospedeira de expressão", "sistema hospedeiro de expressão", "sistema de expressão" ou simplesmente "célula hospedeira"), como aqui usados, são intencionados a se referirem a uma célula na qual um vetor recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são intencionados a se referirem não apenas à célula objeto particular mas à progênie de uma tal célula. Porque certas modificações possam ocorrer nas gerações que se sucedem devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas ainda são incluídas dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como aqui usado. Uma célula hospedeira recombinante pode ser uma célula isolada ou linhagem de célula cultivadas em cultura ou pode ser uma célula que reside em um tecido ou organismo vivos. As células hospedeiras são leveduras e fungos.

O termo "eucariótico" refere-se a uma célula ou organismo nucleados e inclui células de inseto, células vegetais, células de mamífero, células animais e células eucarióticas inferiores.

O termo "células eucarióticas inferiores" inclui levedura, fungos, flagelados de colar, microsporídia, alveolados (por exemplo, dinoflagelados), stramenopiles (por exemplo, algas marrom, protozoários), rhodophyta (por exemplo, algas vermelhas), plantas (por exemplo, algas verdes, células vegetais, musgo) e outros protistas.

Os termos "levedura" e "fungos" incluem, mas não são limitados a: Pichia sp., Pichia pastoris, Pichia finlandiea, Piehia trehalophila, Piehia koelamae, Piehia membranaefaeiens, Piehia minuta (Ogataea minuta, Piehia lindnerz), Piehia opuntiae, Piehia thermotolerans, Piehia salictaria, Piehia guercuum, Piehia pijperi, Piehia stiptis, Piehia methanolica, Saccharomyees sp., Saccharomyees eerevisiae, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albieans, Aspergillus sp., Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Triehoderma reesei, Chrysosporium lueknowense, Fusarium sp., Fusarium graminaum, Fusarium venenaturn, Physcomitrella patens e Neurospora crassa.

O termo "peptídeo" como aqui usado refere-se a um polipeptídeo curto, por exemplo, um que é tipicamente menor do que cerca de 50 aminoácidos de comprimento e mais tipicamente menores do que cerca de 30 aminoácidos de comprimento. Uma pessoa de habilidade na técnica pode fabricar derivados, mutantes, análogos e miméticos que imitam a função estrutural e assim a biológica.

O termo "polipeptídeo" abrange proteínas que ocorrem tanto naturalmente quanto não naturalmente e fragmentos destas. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico. Além disso, um polipeptídeo popde compreender vários domínios diferentes cada um dos quais tem uma ou mais atividades distintas. Uma pessoa de habilidade na técnica pode fabricar ou isolar mutantes, derivados e análogos de polipeptídeos.

Os termos proteína ou polipeptídeo "purificados" ou "isolados" referem-se a uma proteína ou polipeptídeo que em virtude da sua origem ou fonte de derivação (1) não estão associadas naturalmente com componentes que os acompanham no seu estado nativo, (2) existem em uma pureza não encontrada na natureza, onde a pureza pode ser julgada com respeito à presença de outros materiais celulares (por exemplo, está livre de outras proteínas da mesma espécie) (3) são expressados por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorrem na natureza (por exemplo, os mesmos são um fragmento de um polipeptídeo encontrado na natureza ou os mesmos incluem análogos de aminoácido ou derivados não encontrados na natureza ou ligações outras que não as ligações de peptídeo padrão). Assim, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula a partir da qual o mesmo naturalmente se origina será "isolado" dos seus componentes naturalmente associados. Um polipeptídeo ou proteína também podem ser tornadas substancialmente livres ou purificadas de componentes naturalmente associados pela isolação, usando as técnicas de purificação de proteína bem conhecidas no ramo. Como assim definido, "isolado" não requer necessariamente que a proteína, polipeptídeo, peptídeo ou oligopeptídeo assim descritos tenham sido fisicamente removidos do seu ambiente nativo.

O termo "fragmento de polipeptídeo" como aqui usado refere- se a um polipeptídeo que tem uma deleção, por exemplo, uma deleção de terminal amino e/ou terminal carbóxi comparada com um polipeptídeo de tamanho natural. Em uma forma de realização preferida, o fragmento de polipeptídeo é uma seqüência contígua em que a seqüência de aminoácido do fragmento é idêntica às posições correspondentes na seqüência que ocorre naturalmente. Os fragmentos tipicamente têm pelo menos 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 12, 14, 16 ou 18 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 25, 30, 35, 40 ou 45, aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos 50 ou 60 aminoácidos de comprimento e ainda mais preferivelmente pelo menos 70 aminoácidos de comprimento.

Um "derivado modificado" refere-se a polipeptídeos ou fragmentos destes que são substancialmente homólogos em seqüência estrutural primária mas que incluem, por exemplo, modificações químicas e bioquímicas in vivo ou in vitro ou que incorporam aminoácidos que não são encontrados no polipeptídeo nativo. Tais modificações incluem, por exemplo, acetilação, carboxilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitinação, rotulação, por exemplo, com radionuclídeos e várias modificações enzimáticas, como será facilmente avaliado por aqueles habilitados na técnica. Uma variedade de métodos para a rotulação de polipeptídeos e de substituintes ou rótulos úteis para tais propósitos são bem conhecidos na técnica e incluem isótopos radioativos tais como I, S, Ρ, Se Η, ligandos que se ligam aos anti- ligandos rotulados (por exemplo, anticorpos), fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas e anti-ligandos que podem servir como membros de par de ligação específicos para um ligando rotulado. A escolha do rótulo depende da sensibilidade requerida, facilidade de conjugação com o iniciador, exigências de estabilidade e instrumentação disponível. Os métodos para rotular polipeptídeos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 e Suplementos para 2002) (aqui incorporados por referência). O termo "proteína de fusão" refere-se a um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo ou fragmento ligado às seqüências de aminoácido heterólogas. As proteínas de fusão são úteis porque elas podem ser construídas para conter dois ou mais elementos funcionais desejados de duas ou mais proteínas diferentes. Uma proteína de fusão compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo, preferivelmente pelo menos 20 ou 30 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 40, 50 ou 60 aminoácidos e freqüentemente mais preferivelmente pelo menos 75, 100 ou 125 aminoácidos. As fusões que incluem a totalidade das proteínas de interesse têm utilidade particular. O polipeptídeo heterológo incluído dentro da proteína de fusão tem pelo menos 6 aminoácidos no comprimento, freqüentemente pelo menos 8 aminoácidos no comprimento e utilmente pelo menos 15, 20 e 25 aminoácidos no comprimento. As fusões também incluem polipeptídeos maiores, ou ainda proteínas inteiras, tais como a proteína fluorescente verde ("GFP") proteínas contendo cromóforo tendo utilidade particular. As proteínas de fusão podem ser produzidas recombinantemente construindo-se uma seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou um fragmento deste na matriz com uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ou peptídeo diferentes e depois expressando a proteína de fusão. Alternativamente, uma proteína de fusão pode ser produzida quimicamente pela reticulação do polipeptídeo ou um fragmento deste a uma outra proteína.

O termo "análogo não peptídico" refere-se a um composto com propriedades que são análogas àquelas de um polipeptídeo de referência. Um composto não peptídico também pode ser chamado de um "mimético de peptídeo" ou um "peptidomimético". Ver, por exemplo, Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (1992); Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley (1997); Bodanszky et al., Peptide Chemistry--A Practical Textbook, Springer Verlag (1993); Synthetic Peptides: A Users Guide, (Grant, ed., W. H. Freeman e Co., 1992); Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber e Freidinger, Trends Neurosci., 8: 392-396 (1985); e referências localizadas em cada uma das acima, que são aqui incorporadas por referência. Tais compostos são freqüentemente desenvolvidos com a ajuda da modelagem molecular computadorizada. Os miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares aos peptídeos úteis da invenção podem ser usados para produzir um efeito equivalente e são portanto consideradas como sendo parte da invenção.

As substituições de aminoácido podem incluir aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram a afinidade de ligação ou atividade enzimática e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-química ou funcional de tais análogos.

Como aqui usados, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (Golub e Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2a ed. 1991), que é aqui incorporada por referência. Os estereoisômeros (por exemplo, D- aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos α,α-dissubstituídos, N-alquil aminoácidos e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipeptídeos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν- trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina e outros aminoácidos similares e imino ácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação de polipeptídeo aqui usada, a extremidade à esquerda corresponde à extremidade do terminal amino e a extremidade à direita corresponde à extremidade do terminal carbóxi, de acordo com o uso e convenção padrão.

Uma proteína tem "homologia" ou é "homóloga" a uma segunda proteína se a seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína tem uma seqüência similar à seqüência de ácido nucléico que codifica a segunda proteína. Alternativamente, uma proteína tem homologia a uma segunda proteína se as duas proteínas têm seqüências de aminoácido "similares". (Assim, o termo "proteínas homólogas" é definido para significar que as duas proteínas têm seqüências de aminoácido similares). Em uma forma de realização preferida, uma proteína homóloga é uma que exibe pelo menos 65 % de homologia de seqüência com a proteína do tipo selvagem, mais preferido é pelo menos 70 % de homologia de seqüência. Ainda mais preferido são proteínas homólogas que exibem pelo menos 75 %, 80 %, 85 % ou 90 % de homologia de seqüência com a proteína do tipo selvagem. Na forma de realização mais preferida, uma proteína homóloga exibe pelo menos 95 %, 98 %, 99 % ou 99,9 % de identidade de seqüência. Como aqui usado, homologia entre duas regiões de seqüência de aminoácido (especialmente com respeito às similaridades estruturais prognosticadas) é interpretada como implicando similaridade na função.

Quando "homólogo" é usado em referência às proteínas ou peptídeos, é reconhecido que as posições de resíduo que não são idênticas freqüentemente diferem pelas substituições de aminoácido conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). No geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais seqüências de aminoácido diferem uma da outra pelas substituições conservativas, a identidade de seqüência percentual ou grau de homologia podem ser ajustados para cima para corrigir quanto a natureza conservativa da substituição. Meios para mascarar este ajuste são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Ver, por exemplo, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 e 25: 365-89 (aqui incorporadas por referência).

Os seguintes seis grupos cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Acido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V) e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

A homologia de seqüência para polipeptídeos, que é também aludida como identidade de seqüência percentual, é tipicamente medida usando o software de análise de seqüência. Ver, por exemplo, o Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. O software de análise de proteína emparelha seqüências similares usando uma medida de homologia designada a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo as substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, GCG contém programas tais como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros de padrão para determinar a homologia de seqüência ou identidade de seqüência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1.

Um algoritmo preferido quando da comparação de uma seqüência de polipeptídeo particular a uma base de dados contendo um grande número de seqüências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish e States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131- 141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang e Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especialmente blastp ou tblastn (Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)). Os parâmetros preferidos para BLASTp são: Valor de expectativa: 10 (padrão); Filtro: seg (padrão); Custo para abrir um intervalo: 11 (padrão); Custo para prolongar um intervalo: 1 (padrão); Alinhamentos Max.: 100 (padrão); Tamanho da palavra: 11 (padrão); N- de descrições: 100 (padrão); Matriz de Penalidade: BLOWSUM62.

O comprimento das seqüências de polipeptídeo comparadas quanto a homologia no geral será de pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácido, usualmente de pelo menos cerca de 20 resíduos, mais usualmente de pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente de pelo menos cerca de 28 resíduos e preferivelmente mais do que cerca de 35 resíduos. Quando da pesquisa de uma base de dados contendo seqüências de um grande número de organismos diferentes, é preferível comparar seqüências de aminoácido. A pesquisa de base de dados usando seqüências de aminoácido pode ser medida pelos algoritmos outros que não blastp conhecidos na técnica. Por exemplo, as seqüências de polipeptídeo podem ser comparadas usando FASTA, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA fornece alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências dúvida e de pesquisa. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990) (aqui incorporada por referência). Por exemplo, a identidade de seqüência percentual entre as seqüências de aminoácido pode ser determinada usando FASTA com seus parâmetros de padrão (um tamanho de palavra de 2 e a matriz de contagem PAM250), como fornecido no GCG Versão 6.1, aqui incorporada por referência.

O termo "região" como aqui usado refere-se a uma porção fisicamente contígua da estrutura primária de uma biomolécula. No caso de proteínas, uma região é definida por uma porção contígua da seqüência de aminoácido daquela proteína.

O termo "domínio" como aqui usado refere-se a uma estrutura de uma biomolécula que contribui para uma função conhecida ou suspeita da biomolécula. Os domínios podem ser co-extensivos com regiões ou porções destas; os domínios também podem incluir regiões distintas, não contíguas de uma biomolécula.

Como aqui usado, o termo "molécula" significa qualquer composto, incluindo, mas não limitado a, uma molécula pequena, peptídeo, proteína, açúcar, nucleotídeo, ácido nucléico, lipídeo, etc. e um tal composto pode ser natural ou sintético.

Como aqui usado, o termo "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo , será entendido implicar a inclusão de um inteiro estabelecido ou grupo de inteiros mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

Quando da referência a "por cento em mol" de um glicano presente em uma preparação de uma glicoproteína, o termo significa a porcentagem molar de um glicano particular presente na reunião de oligossacarídeos ligados em N liberados quando a preparação de proteína é tratada com PNG'ase e depois quantificada por um método que não é afetado pela composição da glicoforma, (por exemplo, a rotulação de uma reunião de glicano liberado pela PNG'ase com um rótulo fluorescente tal como 2- aminobenzamida e depois separando pela cromatografia líquida de alto desempenho ou eletroforese capilar e depois quantificando os glicanos pela intensidade de fluorescência). Por exemplo, 50 por cento em mol de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2 significa que 50 por cento dos glicanos liberados são GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2 e os 50 por cento remanescentes são compreendidos de outros oligossacarídeos ligados em N. Em formas de realização, a porcentagem em mol de um glicano particular em uma preparação de glicoproteína estará entre 20 % e 100 %, preferivelmente acima de 25 %, 30 %, 35 %, 40 % ou 45 %, mais preferivelmente acima de 50 %, 55 %, 60 %, 65 % ou 70 % e o mais preferivelmente acima de 75 %, 80 % 85 %, 90 % ou 95 %. Como aqui usado, o termo "predominantemente" ou variações tais como "o predominante" ou "que é predominante" será entendido significar a espécie de glicano que tem a porcentagem em mol mais alta (%) de N-glicanos totais depois que a glicoproteína foi tratada com PNGase e os glicanos liberados analisados pela espectroscopia de massa, por exemplo, MALDI-TOF MS. Em outras palavras, a frase "predominantemente" é definida como uma entidade individual, tal como uma glicoforma específica, está presente em maior porcentagem em mol do que qualquer outra entidade individual. Por exemplo, se uma composição consiste da espécie A em 40 por cento em mol, a espécie B em 35 por cento em mol e a espécie C em 25 por cento em mol, a composição compreende predominantemente a espécie A.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade da eritropoietina recombinante da invenção que dá um aumento no hematócrito que fornece benefício a um paciente. A quantidade variará de um indivíduo para outro e dependerá de vários fatores, incluindo a condição física global do paciente e a causa subjacente de anemia. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de eritropoietina da presente invenção para um paciente que sofre de insuficiência renal crônica pode estar na faixa de 20 a 300 unidades/ kg ou 0,5 μg/kg a 500 μg/kg com base na indicação terapêutica. O termo "unidade" refere-se às unidades habitualmente conhecidas na técnica para avaliar a atividade de composições de eritropoietina. Um miligrama de eritropoietina pura é aproximadamente equivalente a 150.000 unidades. Um programa de dosagem pode ser de cerca de três vezes por semana a cerca de uma vez a cada quatro ou seis semanas. O programa real dependerá de vários fatores incluindo o tipo de eritropoietina administrada a um paciente (EPO ou EPO PEGuilada) e a resposta do paciente individual. As faixas de dose mais altas não são tipicamente usadas em aplicações de anemia mas podem ser úteis em outras aplicações terapêuticas. Os meios de se obter e estabelecer uma dose apropriada de eritropoietina para um paciente são bem conhecidos e habitualmente praticados na técnica.

Variações na quantidade dada e no programa de dosagem de paciente para paciente são incluídas por referência ao termo "cerca de" em conjunção com uma quantidade ou programa. A quantidade de eritropoietina usada para a terapia dá uma taxa aceitável de aumento de hematócrito e mantém o hematócrito a um nível benéfico (por exemplo, usualmente pelo menos cerca de 30 % e tipicamente em uma faixa de 30 % a 36 %). Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente averiguada por uma pessoa habilitada na técnica usando materiais e procedimentos publicamente disponíveis. Adicionalmente, ferro pode ser dado ao paciente para manter a eritropoiese aumentada durante a terapia. A quantidade a ser dada pode ser facilmente determinada pelos métodos habitualmente usados por aqueles habilitados na técnica.

A eritropoietina da presente invenção pode ser assim usada para estimular a produção de célula sangüínea vermelha e corrigir os níveis de célula vermelha deprimidos. A aplicação terapêutica mais comum de eritropoietina é corrigir os níveis de célula vermelha que são diminuídos devido à anemia. Entre as condições tratáveis pela presente invenção incluem a anemia associada com um declínio ou perda da função renal (insuficiência renal crônica), anemia associada com a terapia mielossupressiva, tais como os medicamentos quimioterapêuticos ou anti-virais (tais como AZT), anemia associada com a progressão de cânceres não mielóides e anemia associada com as infecções virais (tais como HIV). Adicionalmente, a eritropoietina da presente invenção pode ser usada para prevenir ou diminuir o dano neuronal a seguir do acidente vascular cerebral (particularmente uma epo não sialilada), insuficiência cardíaca congestiva, no tratamento de lesão espinhal; isto é, anti- inflamatória, anti-apoptose e o recrutamento de células tronco à parte da eritropoiese. Também tratáveis são condições que possam levar à anemia em um indivíduo de outro modo saudável, tal como uma perda prevista de sangue durante cirurgia. No geral, qualquer condição tratável com eritropoietinas no geral pode ser tratada com as eritropoietinas da presente invenção.

I. GLICOSILAÇÃO

A invenção fornece métodos e materiais para a transformação, expressão e seleção de proteínas recombinantes, particularmente eritropoietina, em células hospedeiras eucarióticas inferiores, que foram geneticamente engendradas para produzir glicoproteínas com N-glicanos desejados específicos como a espécie predominante. Em certas formas de realização, as células hospedeiras eucarióticas foram geneticamente engendradas para produzir eritropoietina, ou uma variante de eritropoietina, com um N-glicano desejado específico como a espécie predominante. Em formas de realização preferidas, o N-glicano predominante é um que não é imunogênico aos mamíferos, particularmente seres humanos, ou que tem imunogenicidade reduzida comparada com aquela de glicoproteínas hipermanosiladas. Os padrões de glicosilaçãos exemplares são mostrados nas Figuras 9A-9B.

Em uma forma de realização preferida específica, o N-glicano predominante é um glicano totalmente sialilado, representado como: GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2. Em outras formas de realização preferidas, o N-glicano predominante pode ser glicano parcialmente sialilado ou assialilado; totalmente galactosilado; parcialmente galactosilado; ou agalactosilado. Assim, as formas de realização preferidas incluem aquelas em que o N-glicano predominante é GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA; GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal-NANA; GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2; GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal; Glc-

NAc2Man3GlcNAcGal; GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAcr ou GlcNAc2Man3. Em outras formas de realização preferidas, o N-glicano predominante é um glicano parcialmente galactosilado, representado como GlcNAc2Man3GlcNAc2Galn, onde η pode ser 1 ou 2.

Em outras formas de realização da presente invenção, o N- glicano predominante pode ser uma glieoforma híbrida, representada pela fórmula: GlcNAc2Man(4.5)GlcNAc(0-i)Gal(0.i)NANA(0-i). As formas de realização preferidas incluem aquelas em que o N-glicano predominante é GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA, GlcNAc2Man5Glc-NAcGal; e GlcNAc2Man5GlcNAc e GleNAe2Man5.

Muitas células eucarióticas inferiores do tipo selvagem, incluindo leveduras e fungos, tais como Pichia pastoris, produzem glicoproteínas sem nenhum núcleo de fucose. Assim, nas formas de realização acima, as glicoproteínas recombinantes produzidas de acordo com a presente invenção podem carecer de fucose, ou serem essencialmente livres de fucose. Alternativamente, em certas formas de realização, as células hospedeiras eucarióticas inferiores recombinantes podem ser geneticamente modificadas para incluir um caminho da fucosilação, resultando assim na produção de composições de glicoproteína recombinante em que a espécie de N-glicano predominante é fucosilada. A menos que especificamente mencionado, as composições da glicoproteína da presente invenção podem ser produzidas na forma afucosilada, ou com fucosilação de núcleo presente.

Na presente invenção, a glicoproteína recombinante produzida de acordo com a descrição acima é depois quimicamente modificada para melhorar as suas características físicas, notavelmente a meia-vida sérica e farmacocinéticas. Em formas de realização preferidas, a modificação química é realizada pela ligação de uma ou mais porções de polietileno glicol (PEG) à dita glicoproteína recombinante, resultando em uma glicoproteína PEGuilada. Em certas formas de realização preferidas, a glicoproteína recombinante é modificada pela liigação de uma ou mais porções de PEG ao aminoácido de terminal N da glicoproteína recombinante, resultando em uma glicoproteína PEGuilada de terminal N. II. ERITROPOIETINA

A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína hemopoiética produzida nos rins que estimula a diferenciação de células progenitoras de eritróide tardio para maturar células sangüíneas vermelhas. A eritropoietina exerce a sua atividade biológica ligando-se aos receptores nos precursores eritróides. O gene da eritropoietina não é particular aos seres humanos. Genes análogos foram encontrados em outras espécies, incluindo muitos mamíferos (Ver Wen et al., Blood (1993); 82: 1507-16). Portanto, tanto os genes humanos quanto os não humanos podem ser expressados como aqui descrito e a variedade de eritropoietinas também pode ser útil nos métodos da presente invenção.

A eritropoietina humana que ocorre naturalmente é primeiro traduzida a uma cadeia de polipeptídeo contendo 166 aminoácidos com arginina na posição 166. Em uma modificação pós traducional, a arginina 166 é clivada por uma carboxipeptidase. A estrutura primária da eritropoietina humana de 165 aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 2 e um ácido nucléico desta EPO é mostrada na SEQ ID NO: 1. A estrutura secundária da eritropoietina inclui duas pontes de dissulfeto entre Cys7-Cysl61 e Cys29- Cys33. A EPO totalmente glicosilada compreende aproximadamente 40 % de grupos de carboidrato por peso molecular (Sasaki, H., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076). O peso molecular da cadeia de polipeptídeo da eritropoietina humana sem as porções de glicano é de 18.236 Da.

Porque a eritropoietina é essencial na formação da célula sangüínea vermelha, a mesma é útil no tratamento de distúrbios sangüíneos caracterizados pela produção de célula sangüínea vermelha baixa ou defeituosa. Clinicamente, a eritropoietina é usada no tratamento de várias doenças, por exemplo, anemia em pacientes com insuficiência renal crônica (CRF) e em pacientes com AIDS e câncer que passam pela quimioterapia (Danna, R. P., et al., Em: M B, Garrick, ed. Erythropoietin in Clinicai Applications--An Internation Perspective. Nova York, N. Y.: Mareei Dekker; 1990, pp. 301-324). Entretanto, a biodisponibilidade das proteínas terapêuticas correntemente disponíveis tais como a eritropoietina é limitada pela sua meia-vida plasmática curta e susceptibilidade à degradação pela protease. Estas deficiências as impedem de atingir a potência clínica máxima. As modificações da seqüência de aminoácido de EPO foram divulgadas, por exemplo, em várias referências incluindo a Pat. U.S. N2 4.835.260; WO 94/25055; WO 94/24160; WO 94/02611; WO 95/05465.

A eritropoietina foi biossinteticamente fabricada usando a tecnologia de DNA recombinante (Egrie, J. C., et al., Immunobiol. 72 (1986) 213-224). A eritropoietina correntemente usada na terapia humana é o produto de um gene EPO humano clonado inserido em e expressado nas células de tecido ovariano do hamster chinês (células CHO). Tanto a eritropoietina derivada do trato urinário humano quanto a eritropoietina recombinante (expressada em células de mamífero) contêm três cadeias de oligossacarídeo ligadas em N e uma ligada em O que juntas compreendem cerca de 40 % do peso molecular total da glicoproteína. A glicosilação ligada em N ocorre nos resíduos de asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83 enquanto que a glicosilação ligada em O ocorre em um resíduo de serina localizado na posição 126 (Lai, et ai, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116; Broudy, V. C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 265 (1988) 329). As cadeias de oligossacarídeo foram mostradas serem modificadas com resíduos de ácido siálico terminais. O tratamento enzimático de eritropoietina glicosilada para remover todos os resíduos de ácido siálico resulta em uma perda de atividade in vivo mas não afetam a atividade in vítro (Lowy et al., Nature 185 (1960) 102; Goldwasser, E., et al. J. Biol. Chem. 249 (1974) 4202-4206). Este comportamento foi explicado pela depuração rápida de asialoeritropoietina da circulação na interação com a proteína de ligação da asialoglicoproteína hepática (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243 (1968) 155; Briggs, D. W., et al., Am. J. Physiol. 227 (1974) 1385-1388; Ashwell, G. e Kawasaki, T., Methods Enzymol. 50 (1978) 287-288). Assim, a eritropoietina possui atividade biológica in vivo apenas quando a mesma é sialilada para evitar a sua ligação pela proteína de ligação de asialoglicoproteína.

O papel dos outros componentes nas cadeias de oligossacarídeo de eritropoietina não foram bem definidas. Foi mostrado que a eritropoietina parcialmente diglicosilada reduziu enormemente a atividade in vivo comparada com a forma glicosilada mas retém a atividade in vitro (Dordal, M. S., et al., Endocrinology 116 (1985) 2293-2299). Em um outro estudo, entretanto, a remoção de cadeias de oligossacarídeo ligadas em N ou ligadas em O isoladamente ou junto com a mutagênese de resíduos de asparagina ou serina que são sítios de glicosilação acentuadamente reduz a atividade biológica da eritropoietina alterada que é produzida em células de mamífero (Dube, S., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17516-17521).

A mutagênese direcionada a oligonucleotídeo foi usada para preparar mutantes estruturais de sítios específicos que carecem de EPO para a glicosilação (Yamaguchi, K., et al, J. Biol. Chem. 266 (1991) 20434-20439; e Higuchi, M., et al, J. Biol. Chem. 267 (1992) 7703-7709). A clonagem e expressão de EPO não glicosilada na E. coli são descritas por Lee-Huang, S., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 61 (1984) 2708-2712; e na Pat. U.S. Ne 5.641.663.

A EP 0 640 619 diz respeito a análogos de eritropoietina humana que compreendem uma seqüência de aminoácido que inclui pelo menos um sítio adicional para a glicosilação. Os sítios adicionados para a glicosilação podem resultar em um número maior de cadeias de carboidraato e teor de ácido siálico mais alto, do que a eritropoietina humana. Os análogos de eritropoietina que compreendem seqüências de aminoácido que incluem o rearranjo de pelo menos um sítio para a glicosilação também são fornecidos. Os análogos que compreendem uma adição de um ou mais aminoácidos à extremidade de terminal carbóxi da eritropoietina em que a adição fornece pelo menos um sítio de glicosilação também são incluídos.

Comparada com a eritropoietina produzida em células CHO, a eritropoietina produzida em Pichia com glicosilação humanizada é muito mais uniforme nas estruturas de oligossacarídeo ligadas que compreendem N- e O-glicosilação. A rhEPO derivada de CHO é produzida com uma mistura de glicoformas, incluindo as formas bi-, tri- e tetra-antenárias com quantidades variáveis de sialilação. O desenvolvimento do processo é usado para enriquecer quanto as glicoformas sialiladas tetra-antenárias que compreendem uma porção pequena do pré-enriquecimento de N-glicanos (Restelli et al, 2006 Biotechnology and Bioengineering 94 (3) p. 481-494). Adicionalmente, enquanto a sialilação em levedura humanizada não inclui o ácido N- glicolilneuramínico (NGNA), a eritropoietina sialilada produzida em células CHO contém uma mistura de NANA (ácido N-acetilneuramínico) e NGNA.

As eritropoietinas produzidas em linhagens de célula de mamífero, tais como as células do ovário do hamster chinês (CHO) são enriquecidas para carboidratos que contém glicanos sialilados ligados em N. O enriquecimento para glicoformas tetra-antenárias aumenta a proporção de repetições de lactosamina nos N-glicanos da eritropoietina. As moléculas de eritropoietina contendo estas repetições podem possuir eficácia in vivo prejudicada visto que a presença de repetições polilactosamina foi correlacionada com a depuração rápida da circulação por intermédio do fígado (Fukuta et al., (1989) Blood, Vol. 73, 84).

As porções de lactosamina também foram relatadas ligarem-se à família de galectina de lectinas, proteínas de ligação de carboidrato diferencialmente expressadas na superfície celular de tipos de célula e tecido diferentes. Especificamente, galectina-3 especificamente reconhece lactosamina. Galectina-3 foi descoberto ser supra expressada na superfície celular de muitos tipos de célula de tumor diferentes e foi implicada no crescimento, transformação e metástase de célula (Deininger et al., (2002) Anticancer Research, Vol. 22, 1585).

Assim, as glicoproteínas que contêm repetições de lactosamina podem ser potencialmente alvejadas às células que expressam galectina-3 na superfície celular. Além disso, isto apresenta um outro risco potencial que as glicoproteínas contendo lactosamina podem seletivamente alvejar células de tumor que podem coincidentemente carregar o receptor cognato para a glicoproteína. No caso de eritropoietinas, a fração de eritropoietina que contém lactosamina pode preferencialmente alvejar células de tumor e, se o receptor da eritropoietina está presente, um sinal mitogênico aberrante pode surgir que conduz o crescimento da célula de tumor com potencial metastático.

As eritropoietinas produzidas em Pichia pastoris carecem das glicoformas indesejadas tais como repetições de lactosamina. Isto provavelmente aliviaria problemas com respeito ao potencial tumorigênico da EPO e outras glicoproteínas.

Outras diferenças incluem uma falta completa de fucose e polilactosamina de núcleo ligadas na eritropoietina produzida por Pichia, tanto presentes na versão de célula CHO, quanto variações na composição de O-glicano, com uma mistura heterogênea de estruturas O-GalNAc na eritropoietina produzida em CHO comparada com a O-manose que pode ser encontrada na eritropoietina produzida por Pichia. A kigação do ácido siálico é primariamente a2,3 na eritropoietina produzida em CHO, com alguma a2,6 presente, enquanto que a eritropoietina produzida em Pichia contém exclusivamente a2,6 (Hamilton, Science Vol 313, p. 1441-1443), similar à eritropoietina urinária humana que contém predominantemente ácido siálico ligado em a2,6.

A eritropoietina (EPO) é uma citocina protetora de tecido que foi mostrada impedir espasmo vascular, apoptose e respostas inflamatórias. Embora melhor conhecida quanto a sua atividade na hematopoiese, a EPO também afeta outros tecidos, incluindo o sistema nervoso. Os modelos de animal têm demonstrado que doses únicas de rhEPO são eficazes para o tratamento de lesão aguda (4-6, 19). Por exemplo, a infusão de EPO no ventrículo lateral de gerbos submetidos à oclusão das artérias carótidas comuns impediu a incapacidade de aprendizado induzida pela isquemia e livrou os neurônios hipocâmpicos da degeneração (Bernaudin et al. (1999) J Cereb Blood Flow Metab 19, 643).

Estudos in vivo têm demonstrado os efeitos protetivos de EPO em várias formas de dano neuronal (Brines et al. (2000), PNAS, 97, 10526; Celik et al. (2002), PNAS, 99, 2258; Junk et al. (2002), PNAS, 99, 10659). Entretanto, muitas situações clínicas provavelmente requererão doses múltiplas de rhEPO, que mais provavelmente levará a aumentos potencialmente nocivos em hematócritos restringindo assim o entusiasmo quanto a eritropoietina humana recombinante (rhEPO) como um produto terapêutico neuroprotetor potencial. Isto é sustentado pelos modelos de animal que claramente mostram que aumentos dependentes de EPO em hematócrito pode causar e amplificar a lesão cerebral. Uma solução potencial para este paradoxo pode ser através do uso de EPO com glicosilação bi-antenária que tem um efeito mínimo sobre o hematócrito em modelos de animal (Hamilton et al (2006) Science 313, 1441). Assim doses altas múltiplas de EPO com glicosilação biantenária para o tratamento de inflamação pode ter pouco efeito sobre o hematócrito global.

Uma outra glicoforma interessante que pode ser usada para o tratamento de inflamação é uma EPO sem sialilação terminal. Isto também pode servir como um tratamento eficaz como um agente anti-inflamatório sem aumentar significantemente o hematócrito. A vantagem adicionada para esta molécula seria a sua afinidade reduzida para o receptor de asialo-glicoproteína no fígado em relação aos substratos preferidos do seu receptor que são as glicoformas terminalmente galactosiladas tri- e tetra-antenárias. Portanto as vantagens de um EPO com glicosilação asialilada biantenária são depuração hepática reduzida, pouco efeito sobre hematócrito e distribuição de tecido neuronal preferida. Asialo-EPO pode ser fabricado de acordo com esta invenção pela expressão de EPO em células de levedura que carecem a porção de sialiação do caminho da glicosilação aqui mostrada.

III. ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICA A GLICOPROTEÍNA

As eritropoietinas da presente invenção são codificadas pelos ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos podem ser DNA ou RNA, tipicamente DNA. O ácido nucléico que codifica a glicoproteína é operavelmente ligados às seqüências reguladoras que permitem a expressão da glicoproteína. Tais seqüências regulatórias incluem um promotor e opcionalmente um realçador a montante, ou 5', em relação ao ácido nucléico que codifica a proteína de fusão e um sítio de terminação de transcrição 3' ou a jusante do ácido nucléico que codifica a glicoproteína. O ácido nucléico também tipicamente codifica uma região 5' UTR tendo um sítio de ligação de ribossoma e uma região 3' não traduzida. O ácido nucléico é freqüentemente um componente de um vetor que transfere ao ácido nucléico em células hospedeiras em que a glicoproteína é expressada. O vetor também pode conter um marcador para permitir o reconhecimento de células transformadas. Entretanto, alguns tipos de célula hospedeira, particularmente levedura, podem ser transformadas com êxito com um ácido nucléico que carece de seqüências de vetor extranhas.

Os ácidos nucléicos que codificam a eritropoietina desejada da presente invenção podem ser obtidos de várias fontes. As seqüências de cDNA podem ser amplificadas a partir de linhagens de célula conhecidas por expressar a glicoproteína usando iniciadores para as regiões conservadas (ver, por exemplo, Marks et al., J. Mol. Biol. 581-596 (1991)). Os ácidos nucléicos também podem ser sintetizados de novo com base nas seqüências na literatura científica. Os ácido nucléicos também podem ser sintetizados pela extensão de oligonucleotídeos de sobreposição que transpõem uma seqüência desejada de um ácido nucléico maior, por exemplo, DNA genômico (ver, por exemplo, Caldas et ai, Protein Engineering, 13, 353-360 (2000)).

A presente invenção preferivelmente utiliza um ácido nucléico que codifica uma eritropoietina de mamífero e mais preferivelmente utiliza um ácido nucléico que codifica uma eritropoietina humana. A eritropoietina humana é bem conhecida na técnica como uma proteína de 165 ou 166 aminoácidos.

As seguintes seqüências de nucleotídeo e aminoácido são seqüências exemplares preferidas que podem ser utilizadas na presente invenção.

Seqüência de nucleotídeo de EPO [SEQ ID NO: 1]

ATGAGATTTC CTTCAATrTT TACTGCTGTT TTATTCGCAG CATCCTCCGC ATT AGCTGCT CCACC AAGAT TGATTTGTGA CTCCAGAGTT TTGGAGAGAT ACTTGTTGGA GGCTAAAGAG GCTGAGAACA TCACTACTGG TTGTGCTGAA CACTGTTCCT TGAACGAGAA CATCACAGTT CCAGAC ACTA AGGTT AACTT CTACGCTTGG AAGAGAATGG AAGTTGGACA ACAGGCTGTT GAAGTTTGGC AAGGATTGGC TTTGTTGTCC GAGGCTGTTT TGAGAGGTCA AGCTTTGTTG GTTAACTCCT CCCAACCATG GGAACCATTG CAATTGCACG TTGACAAGGC TGTTTCTGGA TTGAGATCCT TGACTACTTT GTTGAGAGCT TTGGGTGCTC AGAAAGAGGC TATTTCTCCA CCAGATGCTG CTTCAGCTGC TCCATTGAGA ACTATCACTG CTGACACTTT CAGAAAGTTG TTC AGAGTTT ACTCCAACTT CTTGAGAGGA AAGTTGAAGT TGTACACTGG TGAAGCTTGT AGAACTGGTG ACTAGTAA

Seqüência de aminoácido de EPO [SEQ ID NO: 2]

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENTT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PFDAASAAPL RTITAJDTFRK LFRVYSNFLR GKIiCLYTGEA CRT(H)

IV. CÉLULAS HOSPEDEIRAS

As células hospedeiras eucarióticas, tais como levedura e fungos, são preferidas para a expressão da eritropoietina da presente invenção porque elas podem ser economicamente cultivadas, dão altos rendimentos e quando apropriadamente modificadas são capazes de glicosilação adequada. A levedura particularmente oferece genéticas estabelecidas permitindo transformações rápidas, estratégias de localização de proteína testadas e técnicas de silenciamento de gene fácil. Os vetores adequados têm seqüências de controle de expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas e uma origem de replicação, seqüências de terminação e outras como desejado.

Várias leveduras, tais como K lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica e Hansenula polimorpha são preferidas para a cultura de célula porque elas são capazes de crescer até densidades de célula altas e secretam quantidades grandes de proteína recombinante. Do mesmo modo, fungos filamentosos, tais como Triehoderma reesei, Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa e outros podem ser usados para produzir as glicoproteínas da invenção.

Os eucariotas inferiores, particularmente levedura e fungos, podem ser geneticamente modificados de modo que expressem glicoproteínas em que o padrão de glicosilação é equivalente ao humano ou humanizado. Isto pode ser obtido eliminando-se enzimas de glosilação endógenas selecionadas e/ou fornecendo enzimas exógenas como descrito por Gerngross et al., US 20040018590 e 7.029.872, as divulgações dos quais são por meio deste aqui incorporadas por referência. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser selecionada ou engendrada para ser esgotada nas atividades de 1,6- manosil transferase, que de outro modo adicionariam resíduos de manose no N-glicano em uma glicoproteína.

Usando os métodos e materiais da presente invenção, é possível produzir composições de glicoproteína que compreendam uma pluralidade de glicoformas, cada glicoforma compreendendo pelo menos um N-glicano ligado a ela, em que a composição de glicoproteína desse modo compreende uma pluralidade de N-glicanos em que uma glicoforma predominante compreende um N-glicano desejado. Utilizando as ferramentas descritas em Gemgross et ai, US 20040018590 e 7.029.872, junto com a presente invenção, é possível produzir muitas glicoformas ligadas em N diferentes. Dependendo das necessidades específicas, os métodos da presente invenção podem ser usados para se obter composição de glicoproteína em que a glicoforma N predominante está presente em uma quantidade entre 5 e 80 por cento em mol mais do que a glicoforma N mais predominante seguinte; em formas de realização preferidas, a glicoforma N predominante pode estar presente em uma quantidade entre 10 e 40 por cento em mol; 20 e 50 por cento em mol; 30 e 60 por cento em mol; 40 e 70 por cento em mol; 50 e 80 por cento em mol mais do que a glicoforma N mais predominante seguinte.

Em outras formas de realização preferidas, a glicoforma N predominante é uma glicoforma N desejada e está presente em uma quantidade de mais do que 25 por cento em mol; mais do que 35 por cento em mol; mais do que 50 por cento em mol; mais do que 60 por cento em mol; mais do que 75 por cento em mol; ou mais do que 80 por cento em mol do número total de N- glicanos.

Em formas de realização preferidas, um vetor pode ser construído com um ou mais gene(s) marcador(es) selecionável(is) e um ou mais genes que codificam eritropoietina desejados que devam ser transformados em uma célula hospedeira apropriada. Por exemplo, um ou mais genes marcadores selecionáveis podem ser fisicamente ligados com um ou mais genes, que expressam um peptídeo ou proteína da eritropoietina desejada para a isolação ou um fragmento do dito peptídeo ou proteína de eritropoietina tendo a atividade desejada podem estar associados com o(s) gene(s) selecionável(is) dentro do vetor. O(s) marcador(es) de gene e gene(s) da eritropoietina selecionável(is) pode(m) estar disposto(s) em um ou mais vetores de transformação de modo que a presença do(s) gene(s) da eritropoietina em uma célula hospedeira transformada está correlacionada com a expressão do(s) gene(s) marcador(es) selecionável(is) nas células transformadas. Por exemplo, os dois genes podem ser inseridos no mesmo plasmídeo físico, sob o controle de um promotor único, ou sob o controle de dois promotores separados. Também pode ser desejado inserir os genes em plasmídeos distintos e co-transformados nas células.

Outras células úteis como células hospedeiras na presente invenção incluem células procarióticas, tais como células hospedeiras de E. coli e eucarióticas em cultura de célula, incluindo células de mamífero, tais como Ovário do Hamster Chinês (CHO).

V. ERITROPOIETINA QUIMICAMENTE MODIFICADA

Como mencionado acima, veículos poliméricos podem ser conjugados às proteínas tais como eritropoietina de modo a realçar as propriedades. Vários meios para ligar porções químicas úteis como veículos são correntemente disponíveis, ver, por exemplo, Publicação Internacional do Patent Cooperation Treaty ("PCT") Na WO 96/11953, intitulado "N- Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods," aqui incorporada por referência em sua totalidade. Esta publicação PCT divulga, entre outras coisas, a ligação seletiva de polímeros solúveis em água ao terminal N de proteínas.

As composições de eritropoietina quimicamente modificadas (isto é, "derivadas"), onde a proteína ou polipeptídeo são ligados a um polímero, são incluídas dentro do escopo da presente invenção. O polímero selecionado é tipicamente solúvel em água de modo que a proteína à qual o mesmo está ligado não precipite em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. O polímero selecionado é usualmente modificado para ter um grupo reativo único, tal como um éster ativo para a acilação ou um aldeído para a alquilação, de modo que o grau de polimerização possam ser controlados como fornecidos nos presentes métodos. Incluído dentro do escopo das composições de eritropoietina modificadas está uma mistura de polímeros. Preferivelmente, para o uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

O polímero solúvel em água ou mistura deste pode ser selecionado do grupo que consiste de; por exemplo, polietileno glicol (PEG), monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose, ou outros polímeros com base em carboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico. Para as reações de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) devem ter um grupo éster reativo único. Para a alquiilação redutiva, o(s) polímero(s) selecionado(s) devem ter um único grupo aldeído reativo. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Um polímero solúvel em água particularmente preferido para o uso aqui é polietileeno glicol, abreviado PEG. Como aqui usado, polietileno glicol é intencionado a abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono- alcóxi (Cl-ClO) ou arilóxi-polietileno glicol.

A PEGuilação (isto é, a modificação pela adição de PEG ou um derivado de PEG), de PAL pode ser realizada por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica, como descrito por exemplo nas seguintes referências: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); EP 0 154 316; e EP 0 401 384. Preferivelmente, a PEGuilação é realizada por intermédio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo), como descrito abaixo.

No geral, a derivatização química pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas usadas para reagir uma substância biologicamente ativa com uma molécula polimérica ativada. Os métodos para preparar eritropoietina PEGuilada no geral compreenderá as etapas de (a) reagir um polipeptídeo de eritropoietina com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG), sob condições por meio das quais a eritropoietina torna-se ligada a um ou mais grupos PEG e (b) obter o(s) produto(s) de reação. No geral, as condições de reação ótimas para as reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e o resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a porcentagem de produto poli-PEGuilado.

A presente invenção também fornece um método que utiliza a alquilação redutiva para obter seletivamente eritropoietina quimicamente modificada no terminal N. Neste método a ligação ao terminal N da eritropoietina pode ser alvejada por causa da reatividade diferencial de grupos amino primários diferentes. Escolhe-se um pH em que o pKa entre o grupo 6- amino de lisinas na proteína e o grupo α-amino do terminal N resulta em derivatização quase seletiva da proteína no terminal N por uma reação com um grupo carbonila ou PEG ou um outro polímero. A eritropoietina modificada por mono-polímero é preferida. As preparações desta invenção preferivelmente serão mais do que 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % ou 75 % eritropoietina mono-polimérica, mais preferivelmente mais do que 80 %, 85 % ou 90 % de conjugado mono-polímero:proteína e o mais preferivelmente mais do que 95 % de conjugado de mono-polímero-eritropoietina.

O método de obter a preparação de eritropoietina derivatizada por mono-polímero pode ser pela purificação do material derivatizado a partir de uma população de moléculas de eritropoietina não derivatizadas depois da conjugação. Por exemplo, apresentado abaixo está um exemplo onde a mono- eritropoietina PEGuilada é separada usando a cromatografia. A cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica ou uma combinação das duas e potencialmente outros métodos de purificação comuns podem ser usadas. Estes métodos podem ser usados como ferramentas analíticas para caracterizar os produtos purificados ou como uma ferramenta de purificação preparativa.

Um veículo polimérico preferido é o polietileno glicol (PEG). O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG preferivelmente variará de cerca de 2 kiloDalton ("kDa") a cerca de 100 kDa, mais preferivelmente de cerca de 5 kDa a cerca de 60 kDa, mais preferivelmente de cerca de 20 kDa a cerca de 50 kDa; o mais preferivelmente de cerca de 30 kDa a cerca de 40 kDa. Estes PEGs podem ser fornecidos a partir de qualquer fornecedor comercial incluindo a NOF Corporation (Tokyo, Japão) , Dow Pharma (ChiroTech Technology, Cambridge, UK), Nektar (San Carlos, CA) e SunBio (Anyang City, Coréia do Sul). As porções de PEG adequadas incluem, por exemplo, metóxi poli(etileno glicol) propionaldeído de 40 kDa; metóxi poli(etileno glicol) propionaldeído de 60 kDa; alfa-metil-w-(3- oxopropóxi) de 31 kDa, polioxietileno; PEG de 30 kDa: Metóxi poli(etileno glicol) propionaldeído de 30 kDa e 2,3-Bis(metilpolioxietileno-óxi)-l-[(3- oxopropil)polioxietileno-óxi]-propano de 45 kDa. Os grupos PEG serão no geeral ligados aos compostos da invenção por intermédio de acilação ou aminação redutiva através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um aldeído, amino, tiol, ou grupo éster) a um grupo reativo na proteína ou polipeptídeo de interesse (por exemplo, um grupo aldeído, amino, ou éster). Por exemplo, a porção de PEG pode ser ligada ao resíduo de aminoácido de terminal N da eritropoietina, diretamente ou através de um ligador.

Uma estratégia útil para a PEGuilação de peptídeos sintéticos consiste de combinar, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um peptídeo e uma porção de PEG, cada uma carregando uma funcionalidade especial que seja mutuamente reativa contra a outra. Os peptídeos podem ser facilmente preparados com a síntese de fase sólida convencional (ver, por exemplo, FIGS. 5 e 6 e o texto nelas contido). Os peptídeos são "pré ativados" com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e completamente caracterizado antes de reagir com a porção de PEG. A ligação do peptídeo com PEG usualmente ocorre na fase aquosa e pode ser facilmente monitorado pela HPLC analítica de fase reversa. Os peptídeos PEGuilados podem ser facilmente purificados pela HPLC preparativa e caracterizados pela HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de massa de dessorção a laser.

Os polímeros de polissacarídeo são um outro tipo de polímero solúvel em água que pode ser usado para a modificação de proteína. Dextranos são polímeros de polissacarídeos compreendidos de subunidades individuais de glicose predominantemente ligadas pelas ligações α 1-6 linkages. O próprio dextrano está disponível em muitas faixas de peso molecular e é facilmente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kD a cerca de 70 kD. O dextrano é um polímero solúvel em água adequado para o uso na presente invenção como um veículo por si só ou em combinação com um outro veículo (por exemplo, Fc). Ver, por exemplo, WO 96/11953 e WO 96/05309. O uso de dextrano conjugado às imunoglobulinas terapêuticas ou de diagnóstico foi relatado; ver, por exemplo, a Publicação de Patente Européia N2 0 315 456, que é por meio deste incorporada por referência. Dextrano de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD é preferido quando dextrano é usado como um veículo de acordo com a presente invenção.

Como descrito acima, a presença de um grupo "ligador" é opcional. Quando presente, a sua estrutura química não é crítica, visto que o mesmo serve primariamente como um espaçador. O ligador é preferivelmente composto de aminoácidos ligados juntos pelas ligações peptídicas. Assim, em formas de realização preferidas, o ligador é composto de 1 a 20 aminoácidos ligados pelas ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Alguns destes aminoácidos podem ser glicosilados, como é bem entendido por aqueles na técnica. Em uma forma de realização mais preferida, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente, um ligador é composto de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não impedidos, tais como glicina e alanina. Assim, os ligadores preferidos são poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5, poli(Gly- Ala) e polialaninas. Outros exemplos específicos de ligadores são: (Gly)3Lys(Gly)4;

(Gly)3AsnGlySer(Gly)2; (Gly)3Cys(Gly)4; e

GlyProAsnGlyGly.

Para explicar a nomenclatura acima, por exemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Combinações de Gly e Ala também são preferidas. Os ligadores aqui mostrados são exemplares; ligadores dentro do escopo desta invenção podem ser muito mais longos e podem incluir outros resíduos.

Os ligadores não peptídicos também são possíveis. Por exemplo, os ligadores de alquila tais como -NH--(CH2)S--C(O)--, em que s = 2 a 20 pode ser usado. Estes ligadores de alquila podem ser ainda substituídos por qualquer grupo não estericamente impedido tal como alquila inferior (por exemplo, C1-C6) acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenila, etc. Um ligador não peptídico exemplar é um ligador de PEG, em que η é tal que o ligador tenha um peso molecular de 100 a 5000 kD, preferivelmente de 100 a 500 kD). Os ligadores peptídicos podem ser alterados para formar derivados na mesma maneira como descrita acima.

A PEGuilação de EPO glicosilada é descrita na WO 01/02017. Tais moléculas mostram uma atividade biológica melhorada. WO 00/32772 e Francis, G. E., et ai., Int. S. Hem. 68 (1988) 1-18, descreve EPO não glicosilada modificada por polietileno glicol. As moléculas da WO 00/32772 são adicionalmente modificadas nas posições 166. Tais moléculas são descritas como não causando um aumento significante em hematócrito. A porção de polímero de PEG consiste de 1 a 5 cadeias poliméricas. A WO 00/32772 sugere controlar o grau e sítio de PEGuilação pela diminuição do pH e redução da razão PEGramina. As reações conduzidas no pH 7 e razão molar de 1,5:1 de PEG-aldeído:grupos amina, preferencialmente reagir com o grupo α-amino de terminal N.

Algumas ligações de PEGuilação úteis são mostradas na Tabela 1 e algumas reações de PEGuilação úteis são mostradas na Figura 12. Em um método preferido, a PEGuilação de terminal N é realizada através do uso de mPEG-propionaldeído e a sua conjugação covalente ao terminal N de rhEPO por intermédio da aminação redutiva. A seletividade é obtida explorando-se a diferença nos valores pKa entre o grupo ε-amino da lisina (pKa -10) e o grupo amino do terminal N (pKa -7,6 a 8,0). Em uma reação de derivatização típica 30 % a 50 % da rhEPO é PEGuilada. Graus mais altos de derivatização podem ser obtidos sob condições otimizadas. A rhEPO mono-PEGuilada é depois purificada usando uma etapa de cromatografia de troca catiônica. Preferivelmente, a rhEPO mono-PEGuilada purificada é mais do que 80 %, 85 %, 90 % ou mais preferivelmente mais do que 95 % da rhEPO depois da cromatografia.

Tabela 1. PEGuilação: Seleção de Reagente, ligação de PEG-conjugado e estabilidade de conjugado

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No geral, as condições que podem ser aliviadas ou moduladas pela administração dos presentes derivados de polímero/eritropoietina incluem aqueles aqui descritos para moléculas de eritropoietina no geral. Entretanto, as moléculas de polímero/ eritropoietina e derivadas de eritropoietina aqui divulgadas podem ter atividades adicionais, atividades realçadas ou reduzidas ou outras características, quando comparadas com as moléculas não derivatizadas.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Construção da linhagem de célula 6.0 de Pichia geneticamente engendrada

Os seguintes procedimentos divulgados em Gerngross US 7.029.872 e Gerngross US 20040018590, pode-se construir vetores que são úteis para células hospedeiras eucarióticas inferiores geneticamente engendradas tal que elas sejam capazes de expressar um polipeptídeo desejado tendo uma glicoforma N desejada como a espécie predominante. Começando com a cepa do tipo selvagem de Pichia pastoris NRRL-11430, a introdução escalonada de genes é feita de acordo com a série descrita na Figura 1. O genótipo da cepa YGLY3159 aqui usada é ura5A::MET16 ochlA::lacZ bmt2A::lacZ/Kl/vINN2-2, num4L 1Δ: :lacZ/MinSLC3 5 A3 Δρηο 1 Am_rm4A :lac2 metl6A::lacZ, hislA::lacZ/ScGAL 10/XB33/DmUGT, arglA::HISl/KD53/TC54, ADEl::lacZ/NA10/MmSLC35A3/14.B8,

PRO1: :lacZ-URA5-IacZ/ TrMDS 1, AOXl :Sh ble/AOXlp/ScaMFpre- GFI800, TRP2::ARG1/ MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33.

Os plasmídeos usados para a construção da cepa YGLY3159 são ilustradas na Figura 2, Painéis A até O. Os plasmídeos são transformados na célula desejada, de acordo com as técnicas padrão. As técnicas adequadas para a construção de linhagens de célula também são demonstradas em Hamilton et al., Science 313: 1441: 1443 (2006), a divulgação da qual é por meio deste aqui incorporada por referência.

Exemplo 2. Construção do vetor para a produção de EPO recombinante.

Oligos para a pré seqüência do fator de acasalamento alfa de Saccharomyces cerevisiae foram fosforilados e recozidos para criar uma projeção EcoRI na extremidade 5' e uma extremidade abrupta na extremidade 3'. Este par de oligo foi depois ligado à seqüência de DNA codificadora que codifica a eritropoietina humana, como mostrado na Figura 2, para formar pGLY2088, que foi transformado em Piehia pastoris como mostrado na Figura 1.

Exemplo 3. Transformação e fermentação da linhagem de célula 6.0

A. Transformação

As cepas de levedura foram transformadas pela eletroporação (usando técnicas padrão como recomendado pelo fabricante do eletroporador BioRad).

B. Descrição do Processo de Fermentação

As rodadas de fermentação foram realizadas em biorreatores de vidro autoclaváveis de 15 L (volume de trabalho de 12 L) da Applikon. O reator é inoculado (0,04 % v/v) com uma cultura em frasco agitado de fase exponencial cultivada a partir de um frasco de estoque congelado. Os finais da fase de batelada em 24 a 36 horas no esgotamento da carga inicial de glicerol. O peso de célula úmida (WCW) depois da fase de batelada é tipicamente de 120 ± 25 g/L de WCW. Neste ponto uma solução de glicerol a 50 % p/p contendo 12 ml/L de sais de PTMl é alimentada ao fermentador em um único pulso levando a uma concentração de glicerol final de 30 g/L no início da fase de lote alimentado de glicerol. Uma solução contendo um inibidor sintético de O-glicosilação fúngica (PMTi-3) dissolvido em metanol a 2,6 mg/ml é adicionada a 1 ml/L. Um coquetel inibidor de protease (45 mg/ml de Pepstatina A e 15 mM de Quimostatina em DMSO) é adicionado a 0,6 ml/L. Dentro de 4 horas o glicerol é consumido e o peso de célula úmida atingiu 225 ± 25 g/L de WCW. A expressão de gene é depois induzida pelo início de uma alimentação de metanol contendo 12 ml/L de sais de PMTl a 2,3 g/h/L. No início da fase de lote alimentado de metanol assim como a cada 24 horas de indução, 1 ml/L de PMTi-3 a 2,6 mg/ml em metanol e 0,6 ml/L do coquetel de inibidor de protease são adicionados. A indução continua por 40 horas quando o peso de célula úmida final é esperado ser de aproximadamente 300 ± 25 g/L. (L* é o volume da carga inicial antes da inoculação).

A clarificação primária do caldo de fermentador é realizada pela centrifugação. O caldo de célula inteira é transferido em garrafas de centrífuga de 1000 ml e centrifugado a 4 °C por 15 minutos a 13.000 χ g.

Exemplo 4:Purificação:

EPO humana (hEPO) para a PEGuilação foi gerada por uma separação cromatográfica de três etapas, como segue, em que 95 % de pureza foi obtida (Figura 3). Primeiro, o sobrenadante de fermentação isento de célula foi filtrado através de filtro de membrana de 0,2 μm, concentrado e trocado de tampão usando um módulo de separação de fluxo tangencial MiniKross com membrana de fibra oca.

Q sepharose Big Beads foi usadas na primeira etapa para capturar as proteínas da célula hospedeira e fluxo direto de hEPO. A reunião de fluxo direto e as amostras de lavagem da coluna Q sepharose Big Beads foram ajustadas ao pH 5,0 com ácido acético. A condutividade foi medida para garantir um valor de aproximadamente 4,5 mS/cm.

Em seguida, a amostra foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μm e carregada em uma coluna SP sepharose Fast Flow pré- equilibrada com três volumes de coluna de acetato de sódio 50 mM pH 5,0. Dez volumes de coluna de um gradiente de acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 a acetato de sódio a 20 mM pH 5,0; 500 mM de NaCl foram aplicados para eluir a proteína, seguido por uma elução escalonada com 0,5 volumes de coluna de acetato de sódio a 20 mM pH 5,0; 750 mM de NaCl. As frações contendo hEPO foram reunidas e dialisadas em 50 mM de TRIS pH 7,0. As frações contendo hEPO foram carregadas em uma coluna Blue Sepharose 6 FF pré-equilibrada com três volumes de coluna de 50 mM de TRIS pH 7,0. Dez volumes de coluna de um gradiente linear de 50 mM de TRIS pH 7,0 a 50 mM de TRIS pH 8; NaCl 3 M foram aplicados, seguidos por uma eluição escalonada de dois volumes de coluna com 50 mM de TRIS pH 8; NaCl 3 M.

As frações que demonstraram uma faixa de EPO (peso molecular médio de -25 kDa) foram reunidos, filtrados através de um filtro de membrana de 0,21 μm, dialisados em 20 mm de MES pH 6,0 a 4°C e armazenadas a 4°C. A reunião de amostra foi depois concentrada e dialisada em 50 mM de tampão de acetato de sódio no pH 5,2 a uma concentração de proteína de 1 mg/ml.

Foi observado que a exposição do sobrenadante de fermentação ao pH 5 aumentou a perda de hEPO. E portanto importante manter a captura e a etapa intermediária de purificação hEPO no pH neutro.

Uma vista geral de um segundo esquema de purificação geral é mostrada na Figura 10. Uma amostra purificada preparada usando este esquema foi analisada pela SDS-PAGE mostrada na Figura 11.

A clarificação primária é realizada pela centrifugação. O caldo de célula inteiro é transferido em garrafas de centrífuga de 1000 ml e centrifugadas a 4°C por 15 minutos a 13.000 χ g. Uma etapa de ultrafiltração pode ser utilizada para fermentadores grandes (10 L a 40 L e maiores). Esta etapa pode ser realizada utilizando chapas planas Sartoriuos com um tamanho de poro de 10 K a uma concentração de 5 vezes.

Uma etapa de captura é realizada com um fluxo rápido de Blue Sepharose 6 (GE healthcare) equilibrado com 50 mM de Tris-HCl/100 mM de NaCl, pH 7. O sobrenadante foi ajustado a 100 mM de NaCl e passado através de filtro de beco sem saída (Whatman, Polycap TC) antes de carregar na coluna. O tempo de residência é mantido em 10 min com uma lavagem de 3 volumes de coluna (CV) depois do carregamento. A eluição é realizada em etapas de 2 CV com 250 mM e 3 CV com NaCl 1 M. a EPO elui no NaCl 1 M.

Hidroxiapatita cerâmica macro-prep Tipo 1 40 μm (Bio-Rad) é usada depois da etapa de captura. Esta coluna é equilibrada com 50 mM de MOPS contendo NaCl 1 M e 10 mM de CaCl2 pH 7. 10 mM de CaCl2 são adicionados à EPO reunida da coluna azul antes de carregar. A lavagem da coluna é executada com 3 CV de solução de equilíbrio seguido por 10 CV de gradiente linear de 0 a 200 mM de fosfato de Na pH 7. A EPO elui entre 60 mM e 100 mM de fosfato de Na.

Fontes 3OS (GE Healthcare) podem ser usadas como uma etapa de purificação opcional. Se este for o caso, a amostra reunida depois que a hidroxiapatita é dialisada contra 50 mM de Acetato de Na pH 5 durante a noite a 4°C e a coluna é equilibrada com o mesmo tampão. Um gradiente linear de 10 CV de 0 a 750 mM de NaCl é aplicado com elução de EPO entre 350 e 500 mM de NaCl.

Análise de EPO Purificada

N-glicanos foram liberados da EPO purificada pelo tratamento com PNGase F (Choi PNAS, Hamilton 2003 Science) e analisados pela SDS- PAGE de acordo com Laemmli (Laemmli 1970) (Figura 4).

A inteireza e presença de agregação da EPO purificada foi determinada pela cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) usando um instrumento Hitachi D7000 com detector UV L7420 monitorando 280 nm, um detector de dispersão de luz de ângulo triplo Wyatt miniDAWN detectando a 690 nm, um detector de índice refrativo diferencial Wyatt Optilab rEx detectando a 690 nm, uma coluna GE Healthcare Superdex 200 10/300 GL (#17-5175-01) e o software Wyatt ASTRA V 5.3.1.5 (Figura 4A a 4D).

Noventa microlitros de amostra (> 0,1 mg/ml) são colocados em um frasco de amostra, tampado e depois injetado na coluna. O gradiente de HPLC consiste de uma rodada isocrática de 60 minutos na temperatura ambiente com uma vazão de 0,45 ml/min usando um tampão de 100 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 150 mM de NaCl e 0,05 % de azida de sódio.

Os pesos moleculares são calculados usando um módulo de análise de conjugado de proteína da ASTRA software. O detector de índice de refração diferencial é ajustado ao detector de concentração. Um dn/dc de 0,185 ml/g é usado para proteína e 0,136 ml/g para PEG e glicanos.

A pureza da EPO purificada foi quantificada pela RP-HPLC usando um instrumento de HPLC Hitachi D7000 com detetor de série de diodo L-7455 e uma coluna Júpiter 5 μ C4 300 Â 150 mm χ 4,6 mm de DI (#00E-4167-E0, Fenomenex) (Figura 4). Noventa microlitros são injetados e a amostra é monitorada a 280 nM e separada de acordo com o gradiente abaixo (a estufa da coluna é pré-aquecida a 80 °C) com os seguintes tampões:

Tampão A: 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA) em água grau de HPLC espargida com gás hélio

Tampão B: 0,08 % de TFA em acetonitrila grau HPLC espargida com gás hélio

Tabela 2

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A qualidade da proteína hEPO foi avaliada e modificações pós-translacionais foram avaliadas pelo mapeamento de peptídeo (LC-MS) usando um Advion Triversa Nanomate, um espectrômetro de massa Thermo Electron Finnigan LTQ, um sistema de HPLC Thermo Electron Finnigan Surveyor, uma coluna Júpiter 4 μ Peoteo 90 A, 250 χ 4,60 mm (#00G-4396- E0, Fenomenex) e uma coluna giratória com um corte de peso molecular de 10 kDa (VS0101, Vivascience) (Figura 7).

Uma amostra de 100 μl (>1 mg/ml) é colocada em um tubo de Eppendorfde 1,5 ml, 150 μl de GuHCl 10 M e 2,5 μl de Ditiotreitol 1 M (DTT) são adicionados. Os conteúdos da amostra são misturados e a amostra é incubada por 1 hora a 37°C. A amostra é deixada esfriar até a temperatura ambiente e 10 μl de ácido Iodoacético 1 M (IAA) são adicionados. A luz é evitada enrolando-se os tubos de amostra com folha de alumínio e as amostras são incubadas na temperatura ambiente por 45 min. O tampão de amostra é trocado para bicarbonato de amônio a 25 mM (NH4HCO3) pH 7,8 (6 vezes por diluição de 10 vezes cada vez) e o volume final é reduzido a ~30 μL 1 μg de solução de estoque de tripsina (tripsina liofilizada constituída em 50 mM de ácido acético a 1 μg/μl e 2 μl de alíquota/tubo, armazenar a -20°C) e acetonitrila a 5 % (v/v) são adicionados. A solução de reação é colocada a 37 °C e incubada durante a noite (~16 horas). A análise de MALDI-TOF é realizada para garantir a conclusão da digestão de tripsina e a atividade de tripsina é inativada. Acido fórmico é depois adicionado a uma concentração final de 0,1 % (v/v) para levar o pH para baixo. Quinze microlitros do digesto são misturados com 15 μl de tampão de HPLC A (0,1 % de ácido fórmico (FA) em água grau HPLC) e carregado em um frasco de amostra. A configuração da HPLC é como segue:

1) Temperatura da bandeja de amostra: 4°C;

2) Temperatura da estufa da coluna: 30°C;

3) Injeção de alça parcial;

4) Detecção de UV: 215 nm e 280 nm;

5) Gradiente de HPLC: Tabela 3

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O espectrômetro de massa é como segue:

1) Fluxo para LTQ -400 nl/min através da Advion Triversa Nanomate;

2) Temperatura de capilar: 115°C, voltagem capilar: 5 v; voltagem de lentes de tubo: 77 ν

3) Varredura ajustada pata o topo de perda neutra 3 para MS4 por 90 min.

O cromatograma é plotado examinando-se no traço do pico base a partir do detector de massa. Os peptídeos presentes em cada pico são identificados pesquisando-se a seqüência de hEPO usando o software Sequest assim como a inspeção manual.

Exemplo 5. Descrição das moléculas de PEG e processo usados para a PEGuilação

As seguintes moléculas de PEG foram usadas para a PEGuilação de hEPO:

Metóxi poli(etileno glicol) proprionaldeído linear de 40 kDa da Dow (Cambridge, UK)

Metóxi poli(etileno glicol) proprionaldeído linear de 60 kDa da Dow (Cambridge, UK)

a-Metil-co-(3-oxopropóxi) linear de 30 kDa, polioxietileeno da NOF Corporation (Tóquio, Japão)

2,3 -Bis(metilpolioxietileno-óxi)-1 - [(3 -oxopropil) polioxietileno-óxi]-propano ramificado de 45 kDa da NOF Corporation

Os PEGs ativados diferentes (PEGs lineares de 30 kDa, 40 kDa ou 60 kDa ou PEG ramificado de 45 kDa) foram adicionados à amostra de hEPO (conc. 1 mg/ml) em tampão de acetato de sódio a 50 mM no pH 5,2 a uma razão de proteína:PEG de 1:10. A reação foi realizada na temperatura ambiente sob condições redutoras pela adição de 10 mM de cianoboroidreto de sódio à mistura de reação com agitação durante a noite. A reação foi interrompida pela adição de 10 mM de TRIS. A hEPO mono-PEGuilada foi purificada usando uma coluna SP sepharose Fast Flow e analisada pela SDS- PAGE (Figura 5).

Se otimização adicional é desejada, os seguintes parâmetros podem ser examinados:

1) Faixas de pH diferentes (pH 4,0, 4,5, 5,2 e 6,0)

2) Razão molar diferente de hEPO:mPEG-aldeído (1:5, 1:10, 1:20)

3) Temperatura ambiente versus 4 0C

4) Tipos diferentes de PEGs

Exemplo 6. Caracterização dos Produtos PEGuilados de EPO

Os quatro produtos PEGuilados de quatro EPO diferentes foram analisados pela SEC HPLC (Figura 6) como descrito no Exemplo 4. Para a quantificação de estruturas de glicano ligado em N (Figura 7), os glicanos ligados em N foram liberados da EPO PEGuilada pelo tratamento com PNGase-F (Choi PNAS, Hamilton 2003 Science) e rotulados com 2- aminobenzidina (2-AB) usando um kit de rotulação 2-AB comercial. A HPLC foi realizada usando um Prevail CHO ES, pérolas de 5 mícrons, coluna de sílica ligada a amino mantida a 30 0C. O perfil de eluição é como segue (Solvente A: 100 % de acetonitrila, Solvente B: 50 mM de formiato de amônio pH 4,4): Tabela 4

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A Figura 7 mostra que aproximadamente 70 a 74 % dos produtos PEGuilados de EPO nas amostras testadas são bi-sialilados (ver o último pico de cada painel).

Exemplo 7. Formulação

Uma formulação representativa de PEG-EPO pode ser 20 mM de fosfato de sódio, 140 mM de cloreto de sódio, 0,005 % de Polissorbato 80, pH 6,0, que está fundamentado em um produto de eritropoietina comercializado similar. PEG-EPO pode ser formulada para injeção como um líquido estéril, claro, em potências múltiplas e dispensada em frascos de vidro de dose única variando na concentração de 25 a 500 μg/ml. Como estas concentrações estão na faixa baixa, existe preocupação com respeito á absorção da proteína pelo frasco, que resultaria em perda de dose. Para minimizar a absorção, tensoativos são usualmente adicionados às formulações (isto é, Polissorbato 20, Polissorbato 80) em concentrações limitadas. A necessidade quanto a tensoativo estará fundamentado em estudos de compatibilidade de material conduzidos durante o desenvolvimento da formulação.

Outras formulações de EPOs comerciais

As formulações comerciais of eritropoietina são conhecidas e podem ser adaptadas para uso com as eritropoietinas da presente invenção. Alguns exemplos de formulações de EPO comerciais são como segue:

ARANESP®: Solução de polissorbato: Cada 1 ml contém 0,05 mg de polissorbato 80 e é formulada no pH 6,2 ± 0,2 com 2,12 mg de fosfato de sódio monobásico monoidratado, 0,66 mg de fosfato de sódio dibásico anidro e 8,18 mg de cloreto de sódio em água para injeção, USP (para 1 ml).

Solução de albumina: Cada 1 ml contém 2,5 mg de albumina (humana) e é formulada no pH 6,0 ± 0,3 com 2,23 mg de fosfato de sódio monobásico monoidratado, 0,53 mg de fosfato de sódio dibásico anidro e 8,18 mg de cloreto de sódio em água para injeção, USP (para 1 ml).

EPOGEN® é formulada como um líquido estéril, incolor em uma solução tamponada de cloreto de sódio/citrato de sódio isotônica ou uma solução tamponada de cloreto de sódio/fosfato de sódio para a administração intravenosa (IV) ou subcutânea (SC).

Frasco de dose única, isento de preservante: Cada 1 ml de solução contém 2000, 3000, 4000 ou 10.000 Unidades de Epoetina alfa, 2,5 mg de Albumina (Humana), 5,8 mg de citrato de sódio, 5,8 mg de cloreto de sódio e 0,06 mg de ácido cítrico em água para injeção, USP (pH 6,9 ± 0,3). Esta formulação não contém nenhum preservante. Os frascos preservados contiveram 1 % de álcool benziIico.

Exemplo 8. Análise in vivo de PEG-EPO

Estudos In Vivo em Camundongos:

Estudo de eficácia de camundongo: As quatro versões diferentes de PEG-EPO produzidas na cepa de P. pastoris YGLY3159 engendradas para gerar EPO humana terminalmente sialilada bi-antenária (>70 %) foram comparadas com Aranesp comercial quanto a sua capacidade para aumentar hematócrito. Camundongos C57B6 (idade de 7 semanas no início do estudo, peso 18 a 20 g, 3 machos/3 fêmeas por grupo de tratamento) foram obtidos e aclimatizados por uma semana. Os valores de hematócrito foram determinados antes da dosagem para se obter uma referência para cada animal. Os animais foram segregados em seis grupos:

(1) veículo (solução salina + 100 μg/ml de rHSA);

(2) ARANESP® 2,5 μg/kg/dose (darbepoetina, isenta de albumina);

(3) PEG-EPO [40 kDa linear DOW]® 2,5 μ^^οββ;

(4) PEG-EPO [60 kDa linear DOW]® 2,5 μg/kg/dose;

(5) PEG-EPO [30 kDa linear NOF]® 2,5 μg/kg/dose;

(6) PEG-EPO [45 kDa ramificado NOF]® 2,5 μg/kg/dose.

Os animais foram dosados pela injeção intraperitoneal duas vezes por semana (Segunda e Quinta-feira) para um total de cinco injeções (a dosagem foi interrompida depois de 2,5 semanas). Os camundongos foram sangrados semanalmente (Segunda-feira) e os valores de hematócrito foram determinados. Os camundongos injetados com conjugados de PEG-EPO da presente invenção demonstram um aumento no hematócrito em Aranesp comercial. Os dados são apresentados na Figura 8.

Um estudo secundário foi conduzido em que os animais: camundongos C57black (7 semanas de idade; -20 g; 3 machos/3 fêmeas por grupo) foram administrados com uma única 2,5 μg/kg/dose semanalmente de epo humana recombinante. As injeções foram às Quintas-feiras e os animais foram sangrados nas Segundas-feiras durante o curso do estudo. O estudo avaliou o efeito sobre os níveis de hematócrito da administração intraperitoneal uma vez por semana de quatro conjugados de PEG-EPO e Aranesp (NESP). Os dados estão apresentados na Figura 13.

Estudos de Imunogenicidade:

De modo a tratar as propriedades imunogênicas de PEG-EPO, macacos rhesus podem ser dosados subcutaneamente duas vezes/semana por 2 semanas. Um método com base no ELISA pode especificamente identificar e medir anticorpos para a eritropoietina recombinante em sangue de rhesus e subseqüentemente humano. A seguir da administração subcutânea de PEG- EPO, as amostras séricas podem ser monitoradas com o tempo quanto a geração de anticorpos anti-eritropoietina. Além disso, as respostas de anticorpo potenciais podem estar correlacionadas com parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos que podem ser monitorados concorrentemente. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> GlycoFi, Inc.

<120> COMPOSIÇÕES DE ERITROPOIETINA

<130> 22376Y PCT

<150> 60/905,770 <151> 2007-03-07

<160> 2

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> humano

<400> 1

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccaccaagat tgatttgtga ctccagagtt ttggagagat acttgttgga ggctaaagag 120 gctgagaaca tcactactgg ttgtgctgaa cactgttcct tgaacgagaa catcacagtt 180 ccagacacta aggttaactt ctacgcttgg aagagaatgg aagttggaca acaggctgtt 240 gaagtttggc aaggattggc tttgttgtcc gaggctgttt tgagaggtca agctttgttg 300 gttaactcct cccaaccatg ggaaccattg caattgcacg ttgacaaggc tgtttctgga 360 ttgagatcct tgactacttt gttgagagct ttgggtgctc agaaagaggc tatttctcca 420 ccagatgctg cttcagctgc tccattgaga actatcactg ctgacacttt cagaaagttg 480 ttcagagttt actccaactt cttgagagga aagttgaagt tgtacactgg tgaagcttgt 540 agaactggtg actagtaa 558

<210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> humano

<400> 2

Ala Pro Pro Arg Leu

1 5

Leu Glu Ala Lys Glu 20

Cys Ser Leu Asn Glu 35

Tyr Ala Trp Lys Arg 50

Gln Gly Leu Ala Leu 65

Leu Val Asn Ser Ser 85

Lys Ala Val Ser Gly 100

Gly Ala Gln Lys Glu 115

Pro Leu Arg Thr Ile 130

Tyr Ser Asn Phe Leu 145

Cys Arg Thr Gly Asp 165

Ile Cys Asp Ser Arg Val 10

Ala Glu Asn Ile Thr Thr 25

Asn Ile Thr Val Pro Asp 40

Met Glu Val Gly Gln Gln 55

Leu Ser Glu Ala Val Leu 70 75

Gln Pro Trp Glu Pro Leu 90

Leu Arg Ser Leu Thr Thr 105

Ala Ile Ser Pro Pro Asp 120

Thr Ala Asp Thr Phe Arg 135

Arg Gly Lys Leu Lys Leu 150 155

Leu Glu Arg Tyr Leu 15

Gly Cys Ala Glu His 30

Thr Lys Val Asn Phe 45

Ala Val Glu Val Trp 60

Arg Gly Gln Ala Leu 80

Gln Leu His Val Asp 95

Leu Leu Arg Ala Leu 110

Ala Ala Ser Ala Ala 125

Lys Leu Phe Arg Val 140

Tyr Thr Gly Glu Ala 160

Claims (24)

1. Composição de proteína da eritropoietina substancialmente homogênea, a dita composição caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de glicanos ligados em N bi-antenários ligados à eritropoietina, a dita pluralidade de glicanos ligados em N compreendendo mais do que 25 por cento em mol de um glicano ligado em N consistindo essencialmente de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2; GlcNAc2-Man3GlcNAc2Gal2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GlcNAc2Man3; Glc-NAc2Man5GlcNAcGalNANA; GlcNAc2Man5GlcNAcGal; GlcNAc2-Man5GlcNAc; e GlcNAc2Man5.

2. Composição de proteína da eritropoietina substancialmente homogênea, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de glicano ligado em N bi-antenária ligado à eritropoietina, em que mais do que por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N ligados consistem de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que mais do que 50 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que mais do que 75 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito N-glicano GlcNAc2Man3Glc-NAc2Gal2NANA2 está presente em um nível de cerca de 5 por cento em mol a cerca de 80 por cento em mol mais do que a estrutura de glicano ligado em N mais predominante seguinte da dita pluralidade de glicanos ligados em N.

6. Composição de proteína da eritropoietina substancialmente homogênea, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de glicanos ligados em N bi-antenários ligados à eritropoietina, em que mais do que 25 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que mais do que 50 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que mais do que 75 por cento em mol da dita pluralidade de glicanos ligados em N consistem essencialmente de GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2.

9. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o dito glicano ligado em N GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2 está presente em um nível de cerca de 5 por cento em mol a cerca de 80 por cento em mol mais do que a estrutura de glicano ligado em N mais predominante seguinte da dita pluralidade de N-glicanos.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que uma porção de polietileno glicol está ligada ao resíduo de aminoácido de terminal N de pelo menos 50 % das proteínas de eritropoietina, a dita ligação sendo diretamente ou por intermédio de um ligador.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a porção de polietileno glicol tem um peso molecular de cerca de 20 kD a cerca de 60 kD.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a porção de polietileno glicol tem um peso molecular de cerca de 30 kD a cerca de 40 kD.

13. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a porção de polietileno glicol é linear.

14. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a porção de polietileno glicol é ligada ao resíduo de aminoácido de terminal N de pelo menos 80 % das proteínas de eritropoietina.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 e um diluente farmaceuticamente aceitável.

16. Método de aumentar hematócrito em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita preparação é uma composição como definida na reivindicação 10 e é administrada uma vez a cada quatro a seis semanas.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita preparação é administrada em uma dose em uma faixa de 0,05 a 500 μg/kg.

19. Método de produzir uma composição de eritropoietina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: Construir uma célula hospedeira eucariótica inferior para ligar glicanos ligados em N pré selecionados às proteínas, os ditos glicanos ligados em N pré selecionados compreendendo mais do que 25 por cento em mol de um glicano ligado em N consistindo essencialmente de uma estrutura selecionada do grupo que consiste de GlcNAc2Man3-GlcNAc2Gal2NANA2; GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2; GlcNAc2Man3Glc-NAc2; GlcNAc2Man3; GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA; GlcNAc2Man5-GlcNAcGal; GlcNAc2Man5GlcNAc; e GlcNAc2Man5, Transformar a dita célula hospedeira eucariótica inferior com um vetor que compreende uma seqüência que codifica a eritropoietina operavelmente ligada às seqüências de controle de expressão reconhecíveis pela dita célula hospedeira, Cultivar a dita célula transformada sob condições sensíveis à expressão de eritropoietina, e Isolar a eritropoietina.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma levedura ou fungos filamentosos

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de Pichia sp., Pichia pastoris, Pichia finlandiea, Piehia trehalophila, Piehia koelamae, Piehia membranefaeiens, Piehia minuta (Ogataea minuta, Piehia lindner), Piehia opuntiae, Piehia thermotolerans, Piehia salietaria, Piehia guereuum, Piehia pijperi, Piehia stiptis, Piehia methanoliea, Saccharomyees sp., Saccharomyees eerevisiae, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces laetis, Candida albieans, Aspergillus sp., Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Triehoderma reesei, Chrysosporium lueknowense, Fusarium sp., Fusarium graminaum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens e Neurospora crassa.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Piehiapastoris.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a Piehia pastoris é ura5A::MET16 ochlA::lacZ bmt2A::lacZ/Kl/vINN2-2, num4LlA::lacZ/MinSLC35A3 Δρηοΐ- Am_rm4A:lac2 metl6A::lacZ, hislA::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT, arglA::HISl/KD53/TC54, ADEl::lacZ/NA10/MmSLC35A3/14.B8, PROl ::lacZ-URA5-IacZ/ TrMDS 1, AOXl :Sh ble/AOXlp/ScaMFpre- GFI800, TRP2::ARG1/ MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33.

24. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita eritropoietina é substancialmente isenta de lactosamina. <figure>figure see original document page 68</figure> FlG. 1B <figure> figure see orginal document page 69</figure> <figure>figure see original document page 70</figure> FIG. 1C <figure>figure see original document page 71</figure> <figure>formula see original document page 72</figure> FIG. 2Α <figure>figure see original document page 73</figure> FIG. 2Β <figure>figure see original document page 74</figure> <figure>figure see original document page 75</figure> FIG. 2D FIG. 2E <figure> figure see orginal document page 76</figure> <figure>formula see original document page 77</figure> FIG. 2F <figure>figure see original document page 78</figure> FIG. 2G FIG. 2Η <figure> figure see orginal document page 79</figure> FIG. 21 <figure>figure see original document page 80</figure> <figure>figure see original document page 81</figure> FIG. 2J FIG. 2Κ <figure> figure see orginal document page 82 </figure> <figure>figure see original document page 83</figure> <figure>formula see original document page 84</figure> FlG. 2M <figure>figure see original document page 85</figure> FIG. 2Ν <figure> figure see orginal document page 86</figure> <figure>figure see original document page 87</figure> FIG. 3 <figure>figure see original document page 88</figure> FIG. 4Β <figure>formula see original document page 89</figure> <figure>figure see original document page 90</figure> FIG. 5 <figure> figure see orginal document page 91</figure> <figure> figure see orginal document page 92</figure> <figure>figure see original document page 93</figure> FlG. 8 <figure>formula see original document page 94</figure> FlG. 9A <figure>figure see original document page 95</figure> <figure>figure see original document page 96</figure> FIG. 10 Mancha de SDS-PAGE Coomassie de EPO purificado <figure>formula see original document page 97</figure> FIG. 11 <figure>figure see original document page 98</figure> <figure> figure see orginal document page 99</figure>