RU2515914C1 - Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения - Google Patents
Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2515914C1 RU2515914C1 RU2013105752/10A RU2013105752A RU2515914C1 RU 2515914 C1 RU2515914 C1 RU 2515914C1 RU 2013105752/10 A RU2013105752/10 A RU 2013105752/10A RU 2013105752 A RU2013105752 A RU 2013105752A RU 2515914 C1 RU2515914 C1 RU 2515914C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- epo
- protein
- seq
- recombinant human
- proteins
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано для получения гибридного рекомбинантного эритропоэтина человека. Конструируют нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6. Белок ЕРО-TR 1,6 представляет собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 1,6 белка MUC1 человека. Белок EPO-TR 4 представляет собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 4 белка MUC1 человека. Гибридный белок EPO-TR 6 представляет собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 6 белка MUC1 человека. Гибридные белки получают путем роллерного культивирования в подходящих условиях модифицированной линии клеток млекопитающих СНО, содержащей кодирующую белок нуклеотидную последовательность с последующим выделением гибридного белка из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получить гибридный рекомбинантный эритропоэтин человека, обладающий пролонгированным действием. 4 н.п. ф-лы, 4 ил, 7 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения с использованием методов генетической инженерии гибридных белков человеческого эритропоэтина (ЭПО), обладающих высокой биологической активностью и пролонгированным действием.
ЭПО является фактором роста и терминальной дифференцировки предшественников эритроцитов в костном мозге.
Синтез эритропоэтина - гормона, регулирующего образование эритроцитов, происходит в почках. Циркулирующий в кровеносной системе ЭПО связывается со специфическими рецепторами клеток-предшественников эритроцитов, вызывая их пролиферацию и дифференциацию. При ряде патологий, особенно при заболеваниях почек, синтез эндогенного ЭПО существенно снижается, что приводит к развитию тяжелых анемических состояний. Введение рекомбинантного ЭПО позволяет эффективно восстанавливать процесс образования эритроцитов, нормализуя тем самым состояние пациентов. В то же время, известно, что ЭПО, как и другие гликопротеины плазмы, быстро подвергается энзиматической деградации, лишаясь сиаловых кислот, что приводит к короткому времени циркуляции в организме и необходимости частого введения белка для достижения максимального клинического эффекта (J. Pharmacology and Exp. Therapeutics: 327, 2, 308-315; British J. of Cancer: 84, Supp.1, 3-10, 2001). Известны несколько стратегий повышения стабильности ЭПО in vivo, обусловленных двумя механизмами элиминации (выведения) ЭПО из организма. Это либо увеличение размеров молекулы ЭПО за счет введения дополнительных лигандов, что приводит к снижению почечного клиренса (скорости выведения ЭПО из организма (J.Biol.Chem: 263, 15064-15070, 1988)), либо введение в молекулу ЭПО дополнительных углеводных цепей, что приводит к большему числу сиаловых групп и снижает уровень элиминации ЭПО через экспрессируемые в клетках печени (гепатоцитах) рецепторы для асиалированных белков - ASGR (American J. Physiology: 227, 6, 1385-1388).
Молекула ЭПО имеет четыре карбогидратных цепи, три из которых связаны с пептидной цепью через азот аспарагина (N-гликозилирование), а одна - через кислород серина (O-гликозилирование). При этом гликолизильные цепи составляют около 40% от молекулярного веса молекулы (British J. of Cancer: 84, Supp.1, 3-10, 2001). Каждая из трех N-углеводных цепей состоит из 2-4 ветвей. Для O-углеводных цепей характерно наличие 1-2 ветвей. Каждая из углеводных цепей может завершаться остатком сиаловой кислоты. Максимальное количество сиаловых кислот в молекуле ЭПО равно 14, что придает всей молекуле ЭПО отрицательный заряд, лишает ее возможности связаться с ASGR-рецепторами гепатацитов и, соответственно, увеличивает время циркуляции в организме.
Как показано при создании коммерческого препарата на основе ЭПО "Aranesp" компании Amgen, введение в молекулу ЭПО двух дополнительных сайтов N-гликозилирования увеличивает время выведения гормона из организма в 3-4 раза (Exp. Hematology: 31, 290-299, 2003; US 7,217,689 В1).
Для получения белка пролонгированного действия - α-дарбэпоэтина использована технология генетической модификации белковой структуры ЭПО. Молекула модифицированного ЭПО (α-дарбэпоэтина) содержит 5 замен в аминокислотной последовательности, две из которых - замена аланина в позиции 30 и триптофана в позиции 88 на аспарагин являются дополнительными сайтами N-гликозилирования. Высокая степень гликозилирования обеспечивает α-дарбэпоэтину пролонгированную биологическую активность и клинический эффект даже при сниженной в два раза, по-сравнению с ЭПО, способности к аффинному взаимодействию со специфическим рецептором (US 7,217,689 B1; British J. of Cancer: 84, supp.1, 3-10, 2001).
При создании гибридного белка ЭПО-(СТР)3, который является ближайшим аналогом заявляемых белков рекоибинантного ЭПО с пролонгированным действием, показано, что введение в молекулу ЭПО дополнительных сайтов O-гликозилирования также увеличивает время циркуляции гормона в организме (US 20070190610 А1). В состав гибридного белка ЭПО-(СТР)3 входят три C-концевых пептида β-субъединицы хорионического гонадотропина человека (СТР), каждый из которых содержит по четыре сайта O-гликозилирования (Intern. J. Cell Biology: 2011, ID 275063; US 20070190610 А1). Два СТР пептида расположены на С-конце молекулы ЭПО и один - на N-конце (US 20070190610 А1). Таким образом гибридный белок ЭПО-(СТР)3 имеет в отличие от ЭПО 12 дополнительных сайтов O-гликозилирования, что обеспечивает снижение клиренса и увеличение времени циркуляции ЭПО-содержащего белка в организме, по сравнению с ЭПО. При этом время полувыведения белка для ЭПО-(СТР)3 близко к аналогичному параметру α-дарбэпоэтина, а аффинность взаимодействия с ЭПО-рецептором не снижена.
Задача заявляемой группы изобретений - расширить арсенал белков на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающих пролонгированным действием, и разработать способ получения таких белков.
Поставленная задача решена путем получения
- гибридного белка EPO-TR 1,6, обладающего пролонгированным действием, соответствующего аминокислотной последовательности SEQ ID NO 4 и представляющего собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 1,6 белка MUC 1 человека;
- гибридного белка EPO-TR 4, обладающего пролонгированным действием, соответствующего аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5 и представляющего собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 4 белка MUC1 человека;
- гибридного белка EPO-TR 6, обладающего пролонгированным действием, соответствующего аминокислотной последовательности SEQ ID NO 6 и представляющего собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 6 белка MUC 1 человека и
- разработки способа получения гибридного белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 путем роллерного культивирования в подходящих условиях модифицированной линии клеток млекопитающих СНО, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 3 с последующим выделением гибридного белка из культуральной жидкости.
Заявляемые белки характеризуются тем, что не имеют лигандов на N-концевом участке молекулы ЭПО, а для создания дополнительных сайтов O-гликозилирования у заявляемых белков в качестве лиганда молекулы ЭПО использован фрагмент человеческого гликопептида MUC 1. Этот фрагмент представляет собой наиболее гликозилированный в молекуле MUC 1 пептидный участок (VNTR), состоящий из 20-120 повторов пептида TR. Каждый такой пептид TR состоит из 20 аминокислот и содержит пять потенциальных сайтов O-гликозилирования (Oncogene: 29, 20, 2893-2904, 2010; Glycobiology: 15 (2), 177-191, 2005). Заявляемые белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6 представляют собой ЭПО, слитый с фрагментами TR разной длины (1,6; 4 и 6, соответственно) на C-концевом участке молекулы ЭПО.
Этапы конструирования штаммов-продуцентов
Конструирование штаммов-продуцентов состоит из следующих этапов:
1. Получение генетических конструкций для экспрессии заявляемого белка EPO-TR 1,6 методом перекрывающейся полимеразной цепной реакции (SOE-PCR) с использованием в качестве матрицы структурной части гена ЭПО (NP_000790.2) и получение генетических конструкций для экспрессии заявляемого белка EPO-TR 4 или EPO-TR 6 путем полимеризации нуклеотидной последовательности мономерного пептида TR, содержащей на 5' и 3'-концах сайты рестрикции для эндонуклеаз II-го порядка BclI и BamHI, позволяющих получать полинуклеотидные фрагменты произвольной кратности.
2. Генетическая модификация клеточной линии СНО DG44 (Invitrogen, США), заключающаяся во встраивании в ДНК сайтов направленной интеграции гена интереса (FRT).
3. Конструирование экспрессионных векторов для получения заявляемых белков в клетках эукариот путем лигирования генетических конструкций в pcDNA5/FRT вектор (Invitrogen, США).
Штаммы-продуценты заявляемых белков СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 1,6 №1F7, СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 4 №1F7 и СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 6 №1F7 депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) и имеют номера: ВКПМ Н-136, ВКПМ Н-138 и ВКПМ Н-137, соответственно.
Способ в общем виде
Штамм-продуцент заявляемого белка ВКПМ Н-136 или ВКПМ Н-138 или ВКПМ Н-137 выращивают в виде адгезионной культуры в процессе роллерного культивирования. Для этого в роллерный флакон, площадью 850 см2, добавляют 250 мл культуральной среды ДМЕМ/F12 (ПанЭко, Россия), содержащей 8% фетальной сыворотки и 8 мМ L-глутамина, и засевают клетками штамма-продуцента в количестве 6,0-8,0×104 клеток на см2. Процесс культивирования проводят в течение 14 суток в CO2-инкубаторе с роллерной установкой в стандартных для адгезионных клеточных линий условиях: 5% CO2, температура 37°С, влажность не менее 90% и скорость 3-4 об/мин. Замену культуральной среды в роллерном флаконе на свежую того же состава проводят на 3, 5, 7, 9, 11, 14 сутки после посева штамма-продуцента. Собранные сливы культуральной жидкости освобождают от клеток центрифугированием в течение 20 мин при 400*g и хранят при температуре - 20°С до использования. Выход конечного продукта - белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 - составляет 20-40 мкг/мл.
Выделение заявляемого белка из культуральной жидкости проводят методом аффинной хроматографии (Аберкромби Д., Алленмарк С. и др. Аффинная хроматография. Методы: изд. Мир, 1988. - 278 с., под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла, пер. с англ. Б.А. Клящицкого). На первом этапе собранные 1500 мл культуральной жидкости размораживают, фильтруют через мембрану с номинальным отсечением 0,45 мкм (Миллипор, США), добавляют твин-20 до конечной концентрации 0,02% по объему и азид натрия до 0,04% по объему. Подготовленную таким образом культуральную жидкость медленно наносят при температуре 4°С на предварительно уравновешенную колонку с сефарозой CL - 2В (Sigma, США), объемом 70 мл, с иммобилизованными методом периодатного окисления моноклональными антителами ЭПО-1-3, специфичными к ЭПО (RU2451071).
По окончании сорбции и исчерпывающей отмывки колонки 10 мМ фосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,5 М хлорид натрия и 0,02% твина-20, осуществляют элюцию белка 200 мМ глициновым буфером с рН 2,2, содержащим 1М NaCl и твин-20 в концентрации 0,02%. Раствор элюированного белка, объемом 70-75 мл, немедленно нейтрализуют добавлением 700-750 мкл 3 М трисового буфера с рН 9,0. Выход выделенного белка EPO-TR 1,6 или ЕРО-TR 4 или EPO-TR 6 составляет не менее 70%.
Далее проводят ионообменную хроматографию выделенного белка на сорбенте MonoQ HR5/5 (Pharmacia, Швеция), в соответствии с методами выделения сиалированных изоформ ЭПО-содержащих рекомбинантных белков (US 20090092607; Биотехнология: №5, 38-59, 2012). Для этого полученный на первом этапе выделения раствор белка концентрируют до объема 3-5 мл, используя ячейки Amicon Ultra-15, при 4000tg в течение 15 мин и температуре 23°С. Полученный концентрат доводят до 50 мл 20 мМ трис-HCl буфером с рН 7,3 и повторно концентрируют до объема 5 мл таким же способом, а затем пропускают полученный концентрат через MonoQ HR5/5 со скоростью 0,5 мл/мин. Далее сорбент промывают 3 мл 20 мМ натрий ацетатного буфера с рН 4,5, для удаления слабосиалированных изоформ белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 с изоточками выше 4,5. Затем сорбент уравновешивают 3 мл 20 мМ трис-HCl буфера с рН 7,3 и элюируют фракцию сиалированных изоформ белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 градиентом ионной силы при 0,22-0,25 М хлорида натрия. Выход конечного продукта на данной стадии составляет 80-86% от нанесенного белка. Полученные таким образом образцы белков хранят при температуре -20°С в 0,05 М Na-фосфатном буфере с рН 7,4, содержащим 0,15 М хлорида натрия.
Изобретение иллюстрировано фигурами 1-4.
Фиг.1. Иммунохимическая характеристика заявляемых белков методом Вестерн блота с последующим проявлением моноклональными антителами к ЭПО (RU2451071) и конъюгата козьих анти-IgG(мыши) антител с пероксидазой.
- по вертикали:
маркеры молекулярного веса от 70 до 10 кД обозначены стрелками слева от фиг.1 (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Biorad, США);
по горизонтали:
треки разделяемых белков, а именно:
1 - маркеры молекулярного веса;
2 - EPO-TR 6;
3 - EPO-TR 4;
4 - EPO-TR 1,6.
На Фиг.2-4:
По оси Х - дни забора крови и измерения показателей:
А) процента ретикулоцитов среди эритроцитарных клеток (RET, %),
Б) общего гемоглобина крови экспериментальных животных (HGB, г/дл),
В) гематокрита крови экспериментальных животных (НСТ, %).
По оси Y - величина RET, % или НОВ, г/дл или НСТ, % (каждая точка представлена средним значением ± SD при p<0,05), обозначенные:
- сплошной линией с незаштрихованным прямоугольным маркером для α-дарбпоэтина;
- сплошной линией с круглым маркером для стандарта рекомбинантного эритропоэтина EPO-BRP («Erythropoietin BRP» (EPO-BRP, E1515000));
- прерывистой линией для контроля фосфатного буфера, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина.
Фиг.2. Результаты измерения показателей крови экспериментальных животных в период со 2 по 15 день после подкожного введения 30 пмоль гибридного белка EPO-TR 1,6 в сопоставлении со EPO-BRP и α-дарбпоэтином;
- сплошной линией с заштрихованным прямоугольным маркером для гибридного белка EPO-TR 1,6;
Фиг.3. Результаты измерения показателей крови экспериментальных животных в период со 2 по 15 день после подкожного введения 30 пмоль гибридного белка EPO-TR 4 в сопоставлении с EPO-BRP и α-дарбпоэтином;
- сплошной линией с заштрихованным прямоугольным маркером для гибридного белка EPO-TR 4;
Фиг.4. Результаты измерения показателей крови экспериментальных животных в период со 2 по 15 день после подкожного введения 30 пмоль гибридного белка EPO-TR 6 в сопоставлении с рекомбинантным ЭПО (EPO-BRP) и α-дарбпоэтином;
- сплошной линией с заштрихованным прямоугольным маркером для гибридного белка EPO-TR 6;
Пример 1. Получение генетических конструкций для экспрессии заявляемых белков.
Для экспрессии белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 в клетках млекопитающих СНО DG44 (FRT+/DHFR+) используют экспрессионный вектор pcDNA5/FRT (Invitrogen, США). Этот вектор содержит: 1. CMV промотер, обеспечивающий высокий уровень экспрессии; 2. FRT сайты для направленной интеграции целевого гена в геном клеток-продуцентов; 3. Ген устойчивости к гигромицину для селекции стабильных клеточных штаммов-продуцентов.
Генетическая конструкция для экспрессии белка EPO-TR 1,6 (SEQ ID NO:1) получена методом перекрывающейся полимеразной цепной реакции (SOE-PCR) с использованием в качестве матрицы структурной части гена ЭПО (NP_000790.2) (Molecular cloning: 3 ed, ext. 13.36, N-Y, 2001), а для экспрессии белков EPO-TR 4 (SEQ ID NO:2) или EPO-TR 6 (SEQ ID NO:3) - путем полимеризации мономерных пептидов TR, содержащего на 5' и 3'-концах сайты рестрикции для эндонуклеаз рестрикции II-го порядка BclI и BamHI (Биоорганическая химия, 26, 6, 423-432, 2000) с последующим лигированием в экспрессионный вектор pcDNA5/FRT, содержащий ген ЭПО.
Для подтверждения корректности структуры полученные нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 лигировали в клонирующий вектор pUC-57 (Invitrogen, США), используемый для трансформации клеток штамма E.coli ТОР10. Селекцию клонов E.coli TOP10 проводили по стандартной методике на чашках с X-gal/IPTG-агаром (blue/white - тест). Далее использовали процедуру секвенирования стандартными праймерами для вектора pUC-57. Затем, последовательность, кодирующую белок EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR6, вырезают по сайтам рестрикции, очищают в агарозном геле и лигируют в экспрессионный вектор pcDNA5/FRT.
Для получения генетической конструкции, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, методом перекрывающейся полимеразной цепной реакции (SOE-PCR) используют праймеры 1-4 (табл.1), (ЗАО «Евроген», Россия).
| Табл.1 | |
| Праймеры для конструирования SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 |
| Подчеркнутые последовательности нуклеотидов 2, 3 и 4 перекрываются при амплификации. Внесенные сайты рестрикции выделены курсивом, старт-кодон выделен жирным шрифтом, стоп-кодон помечен звездочкой. | ||
| № праймера | Нуклеотидная последовательность | Сайты рестрикции |
| 1 | 5'-TTT GCT AGC ATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC-3' | NheI |
| 2 | 5'-CAC TGG TCA CGC CAT GTG CTG GCG GTG CGG TTG АТС CGT CCC CTG TCC TGC-3' | |
| 3 | 5'-TGC GGT TGA TCC CGG TGC CGG ACG GGT АТС TGG AGC ACT GGT CAC GCC AT-3' | |
| 4 |
 |
XhoI |
| 5 | 5'-TTTT TGA TCA ACC GCA CGC CAG CAC ATG GCG TGA CCA GTG CT-3' | BclI |
| 6 | 5'-AAA AGG ATC CCG GTG CCG GAC GGG TAT CTG GAG CAC TGG TCA CGC CA-3' | BamHI |
| 7 |
 |
XhoI |
Для этого на первом этапе проводят 25 циклов амплификации с температурой отжига 47°С прямым праймером 1 и обратным праймером 2. Полученный и очищенный в агарозном геле продукт длиной 622 пар нуклеотидов (п.н.) используют для второго этапа амплификации с праймером 1 и обратным праймером 3 (25 циклов с температурой отжига 46°С). ПЦР продукт 657 п.н. используют для третьего этапа ПЦР с праймером 1 и обратным праймером 4 (25 циклов с температурой отжига 65°С). Полученный продукт SEQ ID NO:1 длиной 693 п.н. фосфорилируют с использованием ДНК киназы Т4 и лигируют по тупым концам в клонирующий вектор pUC-57 по сайту рестрикции SmaI для последующей идентификации. Идентифицированную конструкцию SEQ ID NO:1 вырезали из вектора pUC-57 по сайтам NheI и XhoI и лигируют в экспрессионный вектор pcDNA5/FRT, порезанный по тем же сайтам.
Полимеризацию мономерного пептида TR для генетических конструкций SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 осуществляют с использованием полученного ранее вектора pUC57-TR 1, в котором структура пептида фланкирована участками узнавания рестриктаз BclI и BamHI, позволяющими проводить полимеризацию мономера и получать полинуклеотидные фрагменты произвольной кратности (Биорган. химия: 26, 6, 423-432, 2000). Полученный в результате рестрикции из pUC57-TR 1 мономерный пептид TR, содержащий с 5' конца сайт рестрикции BclI, и с 3' конца сайт рестрикции BamHI достраивают комплементарными олигонуклеотидами с использованием праймеров 5 и 6 или 5 и 7 (Табл 1.), получая соответственно нуклеотидные последовательности TR 1 или TR 2. Последовательность TR1 клонируют в векторе pUC-57, идентифицируют и используют для полимеризации путем последовательных рестрикций - лигирования по BclI и BamHI.
Далее в эту лигазную смесь добавляют предварительно порезанную по BclI сайту и обработанную щелочной фосфатазой плазмиду pUC-TR 2, содержащую последовательность мономерного пептида TR со стоп-кодоном.
Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli. В последующем скрининге выбирают ДНК-вставки, содержащие 4 или 6 повторов пептида TR. Идентифицированные ДНК, содержащие последовательности полимеров TR 4 и TR 6, вырезают по сайтам рестрикции BclI и XhoI, очищают в агарозном геле и лигируют в экспрессионный вектор pcDNA5/FRT, содержащий ген человеческого эритропоэтина, по сайтам BamHI и XhoI.
В результате получают нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, длиной 693 п.н. или SEQ ID NO:2, длиной 828 п.н. или SEQ ID NO:3, длиной 948 п.н. и экспрессионный вектор pcDNA5/FRT, со встроенной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, предназначенный для получения штамма-продуцента гибридного белка EPO-TR 1,6, соответствующего аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 или EPO-TR 4 - аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 или EPO-TR 6, с аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, соответственно. Расчетный молекулярный вес экспрессируемых белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6, охарактеризованный в программе Vector NTI.10 (Invitrogen, США), составляет 21,2 кД, 25,8 кД и 29,5 кД, соответственно.
Пример 2. Получение генно-модифицированной клеточной линии СНО DG44 (FRT+/HFR+) и штаммов-продуцентов заявляемых белков.
Генно-модифицированную линию клеток СНО DG44 (FRT+/DHFR+) получают путем трансфекции линии клеток СНО DG44 (Invitrogen, США) вектором pFRT/LacZeo/DHFR, содержащим кассету генов: ген дегидрофолатредуктазы (DHFR), слитый ген β-галактозидазы и маркера устойчивости к зеоцину (LacZeo), под контролем промотера pSV40Δ гены, а также сайт специфической гомологичной рекомбинации для Flp рекомбиназы (FRT).
Вектор pFRT/LacZeo/DHFR получают путем лигирования в вектор pcDNA5(FRT)LacZeo2, несущий FRT-последовательность для связывания дрожжевой рекомбиназы и слитый ген LacZeo (Invitrogen, США), структурной части гена DHFR мыши, взятой из вектора pOptiVEC (Invitrogen, США), и промоторной области SV40 вектора pCI-neo (Promega).
По окончании этапа двухмаркерной селекции линии клеток СНО DG44 (FRT+/DHFR+) (устойчивость к зеоцину и восстановление фенотипа dhfi^) и восстановления ростовых характеристик выполняют процедуру клонирования. Для конструирования штаммов-продуцентов выбирают клон линии СНО DG44 (FRT+/DHFR+), обладающий лучшими показателями транскрипционной активности и стабильности экспрессии гена lacZeo. Штаммы, экспрессирующие белок EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6, получают в результате со-трансфекции линии СНО DG44 (FRT+/DHFR+) экспрессионным вектором pcDNA5/FRT, со встроенной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 (Пример 1), и плазмидой pOG44 (Invitrogen, США), несущей ген дрожжевой рекомбиназы, в соотношении 1:9. Селекцию и клонирование полученных штаммов проводят при концентрации гигромицина 600 мкг/мл. Метотрексат-зависимую амплификацию клонированных штаммов проводят при концентрациях метотрексата 250-1000 мкМ и поддерживающей дозе гигромицина 50 мкг/мл. Содержание заявляемых белков в к.ж. оценивают использованием ИФА на ЕРО (Эритропоэтин-ИФА-Бест, ЗАО «Вектор-Бест», Россия).
В результате получены модифицированная линия клеток млекопитающих СНО DG44 (FRT+/DHFR+) и штаммы СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 1,6 №1F7, СНО DG44 (FRT+/DHFR+) - EPO-TR 4 №1F7 и СНО DG44 (FRT+/DHFR+) - EPO-TR 1,6 №1F7.
Пример 3. Экспрессия и очистка заявляемого белка EPO-TR 1,6.
Для получения белка EPO-TR 1,6 проводят роллерное культивирование штамма-продуцента СНО DG44 (FRT+/DHFR+) EPO-TR 1,6 №1F7. Роллерные флаконы, площадью 850 см 2, засевают клетками штамма-продуцента в количестве 4,0 тыс. клеток на см2. Культивирование проводят в среде ДМЕМ /F12 (ПанЭко, Россия), содержащей 8% фетальной сыворотки. Объем среды составляет 250 мл. Процесс роллерного культивирования проводят в СО2-инкубаторе с роллерной установкой при 37°С, 5% CO2, влажности >90% и скорости 3-4 об/мин. Замену культуральной среды в роллерном флаконе на свежую того же состава проводят на 3, 5, 7, 9, 11, 14 сутки после посева штамма-продуцента. Собранные сливы культуральной жидкости (к.ж.) освобождают от клеток центрифугированием в течение 20 мин при 400*g и хранят при температуре - 20°С. Определение количественного содержания белка EPO-TR 1,6 в культуральной жидкости проводят методом иммуноферментного анализа (Эритропоэтин-ИФА-Бест, ЗАО «Вектор-Бест») (табл.2). Содержание белка EPO-TR 1,6 в полученной культуральной жидкости составляет 29 мг/мл.
Для выделения белка EPO-TR 1,6 полученные в результате роллерного культивирования 1500 мл культуральной жидкости размораживают и фильтруют через мембрану с номинальным отсечением 0,45 мкм (Миллипор С.А.). Затем добавляют твин-20 до конечной концентрации 0,02% по объему и азид натрия до 0,04% по объему.
Выделение белка осуществляют методом аффинной хроматографии. Для сорбции белка EPO-TR 1,6 подготовленную таким образом культуральную жидкость медленно наносят при температуре 4°С на предварительно уравновешенную колонку с сефарозой CL - 2В (Sigma, США), объемом 70 мл, с иммобилизованными моноклональными антителами ЭПО-1-3, специфичными к ЭПО (RU2451071). По окончании сорбции и исчерпывающей отмывки колонки 10 мМ фосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,5 М хлорид натрия и 0,02% твина-20, проводят элюцию белка EPO-TR 1,6 200 мМ глициновым буфером с рН 2,2, содержащим 1М NaCl и твин-20 в концентрации 0,02%. Раствор элюированного белка, объемом 71 мл, немедленно нейтрализуют добавлением 710 мкл 3 М трисового буфера с рН 9,0. Выход белка EPO-TR 1,6 после аффинной хроматографии составляет 79%.
Далее проводят ионообменную хроматографию выделенного EPO-TR 1,6 на сорбенте MonoQ HR5/5 (Pharmacia, Швеция), подготовленном в соответствии с инструкцией производителя. Для этого полученный на предыдущей стадии белок EPO-TR 1,6 концентрируют до объема 5 мл, используя ячейки Amicon Ultra-15, при 4000*g в течение 15 мин и температуре 23°С. Полученный концентрат доводят до объема 50 мл 20 мМ буфером трис-HCl с рН 7,3 и повторно концентрируют до объема 5 мл. Полученный объем пропускают через MonoQ HR5/5 со скоростью 0,5 мл/мин. Далее ионообменный сорбент промывают 3 мл 20 мМ натрий ацетатного буфера с рН 4,5, для удаления слабосиалированных изоформ белка EPO-TR 1,6 с изоточками выше 4,5.
| Табл.2 | |||
| Содержание белка EPO-TR 1,6 в к.ж. и в выделенном препарате | |||
| Клеточная линия штамма-продуцента | Содержание EPO-TR 1,6 в к.ж., мкг/мл | Содержание EPO-TR 1,6 в препарате после очистки, мг/мл | Молярная концентрация EPO-TR 1,6 в выделенном препарате, нМ/мл |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| СНО DG44(FRT+/DHFR+)-EPO-TR 1,6 | 29 | 2 | 35 |
Затем сорбент уравновешивают 3 мл 20 мМ трис-НСд буфера с рН 7,3 и элюируют фракцию кислых изоформ белка EPO-TR 1,6 при 0,22 М хлорида натрия. Объем элюата составляет 4 мл. Концентрацию очищенного белка EPO-TR 1,6 определяют методом Брэдфорд (BioRad Protein Assay, BioRad, США). Выделенная фракция кислых изоформ EPO-TR 1,6 составляет 86% от общего количества нанесенного на MonoQ HR5/5 белка EPO-TR 1,6. Очищенный образец белка EPO-TR 1,6 переводят в 0,05 М Na-фосфатный буферный раствор с рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl, доводя концентрацию белка в растворе до 2 мг/мл, и хранят при -20°С.
Иммунохимические свойства белка EPO-TR 1,6 характеризуют методом электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, по стандартному протоколу Лэммли с последующим Вестерн блотом. Белок переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм в течение 30 минут при 5 мА/см2 (Biorad, США). Далее нитроцеллюлозу с перенесенным белком инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч в растворе, содержащем 3% молока для иммунноблотинга (Biorad, США), затем инкубируют с моноклональными антителами мыши к ЭПО 2А1 (RU2451071) в течение 2 ч, с последующей 3-кратной отмывкой фосфатным буфером с рН 7,2, содержащим 0,05% твина-20. Иммуноспецифическое проявление белка EPO-TR 1,6 выявляют после 2 ч инкубации с пероксидазным конъюгатом моноклональных антител козы к иммуноглобулину мыши (ООО «Сорбент», Россия) в разведении 1:3000 с использованием хромогенной субстратной смеси с тетраметилбензидином (Sigma, США).
Результаты идентификации белка EPO-TR 1,6 в Вестерн блоте представлены на Фиг.1, трек 4. Заявляемый белок EPO-TR 1,6 характеризуется молекулярной массой 55 кД, рассчитанной по маркерам молекулярного веса (Biorad, США), превышающей расчетный вес 21,2 кД (см. Пример 1), что свидетельствует о гликозилированности экспрессируемого белка.
Пример 4. Экспрессия и очистка заявляемого белка EPO-TR 4.
Получение белка EPO-TR 4 проводят так же, как белка EPO-TR 1,6 (пример 3), но с использованием штамма СНО DG44 (FRT+/DHFR+) EPO-TR 4 №1F7. При этом содержание белка EPO-TR 4 в полученной к.ж. составляет 20 мкг/мл.
Выделение белка EPO-TR 4 из к.ж. осуществляют аналогично процедуре, приведенной в примере 3, но получают 74 мл элюированного белка, который нейтрализуют добавлением 740 мкл 3 М трисового буфера с рН 9,0. Выход очищенного EPO-TR 4 после аффинной хроматографии составляет 76%.
Полученный раствор белка EPO-TR 4 концентрируют до объема 3 мл, используя ячейки Amicon Ultra-15, как в примере 3. Концентрат доводят до 50 мл 20 мМ буфером трис-HCl с рН 7,3 и повторно концентрируют до объема 3 мл. Ионообменную хроматографию выделенного EPO-TR 4 проводят аналогично процедуре, приведенной в примере 3. Выделенная фракция кислых изоформ EPO-TR 4 составляет 83% от общего количества нанесенного на MonoQ HR5/5 белка EPO-TR 4.
| Табл.3 | |||
| Содержание белка EPO-TR 4 в к.ж. и в выделенном препарате | |||
| Клеточная линия штамма-продуцента | Содержание EPO-TR 4 в к. ж., мкг/мл | Содержание EPO-TR 4 в препарате после очистки, мг/мл | Молярная концентрация EPO-TR 4 в выделенном препарате, нМ/мл |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 4 | 20 | 2 | 33 |
Иммунохимические свойства белка EPO-TR 4 определяют как описано в примере 3. Результаты идентификации EPO-TR 4 представлены на Фиг.1, трек 3. Заявляемый белок EPO-TR 4 характеризуется молекулярной массой 60 кД, рассчитанной по маркерам молекулярного веса (Biorad, США), превышающей расчетный вес 25,8 кД (см. Пример 1), что свидетельствует о гликозилированности экспрессируемого белка.
Пример 5. Экспрессия и очистка заявляемого белка EPO-TR 6.
Получение белка EPO-TR 6 проводят так же, как в примере 3, но с использованием штамма-продуцента СНО DG44 (FRT+/DWR+) EPO-TR 6 №1F7. При этом содержание гибридного белка EPO-TR 6 в полученной к.ж. составляет 21 мкг/мл. Выделение белка EPO-TR 6 из к.ж. осуществляют аналогично примеру 3, но получают 75 мл элюированного белка, который нейтрализуют добавлением 750 мкл 3 М трисового буфера с рН 9,0. Выход EPO-TR 6 после аффинной хроматографии составляет 73%.
Полученный раствор белка EPO-TR 6 концентрируют до объема 3 мл, используя ячейки Amicon Ultra-15, и проводят ионообменную хроматографию выделенного EPO-TR 6, как описано в примерах 3. Выделенная фракция кислых изоформ EPO-TR 6 составляет 87% от общего количества нанесенного на MonoQ HR5/5 белка EPO-TR 6.
| Табл.4 | |||
| Содержание EPO-TR 6 в к.ж. и в выделенном препарате | |||
| Клеточная линия штамма-продуцента | Содержание EPO-TR 6 в к.ж., мкг/мл | Содержание EPO-TR 6 в препарате после очистки, мг/мл | Молярная концентрация EPO-TR 6 в выделенном препарате, нМ/мл |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| СНО DG44 (FRT+/DHFR+)-EPO-TR 6 | 21 | 2 | 28 |
Иммунохимические свойства белка EPO-TR 6 характеризуют как описано в примере 3.
Результаты идентификации EPO-TR 6 представлены на Фиг.1, трек 2. Заявляемый белок EPO-TR 6 характеризуется молекулярной массой 70 кД, рассчитанной по маркерам молекулярного веса (Biorad, США), превышающей расчетный вес 29,5 кД (см. Пример 1), что свидетельствует о гликозилированности экспрессируемого белка.
Пример 6. Оценка биологической активности заявляемых белков in vitro.
Биоактивность in vitro заявляемого белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 определяют по их способности связываться с рецептором ЭПО и таким образом инициировать пролиферацию чувствительной к ЭПО клеток линии UT-7/EPO. Скорость пролиферации клеток линии UT-7/EPO пропорциональна количеству гормона ЭПО (или его модификации), добавленного в среду (Blood, 1993, Vol 82, pp 456-464). Скорость пролиферации определяют с помощью колориметрического теста. Метод основан на реакции восстановления бесцветных тетразолиевых солей с образованием окрашенного соединения - формазана. Восстановление солей тетразолиума происходит только под воздействием ферментативной активности живых клеток - сукцината дегидрогеназы. Степень окрашивания пропорциональна количеству живых клеток и позволяет измерить степень клеточной пролиферации (Mosmann Т., J.Immunol.Methods, 1983, 65(1-2), Р. 55-63). В качестве субстрата для ферментативной реакции используют реакционную смесь для колориметрического измерения пролиферации клеток фирмы Promega (CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay), содержащую 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолиум (MTS) и феназин метосульфат (PMS) (Promega, Madison, WI, USA).
В качестве стандарта используют препарат рекомбинантного эритропоэтина человека - EPO-BRP.
Клетки линии UT-7/EPO выращивают в среде IMDM (ПанЭко, Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% фетальной сыворотки (Invitrogen, США) и 1 МЕ/мл рекомбинантного ЭПО. Непосредственно перед проведением теста клеткам заменяют питательную среду на свежую без добавления ЭПО и инкубируют 24 часа для истощения концентрации гормона ЭПО в клетках. Истощенные таким образом клетки рассаживают в 96-луночном планшете (2*103 клеток/на лунку) в 75 мкл среды IMDM с 0,5% фетальной сыворотки. Далее в те же лунки добавляют по 25 мкл среды, содержащей от 0 до 500 пикомолей (пкМ) одного из заявляемых гибридных белков или стандарта рекомбинантного ЭПО. Планшеты со стимулированными клетками инкубируют в течение 72 часов при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. Далее к клеткам добавляют по 20 мкл субстрата. Цветная реакция развивается в течение 2-х часов при 37°С, и поглощение (А) измеряют при длине волны 490 нм.
Расчет показателя ED50 (табл.5), который представляет собой концентрацию белка, вызывающую 50%-ый уровень пролиферации чувствительных клеток, производят в программе GraphPad PRISM.
| Таблица 5 | |
| ED50 для стандарта рекомбинантного эритропоэтина EPO-BRP и заявляемых белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6 | |
| Вид ЭПО-содержащего белка | ED50 (пкМ) |
| EPO-BRP | 18,18±1,09 |
| EPO-TR 1.6 | 8,18±1,12 |
| EPO-TR 4 | 8,656±1,07 |
| EPO-TR 6 | 10,01±1,14 |
Представленные в табл.5 данные позволяют заключить, что все заявляемые белки способны взаимодействовать с клеточными рецепторами к ЭПО и вызывать ЭПО-зависимую пролиферацию чувствительных клеток UT-7/EPO. Сопоставление величин ED50 для стандарта рекомбинантного ЭПО и заявляемых белков показывает, что для достижения одного и того же пролиферативного эффекта требуется значительно большее количество стандартного рекомбинантного ЭПО, чем заявляемых белков.
Таким образом, заявляемые белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6 обладают функциональными свойствами рекомбинантного ЭПО человека, то есть способны взаимодействовать с рецепторами к ЭПО и вызывать пролиферацию клеток in vitro.
Пример 7. Оценка биологической активности заявляемых белков in vivo.
Для оценки биологической активности гибридных белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6 in vivo используют в качестве модели мышей линии Balb/c (Brazilian Journal of Medical and Biological Research: 36, 1561-1569, 2003).
Каждый из заявляемых белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 или EPO-TR 6 вводят подкожно группе из восьми животных. Объем введенного белка составляет 0,5 мл. Содержание биологически активного белка во введенном препарате составляет от 0,075 до 0,3 мкг в 1 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7,2), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Данный диапазон концентраций позволяет получать линейную зависимость между количеством ретикулоцитов и дозой белка. Тот же буферный раствор с альбумином вводят подкожно контрольной группе животных.
Для построения калибровочной кривой отдельной группе животных вводят по 160, 80, 40 или 20 МЕ/мл стандарта рекомбинантного EPO-BRP. По истечении 4-х дней со дня инъекций в крови подопытных животных измеряют число ретикулоцитов в крови животных, взятой из орбитального синуса в пробирку с этилендиаминдиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (Microvette-200 ЭДТА, Sarstedt, Германия), и их процентное отношение к количеству зрелых эритроцитов (RET, %). Количественное определение гемопоэтической активности заявляемых белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 или EPO-TR 6 в сравнении со стандартом рекомбинантного ЭПО проводят с использованием проточного гемоцитометра-анализатора ADVIA 120 (Bayer-Siemens) и программы обработки данных Multispecies Software 2120.
| Табл.6 | |
| Удельная биологическая активность заявляемых гибридных белков в сопоставлении со стандартом рекомбинантного ЭПО | |
| Вид ЭПО-содержащего белка | Удельная активность белка, МЕ/мг |
| EPO-BRP | 141120 |
| EPO-TR 1,6 | 648972±37264 |
| EPO-TR 4 | 1507278±22722 |
| EPO-TR 6 | 2399464±27643 |
Результаты, представленные в табл.6, показывают, что биологическая активность белка EPO-TR 1,6 в четыре раза, белка EPO-TR 4 - в десять раз, а белка EPO-TR 6 - в 15 раз выше удельной биологической активности рекомбинантного ЭПО. Таким образом, заявляемые гибридные белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 или EPO-TR 6 in vivo характеризуются более высоким потенциалом стимуляции эритропоэза, чем рекомбинантный ЭПО.
Пример 8. Оценка стимуляции проесса кроветворения заявляемыми белками in vivo.
Для оценки биологических свойств белка Е PO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 проводят измерение основных показателей стимуляции гемопоэза в течение 15 дней после однократного подкожного введения группе из 8 экспериментальных животных 0,5 мл раствора, содержащего 0,05 М Na-фосфатный буфер с рН 7,4; 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 300 пкМ белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6. Контролями служат 8 экспериментальных животных после подкожного введения 0,5 мл раствора, содержащего 300 пкМ EPO-BRP или 300 пкМ α-дарбпоэтина, а также 8 животных после подкожного введения такого же буферного раствора, но не содержащего ни один биологически активный белок. Ежедневно в течение 15 дней после начала экспериментов в крови модельных животных измеряют уровень ретикулоцитов (RET), гемоглобина (HGB) и гематокрита (НСТ). Измерение параметров гемопоэза проводят в проточном гемоцитометре-анализаторе ADVIA 120 (Bayer-Siemens, Германия).
Результаты эксперимента, представленные на Фиг.2-4, показывают наличие эффекта стимуляции процесса кроветворения белками EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 и EPO-TR 6, которое выражается в увеличении числа ретикулоцитов после инъекции, достигающее максимума на 4-е сутки (А), повышении показателей гемоглобина (Б) и гематокрита (В) и сохраняется в течение 8-12 дней. Следует отметить, что при введении EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 или EPO-TR 6 измеренные уровни гемоглобина и гематокрита достоверно выше, чем у эквимолярной дозы стандарта рекомбинантного эритропоэтина EPO-BRP. Кроме того, способность вызывать гемопоэтический ответ у белков EPO-TR 1,6, EPO-TR 4 или EPO-TR 6, в отличие от EPO-BRP, сохраняется в течение не менее 8 дней, что свидетельствует о наличии у заявляемых белков пролонгированных свойств. Сопоставление результатов эксперимента, полученных при введении равных доз EPO-TR 1,6, EPO-TR 4, EPO-TR 6 и α-дарбпоэтина, известного высокой способностью к пролонгации, показывает, что на протяжении 7 суток заявляемые белки и α-дарбпоэтин вызывают сопоставимые изменения показателей гемопоэза, а на 8 сутки α-дарбпоэтин оказывает более слабое воздействие на процесс кроветворения, чем EPO-TR 1,6, EPO-TR 4, EPO-TR 6.
Таким образом, заявляемые белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4, EPO-TR 6 обладают по сравнению со стандартом рекомбинантного эритропоэтина большим потенциалом для коррекции гемопоэза, сопоставимым с аналогичными свойствами α-дарбпоэтина.
Пример 9. Оценка фармакокинетических свойств заявляемых белков.
Исследование длительности циркуляции белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 in vivo проводят на линии мышей Balb/c. Шести модельным животным вводят в хвостовую вену по 0,25 мл раствора, содержащего по 0,05 М Na-фосфатный буфер с рН 7,4; 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 60 пкМ/кг веса животного белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6. Контролями служат 6 экспериментальных животных после подкожного введения 0,5 мл раствора, содержащего 60 пкМ/кг стандарта EPO-BRP или 60 пкМ/кг α-дарбпоэтина, а также 6 животных после подкожного введения такого же буферного раствора, но не содержащего ни один биологически активный белок. Измерение уровней всех содержащих ЭПО белков в сыворотке крови экспериментальных животных проводят через 5, 60, 120, 360, 480 минут после инъекции методом ИФА в системе Эритропоэтин-ИФА-Бест (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), используя индивидуальные для каждого белка калибровочные кривые.
Для расчета параметров, характеризующих динамику циркуляции и выведения (элиминации) ЭПО-содержащих белков из организма экспериментальных животных, используют общепринятый подход построения кинетической кривой первого порядка для однокамерной модели - Ct=С0*ехр(-K el*t) (Current Clinical Pharmacology: 1, 5-20, 2006; The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics: 282, 520-527, 1997),
где Ct - концентрация белка через время t после его введения экспериментальному животному;
С0 - концентрация белка при t=0;
К el - постоянная скорость элиминации.
Расчет скорости элиминации K el, площади под кинетической кривой AUC и времени полувыведения t ½ для каждого из белков проводят по следующим формулам:
K el=(In С0-In Ct),
AUC=C0/K el,
t½=0,693/K el, где
AUC - величина площади под фармакокинетической кривой,
t½ - время полувыведения белка из организма.
Представленные в табл.7 данные иллюстрируют различия в динамике циркуляции белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 по сравнению со стандартом рекомбинантного эритропоэтина EPO-BRP и α-дарбпоэтином в крови экспериментальных животных.
Как видно из приведенных в табл.7, время полувыведения гибридных белков из организма экспериментальных животных более 2,3 ч, соответствующих времени полувыведения стандарта рекомбинантного эритропоэтина, а скорость элиминации в 10 раз ниже, чем у стандарта рекомбинантного эритропоэтина. Гибридные белки EPO-TR 1,6, EPO-TR 4, EPO-TR 6, в отличие от EPO-BRP, обладают пролонгированными свойствами, схожими со свойствами α-дарбпоэтина.
| Табл.7 | ||||
| Сравнительные фармакокинетические показатели белка EPO-TR 1,6 или EPO-TR 4 или EPO-TR 6 и контролей EPO(BRP) и α-дарбпоэтина | ||||
| Доза, рмоль/кг | KI, рмоль/ч | AUC, рмоль*ч/ml | T½, ч | |
| ЕРО (BRP) | 60 | 0,31 | 0,21 | 2,3 |
| EPO-TR 1,6 | 60 | 0,091 | 1,1 | 7,6 |
| EPO-TR 4 | 60 | 0,047 | 2,55 | 14,7 |
| EPO-TR 6 | 60 | 0,047 | 2,54 | 14,4 |
| α-дарбпоэтин | 60 | 0,56 | 2,13 | 13 |
Таким образом, показано, что заявляемые белки
- обеспечивают стимуляцию образования предшественников эритроцитов-ретикулоцитов у экспериментальных животных и обладают способностью эффективно корректировать процесс кроветворения;
- обладают более высокой, чем стандарт рекомбинантного эритропоэтина EPO(BRP), биологической активностью, рассчитанной по числу ретикулоцитов в крови экспериментальных животных на 4 сутки после введения гибридного белка;
- уровень стимуляции гемопоэза заявляемыми белками намного превышает эффективность стандарта рекомбинантного эритропоэтина EPO(BRP) и сопоставим с эффективностью α-дарбпоэтина;
- оценка фармакокинетических параметров показывает, что заявляемые белки обладают пролонгированным действием. При этом время циркуляции в организме экспериментальных животных у гибридного белка EPO-TR 1,6 в 3 раза больше, чем у стандарта рекомбинантного эритропоэтина EPO(BRP), а фармакинетические параметры гибридных белков EPO-TR 4 и EPO-TR 6 намного превышают аналогичные показатели EPO(BRP) и сопоставимы с параметрами α-дарбпоэтина;
- разработан способ получения заявляемых белков путем культивирования сконструированных штаммов-продуцентов в подходящих условиях с последующим выделением их из культуральной жидкости методами аффинной и ионообменной хроматографии.
Claims (4)
1. Гибридный белок ЕРО-TR 1,6 на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO4 и представляющий собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 1,6 белка MUC1 человека.
2. Гибридный белок EPO-TR 4 на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO5 и представляющий собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 4 белка MUC1 человека.
3. Гибридный белок EPO-TR 6 на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO6 и представляющий собой рекомбинантный эритропоэтин человека, слитый с фрагментом TR 6 белка MUC1 человека.
4. Способ получения гибридного белка по п.п.1 или 2 или 3 путем роллерного культивирования в подходящих условиях модифицированной линии клеток млекопитающих СНО, содержащей кодирующую этот белок нуклеотидную последовательность SEQ ID NO1 или SEQ ID NO2 или SEQ ID NO3 с последующим выделением гибридного белка из культуральной жидкости.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013105752/10A RU2515914C1 (ru) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013105752/10A RU2515914C1 (ru) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2515914C1 true RU2515914C1 (ru) | 2014-05-20 |
Family
ID=50778847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013105752/10A RU2515914C1 (ru) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2515914C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2696864C1 (ru) * | 2018-09-24 | 2019-08-07 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ профилактики нарушений микроциркуляции в почках асиалированным эритропоэтином в эксперименте |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7217689B1 (en) * | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| RU2433134C1 (ru) * | 2010-10-06 | 2011-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФОРТ" | Эритропоэтин, конъюгированный с полиэтиленгликолем |
| RU2467761C2 (ru) * | 2005-09-28 | 2012-11-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Лечение нейродегенеративных расстройств |
-
2013
- 2013-02-12 RU RU2013105752/10A patent/RU2515914C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7217689B1 (en) * | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| RU2467761C2 (ru) * | 2005-09-28 | 2012-11-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Лечение нейродегенеративных расстройств |
| RU2433134C1 (ru) * | 2010-10-06 | 2011-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФОРТ" | Эритропоэтин, конъюгированный с полиэтиленгликолем |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2696864C1 (ru) * | 2018-09-24 | 2019-08-07 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ профилактики нарушений микроциркуляции в почках асиалированным эритропоэтином в эксперименте |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101229995B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| KR100467751B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| AU2007254141B2 (en) | Erythropoietin compositions | |
| BRPI0711898A2 (pt) | composiÇço de proteÍna da eritropoietina substancialmente homogÊnea, composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodos de aumentar hematàcrito em um mamÍfero, e de produzir uma composiÇço de eritropoietina | |
| JPH07138292A (ja) | マウス白血病抑制因子 | |
| WO2006081249A2 (en) | Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life | |
| EA018037B1 (ru) | Способ повышения уровней эритроцитов | |
| CZ49197A3 (cs) | Čištěný a izolovaný polypeptid, jeho použití, DNA sekvence pro jeho expresi a farmaceutická kompozice | |
| JP2004515246A (ja) | 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 | |
| JP2009517009A (ja) | エリスロポエチンポリペプチド及びそれらの使用 | |
| KR20030044272A (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| JP2002509691A (ja) | 生物学的活性が改変された組換えタンパク質多量体の製造及び使用 | |
| RU2515914C1 (ru) | Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения | |
| US11421009B2 (en) | Pharmaceutical composition containing, as active ingredient, granulocyte-colony stimulating factor mutant protein or transferrin fusion protein thereof | |
| JP3646927B2 (ja) | 生体内血小板増殖効能が向上した新規なヒトトロンボポイエチン誘導体 | |
| EP2897634B1 (en) | Double mutant coagulation factor viii and methods thereof | |
| KR101330033B1 (ko) | 인간 과립구 콜로니 자극 인자(ｇ-ｃｓｆ)의 변이체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학 조성물 | |
| Gavrilova et al. | Haemopoetic Activity and Pharmacokinetics of EPO-Fc, EPO-Fcneo and Alb-EPO Fused Proteins, Derivatives of Human Erythropoietin | |
| RU2805879C1 (ru) | Штамм линии клеток яичника китайского хомячка | |
| RU2819866C2 (ru) | Вектор экспрессии, эукариотический штамм продуцент и способ получения дарбэпоэтина альфа | |
| KR100389141B1 (ko) | 인간 에리스로포이에틴을 고효율로 발현하는 재조합세포주 및 이의 제조방법 | |
| US20120129770A1 (en) | Novel polynucleotide molecules for enhanced gene expression | |
| US20140271603A1 (en) | Method for preparing human factor h | |
| KR20010080883A (ko) | Ｐｒｖ-1 유전자 및 이의 용도 | |
| ZA200202379B (en) | The PRV-1 gene and use thereof. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |