JP4611280B2 - 下等真核生物におけるn−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼiii発現 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許出願第10/371,877号(2003年2月20日出願)の一部部継続出願である米国特許出願第10/680,963号の優先権を主張する。上記’877号は、米国特許出願第09/892,591号(2001年6月27日出願)の一部継続出願であり、この’591号は、米国仮特許出願第60/214,358号(2000年6月28日出願)、米国仮特許出願第60/215,638号(2000年6月30日出願)、および米国仮特許出願第60/279,997号(2001年3月30日出願)の、米国特許法第119条(e)項に基づく利益を主張している。これらの各々は、その全体が本明細書に参考として援用される。本願はまた、PCT/US02/41510(2002年12月24日出願)の一部継続出願であり、このPCT/US02/41510は、米国仮特許出願第60/344,169号(2001年12月27日出願)の利益を主張している。これらの各々は、その全体が本明細書に参考として援用される。
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞(例えば、真菌または他の真核生物細胞)が、動物細胞により生成される糖タンパク質のグリコシル化に類似したグリコシル化のパターンを有するグリコシル化タンパク質(糖タンパク質)を生成するように遺伝的に改変され得る方法および組成物に関する。
DNAが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは糖残基の結合、グリコシル化として知られるプロセスを含む。異なる生物は異なるグリコシル化酵素(グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ)を生産し、利用可能な異なる基質(ヌクレオチド糖)を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、その場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する(Moens and Vanderleyden,1997 Arch Microbiol.168(3):169−175)。繊維状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高マンノース」タイプのグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)は、さらにもう1つの方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等真核生物においては、裸のオリゴ糖側鎖をトリミングして、いくつかのマンノース残基を除去し、典型的には、下等真核生物のN−グリカンでは見られないさらなる糖残基で延長される。例えば、R.K.Bretthauer,et al.Biotechnology and Applied Biochemistory,1999,30,193−200;W.Martinet,et al.Biotechnolgy Letters,1998,20,1171−1177;S.Weikert,et al.Nature Biotechnology,1999,17,1116−1121;M.Maliassard,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,267,169−173;Jarvis,et al.,Current Opinion in Biotechnology,1998,9:528−533;およびM Takeuchi,1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology,1997,9,S29−S35参照。
動物糖タンパク質のN−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および繊維状真菌で生産される糖タンパク質では見出されない。ヒトにおいては十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体(例えば、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−N−アセチルノイラミン酸、UDP−ガラクトース、GDP−フコース等)がサイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される(Sommers and Hirschberg,1981 J.Cell Biol.91(2):A406−A406;Sommers and Hirschberg 1982 J.Biol.Chem.257(18):811−817;Perez and Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709−715)。
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ(例えば、マンノシダーゼ)は、ERおよびゴルジ装置の内部(ルミナル)表面をライニングし、それにより、それがERおよびゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触媒」表面を提供する。シス、メジアルおよびトランスのゴルジの多数区画ならびにトランス−ゴルジネットワーク(TGN)は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはTGNにおいてERにおける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特異的炭水化物構造が合成され得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各オルガネラに保持し、係留する正確なメカニズムを明らかにするために多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証拠は、ステム領域、膜にわたる領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素を個々のオルガネラの膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその座に局在化することを示唆する(例えば、Gleeson,P.A.(1998)Histochem.Cell Biol.109,517−532参照)。
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療用タンパク質の推定70%がグリコシル化され、かくして、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化できる生産システム(すなわち、宿主細胞)に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が(1)免疫原性、(2)薬物動態学特性、(3)トラフィッキングおよび(4)治療用タンパク質の効率を決定することにおいて重要な役割を演じることを示している。かくして、製薬産業によるかなりの努力は、できる限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロセスを開発することに向けられてきた。今日、ほとんどの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化(すなわち、シアル酸の末端添加)の程度を増強させるそのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含むことができ、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが知られている。別法として、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのヌクレオチド糖(例えば、2,3−シアリルトランスフェラーゼおよびCMP−シアル酸)を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良することができる。
小胞体におけるタンパク質に移動されたコアオリゴ糖構造は基本的には哺乳動物および下等真核生物で同一であるが、実質的な差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こるその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よりも優れた注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。
α−1,2−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物において複合型N−グリカン形成のための主な中間体であるMan5GlcNAc2を形成するためのMan8GlcNAc2のトリミングで必要である。以前の研究は、切形されたマウス、真菌およびヒトα−1,2−マンノシダーゼがメチロトロピック酵母P.Pastorisで発現され得、Man8GlcNAc2からのMan5GlcNAc2へのトリミング活性を呈することができることを示した(Lal et al.,Glycobiology 1998 Oct;8(10):981−95;Tremblay et al.,Glycobiology 1998 Jun;8(6):585−95,Callewaert et al.(2001)FEBS Lett.503(2−3):173−8)。しかしながら、今日、P.pastorisからの分泌された糖タンパク質でのMan8GlcNAc2からMan5GlcNAc2への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(「GnT」)は、分泌経路においてN結合型オリゴ糖を修飾するグリコシル化酵素のもう1つのクラスに属する。このようなグリコシルトランスフェラーゼは、特定の糖ヌクレオチドドナーに由来する単糖を、2つのあり得るアノマー結合のうちの1つ(αまたはβのいずれか)において、伸長しているグリカン鎖における単糖の特定のヒドロキシル位置に転位することを触媒する。Dennis et al.(1999)Bioessays 21(5):412−21。特定のGnTは、N−アセチルグルコサミン(「GlcNAc」)を、N−グリカン基質(例えば、Man5GlcNAc2(「マンノース−5コア」)およびMan3GlcNAc2(「内部コア構造」))のManα1,6アームまたはManα1,3アームに付加する。その反応生成物(例えば、GlcNAcMan5GlcNAc2またはGlcNAc2Man3GlcNAc2)は、次いで、バイアンテナリーN結合型オリゴ糖構造、トリアンテナリーN結合型オリゴ糖構造、およびテトラアンテナリーN結合型オリゴ糖構造に修飾され得る。
哺乳動物(特に、ヒト)における糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応を行うことが可能な遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する宿主細胞および細胞株を開発した。これらの操作された宿主において発現される組換えタンパク質は、それらの哺乳動物に、実質できに同一ではないかもしれないが、より類似している糖タンパク質(例えば、ヒト対応物)を与える。本発明の宿主細胞(例えば、培養下で増殖される下等真核微生物および他の非ヒト真核生物宿主細胞)は、N−グリカン(例えば、バイセクト型N−グリカン、またはヒトグリコシル化経路に沿って生成される他の構造)を生成するように改変される。この結果は、例えば、真菌糖タンパク質に特徴的な望ましくない構造を作り出す酵素を発現せず、例えば、「ヒト様」糖タンパク質を生成し得る異種酵素を発現する株の操作および/または選択の組み合わせを使用して達成される。
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質化学および核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に関与する1以上の酵素を天然では発現しない、またはそれを発現しないようにされている真核生物宿主細胞は出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な1以上の酵素、または他の因子を発現するように作製される。所望の宿主株は、一度に1つ以上の酵素を発現するように操作することができる。加えて、1以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素(例えば、異種細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素)をコードする核酸分子のライブラリーを(例えば、酵素断片を含むサブ−ライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって)創製し、最も最適な活性を持つ1以上の酵素を有する、またはほとんどの「ヒト様」糖タンパク質を生産する株は、ライブラリーの1以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって選択することができる。
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト様N−グリカン構造を有する糖タンパク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がMan5GlcNAc2で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、高マンノース構造の生産に関与する1以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いられる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して作製することができるか、あるいはそれから得ることができる。かくして、選択された宿主細胞に応じて、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが知られた酵素をコードする1つのまたは多数の遺伝子を欠失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は多数の下等真核生物(例えば、S.cerevisiae、T.reesei、A.nidulana等)において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを供する。これらの遺伝子はマンノシルトランスフェラーゼ、例えば、1,3マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeにおけるMNN1(Graham、1991)1,2マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeからのKTR/KREファミリー)、1,6−マンノシルトランスフェラーゼ(S.cerevisiaeからのOCH1)、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター(S.cerevisaeからのMNN4およびMNN6)および異常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを持つ生きた表現型を生起させる。その例は、表1に示される。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ、すなわちMan3GlcNAc2コア構造のα−1,3アーム上で外部鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素の活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の操作または使用を含む。S.cerevisiaeにおいて、この酵素はOCH1遺伝子によってコードされる。S.cerevisiaeにおけるOCH1遺伝子の破壊の結果、N結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチはOCH1の不活化を必要とした(例えば、Chibaら(1998)J.Biol.Chem.273:26298−304参照)。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、(選択された宿主細胞に応じて)、任意であり得る。というのはOch1p酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために無傷のMan8GlcNAc2を必要とするからである。かくして、7以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Och1pに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化N−グリカンを生産することができる(例えば、Nakayamaら(1997)FEBS Lett.412(3):547−50参照)。
本発明は、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性(全長の酵素、そのホモログ、改変体、誘導体、および触媒的に活性なフラグメントを含む)を発現することによって、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞(例えば、P.pastoris)は、例えば、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の活性化によってかまたはN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の核酸分子から発現することによって、よりヒト様のN−グリカンを生成するために操作される。当該分野で周知の技術を使用して、遺伝子特異的プライマーは、GnTIII遺伝子、好ましくは、哺乳動物GnTIII遺伝子(例えば、マウスGnTIII)の相同な領域に相補的であるように設計される(図24)。これらの配列は、当該分野で容易に入手可能であり(例えば、Genbank登録番号L39373)、PCR増幅される。
本発明の好ましい宿主細胞は下等真核生物細胞、例えば、酵母、単細胞および多細胞または繊維状真菌である。しかしながら、広く種々の宿主細胞が本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質を発現するように操作することができる。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク質を発現させることができる。当業者が認識するように、(ヒト細胞を含めた)任意の真核生物宿主細胞は本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、1以上のキメラタンパク質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿主細胞において、細胞下位置、例えば、オルガネラに標的化される。そのようなタンパク質は、好ましくは、必ずしもそうではないが、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵素である。いずれのタンパク質コード配列も標的化し、本明細書中に記載された方法を用い、真核生物宿主細胞において修飾された活性につき選択することができることが予測される。
複合型N−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構造に結合される連続的プロセスである。高等真核生物においては、これは、種々のプロセシング酵素に連続的に暴露された基質を有することによって達成される。これらの酵素は、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置において特異的反応を行う。この「組立てライン」はER、初期、メディアルおよび後期ゴルジ、およびトランスゴルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジおよびERにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター)が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それらの環境ならびに経路における他の酵素に対して最も効果的に機能するような位置に特異的に標的化されなければならない。
DNA配列情報を用い、当業者はGnT活性をコードするDNA分子をクローン化することができる(例えば、実施例3、8、11、15および18)。当業者によく知られた標準的な技術を用い、GnTI、II、III、IVまたはVをコードする(またはその触媒的に活性な断片をコードする)核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択された宿主細胞、例えば、Pichia sp.、Kluyveromyces種およびAspergillus種のような真菌宿主において転写を駆動することができる他の発現制御配列の転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入することができ、従って、これらの哺乳動物GnT酵素の1以上を、ヒト様複合型糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させることができる(例えば、実施例8、20、および21)。
ゴルジにおいて満足して機能するグリコシルトランスフェラーゼについては、酵素は、新成糖タンパク質に付加される糖部位の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体(例えば、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−N−アセチルノイラミン酸、UDP−ガラクトース等)は、一般には、サイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される。
発現された配列タグデータベース(dbEST)における相同性サーチを介して認識されたヒトUDP−N−アセチルグルコサミントランスポーターのcDNAがクローン化されている(Ishida,1999 J.Biochem.126(1):68−77)。UDP−N−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたKluyveromyces lactis変異体のイヌ腎臓細胞(MDCK)からのcDNAでの表現型修正によってクローン化された(Guillen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14):7888−7892)。結果は、哺乳動物ゴルジUDP−GlcNAcトランスポーター遺伝子が、発現され、酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有し、非常に異なるアミノ酸配列を持つ2つのタンパク質は同一ゴルジ膜内の同一溶質性を輸送することができることを示す(Geullen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14):7888−7892)。
ラット肝臓ゴルジ膜GDP−フコーストランスポーターは、Puglielli,L.and C.B.Hirschberg (Puglielli、1999 J.Biol.Chem.274(50):35596−35600)によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていないが、N末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計で用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、GDP−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
2つの異種遺伝子、Schizosaccharomyces pombeからのアルファ1,2−ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,2 GalT)をコードするgmal2(+)、およびヒトUDP−ガラクトース(UDP−Gal)トランスポーターをコードする(hUGT2)は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、S.cerevisiaeにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化とUDP−ガラクトース輸送活性との間の相関は、α1,2GalTよりはむしろUDP−Galトランスポーターの外因的供給がS.cerevisiaeにおける十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した(Kainuma, 1999 Glycobiology 9(2): 133−141)。
ヒトCMP−シアル酸トランスポーター(hCST)はクローン化され、Lec8 CHO細胞で発現されている(Aoki et al.(1999) J.Biochem.(Tokyo)126(5):940−50; Eckhardt et al.(1997)Eur.J.Biochem.248(1):187−92)。マウスCMP−シアル酸トランスポーターの機能的発現はSaccharomyces cerevisiaeで達成された(Berninsone et al.(1997)J.Biol.Chem.272(19):12616−9)。シアル酸はいくつかの真菌で見出されているが、選択された宿主系が十分なレベルのCMP−シアル酸を供給できるかは明らかでない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホノヌクレオシド(例えば、GDP)はホスファターゼ(例えば、GDPase)によって切断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければならない。この反応は十分なグリコシル化で重要であるように見える。というのは、S.cerevisiaeからのGDPaseはマンノシル化で重要であることが判明しているからである。しかしながら、この酵素はUDPに向けての活性の10%を有するに過ぎない(Berninsone et al.(1994) J.Biol.Chem.269(1):207−211)。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてUDP特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タンパク質合成のためにUDP−糖前駆体を利用しないからである。Schizosaccharomyces pombe(ガラクトース残基を(UDP−ガラクトースからの)細胞壁多糖に加える酵母)は、特異的UDPase活性を有することが判明しており、これは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する(Berninsone et al.(1994) J.Biol.Chem.269(1):207−211)。UDPはグリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるのに重要である。
本発明は、さらに、Man5GlcNAc2炭水化物構造の生産のための酵素または複数酵素をコードする1以上の核酸分子を非−ヒト宿主細胞に取込む工程を含む、この細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を提供する。1つの好ましい実施形態において、Man8GlcNAc2またはMan9GlcNAc2からのMan5GlcNAc2の生産に関与する1以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、1以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性はUDP−GlcNAcトランスフェラーゼ、UDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ、GDP−フコシルトランスフェラーゼ、CMP−シアリルトランスフェラーゼ、UDP−GlcNAcトランスポーター、UDP−ガラクトーストランスポーター、GDP−フコーストランスポーター、CMP−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、1つの活性の産物がもう1つの活性、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、GnTIおよびUDP−GlcNAcトランスポーター活性の基質レベルを増加させる2以上の酵素活性を発現するように選択されるか、または作製される。もう1つの好ましい実施形態において、宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例えば、UDP特異的またはGDP特異的なジホスファターゼ活性を発現するように選択されるかまたは操作される。
本発明の1つの実施形態において、ヒト様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において他の酵素のpH最適値と同様なpH最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的に作製される。例えば、S.cerevisiaeのERおよびゴルジ装置において活性はほとんどの酵素は、約6.5および7.5の間にあるpH最適値を有する(表3参照)。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ERおよびゴルジの内部pHもまた約6〜8の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、pH5.0程度のpH最適値を有する酵素を導入した(Martinet et al.(1998) Biotech.Letters 20(12):1171−1177、およびChiba et al.(1998)J.Biol.Chem.273(41):26298−26304)。pH7.0において、それらのマンノシダーゼのインビトロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、N−グリカン上でのMan5GlcNAc2の効果的なインビボ生産のための、ERおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるような10%未満まで低下される。
本発明のある種の方法は、好ましくは(必ずしも必要ではないが)、1以上の核酸ライブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク質(例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素またはその触媒ドメイン)をコードする配列を含むことである。
融合構築物のコンビナトリアルDNAライブラリーは、一般に、(例えば、C末端欠失を作製することによって、天然タンパク質のN末端ドメインに由来する1以上の細胞標的シグナルペプチド(「標的化ペプチド」)を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的化ペプチドは天然タンパク質(例えば、SEC12)のC末端に由来する。ERまたはゴルジの膜結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)およびステム領域(sr)をコードする配列を有する。これらの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび/または他の局在化されたタンパク質との比較(例えば、疎水性プロットの比較)によって認識可能である。
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝子または野生型遺伝子から直接組立てることができる。好ましい実施形態において、上記DNAライブラリーは、2以上のサブライブラリーの融合から組立てられる。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン(例えば、グリコシル化活性を有するもの)をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製することが、可能である。
1つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ(例えば、マンノシダーゼ)、グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ)、GlcNAcトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするDNA配列を含む。触媒ドメインは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。哺乳動物酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は、全て有用であり、これは、最適温度および最適pHに関して広いスペクトルの生化学特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードする断片を得る。内因性標的化配列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現させ得る。
別の有用なサブライブラリーは、ER、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、3つのカテゴリー:(1)一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜(腔膜)に係留させる、サイトゾルテイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)、およびステム領域(sr)の一部またはステム領域の全てをコードする、N末端配列;(2)HDELテトラペプチド(配列番号41)またはKDELテトラペプチド(配列番号42)のようなC末端で一般に見出される検索シグナル;および(3)ゴルジ中に局在化することが知られている種々のタンパク質(例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター)由来の膜貫通領域;に入る。
好ましいコンビナトリアルDNAライブラリーの構築が、図2に模式的に示され、実施例4に記載される。その融合構築物は、多数のベクター(例えば、当該分野で周知の発現ベクター)に作動可能に連結され得る。広く種々のそのような融合構築物が、表6に示したような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド/触媒ドメインの組合せは、本発明に従って、ER、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドのタイプに応じ、N−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さないものであり得る(例えば、表7、実施例4)。
本発明のコンビナトリアルDNAライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の代表的な例は、pFB8であり、これは、マウスα−マンノシダーゼIA(Genbank AN 6678787)の187N末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結した短縮型Saccharomyces SEC12(m)標的化ペプチド(SwissProt P11655からのSEC12の988〜1296ヌクレオチド)を有する。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド/触媒ドメイン領域を、Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、SEC12標的化ペプチド配列によってERに局在化し、Man5GlcNAc2構造を有するN−グリカンをインビボで生成可能である(実施例4;図6Fおよび7B)。
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルDNAライブラリーが、本発明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼI(GnTI)活性に由来する配列のコンビナトリアルDNAライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てられ、マーカー糖タンパク質上でのGlcNAcMan5GlcNAc2N−グリカン構造の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成につき選択された。GlcNAcMan5GlcNAc2(Saccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38)生じることが示された融合構築物(pPB104)、が同定された(実施例8)。広く種々のそのようなGnTI融合構築物を、組み立てた(実施例8、表10)。標的化ペプチド/GnTI触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルDNAライブラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例8に示すように生成され得ることが、当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルDNAライブラリー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、GlnNAcMan5GlcNAc2生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例において、レポータータンパク質(K3)を発現するOCH1欠失を持つP.pastoris株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質転換して、高マンノースN−グリカンをヒト様N−グリカンに変換した(実施例8)。まず、マンノシダーゼ融合構築物pFB8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187)を、1,6開始マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くP.pastoris株(すなわち、och1欠失;実施例1)に形質転換した。第二に、UDP−GlcNAcトランスポーターをコードするK.lactis MNN2−2遺伝子(Genbank AN AF106080)を含むpPB103を構築して、GlcNAcMan5GlcNAc2のさらなる生成を増加させた。UDP−GlcNAcトランスポーターの付加は、図10Bに示すように、P.pastoris株においてGlcNAcMan5GlcNAc2の生成を有意に増加させた。第3に、Saccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38を含むpPB104を、この株に導入した。このP.pastoris株を「PBP−3」という(実施例36を参照のこと)。
好ましい具体例において、そのような標的化ペプチド/触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物において、グリコシル化反応の一連の性質についての既存の情報を組み込むように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはERの初期部分に標的化する工程を必要とする。例えば、マンノシダーゼによるMan8GlcNAc2のMan5GlcNAc2へのトリミングは、複合型N−グリカン形成における初期の工程である。タンパク質プロセシングはERで開始され、次いで、初期、中間および後期ゴルジを通じて進行するので、この反応はERまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼI局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ERおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼIの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸(例えば、DNAライブラリー)が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも1つの形質転換体が、望まれる表現型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る(Romeroら(2000)J.Biol.Chem.275(15):11071−4)。従って、形質転換に先立ち、DNAライブラリーまたは構成サブライブラリーが、1つ以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、1回以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンPCR、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列(例えば、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必要であり得るような他の機能的配列)を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一般には好ましい。
少なくとも1つの選択マーカー(薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完するための遺伝子)を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、URA3遺伝子、HIS4遺伝子、SUC2遺伝子、G418遺伝子、BLA遺伝子、またはSH BLE遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物宿主細胞で用いるために利用可能である。
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、DNA移入のための任意の簡便な方法(例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法)が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞において、従来の方法としては、粒子ボンバードメント(bombardment)、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養(例えば、酵母における発酵)に適した安定な株を生成するために、上記DNAライブラリー構築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、DNAライブラリーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規定された部位で起こる。
DNAライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および/または除去工程によって行われ得る。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用いて、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上にタンパク質N−グリカンを提示する。
この遺伝子工学の試みの1つの最終的な目標は、産業醗酵プロセスにおいて首尾よく実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主(例えば、真菌)染色体への複数遺伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならない。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性(例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、GlcNAcトランスフェラーゼ、ERおよびゴルジ特異的トランスポーター(例えば、UDP−ガラクトースおよび他の前駆体についてのsynおよびアンチポートトランスポーター)、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびUDP−ガラクトース、CMP−N−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素)のいずれかの組合せを真菌タンパク質発現宿主中に作製し得る。Pichia pastorisのような下等真核生物宿主細胞においてグリコシル化を修飾するための好ましい方法の例を表6に示す。
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられる糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療用タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−6−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャイエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様に、グリカン側鎖への1以上のシアル酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞(例えば、下等真核生物または哺乳動物)は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増加させるように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る(Weikertら、(1999)Nature Biotechnology 17,1116−1121;Wernerら、(1998)Arzneimittelforschung 48(8):870−880;AndersenおよびGoochee(1994)Cur.Opin.Biotechnol.5:546−549;YangおよびButler(2000)Biotechnol.Bioengin.68(4):370−380)。モノクローナル抗体への特異的グリカン修飾(例えば、バイセクト型GlcNAcの付加)は、抗体依存性細胞傷害性を改良することが示されており(Umanaら、(1999)Nat.Biotechnol.17(2):176−80)、これは、抗体または他の治療用タンパク質の生成に望ましくあり得る。
N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIおよびアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIによるGlcNAcMan3GlcNAc2構造へのN−アセチルグルコサミン残基の付加は、いわゆるバイセクト型N−グリカンであるGlcNAc3Man3GlcNAc2を生じる(図15)。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性(ADCC)に関与していた(Umanaら(1999)Nat.Biotechnol.17(2):176−80)。哺乳動物により発現される免疫グロブリンのグリコ形態の再操作は、単調として進まず、かつ煩わしい仕事である。特にGnTIIIの場合(この酵素の過剰発現が増殖阻害に関与している場合)、調節された(誘導性の)遺伝子発現を含む方法が、バイセクト型N−グリカンを有する免疫グロブリンを生成するために使用されなければならなかった(Umanaら(1999)Biotechnol Bioeng.65(5):542−9;Umanaら(1999)Nat.Biotechnol.17(2):176−80;Umanaら WO03/011878;米国特許第6,602,684号)。
(P.pastoris OCH1変異体の生成)
P.pastoris OCH1配列(日本国特許出願公開番号8−336387号)に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
を用いて、推定α−1,6マンノシルトランスフェラーゼをコードするP.pastoris OCH1遺伝子の1215bp ORFを、P.pastorisゲノムDNA(X−33株、Invitrogen、Carlsbad、CA)から増幅した。その後、OCH1遺伝子における内部オリゴヌクレオチド
α−1,2−マンノシダーゼは、Man8GlcNAc2をトリミングして、複合N−グリカン形成のための必須の中間体であるMan5GlcNAc2を得るのに必要である。Man5GlcNAc2前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Man5GlcNAc2の特異的異性体は、GnTIについての基質であってもなくてもよいからである。P.pastorisのoch1変異体は、aoxプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフェロンβを発現するように操作される。DNAライブラリーは、ヒトマンノシダーゼIB(α−1,2−マンノシダーゼ)の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびER局在化ペプチドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される。次いで、DNAライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、90%を超える分泌されたタンパク質はグリコシル化インターフェロンβである。
P.pastoris OHC1遺伝子の1215bpのオープンリーディングフレームならびに2685bp上流および1175bp下流をPCRによって増幅し(WO 02/00879も参照のこと)、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化し、これをpBK9と命名した。複数の栄養要求性マーカーを含むoch1ノックアウト株を生成するために、100μgのpJN329、SfiI制限部位が隣接したoch1::URA3変異体対立遺伝子を含むプラスミドをSfiIで消化し、これを用いて、エレクトロポレーションによって、P.pastoris株JC308(Cereghinoら、Gene 263(2001)159−169)を形質転換した。室温における10日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続き、1000のコロニーを選択し、再度画線培養した。37℃では増殖できないが、室温では増殖したURA+クローンをコロニーPCRに供して、och1::URA3変異体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたPCRパターンを呈した1つのクローンをYJN153と命名した。ヒトプラスミノーゲン(K3)のクリングル3ドメインをモデルタンパク質として用いた。K3遺伝子を含むNeoRでマークしたプラスミドを株YJN153に形質転換し、K3を発現する得られた株をBK64−1と命名した。
MOPS、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、UDP−ガラクトースおよびCMP−N−アセチルノイラミン酸は、Sigma製であった。トリフルオロ酢酸(TFA)は、Sigma/Aldrich,Saint Louis,MO製であった。Spodoptera frugiperda由来の組換えラットα2,6−シアリルトランスフェラーゼ、および牛乳由来のβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Calbiochem(San Diego,CA)製であった。タンパク質N−グリコシダーゼF、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Glyko(San Rafael,CA)製であった。DEAE ToyoPearl樹脂は、TosoHaas製であった。金属キレート化「HisBind」樹脂は、Novagen(Madison,WI)製であった。96ウェル溶解−清浄化プレートは、Promega(Madison,WI)製であった。タンパク質結合96ウェルプレートは、Millipore(Bedford,MA)製であった。塩および緩衝剤は、Sigma(St.Louis,MO)製であった。MALDIマトリックスは、Aldrich(Milwaukee,WI)製であった。
クリングル3を、96ウェル形式で、Beckman BioMek 2000サンプル取り扱いロボット(Beckman/Coulter Ranch Cucamonga,CA)で精製した。クリングル3を、C末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボットによる精製は、Novagenによって、そのHisBind樹脂について提供されるプロトコルの適合である。簡単に言えば、150uL(μL)の沈降した体積の樹脂を、96ウェルの溶解−結合プレートのウェルに注ぎ、3倍体積の水で洗浄し、そして5倍体積の50mM NiSO4を充填し、そして3倍体積の結合緩衝液(5mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCL(pH7.9))で洗浄する。このタンパク質発現培地を、3:2で、培地/PBS(60mM PO4,16mM KCl、822mM NaCl(pH7.4))で希釈し、そしてカラムに充填する。排液後、このカラムを、10倍体積の結合緩衝液および6倍体積の洗浄緩衝液(30mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCl(pH7.9))で洗浄し、そしてタンパク質を、6倍体積の溶出緩衝液(1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris−HCl(pH7.9))で溶出する。溶出した糖タンパク質を、凍結乾燥によって、蒸発乾固させる。
グリカンを、以前に報告された方法(Papacら、A.J.S.(1998)Glycobiology 8,445−454)の改変によって、糖タンパク質から遊離させ、そして分離する。96ウェルのMultiScreen IP(Immobilon−P膜)プレート(Millipore)のウェルを、100uLのメタノールで湿らせ、3×150uLの水および50uLのRCM緩衝液(8M尿素、360mM Tris,3.2mM EDTA(pH8.6))で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で排液する。乾燥したタンパク質サンプルを、30uLのRCM緩衝液に溶解し、そして10uLのRCM緩衝液を含むウェルに移す。これらのウェルを排液し、そしてRCM緩衝液で2回洗浄する。RCM緩衝液中60uLの0.1M DTTの添加によって、37℃で1時間、タンパク質を還元する。これらのウェルを、300uLの水で3回洗浄し、そして60uLの0.1Mヨード酢酸の添加によって、室温で暗所で30分間カルボキシメチル化する。これらのウェルを、水で再度3回洗浄し、そしてその膜を、水中1%のPVP 360(100uL)の添加によって、室温で1時間ブロックする。これらのウェルを排液し、そして300uLの水で3回洗浄し、そして1ミリ単位のN−グリカナーゼ(Glyko)を含有する30μLの10mM NH4HCO3(pH8.3)の添加によって、脱グリコシル化する。37℃で16時間後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、そして蒸発乾固させた。
グリカンの分子量を、Voyager DE PRO線形MALDI−TOF(Applied Biosciences)質量分析計を使用して、遅延抽出を用いて決定した。各ウェルからの乾燥したグリカンを、15uLの水に溶解し、そして0.5uLをステンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして0.5uLのS−DHBマトリックス(1:1の水/アセトニトリル0.1%TFA中9mg/mLのジヒドロキシ安息香酸、1mg/mLの5−メトキシサリチル酸)と混合し、そして乾燥させた。
(コンビナトリアルDNAライブラリーを用いる優勢なN−グリカン構造としてのMan5GlcNAc2を生成するためのP.pastorisの操作)
誘導性AOXIプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、P.pastorisのoch1変異体(実施例1および3を参照のこと)を作成した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)をモデルタンパク質として用いた。Pfu turboポリメラーゼ(Strategene,La Jolla,CA)を用いて、K3をコードするDNAフラグメントを増幅し、pPICZαA(Invitrogen,Carlsbad,CA)のEcoRIおよびXbaI部位にクローン化し、C末端6−Hisタグが得られた。K3のN−結合グリコシル化効率を改良する(Hayesら、1975 J.Arch.Biochem.Biophys.171,651−655)ために、部位特異的変異誘発を用いてPro46をSer46で置き換えた。得られたプラスミドをpBK64と命名した。PCR構築物の正確な配列を、DNA配列決定によって確認した。
+最高程度のMan5GlcNAc2トリミング(30/51)を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分(28/30)は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した(例えば図4B)。2つの構築物のみが培地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いMan5GlcNAc2レベルを示した(例えば、図4C)。
標的化ペプチドに融合したα−1,2−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルDNAライブラリーの生成は、多数の生物からの種々の長さのN末端欠失を含むマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−1,2−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム(ORF)を、以下の源:Homo sapiens,Mus musculus、Drosophila melanogaster,Caenorhabditis elegans、Aspergillus nidulansおよびPenicillium citrinumから得られたcDNAまたはゲノムDNAのいずれかからPCR増幅した。各場合において、PCR反応を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でDNAをインキュベートした。例えば、M.musculus α−1,2−マンノシダーゼIAのORFを増幅するために、5’−プライマー
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の5’および3’領域についてのスペースホールダー(space holder)としての、P.pastoris(Boehmら、Yeast 1999年5月;15(7):563−72)のKEX1遺伝子のDNA領域を含むユニバーサルプラスミドの組を生成する工程を包含した。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのS.cerevisiae Ura−ブラスター(Alaniら、Genetics 116,541−545.1987)、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を有する発現カセットを含んだ。P.pastoris KEX1−5’領域の0.9kbのフラグメントは、プライマー
P.pastorisゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロニーPCRによってスクリーニングした陽性形質転換体を、1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0、1.34%酵母窒素ベース、4×10−5%ビオチン、および1%グリセロールよりなる増殖培地としての50mlのBMGY緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてOD600nm2−6まで増殖し、その時点で、5mlのBMMY中での室温での24時間のレポータータンパク質の誘導に先立ち、10mlのBMMY(増殖培地としての1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0、1.34%酵母窒素ベース、4×10−5ビオチン、および1.5%メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地)で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例3に記載されるように分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表6中の標的化ペプチドを用い、ERまたはゴルジのいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Man5GlcNAc2を主に含有するグリカンに対してMan8GlcNAc2を主に含有するグリカンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を、図5Cおよび6CにおけるP.pastoris och1ノックアウトのそれと、図5D、5E、6D〜6Fに示したM.musculusマンノシダーゼ構築物で形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図5および6は、P.pastorisにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトリアルDNAライブラリーから創製された構築物の発現を示す。pGC5(Saccharomyces MNS1(m)/マウスマンノシダーゼIBΔ99(図5Dおよび6E)の発現は、Man5GlcNAc2にトリミングされた全てのグリカンのほぼ30%を有するタンパク質を生じ、他方、pFB8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187)(図6F)の発現はほぼ50%のMan5GlcNAc2を生じ、pBC18−5(Saccharomyces VAN1(s)/C.elegansマンノシダーゼIBΔ80)(図5E)の発現は70%のMan5GlcNAc2を生じた。
(α−1,2−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング)
実施例4の新規な操作された株が、事実、インビボにて所望のMan5GlcNAc2構造を生じたことを確実にするために、細胞上清をマンノシダーゼ活性につきテストした(図7〜9参照)。後記した各構築物/宿主株については、HPLCを1.0ml/分の流量にて、Altechの4.0mm×250mmカラム(Avondale,PA,USA) Econosil−NH2樹脂(5μm)を用いて30℃にて40分間行った。図7および8において、標準的なMan9GlcNAc2[b]の分解は、Man8GlcNAc2に対応するピークを生じるように起こることが示された。図7において、Man9GlcNAc2[b]標準は24.61分で溶出し、Man5GlcNAc2[a]は18.59分で溶出した。図8において、Man9GlcNAc2は21.37分で溶出し、Man5GlcNAc2は15.67分で溶出した。図9において、標準Man8GlcNAc2[b]は20.88分で溶出することが示された。
(操作されたα−1,2−マンノシダーゼのpH最適アッセイ)
プラスミドpBB27−2((SwissProt50108からの)Saccharomyces MNN10(s)/C.elegansマンノシダーゼIB Δ31)を含むP.pastoris細胞を室温にてBMGY中でOD600-=約17まで増殖させた。これらの細胞の約80μLを600μLのBMGY中に接種し、一晩増殖させた。引き続いて、細胞を遠心分離によって収穫し、BMMYに移して、AOX1プロモーターの制御下のK3(ヒトプラスミノーゲンからのクリングル3)の生産を誘導した。24時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上清(pH6.43)を得た。上清をマンノシダーゼpH最適アッセイのために取り出した。蛍光標識Man8GlcNAc2(0.5μg)を、種々のpHに調整された20μLの上清に加え(図11)、室温にて8時間インキュベートした。インキュベーションの後、Econosil NH2 4.6×250mm、5ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム(Altech,Avondale,PA)を用いるHPLCによって試料を分析した。流量は40分間で1.0ml/分であり、カラムは30℃に維持した。3分間のイソクラフィック溶出(68%A:32%B)の後、直線溶媒勾配(68%A:32%B〜40%A:60%B)を27分間にわたって使用して、グリカン(18)を溶出させた。溶媒A(アセトニトリル)および溶媒B(ギ酸アンモニウム、50mM、pH4.5)。カラムをランの間の20分間、溶媒(68%A:32%B)で平衡化した。
(構造GlcNAcMan5GlcNAc2を持つN−グリカンを生産するためのP.pastorisの操作)
GlcNAcトランスフェラーゼI活性は、複合N−グリカンおよびハイブリッドN−グリカンの成熟化に必要である(米国特許第5,834,251号)。Man5GlcNAc2は単にマンノシダーゼIIによってトリミングされ得、これは、GlcNAcトランスフェラーゼIによるN−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−1,3マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である(Schachter, 1991 Glycobiology 1(5):453−461)。従って、C.elegansおよびHomo sapiensからのGlcNAcトランスフェラーゼI遺伝子の適切に標的化された触媒ドメインと;KTRホモログであるS.cerevisiae:D2、D9およびJ3からの相同性に基づき、S.cerevisiaeおよびP.pastorisの推定α−1,2−マンノシルトランスフェラーゼからのGLS、MNS、SEC、MNN9、VAN1、ANP1、HOC1、MNN10、MNN11、MNT1、KTR1、KTR2、MNN2、MNN5、YUR1、MNN1、およびMNN6からの局在化配列とをコードするDNAフラグメントを含むコンビナトリアルDNAライブラリーを調製した。図10は、限定されるものではないが、P.pastorisおよびK.lactis GnTIからのSECおよびOCH1のような標的化ペプチド配列を含む(表6および表10参照)。
K3は、Beckman BioMek 2000試料−取扱ロボットにて96ウェルフォーマットを用いてNiアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から精製した。ロボット精製は、そのHisBind樹脂についてNovagenによって供されたプロトコルの適合であった。別のスクリーニング方法は、特異的末端GlcNAc結合抗体または末端GlcNAcに結合するレクチン(例えば、Griffonia simplificolia由来のGSIIレクチン)(EY Laboratories,San Mateo,CA)を使用して行われ得る。これらのスクリーニングは、FITCのような蛍光標識で改変されたレクチンまたは抗体を使用することによって自動化し得るか、あるいはMALDI−TOFによって分析され得る。
K3を発現するP.pastoris株(Δoch1、arg−、ade−、his−)を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、pFB8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIA Δ187)を、エレクトロポレーションによって、P.pastoris株において形質転換した。第二に、BamHI酵素およびBglII酵素で消化されたpBLADE−SXプラスミド(Cereghinoら,Gene 263(2001)159−169)にクローン化された(UDP−GlcNAcトランスポーターをコードする)Kluyveromyces lactis MNN2−2遺伝子(Genbank AN AF106080)を含有するpPB103を、P.pastoris株において形質転換した。第三に、NotI−PacIフラグメントとしてpJN336にクローン化された遺伝子をコードするSaccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38を含むpPB104を、P.pastoris株に形質転換した。
(構造Man5GlcNAc2を持つN−グリカンを生産するためのK.lactis細胞の操作)
(K.lactis OCH1遺伝子の同定および破壊)
出芽酵母S.cerevisiaeのOCH1遺伝子は、分泌されたタンパク質上のMan8GlcNAc2N−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う1,6−マンノシルトランスフェラーゼをコードする(Nakanishi−Shindoら(1993),J.Biol.Chem.;268(35):26338−45)。このマンノース転移は、一般には、N−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化における鍵となる最初の工程として認識される(Nakanishi−Shindoら(1993)J.Biol.Chem.268(35):26338−26345; Nakayamaら(1992) EMBO J.11(7):2511−19;Morin−Ganetら,Traffic 1(1):56−68.2000)。S.cerevisiaeにおけるこの遺伝子の欠失の結果、かなり短いN−グリカン構造がもたらされ、これは、高温におけるこの典型的なポリマンノシル化も増殖欠損も含まない(Nakayamaら(1992) EMBO J.11(7):2511−9)。
S.cerevisiae MNN1は、ゴルジα−1,3−マンノシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子である。MNN1の産物は、762アミノ酸タイプII膜タンパク質である(Yipら, Proc Natl Acad Sci USA.91(7):2723−7.(1994))。mnn1変異体から単離されたN結合オリゴ糖およびO結合オリゴ糖双方はα−1,3−マンノース結合を欠く(Raschkeら,J Biol Chem., 248(13):4660−66.1973))。
縮重プライマーを、S.cerevisiae、H.sapiens、およびD.melanogasterに由来するAlg3タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し、これを用いて、P.pastorisゲノムDNAから83bp生成物を増幅した:
S.cerevisiae、Drosophila melanogaster、Homo sapiensなどに由来するALG3p配列を、K.lactis配列と整列させた(PENDANT ESTデータベース)。共通するホモログに存在するが、そのホモログとは正確な配列においては異なる高い相同性の領域を使用して、K.lactis株MG1/2(Bianchiら,1987)に由来するゲノムDNAに対する1対の縮重プライマーを作製した。ALG3の場合、プライマーKAL−1
P.pastoris alg3::KANR欠失構築物を、実施例10に記載のように生成した。約5μgの得られたPCR生成物を、株PBP−3(実施例3を参照のこと)に形質転換し、コロニーを、200μg/ml G418を含むYPD培地で選択した。PCRによってスクリーニングした20株のうちの1株が、そのalg3::KANR変異対立遺伝子の正確な組み込みを含み、野生型対立遺伝子を欠いていることを確認した。この株を、RDP27(図36)と名付けた。
S.cerevisiae MNN9遺伝子のN末端部分と融合したヒトGnTI遺伝子を含むGnTI発現ベクター(pNA15)の構築は、Choiら(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100(9):5022−27に記載される。同様の様式において、ラットGnTII遺伝子をクローニングした。そのラットGnTII遺伝子(GenBank登録番号U21662)を、Takara EX TaqTMポリメラーゼ(Panvera)を用いて、ラット肝臓cDNAライブラリー(Clontech)から以下のプライマー:RAT1
N−アセチルグルコサミンをGlcNAc2Man3GlcNAc2構造へN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIにより付加することにより、いわゆるバイセクト型N−グリカンが生じる(図15を参照のこと)。この構造は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)に大きく関与していた(Umanaら(1999)Nat.Biotechnol.17(2):176−80)。
TMドメインを欠いているマウスGnTIIIタンパク質の部分をコードするDNAフラグメントを、マウス(または他の哺乳動物)のゲノムDNAから、正方向プライマー
抗体の可変領域のクローニングのためのプロトコル(プライマー配列を含む)は、以前に公開されている。抗体源およびコード遺伝子は、とりわけ、インビトロで免疫されたヒトB細胞(例えば、Borrebackら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3995−3999を参照のこと)、末梢血リンパ球または単一のヒトB細胞(see,例えば、Lagerkvistら(1995)Biotechniques 18:862−869;およびTernessら(1997)Hum.Immunol.56:17−27を参照のこと)およびヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウス(これは、ハイブリドーマ細胞株の作製を可能にする)であり得る。
以前に報告されたP.pastoris株BK64(Choiら(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100(9):5022−7)(OCH1ノックアウトを有し、ヒトプラスミノゲンのクリングル3ドメイン(K3)を発現する三重栄養要求株(ADE、ARG、HIS))を、宿主株として使用した。BK64を、制限酵素EcoNIで線状にしたプラスミドpPB103で形質転換して、K.lactis UDP−N−アセチルグルコサミントランスポーターを宿主細胞に導入し、このようにして、株PBP−1を作製した。マウスMnsIを、制限酵素EcoNIで線状にしたプラスミドpFB8で形質転換することによってこの株に導入し、株PEP−2を生成した。株PBP−2から単離されたタンパク質のK3グリカン分析により、存在する主なグリコ形態がMan5GlcNAc2であることが実証された。
YSH−1(実施例13)を、制限酵素ApaIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNN2(s)プラスミド(pKD53)で形質転換し、株YSH−37(図36)を作製した。YSH−37において産生されたK3グリカン構造の分析(図25(下))は、1140m/zにおいて支配的なグリコ形態が、GlcNAcMan3GlcNAc2[b]の質量に対応すること、ならびに1303m/zにおける他のグリコ形態GlcNAcMan4GlcNAc2[c]、および1465m/zにおけるGlcNAcMan5GlcNAc2[d]を示した。
株YSH−37(実施例14)を、制限酵素EcoRIで線状化したラットGnTII/MNN2(s)リーダーをコードするプラスミド(pTC53)で形質転換した。得られた株のYSH−44(図36)は、ポジティブモードのMALDI−TOF質量分析によって1356m/z(これは、GlcNAc2Man3GlcNAc2[x]の質量に対応する)における単一のグリコ形態を有する、K3 N−グリカンを産生した(図29)。
プラスミドpBLURA−SX(Jim Creggから)を、BamHIおよびBglIIで消化して、AOX発現カセットを放出した。次いで、pJN261由来のGAPDH/CYC1発現カセットを含有するBamHIフラグメント(図4B)(実施例4)を、pBLURA−SX骨格に連結して、pJN338を作製した。プラスミドpJN338を、NotIおよびPacIで切断し、そしてインビトロでアニーリングされた2つのオリゴヌクレオチド
GAPDH発現ベクターpJN348を含有するPpURA3を、XhoIで線状化し、そしてT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、そしてウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理した。HYG耐性マーカーを、pAG32から、BgIIIおよびSacIで消化し、そして平滑化し、次いで、pJN348に連結して、pRCD259を作製した。このpRCD259は、PpURA3遺伝子座において組み込むHYG発現ベクターとして使用され得る。
(GnTIII融合構築物の作製)
哺乳動物GnTIIIと酵母標的化配列との間の融合構築物を、マウスMgat3遺伝子(GenBank登録番号L39373、Bhaumikら、1995)を使用して作製した。マウスGnTIII遺伝子のN末端決質Δ32、Δ86、およびΔ212に対応する3つのDNAフラグメントを、Pfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)を使用して、順方向プライマーMG3−B
そのPCR生成物を、次いで、pJN348ベクターにAscI−PacIフラグメントとしてクローニングし、配列決定した。得られたベクターpVA(GnTIIIΔ32)、pVB(GnTIIIΔ86)、およびpVC(GnTIIIΔ212)を、NotI−AscI酵素で消化し、酵母リーダーライブラリー(リーダー20〜67)との連結のために使用した。これらの標的化ペプチドを、32アミノ酸N末端欠失、86アミノ酸N末端欠失、212アミノ酸N末端欠失を有するマウスGnTIIIから選択される触媒ドメインに融合する。例えば、S.cerevisiaeに由来するMNN2標的化ペプチド(長、中間および短)およびK.lactisに由来するGNTI(中間および短)(実施例11を参照のこと)を、表11に示す。
GlcNAcMan5GlcNAc2を生成するP.pastoris株(PBP−3)(実施例8を参照のこと)を、5−FOAに対して選択し、それにより、URA3+マーカーおよびura3−表現型の遺伝子座について選択する。この株(YSH−1と名付けた(図36))を、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)触媒ドメインのライブラリー(ベクターpVA、pVB、およびpVC)およびリーダーで形質転換した。形質転換体を、BMGY中で、約10のOD600になるまで30℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、BMMYに移して、AOX1プロモーターの制御下で、K3(ヒトプラスミノゲンのクリングル3)の生成を誘導した。K3を、96ウェル形式を利用して、Beckman BioMek 2000実験ロボットでNi−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Novagenによって提供される、彼らのHisBind樹脂についてのプロトコルの適合である(実施例3)。そのN−グリカンを、PNGase消化によって遊離させた(実施例3)。N−グリカンを、MALDI−TOF MS(実施例3)で分析した。そのGnTIII活性を、表11に示す。(+)の数は、本明細書で用いられる場合、中性グリカン%のうちのバイセクト型N−グリカン生成の相対レベルを示す。標的化ペプチド配列を、以下からなる群より選択した:Saccharomyces GLS1、Saccharomyces MNS1、Saccharomyces SEC12、Picha OCH1、Saccharomyces MNN9、Saccharomyces VAN1、Saccharomyces ANP1、Saccharomyces HOC1、Saccharomyces MNN10、Saccharomyces MNN11、Saccharomyces MNT1、Pichia D2、Pichia D9、Pichia J3、Saccharornyces KTR1、Saccharomyces KTR2、Kluyveromyces GnTI、Saccharomyces MNN2、Saccharomyces MNN5、Saccharornyces YUR1、Saccharomyces MNN1、およびSaccharomyces MNN6。バイセクト型GlcNAc(例えば、GlcNAc2Man5GlcNAc2)を示すそのpVA53形質転換体を、PBP26と名付けた(図36)。
株YSH−44(図36)におけるGnTIIIの発現のために、ベクターpVA53、pVB53、pVA54、およびpVB54からのGnTIII構築物を、NotI−PacIフラグメントとしてpRCD259に移して、ベクターpPB135、pPB137、pPB136、およびpPB138を作製した。そのベクターは、HYG耐性マーカーおよびP.pastoris URA3遺伝子を、ゲノム組み込みのための標的化タンパク質として含む。プラスミドをSalIで線状にし、株YSH−44にエレクトロポレーションによって形質転換し、ハイグロマイシンを含む培地で選択し、得られた株を、精製K3から遊離されたグリカンの分析によりスクリーニングする。形質転換体を、BMGY中、OD600が約10になるまで24℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、BMMYに移して、AOX1プロモーターの制御下で、K3(ヒトプラスミノゲンのクリングル3)の生成を誘導した。K3を、96ウェル形式を利用して、Beckman BioMek 2000実験ロボットでNi−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した(実施例3)。そのロボット精製は、Novagenによって提供される、彼らのHisBind樹脂についてのプロトコルの適合である(実施例3)。そのN−グリカンを、PNGase消化によって遊離させた(実施例3)。N−グリカンを、MALDI−TOF MSで分析した(実施例3)。バイセクト型GlcNAc(例えば、GlcNAc2Man5GlcNAc2)を示すそのpPB135形質転換体を、YSH−57と名付けた(図36)。表11は、マウスGnTIIIの活性を示す。
そのP.pastoris PBP6−5(実施例11)を、S.cerevisiae MNN2に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結したマウスGnTIII触媒ドメイン(Δ32)をコードするプラスミドpPB135(表11)で形質転換した。形質転換体を、BMGY中で、OD600が約10になるまで30℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、BMMYに移して、AOX1プロモーターの制御下で、K3(ヒトプラスミノゲンのクリングル3)の生成を誘導した。K3を、96ウェル形式を利用して、Beckman BioMek 2000実験ロボットでNi−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Novagenによって提供される、彼らのHisBind樹脂についてのプロトコルの適合である(実施例3)。そのN−グリカンを、PNGase消化によって遊離させた(実施例3)。N−グリカンを、MALDI−TOF MSで分析した(実施例3)。バイセクト型GlcNAc(例えば、GlcNAc2Man3GlcNAc2)を示す形質転換体を、PBP−38(図36)と名付けた。表11は、マウスGnTIIIの活性を示す。
P.pastoris株における任意の潜在的なエキソビボGnTIII活性を試験するために、YSH−57細胞培養上清を、GnTIII活性について試験した。P.pastoris YSH−57細胞を、BMGY中、OD600が約10になるまで24℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、AOX1プロモーターの制御下で、K3(ヒトプラスミノゲンのクリングル3)の生成を誘導した。インキュベーションの24時間後、細胞を遠心分離によって除去して、本質的に清澄な上清を得た。その上清のアリコートを、GnTIIIアッセイのために取り出し、残りを、分泌型可溶性K3の回収のために使用した。K3を、96ウェル形式を利用して、Beckman BioMek 2000実験ロボットでNi−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Novagenによって提供される、彼らのHisBind樹脂についてのプロトコルの適合である(実施例3)。そのN−グリカンを、PNGase消化によって遊離させた(実施例3)。先に取り出した上清のアリコートを、分泌型GnT活性の存在について試験した。PBP−3株において発現されるK3から精製されたGlcNAcMan5GlcNAc2に、以下を添加した:BMMY(A);BMMY中の1mM UDP−GlcNAc(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO))(B);pVA53で形質転換したYSH−44[YSH−57]の上清(C);YSH−57の上清+1mM UDP−GlcNAc(D)。室温で8時間インキュベートした後、サンプルを、アミノシリカHPLCによって分析して、GnTIII活性の程度を決定した。
P.pastoris株YSH−57細胞培養上清中の任意の潜在的なエキソビボGnTIII活性を試験するために、GnTIII活性について試験した。P.pastoris YSH−57細胞を、BMGY中、OD600が約10になるまで24℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、AOX1プロモーターの制御下で、K3(ヒトプラスミノゲンのクリングル3)の生成を誘導した。インキュベーションの24時間後、細胞を遠心分離によって除去して、本質的に清澄な上清を得た。その上清のアリコートを、GnTIIIアッセイのために取り出し、残りを、分泌型可溶性K3の回収のために使用した。K3を、96ウェル形式を利用して、Beckman BioMek 2000実験ロボットでNi−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Novagenによって提供される、彼らのHisBind樹脂についてのプロトコルの適合である(実施例3)。そのN−グリカンを、PNGase消化によって遊離させた(実施例3)。先に取り出した上清のアリコートを、分泌型GnT活性の存在についてさらに試験した。YSH−44株において発現されるK3から精製されたGlcNAc2Man3GlcNAc2に、以下を添加した:BMMY(A);BMMY中の1mM UDP−GlcNAc(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO))(B);pVA53で形質転換したYSH−44の上清(C)。室温で8時間インキュベートした後、サンプルを、アミノシリカHPLCによって分析して、GnTIII活性の程度を決定した。
Claims (18)
- Man3GlcNAc2もしくはMan5GlcNAc2コア構造を有する糖タンパク質を産生するように改変された酵母宿主細胞において組換え糖タンパク質を作製するためのプロセスであって、ここで、前記酵母宿主細胞は、開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼの活性を減少または枯渇させ、α−1,2−マンノシダーゼをコードする核酸配列およびN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT I)をコードする核酸配列を含むように遺伝子的に操作されており、該プロセスは、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性をコードする核酸を該細胞に導入する工程を包含する、プロセスであって、該N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性は、1,2−マンノシルトランスフェラーゼをコードするMNN2の膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよびステム領域、または膜貫通ドメインおよびほぼ半分の長さのステム領域の長さに対応するSaccharomyces cerevisiaeMNN2遺伝子(GenBank Accession No.NP_009571)由来の標的ペプチドに融合するマウスGnTIIIΔ32またはマウスGnTIIIΔ86 N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII酵素ドメインを含む酵素である、プロセス。
- 前記プロセスにより製造された前記組換え糖タンパク質における前記コア構造の10モル%以上が、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2またはGlcNAc2Man5GlcNAc2からなる群より選択されるバイセクト型N−グリカン構造を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia種、Saccharomyces cerevisiae、およびSaccharomyces種からなる群より選択される、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、およびPichia種からなる群より選択される、請求項4に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastorisである、請求項5に記載のプロセス。
- 前記糖タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記治療用タンパク質は、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性IgEレセプターα鎖、IgG、IgGフラグメント、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、DNase II、AAT、rhTBP−1(onercept、TNF結合タンパク質1ともいわれる)、TACI−Ig(膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびサイクロフィリンリガンド相互作用因子)、FSH(卵胞刺激ホルモン)、GM−CSF、FCありまたはなしのGLP−1(グルカゴン様タンパク質1)IL−1受容体アゴニスト、sTNFr(エンブレル、可溶性TNF受容体Fc融合ともいわれる)ATIII、rhトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびCTLA4−Ig(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig)からなる群より選択される、請求項7に記載のプロセス。
- N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を含む酵母宿主細胞であって、ここで、前記酵母宿主細胞は、開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼの活性を減少または枯渇させ、α−1,2−マンノシダーゼをコードする核酸配列およびN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT I)をコードする核酸配列を含むように遺伝子的に操作されており、該N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性は、1,2−マンノシルトランスフェラーゼをコードするMNN2の膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよびステム領域、または膜貫通ドメインおよびほぼ半分の長さのステム領域に対応するSaccharomyces cerevisiaeMNN2遺伝子(GenBank Accession No.NP_009571)由来の標的ペプチドに融合するマウスGnTIIIΔ32またはマウスGnTIIIΔ86 N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII酵素ドメインを含む酵素由来である、宿主細胞。
- さらにN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII活性および/またはN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を含む、請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記細胞は、糖タンパク上でGnTIII活性で反応し得るGlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man5GlcNAc2、またはGlcNAc2Man3GlcNAc2構造を含むN−グリカンを生成する、請求項9または10に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Man5GlcNAc2またはMan3GlcNAc2コア構造上にバイセクト型グリカン構造を含む糖タンパクを生成する、請求項9または10に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2およびGlcNAc2Man5GlcNAc2からなる群より選択されるバイセクト型N−グリカン構造を含む糖タンパクを生成する、請求項9または10に記載の宿主細胞。
- さらに1,2-マンノシダーゼI活性および/またはマンノシダーゼII活性を含む、請求項9〜13のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- さらにUDP−GlcNAcトランスポーターを含む請求項9〜14のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia種、Saccharomyces cerevisiae、およびSaccharomyces種からなる群より選択される、請求項9〜15に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、およびPichia種からなる群より選択される、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Pichia pastorisである、請求項17に記載の宿主細胞。
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