JPH09263A

JPH09263A - ポリユビキチンｃＤＮＡおよび標識ユビキチンの製造方法

Info

Publication number: JPH09263A
Application number: JP7154616A
Authority: JP
Inventors: Masashi Kato; 誠志加藤; Mihoro Saeki; 美帆呂佐伯; Takae Kato; 孝枝加藤; Nanjiyun Kin; 南順金; Shingo Sekine; 伸吾関根
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 1997-01-07

Abstract

(57)【要約】【目的】ポリユビキチンをコードするヒトｃＤＮＡお
よびこれを用いる標識ユビキチンの製造方法を提供す
る。【構成】ポリユビキチンをコードするヒトｃＤＮＡ、
これを用いてた標識ユビキチンの製造方法、標識ユビキ
チンとユビキチン活性化酵素Ｅ１の複合体形成からな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリユビキチンｃＤＮ
Ａおよびこれを用いた標識ユビキチンの製造方法に関す
る。本発明のポリユビキチンｃＤＮＡおよび標識ユビ
キチンは、ユビキチンの代謝異常に起因する病気の診断
あるいはユビキチン系の研究用試薬として用いることが
出来る。

【０００２】

【従来技術】ユビキチンは７６アミノ酸残基からなる蛋
白質であり、細胞内蛋白質分解系において重要な役割を
担っている［蛋白質核酸酵素、３９巻４号、６９６−７
０９、１９９４；Ａ．ＨｅｒｓｈｋｏａｎｄＡ．Ｃ
ｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．、６１：７６１−８０７（１９９２）］。すなわ
ち細胞内で不用になった蛋白質にユビキチンが結合して
分解シグナルの提示を行なう。このプロセスには、ユビ
キチン活性化酵素Ｅ１（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素Ｅ
２（Ｅ２）、ユビキチン識別蛋白質Ｅ３（Ｅ３）などが
関与している。このようにしてユビキチン化された蛋白
質は、ＡＴＰ依存性プロテアソームによって分解され
る。

【０００３】最近の研究によれば、ユビキチン系の異常
がアルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経
変性を伴う病気と関連していることが示唆されている
［Ｒ．Ｊ．Ｍａｙｅｒｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０８９：１４１−１５
７（１９９１）］。従って、病変細胞におけるユビキチ
ンの発現やユビキチン系に関与する酵素活性を調べるこ
とはこれらの病気の診断や予防につながる。

【０００４】これまで、ヒトポリユビキチンをコードす
るゲノムＤＮＡ［Ｏ．Ｗｉｂｏｒｇｅｔａｌ．、ＥＭ
ＢＯＪ．４：７５５−７５９（１９８５）；Ｒ．Ｔ．
ＢａｋｅｒａｎｄＰ．Ｇ．Ｂｏａｒｄ、Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４４３−４６３（１９８
７）］およびｃＤＮＡ断片［Ｒ．Ｅｉｎｓｐａｎｉｅｒ
ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４７：５８１−５８７（１９８
７）；ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号Ｍ７８０８２；Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ、登録番号Ｚ２０９５８］がクローン化されて
いるが、まだ完全長ｃＤＮＡクローンは報告されていな
い。

【０００５】ユビキチン系に関与する酵素活性を調べる
ために、放射性ヨード（¹²⁵Ｉ）で標識したユビキチン
が基質として使用されてきた［例えば、Ａ．Ｌ．Ｈａａ
ｓａｎｄＰ．Ｍ．Ｂｒｉｇｈｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６３：１３２５８−１３２６７（１９８
８）］。しかし、他の放射性物質に比較し放射性ヨード
による標識には危険が伴う。またヨード化によってユビ
キチンの機能が低下するという報告もある［Ｃ．Ｍ．Ｐ
ｉｃｋａｒｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２６７：１４４１８−１４４２３（１９９
２）］。ニワトリジユビキチンをコードするｃＤＮＡ断
片からインビトロ転写によってｍＲＮＡを調製し、この
ｍＲＮＡを［³⁵Ｓ］メチオニンを含むウサギ網状赤血球
溶解液中でインビトロ翻訳し、³⁵Ｓ標識したユビキチン
が生成したという報告［Ｎ．Ａｇｅｌｌｅｔａ
ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８５：３６９３−３６９７（１９８８）］がある
が、ヒトポリユビキチンｃＤＮＡを用いた系でこの反応
が進行するか否かは不明である。また生成したユビキチ
ンがユビキチン活性化酵素の基質になるかどうかも示さ
れていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ポリ
ユビキチンをコードするヒト完全長ｃＤＮＡ、およびこ
れを用いてユビキチン反応系酵素の基質としての活性を
有する標識ユビキチンの製造方法を提供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ポリユビキチンをコードするヒト完全長ｃＤＮＡ
をクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本発明
はポリユビキチンをコードするヒト完全長ｃＤＮＡであ
る、配列番号１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを提
供する。また、本発明はＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ーの下流にポリユビキチンをコードするｃＤＮＡを有
し、ポリユビキチンをコードするｍＲＮＡをインビトロ
転写によって合成可能な組換えＤＮＡを提供する。さら
に、本発明は、上記組換えＤＮＡを鋳型として用いてイ
ンビトロ転写を行ない、ついで標識アミノ酸を含有する
細胞溶解物中でインビトロ翻訳を行なうことを特徴とす
る、標識ユビキチンの製造方法を提供する。

【０００８】本発明のヒトｃＤＮＡは、ヒト細胞由来ｃ
ＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来る。
ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを
鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術
などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。実
施例ではヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７から単離したポ
リ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒ
ｇ法［Ｈ．ＯｋａｙａｍａａｎｄＰ．Ｂｅｒｇ，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０
（１９８２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法
［Ｕ．ＧｕｂｌｅｒａｎｄＪ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅ
ｎｅ２５：２６３−２６９（１９８３）］などいかな
る方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効
率的に得るためには、実施例にあげたようなベクタープ
ライマーを用いる方法［Ｓ．Ｋａｔｏｅｔａｌ．、Ｇ
ｅｎｅ１５０：２４３−２５０（１９９４）］が望ま
しい。ｃＤＮＡの同定は、シーケンシングによる全塩基
配列の決定によって行なう。

【０００９】本発明のｃＤＮＡは、配列番号１で表され
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号２で表される塩基配列からなるものは、２
１９２ｂｐからなる塩基配列を有し、２０５８ｂｐのオ
ープンリーディングフレームを有していた。このオープ
ンリーディングフレームは、６８５アミノ酸残基からな
る蛋白質をコードしている。この蛋白質は７６アミノ酸
残基からなるユビキチンが連続して９個融合したポリユ
ビキチンである。

【００１０】なお、配列番号１あるいは配列番号２に記
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、本発明で用いた細胞株から
作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、本発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容
易に得ることが出来る。

【００１１】本発明のｃＤＮＡには、配列番号１あるい
は２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇に入る。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロー
ブとして用いることができる。

【００１２】インビトロ転写用組換えＤＮＡに用いるＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーター、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなど
を例示できる。インビトロ転写用組換えＤＮＡとして
は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとｃＤＮＡの融合
遺伝子をそのまま用いることもできるし、該融合遺伝子
を任意のベクターに挿入されたもの（例えば図１記載の
ベクター）を用いることもできる。インビトロ転写は、
上記融合遺伝子に対応するＲＮＡポリメラーゼを公知の
条件下で作用させることによって行なう。この工程は市
販のキットを用いて行なうこともできる。

【００１３】インビトロ翻訳は、ウサギ網状赤血球溶解
物や小麦胚芽溶解物などの細胞溶解物を用いて行なう。
これらの細胞溶解物は、公知の方法により調製すること
もできるが、市販キットとしても入手できる。標識アミ
ノ酸としては、［³⁵Ｓ］メチオニン、［¹⁴Ｃ］ロイシ
ン、［³Ｈ］ロイシンなどのラジオアイソトープ標識ア
ミノ酸や、ビオチン標識リジンなどのような非ラジオア
イソトープ標識アミノ酸を用いることができる。

【００１４】本発明の組換えＤＮＡを、インビトロ転写
次いでインビトロ翻訳を行なうと、配列番号１で表され
るアミノ酸配列からなる分子量７５ｋＤａのポリユビキ
チン蛋白質は生成せず、インビトロプロセシングによっ
て生成した分子量８ｋＤａのユビキチンが得られる。生
成した標識ユビキチンはそのまま用いてもよいし、ゲル
濾過クロマトグラフィーなどにより、低分子量の基質や
高分子量の蛋白質を除去した後用いてもよい。

【００１５】生成した標識ユビキチンをＡＴＰ存在下Ｅ
１と反応させると、標識ユビキチンとＥ１との複合体の
形成が認められ、本発明の標識ユビキチンは、ユビキチ
ン反応系酵素の基質としての活性を有することが示され
た。

【００１６】

【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。

【００１７】ｃＤＮＡクローニングヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７のｃＤＮＡライブラリー
（特開平４−１１７２９２号公報に記載）から任意に選
択したクローンの塩基配列決定を行ない、得られた塩基
配列を３フレームのアミノ酸配列に変換した後、これら
の配列でプロテインデータベースを検索した。解析ソフ
トウエアはＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発
社製）を用いた。その結果、クローンＨＰ００１８４が
コードしている蛋白質は、ユビキチンであることが判明
した。このクローンの構造を図１に示す。ｃＤＮＡイン
サートの全塩基配列を決定したところ、６８ｂｐの５’
非翻訳領域、２０５８ｂｐのオープンリーディングフレ
ーム、６６ｂｐの３’非翻訳領域、８８ｂｐのポリ
（Ａ）テールからなる構造を有していた（配列番号
２）。オープンリーディングフレームは６８５アミノ酸
残基からなる蛋白質をコードしている。この蛋白質は７
６アミノ酸残基からなるユビキチンが連続して９個融合
したポリユビキチンであった。

【００１８】なお、本発明の遺伝子と同様に９個の繰り
返し単位からなるポリユビキチンをコードするヒトゲノ
ムＤＮＡが報告されているが［Ｏ．Ｗｉｂｏｒｇｅｔ
ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．４：７５５−７５９（１９８
５）］、５’非翻訳領域は全く類似性が認められず、ま
た翻訳領域においても、９６．２％という類似性であ
り、異なるクローンである。さらに、２個のｃＤＮＡ断
片［Ｒ．Ｅｉｎｓｐａｎｉｅｒｅｔａｌ．、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１
４７：５８１−５８７（１９８７）；ＧｅｎＢａｎｋ、
登録番号Ｍ７８０８２］が、本発明のｃＤＮＡの一部
（それぞれ、１３１７番目から２１４０番目、および６
１２番目から８６６番目）と一致することが示された
が、部分配列が一致するからといって、この断片と本発
明の完全長ｃＤＮＡが同じｍＲＮＡに由来するという保
証はない。またこれらのｃＤＮＡ断片は、開始コドンか
ら始まるオープンリーディングフレームを含まないの
で、これらの断片を用いて蛋白質を合成することも出来
ない。

【００１９】ウサギ網状赤血球溶解物を用いるインビト
ロ翻訳本発明のｃＤＮＡを有するベクターを用いて、Ｔ_NＴウ
サギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるイ
ンビトロ転写／インビトロ翻訳を行なった。この際［³⁵
Ｓ］メチオニン（アマーシャム社製）を添加し、発現産
物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応も
キットに付属のプロトコールに従って行なった。プラス
ミドｐＨＰ００１８４３μｇを、ＴＮＴウサギ網状赤
血球溶解物２０μｌ、緩衝液（キットに付属）１．６μ
ｌ、アミノ酸混合液（Ｍｅｔを含まない）０．８μｌ、
［³⁵Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）１．６μｌ
（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
０．８μｌ、ＲＮａｓｉｎ３２Ｕを含む総量４０μｌ
の反応液中で２３℃で１０分間から９０分間反応させ
た。反応液５μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１００ｍＭ２−
メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．１％ブロ
モフェノールブルー、１０％グリセロール）５μｌを加
え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィ
ーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた結果、本発明の
ｃＤＮＡは、分子量約８ｋＤａの翻訳産物を生成した。
この値は、配列番号２で表される塩基配列から予想され
る蛋白質の予想分子量７５ｋＤａとは一致せず、ユビキ
チンの分子量８ｋＤａと一致する。翻訳産物であるポリ
ユビキチン（ユビキチンが連続して９個融合したもの）
が、ウサギ網状赤血球溶解物に含まれているポリユビキ
チンＣ末端ヒドラターゼの作用により、翻訳後直ちにプ
ロセシングを受けてユビキチンになったものである。な
お、反応時間を長くすると、高分子量のスメアなバンド
が認められるようになる。これらは、溶解物中に存在す
るＥ１、Ｅ２、Ｅ３の作用で、各種の蛋白質が標識ユビ
キチンと複合体を形成したものであると考えられる。

【００２０】小麦胚芽溶解物を用いるインビトロ翻訳プラスミドｐＨＰ００１８４２μｇを２０ＵのＮｏｔ
Ｉで消化したのち、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ各
１０ｎｍｏｌｅ、１０ｘ緩衝液（８００ｍＭＨｅｐｅｓ
ーＫＯＨ、ｐＨ７．５、２０ｍＭスペルミジン、２００
ｍＭジチオスレイトール、１２０ｍＭＭｇＣｌ₂）２
μｌを含む総量２０μｌの反応液中で３７℃で９０分間
反応させた。さらにＤＮａｓｅ３５Ｕを添加して３７
℃で３０分間反応させた。反応液のフェノール抽出、エ
タノール沈殿により、ＲＮＡを得た。調製したＲＮＡ
０．５μｇを小麦胚芽溶解物（アマーシャム社）７．５
μｌ、１ｍＭアミノ酸混合液（メチオニンを含まない）
１μｌ、［³⁵Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）０．８
μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、ＲＮａｓｉｎ１２
Ｕ、１Ｍ酢酸カリウム０．７５μｌを含む総量１５μｌ
の反応液中で２５℃で１時間反応させた。反応液５μｌ
にＳＤＳサンプリングバッファー５μｌを加え、９５℃
３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行な
い、翻訳産物の分子量を求めた結果、ウサギ網状赤血球
溶解物の場合と同様に分子量約８ｋＤａの翻訳産物を生
成した。

【００２１】ユビキチン活性化酵素の調製マウスユビキチン活性化酵素Ｅ１ｃＤＮＡ［Ｎ．Ｉｍａ
ｉｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ、１１８：２７９−２８２
（１９９２）］のＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１
１９にサブクローニングした後、開始コドン部位にＮｄ
ｅＩ部位を導入した。このプラスミドをＮｄｅＩとＥｃ
ｏＲＩで消化、次いでクレノウ処理した後、ｃＤＮＡ断
片をプラスミドｐＲＳＥＴ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社）のＢａｍＨＩ部位（クレノウ処理）に挿入し、ｐ
ＲＳＥＴ−Ｅ１を作製した。ｐＲＳＥＴ−Ｅ１を有する
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌアンピシ
リン含有ＬＢ培地中３０℃で培養後、ＩＰＴＧ（最終濃
度１ｍＭ）誘導を行ない、（Ｈｉｓ）₆−Ｅ１融合蛋白
質を発現させた。菌体を超音波処理によって溶解した
後、遠心上澄をＮｉキレートカラムクロマトグラフィー
にかけて精製した。１Ｍイミダゾール溶液によって溶出
した画分を透析し、（Ｈｉｓ）₆−Ｅ１融合蛋白質の標
品を得た。以上の操作は、すべてキットに付属のプロト
コールに従って行なった。

【００２２】標識ユビキチンとユビキチン活性化酵素と
の結合上記インビトロ翻訳の反応液に、（Ｈｉｓ）₆−Ｅ１融
合蛋白質の標品２６μｇを添加して２３℃９０分間反応
を行なった。翻訳産物に２−メルカプトエタノールを含
まないＳＤＳサンプリングバッファーを添加して、すな
わち非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけたところ、１２０ｋＤａの位置にバンドが
認められた。一方翻訳産物にＳＤＳサンプリングバッフ
ァーを加え、９５℃３分間加熱処理した後、すなわち還
元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけたところ、１２０ｋＤａのバンドは消失した。従っ
て、このバンドは（Ｈｉｓ）₆−Ｅ１融合蛋白質と標識
ユビキチンがチオエステル結合によって結合した複合体
であることが示された。すなわち、ポリユビキチンｃＤ
ＮＡのインビトロ翻訳の結果生成した標識ユビキチンは
ユビキチン活性化酵素Ｅ１の基質となることが判明し
た。

【００２３】

【発明の効果】本発明はポリユビキチンをコードするヒ
トｃＤＮＡ、これを有する組換えＤＮＡおよびこれを用
いた標識ユビキチンの製造方法を提供する。本発明のポ
リユビキチンｃＤＮＡおよび標識ユビキチンは、ユビ
キチンの代謝異常に起因する病気の診断あるいはユビキ
チン系の研究用試薬として用いることが出来る。

【００２４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０５５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACT CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAG 48 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 GTT GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAT 96 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG CTG ATC TTT GCT GGA AAA 144 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG 192 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAA ATC TTC 240 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 65 70 75 80 GTG AAG ACA CTC ACT GGC AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTG GAG CCC AGT 288 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 85 90 95 GAC ACC ATC GAG AAC GTC AAA GCA AAG ATC CAG GAC AAG GAA GGC ATT 336 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 100 105 110 CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAG CAG CTG GAA GAT 384 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 115 120 125 GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCT ACC CTG CAC 432 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 130 135 140 CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG 480 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 145 150 155 160 ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAG GTG GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG 528 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 165 170 175 AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAT AAG GAA GGC ATT CCT CCT GAT CAG 576 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 180 185 190 CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGT CGT ACC CTG 624 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 195 200 205 TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC TTG CAC CTG GTA CTC CGT 672 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 210 215 220 CTC AGA GGT GGG ATG CAA ATC TTC GTG AAG ACA CTC ACT GGC AAG ACC 720 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 225 230 235 240 ATC ACC CTT GAG GTC GAG CCC AGT GAC ACT ATC GAG AAC GTC AAA GCA 768 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 245 250 255 AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATT CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC 816 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 260 265 270 TTT GCC GGA AAG CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC 864 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 275 280 285 ATC CAG AAA GAG TCT ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG 912 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 290 295 300 ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAA 960 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 305 310 315 320 GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC 1008 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 325 330 335 AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAA 1056 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 340 345 350 CAG CTG GAA GAT GGT CGT ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG 1104 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 355 360 365 TCC ACC TTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC 1152 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 370 375 380 GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAG GTG GAG CCG AGT 1200 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 385 390 395 400 GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC 1248 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 405 410 415 CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT 1296 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 420 425 430 GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC 1344 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 435 440 445 CTG GTG CTC CGT CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG 1392 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 450 455 460 ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG 1440 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 465 470 475 480 AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG 1488 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 485 490 495 CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG 1536 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 500 505 510 TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT 1584 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 515 520 525 CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC 1632 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 530 535 540 ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA 1680 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 545 550 555 560 AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC 1728 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 565 570 575 TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC 1776 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 580 585 590 ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG 1824 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 595 600 605 ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAG 1872 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 610 615 620 GTG GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAT 1920 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 625 630 635 640 AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA 1968 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 645 650 655 CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG 2016 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 660 665 670 TCC ACT CTG CAC TTG GTC CTG CGC TTG AGG GGG GGT GTC 2055 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val 675 680 685

【００２５】配列番号：２配列の長さ：２１９２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：リンホーマセルライン：Ｕ９３７クローン名：ＨＰ００１８４配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：６９．．２１２６特徴を決定した方法：Ｅ配列 TAGTTCCGTC GCAGCCGGGA TTTGGGTCGC GGTTCTTGTT TGTGGATCGC TGTGATCGTC 60 ACTTGACA ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACT CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 110 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 1 5 10 CTC GAG GTT GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 158 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 15 20 25 30 CAA GAT AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG CTG ATC TTT GCT 206 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 35 40 45 GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 254 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 50 55 60 AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAA 302 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln 65 70 75 ATC TTC GTG AAG ACA CTC ACT GGC AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTG GAG 350 Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu 80 85 90 CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAC GTC AAA GCA AAG ATC CAG GAC AAG GAA 398 Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu 95 100 105 110 GGC ATT CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAG CAG CTG 446 Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu 115 120 125 GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCT ACC 494 Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr 130 135 140 CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG 542 Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys 145 150 155 ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC CTC GAG GTG GAG CCC AGT GAC ACC 590 Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr 160 165 170 ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAT AAG GAA GGC ATT CCT CCT 638 Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro 175 180 185 190 GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGT CGT 686 Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg 195 200 205 ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC TTG CAC CTG GTA 734 Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val 210 215 220 CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAA ATC TTC GTG AAG ACA CTC ACT GGC 782 Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly 225 230 235 AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTC GAG CCC AGT GAC ACT ATC GAG AAC GTC 830 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val 240 245 250 AAA GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATT CCT CCT GAC CAG CAG AGG 878 Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 255 260 265 270 TTG ATC TTT GCC GGA AAG CAG CTG GAA GAT GGG CGC ACC CTG TCT GAC 926 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 275 280 285 TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCT ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA 974 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 290 295 300 GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 1022 Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 305 310 315 CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 1070 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 320 325 330 CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCC 1118 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 335 340 345 350 GGA AAA CAG CTG GAA GAT GGT CGT ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 1166 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 355 360 365 AAA GAG TCC ACC TTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA GGT GGG ATG CAG 1214 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln 370 375 380 ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAG GTG GAG 1262 Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu 385 390 395 CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA 1310 Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu 400 405 410 GGC ATC CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG 1358 Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu 415 420 425 430 GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC 1406 Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr 435 440 445 CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG 1454 Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys 450 455 460 ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC 1502 Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr 465 470 475 ATT GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT 1550 Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro 480 485 490 GAC CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC 1598 Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg 495 500 505 510 ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG 1646 Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val 515 520 525 CTC CGT CTT AGA GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT 1694 Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly 530 535 540 AAG ACC ATC ACT CTC GAA GTG GAG CCG AGT GAC ACC ATT GAG AAT GTC 1742 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val 545 550 555 AAG GCA AAG ATC CAA GAC AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAC CAG CAG AGG 1790 Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 560 565 570 TTG ATC TTT GCT GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC 1838 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 575 580 585 590 TAC AAC ATC CAG AAA GAG TCC ACC CTG CAC CTG GTG CTC CGT CTC AGA 1886 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 595 600 605 GGT GGG ATG CAG ATC TTC GTG AAG ACC CTG ACT GGT AAG ACC ATC ACC 1934 Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 610 615 620 CTC GAG GTG GAG CCC AGT GAC ACC ATC GAG AAT GTC AAG GCA AAG ATC 1982 Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile 625 630 635 CAA GAT AAG GAA GGC ATC CCT CCT GAT CAG CAG AGG TTG ATC TTT GCT 2030 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 640 645 650 GGG AAA CAG CTG GAA GAT GGA CGC ACC CTG TCT GAC TAC AAC ATC CAG 2078 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 655 660 665 670 AAA GAG TCC ACT CTG CAC TTG GTC CTG CGC TTG AGG GGG GGT GTC 2123 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val 675 680 685 TAAGTTTCCC CTTTTAAGGT TTCAACAAAT TTCATTGCAC TTTCCTTTCA ATAAAGTTGT 2183 TGCATTCCC 2192

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨＰ００１８４の構造を表す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。
【請求項２】配列番号２で表される塩基配列からな
る、請求項１記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流
に請求項１記載のｃＤＮＡを有し、配列番号１で表され
る蛋白質をコードするｍＲＮＡをインビトロ転写によっ
て合成可能な組換えＤＮＡ。
【請求項４】請求項３記載のＤＮＡを鋳型として用い
てインビトロ転写を行ない、ついで標識アミノ酸を含有
する細胞溶解物中でインビトロ翻訳を行なうことを特徴
とする、標識ユビキチンの製造方法。