JPH0937779A - ユビキチン結合酵素Ｅ２およびそれをコードするヒトｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞内蛋白質分解系で重要な役割を有してい
る新規ユビキチン結合酵素Ｅ２およびそれをコードする
ヒトｃＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質および配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。新規ユビキチン結合酵素Ｅ２をコードするヒト
ｃＤＮＡのクローニング、およびこのヒトｃＤＮＡがコ
ードする蛋白質の大腸菌による発現により得られる。 【効果】 発現産物である蛋白質はユビキチン結合活性
を示し、研究用試薬として利用しうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト細胞内で発現
しているｍＲＮＡに由来する新規ｃＤＮＡ、およびそれ
がコードするユビキチン結合酵素Ｅ２に関する。本発明
の ヒトｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治
療用遺伝子源として用いることが出来る。また、該ｃＤ
ＮＡがコードしている蛋白質を大量生産するための遺伝
子源として用いることが出来る。本発明の蛋白質は、ユ
ビキチン系研究のための試薬として用いることが出来
る。

【０００２】

【従来の技術】ユビキチンシステムは細胞内における蛋
白質分解システムの一つであり、ユビキチン活性化酵素
Ｅ１（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素Ｅ２（Ｅ２）、ユビ
キチン識別酵素Ｅ３（Ｅ３）から構成される複合酵素系
である［Ｈｅｒｓｈｋｏ、Ａ．ａｎｄ Ｃｉｅｃｈａｎ
ｏｖｅｒ、Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６１：７６１−８０７（１９９２）］。ユビキチン
（Ｕｂ）はＡＴＰ存在下Ｃ末端のグリシン残基を介して
Ｅ１のシステイン残基とチオエステル結合を形成する。
次いで、Ｅ１−ＵｂがＥ２と反応すると、活性化Ｕｂが
Ｅ１からＥ２に移動し、Ｅ２−Ｕｂが形成される。さら
にＥ２−ＵｂはＥ３存在下、標的蛋白質のユビキチン化
を行なう。ユビキチンによって標識された標的蛋白質
は、最終的にプロテアソームによってエネルギー依存的
に分解される。

【０００３】最近、ユビキチンシステムの異常が多くの
疾患と関連していることが明らかになってきた［Ｍａｙ
ｅｒ、Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８９：１４１−１５７（１
９９１）］。ユビキチン化の標的蛋白質特異性を決定す
るのはＥ２であると考えられており、酵母では１０種類
以上のＥ２が単離されている。しかもそれらの異常が、
細胞分裂や細胞増殖の異常を引き起こすことがわかって
いる。ヒトではさらに多くの種類のＥ２が存在し、さま
ざまな疾患と関連すると予想されているが、これまでに
単離されたＥ２の数は少なく、より多くのＥ２の単離と
機能解明が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
ユビキチン結合酵素Ｅ２をコードするヒトｃＤＮＡ、お
よびこのヒトｃＤＮＡがコードする蛋白質を提供するこ
とである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、新規ユビキチン結合酵素Ｅ２をコードするヒトｃ
ＤＮＡをクローン化し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は新規ユビキチン結合酵
素Ｅ２である、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質を提供する。また本発明は上記蛋白質をコード
する、配列番号１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを
提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のヒトｃＤＮＡは、ヒト細
胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが
出来る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体
から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも
良い。実施例ではヒト類表皮癌細胞株ＫＢから単離した
ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅ
ｒｇ法［Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，
Ｐ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−
１７０（１９８２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ
法［Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．
Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）］など
いかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クロー
ンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなベク
タープライマーを用いる方法が望ましい。ｃＤＮＡの同
定は、シーケンシングによる全塩基配列の決定、塩基配
列から予測されるアミノ酸配列と類似配列を有する既知
蛋白質の検索、インビトロ翻訳による蛋白質発現、大腸
菌による発現、発現産物の活性測定によって行なう。活
性測定は、標識されたユビキチンを含むウサギ網状赤血
球溶解物（ウサギＥ１を含んでいる）に発現産物を添加
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
発現産物とユビキチンのチオエステル結合体が生成する
ことを確認することによって行なう。

【０００８】本発明のｃＤＮＡは、配列番号１で表され
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号２で表されるものは、７１６ｂｐからなる
塩基配列を有し、４６５ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有していた。このオープンリーディングフレー
ムは、１５４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードして
いる。この蛋白質はアミノ酸配列レベルで酵母ユビキチ
ン結合酵素Ｅ２であるＵＢＣ４［Ｓｅｕｆｅｒｔ、Ｗ．
ａｎｄ Ｊｅｎｔｓｃｈ、Ｓ．、ＥＭＢＯ Ｊ．
９：５４３−５５０（１９９０）］と４０．３％という
高い類似性を有している。

【０００９】なお、配列番号１あるいは配列番号２に記
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、本発明で用いた細胞株から
作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、本発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容
易に得ることが出来る。

【００１０】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号１あるいは配列番号２
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。

【００１１】同様に、これらの変更によって生じる、１
又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のア
ミノ酸による置換がなされている蛋白質も、本発明の範
疇に入る。

【００１２】本発明のｃＤＮＡには、配列番号１あるい
は２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。

【００１３】本発明の蛋白質は、本発明のｃＤＮＡを有
するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによ
りインビトロで発現出来る。また翻訳領域を公知の方法
により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、
枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋白質を
大量に発現させることもできる。あるいは本発明のアミ
ノ酸配列に基づき、化学合成によってペプチドを調製す
ることも出来る。

【００１４】本発明の蛋白質には、ユビキチン結合蛋白
質Ｅ２活性を有するものであれば、他の任意の蛋白質と
の融合蛋白質も含まれる。例えば、実施例に挙げたマル
トース結合蛋白質との融合蛋白質が例示できる。

【００１５】

【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ． ｅｌ ａｌ．、
Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。

【００１６】ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの調製 ヒト類表皮癌細胞株ＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７）を
１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地中で５％ＣＯ₂気
流下３７℃で培養し、１ｇの細胞を得た。これを５．５
Ｍグアニジウムチオシアネート溶液１６ｍｌに溶解した
後、文献［Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ． ｅｔ ａｌ．、”Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏ
ｌ．１６４、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８
７］に従いｍＲＮＡを調製した。これを２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡで洗浄したオリゴｄＴセルロースカラムにか
け、上掲文献に従いポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ３００μｇを得
た。

【００１７】ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ１０μｇを１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、ＲＮａｓｅを含まないバ
クテリア由来アルカリホスファターゼ１単位を添加し、
３７℃１時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％２−
メルカプトエタノール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００溶液に溶解した。これに、タバコ由来酸ピロホス
ファターゼ（エピセンターテクノロジーズ社製）１単位
を添加して、総量１００μｌで３７℃１時間反応させ
た。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行な
い、ペレットを水に溶解した。

【００１８】脱キャップ処理したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド（５’−ｄＧ
−ｄＧ−ｄＧ−ｄＧ−ｄＡ−ｄＡ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＣ−
ｄＧ−ｄＡ−Ｇ−Ｇ−Ａ−３’）３ｎｍｏｌを５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭＡＴＰ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ２ーメルカプトエタノー
ル、２５％ポリエチレングリコール水溶液に溶解し、Ｔ
４ＲＮＡリガーゼ５０単位を添加し、総量３０μｌで２
０℃１２時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを水に溶解した。

【００１９】ｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２号公
報）をＫｐｎＩで消化後、末端転移酵素により約６０個
のｄＴテールを付加した。これをＥｃｏＲＶ消化して片
側のｄＴテールを除去したものをベクタープライマーと
して用いた。

【００２０】先に調製したキメラオリゴキャップ付加ポ
リ（Ａ）⁺ＲＮＡ６μｇを、ベクタープライマー１.２μ
ｇとアニールさせた後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
１０ｍＭジチオスレイトール、１．２５ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ）溶液に溶
解し、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯーＢＲＬ社製）２００単
位を添加し、総量２０μｌで４２℃１時間反応させた。
反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行ない、
ペレットを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
ジチオスレイトール溶液に溶解した。これにＥｃｏＲＩ
１００単位を添加し、総量２０μｌで３７℃１時間反応
させた。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を
行ない、ペレットを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５０μｇ／ｍｌ 牛血清アル
ブミン溶液に溶解した。これに大腸菌ＤＮＡリガーゼ６
０単位を添加し、１６℃で１６時間反応させた。反応液
に２ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
４単位、大腸菌ＲＮａｓｅＨ ０．１単位を添加し、１
２℃１時間ついで２２℃１時間反応させた。

【００２１】ｃＤＮＡ合成反応液を用いて大腸菌ＤＨ１
２Ｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）の形質転換を行なっ
た。形質転換はエレクトロポレーション法によって行な
った。形質転換体の一部を１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ン含有２ｘＹＴ寒天培地上に蒔いて３７℃一晩培養し
た。寒天上に生じた任意のコロニーを拾い１００μｇ／
ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌに接種して３
７℃２時間培養後、ヘルパーファージＭＫ１３ＫＯ７
（ファルマシア社）を感染させ、さらに３７℃一晩培養
した。培養液を遠心して、菌体と上清に分け、菌体から
はアルカリリシス法により２本鎖プラスミドＤＮＡを、
上清からは常法に従い一本鎖ファージＤＮＡを単離し
た。２本鎖プラスミドＤＮＡはＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで
二重消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動を行
ないｃＤＮＡインサートの大きさを求めた。一方一本鎖
ファージＤＮＡは、蛍光色素で標識したＭ１３ユニバー
サルプライマーとＴａｑポリメラーゼ（アプライドバイ
オシステムズ社製キット）を用いてシーケンス反応を行
なった後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオ
システムズ社）にかけてｃＤＮＡの５’末端約４００ｂ
ｐの塩基配列を決定した。配列データはホモ・プロテイ
ンｃＤＮＡバンクデータベースとしてファイル化した。

【００２２】ｃＤＮＡクローニング 上記ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したクローン
の塩基配列決定を行ない、得られた塩基配列を３フレー
ムのアミノ酸配列に変換した後、これらの配列でプロテ
インデータベースを検索した。解析ソフトウエアはＧＥ
ＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用い
た。その結果、クローンＨＰ００７４９がコードしてい
る蛋白質は、酵母ユビキチン結合蛋白質Ｅ２であるＵＢ
Ｃ４とアミノ酸配列レベルで類似性を有していることが
判明した。このクローンの構造を図１に示す。ｃＤＮＡ
インサートの全塩基配列を決定したところ、９ｂｐの
５’非翻訳領域、４６５ｂｐのオープンリーディングフ
レーム、２４２ ｂｐの３’非翻訳領域、８９ｂｐのポ
リ（Ａ）テールからなる構造を有していた（配列番号
２）。オープンリーディングフレームは１５４アミノ酸
残基からなる蛋白質をコードしており、この配列を用い
てプロテインデータベースを検索したところ、全領域に
わたって酵母ユビキチン結合蛋白質Ｅ２であるＵＢＣ４
のアミノ酸配列と４０．３％という高い類似性を有して
いた。表１に、本発明の蛋白質ＨＰ７４９（ＨＰ）と酵
母ＵＢＣ４（Ｅ２）のアミノ酸配列の比較を示す。−は
ギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基
を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ
表す。

【００２３】 表１ _________________________________________________________________ HP MAASRRLMKELEEIRKCGMKNFRNIQVDEANLLTWQGLIV-PDNPPYDKGAFRIEINFPA *..*.*. ***... . .. .. .*.. .* **. *. *...**. *.* ..*.**. E2 MSSSKRIAKELSDLERDPPTSCSAGPVGD-DLYHWQASIMGPADSPYAGGVFFLSIHFPT HP EYPFKPPKITFKTKIYHPNIDEKGQVCLPVISAENWKPATKTDQVIQSLIALVNDPQPEH .********.*.********...*..** ... ..*.** . ..*. *. .*..*..*.. E2 DYPFKPPKISFTTKIYHPNINANGNICLDILK-DQWSPALTLSKVLLSICSLLTDANPDD HP PLRADLAEEYSKDRKKFCKNAEEFTKKYGEKRPVD ** ...*. *..** *. .* *.****. E2 PLVPEIAHIYKTDRPKYEATAREWTKKYAV _________________________________________________________________

【００２４】なお得られたｃＤＮＡの配列を用いて塩基
配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢ
Ｊを検索した結果、ＥＳＴデータベースの中に配列番号
２で表される本発明のｃＤＮＡと部分的に一致するｃＤ
ＮＡの部分配列（登録番号Ｔ３０２４２など）が登録さ
れていることがわかった。ただし、部分配列が一致する
からといって、この断片と本発明の完全長ｃＤＮＡが同
じｍＲＮＡに由来するという保証はない。またこの配列
からだけでは、コードしているかもしれない蛋白質のア
ミノ酸配列並びに機能はわからない。

【００２５】インビトロ翻訳による蛋白質合成 本発明のｃＤＮＡを有するベクターを用いて、ＴＮＴウ
サギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるイ
ンビトロ翻訳を行なった。この際［³⁵Ｓ］メチオニンを
添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。
いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行
なった。発現産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた後、オートラジオグラフィーを行ない、
翻訳産物の分子量を求めた。その結果、本発明のｃＤＮ
Ａは、分子量約１８ｋＤａの翻訳産物を生成した。この
値は、配列番号２で表される塩基配列から予想される蛋
白質の予想分子量１７８６１と一致し、このｃＤＮＡが
確かに配列番号２で表される蛋白質をコードしているこ
とが示された。

【００２６】大腸菌による発現 ２本のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１（５’−Ｇ
ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧ
ＧＣＴＧ−３’）とＰＲ２（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴ
ＴＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＴＣＧＣＴＴＴＴＣ−３’）を
ＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社）に
より付属のプロトコールに従い合成した。

【００２７】プラスミドｐＨＰ００７４９を１ｎｇとプ
ライマーＰＲ１、ＰＲ２それぞれ１００ｐｍｏｌｅを用
いて、ＰＣＲキット（宝酒造社）によりｃＤＮＡの翻訳
領域を増幅した。フェノール抽出、エタノール沈殿後、
２０単位のＢｓａＩ（ニューイングランドバイオラボス
社）で消化後、クレノウ処理を行ない、ついでＳａｌＩ
で消化し、反応産物を１．５％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約５００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出し
精製した。

【００２８】次いでｐＭＡＬＴＭ−ｃ２（ニューイング
ランドバイオラボス社）１μｇを、２０単位のＸｍｎＩ
（ニューイングランドバイオラボス社）とＳａｌＩで消
化した後、０．６％アガロースゲル電気泳動にかけ、
６．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。ベク
ター断片とｃＤＮＡ断片をライゲーションキットにより
連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体
からプラスミドｐＭＡＬＨＰ７４９を調製し、制限酵素
切断地図により目的とする組換え体を確認した。得られ
たプラスミドの構造を図２に示す。

【００２９】ｐＭＡＬＨＰ７４９／ＪＭ１０９ の一晩
培養液１０ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有リ
ッチ培地（１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母抽
出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２ｇを含む）５０
０ｍｌに懸濁し、３７℃で振とう培養し、Ａ₆₀₀が約
０．５になったときにイソプロピルチオガラクトシドを
１ｍＭになるように添加した。さらに３７℃で３時間培
養後、遠心によって集菌し、菌体をカラムバッファー
（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、２００ｍＭＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２５ｍｌに懸濁した。この溶液
を超音波処理後、遠心し、上澄をベッド容積３．５ｍｌ
のアミロースカラム（ニューイングランドバイオラボス
社）にかけた。カラム体積の８倍量のカラムバッファー
でカラムを洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラムバ
ッファー２０ｍｌでマルトース結合蛋白質／ＨＰ７４９
融合蛋白質を溶出し、１５ｍｇの融合蛋白質を得た。融
合蛋白質をＳＤＳーポリアクリルアミド電気泳動にかけ
たところ、約６１ｋＤａの位置に単一のバンドが認めら
れた。この分子量の値は、マルトース結合蛋白質／Ｅ２
融合蛋白質の予想分子量と一致する。

【００３０】マルトース結合蛋白質／Ｅ２融合蛋白質１
００μｇを含むカラムバッファー２００μｌにファクタ
ーＸａ １μｇを添加し、４℃で１２時間反応させた。
反応液をアミロースカラムにかけ素通りしてきた分画を
集め、４８ｎｇのＥ２蛋白質を得た。これをＳＤＳーポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけたところ、本発明
のＥ２蛋白質に相当する約１８ｋＤａの位置にバンドが
認められた。

【００３１】ユビキチン結合活性測定 ヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７のｃＤＮＡライブラリー
（特開平４−１１７２９２号公報に記載）から任意に選
択したクローンの塩基配列決定を行ない、配列番号３で
表されるポリユビキチンｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡ
を含むプラスミド１６μｇを、Ｔ_NＴウサギ網状赤血球
溶解物３０μｌ、緩衝液（キットに付属）２．４μｌ、
アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）１．２μｌ、
［³⁵Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２．４μｌ
（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
１．２μｌ、ＲＮａｓｉｎ１．２μｌを含む総量６０μ
ｌの反応液中で２３℃で９０分間反応させた。さらに、
この反応液７μｌに融合蛋白質３μｇと緩衝液（２００
ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、４０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ ₂、４ｍＭ ＡＴＰ、０．４ｍＭジチオスレイトー
ル）３μｌを加え、総量１２μｌとし２３℃で２０分間
反応させた。得れた反応液５μｌにＳＤＳサンプリング
バッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、
２％ＳＤＳ溶液、０．１％ブロモフェノールブルー、１
０％グリセロール）５μｌを加え非還元的条件下でＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オート
ラジオグラフィーを行なった結果、約６９ｋＤａの位置
にバンドが認められた。この分子量は融合蛋白質とユビ
キチンの分子量の和に相当する。なお反応液に１００ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプリン
グバッファーを加え９５℃３分間加熱処理し、還元条件
下で電気泳動にかけたところ、このバンドは消失するこ
とから、チオエステル結合を含む複合体に起因すること
が示された。また、ファクターＸａ処理により、マルト
ース結合蛋白質部分を除去したものについて、同様の実
験を行ったところ、Ｅ２とユビキチンがチオエステル結
合して生成した約２６ｋＤａのバンドが認められた。以
上の結果より、大腸菌で発現させて得られたＥ２は、ユ
ビキチン結合活性を有することが示された。

【００３２】

【発明の効果】本発明は新規ユビキチン結合酵素Ｅ２を
コードするヒトｃＤＮＡ、このヒトｃＤＮＡがコードす
る蛋白質、およびこの蛋白質を含む融合蛋白質を提供す
る。本発明のｃＤＮＡを用いることにより、該組換え蛋
白質を大量に発現することができる。該組換え蛋白質
は、研究用試薬として利用することができる。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４６２ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG GCG GCC AGC AGG AGG CTG ATG AAG GAG CTT GAA GAA ATC CGC AAA 48 Met Ala Ala Ser Arg Arg Leu Met Lys Glu Leu Glu Glu Ile Arg Lys 1 5 10 15 TGT GGG ATG AAA AAC TTC CGT AAC ATC CAG GTT GAT GAA GCT AAT TTA 96 Cys Gly Met Lys Asn Phe Arg Asn Ile Gln Val Asp Glu Ala Asn Leu 20 25 30 TTG ACT TGG CAA GGG CTT ATT GTT CCT GAC AAC CCT CCA TAT GAT AAG 144 Leu Thr Trp Gln Gly Leu Ile Val Pro Asp Asn Pro Pro Tyr Asp Lys 35 40 45 GGA GCC TTC AGA ATC GAA ATC AAC TTT CCA GCA GAG TAC CCA TTC AAA 192 Gly Ala Phe Arg Ile Glu Ile Asn Phe Pro Ala Glu Tyr Pro Phe Lys 50 55 60 CCA CCG AAG ATC ACA TTT AAA ACA AAG ATC TAT CAC CCA AAC ATC GAC 240 Pro Pro Lys Ile Thr Phe Lys Thr Lys Ile Tyr His Pro Asn Ile Asp 65 70 75 80 GAA AAG GGG CAG GTC TGT CTG CCA GTA ATT AGT GCC GAA AAC TGG AAG 288 Glu Lys Gly Gln Val Cys Leu Pro Val Ile Ser Ala Glu Asn Trp Lys 85 90 95 CCA GCA ACC AAA ACC GAC CAA GTA ATC CAG TCC CTC ATA GCA CTG GTG 336 Pro Ala Thr Lys Thr Asp Gln Val Ile Gln Ser Leu Ile Ala Leu Val 100 105 110 AAT GAC CCC CAG CCT GAG CAC CCG CTT CGG GCT GAC CTA GCT GAA GAA 384 Asn Asp Pro Gln Pro Glu His Pro Leu Arg Ala Asp Leu Ala Glu Glu 115 120 125 TAC TCT AAG GAC CGT AAA AAA TTC TGT AAG AAT GCT GAA GAG TTT ACA 432 Tyr Ser Lys Asp Arg Lys Lys Phe Cys Lys Asn Ala Glu Glu Phe Thr 130 135 140 AAG AAA TAT GGG GAA AAG CGA CCT GTG GAC 462 Lys Lys Tyr Gly Glu Lys Arg Pro Val Asp 145 150

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：７１６ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ＝サピエンス 細胞の種類：類表皮癌 セルライン：ＫＢ クローン名：ＨＰ００７４９ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１０．．４７４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATCCAAG ATG GCG GCC AGC AGG AGG CTG ATG AAG GAG CTT GAA GAA ATC 51 Met Ala Ala Ser Arg Arg Leu Met Lys Glu Leu Glu Glu Ile 1 5 10 CGC AAA TGT GGG ATG AAA AAC TTC CGT AAC ATC CAG GTT GAT GAA GCT 99 Arg Lys Cys Gly Met Lys Asn Phe Arg Asn Ile Gln Val Asp Glu Ala 15 20 25 30 AAT TTA TTG ACT TGG CAA GGG CTT ATT GTT CCT GAC AAC CCT CCA TAT 147 Asn Leu Leu Thr Trp Gln Gly Leu Ile Val Pro Asp Asn Pro Pro Tyr 35 40 45 GAT AAG GGA GCC TTC AGA ATC GAA ATC AAC TTT CCA GCA GAG TAC CCA 195 Asp Lys Gly Ala Phe Arg Ile Glu Ile Asn Phe Pro Ala Glu Tyr Pro 50 55 60 TTC AAA CCA CCG AAG ATC ACA TTT AAA ACA AAG ATC TAT CAC CCA AAC 243 Phe Lys Pro Pro Lys Ile Thr Phe Lys Thr Lys Ile Tyr His Pro Asn 65 70 75 ATC GAC GAA AAG GGG CAG GTC TGT CTG CCA GTA ATT AGT GCC GAA AAC 291 Ile Asp Glu Lys Gly Gln Val Cys Leu Pro Val Ile Ser Ala Glu Asn 80 85 90 TGG AAG CCA GCA ACC AAA ACC GAC CAA GTA ATC CAG TCC CTC ATA GCA 339 Trp Lys Pro Ala Thr Lys Thr Asp Gln Val Ile Gln Ser Leu Ile Ala 95 100 105 110 CTG GTG AAT GAC CCC CAG CCT GAG CAC CCG CTT CGG GCT GAC CTA GCT 387 Leu Val Asn Asp Pro Gln Pro Glu His Pro Leu Arg Ala Asp Leu Ala 115 120 125 GAA GAA TAC TCT AAG GAC CGT AAA AAA TTC TGT AAG AAT GCT GAA GAG 435 Glu Glu Tyr Ser Lys Asp Arg Lys Lys Phe Cys Lys Asn Ala Glu Glu 130 135 140 TTT ACA AAG AAA TAT GGG GAA AAG CGA CCT GTG GAC TAAAATCTG 480 Phe Thr Lys Lys Tyr Gly Glu Lys Arg Pro Val Asp 145 150 CCACGATTGG TTCCAGCAGT GTGAGCAGAG ACCCCGTGCA GTGCATTCAG ACACCCCGCA 540 AAGCAGGACT CTGTGGAAAT TGACACGTGC CACCGCCTGG CGTTCGCTTG TGGCAGTTAC 600 TAACTTTCTA CAGTTTTCTT AATCAAAAGT GGTCTAGGTA ACCTGTAAAG AAAGGATTAA 660 AAATTTAAGA TGTTCTAGTT CTGCTCTCTT TGTTTTAAAA ATCACTGCTT CAATCT 716

【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：２１９２ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ＝サピエンス 細胞の種類：リンホーマ セルライン：Ｕ９３７ クローン名：ＨＰ００１８４ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６９．．２１２６ 配列 TAGTTCCGTC GCAGCCGGGA TTTGGGTCGC GGTTCTTGTT TGTGGATCGC TGTGATCGTC 60 ACTTGACA ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACT CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 110 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 1 5 10 CTC GAG GTT GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 158 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 15 20 25 30 CAA GAT AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG CTG ATC TTT GCT 206 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 35 40 45 GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 254 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 50 55 60 AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAA 302 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln 65 70 75 ATC TTC GTG AAG ACA CTC ACT GGC AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTG GAG 350 Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu 80 85 90 CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAC GTC AAA GCA AAG ATC CAG GAC AAG GAA 398 Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu 95 100 105 110 GGC ATT CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAG CAG CTG 446 Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu 115 120 125 GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCT ACC 494 Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr 130 135 140 CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG 542 Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys 145 150 155 ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAG GTG GAG CCC AGT GAC ACC 590 Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr 160 165 170 ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAT AAG GAA GGC ATT CCT CCT 638 Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro 175 180 185 190 GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGT CGT 686 Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg 195 200 205 ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC TTG CAC CTG GTA 734 Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val 210 215 220 CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAA ATC TTC GTG AAG ACA CTC ACT GGC 782 Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly 225 230 235 AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTC GAG CCC AGT GAC ACT ATC GAG AAC GTC 830 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val 240 245 250 AAA GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATT CCT CCT GAC CAG CAG AGG 878 Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 255 260 265 270 TTG ATC TTT GCC GGA AAG CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC 926 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 275 280 285 TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCT ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA 974 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 290 295 300 GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 1022 Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 305 310 315 CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 1070 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 320 325 330 CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC 1118 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 335 340 345 350 GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGT CGT ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 1166 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 355 360 365 AAA GAG TCC ACC TTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG 1214 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln 370 375 380 ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAG GTG GAG 1262 Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu 385 390 395 CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA 1310 Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu 400 405 410 GGC ATC CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG 1358 Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu 415 420 425 430 GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC 1406 Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr 435 440 445 CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG 1454 Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys 450 455 460 ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC 1502 Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr 465 470 475 ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT 1550 Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro 480 485 490 GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC 1598 Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg 495 500 505 510 ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG 1646 Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val 515 520 525 CTC CGT CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT 1694 Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly 530 535 540 AAG ACC ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC 1742 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val 545 550 555 AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG 1790 Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 560 565 570 TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC 1838 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 575 580 585 590 TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA 1886 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 595 600 605 GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 1934 Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 610 615 620 CTC GAG GTG GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 1982 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 625 630 635 CAA GAT AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT 2030 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 640 645 650 GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 2078 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 655 660 665 670 AAA GAG TCC ACT CTG CAC TTG GTC CTG CGC TTG AGG GGG GGT GTC 2123 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val 675 680 685 TAAGTTT CCCCTTTTAA GGTTTCAACA AATTTCATTG CACTTTCCTT TCAATAAAGT 2180 TGTTGCATTC CC 2192

【図面の簡単な説明】

【図１】 クローンＨＰ００７４９の構造を表す図であ
る。

【図２】 大腸菌用融合蛋白質発現ベクターｐＭＡＬＨ
Ｐ７４９の構造を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   む蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
   ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２で表される塩基配列からな
   る、請求項２記載のｃＤＮＡ。