JP2010207236A - 複数のアンテナ構造を有する改変型糖タンパク質の生成 - Google Patents

Abstract

【課題】改変型オリゴ糖を有する真核生物宿主細胞の提供。
【解決手段】一組のグリコシルトランスフェラーゼ、糖および糖ヌクレオチドトランスポーターの異種発現によってグリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現して標的とするために使用され、哺乳動物の例えばヒト治療糖タンパク質の生成のための宿主株になるようにさらに改変され得る下等真核生物宿主細胞であって、改変型脂質結合型オリゴ糖を有する宿主細胞。その操作された宿主細胞において生成されるＮ−グリカンは、ＧｎＴＩＩＩ活性、ＧｎＴＩＶ活性、ＧｎＴＶ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、またはＧｎＴＩＸ活性を示す。このＮ−グリカンは、二分されかつ／または複数のアンテナを有するＮ−グリカン構造を生じ、１つ以上の酵素、糖、糖ヌクレオチドトランスポーターの異種発現によって、ヒト様糖タンパク質を生じるようにさらに改変される。
【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
本出願は、２００３年１０月７日に出願された米国特許出願番号１０／６８０，９６３
の一部継続出願であり、この米国特許出願番号１０／６８０，９６３は、２００３年２月
２０日出願された米国特許出願番号１０／３７１，８７７の一部継続出願であり、この米
国特許出願番号１０／３７１，８７７は、２００１年６月２７日に出願された米国特許出
願番号０９／８９２，５９１の一部継続出願であり、この米国特許出願番号０９／８９２
，５９１は、２０００年６月２８日に出願された米国仮出願番号６０／２１４，３５８、
２０００年６月３０日出願された米国仮出願番号６０／２１５，６３８、および２００１
年３月３０日に出願された米国仮出願番号６０／２７９，９９７の米国特許法第１１９条
（ｅ）下の利益を主張する。これらの出願の各々は、その全体が、参考として本明細書中
に援用される。

（発明の分野）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞（例えば、真菌細胞または他の真核生物細胞）が、
動物細胞（特に、ヒト細胞）によって生成される糖タンパク質のグリコシル化パターンと
類似するグリコシル化パターンを有するグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を生成
するように遺伝子改変され得る、方法および組成物に関する。これらは、ヒトまたは動物
の治療剤として有用である。

（発明の背景）
（ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路）
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは、グ
リコシル化として知られるプロセスである、糖残基の結合を含む。異なる生物は、異なる
グリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、利
用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、
グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される
宿主系に依存して、異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、そし
てグリコシル化する場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する（Ｍｏｅｎｓ
およびＶａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，１９９７ Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（
３）：１６９−１７５）。糸状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マン
ノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高マンノー
ス」型のグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞（例えば
、Ｓｆ９細胞）は、なお別の方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのよ
うな高等真核生物においては、発生期のオリゴ糖側鎖がトリミングされて、いくつかのマ
ンノース残基が除去され得、下等真核生物のＮ−グリカンでは典型的には見られないさら
なる糖残基で延長され得る。例えば、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら，（１９９９）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ ３０：１９
３−２００；Ｍａｒｔｉｎｅｔら，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ２０：１１７１−１１７７；Ｗｅｉｋｅｒｔら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａｌｉａｓｓａｒｄら，（
２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６７：１６９−１７３；Ｊａｒｖｉｓら，（１９
９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５２
８−５３３；ならびにＴａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：Ｓ２９−Ｓ３５参照。

哺乳動物型のオリゴ糖構造の合成は、一連の系列的反応で開始し、この系列の経過にお
いて、当該タンパク質が宿主生物における分泌経路に沿って転移する間に、糖残基が付加
および除去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分
泌されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンを決定する。従って、下等真核生物
宿主細胞で発現されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺
乳動物のような高等真核生物で発現されるタンパク質のグリコシル化パターンとはかなり
異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。典型的な真菌Ｎ−グリカンの構造を図１Ａ
に示す。

ヒトグリコシル化の初期の工程は、少なくとも２つの異なる段階に分けることができる
：（ｉ）脂質結合Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜での
系列的な一連の反応によって組み立てられ（図１３）、そして（ｉｉ）該脂質からのこの
オリゴ糖の転移は、ドリチルピロホスフェートを、デノボ合成されたタンパク質に係留さ
せる。特異的転移の部位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（配列番号１および配
列番号２）（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン（Ａ
ｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌおよびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９９０）Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３：４３３−４２）。グリコシダーゼおよびマンノシダーゼによ
るさらなるプロセシングは、発生期の糖タンパク質が初期ゴルジ装置に転移する前にＥＲ
で起こり、そこで、さらなるマンノース残基はゴルジ特異的アルファ（α）−１，２−マ
ンノシダーゼによって除去される。タンパク質がゴルジを通って進むにつれ、プロセシン
グは継続する。ゴルジ中間嚢において、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（
ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩ
Ｉおよびフコシルトランスフェラーゼを含めた多数の修飾酵素が、特定の糖残基を付加お
よび除去する。最後に、トランス−ゴルジ（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ）において、ガラク
トシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は糖
タンパク質構造を生じ、これがゴルジから遊離される。糖タンパク質にそのヒト特徴を与
えるものは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび高度の末端シア
ル酸を含有する、ビ−アンテナ構造、トリ−アンテナ構造およびテトラ−アンテナ構造に
よって特徴付けられるこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１Ｂに示す
。哺乳動物型Ｎ−グリカンプロセシングに関与する工程については、図１４および図１５
もまた参照のこと。

現在までに研究された全ての真核生物において、糖タンパク質は、共通する脂質結合オ
リゴ糖前駆体Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２−ドリコール−ピロホスフェートに由来す
る。小胞体内では、ドリコールピロホスフェート結合オリゴ糖の合成およびプロセシング
は全ての公知の真核生物の間で同一である。しかしながら、真菌細胞（例えば、酵母）に
よるコアオリゴ糖のさらなるプロセシングは、それが分泌経路に沿って転移するにつれ、
ヒトとはかなり異なる。

酵母においては、これらの工程は、順次にマンノース糖をコアオリゴ糖に加えるＯｃｈ
１ｐ、Ｍｎｔ１ｐおよびＭｎｎ１ｐのような、ゴルジに存在するマンノシルトランスフェ
ラーゼによって触媒される。得られる構造は、ヒト様タンパク質の生産には望ましくなく
、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除するのが望ましい。マン
ノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃ
ｈ１またはｍｎｎ９変異体）は、致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖おいて低
下したマンノース含有量を呈することが示されている。他のオリゴ糖プロセシング酵素（
例えば、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ）はまた、宿主の特定のグリコシル
化パターンに依存して、排除されなければならないかもしれない。

（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末
端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および糸状真菌で生産される糖タンパク質では見出
されない。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）が細胞質ゾルで合成され、
ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ
糖に結合される（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８１）Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅ
ｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；Ｐｅｒｅ
ｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ １３８：７０９−７１５）。

グリコシル転移反応は、典型的には、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン
酸である副産物を生じる。一リン酸は、交互輸送機構によってヌクレオチド三リン酸糖に
代えての交換において直接的に輸送され得るが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ
）は、輸送されるに先立って、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断さ
れて、ヌクレオシド一リン酸および無機ホスフェートを生じなければならない。この反応
は効率的なグリコシル化に重要であり；例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要
であることが判明している。しかしながら、そのＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに向けて９０％
低下した活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、典型的にはゴルジにおいてＵＤＰ特
異的ジホスファターゼ活性を欠く。なぜなら、それはゴルジベースの糖タンパク質合成の
ためにＵＤＰ糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加え
ることが判明している酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、
これは、そのような酵素についての潜在的要件を示す（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９
４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルト
ランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが公知であり、このグリコシル化副産物の除
去は、ゴルジの管腔においてグリコシルトランスフェラーゼの阻害を妨げるのに重要であ
り得る（Ｋｈａｔａｒａら（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：５３７−５
６０）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）
：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔら（１９９８）Ａｂｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａ
ｓｐｅｃｔｓ ２９２：３９７−４１３参照。

（区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの順次のプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）はＥＲおよび
ゴルジ装置の内部（ルミナル）表面をライニングし、それにより、それがＥＲおよびゴル
ジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触
媒」表面を提供する。シスゴルジ、ゴルジ中間嚢およびトランスゴルジの多数区画ならび
にトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）は、グリコシル化反応の順序だった系列が起
こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＥＲに
おける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特定の炭水化物構造が合成され
得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラー
ゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各細胞小器官に保持し、係留する正確な機構
を明らかにするために、多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証
拠は、ステム領域、膜貫通領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素
を個々の細胞小器官の膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその遺伝子座に局
在化することを示唆する（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ（１９９８）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２参照）。

いくつかの場合において、これらの特異的相互作用は、種をまたいで機能することが見
出された。例えば、ラット由来のα２，６−ＳＴ（該動物のトランス−ゴルジに局在化す
ることが知られている酵素）の膜貫通ドメインは、酵母ゴルジにおいてやはりレポーター
遺伝子（インベルターゼ）を局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら（１９
９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。しかしながら、全長
α２，６−ＳＴの一部と非常に同一の膜貫通ドメインはＥＲに保持され、酵母のゴルジに
さらには輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２２０（３）：８０９−１７）。ヒト由来の全長ＧａｌＴは、明らかに高い転写レベ
ルにも拘らず、酵母では合成さえされなかった。対照的に、インベルターゼレポーターに
融合された同じヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低いレベルにも拘らず、酵母ゴルジへの局
在化を方向付け得た。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者は、酵母マンノシルトラン
スフェラーゼ（ＭＮＴ１）の２８アミノ酸、細胞質テイルを含む領域、膜貫通領域および
ステム領域の８つのアミノ酸を、ヒトＧａｌＴの触媒領域へ融合させることが、活性なＧ
ａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを示した。他のガラクトシルトランスフェラーゼ
は特定の細胞小器官に存在する酵素との相互作用に依拠するようである。なぜならば、そ
の膜貫通領域の除去の後には、それは依然として適切に局在化できるからである。

グリコシル化酵素の不適切な局在化は、その経路における酵素の適切な機能を妨げ得る
。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ（ＥａｄｅｓおよびＨｉｎｔｚ（２０００）Ｇｅｎｅ ２５５（１）：２５−
３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い総じてのレベルにも拘らず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で形質
転換される場合に、ＧｌｃＮＡｃをＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅ
ｒら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。ＧｎＴＩは
、活発に発現されるものの、該酵素がその基質の双方：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび生産
的Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２基質（全てのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造が生産的というので
はない；後記参照）と接触しないように不正確に局在化され得る。あるいは、宿主生物は
、ゴルジにおいて適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供しないかもしれず、または
この酵素は、適切に局在化され得るが、それにも拘らず、その新しい環境で不活性である
かもしれない。さらに、宿主細胞に存在するＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、哺乳動物で
見出されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓおよび共同研究者
は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから得られたセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）からのＮ−グリ
カンの約３分の１が、インビトロにて、Ａ．Ｓａｉｔｏｉ １，２−マンノシダーゼよっ
てＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２にトリミングされ得ることを見出した。しかしながら、それら
のＮ−グリカンの１％未満がＧｎＴＩに対する生産的基質として働くことができた。Ｍａ
ｒａｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７。従って、
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の単なる存在は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のさらなるインビボプ
ロセシングが達成され得ることを保証しない。必要なのは、生産的なＧｎＴＩ反応性Ｍａ
ｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造の形成である。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は細胞で生産され得るが
（約２７モル％）、小さな割合のみが、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に変換され得る（約５％
未満、Ｃｈｉｂａら ＷＯ ０１／１４５２２参照）。

現在まで、下等真核生物における特定の異種的に発現されたグリコシルトランスフェラ
ーゼまたはマンノシダーゼが（１）十分に翻訳されるか、（２）触媒的に活性であるか、
または（３）分泌経路内で適切な細胞小器官に局在化されるかを予測する信頼できる方法
はない。これらの全ての３つは、下等真核生物においてグリコシル化パターンに影響する
必要があるので、現在利用できない、予測ツールの非存在下で酵素の所望の触媒機能およ
び適切な保持を達成するための系統的なスキームが望まれる。

（治療糖タンパク質の生産）
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシ
ル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定７０％がグリコ
シル化され、従って、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化し得る生産系（すなわち、
宿主細胞）に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が（１）免疫原性、（２）薬物
動態学特性、（３）トラフィッキングおよび（４）治療タンパク質の効力を決定すること
において重要な役割を演じることを示している。従って、製薬産業によるかなりの努力が
、可能な限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロ
セスを開発することに向けられてきたことは、驚くべきことではない。現在まで、ほとん
どの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパ
ク質のシアル化（すなわち、シアル酸の末端添加）の程度を増強させるための、そのよう
な哺乳動物細胞の遺伝子操作を含み得、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性
を改良することが公知である。あるいは、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそ
のそれぞれのヌクレオチド糖（例えば、２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭ
Ｐ−シアル酸）を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改
良し得る。

ほとんどの高等真核生物は、ヒトで見出されるものと類似のグリコシル化反応を行うが
、前記宿主系で発現される組換えヒトタンパク質は、不変的に、その「天然」ヒト対応物
とは異なる（Ｒａｊｕら（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：４７７−
４８６）。従って、広範な開発研究が、これらの発現系で作られるタンパク質の「ヒト特
性」を改良する方法を見出すことに向けられてきた。これは、醗酵条件の最適化、および
ヒト様グリコ形態の形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タン
パク質発現宿主の遺伝的修飾を含む。Ｇｏｏｃｈｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ９（１２）：１３４７−５５；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ（１９
９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（５）：５４６−４９；Ｗｅｒｎ
ｅｒら（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４８（８）：８７０
−８０；Ｗｅｉｋｅｒｔら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１１）：
１１１６−２１；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎ
ｇ．６８；３７０−８０。全ての哺乳動物発現系に関する固有の問題は解決されていない
。

（真核生物微生物を用いる糖タンパク質の生産）
小胞体においてタンパク質に転移されるコアオリゴ糖構造は、基本的には、哺乳動物と
下等真核生物とで同一であるが、かなりの差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こ
るその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、
かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よ
りも優れたその他の注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための
宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。

内因性宿主グリコシル化経路を利用して、酵母のような微生物宿主で生産される治療糖
タンパク質は、哺乳動物細胞で生産されたものと構造的に異なり、典型的には、大いに低
下した治療効力を示す。そのような糖タンパク質は、典型的には、ヒトにおいては免疫原
性であり、投与の後にはインビボで低下した半減期（従って、低下した生物活性）を示す
（Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，Ｓ２９−Ｓ３５）。ヒトおよび動物における
特異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は、末端マンノース残基を
認識し得、そして血流からの外来性糖タンパク質の迅速なクリアランスを促進し得る。さ
らなる悪影響はタンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、ト
ラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性
、またはアレルギー性の変化を含み得る。

酵母および糸状真菌は、共に、細胞内組換えタンパク質と分泌組換えタンパク質との両
方の生産のために、首尾よく用いられてきた（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ（２
０００）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：４５−６
６；Ｈａｒｋｋｉら（１９８９）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６）：５９６；Ｂ
ｅｒｋａら（１９９２）Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０
３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６
（２−３）：２４５−２５１）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，
Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａのような種々の酵母は、真核生物発現系として特に重要な役割を演じてきた。何故な
らば、それらは、高い細胞密度まで増殖し得、そして大量の組換えタンパク質を分泌し得
るからである。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ
，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａなどのような糸状真菌は、産業スケールで糖タン
パク質を効率的に生産するのに用いられてきた。しかしながら、前記したように、これら
の真核生物微生物のいずれかにおいて発現される糖タンパク質は、動物におけるものとは
Ｎ−グリカン構造が実質的に異なる。このことは、多くの治療糖タンパク質のための生産
のための宿主としての、酵母または糸状真菌の使用を妨げてきた。

酵母および真菌におけるグルコシリ化は、ヒトにおけるものと非常に異なるが、いくつ
かの共通する要素が共有されている。第一の工程、コアオリゴ糖構造の新成タンパク質へ
の転移は、酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物で高度に保存されている
（図１Ａと図１Ｂとを比較のこと）。しかしながら、コアオリゴ糖のその後のプロセシン
グは、酵母においてかなり異なり、数個のマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴル
ジに存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１な
ど）によって触媒され、これらは、マンノース糖をコアオリゴ糖に順次に付加する。得ら
れた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産には望ましくなく、従って、マンノシルト
ランスフェラーゼ活性を低下または排除することが望ましい。マンノシルトランスフェラ
ーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変
異体）は致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖において低下したマンノース含有
量を呈することが示されている。また、マンノシルリン酸トランスフェラーゼのような他
のオリゴ糖プロセシング酵素もまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに依存し
て、排除されなければならないかもしれない。望ましくない内因性グリコシル化反応を低
下させた後、複合Ｎ−グリカンの形成が宿主系で操作されなければならない。これは、い
くつかの酵素および糖ヌクレオチドトランスポーターの安定な発現を必要とする。さらに
、成熟化するグリコシル化構造の順次のプロセシングが確実になるように、これらの酵素
を局在化する必要がある。

哺乳動物治療剤として用いるためにより適した糖タンパク質を提供するために真核生物
微生物のグリコシル化経路を改変しようとする、いくつかの努力がなされてきた。例えば
、数個のグリコシルトランスフェラーゼが別々にクローン化され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）
および他の真菌で発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａら（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ９（１）：５３−８，Ｋａｌｓｎｅｒら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１
２（３）：３６０−３７０）。しかしながら、ヒト細胞で作製されたものに似ているＮ−
グリカンは得られなかった。

酵母は、多様なマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに
おけるＭＮＮ１のような１，３−マンノシルトランスフェラーゼ；ＧｒａｈａｍおよびＥ
ｍｒ（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８）、１，２−
マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／
ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギ
ュレーター（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、
ならびに内因性グリコシル化反応に関与するさらなる酵素を生産する。これらの遺伝子の
多くは個々に欠失され、改変されたグリコシル化プロフィールを有する生きた生物を生じ
る。その例を表１に示す。

（表１．改変されたマンノシル化を有する酵母株の例）

日本国特許出願公開第８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけ
るＯＣＨ１ホモログの欠失を開示している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨ
１は、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２に付加してＭａｎ_９ＧｌｃＮＡ
ｃ_２を生じさせる１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。次いで、３つの
１，６マンノース残基を含むＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、インビボにてさらなる１，
２−マンノシルトランスフェラーゼ、１，６−マンノシルトランスフェラーゼおよび１，
３−マンノシルトランスフェラーゼに対する基質となり、これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅに特徴的であって、典型的には、Ｎ−グリカン当たり３０〜４０のマンノース残基を
有し得る高マンノシル化糖タンパク質に導く。Ｏｃｈ１ｐは、１，６マンノースのＭａｎ
_８ＧｌｃＮＡｃ_２コアへの転移を開始するので、それは、しばしば、それをゴルジにおい
て後に作用する他の１，６マンノシルトランスフェラーゼから区別するために、「開始１
，６マンノシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１
ｍｎｎ１ ｍｎｎ４変異体株において、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２でグリコシル化された
タンパク質が蓄積し、超マンノシル化は起こらない。しかしながら、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡ
ｃ_２は、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのような哺乳動物グリコシルト
ランスフェラーゼに対する基質ではなく、従って、それ自身での、その変異体株の使用は
、哺乳動物様タンパク質（すなわち、複合グリコシル化パターンまたはハイブリッドグリ
コシル化パターンを有する）を生産するのに有用ではない。

Ａ．ｓａｉｔｏｉに由来する真菌マンノシダーゼを小胞体（ＥＲ）内へ操作することに
よって、（インビボにて５０％より高い高効率トリミングは未だ証明されていないが）Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造をＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
異性体にトリミングすることができる。このアプローチの欠点は二倍にある：（１）形成
されたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造が実際に（分泌され、細胞外部でマンノシダーゼによ
ってさらに修飾されたというよりはむしろ）インビボで形成されたか否かは明確ではなく
；そして（２）いずれかの形成されたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、もし実際にインビ
ボで形成されたならばＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるその後のＮ−グリカン修
飾に対する生産的な基質である正しいアイソフォームであるかは明らかでない（Ｍａｒａ
ｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。

真菌宿主に由来するよりヒト様の糖タンパク質を提供する目的で、米国特許５，８３４
，２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉに由来するハイブリッド糖タンパ
ク質を生産する方法を開示する。ハイブリッドＮ−グリカンは、コアマンノース構造のＭ
ａｎα１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１または
２の複雑なアンテナを有する。この構造は有用性を有するが、該方法は、多数の酵素工程
がインビトロで行われなければならず、これは、コスト高で時間を消費するという不利を
有する。単離された酵素は、調製するのにコスト高であり、コスト高の基質（例えば、Ｕ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を必要とする。また、該方法は所望のタンパク質上での複雑なグリ
カンの生成を可能としない。

（Ｎ−グリカントリミングに関与する細胞内マンノシダーゼ活性）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物における複合Ｎ−グリカン形成のための
主な中間体であるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を形成するためのＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のト
リミングのために必要である。以前の研究は、短縮型のマウスα−１，２−マンノシダー
ゼ、真α−１，２−マンノシダーゼ菌およびヒトα−１，２−マンノシダーゼが、メチロ
トロピック酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２からのＭａ
ｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へのトリミング活性を呈することができることを示した（Ｌａｌら（
１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８（１０）：９８１−９５；Ｔｒｅｍｂｌａｙら
（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８（６）：５８５−９５，Ｃａｌｌｅｗａｅｒ
ｔら（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０３（２−３）：１７３−８）。しかしながら
、今日まで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから分泌された糖タンパク質でのＭａｎ_８ＧｌｃＮＡ
ｃ_２からＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在し
ない。

さらに、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼの単なる存在は、単独では、Ｍａｎ
_８ＧｌｃＮＡｃ_２からＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２への適切な細胞内トリミングを保証しない
（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＤＥＬタグ化マンノシダーゼが主としてＥＲに局在化さ
れ、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が事実上検出され得ないインフルエンザヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）レポータータンパク質と共に共発現される、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／０
０８５６ Ａ２参照。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ、初期ゴルジおよび細胞質
ゾルに局在化されたキメラα−１，２−マンノシダーゼ／Ｏｃｈ１ｐ膜貫通ドメイン融合
物がマンノシダーゼトリミング活性を有しない、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４も参照されたし）。従って、ＥＲ
またはゴルジにおけるマンノシダーゼの単なる局在化は、その標的化された細胞小器官に
おいて各酵素の活性を保証するには不十分である（また、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のα−１
，２−マンノシダーゼが、細胞内に局在化しつつ、マンノシル化の程度を減少させるより
はむしろ増加させたことを示す、Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７も参照されたし）。現在まで、膜貫通局
在化配列を用いる、酵母または真菌いずれかにおける活性な異種α−１，２−マンノシダ
ーゼの細胞内の局在化を示す報告はない。

一次Ｎ−グリカン構造としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を産生し得る株を操作することは
有用であるが、ヒトグリカンにより近く似せるようにこれらの高マンノース前駆体構造を
さらに修飾しようとするいずれの試みも、さらなるインビボ工程またはインビトロ工程を
必要とする。インビトロにて真菌および酵母由来のグリカンをさらにヒト化する方法は、
米国特許第５，８３４，２５１号（前出）に記載されている。もし、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２をさらにインビボでヒト化すべきならば、生じたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造が、事
実、細胞内で生じ、培地中でのマンノシダーゼ活性の生成物ではないことを保証しなけれ
ばならない。酵母または真菌における複合Ｎ−グリカン形成は、高レベルのＭａｎ_５Ｇｌ
ｃＮＡｃ_２が、細胞内で生成されること必要とする。なぜならば、細胞内Ｍａｎ_５Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２グリカンのみが、インビボで、ハイブリッドＮ−グリカンおよび複合Ｎ−グリカ
ンにプロセシングされ得るからである。さらに、生じたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造の大
部分が、実際に、ＧｎＴＩに対する基質であり、ハイブリッドＮ−グリカンおよび複合Ｎ
−グリカンの形成を可能とすることを示さなければならない。

従って、非ヒト真核生物宿主細胞、および特に、酵母および糸状真菌において、ヒト様
糖タンパク質構造へさらにプロセシングされ得る、高い細胞内Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２含
有量によって特徴付けられる糖タンパク質を生産するための方法に対する必要性が存在す
る。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（「ＧｎＴ」）は、分泌経路において
Ｎ結合型オリゴ糖を修飾するグリコシル化酵素の別のクラスに属する。このようなグリコ
シルトランスフェラーゼは、特定の糖ヌクレオチドドナーに由来する単糖を、２つのあり
得るアノマー結合のうちの１つ（αまたはβのいずれか）において、伸長しているグリカ
ン鎖における単糖の特定のヒドロキシル位置へと転移することを触媒する。Ｄｅｎｎｉｓ
ら（１９９９）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２１（５）：４１２−２１。特定のＧｎＴは、Ｎ−
アセチルグルコサミン（「ＧＩｃＮＡｃ」）を、Ｎ−グリカン基質（例えば、Ｍａｎ_５Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２（「マンノース−５コア」）およびＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「内部コア構
造」））のＭａｎα１，６アームまたはＭａｎα１，３アームに付加する。その反応生成
物（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２）は、次いで、バイアンテナ（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構
造、トリアンテナ（ｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構造、およびテトラ
アンテナ（ｔｅｔｒａ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構造へと修飾され得る。

Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）は、Ｎ結
合型オリゴ糖のトリマンノースコア（Ｍａｎα１，６（Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４
−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ）の真ん中のマンノースへのＧ
ＩｃＮＡｃの付加を触媒する酵素である。ＧｎＴＩＩＩによるアクセプター基質（例えば
、トリマンノースコア）への二分している（ｂｅｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃの付加
は、いわゆる、二分型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカンを生じる。例えば、ＧｎＴＩＩ
ＩによるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造への二分しているＧｌｃＮＡｃの付加
は、二分型Ｎ−グリカン（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を生じ得
る。同様に、Ｇｎ ＴＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ_２ＭＡｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造への二分
しているＧｌｃＮＡｃの付加は、別の二分型Ｎ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３Ｇｌ
ｃＮＡｃ_２）を生じる。この後者の構造は、より大きな抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（
ＡＤＣＣ）に関係付けられている。Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１７（２）：１７６〜８０。他の二分型Ｎ−グリカンが、Ｇｎ ＴＩＩの作用によ
る形成され得る。例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２が、二分型ＧｌｃＮＡｃ
_２Ｍａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２へと変換され得、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が、二分型ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へと変換され得、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が、
二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へと変換され得る。例えば、Ｎａｒａｓｈ
ｉｍｈａｎ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０２３５〜４２参照のこと
。これまでは、ＧｎＴ ＩＩＩ活性は、哺乳動物細胞においてのみしか示されていない。

哺乳動物細胞により発現される免疫グロブリンの糖形態を再操作することは、冗長なわ
ずらわしい作業である。特にＧｎＴ ＩＩＩの場合、この酵素の過剰発現は、増殖阻害に
関係付けられており、調節性（誘導性）遺伝子発現に関与する方法は、二分型Ｎ−グリカ
ンを伴う免疫グロブリンを生成するために使用されなければならなかった。Ｕｍａｎａら
（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６５（５）：５４２〜９；Ｕｍａｎ
ａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６〜８０；Ｕｍａｎ
ａら、ＷＯ ０３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号。そのような増殖阻
害硬化は、標的タンパク質とＧｎＴ ＩＩＩとを同時発現させる能力を複雑にし、ＧｎＴ
ＩＩＩ過剰発現に対して上限を課し得る。米国特許第６，６０２，６８４号。ＧｎＴ
ＩＩＩの発現レベルを注意深く最適化することが、必要であり得る（同書）。しかし、上
記のように、そのよな生成系において使用される下等真核生物宿主細胞の開発には、その
宿主細胞の内因性グリコシル化経路がさらに改変されることが必要である。

哺乳動物細胞において発現される酵素ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＶおよびＧｎＴ ＩＸ
は、特定の立体構造のＧｌｃＮＡｃ残基が、オリゴ糖基質上へと転移して、複数のアンテ
ナを有するグリカン構造を生成するのを触媒することが公知である。ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニン：α１，３−_Ｄ−マンノシドβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼ（ＧｎＴ ＩＶ；ＥＣ２．４．１．１４５）は、β１，４結合中の残基
のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１
−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮａｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ上
のα１，３−_Ｄ−マンノシドへの転移を触媒する（ＧｌｅｅｓｏｎおよびＳｃｈａｃｈｔ
ｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８３ Ｍａｙ ２５；２５８（１０）：６１６２〜
７３；Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７９，
３５１〜３９７）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：α−６−_Ｄ−マンノシドβ１，
６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＶ；ＥＣ４．１．１５５）
は、β１，６結合中のα１，６マンノシルへとＮ−アセチルグルコサミンを付加してトリ
アンテナＮ−グリカンおよびテトラアンテナＮ−グリカンを形成するのを触媒する。

同様に、鳥類細胞におけるＧｎＴ ＶＩの発現は、オリゴ糖基質上へのＧｌｃＮＡｃの
転移を触媒する。具体的には、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−_Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ
）：ＧｌｃＮａｃβ１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２）Ｍａｎα１−Ｒ[ＧｌｃＮａｃ→Ｍ
ａｎ]β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（ＧｎＴ ＶＩ）
は、ペンタアンテナＮ−グリカンの形成を触媒する（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏ．
Ｃｈｅｍ．２０００ Ｎｏｖ １７；２７５（４６）：３６０２９〜３４）。ＧｎＴ Ｖ
Ｉをコードする遺伝子は、最近、精製されて単離されている。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｊ
Ｐ２００２２０９５８７Ａ２。

複雑な複数のアンテナを有する構造を生成するために必要な基質は、最近まで、真菌宿
主において合成されていない（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ Ａｕｇ
２９；３０１（５６３７）：１２４４〜６）。哺乳動物細胞は、代表的には、一群の複
合グリカン（例えば、バイアンテナ糖形態、トリアンテナ糖形態、テトラアンテナ糖形態
、およびペンタアンテナ糖形態さえ）を、特異的なＧｎＴの連続反応を介して生成する。
そのような細胞のゴルジ装置において、糖タンパク質のＮ−グリカンプロセシングは、ト
リアンテナ構造およびテトラアンテナ構造の形成に加えて、バイアンテナ構造を優勢に生
成する。複合グリカンの形成において、特異的ＧｎＴが、特定のβ−ＧｌｃＮＡｃ結合（
β１，２；β１，４；β１，６）を触媒して、哺乳動物細胞において複数のアンテナを有
するグリカンを生成することが現在理解されている。これらの細胞は、しかし、高収率で
はどのような均一な糖形態も生成不能である。

最近、下等真核生物が、有意なレベルで均一な形態の複合グリカンを生成するように操
作された（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ Ａｕｇ ２９；３０１（５６３７）：１２４４〜
６）。下等真核生物において複数のアンテナを有する複合グリカンを生成する能力は、大
量の適切にフォールディングされグリコシル化されたタンパク質を、産業規模で低コスト
にて、より迅速な時間、より安全かつ高品質で提供する。従って、必要とされるものは、
固有の高生成力価の能力（例えば、下等真核生物宿主細胞（例えば、酵母および糸状真菌
）において生成される能力）を利用するタンパク質生成系であって、複数のアンテナを有
する（そして必要に応じて二分型である）Ｎ結合型グリカンを、これらの細胞において発
現されるタンパク質（特に、治療タンパク質）上に生成する、タンパク質生成系である。

（発明の要旨）
哺乳動物（特に、ヒト）における糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反
応を行うことが可能な遺伝子改変されたグリコシル化経路を有する宿主細胞および細胞株
を、開発した。これらの操作された宿主において発現される組換えタンパク質は、それら
の哺乳動物に、実質的に同一ではないかもしれないが、より類似している糖タンパク質（
例えば、ヒト対応物）を与える。本発明の宿主細胞（例えば、培養下で増殖される下等真
核微生物および他の非ヒト真核生物宿主細胞）は、Ｎ−グリカン（例えば、二分型Ｎ−グ
リカン、またはヒトグリコシル化経路に沿って生成される他の構造）を生成するように改
変される。この結果は、例えば、真菌糖タンパク質に特徴的な望ましくない構造を作り出
す酵素を発現せず、かつ、例えば、「ヒト様」糖タンパク質を生成し得る異種酵素を発現
する、株の操作および／または選択の組み合わせを使用して達成される。

本発明は、従って、（１）下等真核生物宿主（例えば、単細胞真菌もしくは糸状真菌）
、または（２）ヒトとは異なるグリコシル化パターンを有する任意の非ヒト真核生物を使
用して、哺乳動物において見出される糖質構造によりよく似ているように、宿主生物（「
宿主細胞」）において生成されるタンパク質（例えば、ヒトタンパク質）のグリコシル化
組成および構造を改変する、糖タンパク質生成方法を提供する。そのプロセスにより、学
術文献において十分に確立され、かつタンパク質発現の分野の当業者に周知の方法を用い
て、任意の所望の遺伝子（例えば、グリコシル化に関与する遺伝子）を発現し標的とする
ために使用され得る、操作された宿主細胞を得ることが可能となる。改変されたオリゴ糖
を有する宿主細胞が、作り出されるかまたは選択される。治療タンパク質の生成のために
は、この方法は、任意の望ましいグリコシル化構造が獲得され得る細胞株を操作するよう
に、適合され得る。

従って、一実施形態において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼＩＩＩ活性を下等真核生物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト
様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、その細胞において発現され、
なおより好ましい実施形態において、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ
_２二分型構造、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２二分型構造、またはＧｌｃＮＡｃ
_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２二分型構造を含む、Ｎ−グリカンの生成を生じる。別の好まし
い実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は
、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態において、その二分型構造を有
するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から単離される。なおよ
り好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成される糖タンパク質は、治療タ
ンパク質である。

別の局面において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ
活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性の両方を含む、下等
真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む宿主細胞は、この活性と反応し得るＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含むＮ−グリカンを生成する。より好ましい実施形態に
おいて、この活性は、二分型グリカンを生成する。従って、本発明のいくつかの実施形態
の下等真核生物宿主細胞は、二分型グリカンを有するＮ−グリカンを含み得る。好ましい
実施形態において、そのＮ−グリカンは、１０モル％を超える上記二分型グリカンを含む
。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ
_２二分型構造、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２二分型構造またはＧｌｃＮＡｃ_２
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２二分型構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態にお
いて、その宿主細胞は、二分しているＧｌｃＮＡｃにより修飾される、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２コア構造またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を含む。なおより好ましい実施形
態において、その細胞は、１０モル％を超える上記の修飾された構造を生成する。

本発明の別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＩ活性、加えて、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼＩＩＩ活性を含む。好ましい実施形態において、その活性は、実質的に細胞内にある
。別の好ましい実施形態において、その細胞は、ＧｎＴ ＩＩＩ活性と反応し得るＧｌｃ
ＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を含むＮ−グリカンを生成する。さらにより好ましい実施
形態において、その細胞のＧｎＴ ＩＩＩ活性は、二分型グリカンを生成する。

別の実施形態において、本発明の下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼＩＩＩ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性の両方を含む。好ましい
実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ
活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、
その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性の両方をさらに含む。

本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性を下等真核生
物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するた
めの方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトラ
ンスフェラーゼＩＶ活性は、その細胞において発現され、なおより好ましい実施形態にお
いて、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含む、Ｎ−グリカンの
生成を生じる。別の好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼＩＶ活性は、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態におい
て、そのＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から単離される。な
おより好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、９０モル％より多いトリアンテ
ナグリカンを含む。なおより好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成され
る糖タンパク質は、治療タンパク質である。

従って、別の局面において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼＩＶ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性の両方を含む、
下等真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコ
サミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼＶ活性を含む宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含むＮ−グ
リカンを生成する。より好ましい実施形態において、この活性は、テトラアンテナグリカ
ンを生成する。従って、本発明のいくつかの実施形態の下等真核生物宿主細胞は、テトラ
アンテナグリカンを有するＮ−グリカンを含み得る。好ましい実施形態において、そのＮ
−グリカンは、１０モル％を超える上記二分型グリカンを含む。いくつかの実施形態にお
いて、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造およびＧｌｃＮＡｃ
_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態において
、その宿主細胞は、ＧｎＴ ＩＶにより修飾されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
コア構造、あるいはＧｎＴ ＩＶおよびＧｎＴ Ｖにより修飾されるＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａ
ｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を含む。好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、
７０モル％より多いテトラアンテナグリカンを含む。なおより好ましい実施形態において
、その細胞は、７５モル％を超えるテトラアンテナグリカンを生成する。

本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性を含む、下等
真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼＶＩ活性を含む宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ_５Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２構造を含むＮ−グリカン（例えば、ペンタアンテナグリカン）を生成する。従って、
本発明のいくつかの実施形態の下等真核生物宿主細胞は、ペンタアンテナグリカンを有す
るＮ−グリカンを含み得る。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡ
ｃ_５Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態におい
て、その宿主細胞は、ＧｎＴ ＶＩにより修飾される、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２コア構造を含む。

別の実施形態において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ
Ｘ活性を下等真核生物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト様糖タン
パク質を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性は、その細胞において発現され、なおより好
ましい実施形態において、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造およ
びＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含む、Ｎ−グリカンの生成を生じる。別
の好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ
活性は、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態において、複数のアンテ
ナを有する構造を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から
単離される。なおより好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成される糖タ
ンパク質は、治療タンパク質である。

本発明の別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
ＩＩ活性の両方を含む。好ましい実施形態において、その活性は、実質的に細胞内活性で
ある。別の好ましい実施形態において、その細胞は、トリアンテナグリカンを生成するＧ
ｎＴ ＩＶと反応し得るＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を含む、Ｎ−グリカ
ンを含む。なおより好ましい実施形態において、その細胞のＧＮＴ Ｖ活性は、テトラア
ンテナグリカンを生成する。

別の好ましい実施形態において、本発明の下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性の両方を含む。好
ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態にお
いて、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性をさらに
含む。

特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＯＣＨ１マンノシルトランスフェラー
ゼ活性を欠いている。このような細胞は、例えば、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ_５Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いていることもある。な
お別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさ
らに含む。別の実施形態において、その宿主細胞は、糖ヌクレオチドトランスポーターを
さらに含み得る。好ましくは、その宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター
を含み、ＧｌｃＮＡｃ残基の転移は、上記のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼ活性のうちのいずれか１つによって促進される。

本発明はまた、本発明のプロセスによって生成される糖タンパク質を提供する。一実施
形態において、その糖タンパク質は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造またはＭａｎ_３Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２コア構造に二分しているＧｌｃＮＡｃを含み、下等真核生物宿主細胞におい
て生成される。別の実施形態において、その糖タンパク質は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コ
ア構造、Ｍａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、
またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造に結合した、二分しているＧｌｃ
ＮＡｃを含み、下等真核生物宿主細胞において生成される。好ましい実施形態において、
本発明の糖タンパク質の１０モル％を超えるコア構造が、二分しているＧｌｃＮＡｃによ
り修飾される。

なお別の実施形態において、本発明は、テトラアンテナ構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_３
Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を含み、かつ下等真核生物宿主細胞において生成される、糖タ
ンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明の糖タンパク質のコア構造のう
ちの９０モル％よりも多くが、ＧｎＴ ＩＶによって修飾される。別の実施形態において
、その糖タンパク質は、テトラアンテナ構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２）を含み、かつ下等真核生物宿主細胞において生成される。より好ましい実施形態
において、本発明の糖タンパク質のコア構造のうちの７５モル％よりも多くが、ＧｎＴ
Ｖによって修飾される。

別の局面において、本発明は、下等真核生物宿主細胞において生成されるヒト様糖タン
パク質を含む薬学的組成物を提供する。１種以上のＮ−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼＩＩＩ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼＶＩ活性、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性
を有し、かつ結合した標的化ペプチド配列を含む、タンパク質をコードするベクターもま
た、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、そのベクターによってコー
ドされるタンパク質は、下等真核生物宿主細胞が、二分型構造および／または複数のアン
テナを有する構造を有するＮ−グリカンを生成するように、その下等真核生物宿主細胞に
おいて局在化される。

（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術
用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限
り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技
術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵
素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および
核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用
いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。

本発明の方法および技術は、一般には、他に示されない限り、当該分野で周知の従来法
に従って、そして本明細書中に引用されかつ本明細書中にわたって議論される種々の一般
的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅ
ｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補
遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，
Ｋｕｒｔ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗ
ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｏｉ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第Ｉ巻 １９７６ Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏ
ｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＩＩ巻 １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される分
子生物学および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、および医化学および医薬化学（
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連して用いられる命名法、お
よびその実験室的手法および技術は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるもの
である。

本明細書中で言及される全ての刊行物、特許文献および他の参考文献は、参考として援
用される。

以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである
。

本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎ−グリカン」はＮ−結合オリゴ糖（例えば、ポ
リペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合に
よって結合したもの）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の共通の五糖コ
アを有する（「Ｍａｎ」は、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」は、グルコースをいい；そし
て「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンをいう
）。Ｎ−グリカンに関して用いられる用語「トリマンノースコア」もまた、構造Ｍａｎ_３
ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ_３」）をいう。Ｎ−グリカンに関して使用される用語「ペンタ
マンノースコア」または「マンノース−５コア」または「Ｍａｎ_５」は、構造Ｍａｎ_５Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_３コア構造に結合された周辺の糖（例えば
、ＧｌｃＮａｃ、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる
。Ｎ−グリカンは、その分枝した成分に従って分類される（例えば、高マンノース、複合
体またはハイブリッド）。

「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ
−グリカンは、代表的には、トリマンノースコアの１，３マンノースアームに結合した少
なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つ
のＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を
有し得、この残基は、必要に応じて、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで、
「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、そして「Ａｃ」はアセチルをいう）で修飾される。
複合Ｎ−グリカンは、代表的には、例えば：ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌ
ＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２
−３／６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−；ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−（ムチ
ンのみ）；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−（血液型Ｈ）のような、オリゴ糖で終わる少なく
とも１つの分枝を有する。硫酸エステルは、ガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃ残基、およ
びＧｌｃＮＡｃ残基で生じ得、そしてリン酸エステルは、マンノース残基で生じ得る。Ｎ
ｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）はＯ−アセチル化され得るか、また
はＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合Ｎ−グリカン
はまた、「分枝している」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置
換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノー
スアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マ
ンノースアームに０またはそれ以上のマンノースを有する。

Ｎ−グリカンの産生に関して用いられる用語「優勢な」または「優勢に」とは、マトリ
ックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析によって
検出される主要なピークを表す構造をいう。

本明細書中で用いられる略語は、当該分野における共通の用法である（例えば、上記の
糖の略語を参照のこと）。他の共通の略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅ
Ｃ３．２．２．１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼ酵素をいう「ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒ」または「ＧｎＴ」；Ｎ−アセチルノイラミン
酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。

本明細書中で用いられる場合、「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」
とは、３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンがそれに結合しているタンパク質、
および少なくとも５つのマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体（これもまた有
用であり、さらにインビトロまたはインビボで操作され得る）を代替的にいう。好ましく
は、本発明により産生される糖タンパク質は、少なくとも一時的には、少なくとも３０モ
ル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０モル％、６０モル％、７０
モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％さえのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２中
間体を含む。これは、例えば、本発明の宿主細胞を、「より優れた」、すなわちより効率
的なグリコシル化酵素を発現するように操作することによって、達成され得る。例えば、
マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化されて、好ましくは、活性が望まれる宿主
細胞の細胞小器官に対してこの酵素を標的化することによって宿主細胞中に導入される、
宿主細胞中の部位に存在する条件下で、最適な活性を有するように選択される。

用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を変化させることに関連して用いられる場合
、少なくとも１つの酵素活性を有する分子をいい、全長酵素、触媒活性フラグメント、キ
メラ、複合体などを含む。酵素の「触媒活性フラグメント」とは、検出可能なレベルの機
能的（酵素的）活性を有するポリペプチドをいう。酵素活性は、溶解した細胞から測定可
能なものと比較して、その酵素活性の１０％未満が、細胞の外側で測定可能である場合、
「実質的に細胞内」である。

下等真核生物宿主は、グリコシル化プロフィールと関連して本明細書中で用いられる場
合、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核生物細胞をいい、従って、
いくつかの動物細胞または植物細胞および最も代表的な下等真核生物細胞（単細胞および
多細胞の真菌細胞および藻細胞が挙げられる）を包含することが意図される。

本明細書中で用いられる場合、用語「分泌経路」とは、種々のグリコシル化酵素の構築
ラインをいい、この系に対して、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画への
新生ポリペプチド鎖の分子の流れに従って、脂質結合オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン
基質が順に曝露される。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前
に脂質結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙに対して「上流」に
あるか、または「上流」で作用するといわれ；同様に、酵素Ｙは酵素Ｘから「下流」にあ
るか、または「下流」に作用する。

本明細書中で用いられる場合、用語「標的化ペプチド」とは、細胞標的シグナルペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいい、この細胞標的シグナルペプ
チドは、細胞下の位置（例えば、細胞小器官）に対する関連配列の局在化（または保持）
を媒介する。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌク
レオチドのポリマー形態をいう。該用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、な
らびに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド間結合、または双方を含むＤＮ
ＡまたはＲＮＡのアナログを含む。核酸は、いずれのトポロジー的立体配座でもあり得る
。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐状、ヘアピ
ン状、環状、または南京錠様の立体配座であり得る。この用語は、一本鎖形態のＤＮＡお
よび二本鎖形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
、ならびに前記の合成形態および混合ポリマーの、センス鎖とアンチセンス鎖との両方を
含み得る。当業者に容易に認識されるように、それらは化学的に改変されていても、生化
学的に改変されていてもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでいてもよいし、
誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変としては、例えば、標識
、メチル化、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間
改変（例えば、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル
、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部位（例えば、ポリペプチド）、インター
カレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター、アルキレーターおよび
改変された結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。また、指定された配列
に、水素結合および他の化学的相互作用を介して結合する、それらの能力において、ポリ
ヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、
例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合に代えて置き換えるものを含む。

他に示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その少なくとも一部が（ｉ）配
列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をい
う。その２つの間の選択は文脈によって決定される。例えば、もし核酸がプローブとして
用いられる場合、その２つの間の選択はプローブがその所望の標的に対して相補的である
という要件によって決定される。

「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮ
Ａ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然宿主細胞においてネイティブなポリ
ヌクレオチドに天然では伴う他の細胞構成要素（例えば、それに対して天然に会合するリ
ボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列）から実質的に分離されたものである。該用
語は、（１）その天然に存在する環境から取り出されてしまっている核酸またはポリヌク
レオチド、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチド
の全部または一部と会合していない核酸またはポリヌクレオチド、（３）天然には結合し
ていないポリヌクレオチドに作動可能に連結している核酸またはポリヌクレオチド、ある
いは（４）天然には存在しない核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」
または「実質的に純粋な」は、組換えＤＮＡ単離体もしくはクローンＤＮＡ単離体、化学
的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成される
ポリヌクレオチドアナログに関して用いることもできる。

しかしながら、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチド
が、その天然の環境から物理的にそれ自体が取り出されてしまっていることを必ずしも必
要としない。例えば、もし異種配列（すなわち、内因性核酸配列に天然では隣接しない配
列）が、生物のゲノム中の内因性核酸配列の発現が改変されるように、この内因性核酸配
列に隣接して置かれるならば、この内因性核酸配列は、本明細書中では、「単離された」
とみなされる。その例として、非ネイティブプロモーター配列は、ヒト細胞のゲノム中の
遺伝子が改変された発現パターンを有するように、この遺伝子の天然プロモーターに代え
て（例えば、相同組換えによって）置き換えることができる。この遺伝子は今や「単離さ
れた」ものとなっている。何故ならば、それは、天然ではそれに近接する配列の少なくと
もいくつかから分離されているからである。

また、核酸が、ゲノム中の対応する核酸では天然には起こらないいずれかの改変を含む
場合、この核酸は、「単離された」と考えられる。例えば、もし内因性コード配列が、例
えば、ヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失または点変異を含むならば、それ
は「単離された」と考えられる。「単離された核酸」としては、異種部位において宿主細
胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さら
に、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含み得ないか、あるいは組換え技術
によって生産される場合、培養培地を実質的に含み得ないか、あるいは化学的に合成され
る場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含み得ない。

本明細書中で用られる場合、参照核酸配列の「縮重改変体」との語句は、標準的な遺伝
暗号に従い、翻訳されて参照核酸配列から翻訳されたものと同一なアミノ酸配列を供する
ように翻訳され得る核酸配列を含む。

核酸配列の文脈における用語「配列同一性パーセント」または「同一な」とは、最大対
応性に対して整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較
の長さは、少なくとも約９つのヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より
通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、よ
り典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレ
オチドのストレッチにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用い
ることができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラ
ムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列を比
較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良の重複の領域
の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８、その全体が本明細書中に参考として援用さ
れる）。例えば、核酸配列の間の配列同一性パーセントは、デフォルトパラメーター（ス
コアリングマトリックスのための６のワードサイズおよびＮＯＰＡＭ因子）でＦＡＳＴＡ
を用いてか、あるいは本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．
１で提供されるようなデフォルトパラメーターでＧａｐを用いて、決定され得る。

用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはそのフラグメントに
言及する場合、もう１つの核酸（またはその相補鎖）と、ヌクレオチドの適切な挿入また
は欠失を伴って最適に整列させた場合に、前記したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたは
Ｇａｐのようないずれかの周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオ
チド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは約６０％、通常少なくとも約７０％、よ
り通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なく
とも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が
あることを示す。

あるいは、核酸またはそのフラグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で、もう１つの核酸、もう１つの核酸の鎖、その相補鎖にハイブリダイズする場
合に、かなりの相同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈
における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェン
トな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼー
ションは、当業者に容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする
種の塩基組成、相補的な領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド
塩基ミスマッチの数のような条件によって影響される。当業者であれば、どのようにして
これらのパラメーターを変化させ、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシー
を達成するかを知っている。

一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、条件の特定の組の下で、
特異的なＤＮＡハイブリッドについての熱融解温度（Ｔ_ｍ）より約２５℃低い温度で行わ
れる。「ストリンジェントな洗浄」は条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッ
ドについてのＴ_ｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が完全にマ
ッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用される
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、頁９．５１参照。本明細書中での目的では、「高ストリンジ
ェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、８〜１２時間の６５℃における６
×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ムを含む）、１％ＳＤＳでの水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含
まない）、続いての２０分間の６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回
の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズす
る配列の長さおよびパーセント同一性を含めた多数の因子に応じて異なる速度で起こるこ
とは当業者に認識される。

用語「変異した」は、核酸配列に適用する場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核
酸配列と比較して、挿入され得るか、欠失され得るか、または変化され得ることを意味す
る。単一の改変は遺伝子座でなすことができ（点変異）、あるいは多数のヌクレオチドを
単一遺伝子座において挿入し、欠失し、または変化させることができる。加えて、１以上
の改変を、核酸配列内のいずれかの数の遺伝子座で行うことができる。核酸配列は、限定
されるものではないが、「エラープローンＰＣＲ」（点変異の高い率がＰＣＲ産物の全長
に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行
うプロセス；例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５な
らびにＣａｌｂｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐ
ｌｉｃ．，２：２８−３３参照）；および「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発」（目的
の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の生成を可能とするプロセ
ス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５
３−５７参照）のような変異誘発技術が挙げられる、当該分野で公知のいずれかの方法に
よって変異させることができる。

本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが結合したもう１つの核酸を輸送するこ
とができる核酸分子をいうことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」で
あり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二本鎖Ｄ
ＮＡループをいう。他のベクターはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工
染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここ
に、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる（後により詳細
に議論する）。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製できる
（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細
胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って、宿主ゲノムに沿
って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それに作動可能に連結されるゲ
ノムの発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現
ベクター」（または単に、「発現ベクター」）といわれる。

「作動可能に連結した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子と連続して、
目的の遺伝子を制御する結合、ならびにトランス、またはある距離を置いて作用して目的
の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。

本明細書中で用いる用語「発現制御配列」とは、それに作動可能に連結したコード配列
の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の
転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転
写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグ
ナルおよびポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞
質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位
）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配
列が挙げられる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物の場合
には、そのような制御配列としては、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、お
よび転写終止配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現に必須で
ある全ての構成要素を含むことを意図し、また、その配列が有利であるさらなる構成要素
（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含み得る。

本明細書中で用いる場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、そ
の中へ組換えベクターのような核酸が導入されている細胞をいうことを意図する。そのよ
うな用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をもいうことを意図する
ことが、理解されるべきである。ある種の改変は、変異または環境の影響のいずれかに起
因して、継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でない
可能性があるが、依然として、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含ま
れる。組換え宿主細胞は、単離された細胞であっても、培養で増殖された細胞系であって
もよく、あるいは生きた組織または生物中に存在する細胞であってもよい。

本明細書中で用いられる用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的に
は約５０アミノ酸未満の長さ、より典型的には約３０アミノ酸未満の長さのものをいう。
本明細書中で用いられる該用語は、アナログ、ならびに構造および従って生物学的機能を
模倣する模倣物を含む。

本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然に存在するものと天然には存在
しないものとの両方のタンパク質、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体およびア
ナログを含む。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチ
ドは、その各々が、１以上の区別される活性を有する多数の異なるドメインを含み得る。

用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または
誘導の源により、（１）そのネイティブ状態でそれに伴う天然に会合した構成要素に会合
しないタンパク質またはポリペプチド、（２）それが天然で見出されない純度で存在する
場合、その純度を他の細胞物質の存在に関連して調整できる（例えば、同一種由来の他の
タンパク質はない）タンパク質またはポリペプチド、（３）異なる種由来の細胞によって
発現されるタンパク質またはポリペプチド、あるいは（４）天然に存在しない（例えば、
それは天然で見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、あるいはそれは天然で見
出されないアミノ酸アナログまたは誘導体、あるいは標準的なペプチド結合以外の結合を
含む）タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成されたか、またはそ
れが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に会合
した構成要素から「単離」されている。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該分
野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に会合した構成要素を実質的
に含まないようにされ得る。そのように定義されたように、「単離された」は、そのよう
に記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境
から物理的に取り出されてしまっていることを必ずしも必要としない。

本明細書中で用いる用語「ポリペプチドフラグメント」とは、全長ポリペプチドと比較
してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ま
しい実施形態において、ポリペプチドフラグメントは、そのフラグメントのアミノ酸配列
が天然に存在する配列における対応する位置と同一である連続配列である。フラグメント
は、典型的には少なくとも５、６、７、８，９または１０アミノ酸長、好ましくは少なく
とも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長
、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸長、なおより好
ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも７０アミ
ノ酸長である。

「改変された誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えば、イ
ンビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含む、あるいはネイティブ
ポリペプチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはそのフラグメント
をいう。そのような改変としては、例えば、当業者に容易に認識されるように、例えば、
アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、
放射性核種での標識）、および種々の酵素的改変が挙げられる。そのような目的で有用な
、ポリペプチドを標識するための多様な方法、および多様な置換基または標識は、当該分
野で周知であり、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、および^３Ｈのような放射性同位体、標識抗
リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標
識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドを含
む。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合体化の容易性、安定性の要件、およ
び利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野で周知である。本
明細書中で参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補遺）参照。

「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、天然または野生型のタ
ンパク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成また
は置換を含むポリペプチドをいう。ムテインは、ある位置における単一アミノ酸が別のア
ミノ酸に変化されている１以上のアミノ酸点置換、１以上のアミノ酸が天然に存在するタ
ンパク質の配列において、各々、挿入または欠失されている１以上の挿入および／もしく
は欠失、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端いずれかまたは双方におけ
るアミノ酸配列の短縮を有することができる。ムテインは、天然に存在するタンパク質と
比較して、同一の生物学的活性を有することができるが、好ましくは、異なる生物学的活
性を有する。

ムテインは、その野生型対応物に対して、少なくとも７０％の総じての配列相同性を有
する。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の
総じての配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態においては、ム
テインは、９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％
、なおより好ましくは９９％の総じての配列同一性を呈する。配列相同性は、Ｇａｐまた
はＢｅｓｔｆｉｔのような、任意の一般的な配列分析アルゴリズムによって測定され得る
。

好ましいアミノ酸置換は（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置
換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形
成するための結合親和性を改変するアミノ酸置換、（４）結合親和性または酵素活性を改
変するアミノ酸置換、および（５）そのようなアナログの他の物理化学的特性または機能
的特性を付与するか、または改変するアミノ酸置換である。

本明細書中で用いられる場合、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は慣用的用法に従
う。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的ア
ミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキ
ルアミノ酸、および他の非慣用的アミノ酸のような非天然アミノ酸もまた、本発明のポリ
ペプチドのための適切な構成要素であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒド
ロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε
−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニ
ン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、および他の
類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明
細書中で用いられるポリペプチド表記においては、標準用法および約束に従い、左手方向
はアミノ酸末端方向であって、右手方向はカルボキシ末端方向である。

もしタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類
似の配列を有するならば、そのタンパク質は第二のタンパク質に対して「相同性」を有し
、あるいはそれに対して「相同」である。あるいは、もし２つのタンパク質が「類似の」
アミノ酸配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して相同性を有する（
従って、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有する
ことを意味すると定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型
タンパク質に対して６０％の配列相同性、より好ましくは７０％配列相同性を呈するもの
である。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％
配列相同性を呈する相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同タ
ンパク質は９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を呈する。本明細書中で用
いられる場合、（特に、予測された構造類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の間
の相同性は、機能において類似性を意味するものと解釈される。

「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して用いられる場合、同一でない残基位
置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」
は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のア
ミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換
は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が相互に保
存的置換だけ異なる場合、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的性
質を修正するように上方に調整することができる。この調整をなす手段は当業者に周知で
ある（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：
６３−９８参照）。

以下の６つの群は、各々、相互に代えての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリ
ン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）ア
スパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソ
ロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、
および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

配列同一性パーセントともいうポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配
列分析ソフトウエアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ
，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５参照。タンパク質分析ソフトウエア
は、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失および他の改変に帰属される相同性
の尺度を用いて類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「
Ｂｅｓｔ ｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターを用い
て、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド
の間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決
定するために使用され得る。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。

阻害分子配列を、異なる生物からの非常に多数の配列を含むデータベースと比較する場
合の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａ
ｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら．
（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら
．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈ
ａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、
特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。Ｂ
ＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは：期待値：１０（デフォルト）：フィルタ
ー：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャッ
プを拡大するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワー
ドのサイズ１１：（デフォルト）；記載の番号：１００（デフォルト）：ペナルティマト
リックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。

相同性について比較されたポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミ
ノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には
少なくとも約２８残基、好ましくは約３５を超える。非常に多数の異なる生物に由来する
配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ
酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズム
によって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列はＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは
、クエリ配列とサーチ配列との間の最良な重複の領域の整列および配列同一性パーセント
を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６
３−９８参照）。例えば、アミノ酸配列の間の配列同一性パーセントは、本明細書中に参
考として援用される、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１に提供されているように、そのデフ
ォルトパラメーター（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を
用いて決定することができる。

用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまた
はフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク
質由来の２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので有用で
ある。融合タンパク質は、目的のポリペプチドからの少なくとも１０の連続アミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、
５０または６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミ
ノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列
とインフレームであるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を構築
し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換えにより生産することがで
きる。別法として、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントをもう一つ
のタンパク質に架橋させることによって化学的に生産することができる。

本明細書中で用いる用語「領域」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分を
いう。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によっ
て定義される。

本明細書中で用いる用語「ドメイン」とは、生体分子の既知の機能または疑われる機能
に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、領域またはその部分と同じ範囲であり得
；ドメインは、生体分子の別個の非連続領域を含むこともできる。タンパク質ドメインの
例としては、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、および細胞質ドメインが挙げられる。

本明細書中で用いられる場合、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、
ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めた任意の化合物を意味
し、そのような化合物は、天然または合成のものであり得る。

他に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が
属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一な意味を有する。例示的な方
法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載したのと同様なまたは同等な方法
および材料も本発明の実施で用いることができ、それは当業者に明らかである。本明細書
中で言及する全ての刊行物および他の文献は本明細書にその全体が参考として援用される
。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が優先する。材料、方法および例は説明のため
だけのものであり、限定する意図のものではない。

本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」または「を含む」または「含ん
でいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、他の
いかなる整数も整数の群も排除するものではないと理解される。

（下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質
を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に
関与する１以上の酵素を天然では発現しないか、またはそれを発現しないように操作され
ている真核生物宿主細胞が、出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主
細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な１以上の酵素、または他の因子を発
現するように操作される。所望の宿主株は、一度に１つ以上の酵素を発現するように操作
することができる。加えて、１以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本
発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素（例えば、異種
細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素フラグメントを含む
キメラ酵素）をコードする核酸分子のライブラリーが（例えば、酵素フラグメントを含む
サブライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって）創製され、そして最適な活性を
持つ１以上の酵素を有するか、または最も「ヒト様」の糖タンパク質を生産する株が、ラ
イブラリーの１以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって、選択され得
る。

特に、本明細書中に記載された方法は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造をさらに改変して
複合Ｎ−グリカンを得る目的で、少なくとも一時的に、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を高
い収率でインビボで得ることを可能とする。下等真核生物のような宿主細胞において適当
なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を適当な収率で得るための成功したスキームは、一般には
、２つの平行したアプローチ：（１）もしあれば、内因性マンノシルトランスフェラーゼ
活性によって作製された高マンノース構造を低下させること、および（２）１，２−α−
マンノースをマンノシダーゼによって除去して、さらに宿主細胞の内部で反応されて複合
体ヒト様グリコ形態を形成することができる高レベルの適当なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構
造を得ることを含む。

従って、第一の工程は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の作用に
よってインビボでＧｌｃＮＡｃを許容し得るＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の特異的前駆体構造
を生産し得る、真核生物宿主細胞（例えば、下等真核生物）の選択または創生を含む。一
つの実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに関して１，６マン
ノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製すること、また
はそれを用いることを含む。好ましくは、宿主細胞は、開始１，６マンノシルトランスフ
ェラーゼ活性（後記参照）が枯渇したものである。そのような宿主細胞は、ヒト様糖タン
パク質を生産するのに望ましくない高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を欠
く。

次いで、１以上の酵素活性を、そのような宿主細胞に導入して、少なくとも３０モル％
のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ_５」）炭水化物構造を有することによって特徴付け
られるＮ−グリカンを、宿主細胞内で生産する。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造は複合Ｎ−
グリカン形成に必要である：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、少なくとも一時的に、高い収率
で（例えば、３０％を超えて）インビボで形成されなければならない。なぜなら、引き続
いての哺乳動物様およびヒト様のグリコシル化反応はＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはその
誘導体を必要とするからである。

この工程は、高い収率での、細胞内でのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の特定の異性体構造の
形成も必要とする。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造は複合Ｎ−グリカン形成に必要であるが
、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＧｌｃＮＡｃト
ランスフェラーゼＩに対する基質として働くことができる、またはできない異なる異性体
形態で存在し得るからである。殆どのグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグリ
コシル化タンパク質は、一般に、その表面に、ある範囲の異なる炭水化物構造（すなわち
、グリコ形態）を含む。従って、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のような特定の構造の微量の（
すなわち、５％未満の）単なる存在は、哺乳動物様糖タンパク質またはヒト様糖タンパク
質を生産するのにほとんど現実的な関連性はない。必要なのは、高い収率での（すなわち
、３０％を超える）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを許容するＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２中間体（図１Ｂ）の形成である。この中間体の形成は、目的のグリコシル化タンパク質
（標的タンパク質）上の複合Ｎ−グリカンの引き続いてのインビボでの合成を可能とする
のに必要である。

従って、選択された宿主細胞によって生産されたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のいくつかま
たは全ては、哺乳動物グリコシル化経路に沿った酵素活性に対する生産的基質でなければ
ならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性に対する基質としてインビボで
働くことができ、それにより、宿主細胞においてヒト様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃ
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を形成する。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞にお
いて生産されたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少な
くとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、インビボにてＧｎＴＩに対する生産的基質
である。もし、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が１０％で生産され、Ｍａ
ｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が標的タンパク質上で２５％で生産されるならば、一時的に製造され
たＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の合計量は３５％であることが理解される。なぜならば、Ｇｌ
ｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の産物だからである。

当業者は、天然由来の宿主細胞（例えば、インビボでかなりのレベルのＭａｎ_５Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２を生産する現存する真菌または他の下等真核生物）を選択し得る。しかしながら
、合計Ｎ−グリカンの１．８％を超えてインビボにてそのような構造を供することが示さ
れた下等真核生物は未だない（例えば、Ｍａｒａｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２４９，７０１−７０７参照）。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボで
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を生産するように遺伝子的に操作することができる。米国特
許第５，５９５，９００号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞
または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌク
レオチドトランスポーターの非存在または存在を同定することができる。

（望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活化）
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク
質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ
糖前駆体がＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、
高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いら
れる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に
記載された多くのそのような変異体の一つで出発して操作され得るか、あるいはこの変異
体から誘導されて操作され得る。従って、選択された宿主細胞に応じて、非ヒトグリコシ
ル化反応の特徴であることが既知である酵素をコードする１つまたは多数の遺伝子を、欠
失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は、多数の下等
真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎ
ａなど）において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグ
リコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを提供する。こ
れらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、１，３マンノシルトランスフ
ェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ、１９
９１）、１，２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来
のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレ
ギュレーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＭＮＮ４およびＭＮＮ６））、ならびに異
常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるよ
うである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシ
ル化プロフィールを持つ生きた表現型を生じる。その例は、表１に示される。

必要な操作工程を例示するために本明細書中に記載したように、本発明の好ましい下等
真核生物宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓの過マン
ノシル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物のようにＰ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を生じさせるためにα−１，２−マンノシダーゼと
共にＥＲ中にＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２構造を保有する（図１Ａ）。数個のマンノシルトラ
ンスフェラーゼの作用を介して、次いで、この構造はマンナンとしても知られた過マンノ
シル化された構造（Ｍａｎ_＞９ＧｌｃＮＡｃ_２）に変換される（図３５Ａ）。加えて、Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓは、マンノシルリン酸トランスフェラーゼの作用を介して、非末端リ
ン酸基を炭水化物構造へ付加することができることが判明した。これは、マンノース糖の
付加よりはむしろ除去を包含する、哺乳動物細胞で行われる反応とは異なる（図３５Ａ）
。存在するＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造を過マンノシル化する真核生物宿主細胞（例えば
、真菌）の能力を排除するのは特に重要である。これは、超マンノシル化しない宿主細胞
を選択すること、またはそのような細胞を遺伝的に操作することのいずれかによって、達
成され得る。

超マンノシル化プロセスに関与した遺伝子は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓにおいて、同定されており、これらの遺伝子中に変異を作り出すことによって、「望ま
しくない」グリコ形態の生産を低下させることができる。そのような遺伝子は、Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような
他の下等真核生物で見出される現存のマンノシルトランスフェラーゼまたはそれらのレギ
ュレーター（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４，ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によっ
て、あるいは宿主株を変異誘発し低下したマンノシル化を持つグリコシル化表現型を選択
することによって同定することができる。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマ
ンノシルリン酸トランスフェラーゼの間の相同性に基づき、ＰＣＲプライマー（その例は
表２に示される）を設計することができるか、そのような酵素をコードする遺伝子または
遺伝子フラグメントをプローブとして用いて、標的または関連生物のＤＮＡライブラリー
においてホモログを同定することができる。別法として、関連生物において特定のグリコ
シル化表現型を補うその能力によってバンノシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的
ホモログを同定することができる。

（表２．ＰＣＲプライマー）

脚注：Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝Ｃまた
はＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｄ＝Ａまた
はＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｎ＝ＧまたはＡまたはＴまたはＣ。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードす
る遺伝子を得るためには、例えば、以下の工程を行う：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣ
Ｈ１変異体は温度感受性であり、高温では遅く成長する。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのＯＣＨ１変異体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーで補
うことによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＣＨ１の機能的ホモログを同定するこ
とができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙから入手可能でありＲｅｓＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。高温において正常な増殖表現型を呈する
変異体は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡライブラリーで形質転換された後は、Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを有するようである。そのようなライブラリーは、Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分的に消化し、制限酵素を不活化
した後、消化されたＤＮＡを、適合する制限酵素で消化されている適当なベクターに連結
することによって作り出すことができる。

適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカーを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであるｐＲＳ３１４（Ｓｉｋｏｒ
ｓｋｉおよびＨｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７頁）、お
よびＵＲＡ３マーカーを含有する改変されたｐＵＣ１９に基づく高コピー（２μ）プラス
ミドであるｐＦＬ４４Ｓ（Ｂｏｎｎｅａｕｄら（１９９１）Ｙｅａｓｔ ７：６０９−６
１５頁）が挙げられる。そのようなベクターは、学術研究者によって通常用いられ、同様
なベクターは多数の異なる販売業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ
，ＣＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能である。さらなる例として
は、ｐＹＥＳ／ＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２μ複製起点に基づく酵母発現プラス
ミド、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＹｅｐ２４クローニングビ
ヒクルが挙げられる。

染色体ＤＮＡおよびベクターの連結の後、ＤＮＡライブラリーを、特定の変異を持つＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し、対応する表現型の修正を選択することができ
る。野生型表現型を回復することができるＤＮＡフラグメントをサブクローニングし、配
列決定した後、このフラグメントを用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発および／ま
たは組換え技術を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１によってコードされた遺
伝子産物の活性を排除することができる。

あるいは、もし目的の特定の宿主細胞（例えば、真菌）の全ゲノム配列が知られている
ならば、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのようないくつかの情報源から入手可能な、公に
利用可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによって、そのような遺伝子を同定す
ることができる。例えば、与えられたゲノム配列、または公知の１，６マンノシルトラン
スフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）からの配列を
含むデータベースを検索することによって、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性
を有するタンパク質をコードできる（必ずしも必要でない）そのような宿主細胞ゲノムに
おいて高い相同性の遺伝子を同定することができる。しかしながら、核酸配列相同性単独
は、同一の活性を有する酵素をコードするホモログを同定し、単離したことを証明するに
は十分ではない。今日まで、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１欠失が非常
に重要な開始１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を排除することを示すデータは
存在しない（Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（
１２）（Ｄｅｃ．１９９８）：１１７１−１１７７；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ０２／
００８５６ Ａ２）。従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子ホモログがその機
能を現実にコードすることを証明するデータはない。その証明はここに初めて提供される
。

いくつかのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログ
は、これらのアプローチを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同定されている。相同な
遺伝子は、しばしば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関
与する遺伝子と同様な機能を有し、従って、それらの欠失を用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓまたは、同様に、同様なグリコシル化経路を持つ任意の他の宿主細胞（例えば、真菌細
胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞）において、グリコシル化パターンを操作するこ
とができる。

遺伝子ノック−アウトの創製は、一旦与えられた標的遺伝子配列が決定されると、当該
分野におけるよく確立された技術であり、当業者が行うことができる（例えば、Ｒ．Ｒｏ
ｔｈｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：
２８１参照）。宿主生物の選択は、良好な形質転換および遺伝子破壊技術の利用可能性に
よって影響され得る。

もしいくつかのマンノシルトランスフェラーゼがノックアウトされるべきであれば、例
えば、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒ（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６：５４
１−５４５によって開発された方法は、選択マーカー（例えば、酵母におけるＵＲＡ３マ
ーカー）の反復された使用を可能として、全ての望ましくない内因性マンノシルトランス
フェラーゼ活性を順次に排除することができる。この技術は他者によって改良されている
が、基本的には、逆選択マーカーに隣接する２つの反復ＤＮＡ配列の使用を含む。例えば
、ＵＲＡ３をマーカーとして用いて、構築物を取り込んだ形質転換体の選択を確実とする
ことができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復物を隣接させることによって、まず、構築物
を取り込み、従って、標的遺伝子を破壊した形質転換体を選択することができる。形質転
換体の単離、およびその特徴付けの後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に対して
耐性であるものを、第二ラウンドにて逆選択することができる。５−ＦＯＡを含有するプ
レート上で生存することができるコロニーは、先に述べた反復を含む交差事象を介して再
度ＵＲＡ３マーカーを失っている。このアプローチは、従って、同一マーカーの反復され
た使用を可能とし、さらなるマーカーを必要とすることなく複数遺伝子の破壊を容易とす
る。他の選択マーカーおよび逆選択マーカーを持つ別の真核生物宿主細胞で用いるのに適
合された、遺伝子の順次の排除のための同様な技術もまた、用いられ得る。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）ま
たはマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異体を相補する遺
伝子）のような特定のマンノシルトランスフェラーゼ、またはレギュレーター（ＭＮＮ４
）の排除は、この生物の操作された株の創製を可能とし、該株は主にＭａｎ_８ＧｌｃＮＡ
ｃ_２を合成し、これを用いて、より複雑なグリコ形態構造（例えば、哺乳動物（例えば、
ヒト細胞）で生産されるもの）に似るようにグリコシル化パターンをさらに改変すること
ができる。この方法の好ましい実施形態は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同様なまたは
同一の生化学的機能を排除して、遺伝子的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で生産さ
れた糖タンパク質のグリコシル化構造を改変するために生化学的グリコシル化活性をコー
ドするＤＮＡ配列を利用する。

本明細書中で例示したような酵母におけるグリコシル化経路を操作するのに用いられる
方法は、引き続いての修飾のために好ましい基質を生産するために糸状菌で用いることが
できる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒおよび他の糸状菌におけるグリコシル化経路を改変する
ための戦略は、酵母においてヒト様糖タンパク質を生産するように株を操作することに関
して本明細書中に記載したのと同様なプロトコルを用いて、開発することができる。１，
２マンノシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥホモログ）に関与する望
まない遺伝子活性を改変または排除する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は好ま
しい宿主である。なぜならば、それは１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くか
らであり、それゆえ、この宿主において超マンノシル化遺伝子活性（例えば、ＯＣＨ１）
は予測されない。対照的に、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，
２−マンノシダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、グリコシルトランスフェ
ラーゼ（ＧｎＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトラン
スフェラーゼ（ＳＴ））は、本発明の標的化方法を用いて宿主に導入される。

（減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作また
は選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−１，６−マンノシルトランスフ
ェラーゼ（すなわち、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造のα−１，３アーム上で外部鎖マ
ンノシル化を開始する開始特異的酵素）活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の作製
または使用を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子に
よってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子の破壊の結果、
Ｎ結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺
乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活化を必要とした
（例えば、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３
０４参照）。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトラ
ンスフェラーゼ活性の破壊は、（選択された宿主細胞に応じて）、任意であり得る。なぜ
なら、Ｏｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために、インタクトなＭａｎ
_８ＧｌｃＮＡｃ_２を必要とするからである。従って、７以下のマンノース残基を有するオ
リゴ糖を蓄積する、本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Ｏｃｈ１
ｐに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化Ｎ−グリカンを生産し得る（例えば、
Ｎａｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０参照
）。

ＯＣＨ１遺伝子は、記載されているように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（実施例１６）およ
びＫ．ｌａｃｔｉｓ（実施例９）からクローン化された。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のＯＣＨ
１遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を、配列番号７および配列番号８に記載する。遺
伝子特異的プライマーを用いて、各クローンから構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＯＣＨ１遺伝子を欠失させた（各々、実施例１お
よび９）。開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇し、かつＭａｎ_５
ＧｌｃＮＡｃ_２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを生産するように操作された宿主細胞は、
それにより、得られた（例えば、図５、６および１２；実施例４および９参照）。

従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子（配列
番号７）の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０
、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含む、またはそれよりなる核酸配列を有
する単離された核酸分子、ならびにそのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また
、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分
子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテ
イン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供される
。また、さらに本明細書中で記載するように、本発明の上記核酸分子を含む、ベクター（
発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転
換された宿主細胞が提供される。

本発明は、さらに、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、非真菌宿主細胞における同等な酵素
活性を含めたａｌｇ活性）が減少した、または枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し
、または用い、少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する方法を提供す
る。好ましい実施形態において、グリコシダーゼ活性は、宿主細胞内で１以上のマンノシ
ダーゼ活性の発現を引き起こすことによって、例えば、宿主細胞において、マンノシダー
ゼ活性の活性化によって、またはマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって、導
入される。

別の実施形態において、この方法は、糖残基を脂質結合オリゴ糖前駆体の１，６アーム
に転移する１種以上の酵素の活性を減少させたかまたは除去した宿主細胞を作製するかま
たは使用することを包含する（図１３）。本発明の宿主細胞は、脂質結合オリゴ糖前駆体
の１，６アームに糖残基（例えば、マンノシレート）を転移する酵素をコードする遺伝子
のうちの１種以上における変異について選択されるか、またはこれらの遺伝子のうちの１
種以上において変異を導入することによって、操作される。その糖残基は、より好ましく
は、マンノースであり、好ましくは、グルコース、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル
酸、フコースまたはＧｌｃＮＡｃリン酸残基である。好ましい実施形態において、脂質結
合オリゴ糖前駆体の１，６アームをマンノシル化する１種以上の酵素の活性を、減少させ
るかまたは除去する。この方法は、宿主細胞に少なくとも１種以上のグリコシダーゼ活性
を導入する工程をさらに包含し得る（以下を参照のこと）。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク
質を生産する方法を提供し、ここで、糖タンパク質は、トリマンノースコア構造に結合し
た少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。

各々上記の実施形態において、その方法は、脂質結合オリゴ糖前駆体がＭａｎ_ＸＧｌｃ
ＮＡｃ_２構造（ここでＸは、３、４または５である）を富化される宿主細胞を作製するこ
とに関する（図１４）。これらの構造は、宿主細胞のＲＥにおいて、生成しようとしてい
るポリペプチド鎖に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって転移され、グリコシ
ダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、
ＧｎＴＩ）で処理して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_ＸＧｌｃＮＡｃ_２コア構造（ここでＸは、３
、４または５であり、好ましくは３である）を有するＮ−グリカンを生成することによっ
てプロセシングされ得る（図１４および１５）。図１４に示されるように、ＧｌｃＮＡｃ
Ｍａｎ_ＸＧｌｃＮＡｃ_２コア構造（ここでＸは、３より大きい）を有するＮ−グリカンは
、適用可能である場合には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に（例えば、α−１，
３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性で処理する
ことによって）変換され得る。

グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭ
ａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２のさらなるプロセシングは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ
_２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、エキソビボ処理によって、
または宿主細胞における一連のグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼ、糖ト
ランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含める）の異種発現によって、修飾
して、ヒト様Ｎ−グリカンとなるようにされ得る。本発明に従って生産され得る好ましい
ヒト様糖タンパク質としては、７以下個または３個以下のマンノース残基を有するＮ−グ
リカンを含むヒト様糖タンパク質の；ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアリル酸、および
フコースからなる群より選択される１以上の糖を含むヒト様糖タンパク質；ならびに構造
ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮａｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む
ヒト様糖タンパク質が挙げられる。

一実施形態において、その宿主細胞は、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性が減少したかまたは除去されている。
この活性は、ＥＲの管側において、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−ＤｏｌからＭａｎ_６
ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌへの第１のマンノシル化工程に関与する活性である（例え
ば、ＡＬＧ３ 図１３；図１４）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、Ａ
ＬＧ３遺伝子によってコードされる。上記のように、漏出性のａｌｇ３−１変異を有する
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ_５ＧＩｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し、ａ
ｌｇ３が欠失した細胞は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を、ＥＲ内で生成しているポリペ
プチド鎖に転移するようである。従って、この実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ_５
ＧｌｃＮＡｃ_２構造が富化されたＮ−グリカンを蓄積する。この構造は、次いで、グリコ
シダーゼ活性（例えば、α−１，２マンノシダーゼ、α−１，３マンノシダーゼ、または
α−１，２−１，３マンノシダーゼ活性）およびグリコシルトランスフェラーゼ活性（例
えば、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ）での処理によってＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２
に変換され得る（図１４；図３５Ｂ）。

実施例１０に記載されるように、縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来
するＡｌｇ３タンパク質配列、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＡｌｇ３タンパ
ク質配列およびヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）に由来するＡｌｇ３タンパク質配列のアライ
メント（図１６および１７）に基づいて設計し、これらを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓゲノムＤＮＡから生成物を増幅した。得られたＰＣＲ生成物を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対する３５％の全体的な配列同一性および５３％の配列類似性を
有するタンパク質をコードする（図１８および１９）オープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムクローンを同定および単離するために、プロー
ブとして使用した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子は、本明細書で「ＰｐＡＬＧ３」と
いわれる。そのＡＬＧ３遺伝子を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから同様に同定および単離した（実
施例１０；図２０および２１）。

従って、別の実施形態において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ ＡＬＧ３遺伝子（図
１８）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３遺伝子（図２０）のうちの少なくとも４５個、
好ましくは５０個、より好ましくは少なくとも６０個および最も好ましくは７５個以上の
ヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる核酸配列、ならびにそれらのホモログ、
改変体および誘導体を有する核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する。本発明
はまた、ストリンジェントな条件下で上記の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提
供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド（ムテ
イン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体およびアナログを含む）が、提供される
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３遺伝子生成物およびＫ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３遺伝
子生成物は、図１８および図２０に示される）。さらに、本明細書にさらに記載されるよ
うな、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）もまた、提供される。

遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムからＰｐＡＬＧ３遺
伝子を欠失させる構築物を、作製した（実施例１０）。この株を使用して、Ｄｏｌ−Ｐ−
Ｍａｎ：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性が除
去された宿主細胞を生成し、脂質結合Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体を生
成した。この前駆体は、生成しているポリペプチド鎖に転移されて、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２糖質構造を有するＮ−グリカンを生成する。

実施例１１に記載されるように、このような宿主細胞は、望ましいＭａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２コア糖質構造を有するＮ−グリカンを生成するために、適切なマンノシダーゼの発現
によって操作され得る。宿主細胞における（例えば、以下に記載のように、核酸分子また
は核酸分子ライブラリーを標的化することによる）ＧｎＴの発現は、改変された宿主細胞
が、Ｍａｎ_３コア構造の各アームに結合した１つまたは２つのＧｌｃＮＡ構造（すなわち
、ＧｌｃＮＡｃ_１Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ま
たはＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２；図１５を参照のこと）を有するＮ−グリカ
ンを生成することを可能にする。これらの構造は、本発明の方法をさらに使用してプロセ
シングされて、宿主細胞の分泌経路に入るタンパク質上にヒト様Ｎ−グリカンを生成し得
る。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ａｌｇ遺伝子の活性またはＭａｎ
_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ_３」）コア糖質構造のα−１，６アーム上のＮ−グリカンを
マンノシル化する１以上の活性において、減少されるかもしくは除去され；かつ（ｂ）開
始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（すなわち、（Ｍａｎ_３コア構造のα−１
，３アーム上での）外側鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素）の活性において減少
されるかまたは除去される、宿主細胞を作製するかまたは使用することを包含する。Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｏｃｈ１遺伝子の破壊は、Ｎ結合型糖が、ポリマンノー
ス外側鎖を完全に欠いている表現型を生じる。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を
得るための以前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活性化を要した（例えば、Ｃｈｉｂａら．
（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３０４を参照のこと）。し
かし、本発明の宿主細胞におけるその開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活
性の破壊は、必要に応じる。なぜなら、（選択される宿主細胞に依存して）Ｏｃｈ１ｐ酵
素は、効率的なマンノース外側鎖開始のためにインタクトなＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃを要す
るからである。従って、本発明に従って選択されるかまたは生成される宿主細胞は、７個
以下のマンノース残基を有する脂質結合オリゴヌクレオチドを蓄積し、転移後に、Ｏｃｈ
１ｐについての不十分な基質であるようである低グリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙ
ｌａｔｅｄ）Ｎ−グリカンを生成する（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０を参照のこと）。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有する宿主の操作また
は選択）
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性（全長の酵素、
そのホモログ、改変体、誘導体、および触媒的に活性なフラグメントを含む）を発現する
ことによって、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法
をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は
、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性の活性化によって
かまたはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を核酸分子から発現
することによって、よりヒト様のＮ−グリカンを生成するように操作される。当該分野で
周知の技術を使用して、遺伝子特異的プライマーは、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子（好ましくは、
哺乳動物ＧｎＴＩＩＩ遺伝子（例えば、マウスＧｎＴＩＩＩ））の相同領域に相補的であ
るように設計される（図２４）。これらの配列は、当該分野で容易に入手可能であり（例
えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ３９３７３）、ＰＣＲ増幅される。

一実施形態において、本発明は、下等真核生物細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。ここでこの糖タンパク質
は、トリマンノースまたはトリマンノシル（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）コア構造上に二分
しているＧｌｃＮＡｃを示すＮ−グリカンを含む。この実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ
Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（これは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（
「ＧｎＴＩ」）活性とトリマンノースコアとを反応させることにより生成され得るが、代
表的には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２をα−１，３−マンノシダーゼ活性／α
−１，６−マンノシダーゼ活性（例えば、マンノシダーゼＩＩ）によりトリミングするこ
とにより生成される（Ｈａｍｉｌｔｏｎら．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２
４４−４６））。これは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性と
反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する。従って、本発明は
、ＧｎＴＩＩＩ活性を提供し、この活性は、β−１，４ ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物
細胞において二分しているＧｌｃＮＡｃを受容し得る基質上へと転移する。

別の実施形態において、本発明は、下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に
おいてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供し、ここでその糖タンパク質は、
トリマンノースコアに結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するトリマンノースま
たはトリマンノシル（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）コア構造上に二分しているＧｌｃＮＡｃ
を示す、Ｎ−グリカンを含む。この実施形態において、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２は、Ｇｎ
ＴＩ活性と反応し、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（「Ｇ
ｎＴＩＩ」）活性およびＧｎＴＩＩＩ活性（いずれの順でも）と反応して、二分型Ｇｌｃ
ＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する（図３８）。この実施形態の二分型トリマン
ノシルコア構造がまた、ＧｌｃＮＡｃ残基の代わりにさらなるマンノシル基を含み得るこ
とが、理解されるべきである。例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＧｎＴ
ＩＩＩ活性と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２を生成し得る。

本発明はまた、下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてよりヒト様の
糖タンパク質を生成するための方法を提供し、ここでその生成される糖タンパク質は、ペ
ンタマンノースコア構造（Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２）に結合した少なくとも２つのＧｌｃ
ＮＡｃを有し、かつ二分型Ｎ−グリカンを示す、するＮ−グリカンを含む。従って、この
実施形態において、ペンタマンノースコア構造（Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２）は、ＧｎＴＩ
ＩＩ活性と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造およびＧｌｃＮＡ
ｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を生成する。

代替的実施形態において、ｏｃｈ１遺伝子およびａｌｇ３遺伝子の変異を介して生成さ
れるペンタマンノースコア構造は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＧｎＴＩ活性、Ｇｎ
ＴＩＩ活性およびＧｎＴＩＩＩ活性ならびにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと反応して、二分型Ｇ
ｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリカンを生成する（図３５Ｂ）。別の実施形態に
おいて、ペンタマンノースコア構造は、ＧｎＴＩ活性およびＧｎＴＩＩＩ活性と（いずれ
の順番でもよいし、組み合わせてもよい）反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５Ｇｌ
ｃＮＡｃ_２構造を生成する（図３７）。

より好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を
使用して、以下に記載のように、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（Ｇ
ｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２リーダー（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ株ＹＳＨ−１（実施例１３）において発現され、それにより、二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍ
ａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を有するＮ−グリカンを生成する（実施例２０）。図２６（下
）は、上記の株（ＰＢＰ２６と名付けられる（図３６））において発現されたクリングル
３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これ
は、１６６６ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ａ］を示し、このピークは、二分型ＧｌｃＮ
Ａｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する（比較のために、図２６（上）は、ｐＶＡ５３
構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現されるクリングル３タンパク質から遊離さ
れるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。１４６１ｍ／ｚにおける優勢
なピーク［ｄ］は、非修飾グリカン：ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する）
。従って、一実施形態において、本発明の宿主は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する、
少なくとも５０モル％のＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造または少なくとも５
０モル％のＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を示すＮ−グリカンを少なくとも
一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。そのグリカンのモル％は、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦによって検出される総中性グリカンの％に関する。例えば、二分しているＧｌｃ
ＮＡｃを有するＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２が、標的タンパク質上に少なくと
も２０％で生成され、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２が標的タンパク質上に２５
％で生成される場合、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する一時的に生成されるＧｌｃＮＡ
ｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の総量は、４５％であることが、理解される。なぜなら、Ｇ
ｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＧｌｃＮＡ
ｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（ＧｎＴＩＩとさらに反応する）の生成物であるからである
。

同様に、別の実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（
ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（１）リーダー
（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５５構築物は、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−１）において発現され、それによって、Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２および二分型Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２構造を生成する。図２７（下）に示されるように、これらの構造は、それぞれ、１４
６３ｍ／ｚおよび１６６７ｍ／ｚにおけるピークに対応しする（比較のために、図２７（
上）は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現されるクリングル３タ
ンパク質から遊離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。その優勢
なピークは、１４６１ｍ／ｚにおける修飾ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］に
対応する）。従って、別の実施形態において、本発明の宿主は、少なくとも一時的に、二
分しているＧｌｃＮＡｃを有する、少なくとも２０モル％ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２構造または少なくとも２０モル％のＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造
を示すＮ−グリカンを生成するその能力によって、特徴付けられる。

なおより好ましい実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイ
ン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リ
ーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、二分型
ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を有するＮ−グリカンを生成する（実施例２
０）。図３０は、上記の株（ＹＳＨ−５７と名付けられる）において発現されるクリング
ル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。こ
れは、１５４２ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｙ］を示し、二分型グリカンＧｌｃＮＡｃ
_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する（比較のために、図２９は、ｐＶＡ５３構築物を欠
いている株ＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−
グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。図２９の１３５６ｍ／ｚにおける優勢
なピーク［ｘ］は、修飾グリカン：ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する）
。従って、一実施形態において、本発明の宿主は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する、
少なくとも８０モル％のＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を示すＮ−グリカン
を少なくとも一時的に生成するその能力によって、特徴付けられる。そのグリカンのモル
％は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出される総中性グリカンのパーセントに対する。

あるいは、別の実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン
（ＧｎＴＩＩＩΔ３２）に融合されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダ
ー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ株（ＰＢＰ６−５）（実施例１１）において発現され、それによって、Ｇｌ
ｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造および二分型ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２構造を有する、Ｎ−グリカンを生成する。図３２に示されるように、これらの構造は
、それぞれ、１３４０ｍ／ｚおよび１５４３ｍ／ｚにおけるピークに対応する。従って、
別の実施形態において、本発明の宿主は、ａｌｇ３変異宿主細胞において二分しているＧ
ｌｃＮＡｃを有する少なくとも２０モル％のＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造
を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成するその能力によって、特徴付けられる。

本発明は、下等真核生物においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供し、
ここでその糖タンパク質は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２コア構造を含み、そしてそのコア構造は、２以上のＧｌｃＮＡｃでさらに修飾される
。本発明のいくつかの実施形態において、そのコア構造の１０％以上は、２以上のＧｌｃ
ＮＡｃで修飾される。他の好ましい実施形態において、２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％以上の上記コア構造が、そのように修飾される。非常に好まし
い実施形態において、それらのＧｌｃＮＡｃのうちの１つは、二分しているＧｌｃＮＡｃ
である。

本発明の別の局面において、少なくとも１つのＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインをコードする
コンビナトリアル核酸ライブラリーが、下等真核生物宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性
を発現するために使用される（実施例１８）。好ましくは、本発明のライブラリーは、単
一の核酸分子にインフレームで融合されたリーダー配列のサブライブラリー、またはＧｎ
ＴＩＩＩ配列を含む核酸分子のサブライブラリーを含み、これらの核酸分子のうちの１つ
以上が、宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を有する触媒ドメインをコードする。あるい
は、単一の核酸分子またはリーダー配列を含む核酸分子のライブラリーは、ＧｎＴＩＩＩ
配列を含む核酸分子のサブライブラリーにインフレームで融合され、これらの核酸分子の
うちの１以上が、宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を有する触媒ドメインをコードする
（以下を参照のこと）。これらおよび他のこのようなコンビナトリアルライブラリーの発
現は、標的糖タンパク質を発現する宿主細胞において行われ、その標的糖タンパク質のＮ
−グリカン構造が、ＧｎＴＩＩＩが発現されるか否か、およびどの程度発現されるかを決
定するために、分析される。広い範囲の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩ酵素が、本発明の方
法およびライブラリーを使用して宿主細胞において発現されう得る。当業者が、宿主細胞
において、ほとんどまたは全く活性を有さないＧｎＴＩＩＩ酵素と、活発に発現されて優
勢なレベルの望ましい二分型オリゴ糖中間体（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２またはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２）を生成する酵素との間を作りだして示すことを可能にするのが、本発明のこの局
面である。

以下にさらに記載されるように、グリコシル化経路における所定の工程を担う酵素を適
切な細胞下位置に適切に標的化すること、およびその細胞下位置の特定のｐＨにおいて酵
素活性が十分であることは、望ましい構造を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質の
生成において重要な要因である。酵素キメラの多様な集団を生成するための融合タンパク
質のコンビナトリアルライブラリーの使用、および形質転換細胞におけるこれらのライブ
ラリーのスクリーニングは、適切な位置において目的の活性を有する宿主株を同定するた
めの強力な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、その酵素活性は、宿主
細胞において発現されるＮ−グリカン含有糖タンパク質が、分泌プロセスの間にその活性
と反応し得るように、位置付けられる。

リーダー／触媒ドメインの全ての組み合わせが、望ましい酵素活性を生じるわけではな
い。しかし、広く種々のリーダー／触媒ドメインの組み合わせが作り出され、そのうちの
ごくわずかが、本発明で望ましい中間体を生成するにあたって有用であり得る。本発明は
、にもかかわらず、例示される宿主細胞において望ましい酵素活性を現在は示さない組み
合わせもなお包含する。図２８（下）は、ＧｎＴＩＩＩ活性を容易には示さない、Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ株Ｙ８Ｈ−１において発現されるマウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩ
Ｉドメイン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ＧＮT（ｓ）リー
ダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０６０８０）を含むｐＶＢ５１構築物を示す（比較
のために、図２８（上）は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現さ
れるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクト
ルを示す。その優勢なピークは、１４６１ｍ／ｚにおける非修飾ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２に対応する。図２８（下）の１４６３ｍ／ｚにおける優勢なピーク（Ｇｌｃ
ＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２，の質量に相関する）が、観察される。１７２６ｍ／ｚに
おける第２のピーク（これは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の質量に相関しな
い）もまた、観察される。例えば、他の宿主細胞（ヒト様糖形態を生成するように改変さ
れた宿主細胞を含む）において、これらおよび他のこのような組み合わせが発現される場
合、これらの組み合わせは、当該分野で周知の技術を使用して改変しても改変しなくても
有用であり得ることが、予測される。

酵素キメラの多様な集団を生成するためのコンビナトリアルライブラリーの使用、およ
び形質転換細胞におけるこれらのライブラリーのスクリーニングにより、その酵素活性が
実質的に細胞内にある株が同定されることが、さらに可能になる。以下の実施例６は、細
胞外α−１，２−マンノシダーゼ活性を測定するために有用なアッセイ条件の例を提供す
る。実施例２２および２３はまた、培地中でのグリコシルトランスフェラーゼ活性（Ｇｎ
ＴＩＩＩ）についてのアッセイの例を提供する。以下の表９、およびＣｈｏｉら（２００
３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２−２
７もまた参照のこと。本発明の目的のために、酵素活性は、その酵素活性の１０％未満が
細胞外培地において測定可能である場合に、実質的に細胞内にある。

実施例１１、１２、１３、１４、１５、および１９〜２１において記載される場合、宿
主細胞は、望ましい糖質構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇｌｃ
ＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を有するＮ−グリカンを生成するために、適切なグリ
コシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）
の発現によって操作され得る。その宿主細胞における（例えば、以下およびＣｈｏｉら（
２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２
２−２７およびＷＯ０２／００８７９に記載される、核酸分子または核酸分子のライブラ
リーを標的化することによる）ＧｎＴの発現は、その改変された宿主細胞が中間のマンノ
ース上に二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを生成することを可能にする。
これらの構造は、本発明の方法をさらに使用して、宿主細胞の分泌経路に入るタンパク質
上にヒト様Ｎ−グリカンを生成するようにプロセシングされ得る。

より好ましい実施形態において、適切なＵＤＰ−糖−トランスポーターおよびＵＤＰ−
糖−トランスフェラーゼの同時発現は、末端のα−１，６残基およびα−１，３残基、な
らびにＧｌｃＮＡｃを有する中間のマンノースをキャップし、哺乳動物型の複合Ｎ―グリ
コシル化（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）および混成型Ｎ−グリコシ
ル化のための前駆体を生じる。これらのペプチド結合Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、次いで、哺
乳動物型オリゴ糖構造に対するさらなる修飾のための前駆体として働く。ガラクトシルト
ランスフェラーゼのその後の発現、および末端にシアリル酸を転移する能力を遺伝的に操
作すること（図１Ｂを参照のこと）は、哺乳動物型（例えば、ヒト様）Ｎ−グリカン構造
を生成する。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ
活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性を有する宿主の操
作または選択）
本発明は、糖ヌクレオチドＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下でオリゴ糖のＭａｎα１，６
アームおよび／またはＭａｎα１，３アーム上でのＧｌｃＮＡｃβ１，４グリコシド結合
またはＧｌｃＮＡｃβ１，６グリコシド結合の形成を触媒する、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ活性を有する新規な下等真核生物宿主を提供する。そのＧｌｃＮ
ａｃ残基の転移は、一般的には、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの存在下が好ま
しい。本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク
質をコードする組換え核酸分子、および酵母分泌経路において活性な酵素を発現するため
の方法を提供する。さらに、本発明は、治療投与のために有用な形質転換細胞から生成さ
れるオリゴ糖構造を提供する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性によ
りＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから上記オリゴ糖基質上へと糖ＧｌｃＮＡｃを転移するのを触媒
することによって、複数のアンテナを有する糖形態が、タンパク質上に形成され、その後
、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼによって伸長され
る。

本発明はさらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼＶＩ活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性（全
長の酵素、そのホモログ、改変体、誘導体、および触媒的に活性なフラグメントを含む）
を発現することによって、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生成する
ための方法を提供する。一実施形態において、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸの
活性の活性化によってかまたはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ、Ｖ
、ＶＩ、ＩＸの活性を核酸分子から発現することによって、よりヒト様のＮ−グリカンを
生成するように操作される（図３９）。当該分野で周知の技術を使用して、遺伝子特異的
プライマーは、グリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバー（例えば、ＧｎＴ
ＩＶ遺伝子配列、ＧｎＴ Ｖ遺伝子配列、ＧｎＴ ＶＩ遺伝子配列、ＧｎＴ ＩＸ遺伝子
配列）の相同領域にハイブリダイズするように設計される。これらの配列は、当該分野で
容易に入手可能であり（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース）、
ＰＣＲ増幅される。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶの発現）
本発明の一局面において、下等真核生物が、オリゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍ
ａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ
１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，３アーム上での糖残基β（１，４
）Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）の付加を触媒する酵素Ｎ−アセチルグ
ルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ（「ＧｎＴ ＩＶ」）をコードするヌクレオチド配
列で形質転換される。アクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２
）のＭａｎα１，３アーム上への、ＧｎＴ ＩＶによるＧｌｃＮＡｃβ１，４の付加によ
り、いわゆるトリアンテナＮ−グリカンが生じる。

一実施形態において、本発明は、下等真核生物細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。ここでこの糖タンパク質
は、オリゴ糖構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）上にあるトリアン
テナＮ−グリカン構造を含む。この実施形態において、上記オリゴ糖構造ＧｌｃＮＡｃＭ
ａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２２〜７）が、α−１，３−マ
ンノシダーゼ活性／α−１，６−マンノシダーゼ活性（例えば、マンノシダーゼＩＩ）に
よりトリミングすることにより生成される（Ｈａｍｉｌｔｏｎら．（２００３）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ３０１：１２４４−４６））。これは、次に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトラ
ンスフェラーゼＩＶ活性と反応して、トリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２を生成する（図３９）。好ましい実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＭＮＮ（ｓ）標的化ペプチド配列のヌクレオチド１〜１０８にインフレームで連結されて
いるヒトＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメント（図４２）が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ ＹＳＨ−４４中に導入されてその中で発現される（実施例１５）。従って、特定の
実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル
％、８０モル％、９０モル％以上の望ましいＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３Ｇ
ｌｃＮＡｃ_２を好ましくは示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって
、特徴付けられる。なおより好ましい実施形態において、オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ
_３ＧｌｃＮＡｃ_２が、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の基質である。従って、本発
明は、下等真核生物において、オリゴ糖基質上にＧｌｃＮＡｃ残基を転移して、オリゴ糖
基質（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）のＭａｎα１，３アーム上でＧ
ｌｃＮＡｃβ１−４グリコシド結合を形成するのを触媒する、ＧｎＴ ＩＶ活性を提供す
る。

より好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を
使用して、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＶドメイン（ＧｎＴＩＶ Δ１０４）に
融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＰＢ１４４構築物（図４０Ａ）が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、トリアンテナＮ−グリカ
ンＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する（実施例２５）。図４７は、ＰＢＰ
４３と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ
−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１５４３ｍ／ｚにおいて優
勢なピーク［ｙ］を示し、このピークは、トリアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ_３
Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する（比較のために、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２を生成するＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タンパク質から遊離される
Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す、図２９を参照のこと）。従って、
特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも５０モル％のＧｌｃＮＡｃ_３
Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を好ましくは示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能
力によって、特徴付けられる。別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも
６０モル％、７０モル％、８０モル％、より好ましくは９０モル％以上の量で、ＧｎＴＩ
Ｖにより触媒されるトリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する
。本明細書全体を通して、上記グリカンのモル％は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより検
出される総中性グリカンのパーセントに関する。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶおよびＮ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼＶの発現）
本発明の別の局面において、下等真核生物宿主細胞が、トリアンテナオリゴ糖構造（例
えば、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を生成するように操作または選択され、
この宿主細胞は、オリゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃ
β１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１
，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，６アーム上での糖残基β（１，６）
Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）の付加を触媒する酵素Ｎ−アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ Ｖ」）をコードする核酸配列で形質転換さ
れる。ＧｌｃＮＡｃ残基の存在下でのアクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３
ＧｌｃＮＡｃ_２）の、ＧｎＴ ＶによるＧｌｃＮＡｃβ１，６の付加により、テトラアン
テナＮ−グリカンであるＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２が生じる。好ましくは、
本発明のＧｎＴ Ｖ活性が、トリアンテナグリカンを生成する下等真核生物宿主細胞（例
えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３）において発現され、この宿主細胞において、
オリゴ糖基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２のＭａｎα１，６アーム上へＧｌｃＮ
Ａｃ残基を転移してＧｌｃＮＡｃβ１，６グリコシド結合を形成するのをＧｎＴ Ｖ活性
が触媒する、
一実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、ＧｎＴＩＶＢ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ
ＮＮ２（ｓ）融合構築物およびＧｎＴＶ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融
合構築物で形質転換される。図４９は、ＰＢＰ４６と呼ばれる形質転換株において発現さ
れたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクト
ルを示す。これは、１７４７ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｚ］（このピークは、テトラ
アンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する）および１
５４３ｍ／ｚにおける残基ピーク［ｙ］（このピークは、トリアンテナＮ−グリカン構造
ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する）を示す。

別の実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して
、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、ＧｎＴＩＶＡ（Δ８２）／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物を含むプラスミドｐＰＢ１２８と、ＧｎＴＶ（Δ１
４５）／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物を含むプラスミドｐＰＢ
１４０との、酵素およびリーダー融合物の異なる組み合わせで形質転換される。図５０は
、ＰＢＰ９４と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離
されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１７４７ｍ／ｚに
おいて優勢なピーク［ｚ］を示し、このピークは、テトラアンテナＮ−グリカン構造Ｇｌ
ｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する。

従って、特定の実施形態において、本発明は、少なくとも５０モル％、６０モル％、７
０モル％、８０モル％、９０モル％以上の望ましいＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａ
ｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって特徴
付けられる、宿主細胞を提供する。より好ましい実施形態において、ＧｎＴＩＶ活性およ
びＧｎＴＶ活性を発現することによって、上記宿主細胞は、望ましい複数のアンテナを有
するＮ−グリカン構造を生成する。

リーダー／触媒ドメインの全ての組み合わせが、複数のアンテナを有するグリカン構造
の生成において望ましい酵素活性を生じるわけではない。本発明の方法およびライブラリ
ーを使用して、広く種々のリーダー／触媒ドメインの組み合わせが作り出され、そのうち
のごくわずかが、本発明で望ましい中間体を生成するにあたって有用であり得る。本発明
は、にもかかわらず、例示される宿主細胞において望ましい酵素活性を現在は示さない組
み合わせもなお包含する。例えば、他の宿主細胞（ヒト様糖形態を生成するように改変さ
れた宿主細胞を含む）において、これらおよび他のこのような組み合わせが発現される場
合、これらの組み合わせは、当該分野で周知の技術を使用して改変しても改変しなくても
有用であり得ることが、予測される。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶの発現）
本発明の別の実施形態において、ＧｎＴＶ活性をコードする核酸が、コアＧｌｃＮＡｃ
_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造を生成する宿主において発現されて、トリアンテナ構造Ｇ
ｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の形成がもたらされる。公知のＧｎＴＶ配列が、図
４３において提供される。一実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブ
ラリー方法を使用して、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＶドメイン（ＧｎＴＶ Δ１
４５）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＰＢ１４０構築物（図４０Ｂ）が、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、トリアンテナＮ
−グリカンＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する（実施例２５）。図４８は
、ＰＢＰ３２と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離
されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１５５９ｍ／ｚに
おいて優勢なピーク［ｙ］（このピークは、テトラアンテナＮ−グリカン構造に対応する
）および１３５５ｍ／ｚにおける第二ピーク［ｕ］（これは、トリアンテナＮ−グリカン
構造ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に対応する）（比較のために、ＧｌｃＮＡｃ
_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タン
パク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す、図２９を参
照のこと）。従って、特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも４０モ
ル％のトリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を示すＮ−グリカンを少
なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。好ましくは、本発明の宿主は
、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上の、Ｇ
ｎＴＶにより触媒されるトリアンテナ構造を生成する。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩの発現）
本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ「ＧｎＴＶＩ」）
活性をコードする核酸で形質転換された下等真核生物宿主細胞も提供し、この活性は、オ
リゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮ
Ａｃβ１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
β１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，６アーム上での糖残基β（１，
４）Ｎ−アセチルグルコサミンの転移を触媒する。アクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡ
ｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）への、ＧｎＴ ＶＩによるＧｌｃＮＡｃβ１，４の付加に
より、いわゆるペンタアンテナＮ−グリカンが生じる。ＧｌｃＮＡｃ残基の付加により、
オリゴ糖基質上にＧｌｃＮＡｃβ１，４グリコシド残基が形成される。一実施形態におい
て、ＧｎＴＶＩ活性をコードする核酸が、ペンタアンテナＮ−グリカン（例えば、Ｇｌｃ
ＮＡｃ_５Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を生成する宿主において発現される。別の実施形態に
おいて、ＧｎＴＶＩ活性をコードするＤＮＡフラグメント（例えば、図４４において示さ
れる）を使用して、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ由来の触媒的に活性なＧｎＴＶＩドメイ
ンに融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号ＮＰ＿００９５７１）を含むプラスミド構築物が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−
４４において発現され、それにより、ペンタアンテナＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ_５Ｍａｎ
_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する。従って、本発明の宿主細胞は、検出可能な部分でペンタア
ンテナＮ−グリカン生成するＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、
特徴付けられる。

（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの発現）
別の実施形態において、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
ＡＮ ＮＰ＿９４５１９３）が、宿主細胞において発現され、この宿主細胞において、Ｇ
ＮＴＩＶも、ＧＮＴＶも、ＧｎＴＶＩもない状態で複合グリカンアクセプター基質（例え
ば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）上へのＧｌｃＮＡｃ残基の転移をＧｎＴＩ
Ｘ活性が触媒する。ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（これは、通常は、脳において独占
的に発現されるようである）は、ＣＨＯマウス細胞において独特なＮ結合型オリゴ糖の合
成を触媒することが示されている（Ｒａｊｕら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２
７３，１４０９０〜１４０９８）。組換えヒトＧｎＴＩＸの発現は、ＧｎＴＶ活性を示し
、β１，６結合を介してオリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＡのα１，
６結合マンノースアームの６−ＯＨ位置へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒し、それに加えて
、α１，３結合マンノースアーム上で作用した（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｏ
ｃｔ ３１；２７８（４４）：４３１０２〜９）。ＧｎＴＩＸは、配列ＧｌｃＮＡｃβ１
，２−Ｍａｎα１におけるマンノースの６−ＯＨ位置へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒する
ことが可能である。

従って、本発明は、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（図４５）を使用して、Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓにおいてテトラアンテナグリカン構造を生成する方法を提供する。好ましく
は、ＧｎＴＩＸ活性の導入および発現によって、アクセプター基質ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ
_３ＧｌｃＮＡｃ_２上へとＧｌｃＮＡｃ残基が転移されてＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２およびＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２が生成されるのを触媒する。ＧｎＴ
ＩＸ活性の宿主発現は、コアＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２オリゴ糖基質のＭａ
ｎα１，３アームおよびＭａｎα１，６アームの好ましくは両方の６−ＯＨ位置にＧｌｃ
ＮＡｃ残基が転移するのを触媒する。一実施形態において、アクセプター基質ＧｌｃＮＡ
ｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成する宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳ
Ｈ−４４）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダーにインフレームで融
合されたＧＮＴＩＸ活性（Δ４３）をコードする遺伝子を含むプラスミド（例えば、ｐＢ
１７６）で形質転換される（実施例２９）。その宿主細胞は、β１，６結合を介してオリ
ゴ糖ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２のα１，６結合マンノースの６−ＯＨ位置へ
のＧｌｃＮＡｃの転移を触媒し、さらに、そのオリゴ糖基質のα１，３結合マンノースに
対して作用する、好ましくは少なくとも５モル％以上のＧｎＴＩＸ活性を示すＮ−グリカ
ンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。

さらに、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸が、周知の手順を使用して、酵母における翻
訳効率についてコドンを最適化され得る。図４６は、ＰＣＲを使用してオリゴヌクレオチ
ドから合成されたＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＧｎＴＩＸの一部をコードする、コ
ドンを最適化されたＤＮＡフラグメントを提供する。

（複数のアンテナを有するグリカンの変化形）
本発明は、治療目的のために適切な種々の複数のアンテナを有するグリカンを生成する
ように適合される。同じＧｌｃＮＡｃβ結合を有するグリカンは、そのタンパク質の半減
期を増加し得ることが、企図される。従って、本発明は、トリマンノースコアオリゴ糖中
間体（例えば、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡＣ残基を有す
るＮ−グリカンを含む、下等真核生物宿主細胞を提供する。一実施形態において、その下
等真核生物宿主は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ
_２）のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アーム上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃβ
１，４残基を含む。別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、トリマンノー
スコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）のＭａｎα１，３およびＭａ
ｎα１，６アーム上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃβ１，６残基を含む。なお別の実施
形態において、その下等真核生物宿主細胞は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例え
ば、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アーム上に少なく
とも２つのＧｌｃＮＡｃβ１，２残基を含む。

下記のように、下等真核生物宿主細胞は、本発明の方法を使用して治療タンパク質を生
成するために好ましい宿主ではあるが、本発明はまた、任意の真核生物宿主細胞（好まし
くは、非ヒト（例えば、哺乳動物）宿主細胞）において生成される糖タンパク質のＮ−グ
リカン形態を改変するためにも有用である。

（本発明の宿主細胞）
本発明の好ましい宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、酵母、単細胞および多細胞
または糸状真菌）である。しかしながら、広範な種々の宿主細胞が、本発明の方法で有用
であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従って、ヒト様糖タ
ンパク質を発現するように操作され得る。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺
乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク
質を発現させる得る。当業者が認識するように、（ヒト細胞を含めた）任意の真核生物宿
主細胞は、本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、１以上のキメラタンパク質を発
現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿
主細胞における細胞下位置（例えば、オルガネラ）に標的化される。そのようなタンパク
質は、好ましくは、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵
素であるが、必ずしもそうではない。任意のタンパク質コード配列も、本明細書中に記載
された方法を用いて、標的化され得、そして真核生物宿主細胞において修飾された活性に
ついて選択され得ることが予測される。

結合されたＮ−グリカンＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有する糖タンパク質を生産すること
ができる下等真核生物が特に有用である。何故ならば、（ａ）高度なマンノシル化を欠き
（例えば、Ｎ−グリカン当たり８マンノースを超え、または特に３０〜４０マンノース）
、それらはヒトにおいて低下した免疫原性を示し；そして（ｂ）Ｎ−グリカンは、例えば
、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を形成するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラー
ゼＩの作用によって（図１Ｂ；β１，２ＧｎＴＩ）、なおよりヒト様のグリコ形態を形成
するためのさらなるグリコシル化反応のための基質であるからである。３０モル％より大
きい、より好ましくは５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、
または１００モル％さえの、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を有するＮ−グリカンを持つ糖
タンパク質の収率が得られる。好ましい実施形態において、５０％を超えるＭａｎ_５Ｇｌ
ｃＮＡｃ_２構造が、ＧｎＴＩ活性に対する基質であり、インビボにてそのような基質とし
て働くことができることが示される。

本発明の好ましい下等真核生物としては、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌ
ｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆ
ａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ（例えば、Ｏｇａｔａｅ ｍｉｎｕｔａ、
Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇ
ｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏ
ｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇ
ｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａが挙げられる。

各上記実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２で富
化された宿主細胞を作製することに関する。これらの構造は望ましい。何故ならば、それ
らは、次いで、例えば、ＭａｒａｓおよびＣｏｎｔｒｅｒａｓ、米国特許第５，８３４，
２５１号の方法を用い、インビトロでの処理によってプロセシングされ得るからである。
しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が富化された前駆
体は−−グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェ
ラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で−−インビボでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化
反応によって処理されて、ヒト様Ｎ−グリカンを生じる。例えば、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２が富化されたオリゴ糖前駆体は、好ましくは、Ｘが３、４または５であり、好ましくは
３であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_ｘＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を有するものへとプロセシングさ
れる。Ｘが３より大きなＧｌｃＮＡｃＭａｎ_ｘＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を有するＮ−グリ
カンは、例えば、適用可能であれば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−
１，６マンノシダーゼ活性での処理によって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に変
換することができる。グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理に
よるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２のさらなるプロセシングはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａ
ｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、グリコシ
ルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含めた
さらなるグリコシル化酵素の宿主細胞におけるエキソビボ処理によって、または異種発現
によって修飾して、ヒト様Ｎ−グリカンとなることができる。

本発明に従って生産することができる好ましいヒト様糖タンパク質は、７以下、または
３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含むもの；およびガラクトース、Ｇｌｃ
ＮＡｃ、シアル酸、およびフコースよりなる群から選択される１以上の糖を含むものを含
む。

本発明の別の好ましい非ヒト宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、単細胞または糸
状の真菌）であり、これは、１種以上のａｌｇ遺伝子活性（ａｌｇ活性に対するホモログ
または等価物である酵素活性を含む）の活性が減少または除去されている。本発明の別の
好ましい宿主細胞は、脂質結合オリゴ糖構造のα−１，６アームをマンノシル化する１種
以上の酵素の活性（ａｌｇ活性以外）が減少または除去されている。

下等真核生物宿主細胞が好ましいが、上記の特性を有する広範な種々の宿主細胞は、本
発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞は、本発明に従ってヒト様糖タ
ンパク質を発現するように操作することができる。同様に、種々の非ヒト哺乳動物宿主細
胞は、本発明の方法を用い、よりヒト様の糖タンパク質を発現するように改変することが
できる。適当な宿主細胞が操作され得るか、あるいは酵母において既に記載された多くの
そのような変異体の１つが用いられ得る。本明細書中で例示したように、本発明の好まし
い宿主細胞は、ａｌｇ３を欠失するようにさらに改変されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓにおける高マンノシル化−マイナス（ＯＣＨ１）変異体である。

本発明は、二分型Ｎ−グリカン（例えば、二分型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、お
よび好ましくはＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を有する糖タンパク質を生成し
得る下等真核生物宿主細胞をさらに提供する。本発明の好ましい実施形態において、その
宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を含む。より好ましい実施形態において、その宿主細胞は
、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＶ、およびＧｎＴＶから選択される１種以上の活性を
さらに含む。好ましい宿主細胞は、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩを発現す
る。他の好ましい宿主細胞は、ＧｎＴＩＶおよび／またはＧｎＴＶをさらに発現する。な
おより好ましくは、その宿主細胞の１種以上のＧｎＴ活性は、実質的に細胞内活性である
。

従って、本発明の好ましい実施形態において、１種以上のＧｎＴ活性を含む宿主細胞は
、ＧｎＴＩＩＩ酵素活性と反応して、対応する二分型Ｎ−グリカンを生成し得る構造（Ｇ
ｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２、またはＧｌ
ｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が挙げられるが、これらに限定されない）を含むＮ−グ
リカンを生成する。その酵素活性は、それにより、これらのＮ−グリカンを含む糖タンパ
ク質を、新たなかつより望ましい特性を有する形態に変換する。ＧｎＴＩＩＩは、哺乳動
物細胞においてさらなるＧｎＴ活性を阻害することが現在理解されているので、当業者は
、その連続的なグリコシル化反応が、重要であっても重要でなくてもよいことを理解する
はずである。しかし、本発明は、いずれの順でも、あるいは一緒でもＧｎＴＩおよびＧｎ
ＴＩＩＩの付加を意図する。その細胞内の他の酵素活性（例えば、１種以上の望ましいマ
ンノシダーゼ活性（例えば、α１，２マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩ、マンノシダー
ゼＩＩ））が、ＧｎＴ活性と協働して、目的のさらに他のヒト様糖タンパク質を生成する
ように作用し得る（図１Ｂを参照のこと）こともまた、理解されるべきである。

好ましい実施形態において、マンノシダーゼＩＩまたはその触媒的に活性なフラグメン
トは、二分型５マンノースコア構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２）
のα１，３マンノースを含むアームおよびα１，６マンノースを含むアームを切り取るた
めに、宿主細胞に導入される。得られたグリカン（例えば、二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ
_４ＧｌｃＮＡｃ_２およびＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）は、その後のヒト様Ｎ
−グリカン修飾のための好ましい基質である。

本発明の別の実施形態において、その宿主細胞は、２つ以上のＧｌｃＮＡｃにより修飾
される、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造またはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を含む
。いずれのコア構造も、ＧｌｃＮＡｃによる修飾に加えて、さらなる修飾を含み得ること
が理解されるべきである。好ましくは、１０％以上のコア構造が、ＧｌｃＮＡｃにより修
飾される。最も好ましくは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％
以上のコア構造が、ＧｌｃＮＡｃ修飾を含む。

（複合Ｎ−グリカンの形成）
複合Ｎ−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構
造に結合される連続的プロセスである。高等真核生物においては、これは、基質を種々の
プロセシング酵素に連続的に暴露させることによって達成される。これらの酵素は、全プ
ロセシングカスケード内のそれらの特定の位置に依存して、特異的反応を行う。この「組
立てライン」はＥＲ、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢および後期ゴルジ、ならびにトランスゴ
ルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物の
ゴルジおよびＥＲにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の
酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよび
トランスポーター）が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それら
の環境ならびに経路における他の酵素に対して最も効率的に機能するような位置に特異的
に標的化されなければならない。

本明細書中で記載した方法の１つの目標は、産業醗酵プロセスにおいてよく行うことが
できる頑強なタンパク質生産株を達成することにあるので、複数の遺伝子の、宿主細胞染
色体への組込みは、注意深い計画を含む。上記したように、非ヒトグリコシル化反応に特
徴的であることが知られている酵素をコードする１以上の遺伝子は、好ましくは、欠失さ
れる。操作された細胞株は、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換
され、これらの遺伝子は安定な様式で形質転換され、それにより、所望の活性が醗酵プロ
セスを通じて維持されるのを保証する。

以下の酵素活性のいずれの組合せも、本発明の方法を用いて単一でまたは複数で宿主中
へ操作することができる：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトラ
ンスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、
ＥＲ特異的トランスポーターおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガ
ラクトースおよび他の前駆体に対するｓｙｎポートトランスポーターおよびアンチポート
トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、ならびにＵＤＰ−ガ
ラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆
体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性を、１以上の核酸分子に導入することが
できる（下記も参照）。核酸分子は単一でまたは複数で、例えば、本発明のコンビナトリ
アルライブラリーのような核酸ライブラリーの意味で導入することができる。しかしなが
ら、単一または複数の酵素活性を、限定されるものではないが、タンパク質送達方法およ
び／または本発明の核酸ライブラリーもコンビナトリアルライブラリーも必ずしも用いる
ことのない１以上の核酸分子の使用を含めたいずれかの方法で宿主細胞に導入することが
できることが、理解されるべきである。

（複合Ｎ−グリカンを生産するためのグリコシルトランスフェラーゼの発現）
ＤＮＡ配列情報を用い、当業者はＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化する
ことができる（例えば、実施例３、８、１１、１５および１８）。当業者に周知である標
準的な技術を用い、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶまたはＧｎＴＶを
コードする（またはその触媒的に活性なフラグメントをコードする）核酸分子を、本明細
書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択された宿主細胞（例えば、
Ｐｉｃｈｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種のよう
な真菌宿主）において転写を駆動することができる他の発現制御配列の転写制御下にある
適当な発現ベクターに挿入することができ、従って、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素の１以
上を、ヒト様複合型糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させる
ことができる（例えば、実施例８、２０、および２１）。

数個の個々のグリコシルトランスフェラーゼが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ
、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌
においてクローン化され、そして発現されているが、生物のグリコシル化パターンに対す
る「ヒト化」の所望の結果を証明しない（Ｙｏｓｈｉｄａら．（１９９９） Ｇｌｙｃｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ９（１）：５３−８； Ｋａｌｓｎｅｒら．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃ
ｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。そのようなグリコシルトランスフェラーゼ
の作用によって糖を許容するのに必要な炭水化物構造は十分な量で存在せず、それは複合
Ｎ−グリカン形成の欠如に最も寄与したようであると推測された。

本発明の好ましい方法は、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢または後期ゴルジ装置における、
ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩのような他のＧｎＴの機能的発現を提供し、そ
して（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現によって；後記の実施例を
参照）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証する。

（糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ装置に提供するための方法）
グリコシルトランスフェラーゼがゴルジにおいて満足して機能するためには、酵素は、
新成糖タンパク質に付加される糖部分の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖
の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例え
ば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトースなど）は、一般には、サイトゾルで
合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによって
コアオリゴ糖に結合される。

下等真核生物のような非ヒト宿主細胞においてこのプロセスを複製するためには、糖ヌ
クレオシド特異的トランスポーターがゴルジで発現されて、ヌクレオシド糖前駆体の適切
なレベルが確保されなければならない（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１
９８１） Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；Ｓｏｍｍｅｒｓ
およびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８
１１−８１７；ＰｅｒｅｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。ヌクレオチド糖は、例えば、宿
主微生物において糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外因性遺伝子を発現させ
ることによって、適切な区画に提供され得る。トランスポーター酵素の選択は、用いられ
る外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によって影響される。例えば、ＧｌｃＮＡ
ｃトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを必要とし得、フコシ
ルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコーストランスポーターを必要とし得、ガラクトシ
ルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを必要とし得、そして
シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを必要とし得る。

付加されたトランスポータータンパク質は、ヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ装
置へ運び、そこで、ヌクレオチド糖はグリコシルトランスフェラーゼによって反応して、
例えば、Ｎ−グリカンを伸長させ得る。この反応は、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレ
オシド一リン酸（例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＭＰ）を遊離する。ヌクレオシド一リ
ン酸は、アンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換におい
てゴルジから直接的に輸出することができる。しかしながら、ヌクレオシド二リン酸の蓄
積は、グリコシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する。この反応は、効率的な
グリコシル化のために重要なようであるので、ヌクレオチド二リン酸をコードする遺伝子
の発現されたコピーを提供するのがしばしば望ましい。（適切にはＵＤＰまたはＧＤＰに
特異的な）ジホスファターゼはジホスホヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リ
ン酸および無機リン酸塩を生じる。

典型的には哺乳動物起源である適当なトランスポーター酵素は後記する。そのような酵
素は、本発明の方法を用い、選択された宿主細胞に操作することができる。

別の例において、α２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６−シアリルト
ランスフェラーゼは、ガラクトース残基を、ヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおい
てシアル酸でキャップを施し、糖タンパク質の成熟形態に導く（図１Ｂ）。このプロセシ
ング工程を、代謝的に操作された酵母または真菌へ再度操作することは、酵母の後期ゴル
ジにおいて、（１）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性またはα２，６−シアリ
ルトランスフェラーゼ活性および（２）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給
を必要とする。後期ゴルジにおいて十分なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を
得るためには、例えば、（例えば、ヒト由来の）公知のシアリルトランスフェラーゼの触
媒ドメインは、真菌における後期ゴルジに向けられなければならない（上記参照）。同様
に、トランスポーターは、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可
能とするように操作されなければならない。現在、真菌が十分量のＣＭＰ−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸を合成し、またはそれをゴルジに輸送さえできることを示すものはない。そ
の結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確保するた
めには、真菌へのＣＭＰ−シアル酸の生産を代謝的に操作しなければならない。

（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）
発現Ｓ配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性サーチを介して認識された
、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡがクローン化され
ている（Ｉｓｈｉｄａ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上
記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）由来のｃＤＮＡでの表現型修正によ
ってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。結果は、哺乳動物ゴルジＵＤＰ
−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子が、タンパク質が発現されて酵母のゴルジ装置へ
機能的に標的化されるために必要な情報の全てを有すること、および非常に異なるアミノ
酸配列を持つ２つのタンパク質が、同一ゴルジ膜内の同一溶質を輸送し得ることを示す（
Ｇｕｉｌｌｅｎら．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５
（１４）：７８８８−７８９２）。

従って、例えば、（１）それによって形質転換された構築物が細胞中に維持される領域
（例えば、複製起点、または染色体組込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３またはＴ−
ｕｒｆｌ３（Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍら．（２００１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１
（２）：３０６−１０）または他のよく特徴付けられた選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４
、ｂｌａ、Ｓｈ ｂｌｅなど）のような逆選択マーカーおよびリサイクル可能マーカーを
含めた、形質転換されている細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子、（３）機能的ＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする遺伝子またはそのフラグメント（例えば
、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来（Ａｂｅｉｊｏｎ， （１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）、またはＨ．ｓａｐｉｅｌｓ由
来（Ｉｓｈｉｄａ ら．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０（６）
：１０７８−８））、および（４）上記した局在化／触媒ドメイン融合構築物ライブラリ
ーの発現を活性化するプロモーターを含み得る核酸構築物によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃトランスポーターの発現を宿主細胞に取込むことができる。

（ＧＤＰ−フコース）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉおよび
Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９
６−３５６００）によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていな
いが、Ｎ末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計で用い
ることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、ＧＤＰ−フコー
ストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。

（ＵＤＰ−ガラクトース）
２つの異種遺伝子、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のα１
，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，２ ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２
（＋）、およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターをコード
する（ｈＵＧＴ２）は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化とＵＤＰ
−ガラクトース輸送活性との間の相関は、α１，２ＧａｌＴよりはむしろＵＤＰ−Ｇａｌ
トランスポーターの外因的供給がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける十分なガラクトシル
化についての鍵となる役割を演じたことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ（１９９９）Ｇｌｙｃ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（２）：１３３−１４１）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＵＤＰ
−ガラクトーストランスポーターが、クローニングされた（Ｓｅｇａｗａ（１９９９）Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５１（３）：２９５−２９８）。

（ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸））
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）はクローン化され、Ｌｅｃ８ Ｃ
ＨＯ細胞で発現されている（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．（Ｔｏｋｙｏ）１２６（５）：９４０−５０； Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（１
９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−９２）。マウスＣＭＰ−
シアル酸トランスポーターの機能的発現はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅで達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−９）。シアル酸はいくつかの真菌で見出されて
いるが、選択された宿主系が十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給できるかは明らかで
ない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに
供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。

（ジホスファターゼの発現）
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖
ヌクレオチド前駆体から遊離される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレ
オシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホヌ
クレオシド（例えば、ＧＤＰ）はホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断
されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければ
ならない。この反応は十分なグリコシル化のために重要であるようである。というのは、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＧＤＰａｓｅはマンノシル化で重要であることが判
明しているからである。しかしながら、この酵素はＵＤＰに向けての活性の１０％を有す
るに過ぎない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵ
ＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タ
ンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）
細胞壁多糖に加える酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、こ
れは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ
ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。Ｕ
ＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られており、このグ
リコシル化副産物の除去は、ゴルジの腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨
げるのに重要である（Ｋｈａｒａｔａら、（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４
４：５３７−５６０）。

（核酸分子からの標的化酵素活性を発現させることにより宿主においてＮ−グリカンを
改変するための方法）
本発明は、さらに、非ヒト宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産するための方法
を提供し、この方法は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２炭水化物構造の生産のための酵素または
複数酵素をコードする１以上の核酸分子を、この細胞に導入する工程を包含する。１つの
好ましい実施形態において、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２またはＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２から
のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の生産に関与する１以上のマンノシダーゼ活性をコードする核
酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、１以上のグリコシル化酵素または活性をコ
ードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タン
パク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェ
ラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラー
ゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、Ｕ
ＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シ
アル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択され
る。特に好ましい実施形態において、宿主は、１つの活性の産物が別の活性、例えば、グ
リコシルトランスフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、ＧｎＴＩおよ
びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性の基質レベルを増加させる２以上の酵素活
性を発現するように選択されるか、または操作される。別の好ましい実施形態において、
宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例
えば、ＵＤＰ特異的またはＧＤＰ特異的なジホスファターゼ活性を発現するように選択さ
れるかまたは操作される。

本発明の好ましい方法は、宿主細胞において核酸分子からの１以上の酵素活性を発現さ
せることを含み、酵素の触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチド、例えば、通常
は触媒ドメインに連結またはそれに会合していない異種シグナルペプチドを含む融合タン
パク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞下位置（例えば
、オルガネラ）へ標的化する工程を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル
化酵素）、またはその触媒的に活性なフラグメントをコードする核酸フラグメントへ同一
翻訳リーディングフレームにて（「インフレーム」）連結された細胞標的化シグナルペプ
チドをコードする核酸フラグメントを含む少なくとも１つの遺伝子構築物（「融合構築物
」）によってコードされる。

融合構築物またはタンパク質の標的化シグナルペプチド成分は、好ましくは、ＥＲまた
はゴルジの膜結合タンパク質、検索シグナル、タイプＩＩ膜タンパク質、タイプＩタンパ
ク質、膜スパニングヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトラン
スフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシル
トランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来する。

融合構築物またはタンパク質の触媒ドメイン成分は、好ましくは、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩ
Ｉ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフ
ェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来するグリコシダ
ーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性に由来する。触媒ドメイ
ンは、好ましくは、酵素が局在化されたオルガネラにおける他の代表的な酵素の平均ｐＨ
最適値の１．４ｐＨユニット内にｐＨ最適値を有するか、あるいは５．１と８．０との間
のｐＨにおいて最適活性を有する。好ましい実施形態において、触媒ドメインはＣ．ｅｌ
ｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａ
ｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃ
ｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩ
Ｂ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩ
Ｂ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシ
ダーゼＩＩＩよりなる群から選択されるマンノシダーゼをコードする。

（グリコシル化酵素の選択：ｐＨ最適値および細胞下位置）
本発明の１つの実施形態において、ヒト様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において
他の酵素のｐＨ最適値と同様なｐＨ最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を
細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的に
作製される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性は
ほとんどの酵素は、約６．５と７．５との間にあるｐＨ最適値を有する（表３参照）。タ
ンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ＥＲおよびゴ
ルジの内部ｐＨもまた約６〜８の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換えマ
ンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、ｐＨ
５．０程度のｐＨ最適値を有する酵素を導入している（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．
（１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７、
およびＣｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）
：２６２９８−２６３０４）。ｐＨ７．０において、それらのマンノシダーゼのインビト
ロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、Ｎ−グリカン上でのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の
効果的なインビボ生産のための、ＥＲおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるよう
な１０％未満まで低下される。

従って、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒
ドメイン）、例えば、α−マンノシダーゼを宿主細胞における細胞下位置（例えば、オル
ガネラ）へ標的化し、そこで、酵素またはドメインのｐＨ最適値は、同一オルガネラに局
在化された他の代表的なマーカー酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にある。
特定のオルガネラへ標的化されるべき酵素のｐＨ最適値は、同一オルガネラで見出された
他の酵素のｐＨ最適値とマッチングさせて、得られた単位酵素当たりの活性を最大化すべ
きである。表３は、種々の源からのマンノシダーゼの活性およびそれらの各ｐＨ最適値を
まとめる。表４は、それらの典型的な細胞下位置をまとめる。

（表３．マンノシダーゼおよびそれらのｐＨ最適値）

好ましい実施形態において、特定の酵素または触媒ドメインは、通常は酵素ドメインに
会合していない細胞標的化シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構
築物によって、宿主細胞中の細胞下位置に標的化される。好ましくは、酵素またはドメイ
ンは宿主細胞のＥＲ、初期ゴルジ、メディアルゴルジもしくは後期ゴルジ、またはトラン
スゴルジ装置に標的化される。

より好ましい実施形態において、標的化グリコシル化酵素はマンノシダーゼ、グリコシ
ルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、マ
ンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこで、グリコシル化の初期
反応が起こる。この方法は非ヒト宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産するのに有
用であるが、この方法は、ヒト宿主細胞を含めたいずれかの真核生物宿主細胞において糖
タンパク質の炭水化物プロフィールを修飾するのにより一般的には有用でもあることを認
識されるであろう。

宿主細胞分泌経路のある種のオルガネラにおいてタンパク質の滞留を媒介する標的化配
列は周知であり、標的化配列および標的化された酵素の選択用のライブラリーに関して後
により詳細に議論するように、科学文献および公のデータベースに記載されている。その
ような細胞下標的化配列は、単独、または組合せて用いて、選択されたグリコシル化酵素
（またはその触媒ドメイン）を宿主細胞における特定の細胞下位置（すなわち、特に酵素
がｐＨ最適値または他の同様な因子の存在に基づいて増強されたまたは最適な活性を有す
る細胞下位置）に標的化することができる。

高マンノース構造をトリミングして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような宿主細胞のＥ
Ｒまたはゴルジ装置においてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生じさせようと試みる場合、例え
ば、（１）十分に近いｐＨ最適値（すなわち、ｐＨ５．２とｐＨ７．８との間）を有し、
そして（２）単独で、または協働して、ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃの引き続いての付加
を許容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を作り出すことが知られ
ている、任意の酵素または酵素の組合せを選択することができる。インビトロにてＧｎＴ
ＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に変換することができる構造を作り出す
ことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せは、適当な選択を構成する。この
知識は、科学文献から、あるいは実験的に得ることができる。例えば、潜在的マンノシダ
ーゼがＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２−２ＡＢ（２−アミノベンズアミド）をＭａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２−ＡＢに変換することができるかを判断することができ、次いで、得られたＭａｎ
_５ＧｌｃＮＡｃ_２−２ＡＢ構造がＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する基質とし
て働いて、インビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を与えることができること
を証明することができる。ヒトまたはマウス源からのマンノシダーゼＩＡは、例えば、適
切な選択であろう（例えば、実施例４参照）。本明細書中に記載した例は、２−アミノベ
ンズアミド標識Ｎ結合オリゴマンノースを利用し、その後、この判断を行うためにＨＰＬ
Ｃ分析を利用する。

（表４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種々のグリコシル化関連酵素の細胞位置およびｐ
Ｈ最適値）

従って、本発明に従って用いられるα−１，２−マンノシダーゼ酵素のようなグリコシ
ル化酵素は、５．１と８．０との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。好ましい実施形
態において、この酵素は５．５と７．５との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ酵素は、例えば、本発明の方法でよく働き、約５．５の見
掛けのｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼとしては適当なｐＨ最適値を有する
表３に列挙したもの、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐ
ｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、
マウスＩＢ（ゴルジ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓが挙げられる。

α−１，２−マンノシダーゼ酵素についてのｐＨ最適値を示す実験を実施例７に記載す
る。培地に漏出するキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ３１）を種々のｐＨ範囲に
供して、酵素の最適活性を決定した。実験の結果は、α−１，２−マンノシダーゼはその
機能に対して約５．５の最適ｐＨを有することを示す（図１１）。

好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子は宿主生物におい
て発現される。しかしながら、いくつかの場合、数個の異なるマンノシダーゼ遺伝子、ま
たは１つの特定の遺伝子の数個のコピーを発現させて、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の適切な
生産を達成するのが望ましいであろう。複数遺伝子を用いる場合、コードされたマンノシ
ダーゼは、好ましくは、全て、約５．１〜約８．０、または特に約５．５と約７．５との
間の好ましい範囲内にｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼ活性はマウス、ヒト
、Ｌｅｐｉｂｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃ
ｉｌｌｕｓ種、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎ
ｕｍ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓまたはＡ．ｎｉｂｕｌａｎｓに由来するα−１，２−マンノシダ
ーゼを含む。

（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる宿主細胞グリコシル化のインビボ改変
）
本発明のある種の方法は、好ましくは（必ずしも必要ではないが）、１以上の核酸ライ
ブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は
、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク
質（例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素また
はその触媒ドメイン）をコードする配列を含むことである。

１つの実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）異なる細胞標
的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列；および（ｂ）標的化すべ
きポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。別の実施形態において、
コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする
少なくとも１つの核酸配列、および（ｂ）宿主細胞へ標的化すべきポリペプチドをコード
する少なくとも２つの核酸配列を含む。後にさらに記載するように、（ａ）に由来する核
酸配列、および（ｂ）に由来する核酸配列を連結させて、目的のポリペプチドドメインに
機能的に連結した細胞標的化シグナルペプチドをコードする１以上の融合構築物を生じさ
せる。機能的結合の１つの例は、細胞標的化シグナルペプチドが同一翻訳リーディングフ
レームにて（「インフレーム」）目的のポリペプチドドメインに連結される場合である。

好ましい実施形態において、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメイ
ンにインフレーム連結した細胞標的化シグナルペプチドを含む１以上の融合タンパク質を
発現させる。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンの哺乳類様修飾
またはヒト様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい実施形態において
、触媒ドメインは、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および１以上の標
的化シグナルペプチドにインフレームに連結した他のグリコシダーゼよりなる群から選択
される酵素に由来する。酵素ドメインは、宿主細胞に対して外因性および／または内因性
であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジへの輸送を受けるタンパ
ク質に通常は会合したものである。

本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、哺乳類様Ｎ−グリカン修飾またはヒ
ト様Ｎ−グリカン修飾に関与する酵素をインビボで生産し、局在化するのに用い得る。コ
ンビナトリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が、それが目的の
糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを生産することに関与する宿主細胞のＥＲ、ゴルジ
またはトランス−ゴルジネットワークに局在化されるように操作される。本発明のＮ−グ
リカン修飾酵素の局在化は、付着機構（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を介
して、またはタンパク質−タンパク質相互作用を介して達成され、ここに、コンビナトリ
アルＤＮＡライブラリーから構築した局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴ
ルジネットワークのような分泌経路の所望の細胞小器官に局在化される。

十分に、かつヒト様（複合）グリコシル化反応によってさらなる修飾用の十分な量が生
産される有用なＮ−グリカンの例は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２である。十分な量のＭａｎ
_５ＧｌｃＮＡｃ_２が、インビボでのさらなるヒト様プロセシングのために目的の糖タンパ
ク質に必要とされる（例えば、３０モル％より多く）。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２中間体は
、さらなるＮ−グリカン修飾用の基質として用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２を生産し得る（図１Ｂ；上記参照）。従って、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブ
ラリーを用いて、引き続いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、または他の所望の
複合Ｎ−グリカンを有用な量で生産する酵素を生産し得る。

本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて生産された融合構築物のさらな
る局面は、それらが、操作された宿主細胞において十分かつしばしば完全に近い細胞内Ｎ
−グリカントリミング活性を可能とすることである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡラ
イブラリーによって生産された好ましい融合構築物は、グリコシル化酵素（例えば、マン
ノシダーゼ）をコードし、これは、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在化され、それによ
り、細胞外活性をほとんど、好ましくは全く呈しない。マンノシダーゼ酵素をコードする
本発明の好ましい融合構築物は、Ｎ−グリカンが修飾される場所（すなわち、ＥＲおよび
ゴルジ）に局在化されることが示されている。本発明の融合酵素は分泌経路中のそのよう
な特定の細胞小器官に標的化され、そこでは、それらは局在化され、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡ
ｃ_２のようなＮ−グリカンに作用して、目的の糖タンパク質上でＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
を生産する。

二分されたグリカンを産生するようにコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから作製さ
れたＧｎＴＩＩＩ融合構築物を、任意の細胞外活性を決定するためにアッセイした。宿主
細胞のグリコシル化のインビボでの変化を示すＧｎＴＩＩＩ融合構築物の例は、ｐＶＡ５
３と称される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１を融合構築物ｐＶＡ５３で形質転換し
た後に、任意のエキソビボＧｎＴＩＩＩ活性を検出するために、その上清を試験した。図
３３は、培地中で細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を明らかにする条件下で、標準的な基質Ｇｌｃ
ＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の明白な変化を示さない（実施例２２）。同様に、図３４
は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７中での、基質ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２と反応する検出可能な細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を示さない（実施例２３）。

本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生産された酵素は、各々、図５
、６および２５〜３４に示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたＫ３また
はＩＦＮ−βタンパク質について示されたように、目的の糖タンパク質上でＮ−グリカン
を修飾することができる（また、実施例２、４および１８〜２３参照）。しかしながら、
限定されるものではないが、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωのようなサイトカイン、および顆
粒球−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子のような凝固因子、およびヒトプロテインＣ
、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキ
ン、ウロキナーゼ、セイメース、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパ
ク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオス
タチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテゲリン、α−１抗
トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネル
セプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子および
カルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ
））、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）
ＩＬ−１レセプターアゴニストを伴うか伴わないＧＬＰ−１、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、
ａｋａ可溶性ＴＮＦレセプターＦｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロ
シダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めた他
のタイプの糖タンパク質も、このようにしてグリコシル化され得るのが認識される。

（融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築）
融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、一般に、（例えば、Ｃ末端欠失
を作製することによって）天然タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１以上の細胞標的
シグナルペプチド（「標的化ペプチド」）を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的
化ペプチドは、天然タンパク質（例えば、ＳＥＣ１２）のＣ末端に由来する。ＥＲまたは
ゴルジの膜結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用
いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通
ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これらの領域
はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび／または他の局在化されたタンパク質
との比較（例えば、疎水性プロットの比較）によって認識可能である。

標的化ペプチドはここではタイプＩＩ膜の一部に対して短い（ｓ）、中程度（ｍ）およ
び長い（ｌ）として示される。短い（ｓ）と示された標的化ペプチド配列は膜−結合タン
パク質の膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と示された標的化ペプチド配
列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中程度（ｍ
）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ
）の長さのほぼ半分に対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル
化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。

（サブライブラリー）
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝
子または野生型遺伝子から直接構築することができる。好ましい実施形態において、上記
ＤＮＡライブラリーは、２以上のサブライブラリーの融合から構築される。サブライブラ
リーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン（例えば、グ
リコシル化活性を有するもの）をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製する
ことが、可能である。

（グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー）
１つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、グリ
コシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよ
びシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメイ
ンは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選
択され得る。哺乳類酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は
、全て有用であり、これは、最適温度および最適ｐＨに関して広いスペクトルの生化学特
性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そ
のいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードするフラグメントを得る。内因性標的化配
列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座
で発現させ得る。

そのような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが引き続いて活性であるべき特定
の環境についての知識によって誘導され得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴ
ルジにおいて活性であり、かつ後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定の
ｐＨ最適値を有するか、あるいは後期ゴルジが特定のｐＨを有することが公知である場合
、上記したように、そのｐＨにおいて十分な（好ましくは最大の）活性を示す触媒ドメイ
ンを、選択する。

（標的化ペプチド配列サブライブラリー）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内
の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、
核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他
の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、
３つのカテゴリー：（１）一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜（腔膜）に
係留させる、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域
（ｓｒ）の一部またはステム領域の全てをコードする、Ｎ末端配列；（２）ＨＤＥＬテト
ラペプチド（配列番号４１）またはＫＤＥＬテトラペプチド（配列番号４２）のようなＣ
末端で一般に見出される検索シグナル；および（３）ゴルジ中に局在化することが知られ
ている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通領域
；に分類される。

最初の場合において、標的化ペプチドが種々のエレメント（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）
からなる場合、上記ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が提示
されるように設計される。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実
施形態は、ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列および／
またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合、種々の長さのｓｒ配列を持つサブライブラリー
を提供することが、望ましいものであり得る。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮ
Ａの５’末端に結合するプライマーを用い、かつステム領域の種々の部分に結合する一連
の対向プライマーを使用するＰＣＲによって、達成され得る。

標的化ペプチド配列のさらに他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向
輸送されるタンパク質のＣ末端において代表的には見出される、検索シグナルペプチド（
例えば、テトラペプチドＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ）が挙げられる。標的化ペプチド配列の
さらに他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（
ｃ）ゴルジに局在化される膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、および（ｄ）表５に
おいて言及される配列、が挙げられる。

（表５．有用な区画標的化配列の供給源）

いずれの場合においても、特定の酵素活性に適する標的化ペプチド配列を選択して、所
望のグリコシル化反応の系列内で最適に機能することが、非常に好ましい。例えば、新生
Ｎ−グリカンの末端シアリル化（ヒトにおいて後期ゴルジで起こるプロセス）が可能な改
変された宿主微生物を開発するにおいて、後期ゴルジタンパク質に由来する標的化ペプチ
ド配列のサブライブラリーを利用することが、望ましい。同様に、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２を与えるようにα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のトリミン
グすることは、ヒトにおける複合Ｎ−グリカン形成における初期工程である（図１Ｂ）。
従って、この反応を、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが
、望ましい。ＥＲ滞留シグナルおよび初期ゴルジ滞留シグナルをコードするサブライブラ
リーが、使用される。

次いで、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリ
ー）が、１つまたは一連の標的化ペプチド配列を、触媒ドメインをコードする１つまたは
一連の配列に機能的に連結させることによって構築する。好ましい実施形態において、こ
れは、標的化ペプチド配列（上記）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーを、グリ
コシル化酵素または触媒的に活性なそのフラグメント（後記参照）をコードするＤＮＡを
含むサブライブラリーへとイン−フレーム連結することよって、達成される。

得られたライブラリーは、標的化ペプチド配列を含有する融合タンパク質をコードする
合成遺伝子を含む。いくつかの場合、融合タンパク質のＮ末端に、あるいは他の場合には
Ｃ末端に、標的化ペプチド配列を提供することが、望ましい。いくつかの場合、標的化ペ
プチド配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り
畳まれたドメインのタンパク質構造は、破壊されないものとする。融合タンパク質の各タ
イプは、（段階的指向性様式または半ランダム様式にて）構築され、最適な構築物は、本
発明の方法を用いて、宿主細胞の形質転換、および形質転換された細胞におけるグリコシ
ル化パターンの特徴付けに基づいて、選択され得る。

（コンビナトリアルライブラリーからの融合構築物を用いる宿主細胞グリコシル化の改
変）
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築が、図２に模式的に示され、実施
例４に記載される。その融合構築物は、多数のベクター（例えば、当該分野で周知の発現
ベクター）に作動可能に連結され得る。種々のそのような融合構築物が、表６に示したよ
うな代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド／触媒ドメインの組合せは、本
発明に従って、ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノ
シダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるた
めに組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドの
タイプに応じ、Ｎ−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さな
いものであり得る（例えば、表７、実施例４）。

（マンノシダーゼ融合構築物）
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の
代表的な例は、ｐＦＢ８であり、これは、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ ＡＮ ６６７８７８７）の１８７Ｎ末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結し
た短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰ
ｒｏｔ Ｐ１１６５５からのＳＥＣ１２の９８８〜１２９６ヌクレオチド）を有する。従
って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン
領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ
１８７と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を
保持しつつ、ＳＥＣ１２標的化ペプチド配列によってＥＲに局在化し、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である（実施例４；図６Ｆおよび
７Ｂ）。

融合構築物ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシ
ダーゼＩＢΔ９９）は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の
例である（実施例４；図５Ｄおよび８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）は、
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である効率的な
融合構築物のさらに別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物およ
び他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作
製することによって、当業者は、最適細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低
い活性を持つかまたは活性を全く持たない構築物から区別し、そしてそれを選択し得る。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノ
シダーゼ融合構築物のみが、特に望ましいＮ−グリカンをインビボで生成し得るので、有
利である。

さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的で
あり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同
等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じさせ得るというわ
けではないことが、さらに理解されるべきである。従って、目的のタンパク質は、コンビ
ナトリアルＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた宿主細胞に導入されて、目的の
タンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され
得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプロー
チを用い、最適な融合構築物を生じさせて選択することが可能であり得る。

さらに、局在化された活性なマンノシダーゼ触媒ドメイン（またはより一般的には、任
意の酵素のドメイン）を示す他のそのような融合構築物は、実施例４に例示される技術お
よび本明細書中に記載された技術のような技術を用いて、生成され得ることが、明らかで
ある。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成しそれを用いて、例えば、特
定の宿主細胞中に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリーから
のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。

（グリコシルトランスフェラーゼ融合構築物）
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、本発
明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性に由来
する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てら
れ、マーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカン構造
の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成についてスクリーニングされた。ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎ
ＴＩ Δ３８）を生じることが示された融合構築物（ｐＰＢ１０４）、が同定された（実
施例８）。多種多様なそのようなＧｎＴＩ融合構築物を構築した（実施例８、表１０）。
標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブ
ラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラー
ゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例８に示すように生成され得ることが、
当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラ
リー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物
を用い、ＧｌｎＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２生成を最適化することは、当業者にとって
慣用的実験である。

マンノシダーゼ融合構築物について上で述べたように、全ての標的化ペプチド／ＧｎＴ
Ｉ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、本明細書中に記載するように目的の糖
タンパク質上で適切なグリコシル化を生じるというわけではない。しかしながら、当業者
は、本明細書中に記載したＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生
成してそれを選択することが可能である。実施例８は、標的化ペプチドと、優勢なＧｌｃ
ＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を持つ糖タンパク質の生成に関与するＧｎＴＩ触媒ド
メイン融合構築物とを含む、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態を
示す。

（宿主細胞グリコシル化を改変するための多重融合構築物の使用）
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例に
おいて、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現するＯＣＨ１欠失を持つＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質
転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに変換した（実施例８）。ま
ず、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ
）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）を、１，６開始マンノシルトランスフェラーゼ
活性を欠くＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（すなわち、ｏｃｈ１欠失；実施例１）に形質転換し
た。第二に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ
ＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構
築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のさらなる生成を増加させた。ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、図１０Ｂに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株
においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の生成を有意に増加させた。第３に、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を
、この株に導入した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を「ＰＢＰ−３」という（図３６参照
）。

上記した酵母株のような宿主細胞は、１以上の発現ベクターで順次に形質転換および／
または共形質転換され得ることが、当業者によって理解される。また、形質転換の順番は
、目的の糖タンパク質を生成するのに特には関係しないことも、理解される。当業者は、
本明細書中に開示された手法の慣用的改変は、目的の糖タンパク質の生成において改良さ
れた結果を提供し得ることを認識する。

特定の触媒ドメイン配列を持つ特定の標的化ペプチド配列を用いることの重要性は、本
明細書中に記載された実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリ
ーは、ヒト様糖タンパク質を生成するのに特に有用な、目的の糖タンパク質上でのＮ−グ
リカンの改変に関与する酵素融合物を構築するためのツールを提供する。（しかしながら
、本発明のライブラリーおよび方法を用い、任意の酵素融合物が、選択され得る）。適切
に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５
Ｄおよび５Ｅに示されたように、構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを持つＫ３
を生じる。これは、図５ＣにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されたよう
に、親ＯＣＨ１欠失株のＫ３と比較して、切断されたグリカンに減少した分子質量を与え
る。

同様に、同じアプローチを用いて、別の分泌型糖タンパク質（Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
を優勢に含むＩＦＮ−β）を生成した。このＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＰＮＧａｓｅ消
化によって除去し（Ｐａｐａｃら．，１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５
−４５４）によって除去し、図６Ａ〜６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１
２５４（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークは、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）および図６Ｆ（ｐ
ＦＢ８）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ
Δ１８７）において、ＩＦＮ−β上でのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の生成を確認する。さ
らに、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダー
ゼＩＡ Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒ
トＧｎＴＩ Δ３８）およびｐＰＢ１０３（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子）を
含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ−３において、ハイブリッドＮ−グリカンＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）
。

高度なマンノーストリミングで形質転換体を同定した後、さらなる実験を行って、マン
ノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで起こり、これは、優勢には、増殖培地中での
細胞外活性の結果ではないことを確認した（実施例６；図７〜９）。

本発明をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主
の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト
様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主
細胞グリコシル化遺伝子（例えば、ＯＣＨ１）の同定および破壊のための本明細書中に記
載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよ
び／または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが
、理解される。実施例９に記載されたように、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１遺伝子が、Ｋ．ｌａｃ
ｔｉｓから欠失されて、１，２−マンノシダーゼによってＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２へと完
全に変換されるＮ−グリカンに導く宿主細胞を操作した（図１２Ｃ）。

ＭＮＮ１遺伝子を、実施例９に記載されたようにＫ．ｌａｃｔｉｓからクローン化した
。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、配列
番号４３および配列番号４４に示される。遺伝子特異的プライマーを用い、Ｋ．ｌａｃｔ
ｉｓのゲノムからＭＮＮ１遺伝子を欠失するように、構築物を操作した（実施例９）。ｏ
ｃｈ１活性およびｍｎｎ１活性を除去した宿主細胞は、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２糖質構造
を有するＮ−グリカンを生じる（例えば、図１２Ｂ参照）。そのような宿主細胞は、例え
ば、本発明の方法およびライブラリーを用いてさらに操作して、哺乳動物様糖タンパク質
またはヒト様糖タンパク質を生成され得る。

従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子（配列
番号４３）の少なくとも４５ヌクレオチド残基、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド
残基、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド残基、最も好ましくは７５のヌクレオ
チド残基以上を含む核酸配列を有する単離された核酸分子、またはそれらのヌクレオチド
残基からなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそれらのホモログ、改変体お
よび誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子
にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードさ
れた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体およびアナ
ログを含む）が提供される。加えて、さらに本明細書中で記載するような、本発明の核酸
分子を含むベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子ま
たはベクターで形質転換された宿主細胞が、提供される。

従って、本発明の別の局面は、ヒト細胞によって生成されるものと似ている改変された
Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する、非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、
酵母細胞および真菌細胞以外の種における本発明の方法の実行が、企図され、これは本発
明に含まれる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを用いて、任意の真核生物宿
主細胞系におけるグリコシル化経路を改変する構築物を選択し得ることが、企図される。
例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、植物、藻類および昆虫、ならびに他
の真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む）で用いて、宿主細胞分泌経路
に沿った望む位置において、タンパク質（グリコシル化酵素またはその触媒ドメインを含
む）を局在化し得る。好ましくは、グリコシル化酵素または触媒ドメインなどは、宿主細
胞分泌経路に沿って亜細胞位置に標的化され、その場所で、それらの酵素は、機能可能で
あり、好ましくは、それらが最も効率的に機能するように設計または選択される。

植物および昆虫細胞を、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用い、発
現されたタンパク質のグリコシル化を改変するように作製し得る。さらに、ヒト細胞を含
めた哺乳動物細胞におけるグリコシル化はまた、本発明のコンビナトリアルライブラリー
および方法を用いて修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよ
び方法を用いて、特定の酵素活性を最適化するか、あるいは哺乳動物宿主細胞において作
製された種々のＮ−グリカンの相対的割合を修飾することが可能であり得る。

本発明のこの実施形態に従った方法を用いて作用され得るグリコシル化に対する修飾の
例は：（１）Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２からのマンノース残基をトリミングして、Ｍａｎ_５
ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを生じるように真核生物宿主細胞を操作する工程；（２）Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）残基をＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に付加するように真核生物宿主細胞を操作する工程；
（３）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴ
ＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランス
フェラーゼ（ＦＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）またはシアリルトラ
ンスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核生物宿主細胞を操作
する工程である。

この方法を反復することによって、徐々に複雑なグリコシル化経路を、下等真核生物微
生物のような標的宿主に操作し得る。１つの好ましい実施形態において、宿主微生物は、
グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで２回以上形質転換する。
所望の表現型の選択は、各ラウンドの形質転換の後に、あるいは、数回の形質転換が生じ
た後に行われ得る。複合グリコシル化経路はこのようにして迅速に操作され得る。

（連続的グリコシル化反応）
好ましい例において、そのような標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、高等
真核生物において、グリコシル化反応の連続的性質についての既存の情報を組み込むよう
に設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、その
ような反応を触媒する酵素をゴルジまたはＥＲの初期部分に標的化する工程を必要とする
。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２への
トリミングは、複合Ｎ−グリカン形成における初期の工程である（図１Ｂおよび３５Ａ）
。タンパク質プロセシングはＥＲで開始され、次いで、初期ゴルジ、内側ゴルジおよび後
期ゴルジを通じて進行するので、この反応はＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが望
ましい。従ってマンノシダーゼＩ局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、
ＥＲおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインと対応させるよ
う試みられる。

（さらなる配列多様性の生成）
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー）
が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも１つの形質転換体が、望まれる表現
型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖
タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る（Ｒｏｍｅｒｏら（２０００））
。従って、形質転換に先立ち、ＤＮＡライブラリーまたは構成サブライブラリーが、１つ
以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、１回以上の遺伝子
シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じ
るための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得
る。

（発現制御配列）
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列（例えば、プロモ
ーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への
融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必
要であり得るような他の機能的配列）を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一
般には好ましい。

適切なベクター構成要素（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモータ
ー、エンハンサー、ターミネーターなど）および必要に応じて、宿主細胞における自律複
製に必要な配列が、どの特定の宿主細胞が選択されるかの関数として選択される。特定の
哺乳動物または下等真核生物宿主細胞で用いるための適切なベクター構成要素についての
選択基準は、慣用的である。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅ
ｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎ
ａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔ
ｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕ
ｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍ
ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄ
ｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａ
ｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。宿主がＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモー
ター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＰ４０プロモーターが挙げ
られる。

（選択マーカー）
少なくとも１つの選択マーカー（薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完す
るための遺伝子）を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は
、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、ＵＲＡ３遺
伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１８遺伝子、ＢＬＡ遺伝子、またはＳＨ
ＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細
胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物
宿主細胞で用いるために利用可能である。

（形質転換）
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、Ｄ
ＮＡ移入のための任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法
、またはスフェロプラスト法）が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞におい
て、従来の方法としては、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクト
ロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養（例え
ば、酵母における発酵）に適した安定な株を生成するために、上記ＤＮＡライブラリー構
築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは
、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、ＤＮＡライブラ
リーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして
、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規
定された部位で起こる。

特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体における望まれな
い遺伝子の部位中に組み込まれ、その遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣ
Ｈ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子またはＭＮＮ４遺伝子の部位への組込みは、糖タンパク質の
酵母超マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に関与する酵素の発現を
妨げつつ、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能とする。他の実施形態において、ライ
ブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは
レトロウイルスベクター）、染色体を介して宿主中に導入され得、自律核酸分子としてか
、または宿主ゲノム中への相同組み込みもしくはランダム組込みによって、導入され得る
。いずれの場合においても、一般には、安定に形質転換された宿主生物の容易な選択を可
能とするために、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を各ライブラリーＤＮＡ構築物と
ともに含ませることが、一般に望ましい。そのために、またはそれに抗して選択され得る
再生可能なマーカー遺伝子（例えば、ｕｒａ３）は、特に適切である。

（スクリーニングおよび選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示
す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出
方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および／または除去工程によって行われ得る
。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用い
て、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上
にタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。

例えば、細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞につき、または最高末
端ＧｌｃＮＡｃ含有量にてタンパク質を分泌する細胞につき、スクリーニングし得る。そ
のようなスクリーニングは、染色手順のような目に見える方法、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ
結合抗体またはマーカー結合体化レクチン（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）に結合する
能力、特異的レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の低下、インビトロで放射性
標識糖を取り込む能力、染料または荷電表面への改変された結合に基づいてスクリーニン
グされ得るか、あるいは発蛍光団標識レクチンまたは発蛍光団標識抗体と組み合せた蛍光
支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを用いることによって達成され得る（Ｇｕｉ
ｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）
：７８８８−７８９２）。

従って、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に細胞を暴露する
ことによって、インタクトな細胞が、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニング
され得る。広汎な種類のオリゴ糖特異的レクチンは、（例えば、ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから）市販されている。あるいは、特異的ヒトＮ−
グリカンに対する抗体または動物Ｎ−グリカンに対する抗体は、市販されているか、ある
いは標準技術を用いて製造され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子（例
えば、発色団、発蛍光団、放射性同位体、または発色性基質を有する酵素）に結合体化さ
れ得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。

次いで、スクリーニングは、分析方法（例えば、分光測定法、蛍光比色法、蛍光活性化
細胞ソーティング、またはシンチレーションカウンティング）を用いて実施され得る。他
の場合には、形質転換された細胞からの単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分
析することが、必要であり得る。タンパク質単離は、当該分野で公知の技術によって行わ
れ得る。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が、培地に分泌され、アフィ
ニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーまたは
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアフィニティークロマトグラフィー）によって精
製される。単離されたＮ−グリカンが好ましい場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｄｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような酵素を用いて、糖タンパク質からＮ
−グリカンが切断され得る。次いで、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質
量分析法、または他の適切な手段によって、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンが
、分析され得る。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖質構造を持つ細胞
を同定し得るいくつかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ質量分析法を用いて、切断されたＮ−グリカンが分析される。

所望の形質転換体の選択に先立ち、望まない表現型を有する細胞の形質転換された集団
を除去することが、望ましいものであり得る。例えば、その方法を用いて機能的マンノシ
ダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞糖タンパク質において、
より低レベルのマンノースを有する。培地中のマンノースの致死的放射性同位体への形質
転換された集団の暴露は、望まない表現型（すなわち、高レベルの取り込まれたマンノー
ス）を有する形質転換体の集団を除去する（ＨｕｆｆａｋｅｒおよびＲｏｂｂｉｎｓ（１
９８３）ＰＷ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８０（２４）：７４
６６−７０）。あるいは、細胞傷害性レクチンまたは望ましくないＮ−グリカンに対する
抗体を用いて、望まない表現型の形質転換集団を除去し得る（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙお
よびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ（１９７７），Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ３
（４）：３９１−４０５）。米国特許第５，５９５，９００号は、望まれる細胞外糖質構
造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。この戦略を反復して行うと、下等
真核生物において、より多くの複合グリカンの連続操作が可能となる。

高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２をその表
面に有する宿主細胞を検出するためには、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効
果的な転移を可能とする形質転換体につき選択し得る。このスクリーニングは、寒天プレ
ート上での選択圧下で形質転換されたライブラリーを保有する細胞を増殖させること、個
々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって、実施され得る
。細胞を増殖させた後、細胞は遠心分離され、細胞は、緩衝液中に再懸濁され、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩの添加の後、ＵＤＰの遊離が、ＨＰＬＣまたはＵＤＰにつ
いての酵素連結アッセイによって、測定される。あるいは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
ＡｃおよびＧｎＴＩＩを用い得、細胞を洗浄し得、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼによって放射性ＧｌｃＮＡｃの遊離を探索し得る。これはすべて、手動により行って
も、あるいは高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化されてもよい。第
一のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを遊離する形質転換体、または第二のアッセイに
おいてより多くの放射性標識ＧｌｃＮＡｃを遊離する形質転換体は、その表面により高い
程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を有し、従って、所望の表現型を構成すると
予測される。同様なアッセイもまた、同様に、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを見るよ
うに適合され得る。

あるいは、形質転換細胞の表面上の改変されたグリコシル化パターンを明らかにし得る
他の適切な任意のスクリーニング（例えば、レクチン結合アッセイ）を用い得る。この場
合、末端マンノースに対して特異的なレクチンの結合減少は、適切な選択ツールであり得
る。Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的
に結合し、これは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジに存在する場合には低下する
ことが、予測される。また、高い末端マンノース含有量を含む細胞の除去を可能とするク
ロマトグラフィー分離工程を行うことによって、所望の形質転換体を富化し得る。この分
離工程は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を
持つ細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎ
ｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行う
。

加えて、異なる下等真核生物宿主において活性な糖質改変酵素の局在化についてのさら
なる情報は科学文献にて入手可能となるので、そのような融合タンパク質構築物を直接作
製し得る。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由
来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、その触媒活性を保有し
つつゴルジ装置に局在化され得ることが、公知である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら．（１９
９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような知見を全体的戦略
に直接的に組み込んで、そのような宿主から複合Ｎ−グリカンを取得し得る。Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓにおけるいくつかのそのような遺伝子フラグメントが同定されており、これら
はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグリコシルトランスフェラーゼに関連する。従って
、これらは、その目的で使用され得る。

（組込み部位）
この遺伝子工学の試みの１つの最終的な目標は、産業的醗酵プロセスにおいて首尾よく
実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への複数遺
伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる
遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換
されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならない
であろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性（例えば、シアリルト
ランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲ
およびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体
についてのｓｙｎおよび交互輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与す
る他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような
活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）のいずれかの組合せを真菌タンパク
質発現宿主中に作製し得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような下等真核生物宿主
細胞においてグリコシル化を改変するための好ましい方法の例を表６に示す。
（表６．下等真核微生物におけるグリコシル化を改変するためのいくつかの好ましい実施
形態）

下等真核生物のような宿主細胞への複合Ｎ−グリカンの形成を操作するためのいずれか
の戦略は特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性の除去ならびに付加の両方を含むので
、包括的なスキームは、両方の要件を協調させる試みであろう。望ましくない酵素をコー
ドする遺伝子は、望ましい遺伝子についての潜在的組込み部位として働く。例えば、１，
６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの既知の下等真核生物におけるグリコシル
化の特徴である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ
１）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化され、この遺伝子における変異は低下し
たマンノシル化と共に生存可能な表現型を生じる。従って、α−１，６マンノシルトラン
スフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコード
する遺伝子の組込み用のプライミング標的である。同様に、その遺伝子座における遺伝子
破壊事象に基づいて、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改良し、
（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を改良し、（３）外来性タンパク質のタンパク質
分解を低減させ、そして（４）その精製または醗酵プロセス自体を容易にするプロセスの
他の特徴を改良することが期待されるある範囲の他の染色体組込み部位を選択し得る。

（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられ
る糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、
例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−６
−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャ
イエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数
種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様
に、グリカン側鎖への１以上のシアリン酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タ
ンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞（例えば、下等真核生物または哺乳動
物）は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアリン酸の程度を増加させるよ
うに遺伝的に操作され得る。あるいは、シアリン酸は、シアリン酸トランスフェラーゼお
よび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増
殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用
して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る（Ｗｅｉｋｅｒｔら、（
１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１１１６−１１２１；Ｗ
ｅｒｎｅｒら、（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（８）
：８７０−８８０；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。モノクローナル抗体への特異的グリカ
ン修飾（例えば、二分されたＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性細胞傷害性を改良する
ことが示されており（Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉｌ．１
７（２）：１７６−８０）、これは、抗体または他の治療タンパク質の生成に望ましくあ
り得る。

治療タンパク質は、代表的には、注射、経口、肺または他の手段によって投与される。
本発明に従って生成され得る適した標的糖タンパク質の例としては、エリスロポエチン、
サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ
、インターフェロンω）、および顆粒球−ＣＳＦ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、
第ＩＸ因子）、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ
フラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン類、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリ
プシンインヒビター、ＩＧＦ−結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、
アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害
因子１、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、α−１抗トリプシ
ン、ＤＮａｓｅＩＩ、αフェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、別
名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウム
モジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホ
ルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様プロテイ
ン１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦレセ
プターＦｃ融合物）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬ
Ａ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

（抗体機能性を高めるＧｎＴ−ＩＩＩの発現）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩおよびアセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造へのＮ−アセチ
ルグルコサミン残基の付加は、いわゆる二分型Ｎ−グリカンであるＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ
_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生じる（図１５）。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性（
ＡＤＣＣ）に関与していた（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１７（２）：１７６−８０）。哺乳類細胞により発現される免疫グロブリンのグリコ形態
の再操作は、単調として進まず、かつ煩わしい仕事である。特にＧｎＴＩＩＩの場合（こ
の酵素の過剰発現が増殖阻害に関与している場合）、調節された（誘導性の）遺伝子発現
を含む方法が、二分型Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを生成するために使用されな
ければならなかった（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．
６５（５）：５４２−９；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１
７（２）：１７６−８０；Ｕｍａｎａら ＷＯ０３／０１１８７８；米国特許第６，６０
２，６８４号）。

従って、別の実施形態において、本発明は、トリマンノースコア構造またはペンタマン
ノースコア構造上に二分型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するヒト様Ｎ
−グリカンを生成するためのシステムおよび方法を提供する。好ましい実施形態において
、本発明は、二分型Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを生成するためのシステムおよ
び方法を提供する。本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、以前の問題（例えば
、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現またはＡＤＣＣと関連した細胞傷害性）にあった欠点がない。
なぜなら、本発明の宿主細胞は、実質的に修飾されたヒト型グリコ形態（例えば、Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を有するＮ−グリカンを生成する生細胞（好ましくは
、強い細胞）であるように操作され、選択されるからである。従って、本発明の宿主細胞
における二分型Ｎ−アセチルグルコサミンの付加は、増殖表現型またはそれらの宿主細胞
の生存性に対してごくわずかな影響しか有さない。

さらに、他の研究者による研究によって、ＧｎＴＩＩＩ発現レベルとＡＤＣＣの程度と
の間に線形的な相関はないことが示された。Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０。従って、哺乳動物細胞における最適な
発現レベルを見いだし、ＦＤＡによって認可された発行プロセス全体を通してその最適な
レベルを維持することは、困難であると思われる。しかし、本発明の宿主細胞（例えば、
真菌細胞）において、強い、信頼性のあるかつ最適なＧｎＴＩＩＩ発現レベルを確立する
ための適切な強度のプロモーターを見いだすことは、当業者にとって比較的容易な作業で
ある。

Ｎ−グリカンを二分することにより糖タンパク質を生産し得る酵母株のような宿主細胞
は、本発明に従って、宿主細胞にＧｎＴＩＩＩ活性を誘導することによって操作される（
実施例１２）。好ましくは、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸（例えば、図２
４参照）、または酵素活性を有するそのドメインを用いて形質転換され、必要に応じて、
（例えば、本発明のライブラリーおよび関連する方法を使用して）異種細胞シグナル標的
化ペプチドに融合される。ＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、哺乳類
細胞が生じ得る抗体力価よりも高い抗体力価を生じる。それらの宿主細胞はまた、ＡＤＣ
Ｃに関してより高い効力を有する抗体を生産する。

ＧｎＴＩＩＩでトランスフェクトされた哺乳類細胞株によって生産された抗体は、トラ
ンスフェクトされていない細胞株によって生産された抗体と同じくらいに有効であること
が示されているが、１０〜２０分の１低い濃度においてである（Ｄａｖｉｓら、（２００
１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（４）：２８８−９４）。２０の因子に
よる哺乳類系を上回る本発明の生産ビヒクルの生産性の増加、および効力の１０倍増加は
、２００の正味の生産性の改善を生じる。従って、本発明は、高い効力（例えば、現在生
じ得る効力よりも強力な数オーダーの大きさまで）を有する抗体の高い力価を生じるため
のシステムおよび方法を提供する。そのシステムおよび方法は、安全であり、かつ短い期
間で強力な抗体を提供する。本発明に従ってＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿
主細胞は、少なくとも一日当たり５０ｍｇ／リットル〜５００ｍｇ／リットルの速度で、
二分されたＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを生産する。さらに、各免疫グロブリン
（Ｉｇ）分子（二分したＧｌｃＮＡｃを含む）は、二分したＧｌｃＮＡｃなしで生産され
た同じＩｇ分子よりも強力である。

（改善された糖タンパク質機能性のための複数のアンテナ構造の生成）
テトラアンテナ構造の合成は、種々のタンパク質（例えば、ＥＰＯおよびα_１−酸性糖
タンパク質）のインビボでの生物学的活性にとって重要であることが見出されている。Ｔ
ａｋｅｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９ Ｏｃｔ
；８６（２０）：７８１９〜２２；Ｂｏｒｉｓら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（１９９０
１４，３１５〜３２３。薬物動態研究によって、テトラアンテナ分岐の嵩高い構造は、Ｅ
ＰＯが尿中へろ過されるのを防ぐことが示された。タンパク質を、例えば、化学結合体（
例えば、ポリエチレングリコール）で改変すると、潜在的な治療糖タンパク質のクリアラ
ンスを遅らせることが考案された。従って、一実施形態において、本発明は、下等真核生
物（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において複数のアンテナ構造を含む糖タンパク質を合成する
ための方法を提供し、この糖タンパク質は、より良好なインビボの生物学的活性を有し、
そして減少したアンテナを有する同じ糖タンパク質よりも迅速には排泄されない。本質的
には、本発明の方法に従って生成される糖タンパク質（また、本明細書中に援用されるＷ
Ｏ０２／００８７９およびＷＯ０３／０５６９１４を参照のこと）は、治療効力を改善し
ている。

以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明する。これらの実施例は限定するも
のとして解釈されるべきではなく：実施例は説明の目的のみのために含まれる。

（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１遺伝子のクローニングおよび破壊）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号）
に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド

（配列番号３）および

（配列番号４）
を用いて、推定α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードするＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐ ＯＲＦを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ（
Ｘ−３３株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から増幅した。その後、
ＯＣＨ１遺伝子における内部オリゴヌクレオチド

（配列番号４７）、ならびにライブラリー担持プラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格における

（配列番号４８）オリゴヌクレオチドおよび

（配列番号４９）オリゴヌクレオチドを用いて、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの２６８５ｂｐ
上流および１１７５ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリー（Ｂｏ
ｅｈｍ，Ｔ．ら、Ｙｅａｓｔ １９９９ ５月；１５（７）：５６３−７２）から増幅し
た。得られた５０７５ｂｐフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。

ＨＩＳ４耐性遺伝子でＯＣＨ１リーディングフレームを置換した遺伝子ノックアウト構
築物を構築した後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換し、コロニーを３７℃における温度
感受性についてスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度
感受性であり、上昇した温度における成長が遅い。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ＯＣＨ１変異体に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを補完す
ることによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的ホモログを同定するこ
とができる。約２０の温度感受性株を、さらに、コロニーＰＣＲスクリーニングに供して
、欠失したｏｃｈ１遺伝子でコロニーを同定した。数個のｏｃｈ１欠失を得た。

ＰｉｃｈｉａＨＩＳ４遺伝子を保有するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂ上流配列
および１．５ｋｂ下流配列を有する直線化ｐＢＫ９．１を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＢＫ
１［ＡＯＸ１遺伝子座においてヒトＩＦＮ−β遺伝子を保有するＧＳ１１５（ｈｉｓ４
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］に形質転換して、野
生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトした。形質転換体の初期スクリーンニングは、ヒスチ
ジンドロップ−アウト培地を用いて行い、その後、レプリカプレーティングを行って、温
度感受性コロニーを選択した。２００のヒスチジン−陽性コロニーのうち２０が、３７℃
における温度感受性表現型を示した。ＰｉｃｈｉａゲノムへのｐＢＫ９．１のランダムな
組込みを排除するために、２０の温度−感受性単離体を、組込み部位の上流配列、および
ＨＩＳ４ ＯＲＦに特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニ
ーのうち２つはｏｃｈ１障害性であり、サザンブロットおよびウェスタンブロットを用い
てさらに分析し、これは、ｏｃｈ１ノック−アウト構築物による機能性ｏｃｈ１破壊を示
す。２つの別々の制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いてゲノムＤＮＡを消化して、
ｏｃｈ１のノックアウトを確認し、オープンリーディングフレームにおける組込みを確認
した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａにおいてＧＳ１１５野生型で生じた区別さ
れるバンドを欠くｏｃｈ１変異体を示した。

（実施例２）
（Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２含有ＩＦＮ−β前駆体を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓのα―１，２−マンノシダーゼを用いた操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２をトリミングして、複合Ｎ−
グリカン形成のための必須の中間体であるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を得るのに必要である
。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複
合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の特異
的異性体は、ＧｎＴＩについての基質であってもなくてもよいからである。Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体は、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフ
ェロンβを発現するように操作される。ＤＮＡライブラリーは、ヒトマンノシダーゼＩＢ
（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびＥＲ局在化ペプチ
ドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される
。次いで、ＤＮＡライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が
各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現
する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフ
ェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、分泌されたタン
パク質の９０％より多くはグリコシル化インターフェロンβである。

上澄みを精製して、Ｃ_１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって塩および低分子量夾
雑物を除去する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望
の形質転換体は、親株のインターフェロンβと比較して低下した分子質量を有する、構造
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを生成する。精製され
たインターフェロンβをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、インターフェロン
βの所望の形態を発現するコロニーを同定する。

（実施例３）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧ
ｎＴＩＩを発現するｏｃｈ１変異体株の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＨＣ１遺伝子の１２１５ｂｐのオープンリーディングフレー
ムならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流をＰＣＲによって増幅し（ＷＯ ０
２／００８７９も参照のこと）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。複数の栄養要求性マーカーを含むｏｃ
ｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９、ＳｆｉＩ制限部位が
隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含むプラスミドをＳｆｉＩで消化し、
これを用いて、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換した
。室温における１０日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに
続き、１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。３７℃では増殖できないが、室
温では増殖したＵＲＡ^＋クローンをコロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異
体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたＰＣＲパターンを呈した１つ
のクローンをＹＪＮ１５３と命名した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ド
メインをモデルタンパク質として用いた。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏ^Ｒでマークしたプラス
ミドを株ＹＪＮ１５３に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と命名し
た。

ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子を含むプラスミドｐＰＢ１０３を、
ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）からの平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＤＥ１遺伝子（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、（
２００１）Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９）を含むＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化
した平滑末端ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸにクローン化することによって、構築した。このプラス
ミドをＥｃｏＮＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＢＫ６４−１に形質転
換し、１つの株はＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むと確認され、これをＰＢＰ１と命
名した。

ヒト、マウス、ハエ、虫および酵母源からの数個のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子
の触媒ドメインと融合させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓから
の数個のＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのインフレーム融合物を含む
マンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ ０２／００８７９を参
照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。このライブラリーをＰ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４組込みベクターにおいて作製し、ＳａｌＩで線状化し、エレクト
ロポレーションによって株ＰＢＰ１に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から遊離さ
れたグリカンを分析することによってスクリーニングした。１つの活性な選択された構築
物は、１８７ヌクレオチドを失った、マウスα―１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子（図
３）のＮ末端欠失と融合させた酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８−１２９６ヌクレオチド（
Ｃ末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ２と
命名した（図３６もまた参照のこと）。

ヒト、虫、カエルおよびハエ源からのＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリー
ダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した
（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ４組込
みベクターにおいて作製し、そして、ＡａｔＩＩで直線化し、エレクトロポレーションに
よって株ＰＢＰ２に形質転換し、Ｋ３から遊離されたグリカンを分析することによってス
クリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４ｂｐが失われた、ヒ
トＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子の最初の
１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ３
と命名した。

ヒトおよびラット源からのＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインを有するリーダーライブラ
リーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ ０
２／００８７９）。このライブラリーを、薬物ノロセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒ
ｉｃｉｎ）に対する耐性を与えるＮＳＴ^Ｒ遺伝子を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組込みベ
クターにおいて作製した。これらのライブラリープラスミドを、ＥｃｏＲＩで線状化し、
エレクトロポレーションによって株ＲＤＰ２７内に形質転換し、そしてこの得られた株を
、精製したＫ３から遊離されるグリカンの分析によって、スクリーニングした。

（以下の反応のための材料）
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａ製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は
、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であった。Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα２，６−シアリルトランスフェ
ラーゼ、および牛乳由来のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ、
マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製であ
った。ＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓ製であった。金属キレー
ト化「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。
９６ウェル溶解−清浄化プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であっ
た。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
）製であった。塩および緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。
ＭＡＬＤＩマトリックスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）製であった。

（タンパク質の精製）
クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）３を、９６ウェル形式で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅ
ｋ ２０００サンプル取り扱いロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒａｎｃｈ
Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で精製した。Ｋｒｉｎｇｌｅ ３を、Ｃ末端ヘキサヒスチ
ジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｖａｇｅ
ｎによって、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂について提供されるプロトコルの適合である。簡単
に言えば、１５０ｕＬ（μＬ）の沈降した体積の樹脂を、９６ウェルの溶解−結合プレー
トのウェルに注ぎ、３倍体積の水で洗浄し、そして５倍体積の５０ｍＭ ＮｉＳＯ４を充
填し、そして３倍体積の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９））で洗浄する。このタンパク質発現培地を、３：２
で、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ ＰＯ４，１６ｍＭ ＫＣｌ、８２２ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．４））で希釈し、そしてカラムに充填する。排液後、このカラムを、１０倍体積の結
合緩衝液および６倍体積の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄し、そしてタンパク質を、６倍体積
の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．９））で溶出する。溶出した糖タンパク質を、凍結乾燥によって、蒸発乾固させ
る。

（Ｎ結合型グリカンの遊離）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙ
ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から遊離させ
、そして分離する。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−
Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００ｕＬのメタノールで湿らせ、
３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ，
３．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で排液する
。乾燥したタンパク質サンプルを、３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液に溶解し、そして１０ｕＬの
ＲＣＭ緩衝液を含むウェルに移す。これらのウェルを排液し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回
洗浄する。ＲＣＭ緩衝液中６０ｕＬの０．１Ｍ ＤＴＴの添加によって、３７℃で１時間
、タンパク質を還元する。これらのウェルを、３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして６０
ｕＬの０．１Ｍヨード酢酸の添加によって、室温で暗所で３０分間カルボキシメチル化す
る。これらのウェルを、水で再度３回洗浄し、そしてその膜を、水中１％のＰＶＰ ３６
０（１００ｕＬ）の添加によって、室温で１時間ブロックする。これらのウェルを排液し
、そして３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして１ミリ単位のＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋ
ｏ）を含有する１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３（ｐＨ８．３）の３０μＬの添加によって、脱
グリコシル化する。３７℃で１６時間後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によっ
て除去し、そして蒸発乾固させた。

（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法）
グリカンの分子量を、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析計を使用して、遅延抽出を用いて決定した
。各ウェルからの乾燥したグリカンを、１５ｕＬの水に溶解し、そして０．５ｕＬをステ
ンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして０．５ｕＬのＳ−ＤＨＢマトリックス
（１：１の水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ中９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、
１ｍｇ／ｍＬの５−メトキシサリチル酸）と混合し、そして乾燥させた。

イオンを、４ｎｓのパルス時間のパルス化窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いて照射す
ることによって、生成させた。この器具を、１２５ｎｓの遅延および２０ｋＶの加速電圧
を用いて、遅延抽出モードで操作した。格子電圧は、９３．００％であり、格子ワイヤ電
圧は、０．１０％であり、内圧は、５×１０^−７トル未満であり、そして低質量ゲートは
８７５Ｄａであった。スペクトルを、１００〜２００のレーザーパルスの合計から生成し
、そして２ＧＨｚデジタイザーで獲得した。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２オリゴ糖を、外部分
子量標準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードでこの器具を用いて生成
した。このスペクトルの推定質量精度は、０．５％であった。

このカラムから溶出したＮ−グリカンの質量は、一般的に陽イオン付加物と会合してお
り、陽イオンの分子量によって質量は増加する。最も一般的な付加物は、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、
およびＫ^＋である。

（実施例４）
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる優勢なＮ−グリカン構造としてのＭａ
ｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイ
ン（Ｋ３）のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
のｏｃｈ１変異体（実施例１および３を参照のこと）を作成した。ヒトプラスミノーゲン
のクリングル３ドメイン（Ｋ３）をモデルタンパク質として用いた。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、Ｋ３をコー
ドするＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化し、Ｃ−末端６−Ｈｉｓ
タグを得た。Ｋ３のＮ−結合グリコシル化効率を改良する（Ｈａｙｅｓら、１９７５ Ｊ
．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１，６５１−６５５）ために、部位
特異的変異誘発を用いてＰｒｏ_４６をＳｅｒ_４６で置き換えた。得られたプラスミドをｐ
ＢＫ６４と命名した。ＰＣＲ構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、表６に従って、Ｃｏｐ ＩＩ小胞、ＥＲ、お
よび初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、マウスα−
１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）およびＩＡ（Ｇ
ｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６７５４６１９）触媒ドメインとのイン−フレーム連結によって構
築した。組み合わされたＤＮＡライブラリーを用いて、個々の融合構築物を生成し、次い
で、これをＫ３発現宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体各々がＫ３なら
びにライブラリーからの局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に
混合された集団を得た。個々の形質転体を培養し、Ｋ３の産生を、メタノール含有培地へ
の移動によって誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後に、培地中のタンパク質
の９０％より多くはＫ３であった。Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製して、Ｎｉ
―アフィニティークロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去した。アフ
ィニティー精製に続き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、後記するＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に直接的に供するか、あるいはＮ−グリカンを後記するようなＰＮ
Ｇａｓｅ消化によって除去し（Ｎ−グリカンの遊離）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した
（Ｍｉｅｌｅら、１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，
１５１−１５７）。

このアプローチに続き、多様な組の形質転換体が得られた；いくつかはｏｃｈ１ノック
アウト株と比較してＮ−グリカンの修飾を示さず；他のものは高度なマンノーストリミン
グを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダー
ゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを有する
Ｋ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比較して、糖タンパク質に対して低
下した分子質量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって容易に検出され
た（図５）。表７は、相対的なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２産生レベルを示す。

（表７．Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２生成の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの
代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）

（表８．Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２生成の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの
代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）

標的化ペプチドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（長、中程度および短）（前出を参照の
こと、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ
ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）におけるＭＮＳ
Ｉ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３２９０６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（９８８〜１
１４０ヌクレオチド：短）および（９８８〜１２９６：中程度）におけるＳＥＣ１２（Ｓ
ｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５）から選択した。標的化ペプチド配列の大部分はＮ末端
欠失であったが、ＳＥＣ１２のようないくつかの標的化ペプチド配列はＣ末端欠失であっ
た。この実験で用いた触媒ドメインは、１８７アミノ酸Ｎ−末端欠失を含むマウスマンノ
シダーゼ１Ａ；および５８、９９および１７０アミノ酸欠失を含むマウスマンノシダーゼ
１Ｂから選択した。本明細書中で使用される場合、（＋）の数は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２産生の相対的レベルを示す。表示（−）は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の明白な産生が無
いことを示す。表示（＋）は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の１０％未満の産生を示す。表示
（＋＋）は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の約１０〜２０％の産生を示す。表示（＋＋＋）は
、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の約２０〜４０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ
_５ＧｌｃＮＡｃ_２の約５０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２の５０％を超える産生を示す。

表９は、分泌されたＫ３に対するＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の相対的な量を示す。１９の
α−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ、およびシス−ゴルジリーダー
に融合させることによって作製されたコンビナトリアル遺伝子ライブラリーからの単一構
築物で各々を形質転換することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｏｃｈ１）の６０８
の異なる株を作製した。

（表９）

^＊数個の融合構築物は試験しなかった。なぜなら、対応するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓへの形質転換の前にＥ．ｃｏｌｉ中で増殖し得なかったからである。
^＋最高程度のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２トリミング（３０／５１）を有するクローンを、培
地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分（２８／３０）は、上
清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した（例えば図４Ｂ）。２つの構築物のみが培
地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２レベルを示した（
例えば、図４Ｃ）。

表７は、とりわけ、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を示す２つの構築物ｐＦＢ８およびｐＧＣ
５を示す。表８は、
より好ましい構築物である、ｐＢＣ１８−５（８０アミノ酸Ｎ−末端欠失を有するＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖａｎ１（ｓ）／Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＣＡＡ９８１１
４）にインフレーム連結したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド
配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２由来））、を示す。この融合構築物はまた、図５Ｅ
に示すように、優勢なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を生成する。この構築物は、５０％を
超えるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成することが示された（＋＋＋＋＋）。

（コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製）
標的化ペプチドに融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリア
ルＤＮＡライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのＮ−末端欠失を含むマン
ノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−１，２
−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の源：Ｈｏｍ
ｏ ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍから得られたｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかからＰＣＲ増幅した。各場合において、ＰＣＲ反応
を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーの存在下でＤＮＡをインキュベートした。例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α
−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを増幅するために、５’−プライマー

（配列番号５２）および３’−プライマー

（配列番号５３）をＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）の存在下でインキュベートし、循環パラメーター：９４℃で１分間（１サイ
クル）；９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間（３０サイクル）を用い
るＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅に続いて、ＯＲＦを
コードするＤＮＡ配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）への連結の前に１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に７２℃にて５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
によって推奨されるように、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転
換した。クローン化されたＰＣＲ産物は、マンノシダーゼＯＲＦに特異的なプライマーを
用いるＡＢＩ配列決定によって確認した。

各マンノシダーゼの所望のＮ−末端短縮形を作製するために、各マンノシダーゼの完全
なＯＲＦを、ＰＣＲ反応の後のラウンドでテンプレートとして用い、ここで、５’プライ
マーのアニーリング位置は所望の短縮形の５’末端に特異的であり、３’プライマーはＯ
ＲＦの元来の３’末端に特異的なままであった。酵母発現ベクターへの短縮形マンノシダ
ーゼフラグメントのサブクローニングを容易にするために、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）Ａｓ
ｃＩおよびＰａｃＩ制限部位をそれぞれ、５’および３’末端において、各短縮産物に操
作した。各マンノシダーゼＯＲＦについて作製されたＮ−末端短縮形の数および位置は、
触媒ドメイン）（ＣＤ）に関して膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭお
よびＣＤの間に位置したステム領域が１５０ｂｐ未満である場合、そのタンパク質につい
ての１つの短縮形のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０ｂｐよりも長い場合
、ステム領域の長さに応じて１以上の短縮形が作製された。

Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）
についての短縮形をいかにして作製したかの例を本明細書に記載し、同様なアプローチを
他のマンノシダーゼについて用いた。図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マン
ノシダーゼＩＡのＯＲＦを示し、予測された膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを太字で
強調した。この構造に基づいて、３つの５’プライマーを設計して（図３において下線を
施したアニーリング位置）、Δ６５−、Δ１０５−およびΔ１８７−Ｎ−末端欠失を作製
した。Δ６５Ｎ−末端欠失を例として用いた、使用された５’プライマーは、

（配列番号５４）（ＡｓｃＩ制限部位は太字で強調する）＋３’プライマー

（配列番号５５）（ＰａｃＩ制限部位は太字で強調する）であった。これらのプライマー
の両方を用いて、全長Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ１Ａ ＯＲＦを増幅するため
の上記にて概説した条件下で１５６１ｂｐフラグメントを増幅した。さらに、全長ＯＲＦ
で得られた産物のように、短縮産物もまたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベ
ートし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に
連結し、ＴＯＰ１０に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。短縮マンノシダーゼフラグメン
トの配列を増幅し、確認した後に、得られたプラスミド、ｐＣＲ２．１−Δ６５ｍＭａｎ
ｎＩＡを、３７℃にて１６時間、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中でＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。平行して、ｐＪＮ３４
７（図２Ｃ）を同一酵素で消化し、上記のようにインキュベートした。消化後、ｐＪＮ３
４７（図２Ｃ）骨格および短縮触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨
されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ
５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。コロニー
ＰＣＲを用いて、ｐＪＮ３４７−マウスマンノシダーゼＩＡΔ６５構築物の生成を確認し
た。

酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）において短縮α−１，２−マンノシダーゼ触
媒ドメインのライブラリーを生成し、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーの生成
における残りの工程は、標的化ペプチド配列（図２）をイン−フレームクローン化するこ
とであった。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）およびｐＣＲ２．１ＴＯＰ
Ｏ−標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）両方を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの存在下
で、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中で３７℃において一晩インキ
ュベートした。消化に続き、ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ骨格および標的化ペプチド領
域の双方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。引き続いて、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マン
ノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定して、生成された融合がイン−フレームであることを
確認した。最終標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズ
は、上記アプローチによって生成された１３００を超える構築物を含む。図２は、コンビ
ナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。

（複数栄養要求性マーカーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１ノックアウト株の
操作）
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の５’および３’領
域についてのスペースホールダー（ｓｐａｃｅ ｈｏｌｄｅｒ）としての、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ １９９９年５月；１５（７）：５６３−７２）の
ＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含し
た。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｕｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉら（１９８７）、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ １１６，５４１−５４５）、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位
を有する発現カセットを含んだ。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋ
ｂのフラグメントは、プライマー

（配列番号５６）および

（配列番号５７）、ならびにテンプレートとしてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを
用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミ
ドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマー

（配列番号５８）および

（配列番号５９）を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂのフラグメントを
開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切
断し、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら（１９８７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−
５４５）の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを可能な双方の向きに挿入
し、その結果、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）およびｐＪＮ２８４（図４Ｂ）を得た
。

発現カセットをクローニング部位としてのＮｏｔＩおよびＰａｃＩを用いて作製した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマー

（配列番号６０）および

（配列番号６１）と、テンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）とを用いて増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ部位にクローン化した（図４Ｂ）。得られ
たプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマー

（配列番号６２）および

（配列番号６３）と、テンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）とを用いて増幅したＣＹＣ１転写ターミネーター領域（「ＴＴ」）を開いた部位
にクローン化し、ｐＪＮ２６１を作製した（図４Ｂ）。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドをｐＪＮ２
６３をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化することによって作製し、プライマー

（配列番号６４）および

（配列番号６５）と、テンプレートとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡとを用いて
増幅したＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを開いた部位にクローン
化した（図４Ｃ）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断し、プライマ
ー

（配列番号６６）および

（配列番号６７）を用いて生成したＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂのＤＮＡフラグメン
トを挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した（図４Ｃ）。プラスミドを同時に用いて新しい遺
伝子を導入する可能性を可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図
４Ｂ）をｐＪＮ２９８（図４Ｃ）の固有のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ２９
９を作製した（図４Ｅ）。

Ｌｕら、（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：
１４１−１４６に記載されている同様な戦略を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｕｒａ３−
ブラスターカセットを構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３の２．０ｋｂのＰｓｔ
Ｉ、ＳｐｅＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ，ＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＪＮ３０６を作製した（
図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂのＳａｃＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントをＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ３０
８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８（図４Ｄ）の消化、およびＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼでの処理に続いて、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｌａｃＺ由
来のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを挿入し、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。
ｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩでの消化によって遊離し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９の骨格にクローン化した。得られたプラス
ミドをｐＪＮ３２９と命名した（図４Ｅ）。

ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩで切断することによって、ＨＩＳ４でマーク
した発現プラスミドを作製した（図４Ｆ）。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断したプラ
イマー

（配列番号６８）および

（配列番号６９）を用いて増幅し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端
化したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂのフラグメントを
、次いで、開いた部位に連結した。このプラスミドをｐＪＮ３３７と命名した（図４Ｆ）
。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築する
ために、ｐＪＮ３３７をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングし
た２つのオリゴヌクレオチド

（配列番号７０）および

（配列番号７１）を開いた部位に連結し、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。

複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇ
のｐＪＮ３２９をＳｆｉＩで消化し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８
（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポ
レーションによって形質転換した。形質転換に続いて、ＵＲＡドロップアウトプレートを
室温で１０日間インキュベートした。１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。
次いで、全ての１０００のクローンを２組のＵＲＡドロップアウトプレート上で画線培養
した。１つの組を室温にてインキュベートし、他方、第二の組を３７℃でインキュベート
した。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供して
、正しいＯＣＨ１ノックアウトについて試験した。予測されたＰＣＲシグナル（約４．５
ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。

（実施例５：コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの特徴付け）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロ
ニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性形質転換体（実施例４）を、１％酵母抽出物
、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベ
ース、４×１０^−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての５０
ｍｌのＢＭＧＹ緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてＯＤ_{６００ｎｍ}
２−６まで増殖し、その時点で、５ｍｌのＢＭＭＹ中での室温での２４時間のレポーター
タンパク質の誘導に先立ち、１０ｍｌのＢＭＭＹ（増殖培地としての１％酵母抽出物、２
％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース
、４×１０^−５ビオチン、および１．５％メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培
地）で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例３に記載される通り
に分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表６中の標的化ペプチドを用い、ＥＲまた
はゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２を主に含有するグリカンに対してＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を主に含有するグリカンのト
リミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を
、図５Ｃおよび６ＣにおけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｏｃｈ１ノックアウトのそれと、図
５Ｄ、５Ｅ、６Ｄ〜６Ｆに示したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ構築物で形質転換
された同株との間で比較する場合で明らかである。図５および６は、Ｐ．ｐａｓｔｉｒｉ
ｓにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから創
製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）
／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９（図５Ｄおよび６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２にトリミングされた全てのグリカンのほぼ３０％を有するタンパク質を生じ、他方、
ｐＦ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ
１８７）（図６Ｆ）の発現はほぼ５０％のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生じ、ｐＢＣ１８−
５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ
ＩＢΔ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生じた。

（実施例６）
（α−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング）
実施例４の新規な操作された株が、事実、インビボにて所望のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
構造を生じたことを確実にするために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストし
た（図７〜９を参照のこと）。後記した各構築物／宿主株については、ＨＰＬＣを１．０
ｍｌ／分の流量にて、Ａｌｔｅｃｈの４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（Ａｖｏｎｄａｌｅ
，ＰＡ，ＵＳＡ） Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ_２樹脂（５μｍ）を用いて３０℃にて４０分
間行った。図７および８において、標準的なＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の分解は、Ｍ
ａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークを生じるように起こることが示された。図７にお
いて、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
ｃ_２［ａ］は１８．５９分で溶出した。図８において、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２は２１．
３７分で溶出し、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は１５．６７分で溶出した。図９において、標
準Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。

プラスミドｐＦＤ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノ
シダーゼＩＡ Δ１８７）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、３０℃にてＢＭＧＹ中で
ＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。遠心分離によって細胞を収穫し、ＢＭＭＹに移して
、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）
の生産を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明
な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分
泌された可溶性Ｋ３の回収に用いた。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーおよび２５
ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出
勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％
純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図６Ｆに示す。上澄のよ
り早く取り出されたアリコートを、さらに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につき
テストした。２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−２−
ＡＢ）の商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図
７Ａ）、上記アリコートからの上澄（図７Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ
０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１
０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図７Ｃ）に
加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによ
って分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。

プラスミドｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシ
ダーゼＩＢ Δ９９）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を同様に増殖させ、アッセイした
。細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によ
って収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３の生産を誘導した
。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上
澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ
３の回収に用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ Ｎａ
Ａｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用い
る単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３
が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｄに示す。上澄のより早く取り
出されたアリコートを、さらに、図８Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の
存在につきテストした。Ｍａｎ９−２−ＡＢの商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎ
ｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記アリコートからの上澄（図８Ｂ）、お
よび（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダ
ーゼを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの
後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を
測定した。

Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として用い、２４時間のインキュベーション後に、マンノシ
ダーゼ活性は、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマン
ノシダーゼＩＡ Δ１８７）株消化物（図７Ｂ）およびｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）株消化物（図８Ｂ）の上
澄に実質的に存在しなかったことは明らかであり、他方、陽性コントロール（Ｃｏｎｔｒ
ｅｒａｓから得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉからの精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）
は、図７Ｃおよび８Ｃに示すように、同一条件下でＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２からＭａｎ_５
ＧｌｃＮＡｃ_２への完全な変換を導く。これは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＧＣ５株；お
よびｐＦＢ８株におけるインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータであり
、これは、今日までに報告されているものとは明らかに異なる（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら、
ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２）。

図９は、さらに、マンノシダーゼ酵素の局在化および活性を立証する。ｐＢＣ１８−５
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｍ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩ
Ｂ Δ８０）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、ＢＭＧＹ中で室温にてＯＤ６００＝約１０
まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモー
ターの制御下でのＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導の後、細胞を遠心分離によって
除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのた
めに取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収のために用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ
、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００
ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３を得た。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカ
ン分析を図５Ｅに示す。上澄のより早く取り出されたアリコートを、さらに、図９Ｂに示
すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ８−２−ＡＢ
の商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図９Ａ）
、上記アリコートｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）からの上澄（図９Ｂ）、および異なる融合
構築物ｐＤＤ２８−３（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）からの培
地を含有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後
、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を決
定した。図９Ｂは、陰性結果を呈する融合構築物ｐＤＤ２８−３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）と比較し
た細胞内マンノシダーゼ活性を示す（図９Ｃ）。

（実施例７）
（操作されたα−１，２−マンノシダーゼのｐＨ最適アッセイ）
プラスミドｐＢＢ２７−２（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）を
含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１７まで増殖させ
た。これらの細胞の約８０μＬを６００μＬのＢＭＧＹ中に接種し、一晩増殖させた。引
き続いて、細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの
制御下のＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。２４時間
のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄（ｐ
Ｈ６．４３）を得た。上澄をマンノシダーゼｐＨ最適アッセイのために取り出した。蛍光
標識Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（０．５μｇ）を、種々のｐＨに調整された２０μＬの上澄
に加え（図１１）、室温にて８時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｅｃ
ｏｎｏｓｉｌ ＮＨ２ ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカ
ラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｎｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって試料を分析し
た。流量は４０分間で１．０ｍｌ／分であり、カラムを３０℃に維持した。３分間のイソ
クラフィック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒勾配（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４
０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカン（１８）を溶出させた。溶
媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）。カ
ラムを実施している（ｒｕｎ）間の２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化した
。

（実施例８）
（構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を持つＮ−グリカンを生産するためのＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複合Ｎ−グリカンおよびハイブリッドＮ−
グリカンの成熟化に必要である（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２は単にマンノシダーゼＩＩによってトリミングされ得、これは、ＧｌｃＮＡｃトラ
ンスフェラーゼＩによるＮ−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−
１，３マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である
（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １（５）：４５３−４
６１）。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＧｌｃＮＡ
ｃトランスフェラーゼＩ遺伝子の適切に標的化された触媒ドメインと；ＫＴＲホモログで
あるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｄ２、Ｄ９およびＪ３からの相同性に基づき、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの推定α−１，２−マンノシルトランスフ
ェラーゼからのＧＬＳ、ＭＮＳ、ＳＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、Ｍ
ＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１
、ＭＮＮ１、およびＭＮＮ６からの局在化配列とをコードするＤＮＡフラグメントを含む
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを調製した。表１０は、限定されるものではないが
、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｕｃｔｉｓ ＧｎＴＩからのＳＥＣおよびＯＣＨ
１のような標的化ペプチド配列を含む（表６および表１０参照）。

（表１０．標的化ペプチド配列／ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼＩ（ＧｎＴＩ）の触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルライブラリー）

標的化ペプチド配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（長、中程度および短）におけるＯＣＨ
１（実施例４参照）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ短および中程度におけるＭＮＮ９（
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３９１０７）から選択した。触媒ドメインを、各々、３８および
８６アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つヒトＧｎＴＩ、３５および６３アミノ酸欠失を持つＣ．
ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩならびに８８アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＣ．
ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩならびに３３および１０３アミノ酸Ｎ−末端欠
失を持つＸ．ｌｅａｖｉｓ ＧｎＴＩから選択した。

最初の１５４ｂｐを欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍ
ＧＡＴＩ、登録番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を、オリゴヌクレオチ
ド

（配列番号７２）および

（配列番号７３）と、テンプレートとしてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ番号７９０
０３）とを用いるＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰ
Ｏにクローン化し、正しい配列を確認した。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化に続き、短
縮型ＧｎＴＩをプラスミドｐＪＮ３４６に挿入して、ｐＮＡを創製した。ＮｏｔＩおよび
ＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の消化の後、１２０ｂｐインサートをｐＮＡに連結して、ＭＮ
Ｎ９膜貫通ドメインとＧｎＴＩとのイン−フレーム融合物を作製し、ｐＮＡ１５を創製し
た。

宿主生物はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株であり、これは超マンノシル化を欠損し（例えば
、ＯＣＨ１変異体）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提
供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み）、ゴルジおよび
／またはＥＲにおける構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを提供する（例えば、
上記からのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２
（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７））。まず、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミ
ド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（２００１），Ｇｅｎｅ ２６３１５９−１６９）のＢａｍＨ
ＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを
コードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
ｐＦＢ８を形質転換した。次いで、外因性または内因性のＧｎＴＩ／局在化遺伝子の組
合せをコードする上記コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロニーを選
択し、コロニーＰＣＲによってＧｎＴＩ構築物の存在につき分析した。我々の形質転換お
よび組込み効率は、一般には、８０％を超え、ＰＣＲスクリーニングは、一旦頑強な形質
転換パラメーターが確立されれば省略することができる。

（タンパク質精製）
Ｋ３は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００試料−取扱ロボットにて９６ウェル
フォーマットを用いてＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から精製した
。ロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって供されたプ
ロトコルの適合であった。別のスクリーニング方法は、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体
または末端ＧｌｃＮＡｃに結合するレクチン（例えば、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌ
ｉｆｉｃｏｌｉａ由来のＧＳＩＩレクチン）（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ
Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）を使用して行われ得る。これらのスクリーニングは、ＦＩＴＣのよ
うな蛍光標識で改変されたレクチンまたは抗体を使用することによって自動化し得るか、
あるいはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析され得る。

分泌されたＫ３は、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得、定量さ
れ得、等量のタンパク質が、高タンパク質結合型９６ウェルプレートに結合され得る。Ｂ
ＳＡでブロッキングした後、プレートを、ＧＳＩＩ−ＦＡＣＳレクチンでプローブし得、
最大蛍光応答についてスクリーニングした。上記の糖タンパク質を検出する好ましい方法
は、９６ウェル培養形質転換体の上清から分泌Ｋ３をアフィニティー精製した後に、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってスクリーニングすることを含む。形質転換されたコロニ
ーは拾い上げられ、３０℃において、ＢＭＧＹ中、２ｍｌの９６ウェルプレートにおいて
ＯＤ６００＝約１０にまで増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、ＢＭＭＹで洗浄
し、２５０μｌのＢＭＭＹで再懸濁した。２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分
離によって除去し、その上清を回収し、Ｋ３を上清からＮｉアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製した。そのＮ−グリカンを遊離させ、本明細書に記載のように、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ遅延抽出質量分析によって分析した。

まとめると、本発明の方法は、図１０Ｂに示されるように、高収率でＧｌｃＮＡｃＭａ
ｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を生成する。そのＮ−グリカンの
６０％は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２である。今日までに、いずれの酵母にお
いても分泌された可溶性形態でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の形成を記載した
報告は存在しない。本明細書に示される結果は、ＧｎＴＩ活性とともにＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃトランスポーターの付加が、１４５７（ｍ／ｚ）におけるピークによって確認される
、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を生成することを示す（図１０Ｂ）。

（株ＰＢＰ−３の構築）
Ｋ３を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（Δｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−
）を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を、エレクトロポレー
ションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第二に、ＢａｍＨＩ酵
素およびＢｇｌＩＩ酵素で消化されたｐＢＬＡＤＸ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎ
ｏら（２００１），Ｇｅｎｅ ２６３１５９−１６９）にクローン化された（ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ
ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１
０３を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第三に、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩフ
ラグメントとしてｐＪＮ３３６にクローン化された遺伝子をコードするＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ株に形質転換した。

（実施例９）
（構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を持つＮ−グリカンを生産するためのＫ．ｌａｃｔｉｓ
細胞の操作）
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の同定および破壊）
出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭ
ａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う１
，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ
ら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６８（３５）：２６３３８−４５）。こ
のマンノース転移は、一般には、Ｎ−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化におけ
る鍵となる最初の工程として認識される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３５）：２６３３８−２６３４５；Ｎａｋａｙａ
ｍａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−１９；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅ
ｔら，Ｔｒａｆｆｉｃ １（１）：５６−６８）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこ
の遺伝子の欠失の結果、かなり短いＮ−グリカン構造がもたらされ、これは、高温におけ
るこの典型的なポリマンノシル化も増殖欠損も含まない（Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２
） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−９）。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯｃｈ１ｐ配列を、関連するが異なるマンノシルトラ
ンスフェラーゼであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｎｅｉｍａｎら（１９９７），Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，１４５（３）：６３７−４５およびＫ．ｌａｃｔｉｓ （ＰＥＮＤＥＮＴ
ＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質と共に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＬ４９９８７）、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの既知
のホモログと整列させた。Ｏｃｈ１ｐホモログの間では共通するが、Ｈｏｃ１ｐホモログ
とは異なる高相同性の領域を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら
， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，１８５−１９２（１９８７））からのゲ
ノムＤＮＡに対する縮重プライマーの対を設計した。プライマーＲＣＤ３３

（配列番号７４）およびＲＣＤ３４

（配列番号７５）でのＰＣＲ増幅の結果、３０２ｂｐ産物が得られ、これをクローン化し
、配列決定し、予測された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対して高度な相同性を有すること
が示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｏｃｈ１ｐに対して＞５５％）。

３０２ｂｐ ＰＣＲ産物を用いて、高ストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）でのＫ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２
）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。ハイブリダイゼーションが、単
一遺伝子と合致するパターンで観察され、これは、この３０２ｂｐセグメントがＫ．ｌａ
ｃｔｉｓゲノムの一部に対応し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＫｌＯＣＨ１）がこの遺伝子の単一
コピーを含むことを示す。全ＫｌＯＣＨ１遺伝子をクローン化するために、サザンブロッ
トを用いて、ゲノム遺伝子座をマッピングした。従って、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２
ｋｂの範囲のフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作ること
によって、５．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントをクローン化した。このサブ
ゲノムライブラリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローンをＲＣＤ３３／３４を
用いるコロニーＰＣＲによってテストした。予測されたＫｌＯＣＨ１遺伝子を含む５．２
ｋｂクローンを配列決定し、予測されたタンパク質をコードする１３６２ｂｐのオープン
リーディングフレームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺伝子と４６．５％同一
である。この５．２ｋｂ配列を用いて、ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２
） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５）を用い、ｏｃｈ１：：
ＫＡＮ^Ｒ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを作製した。この欠失対立遺伝子を２
つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、Ｇ４１８耐性コロニーを選択した。これらのコロ
ニーを双方のＰＣＲによって、および温度感受性につきスクリーニングして、ＯＣＨ１
ＯＲＦが欠失した株を得た。実験の結果は、変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株を示
し、これは、種々の温度における増殖の分析、およびＰＮＧａｓｅ消化の後における分泌
されたタンパク質および細胞壁タンパク質のＮ−グリカン糖質分析によって特徴付けした
。ｏｃｈ１変異は、株を３０℃では増殖させるが３５℃では増殖させない、温度感受性を
付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］およびそれより高次のＮ−グリカ
ンを生産する野生型Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。

（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニングおよび破壊）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１は、ゴルジα−１，３−マンノシルトランスフェ
ラーゼについての構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は、７６２アミノ酸タイプＩＩ膜タ
ンパク質である（Ｙｉｐら（１９９４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ．９１（７）：２７２３−７）。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ結合オリゴ糖および
Ｏ結合オリゴ糖双方はα−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅら（１９７３
），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２４８（１３）：４６６０−６）。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭｎｎｌｐ配列を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ翻訳ゲノ
ム配列（ＰＥＤＡＮＴ）をサーチした。Ｍｎｎｌｐに対して有意な類似性の推定タンパク
質フラグメントをコードする１つの４０５ｂｐのＤＮＡ配列を同定した。この配列の内部
セグメントを、引き続いて、プライマーＫＭＮ１

（配列番号７６）およびＫＭＮ２

（配列番号７７）でＰＣＲ増幅し、これを用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）か
らのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。サザンハイブリダイゼーションデー
タに基づき、４．２Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、本明細書中に記載した
ように、サイズで選択されたライブラリーを作ることによってクローン化した。Ｋ．ｌａ
ｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子を含む単一クローンを、プライマーＫＭＮ１およびＫＭＮ２を
用いる全コロニーＰＣＲによって同定し、配列決定した。このクローン内で、Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子に３４％同一である予測されたタンパク質をコードする
２２４１ｂｐ ＯＲＦが同定された。ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２）
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５））を用い、ｍｎｎ１：：Ｎ
ＡＴ^Ｒ欠失対立遺伝子の構築のためにプライマーを設計した。

エレクトロポレーションによって、この破壊対立遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓの株に形質
転換し、ヌーセオトリシン耐性形質転換体を選択し、破壊対立遺伝子の相同挿入のために
ＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株は、公知のレポーター遺伝子の
Ｎ−グリカン糖質分析に供し得る。

図１２Ｂは、本明細書中に記載されたように、ＰＮＧａｓｅ消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに
続いて観察されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失株からのＮ−グリカンを示
す。［ｄ］として示される１９０８（ｍ／ｚ）における優勢なピークはＭａｎ_９ＧｌｃＮ
Ａｃ_２の質量と合致する。

グリコシル化を修飾するための方法で用いることができるさらなる方法および試薬は米
国特許第５，９５５，４２２号、米国特許第４，７７５，６２２号、米国特許第６，０１
７，７４３号、米国特許第４，９２５，７９６号、米国特許第５，７６６，９１０号、米
国特許第５，８３４，２５１号、米国特許第５，９１０，５７０号、米国特許第５，８４
９，９０４号、米国特許第５，９５５，３４７号、米国特許第５，９６２，２９４号、米
国特許第５，１３５，８５４号、米国特許第４，９３５，３４９号、米国特許第５，７０
７，８２８号および米国特許第５，０４７，３３５号のような文献に記載されている。適
当な酵母発現系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤのような源から得ることができる。ベクターは種々の源
から商業的に入手可能である。

（実施例１０）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クロ
ーニングおよび欠失）
縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｌｇ３タンパク質配列、Ｈ
．ｓａｐｉｅｎｓに由来するＡｌｇ３タンパク質配列、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔ
ｅｒに由来するＡｌｇ３タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し、これを用い
て、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡから８３ｂｐ生成物を増幅した：

（配列番号７８）および

（配列番号７９）。得られたＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、配列分析により、既知のＡＬＧ３／
ＲＨＫ１／ＮＯＴ５６ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１１３４．２、ＡＦ３０９
６８９、ＮＣ＿００３４２４．１）に対する相同性を明らかにした。その後、最初のＰＣ
Ｒ生成物の１９２９ｂｐ上流および２７３８ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤ
ＮＡライブラリーから、内部オリゴヌクレオチド

（配列番号８０）および

（配列番号８１）
ならびに上記ライブラリーを保有するプラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格中のＴ３

（配列番号４９）およびＴ７

（配列番号４８）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒ
ａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて、増幅した（Ｂｏｅｈｍ（１９９９）Ｙｅａｓｔ １５
（７）：５６３−７２）。得られたフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。この配列から、（ＢＬＡＳＴ
プログラムを用いて）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対して３５％同一性
および５３％類似性を有するタンパク質をコードする、１３９５ｂｐ ＯＲＦが同定され
た。この遺伝子を、ＰｐＡＬＧ３と名付けた。

ＰｐＡＬＧ３の配列を使用して、プライマーセットを作製し、ＰＣＲ重複によりＰｐＡ
ＬＧ３遺伝子の欠失構築物を作製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２） Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２６０７−１５）。以下のプライマーを使用して、それぞれ
、そのＰｐＡＬＧ３ ＯＲＦの５’側にある１ｋｂ領域および３’側にある１ｋｂ領域と
、ＫＡＮ^Ｒ遺伝子とを増幅した：ＲＣＤ１４２

（配列番号８２）、ＲＣＤ１４４

（配列番号８３）、ＲＣＤ１４５

（配列番号８４）、ＲＣＤ１４７

（配列番号８５）、ＲＣＤ１４３

（配列番号８６）、およびＲＣＤ１４６

（配列番号８７）。
その後、プライマーＲＣＤ１４２およびＲＣＤ１４７を使用して、３つの得られたＰＣＲ
生成物を重ねて、単一の３．６ｋｂ ａｌｇ３：：ＫＡＮ^Ｒ 欠失対立遺伝子を得た。

（Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＬＧ３ｐ配列、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＡＬＧ３ｐ配列、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓなどに由来す
るＡＬＧ３ｐ配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ配列と整列させた（ＰＥＮＤＡＮＴ ＥＳＴデー
タベース）。共通するホモログに存在するが、そのホモログとは正確な配列においては異
なる高い相同性の領域を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら，
１９８７）に由来するゲノムＤＮＡに対する１対の縮重プライマーを作製した。ＡＬＧ３
の場合、プライマーＫＡＬ−１

（配列番号８８）およびＫＡＬ−２

（配列番号８９）でのＰＣＲ増幅により生成物が生じ、これを、クローニングし、配列決
定し、その推定翻訳物は、Ａｌｇ３ｐタンパク質に対して高い程度の相同性を有すること
が示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３ｐに対して＞５０％）。

そのＰＣＲ生成物を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）に由来するゲノムＤ
ＮＡのサザンブロットを、高ストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）でプローブした。ハイブリダイゼーションは、単
一の遺伝子と一致したパターンで観察された。このサザンブロットを使用して、ゲノム遺
伝子座をマッピングした。ゲノムＤＮＡを消化し、適切なサイズ範囲におけるそれらのフ
ラグメントをｐＵＣ１９に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作製す
ることによって、ゲノムフラグメントをクローニングした。このサブゲノムライブラリー
を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百個のクローンを、プライマーＫＡＬ−１およびＫＡ
Ｌ−２を使用して、コロニーＰＣＲによって試験した。この推定ＫｌＡＮＧ３遺伝子およ
びＫｌＡＬＧ６１遺伝子を含むクローンを配列決定し、オープンリーディングフレームを
同定した。

ａｌｇ３：：ＮＡＴ^Ｒ欠失対立遺伝子の構築物についてのプライマー（ＰＣＲ重複法を
用いる）（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２
６０７−１５）を設計し、得られた欠失対立遺伝子を、２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質
転換し、ＮＡＴ耐性コロニーを選択した。これらのコロニーをＰＣＲによってスクリーニ
ングし、ＡＬＧ３ ＯＲＦが、ｏｃｈ１：：ＮＡＴ^Ｒ変異対立遺伝子で置き換わった形質
転換体を得た。

（実施例１１）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧ
ｎＴＩＩを発現する、ａｌｇ３ ｏｃｈ１変異株の生成）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３：：ＫＡＮ^Ｒ欠失構築物を、実施例１０に記載のよう
に生成した。約５μｇの得られたＰＣＲ生成物を、株ＰＢＰ−３（実施例３を参照のこと
）に形質転換し、コロニーを、２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＰＤ培地で選択した
。ＰＣＲによってスクリーニングした２０株のうちの１株が、そのａｌｇ３：：ＫＡＮ^Ｒ
変異対立遺伝子の正確な組み込みを含み、野生型対立遺伝子を欠いていることを、確認し
た。この株を、ＲＤＰ２７（図３６）と名付けた。

次いで、ＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを生成した。このライブラリーは、ヒト供給
源およびラット供給源に由来するＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメイン（ＷＯ０２／００８７
９）との、リーダーライブラリーのインフレーム融合物から構成された。このライブラリ
ーを、ＮＳＴ^Ｒ遺伝子（これは、薬物ニューロセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃ
ｉｎ）に対する耐性を付与する）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組み込みベクターにおいて
、作製した。このライブラリープラスミドをＥｃｏＲＩで線状にし、株ＲＤＰ２７にエレ
クトロポレーションにより形質転換し、得られた株を、精製Ｋ３から遊離させたグリカン
の分析によってスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９（ｓ）構築物
にインフレームで融合したラットＧｎＴＩＩを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＰＢ
Ｐ６−５と名付けた（図３６）。

（ＧｎＴＩＩ発現構築物の生成）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子のＮ末端部分と融合したヒトＧｎＴＩ遺伝
子を含むＧｎＴＩ発現ベクター（ｐＮＡ１５）の構築は、Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏ
ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（９）：５０２２−２７に記載される
。同様の様式において、ラットＧｎＴＩＩ遺伝子をクローニングした。そのラットＧｎＴ
ＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２１６６２）を、Ｔａｋａｒａ ＥＸ Ｔａｑ^Ｔ
Ｍポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅｒａ）を用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）から以下のプライマー：ＲＡＴ１

（配列番号９０）およびＲＡＴ２

（配列番号９１）でＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ生成物を次いで、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰ
Ｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。このベクターを
テンプレートとして用いて、ＧｎＴＩＩのＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメント（アミノ酸８
８〜４４３をコードする）を、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）、ならびにそれぞれプライマーＲＡＴ４４

（配列番号９２）およびＲＡＴ１１

（配列番号９３）を用いて増幅した（導入したＡｓｃＩ制限部位およびＰａｃＩ制限部位
に下線を付す）。配列決定による確認後、ラットＧｎＴＩＩの触媒ドメインを、ｐＢＰ１
２４中のＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメントとして、ＰＭＡ１プロモーターの下流にクロー
ニングした。最終工程において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｎｎ２局在シグナルをコ
ードする遺伝子フラグメントを、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてｐＪＮ２８１か
らクローニングして、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインとのインフレーム融合物を生成し、プラ
スミドｐＴＣ５３を作製した。

（実施例１２）
（抗体機能性を高める二分しているＧｌｃＮＡｃを生成するためのＧｎＴＩＩＩのクロ
ーニングおよび発現）
Ｎ−アセチルグルコサミンをＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２構造へＮ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩにより付加することにより、いわゆる二分型
Ｎ−グリカンが生じる（図１５を参照のこと）。この構造は、抗体依存性細胞媒介性細胞
傷害（ＡＤＣＣ）に大きく関与していた（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０）。

二分型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を生成し得る酵母株のような宿主細胞を、本
発明に従って、その宿主細胞にＧｎＴＩＩＩ活性を導入することによって操作する。好ま
しくは、その宿主細胞を、必要に応じて、異種細胞のシグナル標的化ペプチドに（例えば
、本発明のライブラリーおよび関連した方法を用いて）融合したＧｎＴＩＩＩ（例えば、
図２４に示される、マウスのような哺乳動物のＧｎＴＩＩＩ）または酵素活性を有するそ
のドメインをコードする核酸分子で、形質転換する。

ＩｇＧは、２つの重鎖（図２２におけるＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）（これは
、３つのジスルフィド架橋を介してヒンジ領域に相互に連結される）、および２つの軽鎖
（図２２におけるＶ_Ｌ、Ｃ_Ｌ）からなる。その軽鎖（ドメインＶ_ＬおよびＣ_Ｌ）は、別の
ジスルフィド架橋により、重鎖のＣ_Ｈ１部分に、Ｃ_Ｈ１およびＶ_Ｈフラグメントと一緒に
連結され、いわゆるＦａｂ領域を構成する。抗原は、このＦａｂ領域の末端部分に結合す
る。ＩｇＧのＦｃ領域は、Ｃ_Ｈ３領域、Ｃ_Ｈ２領域およびヒンジ領域からなり、いわゆる
エフェクター機能の発揮を担う（以下を参照のこと）。

抗体の主な機能は、抗原への結合である。しかし、抗原に直接結合して、（例えば、細
菌毒素の場合のように）抗原を不活性化しない場合、いわゆるエフェクター機能が誘発さ
れなければ、単なる結合は意味がない。ＩｇＧサブクラスの抗体は、２つの主要なエフェ
クター機能を発揮する：補体系の活性化およびファゴサイトーシスの誘導である。補体系
は、炎症事象の制御、ファゴサイトーシスの活性化、および細胞膜の溶解による破壊に関
与する、血清タンパク質の複雑な群からなる。補体活性化は、Ｃ１複合体が２つのＩｇＧ
のＦｃ部分へ極めて近接して結合することで開始する。Ｃ１は、１つの分子Ｃ１ｑ、なｒ
びに２つの分子Ｃ１ｒおよびＣ１ｓからなる。ファゴサイトーシスは、ＩｇＧのＦｃフラ
グメントとＦｃ−γレセプター（図２２におけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩｌおよびＦｃγ
ＲＩＩＩ）との間の相互作用を介して開始される。Ｆｃレセプターは、免疫系のエフェク
ター細胞（特にマクロファージ、単球、骨髄細胞および樹状細胞）の表面に主に発現され
る。

そのＣ_Ｈ２部分は、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）において保存されたＮ−グリ
コシル化部位を有する。そのＡｓｎ２９７のＮ−グリカンは、非常に不均一であり、かつ
Ｆｃレセプター結合および補体活性化に影響を及ぼすことが公知である。ＩｇＧのごく少
数（すなわち、約１５〜２０％）が、脱シアル化されたＮ−グリカンを有し、３〜１０％
が、モノシアル化Ｎ−グリカンを有する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ（２００１）Ｂｉｏｐｈａｒ
ｍ．１４：１９−２６に総説されている）。興味深いことに、補体活性化およびＦｃレセ
プター結合が可能な十分に機能的な抗体に必要であることが示された最小のＮ−グリカン
構造は、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する五糖（ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３）で
ある（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｉｇ
Ｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ，２００１において総説されている）。Ａ
ｓｎ２９７においてＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３Ｎ−グリカン未満しか有さないかまたはＮ−
グリコシル化が全くない抗体は、なお抗原に結合し得るが、ファゴサイトーシスおよび補
体活性化のような重要な下流事象をほとんど活性化しないようである。さらに、Ａｓｎ２
９７に真菌型Ｎ−グリカンが結合した抗体は、おそらく、哺乳動物において免疫応答を誘
発し、抗体を治療タンパク質として役に立たなくする。

（ＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠いているマウスＧｎＴＩＩＩタンパク質の部分をコードするＤＮＡフ
ラグメントを、マウス（または他の哺乳動物）のゲノムＤＮＡから、順方向プライマー

（配列番号９４）および逆方向プライマー

（配列番号９５）を用いてＰＣＲ増幅する。これらのプライマーは、ＡｓｃＩ制限部位お
よびＰａｃＩ制限部位を含み、これらの部位は、リーダーライブラリーとの融合に適した
ベクターへのクローニングに使用され得る。

マウスＧｎＴＩＩＩの核酸配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）
は、図２４に示される。

（免疫グロブリンコード配列のクローニング）
抗体の可変領域のクローニングのためのプロトコル（プライマー配列を含む）は、以前
に公開されている。抗体源およびコード遺伝子は、とりわけ、インビトロで免疫されたヒ
トＢ細胞（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｃｋら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３９９５−３９９９を参照のこと）、末梢血リンパ球または単一
のヒトＢ細胞（例えば、Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ １８：８６２−８６９；およびＴｅｒｎｅｓｓら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．５６：１７−２７を参照のこと）およびヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランス
ジェニックマウス（これは、ハイブリドーマ細胞株の作製を可能にする）であり得る。

標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、抗体をコードする核酸配列を、クローニングし
得る。目的の免疫グロブリンをコードする遺伝情報の供給源は、代表的には、目的の細胞
からの総ＲＮＡ調製物（例えば、血液リンパ球またはハイブリドーマ細胞株）である。例
えば、特異的プライマーを使用するＰＣＲベースのプロトコルを使用することによって、
可変領域を、ＩｇＧ Ｃ_Ｈ１ドメイン部位にハイブリダイズする配列特異的プライマーお
よびおよびマウスκ定常領域のアミノ酸１１１〜１１８をコードする第２のプライマーか
ら開始される逆転写を介して、クローニングし得る。そのＶ_ＨおよびＶ_ＫのコードｃＤＮ
Ａは、次いで、以前に公開されているように増幅され得る（例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏら
（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２；Ｗｅｌｓｃｈ
ｏｆら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９：２０３−２１４；お
よびＯｒｌａｎｄｉら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：３８３３を参照のこと）。免疫グロブリン全体（重鎖および軽鎖）のクローニング手
順もまた、公開されている（例えば、Ｂｕｃｋｅｌら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５１：１３
−１９；Ｒｅｃｉｎｏｓら（１９９４）Ｇｅｎｅ １４９：３８５−３８６；Ｒｅｃｉｎ
ｏｓら（１９９５）Ｇｅｎｅ １５８：３１１−１２を参照のこと）。抗体フラグメント
のクローニングおよび生成ならびに抗体発現構築物のためのさらなるプロトコルは、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２０
０１）編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする真菌発現プラスミドが、記載されている
（例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｓａｌａｍら（２００１）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｒａｌ．５６：１５７−１６４；およびＯｇｕｎｊｉｍｉら（１９９９）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：５６１−５６７を参照のこと）。従っ
て、免疫グロブリンの定常領域を有する発現プラスミドが生成され得る。これらの発現ベ
クターへの可変領域のクローニングを容易にするために、適切な制限部位を、可変領域の
末端に極めて近く配置し得る。この定常領域は、可変領域が単一の制限消化／連結実験に
よってそれらにインフレームで容易に融合されうるように、構築され得る。図２３は、種
々のモジュール様式で設計されたそのような発現構築物の模式図を示し、プロモーター、
転写ターミネーター、組み込み標的化ドメインおよびさらに選択マーカーの容易な交換を
可能にする。

図２３に示されるように、選択されたＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインは、それぞれ、
Ｃ_Ｌ領域およびＣ_Ｈ領域とインフレームで容易にクローニングされ得る。最初の組み込み
を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ遺伝子座（または別の真菌細胞における相同な遺伝子
座）に標的化し、そのメタノール誘導性ＡＯＸプロモーターは発現を駆動する。あるいは
、任意の他の望ましい構成的プロモーターカセットまたは誘導性プロモーターカセットを
使用し得る。従って、望ましいのであれば、その５’ＡＯＸ領域および３’ＡＯＸ領域な
らびに転写ターミネーター（ＴＴ）フラグメントを、異なるＴＴ、プロモーター、および
組み込み標的化ドメインで容易に置き換えて、発現を最適化し得る。最初に、標準的なＫ
ＥＸプロテアーゼ部位を有するα因子分泌シグナルを使用して、重鎖および軽鎖の分泌を
容易にする。発現ベクターの特性を、標準的な技術を使用して、さらに洗練し得る。

Ｉｇ発現ベクター（例えば、上記のもの）は、ＧｎＴＩＩＩを、好ましくは、宿主細胞
のゴルジ装置において発現する、本発明の宿主細胞に導入される。このような宿主細胞に
おいて発現されるＩｇ分子は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。

（実施例１３）
（酵母株ＹＳＨ−１（Δｏｃｈ１，α１，２−マンノシダーゼ，ＧｎＴＩ）の生成）
以前に報告されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＫ６４（Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（９）：５０２２−７）（ＯＣＨ１ノッ
クアウトを有し、ヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）を発現する三重栄
養要求株（ＡＤＥ、ＡＲＧ、ＨＩＳ））を、宿主株として使用した。ＢＫ６４を、制限酵
素ＥｃｏＮＩで線状にしたプラスミドｐＰＢ１０３で形質転換して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを宿主細胞に導入し、このようにし
て、株ＰＢＰ−１を作製した。マウスＭｎｓＩを、制限酵素ＥｃｏＮＩで線状にしたプラ
スミドｐＦＢ８で形質転換することによってこの株に導入し、株ＰＥＰ−２を生成した。
株ＰＢＰ−２から単離されたタンパク質のＫ３グリカン分析により、存在する主な糖形態
がＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２であることが実証された。

ＰＢＰ−２を、その後、制限酵素ＡａｔＩＩで線状にしたヒトＧｎＴＩプラスミドｐＮ
Ａ１５で形質転換し、株ＰＢＰ−３を生成した。株ＰＢＰ−３において生成されたＫ３糖
形態の分析により、混成型グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が主な構造であ
ることが実証された。ＵＲＡ３マーカーをＰＢＰ−３から回収するために、この株を、５
−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ（５−ＦＯＡ，ＢｉｏＶｅｃｔｒａ）およびウラシル（Ｂｏ
ｅｋｅら．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６）を含む
最小培地での選択の前に、ＹＰＤ中で増殖させた。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２
糖形態を生成する、その回収されたＵｒａ−株を、ＹＳＨ−１と名付けた（図３６）。株
ＹＳＨ−１からのそのＮ−グリカンプロフィールを図２５（上）に示す。このプロフィー
ルは、１４６５ｍ／ｚにおける優勢なピークを示し、このピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ
_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］の質量に対応する。

（実施例１４）
（酵母株ＹＳＨ−３７（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現マンノシダーゼＩＩ）の作製）
ＹＳＨ−１（実施例１３）を、制限酵素ＡｐａＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）プラスミ
ド（ｐＫＤ５３）で形質転換し、株ＹＳＨ−３７（図３６）を作製した。ＹＳＨ−３７に
おいて産生されたＫ３グリカン構造の分析（図２５（下））は、１１４０ｍ／ｚにおいて
支配的な糖形態が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の質量に対応すること、
ならびに１３０３ｍ／ｚにおける他の糖形態ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］
、および１４６５ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］を示した。

（実施例１５）
（酵母株ＹＳＨ−４４の作製）
株ＹＳＨ−３７（実施例１４）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したラットＧｎＴＩＩ
／ＭＮＮ２（ｓ）リーダーをコードするプラスミド（ｐＴＣ５３）で形質転換した。得ら
れた株のＹＳＨ−４４（図３６）は、ポジティブモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に
よって１３５６ｍ／ｚ（これは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｘ］の質量に
対応する）における単一の糖形態を有する、Ｋ３ Ｎ−グリカンを産生した（図２９）。

（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化）
ＹＳＨ−４４由来のグリカンを、糖タンパク質から、以前に報告された方法（Ｐａｐａ
ｃら．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改
変によって、遊離させ、そして分離した。これらのタンパク質を還元し、そしてカルボキ
シメチル化し、そしてその膜をブロックした後に、ウェルを水で３回洗浄した。このタン
パク質を、１ミリ単位のＮ−グリカナーゼを含有する１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３（ｐＨ８
．３）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（３０μｌ）の添加によって、脱グリコシル
化した。３７℃で１６時間の消化後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によって除
去し、そして蒸発乾固させた。次いで、これらのグリカンを、ａＳＣ２１０Ａ ｓｐｅｅ
ｄ ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓａｖａｎｔ，Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で乾燥させた。こ
の乾燥させたグリカンを、３７℃で５０ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ（ｐＨ５．０）中に一晩置き、
そして１ｍＵのヘキソース（ｈｅｘｏｓ）（Ｇｌｙｃｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を添加し
た。

（実施例１６）
（プラスミドｐＪＮ ３４８の構築）
プラスミドｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ（Ｊｉｍ Ｃｒｅｇｇから）を、ＢａｍＨＩおよびＢｇ
ｌＩＩで消化して、ＡＯＸ発現カセットを遊離した。次いで、ｐＪＮ２６１由来のＧＡＰ
ＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットを含有するＢａｍＨＩフラグメント（図４Ｂ）（実施例４）
を、ｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ骨格に連結して、ｐＪＮ３３８を作製した。プラスミドｐＪＮ３
３８を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、そしてインビトロでアニーリングされた２つ
のオリゴヌクレオチド

（配列番号９６）および

（配列番号９７）を、開いた部位に連結して、ｐＪＮ３４８を作製した。

（実施例１７）
（組込みプラスミドｐＲＣＤ２５９の構築）
ＧＡＰＤＨ発現ベクターｐＪＮ３４８を含有するＰｐＵＲＡ３を、ＸｈｏＩで線状化し
、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）
で処理した。ＨＹＧ耐性マーカーを、ｐＡＧ３２から、ＢｇＩＩＩおよびＳａｃＩで消化
し、そして平滑化し、次いで、ｐＪＮ３４８に連結して、ｐＲＣＤ２５９を作製した。こ
のｐＲＣＤ２５９は、ＰｐＵＲＡ３遺伝子座において組み込むＨＹＧ発現ベクターとして
使用され得る。

（実施例１８）
（ＧｎＴＩＩＩ融合構築物の作製）
哺乳動物ＧｎＴＩＩＩと酵母標的化配列との間の融合構築物を、マウスＭｇａｔ３遺伝
子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３９３７３、Ｂｈａｕｍｉｋら、１９９５）を使用して作
製した。マウスＧｎＴＩＩＩ遺伝子のＮ末端決質Δ３２、Δ８６、およびΔ２１２に対応
する３つのＤＮＡフラグメントを、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を使用して、順方向プライマーＭＧ３−Ｂ

（配列番号９８）、ＭＧ３−Ｃ

（配列番号９９）、ＭＧ３−Ｄ

（配列番号１００）、および逆方向プライマーＭＧ３−Ａ

（配列番号１０１）を用いて、ＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ生成物を、次いで、ｐＪＮ３
４８ベクターにＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメントとしてクローニングし、配列決定した。
得られたベクターｐＶＡ（ＧｎＴＩＩＩΔ３２）、ｐＶＢ（ＧｎＴＩＩＩΔ８６）、およ
びｐＶＣ（ＧｎＴＩＩＩΔ２１２）を、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ酵素で消化し、酵母リーダー
ライブラリー（リーダー２０〜６７）との連結のために使用した。これらの標的化ペプチ
ドを、３２アミノ酸Ｎ末端欠失、８６アミノ酸Ｎ末端欠失、２１２アミノ酸Ｎ末端欠失を
有する、マウスＧｎＴＩＩＩから選択される触媒ドメインに融合する。例えば、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ２標的化ペプチド（長、中間および短）およびＫ．ｌ
ａｃｔｉｓに由来するＧＮＴＩ（中間および短）（実施例１１を参照のこと）を、表１１
に示す。

（表１１．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１においてＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を示す標的化ペプチド配列／触媒
ドメインの代表的なコンビナトリアルライブラリー）

（実施例１９）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓの操作）
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＰＢＰ−３
）（実施例８を参照のこと）を、５−ＦＯＡに対して対比選択し、それにより、ＵＲＡ３
＋マーカーおよびｕｒａ３−表現型の遺伝子座について選択する。この株（ＹＳＨ−１と
名付けた（図３６））を、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（Ｇｎ
ＴＩＩＩ）触媒ドメインのライブラリー（ベクターｐＶＡ、ｐＶＢ、およびｐＶＣ）なら
びにリーダーで形質転換した。形質転換体を、ＢＭＧＹ中で、ＯＤ６００＝約１０になる
まで３０℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモー
ターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノゲンのクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を
、９６ウェル形式を利用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験ロボットで
Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製
は、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコ
ルの適合形である（実施例３）。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離さ
せた（実施例３）。Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（実施例３）で分析した
。そのＧｎＴＩＩＩ活性を、表１１に示す。（＋）の数は、本明細書で用いられる場合、
中性グリカン％のうちの二分型Ｎ−グリカン生成の相対レベルを示す。標的化ペプチド配
列を、以下からなる群より選択した：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈａ
ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖ
ＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ
１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１
１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９
、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅ
ｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＭＮＮ６。二分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮ
Ａｃ_２）を示すそのｐＶＡ５３形質転換体を、ＰＢＰ２６と名付けた（図３６）。

（実施例２０）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ ＹＳＨ−４４の操作）
株ＹＳＨ−４４におけるＧｎＴＩＩＩの発現のために（図３６）、ベクターｐＶＡ５３
、ｐＶＢ５３、ｐＶＡ５４、およびｐＶＢ５４からのＧｎＴＩＩＩ構築物を、ＮｏｔＩ−
ＰａｃＩフラグメントとしてｐＲＣＤ２５９に移して、ベクターｐＰＢ１３５、ｐＰＢ１
３７、ｐＰＢ１３６、およびｐＰＢ１３８を作製した。そのベクターは、ＨＹＧ耐性マー
カーおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３遺伝子を、ゲノム組み込みのための標的化タ
ンパク質として含む。プラスミドをＳａｌＩで線状にし、株ＹＳＨ−４４にエレクトロポ
レーションによって形質転換し、ハイグロマイシンを含む培地で選択し、得られた株を、
精製Ｋ３から遊離されたグリカンの分析によりスクリーニングする。形質転換体を、ＢＭ
ＧＹ中、ＯＤ６００＝約１０になるまで２４℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、Ｂ
ＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノゲンのクリン
グル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、９６ウェル形式を利用して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉ
ｏＭｅｋ ２０００実験ロボットでＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって培
地から精製した（実施例３）。そのロボット精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される
、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコルの適合形である（実施例３）。そのＮ
−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた（実施例３）。Ｎ−グリカンを、Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した（実施例３）。二分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、
ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２）を示すｐＰＢ１３５形質転換体を、ＹＳＨ−５
７と名付けた（図３６）。表１１は、マウスＧｎＴＩＩＩの活性を示す。

（実施例２１）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ ＰＢＰ６−５の操作）
そのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５（実施例１１）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＭＮＮ２に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結したマウスＧｎＴＩＩＩ触
媒ドメイン（Ａ３２）をコードするプラスミドｐＰＢ１３５（表１１）で形質転換した。
形質転換体を、ＢＭＧＹ中で、ＯＤ６００が約１０になるまで３０℃で増殖させた。細胞
を遠心分離によって採取し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３
（ヒトプラスミノゲンのクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、９６ウェル形式を利
用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験ロボットでＮｉ−アフィニティー
クロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Ｎｏｖａｇｅｎに
よって提供される、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコルの適合形である（実
施例３）。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた（実施例３）。二
分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を示す形質
転換体を、ＰＢＰ−３８と名付けた（図３６）。表１１は、マウスＧｎＴＩＩＩの活性を
示す。

（実施例２２）
（操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７において基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５
ＧｌｃＮＡｃ_２を使用する、インビトロＧｎＴＩＩＩ活性のアッセイ）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７におけるあらゆる潜在的なエキソビボＧｎＴＩＩ
Ｉ活性を試験するために、細胞培養上清を、ＧｎＴＩＩＩ活性について試験した。Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７細胞を、ＢＭＧＹ中で２４℃でＯＤ６００＝約１０まで増
殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモー
ターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導した。
２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって回収して、本質的に透明な上清を得た。この
上清のアリコートを、ＧｎＴＩＩＩアッセイのために取り出し、そして残りを、分泌され
た可溶性Ｋ３の回収のために使用した。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２００
０実験室ロボットでの９６ウェル形式を利用するＮｉアフィニティークロマトグラフィー
によって、培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｂａｇｅｎによって、そ
のＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して提供されるプロトコルの適合形である（実施例３）。これ
らのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化（実施例３）によって遊離させた。先に取り出し
た上清のアリコートを、分泌されたＧｎＴＩＩＩ活性の存在について、さらに試験した。
ＰＢＰ−３株において発現されたＫ３から精製されたＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ
_２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶＡ５
３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）；ＹＳＨ−５７の上清＋１
ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ；（Ｄ）。室温で８時間のインキュベーション後、サンプル
を、アミノシリカＨＰＬＣによって分析して、ＧｎＴＩＩＩ活性の程度を決定した。

（実施例２３）
（操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７における、基質ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａ
ｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を用いるインビトロＧｎＴＩＩＩ活性アッセイ）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７におけるあらゆる潜在的なエキソビボＧｎＴＩＩ
Ｉ活性を試験するために、細胞培養上清を、ＧｎＴＩＩＩ活性について試験した。Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７細胞を、ＢＭＧＹ中で２４℃でＯＤ６００＝約１０まで増
殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモー
ターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導した。
２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって回収して、本質的に透明な上清を得た。この
上清のアリコートを、ＧｎＴＩＩＩアッセイのために取り出し、そして残りを、分泌され
た可溶性Ｋ３の回収のために使用した。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２００
０実験室ロボットでの９６ウェル形式を利用するＮｉアフィニティークロマトグラフィー
によって、培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｂａｇｅｎによって、そ
のＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して提供されるプロトコルの適合形である（実施例３）。これ
らのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化（実施例３）によって遊離させた。先に取り出し
た上清のアリコートを、分泌されたＧｎＴＩＩＩ活性の存在について、さらに試験した。
ＹＳＨ−４４株において発現されたＫ３から精製されたＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮ
Ａｃ_２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡ
ｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶ
Ａ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）。室温で８時間のイン
キュベーション後、サンプルを、アミノシリカＨＰＬＣによって分析して、ＧｎＴＩＩＩ
活性の程度を決定した。

（実施例２４）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＩＶのクローニングおよび発現）
ヒトＧｎＴＩＶタンパク質アイソエンザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）の、ＴＭドメインを欠
く部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトｃＤＮＡから、順方向プライマーＨＧＩ
Ｖ−２

および逆方向プライマーＨＧＩＶ−３

を使用してヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、配列決定した。リーダーライブラリーとの融
合物のために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、Ａｓ
ｃＩ制限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ
増幅した。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＨＧＩＶ−ＡＳＣ１

、ＨＧＩＶ−ＡＳＣ２

、ＨＧＩＶ−ＡＳＣ３

。ＰａｃＩ逆方向プライマーＨＧＩＶ−ＰＡＣ

。ヒトＧｎＴＩＶ Ａの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４１に示される。

同様に、ヒトＧｎＴＩＶタンパク質アイソエンザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）の、ＴＭドメ
インを欠く部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトｃＤＮＡから、順方向プライマ
ーＨＧＩＶＢ−２

および逆方向プライマーＨＧＩＶＢ−３

を使用してヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定した。リーダーライブラリーとの融合物の
ために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、ＡｓｃＩ制
限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し
た。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＨＧＩＶＢ−Ａ１

、ＨＧＩＶＢ−Ａ２

。ＰａｃＩ逆方向プライマーＨＧＩＶＢ−Ｐ

。ヒトＧｎＴＩＶ Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４２に示される。

（表１２．複数のアンテナを有する構造の発現のためのＧｎＴＶ融合構築物またはＧｎ
ＴＩＶ融合構築物を含む、プラスミド）

（実施例２５）
（トリアンテナグリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
複合グリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）を
、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）［ヌクレオチド１〜１０８］標的化ペプチ
ドにインフレームで連結されたヒトＧｎＴＩＶＢ触媒ドメイン（Δ１０４）をコードする
遺伝子フラグメントを含むプラスミドｐＰＢ１４４（表１２）で形質転換した。プラスミ
ドｐＰＢ１４４はまた、ＨＹＧ耐性マーカーと、ゲノム組み込みのための標的化配列とし
てのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３遺伝子とを含む。１μｇプラスミドを、ＳａｌＩを
用いて線状化し、エレクトロポレーションによって株ＹＳＨ−４４中に形質転換し、ハイ
グロマイシンを含む培地上で選択した。生じた株を、精製Ｋ３から遊離されたグリカンの
分析によってスクリーニングした。形質転換体を、ＢＭＧＹ中で３０℃にてＯＤ６００＝
約１００まで増殖させ、遠心分離によって収集し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プ
ロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノゲン由来のクリングル３）の生成を誘導し
た。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験室ロボットにて９６ウェル形
式を使用するＮｉアフィニティクロマトグラフィーによって、培地から精製した。このロ
ボット精製は、そのＨｉｓＢａｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって提供されるプロ
トコル（実施例３）の適合形である。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧアーゼ消化（実施例３
）によって遊離させた。そのＮ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（実施例３）を
用いて分析した。オリゴ糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）のＭａｎ
α１，３アーム上へのＧｌｃＮＡｃ残基の転移を示す形質転換体を、ＰＢＰ４３（図４７
）と名付けた。Ｎ−グリカンの分析により、１５４３ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｙ］
が提供され、これは、グリカンＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量と一致する
。

（実施例２６）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＶのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠くマウスＧｎＴＶタンパク質の一部（ＭＧＡＴ４５）をコードするＤ
ＮＡフラグメントを、順方向ＭＧＶ−２プライマー

および逆方向ＭＧＶ−３プライマー

を使用して、マウスｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして配列決定した。リーダーライブラリーと
の融合物のために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、
ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰ
ＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＭＧＶ−ＡＳＣ１

、ＭＧＶ−ＡＳＣ２

、ＭＧＶ−ＡＳＣ３

。ＰａｃＩ逆方向プライマーＭＧＶ−ＰＡＣ

。マウスＧｎＴＶの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４３に示される。

（実施例２７）
（ＧｎＴＶを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
複合グリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）を
、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）に由来する標的化ペプチドにインフレーム
で連結されたマウスＧｎＴＶ触媒ドメイン（Δ４５）をコードする遺伝子フラグメントを
含むプラスミドｐＰＢ１４０（表１２）で形質転換した。培養条件は、実施例２５と同じ
であった。２つの形質転換体由来のＫ３レポータータンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを
使用して分析した。１５５９ｍ／ｚにおけるピーク［ｙ］は、グリカンＧｌｃＮＡｃ_３Ｍ
ａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量と一致する（図４８）。１３５５ｍ／ｚにおけるピーク［ｕ
］は、グリカンＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量と一致する。

（実施例２８）
（糖タンパク質上でテトラアンテナ構造を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
テトラグリカン構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）を生成するＰ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３株（実施例２５）を、マウスＧｎＴＶをコードするプラ
スミドｐＰＢ１４０（図４０Ｂ）で形質転換した。このベクターｐＰＢ１４０は、ＫＡＮ
耐性マーカーと、ゲノム組み込みのための標的化配列としてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｈ
ＩＳ３遺伝子とを含む。１μｇのプラスミドを、ＫｐｎＩを用いて線状化し、エレクトロ
ポレーションによって株ＰＢＰ４３中に形質転換し、カナマイシンを含む培地上で選択し
た。生じた株を、精製Ｋ３から遊離されたグリカンの分析によってスクリーニングした。
培養条件は、実施例２５と同じであった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＫ３レポータータン
パク質の分析は、１７４７ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｚ］を示した。これは、テトラ
アンテナグリカンＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量と一致する（図４９）。
生じたグリカンのヘキソサミニダーゼ消化（実施例１５参照）によって、Ｍａｎ_３Ｇｌｃ
ＮＡｃ_２に対応するピークの質量が示された（データは示さない）。

第二の実験において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４を、ｐＰＢ１２８およびｐ
ＰＢ１４０（表１２）で形質転換した。Ｋ３レポータータンパク質を生成する形質転換体
のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる分析によって、１７４３ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｚ］
が示された。このピークは、テトラアンテナグリカンＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ
ｃ_２の質量と一致する（図５０）。

（実施例２９）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＩＸのクローニングおよび発現）
ヒトＧｎＴＩＸ（ＡＢ１０９１８５．１）の核酸配列およびアミノ酸配列が、図４５に
示される。ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＧｎＴＩＸの一部をコードするコドンを最
適化したＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを使用してオリゴヌクレオチドから合成した（図
４６）。ＧｎＴＩＸ触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結した。生じた
プラスミドｐＰＢ１７６（図４０Ｃ）を、ＫｐｎＩを用いて線状化し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）中に形質転換して、複合テトラアンテナグリカン構
造を生成した。培養条件は、実施例２５と同じであった。形質転換体由来のＫ３レポータ
ータンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して分析した。

図１Ａは、代表的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の模式図である。 図１Ｂは、代表的なヒトＮ−グリコシル化経路の模式図である。 図２は、融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への、標的化ペプチドフラグメントの挿入を示す。図２Ｂは、制限部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する産生された標的化ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変されたｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への、触媒ドメイン領域の挿入を示す。図２Ｄは、制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する、産生された触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、標的化ペプチドサブライブラリーおよび触媒ドメインサブライブラリーから産生された、１つの特定の融合構築物を示す。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号４８）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号４９）を示す。Ｎ末端短縮物を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号４８）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号４９）を示す。Ｎ末端短縮物を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有するヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）糖タンパク質の生成を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、標準的なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２＋Ｎａ^＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型からＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。示したＮ−グリカンは以下の通りである：Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］；Ｍａｎ_１０ＧｌｃＮＡｃ_２［ｅ］；Ｍａｎ_１１ＧｌｃＮＡｃ_２［ｆ］；Ｍａｎ_１２ＧｌｃＮＡｃ_２［ｇ］。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］の産生を生じるｏｃｈ１欠失を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のインビボトリミングの後の、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］としてのその同定と合致する、質量（ｍ／ｚ）１２５３を有するピークによって示される。 図６Ａ〜６Ｆは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の産生を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ａは、標準的なＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ａ］および標準物質としてのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２＋Ｎａ^＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型からＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］；Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］；Ｍａｎ_{１ ０}ＧｌｃＮＡｃ_２［ｅ］；Ｍａｎ_１１ＧｌｃＮＡｃ_２［ｆ］；Ｍａｎ_１２ＧｌｃＮＡｃ_２［ｇ］を産生するｏｃｈ１ノックアウト；およびＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の非産生を示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］〜Ｍａｎ_１２ＧｌｃＮＡｃ_２［ｇ］のうちで、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］が相対的に少量であることを示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）によって産生された他のグリカンＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］およびＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］に対して、有意な量のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）による分泌糖タンパク質ＩＦＮ−βにおける、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の優勢な産生を示す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］としてのその同定と一致する、質量（ｍ／ｚ）１２５４を含むピークによって示される。 図７は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換されたΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露の後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２標準物質（ポジティブコントロール）。 図８は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２標準物質（ポジティブコントロール）。 図９は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）培地Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＤＤ２８−３で形質転換されたΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは、上清中の活性を示す（ポジティブコントロール）。 図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］のいくらかの産生を生じるが、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ａ］の優勢な産生を生じるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターなしに、ヒトＧｎＴＩで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の優勢な産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩで形質転換された株（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。質量（ｍ／ｚ）１４５７での単一の突出したピークは、図１０Ｂに示されるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］としての同定と一致する。 図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたｐＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）によってコードされた異種マンノシダーゼ酵素のｐＨ最適値を示す。 図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの無細胞抽出物から遊離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む、野生型細胞から遊離されたＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から遊離されたＮ−グリカンを示し、これは、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］としてのその同定と一致して、１９０８における質量（ｍ／ｚ）の明瞭なピークを示す。図１２Ｃは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２と一致するピークに対応する、インビトロα−１，２−マンノシダーゼ消化後のｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から遊離されたＮ−グリカンを示す。 図１３は、ドリキル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）ピロリン酸結合オリゴ糖の構造の模式図である。 図１４は、ａｌｇ３活性、ａｌｇ９活性、またはａｌｇ１２活性を欠いている真菌宿主細胞に由来するＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の生成の模式図である。 図１５は、ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子型を有する真菌宿主細胞における哺乳動物型オリゴ糖構造を生成するために必要なプロセシング反応の模式図である。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１７は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３配列（配列番号２１）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号２２）を示す。 図１８は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列（配列番号２３）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号２４）配列を示す。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図２０は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３配列（配列番号３３）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号３４）配列を示す。 図２１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号３５〜４０）。 図２２は、ＩｇＧ免疫グロブリンのモデルを示す。重鎖および軽鎖は、類似する二次構造および三次構造に基づいて、ドメインにさらに分けられ得る。２つの重鎖（ドメインＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）は、３つのジスルフィド架橋を介して連結されている。それらの軽鎖（ドメインＶ_ＬおよびＣ_Ｌ）は、別のジスルフィド架橋によってその重鎖のＣ_Ｈ１部分へと連結され、Ｃ_Ｈ１フラグメントおよびＶ_Ｈフラグメントと一緒になって、Ｆａｂ領域を形成する。抗原は、そのＦａｂ領域の末端部分に結合する。エフェクター機能（例えば、Ｆｃ−γ−レセプター結合）は、そのＣ_Ｈ２ドメイン（そのヒンジ領域のすぐ下流にある）に局在化しており、その重鎖におけるアスパラギン２９７のＮ−グリコシル化によって影響を受ける。 図２３は、モジュラーＩｇＧ１発現ベクターの模式図である。 図２４は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ ＧｎＴ ＩＩＩの核酸配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。 図２５（上）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］の質量に対応する、１４６１ｍ／ｚにおいて優勢なピークを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。図２５（下）は、１１４０ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｂ］の質量に対応する優勢なピークを示し、１３０３ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ_４ＧｌｃＮＡｃ_２［ｃ］に対応する他のピーク、および１４６５ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］に対応する他のピークを示す、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。この株を、ＹＳＨ−３７と名付けた。 図２６（上）は、図２５（上）に示される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２６（下）は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］の質量に対応し、１６６６ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ａ］の質量に対応する。 図２７（上）は、図２５（上）に示される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２７（下）は、ｐＶＡ５５構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］の質量に対応し、１６６７ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ａ］の質量に対応する。 図２８（上）は、図２５（上）に示され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２８（下）は、ｐＶＢ５１構築物（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＧＮＴ１（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２［ｄ］の質量に対応し、１７２６ｍ／ｚにおける第二のピーク［ｅ］が観察され、この第二のピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の質量に対応しない。 図２９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３５６ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｘ］の質量に対応する。 図３０は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｘ］の質量に対応し、１５４２ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｙ］の質量に対応する。 図３１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｘ］の質量に対応する。 図３２は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｘ］の質量に対応し、１５４３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２［ｙ］の質量に対応する。 図３３は、上清中に細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を欠いている（ｐＶＡ５３）ことを実証する高速液体クロマトグラムを示す。ＰＢＰ−３株において発現されるＫ３から精製されたＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）；およびＹＳＨ−５７の上清＋１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｄ）。 図３４は、上清において細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を欠いている（ｐＶＡ５３）ことを実証する高速液体クロマトグラムを示す。ＹＳＨ−４４株において発現されるＫ３から精製されたＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；およびｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）。 図３５は、ヒトおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｓにおける通常のグリコシル化経路（パネルＡ）と、下等真核生物において操作されたヒト化Ｎ−グリコシル化経路（パネルＢ）とを比較する模式図である。その操作された経路は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ６−５の構築を示し、これは、ＧｎＴＩＩＩで改変された後にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ３８になる。 図３６は、指定のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の各々によって生成される優勢な分泌糖形態、およびそれらの株の各々を操作するために使用される遺伝子改変を示す、模式図である。 図３７は、ＧｎＴＩＩＩによって触媒される、ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物宿主細胞における糖タンパク質において生成されるオリゴ糖中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に転移する構造的模式図である。 図３８は、ＧｎＴＩＩによって触媒される、ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物宿主細胞における糖タンパク質において生成されるオリゴ糖中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に転移し、その後、ＧｎＴＩＩＩによって触媒される、その反応の生成物ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２にＧｌｃＮＡｃを転移する構造的模式図である。 図３９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、およびＧｎＴＩＸによって触媒される、オリゴ糖中間体上へのＧｌｃＮＡｃの転移を示す構造的模式図である。 図４０は、３つの例示的なプラスミド地図を示す。図４０Ａは、マウスＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１４４を示す。図４０Ｂは、ヒトＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１４０を示す。図４０Ｃは、宿主Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける形質転換のために使用されるマウスＧｎＴ ＩＸをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１７６を示す。 図４１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）（登録番号ＮＭ＿０１２２１４）をコードする遺伝子を示す。 図４１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）（登録番号ＮＭ＿０１２２１４）をコードする遺伝子を示す。 図４２は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）（登録番号ＮＭ＿０１４２７５）をコードする遺伝子を示す。 図４２は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）（登録番号ＮＭ＿０１４２７５）をコードする遺伝子を示す。 図４３は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｍｇａｔ５）（登録番号ＡＦ４７４１５４）をコードする遺伝子を示す。 図４３は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｍｇａｔ５）（登録番号ＡＦ４７４１５４）をコードする遺伝子を示す。 図４４は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（登録番号ＡＢ０４０６０８）をコードする遺伝子を示す。 図４４は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（登録番号ＡＢ０４０６０８）をコードする遺伝子を示す。 図４５は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ（登録番号ＡＢ１０９１８５．１）をコードする遺伝子を示す。 図４５は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ（登録番号ＡＢ１０９１８５．１）をコードする遺伝子を示す。 図４６は、ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの一部をコードする、コドンを最適化したＤＮＡフラグメントを示す。 図４６は、ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの一部をコードする、コドンを最適化したＤＮＡフラグメントを示す。 図４７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ヒトＧｎＴ ＩＶ融合構築物で形質転換された。１５４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量［ｙ］に相当する。 図４８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ３２において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ Ｖ融合構築物で形質転換された。１５５９におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量［ｙ］に相当する。 図４９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４６において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１５４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量［ｙ］に相当し、１７４７におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量［ｚ］に相当する。 図５０は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ９４において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ ＩＶＡ融合構築物を含むｐＰＢ１２８と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ Ｖ融合構築物を含むｐＰＢ１４０とで形質転換された。１７４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の質量［ｚ］に相当する。

Claims (51)

1. 下等真核生物宿主細胞中で糖タンパク質を生成するためのプロセスであって、
   該細胞中に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセチル
   グルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
   ーゼＶＩ活性、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性からなる
   群より選択されるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を導入する工程、
   を包含し、該糖タンパク質は、トリマンノースコア上に少なくとも３つのアンテナを含む
   、プロセス。
2. 下等真核生物宿主細胞中で糖タンパク質を生成するためのプロセスであって、
   該細胞において、ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇｌ
   ｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡ
   ｃβ１，４−Ａｓｎ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６
   （ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−Ｇｌｃ
   Ｎａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造；およびＧｌｃＮＡｃβ１，６Ｇｌ
   ｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇｌｃ
   ＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ
   β１，４−Ａｓｎ構造を含む、複数のアンテナを有するＮ−グリカンを生成する１つ以上
   の酵素活性を発現させる工程、
   を包含する、プロセス。
3. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記活性は、実質的に細胞内活性である、
   プロセス。
4. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離
   する工程をさらに包含する、プロセス。
5. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
   ｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉ
   ｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅ
   ｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ
   ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏ
   ｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ
   、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅ
   ｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
   ｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃ
   ｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎ
   ｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔ
   ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅ
   ｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａ
   ｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群
   より選択される、プロセス。
6. 請求項５に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
   、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐ
   ｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ
   ｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄ
   ｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａ
   ｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃ
   ｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎ
   ｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ ｓｐ．からなる群より選択される、プロセス。
7. 請求項６に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
   である、プロセス。
8. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記糖タンパク質は、治療タンパク質であ
   る、プロセス。
9. 請求項８に記載のプロセスであって、前記治療タンパク質は、ヒトプラミノゲンのクリン
   グルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターα
   鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、カイメー
   ス、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン
   放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、脈管内皮増殖因子２、骨髄
   前駆体阻害因子１、オステオプロテゲリン、α１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α
   −フェトタンパク質、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、プロ
   セス。
10. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活
    性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニ
    ルトランスフェラーゼＶＩ活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
    ＩＸ活性を含む、宿主細胞。
11. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活
    性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性を含む、宿主細胞。
12. 請求項１０または１１に記載の宿主細胞であって、前記活性は、実質的に細胞内活性であ
    る、宿主細胞。
13. 請求項１０または１１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、ＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ
    Ｖ活性、またはＧｎＴ ＶＩ活性と反応可能であるＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ
    ｃ_２構造を含むＮ−グリカンを生成する、宿主細胞。
14. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２オリゴ糖上に少なくとも３つの
    ＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを含む、宿主細胞。
15. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−グリカンは、少なくとも５０モル％、６
    ０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上のトリアンテナグリカンを含む、宿
    主細胞。
16. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−グリカンは、少なくとも７０モル％、８
    ０モル％、９０モル％以上のトリアンテナグリカンを含む、宿主細胞。
17. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃ
    β１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４
    −ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍ
    ａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１
    ，４−ＧｌｃＮａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造；およびＧｌｃＮＡｃ
    β１，６ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ
    １，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−
    ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造を含む、複数のアンテナを有するＮ−グリカンを含む
    、宿主細胞。
18. 請求項１０、１１、１４、または１７に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃ
    ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒ
    ｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａ
    ｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ
    、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ
    ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ
    ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐ
    ｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
    ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌ
    ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ａ
    ｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
    ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅ
    ｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ
    ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕ
    ｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、宿主細胞。
19. 請求項１８に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
    、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐ
    ｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ
    ｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄ
    ｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａ
    ｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃ
    ｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎ
    ｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ ｓｐ．からなる群より選択される、宿主細胞。
20. 請求項１９に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
    である、宿主細胞。
21. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｌｃＮＡｃβ１，４トランスフェラーゼもしくはＧｌ
    ｃＮＡｃβ１，６トランスフェラーゼによって改変された、トリマンノースコア（Ｇｌｃ
    ＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２）構造もしくはＭａｎ５コア構造（ＧｌｃＮａｃＭａｎ
    _５ＧｌｃＮＡｃ_２）を含む、宿主細胞。
22. 請求項２１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、７０モル％を超える前記改変型構造を
    生成する、宿主細胞。
23. 請求項２１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、９０モル％を超える前記改変型構造を
    生成する、宿主細胞。
24. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性
    およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性を含む、宿主細胞。
25. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、前記活性は、実質的に細胞内活性である、宿主細
    胞。
26. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、該細胞は、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、
    またはＧｎＴ ＩＸ活性と反応可能であるＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２を含む
    Ｎ−グリカンを生成する、宿主細胞。
27. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
    ーゼ活性は、複数のアンテナを有するグリカンを生成する、宿主細胞。
28. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性
    またはＧｎＴ ＩＸ活性と、マンノシダーゼＩＩ活性とを含む、宿主細胞。
29. 請求項２８に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
    Ｉ活性をさらに含む、宿主細胞。
30. 請求項２９に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
    ＩＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
31. 請求項２８に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
    Ｉ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、宿
    主細胞。
32. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
    １，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠損している、宿主細胞。
33. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
    Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮａｃ_２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラ
    ーゼ活性が欠損している、宿主細胞。
34. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
    α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
35. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
    ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをさらに含む、宿主細胞。
36. 請求項１に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
37. 請求項２に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
38. 請求項５に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
39. 請求項６に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
40. 請求項７に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
41. 請求項８に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
42. 請求項９に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
43. 糖タンパク質であって、下等真核生物宿主細胞において生成されたＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ
    _３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造上に、少なくとも３つのＧｌｃＮＡｃβ１，４残基または少な
    くとも３つのＧｌｃＮＡｃβ１，６残基を含む、糖タンパク質。
44. 糖タンパク質であって、下等真核生物宿主細胞において生成された基質ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍ
    ａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、基質ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、
    基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、基質Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２コア構
    造、基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造、または基質Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡ
    ｃ_２コア構造のＭａｎα１，３アームもしくはＭａｎα１，６アームのうちのいずれかに
    結合している、ＧｌｃＮＡｃβ１，４残基を含む、糖タンパク質。
45. 請求項４４に記載の糖タンパク質であって、前記コア構造のうちの７０モル％より多くが
    、ＧｎＴ ＩＶによって改変されている、糖タンパク質。
46. 請求項４４に記載の糖タンパク質であって、前記コア構造のうちの５０モル％より多くが
    、ＧｎＴ Ｖによって改変されている、糖タンパク質。
47. 請求項３６〜４６のうちのいずれか１項に記載の糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
48. 下等真核生物宿主においてＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、Ｇｎ
    Ｔ ＩＸ活性を発現可能である、ベクター。
49. 下等真核生物宿主細胞であって、トリマンノースコアオリゴ糖中間体のＭａｎα１，３ア
    ームまたはＭａｎ１，６アームのいずれかにて少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃ残基を有す
    るＮ−グリカンを含む、宿主細胞。
50. 請求項４９に記載の下等真核生物宿主細胞であって、前記トリマンノースコアオリゴ糖中
    間体のＭａｎα１，３アームおよびＭａｎ１，６アームにて２つのＧｌｃＮＡｃβ１，４
    残基をさらに含む、宿主細胞。
51. 請求項４９に記載の下等真核生物宿主細胞であって、前記トリマンノースコアオリゴ糖中
    間体のＭａｎα１，３アームおよびＭａｎ１，６アームにて２つのＧｌｃＮＡｃβ１，６
    残基をさらに含む、宿主細胞。