JPH0975085A

JPH0975085A - ヒト２６ｓプロテアソーム構成成分蛋白質およびそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH0975085A
Application number: JP7235052A
Authority: JP
Inventors: Masashi Kato; 誠志加藤; Mihoro Saeki; 美帆呂佐伯; Shingo Sekine; 伸吾関根; Keiji Tanaka; 啓二田中
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 1997-03-25

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞内蛋白質分解系で重要な役割を有してお
り、各種疾患の治療や診断に用いることが可能なヒト２
６Ｓプロテアソーム構成成分およびそれをコードするヒ
トｃＤＮＡを提供する。【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配
列番号１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。【効果】本発明のヒトプロテアソーム構成成分Ｐ２８蛋
白質をコードするヒトｃＤＮＡの組換え体を発現させる
ことにより該蛋白質が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト細胞内プロテ
アーゼである２６Ｓプロテアソームを構成する蛋白質、
およびそれをコードしているＤＮＡに関する。本発明の
蛋白質は、ヒト２６Ｓプロテアソームの機能解明に有用
であるのみならず、各種病態の診断および治療にも有用
である。本発明のヒトｃＤＮＡは、遺伝子診断用プロー
ブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることが出来る。
また、該ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量生産す
るための遺伝子源として用いることが出来る。

【０００２】

【従来技術】多機能プロテアーゼであるプロテアソーム
は酵母からヒトに至る真核生物に広く存在し、細胞内で
エネルギー依存的にユビキチン化蛋白質を分解する酵素
である。プロテアソームは分子量２１〜３１ｋＤａの種
々の構成成分からなる２０Ｓプロテアソーム、および３
０〜１１２ｋＤａ、沈降係数２２ＳのＰＡ７００制御蛋
白質群で構成され、全体として沈降係数２６Ｓ、分子量
約２００万Ｄａを有する巨大分子（以降、２６Ｓプロテ
アソームと呼ぶ）より構成されている［Ｒｅｃｈｃｈｓ
ｔｅｉｎｅｒ、Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：６０６５−６０６８（１９９３）、Ｙ
ｏｓｈｉｍｕｒａ、Ｔ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｓｔｒｕ
ｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１１：２００−２１１（１９９
３）、Ｔａｎａｋａ、Ｋ．ｅｔａｌ．、ＮｅｗＢ
ｉｏｌｏｇｉｓｔ４：１７３−１８７（１９９
２）］。プロテアソームの全容は明かになっていない
が、酵母やマウスなどを用いた研究から以下に示すよう
な機能・有用性が明かになっている。

【０００３】真核生物の細胞内において、エネルギー
（ＡＴＰ）依存的な蛋白質の分解は、ユビキチンが蛋白
質に選別的に結合することにより開始されるが、ユビキ
チンの結合した蛋白質を分解するＡＴＰ依存的な活性は
プロテアソーム、特に２６Ｓプロテアソームにあること
が明かになっており［Ｃｈｕ−Ｐｉｎｇ、Ｍ．ｅｔａ
ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３５３９−３
５４７（１９９４）］、ヒト２６Ｓプロテアソームはエ
ネルギー依存性の蛋白質分解機構の解明に有用であると
考えられる。

【０００４】ｃ−Ｍｙｃ、Ｍｏｓ、Ｆｏｓを始めとする
ガン遺伝子やサイクリンのような細胞周期関連遺伝子の
分解は、エネルギーおよびユビキチン依存的に２６Ｓプ
ロテアソームにより行なわれることが判明しており［Ｉ
ｓｈｉｄａ、Ｎ．ｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔ
ｔ．３２４：３４５−３４８（１９９３）、Ｈｅｒｓｈ
ｋｏ、Ａ．ａｎｄＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａ．、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：７６１−
８０７（１９９２）］、細胞周期制御におけるプロテア
ソームの重要性が認識されている。

【０００５】また肝癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞など
においてプロテアソーム遺伝子は異常発現しており［Ｋ
ａｎａｙａｍａ、Ｈ．ｅｔａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５１：６６７７−６６８５（１９９１）］、腫
瘍細胞核にプロテアソームが異常に蓄積されていること
が観察されている。従って、ヒトプロテアソームはこれ
らの癌化のメカニズムの解明や癌の診断あるいは治療に
有用と考えられる。

【０００６】また、プロテアソームの発現がインターフ
ェロンγなどによって誘導され、細胞内でのクラスＩ主
要組織適合抗原提示などに深く関与していることが示唆
されている［Ａｋｉ、Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１１５：２５７−２６９（１９９４）、Ｍｉ
ｃｈａｌｅｋ、Ｍ．Ｔ．ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ
３６３：５５２−５５５４（１９９４）］。従って、
ヒトプロテアソームの構成成分は免疫系の抗原提示のメ
カニズムの解明や免疫抑制剤の開発にも利用できる。

【０００７】さらにアルツハイマー患者の脳内において
ユビキチン化蛋白質が異常に蓄積しているという現象
［Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ、Ｎ．ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ３３１：５３０−５３２（１９８８）］から、アル
ツハイマー病にプロテアソームが関与していることも示
唆されており、ヒトプロテアソームはアルツハイマー病
の原因解明やその治療に有用と考えられる。

【０００８】ヒト２６Ｓプロテアソームの特性を有する
蛋白質については特開平５−２９２９６４に開示されて
おり、またラットプロテアソーム構成蛋白質については
特開平５−２６８９５７および特開平５−３１７０５９
に開示されているが、本発明のヒト２６Ｓプロテアソー
ム構成成分は知られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
２６Ｓプロテアソームを構成する分子量約２８ｋＤａの
蛋白質（以下Ｐ２８蛋白質と呼ぶ）、および該蛋白質を
コードするＤＮＡを提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ヒト２６Ｓプロテアソームを構成するＰ２８蛋白
質をコードするヒトｃＤＮＡをクローン化し、本発明を
完成した。すなわち、本発明はヒトＰ２８蛋白質であ
る、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を
提供する。また本発明は上記蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、例えば配列番号１で表される塩基配列を含むｃＤＮ
Ａを提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の蛋白質は、ヒトの臓器、
細胞株などから単離する方法、本発明のアミノ酸配列に
基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、ある
いは本発明のヒトＰ２８蛋白質をコードするＤＮＡを用
いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得す
ることができるが、組換えＤＮＡ技術で取得する方法が
好ましく用いられる。例えば、本発明のｃＤＮＡを有す
るベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによ
りインビトロで発現出来る。また翻訳領域を公知の方法
により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、
枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋白質を
大量に発現させることができる。

【００１２】本発明のＤＮＡには、上記蛋白質をコード
するすべてのＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、化学合成
による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用
いて取得することができる。

【００１３】本発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来
ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来
る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から
手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良
い。実施例ではヒトリンホーマ細胞株Ｕ９３７から単離
したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−
Ｂｅｒｇ法［Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄＢｅｒ
ｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６
１−１７０（１９８２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍ
ａｎ法［Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄＨｏｆｆｍａ
ｎ，Ｊ．Ｇｅｎｅ２５：２６３−２６９（１９８
３）］などいかなる方法を用いて合成してもよいが、完
全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげた
ようなベクタープライマーを用いる方法が望ましい。

【００１４】ｃＤＮＡのクローニングは、ウシ２６Ｓプ
ロテアソーム構成成分Ｐ２８蛋白質の単離精製および部
分アミノ酸配列決定、ｃＤＮＡライブラリーから任意に
選択したｃＤＮＡクローンの部分塩基配列決定、塩基配
列から予測されるアミノ酸配列のデータベース作製、ウ
シＰ２８蛋白質の部分アミノ酸配列によるデータベース
検索によって行なう。ｃＤＮＡの同定は、シーケンシン
グによる全塩基配列の決定、塩基配列から予測されるア
ミノ酸配列とウシＰ２８蛋白質部分アミノ酸配列の比
較、インビトロ翻訳による蛋白質発現、大腸菌による発
現によって行なう。

【００１５】本発明のｃＤＮＡは、配列番号１で表され
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号２で表されるものは、１４６８ｂｐからな
る塩基配列を有し、６８１ｂｐのオープンリーディング
フレームを有していた。このオープンリーディングフレ
ームは、２２６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードし
ている。

【００１６】なお、配列番号１あるいは配列番号２に記
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、本発明で用いた細胞株から
作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、本発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容
易に得ることが出来る。

【００１７】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号１あるいは配列番号２
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。

【００１８】同様に、これらの変更によって生じる、１
又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のア
ミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する
限り、本発明の範疇に入る。

【００１９】本発明のｃＤＮＡには、配列番号１あるい
は２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。

【００２０】

【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ．ｅｔａｌ．、
Ｇｅｎｅ１５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。

【００２１】ウシ２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ２８
蛋白質の単離精製および部分アミノ酸配列の決定文献［Ｃｈｕ−Ｐｉｎｇ、Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：３５３９−３５４７（１
９９４）］に記載されているウシプロテアソームの精製
法に従い、ウシ赤血球より、硫安沈殿、セファクリルＳ
−３００、ＤＥＡＥフラクトゲルおよびハイドロキシア
パタイトを用いたカラムクロマトグラフィーによりウシ
プロテアソームの精製を行なった。得られたウシプロテ
アソームから、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により、Ｐ２８蛋白質を分画した。該溶出画分を、
ジチオスレイトール還元下、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行ない、ウシＰ２８蛋白質を単離精製した。

【００２２】ウシＰ２８蛋白質の部分アミノ酸配列を以
下の方法により決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した
ウシＰ２８蛋白質を、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．
０）、４Ｍ尿素中、１μｇのリジン特異的エンドプロテ
アーゼにより３７℃で８時間酵素消化を行なった。得ら
れた部分ペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離し、４種類
のペプチド断片についてＮ末端のアミノ酸配列を自動プ
ロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社）により決定した。各ペプチド断片のＮ末端アミノ酸
配列を配列番号３〜６に示した。

【００２３】ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの調製ヒトリンフォーマ細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ
１５９３）を５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０
培地中で５％ＣＯ₂気流下３７℃で培養した後、フォル
ボールミリステートアセテート（３０ｎｇ／ｍｌ培地）
で１６時間処理し、１．１ｇの細胞を得た。これを５．
５Ｍグアニジウムチオシアネート溶液１６ｍｌに溶解し
た後、文献［Ｏｋａｙａｍａｅｔａｌ．、”Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１６
４、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８７］に従い
ｍＲＮＡを調製した。これを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡで
洗浄したオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、上掲文献
に従いポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した。このようにして
７２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを得た。

【００２４】ｃＤＮＡライブラリーの作製クローニングベクターｐＫＡ１（特開平４−１１７２９
２号公報）をＫｐｎＩで消化後、末端転移酵素により約
６０個のｄＴテールを付加した。これをＥｃｏＲＶ消化
して片側のｄＴテールを除去したものをベクタープライ
マーとして用いた。ｃＤＮＡ合成の反応条件は文献［Ｏ
ｋａｙａｍａｅｔａｌ．、上掲文献］に従った。先
に調製したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ６μｇを、ベクタープラ
イマー２．２μｇとアニールさせた後、１４４単位の逆
転写酵素（生化学工業社製）を加え３７℃１時間反応
し、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。反応液をフェノール抽
出、エタノール沈殿後、２．５μＭｄＣＴＰ存在下１５
単位の末端転移酵素を加えて３７℃３０分間反応しｄＣ
テール付加を行なった。反応液をフェノール抽出、エタ
ノール沈殿後、５０単位のＢｓｔＸＩ（ニューイングラ
ンドバイオラボス社製）で５５℃２時間消化した。反応
液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、アニールし、
３００単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを添加後１２℃一晩
セルフライゲーション反応を行なった。反応液にｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、３０
０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、１５単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨを添加
して、１２℃１時間、次いで２２℃１時間反応させ、Ｒ
ＮＡ鎖をＤＮＡに置換した。ｃＤＮＡ合成反応液を用い
て大腸菌ＮＭ５２２（ファルマシア社）の形質転換を行
なった。形質転換はハナハン法［Ｄ.Ｈａｎａｈａｎ、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０（１
９８３）］に従った。

【００２５】ヒトｃＤＮＡライブラリーの塩基配列解析上記ｃＤＮＡライブラリーの一部を１００μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有２ｘＹＴ寒天培地上に蒔いて３７℃一晩
培養した。寒天上に生じた任意のコロニーを拾い１００
μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌに接種
して３７℃２時間培養後、ヘルパーファージＭＫ１３Ｋ
Ｏ７を感染させ、さらに３７℃一晩培養した。培養液を
遠心して、菌体と上清に分け、上清から常法に従い一本
鎖ファージＤＮＡを単離した。一本鎖ファージＤＮＡ
は、蛍光色素で標識したＭ１３シーケンスプライマーと
Ｔａｑポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社製
キット）を用いてシーケンス反応を行なった後、蛍光Ｄ
ＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社）に
かけてｃＤＮＡの塩基配列を決定した。反応条件はキッ
トに付属のプロトコールに従った。得られた塩基配列を
三フレームのアミノ酸配列に変換し、アミノ酸配列デー
タベースを作製した。

【００２６】ｃＤＮＡクローニング上記データベースを、ウシＰ２８蛋白質の部分アミノ酸
配列で検索した結果、クローンＨＰ１００９７が含有す
るプラスミドｐＨＰ１００９７によってコードされてい
る蛋白質が、この部分アミノ酸配列と高い類似性を有し
ていることが判明した。このプラスミドの構造を図１に
示す。ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したとこ
ろ、２２ｂｐの５’非翻訳領域、６８１ｂｐのオープン
リーディングフレーム、７６５ｂｐの３’非翻訳領域か
らなる構造を有していた（配列番号２）。オープンリー
ディングフレームは２２６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードしており、表１に示すように該蛋白質には配列
番号３〜６に示した精製ウシＰ２８蛋白質の４個の部分
アミノ酸配列と類似性の高いアミノ酸配列がすべて含ま
れていた。

【００２７】

【表１】表１アミノ酸配列の比較 _________________________________________________________________ 配列番号アミノ酸配列（Ｎ末端からの位置）（一文字表記） _________________________________________________________________ １（１１７−１３５）ＮＲＨＥＩＡＶＭＬＬＥＧＧＡＮＰＤＡＫ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊３ＮＲＨＥＩＡＶＭＬＬＥＧＧＡＮＰＤＡＫ１（７０−８０）ＤＤＡＧＷＳＰＬＨＩＡ＊＊＊＊＊＊＊＊＊４ＸＤＡＧＷＱＰＬＨＩＡ１（１３６−１４４）ＤＨＹＥＡＴＡＭＨ＊＊＊＊＊＊＊５ＸＨＹＥＡＴＡＶＨ１（１９０−２０４）ＬＬＶＳＱＧＡＳＩＹＩＥＮＫＥＥ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊６ＸＬＶＳＱＧＡＳＩＹＩＥＮＸＥＬ _________________________________________________________________ ＊：アミノ酸が一致している箇所

【００２８】なお得られたｃＤＮＡの配列を用いて塩基
配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢ
Ｊを検索した結果、ＥＳＴデータベースの中に配列番号
２で表される本発明のｃＤＮＡと部分的に一致するｃＤ
ＮＡの部分配列（登録番号Ｒ１３９４７など）が登録さ
れていることがわかった。ただし、部分配列が一致する
からといって、この断片と本発明の完全長ｃＤＮＡが同
じｍＲＮＡに由来するという保証はない。またこの配列
からだけでは、コードしているかもしれない蛋白質のア
ミノ酸配列並びに機能はわからない。

【００２９】インビトロ翻訳による蛋白質合成本発明のｃＤＮＡを有するプラスミドｐＨＰ１００９７
を用いて、Ｔ_NＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロ
メガ社製）によるインビトロ翻訳を行なった。この際［
³⁵Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソト
ープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロ
トコールに従って行なった。発現産物をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた後、オートラジオグ
ラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた。その結
果、本発明のｃＤＮＡは、分子量約２６ｋＤａの翻訳産
物を生成した。この値は、配列番号２で表される塩基配
列から予想される蛋白質の予想分子量２４，４２７と実
験誤差内で一致し、このｃＤＮＡが確かに配列番号２で
表される蛋白質をコードしていることが示された。

【００３０】大腸菌による発現プラスミドｐＨＰ１００９７１μｇを、２０単位のＰ
ｖｕＩＩと２０単位のＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、
０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約７００ｂｐ
のＤＮＡ断片をゲルから切り出した。ついで、ｔａｃプ
ロモーター、メタピロカテカーゼのＳＤ配列、ｒｒｎＢ
Ｔ１Ｔ２ターミネーターを有する大腸菌用発現ベクター
ｐＭＫ１２（特開平２−１８２１８６号公報）１μｇを
２０単位のＰｖｕＩＩと２０単位のＨｉｎｄＩＩＩで消
化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。両者のＤ
ＮＡ断片をライゲーションキットにより連結後、大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体からプラスミド
ｐＭＫＰ２８−ＰｖｕＩＩを調製し、制限酵素切断地図
により目的とする組換え体を確認した。

【００３１】２本のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ
１（５’−ＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴ
ＧＴＧＴＣＴＡＡ−３’）とＰＲ２（５’−ＧＴＣＣＡ
ＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴ−３’）
をＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社）
により付属のプロトコールに従い合成した。プラスミド
ｐＨＰ１００９７を１ｎｇとプライマーＰＲ１、ＰＲ２
それぞれ１００ｐｍｏｌｅを用いて、ＰＣＲキット（宝
酒造社）によりｃＤＮＡの５’側翻訳領域を増幅した。
フェノール抽出、エタノール沈殿後、２０単位のＡａｔ
ＩＩ（東洋紡）と２０単位のＰｖｕＩＩで消化し、反応
産物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１５
０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出し精製した。

【００３２】プラスミドｐＭＫＰ２８−ＰｖｕＩＩ１
μｇを、２０単位のＡａｔＩＩと２０単位のＰｖｕＩＩ
で消化した後、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、
３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。この
ＤＮＡ断片と先にＰＣＲによって調製した約１５０ｂｐ
のＤＮＡ断片を、ライゲーションキットにより連結後、
大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体からプラ
スミドｐＭＫＰ２８を調製し、制限酵素切断地図により
目的とする組換え体を確認した。得られたプラスミドの
構造を図２に示す。

【００３３】ｐＭＫＰ２８／ＪＭ１０９の一晩培養液１
０ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地１
００ｍｌに懸濁し、３７℃で振とう培養し、Ａ₆₀₀が約
０．５になったときにイソプロピルチオガラクトシドを
１ｍＭになるように添加した。さらに３７℃で３時間培
養後、遠心によって集菌した。この溶液を超音波処理
後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけたとこ
ろ、２６ｋＤａの位置に誘導されてきた蛋白質のバンド
が認められた。

【００３４】

【発明の効果】本発明はヒト２６ＳプロテアソームＰ２
８、該蛋白質をコードするＤＮＡ、および該蛋白質をコ
ードするヒトｃＤＮＡを提供する。本発明の蛋白質は、
プロテアソームの詳細な機能の解明、悪性腫瘍などのプ
ロテアソームの関与する各種病態の診断および治療など
に有用である。また、本発明のＤＮＡを用いることによ
り、該蛋白質を大量に発現することができる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６７８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATG GAG GGG TGT GTG TCT AAC CTA ATG GTC TGC AAC CTG GCC TAC AGC 48 Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Ser 1 5 10 15 GGG AAG CTG GAA GAG TTG AAG GAG AGT ATT CTG GCC GAT AAA TCC CTG 96 Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile Leu Ala Asp Lys Ser Leu 20 25 30 GCT ACT AGA ACT GAC CAG GAC AGC AGA ACT GCA TTG CAC TGG GCA TGC 144 Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Ala Leu His Trp Ala Cys 35 40 45 TCA GCT GGA CAT ACA GAA ATT GTT GAA TTT TTG TTG CAA CTT GGA GTG 192 Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Gln Leu Gly Val 50 55 60 CCA GTG AAT GAT AAA GAC GAT GCA GGT TGG TCT CCT CTT CAT ATT GCG 240 Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp Ser Pro Leu His Ile Ala 65 70 75 80 GCT TCT GCT GGC CGG GAT GAG ATT GTA AAA GCC CTT CTG GGA AAA GGT 288 Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys Ala Leu Leu Gly Lys Gly 85 90 95 GCT CAA GTG AAT GCT GTC AAT CAA AAT GGC TGT ACT CCC TTA CAT TAT 336 Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Tyr 100 105 110 GCA GCT TCG AAA AAC AGG CAT GAG ATC GCT GTC ATG TTA CTG GAA GGC 384 Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala Val Met Leu Leu Glu Gly 115 120 125 GGG GCT AAT CCA GAT GCT AAG GAC CAT TAT GAG GCT ACA GCA ATG CAC 432 Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr Glu Ala Thr Ala Met His 130 135 140 CGG GCA GCA GCC AAG GGT AAC TTG AAG ATG ATT CAT ATC CTT CTG TAC 480 Arg Ala Ala Ala Lys Gly Asn Leu Lys Met Ile His Ile Leu Leu Tyr 145 150 155 160 TAC AAA GCA TCC ACA AAC ATC CAA GAC ACT GAG GGT AAC ACT CCT CTA 528 Tyr Lys Ala Ser Thr Asn Ile Gln Asp Thr Glu Gly Asn Thr Pro Leu 165 170 175 CAC TTA GCC TGT GAT GAG GAG AGA GTG GAA GAA GCA AAA CTG CTG GTG 576 His Leu Ala Cys Asp Glu Glu Arg Val Glu Glu Ala Lys Leu Leu Val 180 185 190 TCC CAA GGA GCA AGT ATT TAC ATT GAG AAT AAA GAA GAA AAG ACA CCC 624 Ser Gln Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Glu Asn Lys Glu Glu Lys Thr Pro 195 200 205 CTG CAA GTG GCC AAA GGT GGC CTG GGT TTA ATA CTC AAG AGA ATG GTG 672 Leu Gln Val Ala Lys Gly Gly Leu Gly Leu Ile Leu Lys Arg Met Val 210 215 220 GAA GGT 678 Glu Gly 225

【００３６】配列番号：２配列の長さ：１４６８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：リンホーマセルライン：Ｕ９３７クローン名：ＨＰ１００９７配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：２３．．７０３特徴を決定した方法：Ｅ配列 AAGTAGTTGC TGGGACAGCG AA ATG GAG GGG TGT GTG TCT AAC CTA ATG GTC 52 Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val 1 5 10 TGC AAC CTG GCC TAC AGC GGG AAG CTG GAA GAG TTG AAG GAG AGT ATT 100 Cys Asn Leu Ala Tyr Ser Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile 15 20 25 CTG GCC GAT AAA TCC CTG GCT ACT AGA ACT GAC CAG GAC AGC AGA ACT 148 Leu Ala Asp Lys Ser Leu Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr 30 35 40 GCA TTG CAC TGG GCA TGC TCA GCT GGA CAT ACA GAA ATT GTT GAA TTT 196 Ala Leu His Trp Ala Cys Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe 45 50 55 TTG TTG CAA CTT GGA GTG CCA GTG AAT GAT AAA GAC GAT GCA GGT TGG 244 Leu Leu Gln Leu Gly Val Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp 60 65 70 TCT CCT CTT CAT ATT GCG GCT TCT GCT GGC CGG GAT GAG ATT GTA AAA 292 Ser Pro Leu His Ile Ala Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys 75 80 85 90 GCC CTT CTG GGA AAA GGT GCT CAA GTG AAT GCT GTC AAT CAA AAT GGC 340 Ala Leu Leu Gly Lys Gly Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly 95 100 105 TGT ACT CCC TTA CAT TAT GCA GCT TCG AAA AAC AGG CAT GAG ATC GCT 388 Cys Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala 110 115 120 GTC ATG TTA CTG GAA GGC GGG GCT AAT CCA GAT GCT AAG GAC CAT TAT 436 Val Met Leu Leu Glu Gly Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr 125 130 135 GAG GCT ACA GCA ATG CAC CGG GCA GCA GCC AAG GGT AAC TTG AAG ATG 484 Glu Ala Thr Ala Met His Arg Ala Ala Ala Lys Gly Asn Leu Lys Met 140 145 150 ATT CAT ATC CTT CTG TAC TAC AAA GCA TCC ACA AAC ATC CAA GAC ACT 532 Ile His Ile Leu Leu Tyr Tyr Lys Ala Ser Thr Asn Ile Gln Asp Thr 155 160 165 170 GAG GGT AAC ACT CCT CTA CAC TTA GCC TGT GAT GAG GAG AGA GTG GAA 580 Glu Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Asp Glu Glu Arg Val Glu 175 180 185 GAA GCA AAA CTG CTG GTG TCC CAA GGA GCA AGT ATT TAC ATT GAG AAT 628 Glu Ala Lys Leu Leu Val Ser Gln Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Glu Asn 190 195 200 AAA GAA GAA AAG ACA CCC CTG CAA GTG GCC AAA GGT GGC CTG GGT TTA 676 Lys Glu Glu Lys Thr Pro Leu Gln Val Ala Lys Gly Gly Leu Gly Leu 205 210 215 ATA CTC AAG AGA ATG GTG GAA GGT TAAACAGCTT GGATTTATTC 720 Ile Leu Lys Arg Met Val Glu Gly 220 225 TTACTTTGTA TGTTGTGTTG TTGTCCCCAG TGTCCTACAA ACTAATGTAT TTGTGCACAA 780 GACATCATCT ATGAATGATG AAGTTTTCTC ACCTTCAAAG TCTTATAAAC ATGTTGACTC 840 TTGTTCCTGC TGAGTTACTT GTTCGAAGCT TACAGCTTGT TTTCCAGGCA TCGAATAACT 900 GTTGAGATTG TTCTACTGTT GTCGTATATT CTTCTATATT GAATTCTGGT TAATTTGGAG 960 TAACTAATTC TGTGGCTGTT GTGAGTCTTC AGCACCCTCC CATGTACCTT ATATCCCTCT 1020 CTGAAACAGA ACAGCTCCAA TAGCAACAAG CTAGTTGTTC TGCCAGATGT TTCTATGTGG 1080 ATTCTGTAAT GTTCCTCCAT ACAGTTAAAA CATCCTAACT TGTTTTTCAA GCTCACTCAG 1140 GCCTACGCCA AACGTTTCTG TTTTTTTTAA CCATGAGGTT TAATTTATTT TTGTGATAGG 1200 AGGGATATTT ACATATTTTA GTGGACCACA TTTTAAGTTG GATGGTGTGC TCTAAAATAC 1260 TGAAAAACAA TAGCCCATAT ACCTATGTAT TTGTTTTTGA TGGGTTGTTT ACTCTGAAAT 1320 AAAATGTATG GTTTTCTTAA AAGGAAGTTT TAAAGTACCT ATTTTGTGTC ATCCTGTATT 1380 GAAAAGAATG TCAAGCTTGT TAAAATGACA TGTAACAAAA ATGTATTTTG ATTTGTATTT 1440 CAGAAACTAA AAAATAAAAT GTTGAAAG 1468

【００３７】配列番号：３配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源：生物名：ウシ細胞の種類：赤血球配列 Asn Arg His Glu Ile Ala Val Met Leu Leu Glu Gly Gly Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asp Ala Lys

【００３８】配列番号：４配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源：生物名：ウシ細胞の種類：赤血球

【００３９】配列番号：５配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源：生物名：ウシ細胞の種類：赤血球

【００４０】配列番号：６配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源：生物名：ウシ細胞の種類：赤血球配列 Xaa Leu Val Ser Gln Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Glu Asn Xaa Glu Leu 1 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】クローンＨＰ１００９７の構造を表す図であ
る。

【図２】大腸菌用発現ベクターｐＭＫＰ２８の構造を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質。
【請求項２】請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。
【請求項３】配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。
【請求項４】配列番号２で表される塩基配列からな
る、請求項３記載のｃＤＮＡ。