JP2002209587A - アセチルグルコサミン転移酵素ｖｉタンパク質及びそれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 精製されたアセチルグルコサミン転移酵素VI
(GnT VI)及びそれをコードする核酸を提供すること。 【解決手段】 GnT VIを単離し、それをコードする遺伝
子をクローニングし、GnT VIのアミノ酸配列及びその遺
伝子の塩基配列を決定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアセチルグ
ルコサミン転移酵素VIタンパク質及びそれをコードする
核酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖たんぱく質におけるアスパラギンを結
合したオリゴ糖（N-グリカン）の生物学的役割は、末端
グリカン構造とその受容体の相互作用を介して果される
と考えられている。しかしながら、末端構造の多様性と
結合活性は、N-グリカンのコア構造により制御されてい
る。脊椎動物では、6種類のN-アセチルグルコサミン転
移酵素(GnT) IからVIまでが高度に分枝したN-グリカン
のコア構造の合成開始に携わっている（図７）。今まで
にGnT IからVまでは精製され、相当する遺伝子がクロー
ニングされている。GnT VIだけが精製されてなく、遺伝
子構造も判らないままだった。GnT VIは、GlcNAcがN-グ
リカンのコア構造のManα1,6アームの第4位に転移する
のを触媒し、GlcNAcを二分して最も高度に分枝した5つ
のアンテナを持つグリカンを形成する。このようなグリ
カンはオボムコイドや魚卵に見られ、GnT VI活性はニワ
トリの卵管や魚類の卵巣に認められている。GnT-VIの実
在を確認し、5つのアンテナを持つN-グリカンの機能に
ついて見識を得るためには、この酵素の分子クローニン
グが必須である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、精製されたGnT VI及びそれをコードする核酸、並び
に該核酸を有し、宿主細胞中でGnT VIを発現することが
できる組換えベクター及び該発現ベクターで形質転換さ
れ、GnT VIを生産することができる細胞を提供すること
である。

【課題を解決するための手段】

【０００４】本願発明者らは、鋭意研究の結果、後述す
る方法によりニワトリ卵管からGnTVIを精製することに
成功した。さらに、精製したGnT VIから部分アミノ酸配
列を決定し、この部分アミノ酸配列に基づきニワトリ卵
管から得た全ＲＮＡを用いたRT-PCRによりGnT VIをコー
ドするｃＤＮＡのクローニングに成功し、さらにその塩
基配列を決定した。さらにこのｃＤＮＡを組み込んだ組
換えベクターを作製し、これでCOS-1細胞を形質転換
し、COS-1細胞にGnT VIを産生させることに成功し、本
発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミ
ノ酸配列を構成する１若しくは複数のアミノ酸が置換し
若しくは欠失し、若しくは１若しくは複数のアミノ酸が
該アミノ酸配列に挿入され若しくは付加されたアミノ酸
配列を有するタンパク質であってアセチルグルコサミン
転移酵素VI活性を有するタンパク質を提供する。また、
本発明は、本発明の該タンパク質をコードする核酸を提
供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸を有し、
宿主細胞中で上記本発明のタンパク質を発現することが
できる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、
上記本発明の組換えベクターで形質転換され、上記本発
明のタンパク質を産生する細胞を提供する。さらに、本
発明は、GlcNAcがN-グリカンのコア構造のManα1,6アー
ムの第4位に転移するのを触媒し、至適ｐＨが約7.75で
あり、ニワトリ卵管中に存在するアセチルグルコサミン
転移酵素VIを提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明により、下記実施例に詳述
する方法により、ニワトリ卵管からGnT VIが精製され
た。GnT VIは下記実施例に詳述される方法で確認された
ように、GlcNAcがN-グリカンのコア構造のManα1,6アー
ムの第4位に転移するのを触媒し、至適ｐＨが約7.75で
あるものである。

【０００７】さらに、下記実施例に詳述される方法によ
り、精製されたGnT VIの部分アミノ酸配列に基づき、該
酵素のｃＤＮＡのクローニングに成功し、その塩基配列
を決定した。翻訳開始コドンatgが１箇所しかなかった
ので、オープンリーディングフレームを容易に定めるこ
とができ、推定アミノ酸配列を決定した。決定された推
定アミノ酸配列を配列表の配列番号１に、これをコード
するｃＤＮＡの塩基配列を該推定アミノ酸配列と共に配
列番号２に示す。

【０００８】なお、一般に、生理活性を有するタンパク
質において、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のう
ち１又は複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は
該アミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸が挿入され若し
くは付加された場合であっても、その生理活性が維持さ
れる場合があることは当業者に広く知られているところ
である。従って、配列表の配列番号１で示されるアミノ
酸配列を構成する１若しくは複数のアミノ酸が置換し若
しくは欠失し、又は１若しくは複数のアミノ酸が該アミ
ノ酸配列に挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を
有するタンパク質であってアセチルグルコサミン転移酵
素VI活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タ
ンパク質」という）も本発明の範囲に含まれる。この場
合、該修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で
示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％
以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するこ
とが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えば
FASTAのようなこの分野において周知のソフトを用いて
容易に算出することができ、このようなサービスはイン
ターネットによって受けることも可能である。修飾タン
パク質としては、特に、配列表の配列番号１で示される
アミノ酸配列を構成する１若しくは数個のアミノ酸が置
換し若しくは欠失し、又は１若しくは数個のアミノ酸が
該アミノ酸配列に挿入され若しくは付加されたアミノ酸
配列を有するタンパク質であってアセチルグルコサミン
転移酵素VI活性を有するタンパク質が好ましい。

【０００９】本発明は、アセチルグルコサミン転移酵素
VI活性を有する上記タンパク質をコードする核酸をも提
供する。該核酸の塩基配列は、上記タンパク質をコード
するいずれのものであってもよく、その好ましい一例は
上記の通り配列番号２に示されている。

【００１０】本発明は、さらに、上記本発明の核酸を有
し、宿主細胞中で上記本発明のタンパク質を発現するこ
とができる組換えベクターを提供する。このような組換
えベクターは、公知の発現ベクターのマルチクローニン
グ部位に上記本発明の核酸を挿入することにより容易に
作製することができる。発現ベクター自体は種々のもの
が広く知られており、種々の宿主細胞のための種々の発
現ベクターが市販されている。本発明において、このよ
うな市販の発現ベクターを好ましく用いることができ
る。

【００１１】さらに、本発明は、上記本発明の組換えベ
クターで形質転換され、上記本発明のタンパク質を産生
する細胞を提供する。形質転換の方法自体は周知であ
る。宿主細胞としては、特に限定されるものではなく、
哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌や枯草菌のような細菌
細胞、酵母細胞等を挙げることができる。なお、本発明
の酵素を、糖タンパク質の糖鎖の修飾に用いる場合に
は、該糖タンパク質を産生している細胞を形質転換して
本発明のタンパク質を生産させることが好ましい。

【００１２】本発明の酵素は、GlcNAcがN-グリカンのコ
ア構造のManα1,6アームの第4位に転移するのを触媒
し、GlcNAcを二分して最も高度に分枝した5つのアンテ
ナを持つグリカンを形成する。すなわち、GlcNAcの分枝
化に有用であり、従って、本発明の酵素を適用すること
により、糖タンパク質等の糖鎖を修飾することが可能で
ある。糖鎖を修飾することにより、例えば糖タンパク質
の生体中での安定性を代えることが可能であり、タンパ
ク製剤の安定性の改良を行うことが可能である。また、
異種移植において、異種臓器を構成する細胞の糖鎖を受
容者（例えばヒト）本来の糖鎖構造に変更することによ
り、異種臓器移植における拒絶反応を抑制することが可
能であると考えられる。このような糖タンパク質や細胞
の糖鎖の修飾は、本発明の酵素単独で、又は公知のGnT
IないしVと共働して行うことが可能である。

【００１３】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１４】（参考例１） ＧｎＴ ＶI活性の測定 ＧｎＴ ＶI活性はＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５，
１５５−１５７に記載した方法に従い測定した。標準イ
ンキュベート混合物は全量１０μｌに、１５０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃ、１００ｍＭのＧｌｃＮＡｃ、３０ｍＭのＭｎＣｌ
_２、０.５％のトリトンＸ−１００（商品名）、２ｍｇ
／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２４ｐｍｏｌ
の基質[（２，４）（２，６）]−ＰＡ及び酵素分画（２
μｌ）を含んでいた。この混合物を３７℃にて４時間イ
ンキュベートした後、４０μｌの水を加えて、１分間煮
沸することにより酵素反応を停止した。１３，０００ｒ
ｐｍにて５分間遠心した後、反応混合物から取った１０
μｌの上清をＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ−８０ＴＭカラム
（４.６×７.５ｍｍ;トーソー）にかけた。溶出は２０
ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ４.０）により１.６ｍｌ
／分の流速で５５℃にて行った。励起波長３２０ｎｍ、
発光波長４００ｎｍにて蛍光をモニターした。酵素の特
異活性はタンパク質ｍｇ当たり、１時間当たりの生成物
のピコモルとして表した。タンパク質濃度は、ＢＳＡを
標準として、ＢＣＡキット（ピアース）またはバイオラ
ッドタンパク質アッセイキットを用いて測定した。

【００１５】（実施例１） ＧｎＴ ＶIの精製 （１）ミクロソーム分画のホモジネート調製（ステップ
１） 緩衝液Ａ（０.２５Ｍのショ糖、２０μＭのｐＡＰＭＳ
Ｆ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７.５））中でワリン
グ・ブレンダーにて凍結したニワトリの卵管（２７０
ｇ）をホモジナイズした。８，０００ｒｐｍで１０分間
遠心した後、上清をプールし、ペレットについては更に
２回抽出を行い、その後上清（１，２００ｍｌ）をすべ
て混合した。７８，０００ ｘ ｇで２時間遠心した後、
約１３ｇのミクロソーム分画を得た。

【００１６】（２）ＧｎＴ ＶIの可溶化（ステップ２） 次いで、このミクロソーム分画を１５０ｍｌの緩衝液Ｂ
（２０％のグリセロール、２０μＭのｐＡＰＭＳＦ、１
％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７.５））に懸濁し、２時間緩やかに撹拌してから、１
０５，０００ ｘｇにて１時間遠心した。上清分画を回
収し、残ったペレットについて同じ超遠心にてもう１回
抽出した。１回目と２回目のトリトン−Ｘ抽出物を混合
し、次の酵素精製に用いた。

【００１７】（３）Ｑ−セファロースＦＦカラムクロマ
トグラフィ（ステップ３） このトリトン−Ｘ抽出物を、緩衝液Ｃ（２０％のグリセ
ロール、０.１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのト
リス塩酸（ｐＨ８.４））で平衡化したＱ−セファロー
スＦＦカラム（１０×４ｃｍ）にて処理した。このカラ
ムクロマトグラフィで４０ｍｌの分画を回収した。タン
パク質濃度が１.０ｍｇ／ｍｌに低下するまで緩衝液Ｃ
にてカラムを洗浄した。１，０００ｍｌの緩衝液Ｃと
１，０００ｍｌの０.８Ｍ ＮａＣｌ／緩衝液Ｃとの間で
作った線形勾配によって溶出を行った。参考例１に従
い、ＧｎＴ ＶI活性を調べ、活性を含む分画を得た。

【００１８】（４）Ｎｉ^２＋−キレート・セファロース
ＦＦカラムクロマトグラフィ（ステップ４） 前記分画を、緩衝液Ｄ（２０％のグリセロール、０.４
ＭのＮａＣｌ、０.１％のトリトンＸ−１００、２０ｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８.０））にて平衡化したＮｉ
^２＋−キレート・セファロースＦＦカラム（２.５×１
０ｃｍ）（商品名）で処理した。Ｎｉ^２＋の漏出を避け
るために、金属イオンを含まないキレート・セファロー
スＦＦ樹脂（２.５×５ｃｍ）の上にＮｉ^２＋−キレー
ト・セファロースＦＦ樹脂を重層した。このカラムクロ
マトグラフィで１１ｍｌの分画を回収した。カラムによ
って ＧｎＴ ＶIの活性はすべて維持されていた。タン
パク質濃度が０.２ｍｇ／ｍｌに減じるまで緩衝液Ｄで
カラムを洗浄した後、３００ｍｌの緩衝液Ｄと３００ｍ
ｌの０.１Ｍ グリシン／緩衝液Ｄで作った線形勾配にて
ＧｎＴ ＶI活性を溶出した。ＧｎＴ ＶIの活性を含む分
画を混合し、ＹＭ３０メンブレンを用いたアミコン・ダ
イアフロー限外濾過器（アミコン）によってこの分画の
緩衝液を緩衝液Ｅ（２０％のグリセロール、０.０５％
のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのＭｎＣｌ_２、１ｍＭ
のＤＴＴ、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７.４））に置換
した。

【００１９】（５）ＵＤＰ−ヘキサノール−アガロース
アフィニティカラムクロマトグラフィ（ステップ５） 上記ステップ４の後、シグマコート（シグマ）にてカラ
ムをシリコン処理し、分画回収にはシリコン処理した試
験管（アシスト）を用いた。この分画を０.０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ／緩衝液Ｅで平衡化したＵＤＰ−ヘキサノール−ア
ガロースカラム（１.５×１５ｃｍ）で処理した。この
カラムを、１００ｍｌの緩衝液Ｅにて洗浄した。ＧｎＴ
ＶI活性は緩衝液Ｆ（２０％のグリセロール、０.０５
％のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０.０５Ｍ
のＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７.４））にて
溶出した。カラムに載せるステップと洗浄するステップ
は５ｍｌずつの分画とした。溶出ステップでは１.４ｍ
ｌずつの分画とし、ＧｎＴ ＶI活性を含む分画を集め
た。

【００２０】（６）ＵＤＰ−ヘキサノール−アガロース
アフィニティカラムクロマトグラフィ（ステップ６） ステップ５で得た分画に、等量の緩衝液Ｇ（２０％のグ
リセロール、０.０５％のトリトンＸ−１００、２０ｍ
ＭのＭｎＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのＭＯＰＳ
（ｐＨ７.４））を加え、この溶液を前述と同様に再び
ＵＤＰ−ヘキサノール−アガロース クロマトグラフィ
を行い精製した ＧｎＴ ＶI分画を得た。

【００２１】上記、精製過程のステップ３〜５における
クロマトグラフィにおける溶出パターンを図１〜３に示
す。各図に棒線で示した分画をプールした。また、上記
精製過程の総タンパク量、総活性、比活性、回収率、精
製倍率について、表１に示す。精製した ＧｎＴ ＶI分
画は、１０％のゲルを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５）により、非還元
条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲル中のタンパク
質は銀染色キット（２Ｄ銀染色II「ダイイチ」第一化
学）によって染色した。その結果を図４に示す。銀染色
によって染色されるバンドは単一であった。また、ニワ
トリ卵管ホモジネートを出発原料とした場合、最終的な
回収率は表１に示す通り１６％で、６４，０００倍に精
製することができた。

【００２２】

【表１】表１ ニワトリ卵管からのGnT VIの精製

【００２３】（実施例２） ＧｎＴ ＶIの分析（前述の
方法により得られた精製ＧｎＴ ＶIの特徴） （１）ＧｎＴ ＶIの至適ｐＨ 各ｐＨの緩衝液の中で、参考例１に記載してあるとおり
に ＧｎＴ ＶIの活性を測定した。ｐＨ５．５〜６．５
（▲）の１５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ７．０〜８．２５
（●）の１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及びｐＨ８．５〜
９．５（■）の１５０ｍＭのトリスを含むアッセイ溶液
を用いた。図５に示すように ＧｎＴ ＶI活性の至適ｐ
Ｈは７．７５であり、比較的幅広いｐＨ範囲において活
性を示した。

【００２４】（２）ＧｎＴ ＶI活性における２価陽イオ
ン １０ｍＭ ＭｎＣｌ_２溶液中の ＧｎＴ ＶI活性を１０
０とし、各２価陽イオン（１０ｍＭ）溶液による影響を
調べた。活性はＭｎ^２＋で最大であった。Ｃｏ ^２＋、Ｍ
ｇ^２＋、及びＮｉ^２＋は部分的にＭｎ^２＋の代わりを果
せたが、Ｃａ^{２ ＋}、Ｚｎ^２＋、Ｆｅ^２＋、及びＣｕ^２＋
は有意な効果を示さなかった。その結果を表２に示す。
また、ＧｎＴ ＶI活性のＭｎ^２＋依存性について調べた
結果を図６に示す。ＧｎＴ ＶI活性を参考例１に従い測
定を行った結果、Ｍｎ^２＋ ５ｍＭ付近で高い活性を示
し、それ以上のＭｎＣｌ_２濃度では徐々に活性が低下し
た。

【００２５】

【表２】表２ ｎ．ｄ．：検出されず

【００２６】（３）受容体基質の特異性 複合型糖鎖を用いて、ＧｎＴ ＶIの受容体基質の特異性
を調べた。表３に示すように精製した ＧｎＴ ＶIはそ
の基質を明瞭に選択することを示した。それはＧｌｃＮ
Ａｃを[（２，４），（２，６）]−ＰＡ及び[２，
（２，６）]−ＰＡ（ＧｎＴ Ｖの産物）に変換すること
はできたが、[２，２]−ＰＡまたは[（２，４），２]−
ＰＡ（ＧｎＴ IＶの産物）を基質として用いた場合、活
性は認められなかった。各受容体糖鎖を図７に示す。こ
の結果から受容体基質としてＭａｎα１−６アームへの
β１−６Ｎ−アセチルグルコサミル化が、ＧｎＴ ＶIの
活性発現に必須であり、特異性の高い酵素であった。

【００２７】

【表３】表３

【００２８】（実施例３） 精製 ＧｎＴ ＶIに由来するペプチドのアミノ酸配列の
決定 前記実施例１で得た精製した ＧｎＴ ＶI約２μｇを用
いて、還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシ
ーブリリアントブルー Ｒ−２５０にて染色した。６０
ｋＤａのバンドを切り出し、０.１％ＳＤＳと１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液中で３７℃に
て１２時間、０.１μｇのアクロモバクタープロテアー
ゼ（リシレンドペプチダーゼ）で処理した。生成したペ
プチドをゲルから抽出し、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（１×２０
ｍｍ；トーソー）及びモデル１１００（ヒューレットパ
ッカード）液体クロマトグラフィシステムと直列に接続
したＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ＵＧ１２０（１×１
００ｍｍ；資生堂）にて分画した。０〜６０％までの線
形勾配で溶媒Ｂを用いて流速３５μｌ／分にて９６分間
でペプチドを溶出した。ここでは、溶媒Ａ及びＢはそれ
ぞれ、０.０９％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液及
び８０％アセトニトリル中の０.０７５％（ｖ／ｖ）ト
リフルオロ酢酸であった。選択したペプチドをモデルＰ
ｒｏｃｉｓｅ４９４ｃＬＣシークエンサー（パーキンエ
ルマー）を用いてエドマン分解にかけ、メルカプトベン
ゾチアゾールをマトリックスとして用いた線形モデルに
てＲｅｆｌｅｘ ＭＡＬＤ−ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｆ
ｒａｎｚｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｋ）でマトリックス補助
レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を行った。そ
の結果を、配列表の配列番号３〜７に示す。なお、配列
番号３〜７に示すアミノ酸配列を有するペプチドをそれ
ぞれＰ２５、Ｐ５３、Ｐ８９、Ｐ９１及びＰ９３と命名
した。

【００２９】（実施例４） 実施例３のアミノ酸配列か
らのプライマーの設計とポリメラーゼ連鎖反応及びプロ
ーブの作成 精製 ＧｎＴ ＶIに由来するペプチドＰ８９（配列番号
５）とＰ９１（配列番号６）のアミノ酸配列に基づい
て、センス及びアンチセンス両方の変性オリゴヌクレオ
チドを表４に示すようにデオキシイノシン置換によって
合成した。プライマーの組合せを減らすために、コドン
の同義性が２を超える部位ではデオキシイノシンを代わ
りに使い、セリン、アルギニンまたはロイシン残基につ
いてはそれぞれ、以下の表４に示すように２つのコドン
型のプライマーの組合せを用意した。オリゴヌクレオチ
ド９１Ｓ１，９１Ｓ２と９１Ａ１〜９１Ａ４は、それぞ
れＰ９１のアミノ末端配列とカルボキシ末端配列に基づ
いて合成した。同様に、８９Ｓ１，８９Ｓ２及び８９Ａ
１〜８９Ａ４は、Ｐ８９のペプチド配列に基づいて合成
した。このオリゴヌクレオチドはニワトリ卵管から得た
全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析のプライマーとして
使った。ニワトリ卵管の全ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ試薬
（ギブコＢＲＬ）を用いて抽出した。

【００３０】

【表４】表４ ＰＣＲを用いたｃＤＮＡクローン単離実験用オリゴヌク
レオチドプライマー プライマー名中、「Ｓ」はセンス、「Ａ」はアンチセン
スを示す。「Ｉ」はデオキシイノシンを示す。

【００３１】ＰＴ−ＰＣＲは、以下の条件で行った。逆
転写酵素反応は、プライマーとしての５０ｐｍｏｌのラ
ンダムヘキサマー、２μｇの全ＲＮＡ、０.５ｍＭの各
ｄＮＴＰ、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.
４）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ、１０ｍＭ
のジチオスレイトール及びモロニーマウス白血病ウイル
ス由来の２００単位の逆転写酵素（スーパースクリプト
II ＲＴ、ギブコＢＲＬ）を用いて最終容量を２０μｌ
として４２℃にて１時間行った。次のＰＣＲの反応混合
物は、２μｌの逆転写酵素反応溶液、１００ｐｍｏｌの
各プライマー、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫ
Ｃｌ、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.３）、１.
５ｍＭのＭｇＣｌ、及び１.２５単位のＴａｑポリメラ
ーゼを含み最終容量を５０μｌとした。反応混合物につ
いて、９４℃にて３０秒間の変性、５０℃にて３０秒間
のアニ―リング、及び７２℃にて１０秒間の伸展を５０
サイクル行った。ニワトリ卵管由来の全ＲＮＡをテンプ
レートとして用いたＲＴ−ＰＣＲ分析では、まずセンス
とアンチセンスプライマーの８つの可能なそれぞれのペ
アを用いた。その結果、９１Ｓ２と９１Ａ１のプライマ
ーセットのペアでは８０ｂｐのｃＤＮＡ断片を生じ、Ｐ
９１のアミノ酸配列から推定される長さに相当してい
た。８９Ｓ２と８９Ａ１のプライマーセットのペアは７
１ｂｐのｃＤＮＡ断片を生じ、Ｐ８９のアミノ酸配列か
ら推定される長さに相当していた。ＰＣＲ産物をポリア
クリルアミド電気泳動にかけた後、ＤＮＡ断片を切り出
し、ｐＴ７ブルーベクター（ノバゲン、ＷＩ）にサブク
ローニングし、配列を決定すると、推定アミノ酸配列は
Ｐ９１及びＰ８９のそれに一致していた。次いで、この
サブクローニングしたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列に
基づいてセンス鎖（９１ＳＰと呼ぶ５'−ＴＣＴＣＣＡ
ＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣ−３'（配列番号８）または８
９ＳＰと呼ぶ５'−ＴＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＣＧ
Ａ−３'（配列番号９））及びアンチセンス鎖（９１Ａ
Ｐと呼ぶ５'−ＧＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡ−
３'（配列番号１０）または８９ＡＰと呼ぶＴＣＧＴＣ
ＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡ−３'（配列番号１１））の
両方を合成した。これらのプライマーを組み合わせて、
ＲＴ−ＲＣＲを実施した。その結果、８９ＳＰと９１Ａ
Ｐをプライマーとして用いた場合、８５０ｂｐの産物が
増幅された。このＲＴ−ＲＣＲ産物をｐＴ７ブルーベク
ターにサブクローニングし、配列決定分析を行った。そ
の結果、８５０ｂｐの断片は実施例３で決定したＰ２５
（配列番号３）をコードする配列を含むことが示され、
この断片は目的遺伝子の一部であった。

【００３２】（実施例５） ニワトリ卵管のｃＤＮＡラ
イブラリの作製及びｃＤＮＡクローンの単離 前記と同様に、ニワトリの卵管から全ＲＮＡを抽出し
た。オリゴ（ｄＴ）ラテックス（オリゴテックス−ｄＴ
３０＜スーパー＞、ロシュ）によりポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ
をさらに精製した。２本鎖ｃＤＮＡはＤＮＡ合成キット
（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット、ストラタジーン）を用
いて合成した。手短に言えば、オリゴ（ｄｔ）とＸｈｏ
Ｉ制限酵素認識部位を含むプライマーと共に、ポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡの逆転写によって１本目のｃＤＮＡ鎖を
合成した。２本目を合成した後、２本鎖ｃＤＮＡはＥｃ
ｏ ＲＩアダプターに連結した。次いでｃＤＮＡをＥｃ
ｏ ＲＩとＸｈｏ Ｉで消化したＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベ
クターに連結し、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏにてパッケー
ジングした（ギガパックIIIゴールドパッケージングエ
クストラクト、ストラタジーン）。上述した８５０ｂｐ
のｃＤＮＡ断片から合成したジゴキシゲニン標識ＤＮＡ
プローブを用いて、λＺＡＰニワトリ卵管ｃＤＮＡライ
ブラリをスクリーニングした。３.９×１０^５個のプラ
ークから陽性のクローンを１つ単離し、プラスミドｐＢ
Ｓ−ＧｎＴ ＶIを得るためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔフ
ァージミドのｉｎ ｖｉｖｏ切り出しを行った。そのｃ
ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列（２.１キロベース）
を決定した。その配列を、配列番号１４及び図８に示す
（配列番号１４及び図８に示された配列は同じであ
る）。なお、図８中、精製GnT VIの消化により得られた
５種類のペプチドの位置を下線で示す。アスタリスク
は、潜在的なN-グリコシル化部位を示す。また、仮想的
膜貫通疎水性領域を二重下線で示す。

【００３３】（実施例６） ＧｎＴ ＶIのｃＤＮＡ及び
予想タンパク質配列 配列番号１４及び図８に示すように、ｃＤＮＡは、分子
量５２，８１７Ｄａの４６４個のアミノ酸残基をコード
するオープンリーディングフレームを有し、２１９番目
の推定開始コドン及び１，６１１番目のＴＧＡ停止コド
ンを伴った２，０４６個のヌクレオチドで構成されてい
た。推定アミノ酸配列は、精製タンパク質の消化物から
得たペプチド残基を全て含んでいた。オープンリーディ
ングフレームで得られた最上流のペプチドである、Ｐ９
３（配列番号７）ペプチドの配列で上流におけるインフ
レームＡＴＧコドンは１つしかなかったので、我々はそ
れを推定開始コドンと確認した。推定ポリアデニル化部
位は２，０２６番目にあり、ポリ（Ａ）がつながってい
た。２，０６５ｂｐというｃＤＮＡの長さが、ニワトリ
の卵管で見られたｍＲＮＡのサイズにほとんど一致して
いるということは、ＤＮＡがほぼ完全長であることを示
している。推定アミノ酸配列は、２つのＮ−結合グリコ
シル化部位を含んでいた。酵素タンパク質が２つのＮ−
結合オリゴ糖鎖を持つ場合、分子量は、還元条件下のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで認められた６０ｋＤａの精製タンパク
質に一致する。図９に示すようにヒドロパシー（疎水性
親水性指標）を、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｅの方法(K
yte, J. and Doolittle, R.F.(1982) J. Mol. Biol. 15
7, 105-132)に従い、１１アミノ酸のウィンドウでプロ
ットして分析すると、アミノ末端領域に陽イオン性の境
界を伴った顕著な疎水性断片が１つ見られ、今までにク
ローニングされたほとんどのグリコシルトランスフェラ
ーゼの場合と同様にこのタンパク質がII型膜貫通構造を
持つと考えられる。

【００３４】（実施例７） ニワトリ組織における Ｇ
ｎＴ ＶI遺伝子の発現 ニワトリの卵管から得た４μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを
６５℃にて、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１７.５
％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、２０ｍＭのＭＯＰＳ
（ｐＨ ７.０）で変性させ、６％ホルムアルデヒドを含
む１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレ
ン（ロシュ）に移した。プライマーとして５'−ＡＴＧ
ＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＡ−３'（配列番号１２）
と５'−ＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＡＡ−３'
（配列番号１３）及びテンプレートとしてｐＢＳ−Ｇｎ
Ｔ ＶIと共にＤＩＧ ＰＣＲプローブ合成キット（ロシ
ュ）を用いて、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを合
成した。５０℃にてメンブレンとＤＮＡプローブとのハ
イブリッド形成を行った。ジゴキシゲニン標識ＲＮＡ分
子量マーカーII（ロシュ）をサイズマーカーとして用い
た。その他の方法はプラークハイブリッド形成で用いた
ものと同じであった。ニワトリの卵管から得たポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡのノーザンブロットを ＧｎＴ ＶI ｃＤ
ＮＡから作成したジゴキシゲニン標識ＤＮＡとハイブリ
ッド形成させた。その結果、ニワトリの卵管では２.１
キロベースの転写物が観察された。ニワトリの卵管由来
の４μｇポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いた場合にのみ Ｇｎ
Ｔ ＶIの転写物を検出できたので、組織における Ｇｎ
Ｔ ＶIのｍＲＮＡ量は極めて少ないものと思われた。従
って、我々はＲＴ−ＰＣＲ分析によってニワトリの組織
における ＧｎＴ ＶI遺伝子の発現を調べた。このよう
な分析における作為を回避するために、我々は ＧｎＴ
ＶI ｃＤＮＡの３つの部分に対するＰＣＲを行い、結果
を比較した。用いたプライマーセットは、(A)5'-ACCGTC
AACCGACTGGA-3'(図８のヌクレオチド1137-1153、配列番
号２７)と5'-GGTGCCTGCAGTCCAAA-3' (図８のヌクレオチ
ド1594-1610、配列番号１３)、(B) 5'-ATGCGGTGCTCCCCG
AA-3' (図８のヌクレオチド219-235、配列番号１２)と
5'-TCGTCGCACTGATGACA-3'(図８のヌクレオチド490-50
6、配列番号１１)及び(C) 5'-CCCTGGAAGGCCTCAAG-3'
(図８のヌクレオチド718-734、配列番号２８)と 5'-AGG
CGGAAGTGGGTCAG-3' (ヌクレオチド1041-1057、配列番号
２９)であった。これらの各プライマーセットを用い
て、逆転写したｃＤＮＡをＰＣＲにて別々に増幅した。
ＰＣＲ産物を電気泳動で分画し、臭化エチジウムで視覚
化した。データはすべて一貫して ＧｎＴ ＶI ｍＲＮＡ
は卵管、脾臓、肺及び結腸に相対的に強く発現している
ことを示した。

【００３５】（実施例８） ニワトリ ＧｎＴ ＶI及び
ヒト ＧｎＴ ＩＶ−ホモログｃＤＮＡのＣＯＳ−１細胞
における過剰発現 ｐＢＳ−ＧｎＴ ＶIをＥｃｏ ＲＩとＸｈｏ Ｉで消化
し、挿入するＤＮＡを発現ベクターｐＳＶＫ３（アマシ
ャム・ファルマシア）のＥｃｏ ＲＩ部位とＸｈｏ Ｉ部
位の間に連結した（ｐＳＶ−ＧｎＴ ＶIと呼ぶ）。 ｐ
ＢＳ−ｈＧｎＴIＶｈ（Anal. Biochem. 255, 155-157
(1998))をＸｂａ ＩとＸｈｏ Ｉで消化し、挿入するＤ
ＮＡをｐＳＶＫ３のＸｂａ Ｉ部位とＸｈｏ Ｉ部位の間
に連結した（ｐＳＶ−ｈＧｎＴ ＩＶｈＲ）。ｐＳＶ−
ｈＧｎＴ ＩＶｈＲはＳＶ４０プロモーターに対して反
対方向を向いたｈＧｎＴ IＶｈを含んでいるので、Ｓａ
ｌ Ｉで消化して適切な方向を向いたｈＧｎＴ IＶｈ
（ｐＳＶ−ｈＧｎＴ IＶｈ）を得るために連結し直し
た。直径１００−ｍｍのディッシュで事前に１日間培養
したＣＯＳ−１細胞（１×１０^６）に、２μｇのプラス
ミドＤＮＡ、８μｌのＰＬＵＳ試薬及び１２μｌのリポ
フェクトアミン（ギブコＢＲＬ）によるリポフェクチン
によって遺伝子を移入した。７２時間後、２ｍｌの冷却
ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、シリコン製のスクレーパー
を用いて０.１ｍｌのＰＢＳと共に回収した。氷中にて
細胞を超音波破砕し、様々なＧｌｃＮＡｃトランスフェ
ラーゼ活性を測定し、ＢＳＡを標準としてタンパク濃度
（ＢＣＡタンパクアッセイキット、ピアース）を測定し
た。また、ＧｎＴ III、IＶ、Ｖ，及びＶIの活性は、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５，１５５−１５７；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０３５，
３１３−３１８等に記載された方法に従い測定した。表
５に示すように、ｐＳＶ−ＧｎＴ ＶIを遺伝子移入した
ＣＯＳ−１細胞は ＧｎＴＶI活性を示したが、ｐＳＶ−
ｈＧｎＴ−ＩＶｈまたはｐＳＶＫ３のみを遺伝子移入し
た細胞には ＧｎＴ ＶI活性はなかった。 ｐＳＶ−Ｇ
ｎＴ ＶIまたはｐＳＶ−ｈＧｎＴ−IＶｈを遺伝子移入
した細胞はどちらも ＧｎＴ III及びＶ活性を示さなか
った（データは示さず）。これらの結果は、クローニン
グしたｃＤＮＡは ＧｎＴ ＶIをコードしているが、ヒ
トＧｎＴ IＶ−ホモログはコードしていないことを示し
ている。

【００３６】

【表５】表５ COS-1細胞におけるGnT VI及びヒトGnT IV-Hの発現 トランスフェクトされた細胞ホモジネートのGnT VI及び
IV活性。結果は、３回の実験の平均値を示す。 ND: 検出せず

【００３７】

【発明の効果】本発明により、これまでに単離されてい
なかったアセチルグルコサミン転移酵素VIが初めて単離
され、それをコードする核酸が初めてクローニングさ
れ、その塩基配列が決定された。本発明により、アセチ
ルグルコサミン転移酵素VIを遺伝子工学的手法により生
産することが初めて可能となった。

【００３８】

【配列表】 <110> FUJIREBIO INC. <120> Acetylglucosaminyl transferase VI and nucleic acid encoding the s ame <130> 00685 <160>

【００３９】 <210> 1 <211> 464 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 1 Met Arg Cys Ser Pro Lys Arg Ser Leu Thr Ala Val Ile Ala Ala Ser 1 5 10 15 Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu His Arg Gly Ser Trp Gln 20 25 30 Asp Pro Gln Glu Val Gln Phe Arg Asp Leu Pro Ser Asp Ala Val Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Lys Gln Gly Ser Leu His Ile Leu Gln Asp Thr Asp Asn 50 55 60 Leu Cys Ala Leu His Asn Ile Ser Tyr His Leu Leu Ala Gly Ser Pro 65 70 75 80 Leu Pro His Lys Lys Phe Leu Ala Val Gly Leu Ser Ser Val Arg Arg 85 90 95 Pro Arg Gly Tyr Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Gln Ser Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ser Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Met Val Val Val Val His Leu Ala 115 120 125 Asp Ala Asp Pro Ile Trp Asn Ala Gln Val Ala Ala Asp Ile Ser His 130 135 140 Arg Phe Ala His His Ile Leu Leu Gly Arg Leu Val Leu Ile His Thr 145 150 155 160 Pro His Glu Phe Tyr Pro Thr Leu Glu Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Asn 165 170 175 Asp Pro Glu Glu Arg Val Lys Phe Arg Ser Lys Gln Asn Val Asp Tyr 180 185 190 Ala Phe Leu Phe Thr Phe Ala Ala Asn Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Met 195 200 205 Ile Glu Asp Asp Val Trp Ser Ala Lys Ser Phe Phe Thr Ala Ile Arg 210 215 220 Lys Ala Val Ala Ser Gln Glu Gly Ser Asn Trp Ala Thr Leu Glu Phe 225 230 235 240 Ser Lys Leu Gly Tyr Ile Gly Lys Leu Tyr Arg Ser Ser Asp Leu Pro 245 250 255 Arg Leu Ala Arg Phe Leu Leu Leu Phe Tyr Gln Glu Met Pro Cys Asp 260 265 270 Trp Leu Leu Thr His Phe Arg Leu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Val Ile 275 280 285 Arg Phe Lys Pro Ser Leu Phe Gln His Met Gly Leu Tyr Ser Ser Phe 290 295 300 Gln Gly Thr Val Asn Arg Leu Glu Asp Asp Glu Phe Gln Ala Asp Ala 305 310 315 320 Met Asp Leu Pro Asp Asn Pro Pro Ala Ala Leu Phe Thr Asn Met Val 325 330 335 Val Phe Glu Asn Tyr Glu Pro Ser Lys Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Gly 340 345 350 Tyr Phe Trp Gly Lys Asn Pro Ala Val Gly Ser Ile Phe Ser Ile Val 355 360 365 Phe His Gln Pro Ala Arg Val Thr Arg Val Arg Val Gln Thr Gly Ser 370 375 380 Ser Glu Arg Pro Gly Asp Phe Leu His Ala Gly Val Leu Glu Leu Gly 385 390 395 400 Arg Gly Arg Arg Ala Asp Gly Arg Asp Cys Ser Val Tyr Thr Thr Val 405 410 415 Gly Thr Phe Glu Lys Gly Asn Leu Glu Trp Arg Gly Leu Glu Lys Gly 420 425 430 Met Pro Asn Pro Val Glu Cys Val Arg Ile Arg Val Thr Gln Ser Gln 435 440 445 Ser Glu Trp Leu Ile Ile Gln Ser Ile Gly Ile Trp Thr Ala Gly Thr 450 455 460

【００４０】 <210> 2 <211> 1395 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 2 atg cgg tgc tcc ccg aaa cgc tcc ctc acg gct gtg att gca gcc tcc 48 Met Arg Cys Ser Pro Lys Arg Ser Leu Thr Ala Val Ile Ala Ala Ser 1 5 10 15 ttc ctc ctc ctc ctc ctt ctc ctc ctt ctg cac agg ggc agc tgg cag 96 Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu His Arg Gly Ser Trp Gln 20 25 30 gac ccc cag gag gtg cag ttt agg gat cta cct tca gat gcg gtc ctg 144 Asp Pro Gln Glu Val Gln Phe Arg Asp Leu Pro Ser Asp Ala Val Leu 35 40 45 aag ata ctg aag caa gga tcc ctg cac atc ctc cag gac acg gac aac 192 Lys Ile Leu Lys Gln Gly Ser Leu His Ile Leu Gln Asp Thr Asp Asn 50 55 60 ctc tgt gca ctc cac aac atc tcc tac cac ctc ctt gct ggt tcc cca 240 Leu Cys Ala Leu His Asn Ile Ser Tyr His Leu Leu Ala Gly Ser Pro 65 70 75 80 tta ccc cac aaa aag ttc ttg gcg gtg ggg ctg tca tca gtg cga cga 288 Leu Pro His Lys Lys Phe Leu Ala Val Gly Leu Ser Ser Val Arg Arg 85 90 95 cca cgt gga tat tac ctc cca gac acg ctg cag tcc ctc ttc aag cag 336 Pro Arg Gly Tyr Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Gln Ser Leu Phe Lys Gln 100 105 110 tca tca gag gag gag ctg cag gag atg gtg gtg gtg gtg cac ctg gca 384 Ser Ser Glu Glu Glu Leu Gln Glu Met Val Val Val Val His Leu Ala 115 120 125 gat gca gac ccc atc tgg aat gcc cag gtg gcc gcc gac atc agc cat 432 Asp Ala Asp Pro Ile Trp Asn Ala Gln Val Ala Ala Asp Ile Ser His 130 135 140 agg ttc gct cac cac atc ctc ctg ggc cgg ctc gtg ctt atc cat act 480 Arg Phe Ala His His Ile Leu Leu Gly Arg Leu Val Leu Ile His Thr 145 150 155 160 ccc cat gag ttt tac cca acc ctg gaa ggc ctc aag aga aac tac aac 528 Pro His Glu Phe Tyr Pro Thr Leu Glu Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Asn 165 170 175 gac cca gag gag cgg gtg aag ttc agg tcc aag cag aac gtg gat tac 576 Asp Pro Glu Glu Arg Val Lys Phe Arg Ser Lys Gln Asn Val Asp Tyr 180 185 190 gcc ttc ctc ttc acc ttt gct gcc aac ctt tcc tcc tac tac ttg atg 624 Ala Phe Leu Phe Thr Phe Ala Ala Asn Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Met 195 200 205 att gag gat gac gtg tgg tct gcc aag tcc ttc ttc act gcc atc cgc 672 Ile Glu Asp Asp Val Trp Ser Ala Lys Ser Phe Phe Thr Ala Ile Arg 210 215 220 aaa gct gtg gcc tcc cag gaa ggc tcc aac tgg gcc acc ctt gag ttc 720 Lys Ala Val Ala Ser Gln Glu Gly Ser Asn Trp Ala Thr Leu Glu Phe 225 230 235 240 tcc aag ctg ggc tac atc ggt aag ctc tac cgc tcc agt gac ctt cct 768 Ser Lys Leu Gly Tyr Ile Gly Lys Leu Tyr Arg Ser Ser Asp Leu Pro 245 250 255 cgc ttg gct cgc ttc ctc ctc ctc ttc tac cag gag atg ccc tgt gac 816 Arg Leu Ala Arg Phe Leu Leu Leu Phe Tyr Gln Glu Met Pro Cys Asp 260 265 270 tgg ctg ctg acc cac ttc cgc ctc ctg ctc acc cag aag gat gtg atc 864 Trp Leu Leu Thr His Phe Arg Leu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Val Ile 275 280 285 cgc ttc aag ccc tcc ctc ttc cag cac atg ggc ctc tac tcc tcc ttc 912 Arg Phe Lys Pro Ser Leu Phe Gln His Met Gly Leu Tyr Ser Ser Phe 290 295 300 caa ggt acc gtc aac cga ctg gag gat gac gag ttt cag gct gat gcc 960 Gln Gly Thr Val Asn Arg Leu Glu Asp Asp Glu Phe Gln Ala Asp Ala 305 310 315 320 atg gac ctt cca gac aac ccg cca gca gcc ctg ttc acc aac atg gtt 1008 Met Asp Leu Pro Asp Asn Pro Pro Ala Ala Leu Phe Thr Asn Met Val 325 330 335 gtc ttt gag aac tat gag ccc tcc aag gct tac agc aca gca agg ggg 1056 Val Phe Glu Asn Tyr Glu Pro Ser Lys Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Gly 340 345 350 tat ttc tgg ggg aaa aac cca gca gtt ggc agc att ttc tcc att gtc 1104 Tyr Phe Trp Gly Lys Asn Pro Ala Val Gly Ser Ile Phe Ser Ile Val 355 360 365 ttc cac caa cca gcc cgt gtc acc cgc gtc cgg gtg cag acg gga tcc 1152 Phe His Gln Pro Ala Arg Val Thr Arg Val Arg Val Gln Thr Gly Ser 370 375 380 agt gag cgc cct ggg gac ttc ctg cat gca ggg gtt ctg gag ctg ggc 1200 Ser Glu Arg Pro Gly Asp Phe Leu His Ala Gly Val Leu Glu Leu Gly 385 390 395 400 cgg ggg cgg cgg gct gat ggc cga gac tgc tct gtg tac acc act gtg 1248 Arg Gly Arg Arg Ala Asp Gly Arg Asp Cys Ser Val Tyr Thr Thr Val 405 410 415 ggc acc ttt gag aaa ggg aac tta gag tgg cgg ggg ctg gag aag gga 1296 Gly Thr Phe Glu Lys Gly Asn Leu Glu Trp Arg Gly Leu Glu Lys Gly 420 425 430 atg ccc aac cct gtg gag tgc gtg agg atc cgg gtg acc cag agc cag 1344 Met Pro Asn Pro Val Glu Cys Val Arg Ile Arg Val Thr Gln Ser Gln 435 440 445 agt gag tgg ctc atc atc cag agc att ggt att tgg act gca ggc acc 1392 Ser Glu Trp Leu Ile Ile Gln Ser Ile Gly Ile Trp Thr Ala Gly Thr 450 455 460 tga 1395

【００４１】 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 3 Arg Asn Tyr Asn Asp Pro Glu Glu Arg Val Lys 1 5 10

【００４２】 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Gallus gallus <223> Peptide fragment of Acetylglucosaminyl transferase VI <400> 4 Gly Xaa Leu Glu Trp Arg Gly Leu Glu Lys 1 5 10

【００４３】 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 5 Lys Phe Leu Ala Val Gly Leu Ser Ser Val Arg Arg Pro Arg Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Gln 20

【００４４】 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 6 Asn Pro Ala Val Gly Ser Ile Phe Ser Ile Val Phe His Gln Pro Ala 1 5 10 15 Arg Val Thr Arg Val Arg Val Gln Thr Gly Ser 20 25

【００４５】 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 7 Phe Leu Ala Val Gly Leu Ser Ser Val Arg Arg Pro Arg Gly Tyr Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asp Thr Leu Gln 20

【００４６】 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for RT-PCR for cloning cDNA codi ng for acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 8 tctccattgt cttccac 17

【００４７】 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for RT-PCR for cloning cDNA codi ng for acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 9 tgtcatcagt gcgacga 17

【００４８】 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for RT-PCR for cloning cDNA codi ng for acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 10 gtggaagaca atggaga 17

【００４９】 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for RT-PCR for cloning cDNA codi ng for acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 11 tcgtcgcact gatgaca 17

【００５０】 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for producing probe for detectin g acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 12 atgcggtgct ccccgaa 17

【００５１】 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for producing probe for detectin g acetylglucosaminyl transferase VI from Gallus gallus <400> 13 ggtgcctgca gtccaaa 17

【００５２】 <210> 14 <211> 2065 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 14 GGCACGAGGC AGAGCCCAGC AGGGACGCTG CCAGGGCCCA ACGCCCCACG AGCCCACAGC 60 TGCCCACGCA CCCGGCAGAC CCAGTTGCAT TAATAATGGA AAAATCCCAG GTAAACTCAG 120 GAGCCTTTGA GCCTCATGCC ATGCCTCTGC TGCGAGGAGA AACGTCTCAA GGGCACTAAT 180 GTCTCCATGA AGGGCTCTCA GCAGGCCGGC CTGGTGCT ATG CGG TGC TCC CCG AAA 236 Met Arg Cys Ser Pro Lys 1 5 CGC TCC CTC ACG GCT GTG ATT GCA GCC TCC TTC CTC CTC CTC CTC CTT 284 Arg Ser Leu Thr Ala Val Ile Ala Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Leu 10 15 20 CTC CTC CTT CTG CAC AGG GGC AGC TGG CAG GAC CCC CAG GAG GTG CAG 332 Leu Leu Leu Leu His Arg Gly Ser Trp Gln Asp Pro Gln Glu Val Gln 25 30 35 TTT AGG GAT CTA CCT TCA GAT GCG GTC CTG AAG ATA CTG AAG CAA GGA 380 Phe Arg Asp Leu Pro Ser Asp Ala Val Leu Lys Ile Leu Lys Gln Gly 40 45 50 TCC CTG CAC ATC CTC CAG GAC ACG GAC AAC CTC TGT GCA CTC CAC AAC 428 Ser Leu His Ile Leu Gln Asp Thr Asp Asn Leu Cys Ala Leu His Asn 55 60 65 70 ATC TCC TAC CAC CTC CTT GCT GGT TCC CCA TTA CCC CAC AAA AAG TTC 476 Ile Ser Tyr His Leu Leu Ala Gly Ser Pro Leu Pro His Lys Lys Phe 75 80 85 TTG GCG GTG GGG CTG TCA TCA GTG CGA CGA CCA CGT GGA TAT TAC CTC 524 Leu Ala Val Gly Leu Ser Ser Val Arg Arg Pro Arg Gly Tyr Tyr Leu 90 95 100 CCA GAC ACG CTG CAG TCC CTC TTC AAG CAG TCA TCA GAG GAG GAG CTG 572 Pro Asp Thr Leu Gln Ser Leu Phe Lys Gln Ser Ser Glu Glu Glu Leu 105 110 115 CAG GAG ATG GTG GTG GTG GTG CAC CTG GCA GAT GCA GAC CCC ATC TGG 620 Gln Glu Met Val Val Val Val His Leu Ala Asp Ala Asp Pro Ile Trp 120 125 130 AAT GCC CAG GTG GCC GCC GAC ATC AGC CAT AGG TTC GCT CAC CAC ATC 668 Asn Ala Gln Val Ala Ala Asp Ile Ser His Arg Phe Ala His His Ile 135 140 145 150 CTC CTG GGC CGG CTC GTG CTT ATC CAT ACT CCC CAT GAG TTT TAC CCA 716 Leu Leu Gly Arg Leu Val Leu Ile His Thr Pro His Glu Phe Tyr Pro 155 160 165 ACC CTG GAA GGC CTC AAG AGA AAC TAC AAC GAC CCA GAG GAG CGG GTG 764 Thr Leu Glu Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Asn Asp Pro Glu Glu Arg Val 170 175 180 AAG TTC AGG TCC AAG CAG AAC GTG GAT TAC GCC TTC CTC TTC ACC TTT 812 Lys Phe Arg Ser Lys Gln Asn Val Asp Tyr Ala Phe Leu Phe Thr Phe 185 190 195 GCT GCC AAC CTT TCC TCC TAC TAC TTG ATG ATT GAG GAT GAC GTG TGG 860 Ala Ala Asn Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Met Ile Glu Asp Asp Val Trp 200 205 210 TCT GCC AAG TCC TTC TTC ACT GCC ATC CGC AAA GCT GTG GCC TCC CAG 908 Ser Ala Lys Ser Phe Phe Thr Ala Ile Arg Lys Ala Val Ala Ser Gln 215 220 225 230 GAA GGC TCC AAC TGG GCC ACC CTT GAG TTC TCC AAG CTG GGC TAC ATC 956 Glu Gly Ser Asn Trp Ala Thr Leu Glu Phe Ser Lys Leu Gly Tyr Ile 235 240 245 GGT AAG CTC TAC CGC TCC AGT GAC CTT CCT CGC TTG GCT CGC TTC CTC 1004 Gly Lys Leu Tyr Arg Ser Ser Asp Leu Pro Arg Leu Ala Arg Phe Leu 250 255 260 CTC CTC TTC TAC CAG GAG ATG CCC TGT GAC TGG CTG CTG ACC CAC TTC 1052 Leu Leu Phe Tyr Gln Glu Met Pro Cys Asp Trp Leu Leu Thr His Phe 265 270 275 CGC CTC CTG CTC ACC CAG AAG GAT GTG ATC CGC TTC AAG CCC TCC CTC 1100 Arg Leu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Val Ile Arg Phe Lys Pro Ser Leu 280 285 290 TTC CAG CAC ATG GGC CTC TAC TCC TCC TTC CAA GGT ACC GTC AAC CGA 1148 Phe Gln His Met Gly Leu Tyr Ser Ser Phe Gln Gly Thr Val Asn Arg 295 300 305 310 CTG GAG GAT GAC GAG TTT CAG GCT GAT GCC ATG GAC CTT CCA GAC AAC 1196 Leu Glu Asp Asp Glu Phe Gln Ala Asp Ala Met Asp Leu Pro Asp Asn 315 320 325 CCG CCA GCA GCC CTG TTC ACC AAC ATG GTT GTC TTT GAG AAC TAT GAG 1244 Pro Pro Ala Ala Leu Phe Thr Asn Met Val Val Phe Glu Asn Tyr Glu 330 335 340 CCC TCC AAG GCT TAC AGC ACA GCA AGG GGG TAT TTC TGG GGG AAA AAC 1292 Pro Ser Lys Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Gly Tyr Phe Trp Gly Lys Asn 345 350 355 CCA GCA GTT GGC AGC ATT TTC TCC ATT GTC TTC CAC CAA CCA GCC CGT 1340 Pro Ala Val Gly Ser Ile Phe Ser Ile Val Phe His Gln Pro Ala Arg 360 365 370 GTC ACC CGC GTC CGG GTG CAG ACG GGA TCC AGT GAG CGC CCT GGG GAC 1388 Val Thr Arg Val Arg Val Gln Thr Gly Ser Ser Glu Arg Pro Gly Asp 375 380 385 390 TTC CTG CAT GCA GGG GTT CTG GAG CTG GGC CGG GGG CGG CGG GCT GAT 1436 Phe Leu His Ala Gly Val Leu Glu Leu Gly Arg Gly Arg Arg Ala Asp 395 400 405 GGC CGA GAC TGC TCT GTG TAC ACC ACT GTG GGC ACC TTT GAG AAA GGG 1484 Gly Arg Asp Cys Ser Val Tyr Thr Thr Val Gly Thr Phe Glu Lys Gly 410 415 420 AAC TTA GAG TGG CGG GGG CTG GAG AAG GGA ATG CCC AAC CCT GTG GAG 1532 Asn Leu Glu Trp Arg Gly Leu Glu Lys Gly Met Pro Asn Pro Val Glu 425 430 435 TGC GTG AGG ATC CGG GTG ACC CAG AGC CAG AGT GAG TGG CTC ATC ATC 1580 Cys Val Arg Ile Arg Val Thr Gln Ser Gln Ser Glu Trp Leu Ile Ile 440 445 450 CAG AGC ATT GGT ATT TGG ACT GCA GGC ACC TGACCAGGGC TGTGATGGGT 1630 Gln Ser Ile Gly Ile Trp Thr Ala Gly Thr 455 460 CACCACTGTG GTTGGATTTT GCTCTAAGAA GAGCTTTATT TTTCTCAGTC CCTTTTTTCG 1690 ATGGGGAATT AAATTATTCA GTCAAACCGG TCCTGCTTGC TGAACGTAGA GGGGTGGCAG 1750 GGCAGCTGCG GGGTCTGCTT CCTGCACGGA GGTGGACGGG GTTGGCTGTA GGGCCCACTG 1810 TGCTGCACCA GACTGGGGGA TGCTGCAGAA AGCAGTGCCC AGCCCCAGGC TGCAGCCCTA 1870 CGGCCCATCA GTATGGGGAA AGTGATGGAC AGGCAGCTCT GCATACGCTT TGTGTCCTGA 1930 TGGAGTGCCA GTTTTCGTGC TCCAAGCAGA GTCCTGCTTC CTTTGTACCC CAGTGCCCTT 1990 CTTGATGCTT CCTTATGCCC TGACTCAGCT AATTAATTAA AAACGGTGAG TCAATTAAAA 2050 AAAAAAAAAA AAAAA 2065

【００５３】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 15 aaraayccng cngtnggntc 20

【００５４】 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 16 aaraayccng cngtnggnag 20

【００５５】 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 17 ccngtytgna cncgnacncg 20

【００５６】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 18 ccngtytgna cyctnacncg 20

【００５７】 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 19 ccngtytgna cncgnacyct 20

【００５８】 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 20 ccngtytgnacyctnacyct

【００５９】<210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 21 aaraarttyc tngcngtngg 20

【００６０】 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 22 aaraarttyttrgcngtngg

【００６１】 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 23 tgnagngtrtcnggnagrta

【００６２】 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 24 tgyaangtrtcnggnagrta

【００６３】 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 25 tgnagngtrt cnggcaarta 20

【００６４】 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in PCR for cloning GnT VI cDNA <400> 26 tgyaangtrt cnggyaarta 20

【００６５】 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in RT-PCR for determining the express ion level of GnT VI in various tissues <400> 27 accgtcaacc gactgga 17

【００６６】 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in RT-PCR for determining the express ion level of GnT VI in various tissues <400> 28 ccctggaagg cctcaag 17

【００６７】 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer used in RT-PCR for determining the express ion level of GnT VI in various tissues <400> 29 aggcggaagt gggtcag 17

【図面の簡単な説明】

【図１】GnT VIの精製過程のステップ３におけるQ-セフ
ァロースFF（商品名）カラムクロマトグラフィーの溶出
パターンを示す図である。

【図２】GnT VIの精製過程のステップ４におけるNi²⁺キ
レート・セファロースFF（商品名）カラムクロマトグラ
フィーの溶出パターンを示す図である。

【図３】GnT VIの精製過程のステップ５におけるUDP-ヘ
キサノールアミン・アガロースカラムクロマトグラフィ
ーの溶出パターンを示す図である。

【図４】GnT VIの精製過程のステップ６の後の試料を、
非還元条件下、10% SDS-PAGEを行って銀染色して得られ
た泳動パターンの模式図である。矢印は、GnT VIの位置
を示す。

【図５】GnT VI活性に対するｐＨの影響を示す図であ
る。

【図６】GnT VI活性に対するMn²⁺濃度の影響を示す図で
ある。MnCl₂の濃度を除いて参考例１に記載したアッセ
イ溶液中でGnT VIの活性を測定した。

【図７】本発明の研究で用いたピリジルアミン化糖鎖の
構造と略語を示す図である。

【図８】GnT VIのコード領域を含む、実施例で得られた
ｃＤＮＡ挿入物の塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図９】GnT VIのヒドロパシー（疎水性親水性指標）
を、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｅの方法に従い、プロッ
トして分析した結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA04 DA02 GA13 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 FF11E FF14E LL10 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA05 CA29 CA60

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列を構成する
   １若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若
   しくは１若しくは複数のアミノ酸が該アミノ酸配列に挿
   入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパ
   ク質であってアセチルグルコサミン転移酵素VI活性を有
   するタンパク質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有する領域を含む請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有する請求項１記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   のタンパク質をコードする核酸。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
   を有する請求項４記載の核酸。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の核酸を有し、宿主
   細胞中で請求項１ないし３のいずれか１項に記載のタン
   パク質を発現することができる組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターで形質転
   換され、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のタン
   パク質を産生する細胞。
8. 【請求項８】 GlcNAcがN-グリカンのコア構造のManα
   1,6アームの第4位に転移するのを触媒し、至適ｐＨが約
   7.75であり、ニワトリ卵管中に存在するアセチルグルコ
   サミン転移酵素VI。