CN102712914A - 水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖 - Google Patents

Abstract

本文通过能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶描述了用于脱帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸残基的方法和遗传改造过的细胞。

Description

水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年9月29日提交的美国系列申请号61/246,847的优先权。在先申请的公开内容通过引用全文整合到本文中。

技术领域

本申请涉及水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接(linkage)的方法，更特别的涉及使用甘露糖苷酶水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接，脱帽糖蛋白上的磷酸-6-甘露糖残基。

背景

目前研发中的大部分生物药（例如，重组蛋白）的生产需要高性能的表达系统。许多这类生物药的生物学活性依赖于它们的翻译后修饰（例如，磷酸化或糖基化）。基于酵母的表达系统组合了遗传操作的简便与能够分泌和修饰蛋白质的微生物发酵组合。然而，在酵母细胞中生产的重组糖蛋白主要表现出异质的高甘露糖和超甘露糖聚糖结构，对蛋白质功能、下游加工和后续的治疗用途是有害的，特别是当糖基化作用发挥重要的生物学作用时。

美国系列申请号12/062,469通过引用全文整合。

概述

本发明至少部分的基于发现了能够水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶。藉此，甘露糖苷酶可用于获得还有脱帽末端甘露糖-6-磷酸残基的糖蛋白。本文中描述了获得此类糖蛋白的体外和体内方法。遗传改造过的细胞可用于方法中，生产具有脱帽末端甘露糖-6-磷酸残基的靶分子。

在一个方面，本文件的特征是脱帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸残基的方法。方法包括提供具有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的寡糖；和将寡糖与能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接触。接触步骤可以使用纯化的甘露糖苷酶、重组的甘露糖苷酶、含有所述重组的甘露糖苷酶的细胞裂解物，或者含有所述重组的甘露糖苷酶的真菌细胞来实施。甘露糖苷酶可以包括靶向序列。寡糖可以与蛋白质（例如，在真菌生物中表达的人蛋白）连接。

在另一个方面，本文件的特征是生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法。方法包括提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖；和向所述细胞导入编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生产包括所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。

本文件的特征还是在真菌生物中生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法。方法包括：提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖，且所述真菌细胞进一步包括编码靶蛋白的核酸；和分离具有所述末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，和/或经过遗传改造缺少OCH1活性。

本文件的特征还是经过遗传改造生产包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白的分离的真菌细胞。所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，其中甘露糖苷酶在真菌细胞中的表达产生了包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白。真菌细胞还可以包括编码靶糖蛋白的核酸。

在另一个方面，本文件的特征是解脂耶氏酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、Arxula adeninivorans、甲醇毕赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉细胞的基本纯的培养物，其大部分被遗传改造为生产包括末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白，所述细胞包括编码能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。

在本文描述的任何实施方案中，真菌生物可以是解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）或Arxula adeninivorans。真菌生物可以是甲基营养型酵母，例如毕赤酵母（Pichia pastoris）、甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）、Oogataeaminuta或多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）。真菌生物可以是丝状真菌（例如，选自浅蓝灰曲霉（Aspergillus caesiellus）、亮白曲霉（Aspergilluscandidus）、肉色曲霉（Aspergillus carneus）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）、弯头曲霉（Aspergillus deflectus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、Aspergillus penicilloides、局限曲霉（Aspergillus restrictus）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）、聚多曲霉（Aspergillus sydowi）、Aspergillus tamari、土曲霉（Aspergillus terreus）、焦曲霉（Aspergillus ustus）和花斑曲霉（Aspergillusversicolor）的丝状真菌）。

在本文描述的任何实施方案中，蛋白质可以是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。溶酶体蛋白可以是溶酶体酶（例如，与溶酶体贮积症（LSD）相关的溶酶体酶，如酸性α葡萄糖苷酶或α半乳糖苷酶）。LSD可以是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GM1-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病(Fabry’sdisease,mucopolysaccharidosis I,Farber disease,Gaucher disease,GM1-gangliosidosis,Tay-Sachs disease,Sandhoff disease,GM2 activator disease,Krabbe disease,metachromatic leukodystrophy,Niemann-Pick disease)、V型粘多糖病（Scheie disease）、II型粘多糖病（Hunter disease）、IV型粘多糖病（Sanfilippo disease）、莫奎欧氏症(Morquio disease)、VI型粘多糖病（Maroteaux-Lamy disease）、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco-

综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon氏病或Geleophysic发育不良。例如，LSD可以是庞贝氏症或费波瑞病(hyaluronidase  deficiency,aspartylglucosaminuria,fucosidosis,mannosidosis,Schindler disease,sialidosistype 1,Pompe disease,Pycnodysostosis,ceroid lipofuscinosis,cholesterol esterstorage disease,Wolman disease,Multiple sulfatase deficiency,galactosialidosis,mucolipidosis,cystinosis,sialic acid storage disorder,chylomicron retentiondisease with Marinesco-

syndrome,Hermansky-Pudlak syndrome,Chediak-Higashi syndrome,Danon disease,or Geleophysic dysplasia.Forexample,the LSD can be Pompe disease or Fabry’s disease)。

在本文描述的任何实施方案中，对于甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以包括与SEQ ID NO:50的1至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性（例如，至少95%或98%同一性）的氨基酸序列。

在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以包括以下氨基酸序列，所述序列具有（i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；（ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr,Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以是C.cellulans、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）或变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）的甘露糖苷酶。

在本文描述的任何实施方案中，真菌细胞可以进一步包括编码促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸（例如，MNN4多肽，如解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的多肽）和/或可以经过遗传改造缺少OCH1活性。例如，能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是毕赤酵母PNO1多肽。

在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以进一步包括分泌信号和/或靶向信号，将甘露糖苷酶靶向到胞内区室。靶蛋白和甘露糖苷酶可以是共同分泌的。

本文件的特征还是包含末端磷酸-6-甘露糖残基的分离的糖蛋白，其中蛋白是由本文描述的方法生产的。

在仍然另一个方面，本文件的特征是包含糖蛋白的组合物，其中糖蛋白上至少47%的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖残基。例如，糖蛋白上至少50%、75%、80%、85%或90%的N-聚糖可具有末端磷酸-6-甘露糖残基。

本文件的特征还是分离的核酸，所述核酸包括SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所述核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:14至少90%相同的核苷酸序列。本文件的特征还是这样的载体，所述载体包括与上述核酸有效连接的启动子，其中所述核酸编码甘露糖苷酶。核酸可以进一步包括分泌信号或靶向信号，将甘露糖苷酶靶向到胞内区室。

除非另外定义，则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等价的方法和材料可用于实践或测试本发明，但下文仍描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、

登录号和其他参考文献都通过引用全文整合到本文中。在发生冲突的情况下，由本申请，包括定义主导。材料、方法和实例都只是示例性的，并非意在限制。

根据下列详细的说明和权利要求，本发明的其他特征和优点是显而易见的。

附图简介

图1是pYLTmAX和pYLTmAXMnn4构建体的示意图。

图2是描述MTLY60Δoch1（Mnn4的1个野生型拷贝）、MTLY60Δoch1+Hp4dMnn4（1WT+Mnn4的1个额外拷贝）和MTLY60Δoch1+Hp4dMnn4+TEFMnn4的糖分析的一系列electroferogram。P表示单磷酸化峰。PP表示二磷酸化峰，而Man8表示Man₈GlcNAc₂峰。

图3是哺乳动物和酵母的聚糖磷酸化通路的示意图。哺乳动物的聚糖磷酸化通路涉及由GlcNAc磷酸转移酶催化向Man₈GlcNAc₂聚糖添加磷酸化-GlcNAc，然后通过剥离酶（uncovering enzyme）脱帽GlcNAc暴露磷酸。相反，酵母的聚糖磷酸化涉及向Man₈GlcNAc₂聚糖添加磷酸-甘露糖，但不存在内源性的酶脱帽甘露糖来暴露磷酸。

图4是描述源自菌株MTLY60Δoch1+Hp4dMnn4+TEFMnn4的N聚糖的一系列electroferogram，所述菌株用C.cellulans培养基的上清液处理了不同的时间段（7hr、8hr或过夜（ON））。

图5是描述源自MNN4过表达菌株的N聚糖的一系列electroferogram，所述菌株用C.cellulans上清液（SN）以及有或无磷酸酶（CIP）抑制剂处理过。

图6是在指定的MW的洗脱级分的吸光值单位（mAU）的图。每个洗脱级分含~500μl。

图7是在硅胶凝胶过滤（将250μl各级分DOC/TCA沉淀）的洗脱级分电泳后的SDS聚丙烯酰胺凝胶的展示。将框住的条带切出，使用串联质谱（MS/MS）进行肽质量指纹识别和重新测序。

图8A是编码CcMan1（即，C.Cellulans的甘露糖苷酶候选物）的核苷酸序列（SEQ ID NO:6）（在重叠群1003），CcMan1是在MS/MS重新测序中鉴别出的。图8B是CcMan 1的氨基酸序列（SEQ ID NO:7），包括信号序列（粗体）。没有信号肽的CcMan 1多肽的预测分子量是92.6kDa。

图9A是编码CcMan2的核苷酸序列（SEQ ID NO:8）（在重叠群774），图9B是包括信号序列（粗体）的CcMan 2的氨基酸序列（SEQ ID NO:9）。没有信号肽的CcMan 2多肽的预测分子量是121.6kDa。

图10A是编码CcMan3的核苷酸序列（SEQ ID NO:10）（在重叠群774），图10B是包括信号序列（粗体）的CcMan 3的氨基酸序列（SEQ ID NO:11）。没有信号肽的CcMan 3多肽的预测分子量是116kDa。

图11A是编码CcMan4的核苷酸序列（SEQ ID NO:12）（在重叠群1237），图11B是包括信号序列（粗体）的CcMan 4的氨基酸序列（SEQ ID NO:13）。没有信号肽的CcMan 4多肽的预测分子量是184kDa。

图12A是编码CcMan5的核苷酸序列（SEQ ID NO:14）（在重叠群896），图12B是包括信号序列（粗体）的CcMan5的氨基酸序列（SEQ ID NO:15），图12C是不包括信号序列的CcMan5的氨基酸序列（SEQ ID NO:50）。没有信号肽的CcMan 5多肽的预测分子量是173kDa。

图13含有用于表达CcMan1-5的表达质粒的实例，所述表达是在E.coli的细胞周质中（pET25-Man）、作为分泌蛋白在解脂耶氏酵母中（pYLPSecCcMan1-5）、作为靶向解脂耶氏酵母的分泌通路的蛋白质、被标记于N端（pYLPNtCcMan1-5）或被标记于C端（pYLPCtCcMan1-5）。

图14是用于在E.coli中表达的密码子优化过的CcMan1的核苷酸序列（SEQ ID NO:16）。

图15是用于在E.coli中表达的密码子优化过的CcMan2的核苷酸序列（SEQ ID NO:17）。

图16是用于在E.coli中表达的密码子优化过的CcMan3的核苷酸序列（SEQ ID NO:18）。

图17是用于在E.coli中表达的密码子优化过的CcMan4的核苷酸序列（SEQ ID NO:19）。

图18是用于在E.coli中表达的密码子优化过的CcMan5的核苷酸序列（SEQ ID NO:20）。

图19是pLSAH36和pLSH36载体的示意图，和用于将C.cellulans基因导入载体的克隆策略。

图20是描述表达CcMan4和CcMan5的E.coli细胞的细胞周质级分的分析的一系列electroferogram。分析是使用DNA测序仪辅助的、荧光团辅助的碳水化合物电泳（DSA-FACE）来实施的。第1和第2道分别代表右旋糖梯带和来自RNaseB的糖。第3道是未处理过的Mnn4糖，“P”对应单甘露糖磷酸化的Man₈GlcNAc₂峰，“PP”对应双甘露糖磷酸化的Man₈GlcNAc₂峰，儿“Man8”对应Man₈GlcNAc₂峰。4至9道是用Mnn4聚糖与标出的细胞周质孵育所获得的结果，有或无后续的胎牛肠磷酸酶（CIP）消化。

图21是Zhu等人，Nat.Chem.Biol.,6(2):125-32.Epub 2009 Dec 27(2010)描述的CcMan4（1759AA）和CcMan5（1650AA）与Bt3990（744AA）和Bt2199（739AA）甘露糖苷酶的示意性比对。

图22是描述从表达的E.coli细胞中获得的CcMan4和CcMan5酶分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE实施的，利用过表达MNN4的菌株来源的聚糖作为底物（被称为MNN4聚糖或MNN4糖）。第1道代表右旋糖梯带，第2道代表未处理过的Mnn4糖。在第3至第6道中，糖分别与以下孵育：不诱导的或在18℃用IPTG诱导过夜的CcMan4domain细胞周质级分，不诱导的或在18℃用IPTG诱导过夜的CcMan5domain细胞周质级分。最后一道代表来自RNaseB的糖。

图23是CcMan5_1-774的彩带状示意图。CcMan5_1-774由N端β-夹心结构域（8-271位残基；浅灰色）、α-螺旋接头（272-290位残基；黑色）和(αα)6桶状结构域（291-771位残基；深灰色）组成。催化性Ca2+显示为球状。

图24是CcMan5_1-774蛋白质骨架的彩带状示意图，其中骨架的侧链排列出以竖条表示的底物结合位点。碳、氧和氮原子分别着色为浅灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca²⁺离子和水W1、W2、W3和W4显示为球状。

图25是CcMan5_1-774蛋白质骨架的彩带状示意图，其中骨架的侧链排列出以竖条表示的底物结合位点和甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖（标记为Man-P-Man）的建模位置。碳、氧和氮原子分别着色为浅灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca²⁺离子和水W1、W2、W3和W4显示为球状（为了比较，仍然显示了将被底物O2和O3羟基取代的W2和W3的位置）。黄色、红色和黑色虚线分别表示含Ca2+的配位键、含假设的亲核水（W4）的H键和含-1位甘露糖和磷酸的H键。-1位甘露糖建模为其基态的椅式构像。在催化过程中，它的O2羟基将在Ca²⁺离子的赤道配位平面中占据比W2更近的位置，从而导致甘露糖-1环变形为半椅式构像，促进亲核水（W4）对C1碳（箭头）的线性攻击。

图26A是编码半乳糖苷酶A的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列，含粗体的lip2前序列和下划线的Myc His标签（SEQ ID NO:22）。图26B是α-半乳糖苷酶A的氨基酸序列，含粗体的lip2前序列和下划线的Myc His标签（SEQ ID NO:23）。

图27A是人α葡萄糖苷酶（GAA）的密码子优化的核苷酸序列，含粗体的lip2前序列（SEQ ID NO:24）。图27B是人GAA的氨基酸序列，含粗体的lip2前序列（SEQ ID NO:25），其中*表示终止密码子。

图28是用于克隆huGAA的解脂耶氏酵母表达载体的示意图。

图29是描述用源自E.coli细胞的细胞周质级分的CcMan5处理huGAA的分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE实施的。

图30是对CcMan5的最小催化中心的描述。用圆括号给出了SEQ IDNO:50中的等价残基的编号。1：Q(Q536)；2：N/D-E/Q(N588-Q589)；3：D/E(D355)；4：R(R405)；5：D/E-X-D/E(D660-X-D662)；6：G-G(G71-G72)；和7：T/S/G(T626)。

图31是使用MUSCLE（通过对数预期的多序列比较），对CcMan5的氨基酸序列（SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:15所述氨基酸序列没有信号肽）和它的10个同源物的比对。NP_630514链霉菌属，SEQ ID NO:26；ZP_02866543梭菌属（Clostridium），SEQ ID NO:27；NP_812442拟杆菌属（Bacteroides），SEQ ID NO:28；YP_003584502王祖农菌属（Zunongwangia），SEQ ID NO:29；YP_003120664噬几丁质菌属（Chitinophaga），SEQ ID NO:30；AAK22560柄杆菌属（Caulobacter），SEQ ID NO:31；ACL94075柄杆菌属，SEQ IDNO:32；ACT03290类芽孢杆菌属（Paenibacillus），SEQ ID NO:33；ACU59240噬几丁质菌属，SEQ ID NO:34；ACU05553土地杆菌属（Pedobacter），SEQ IDNO:35。

图32是使用MUSCLE对CcMan5的氨基酸序列（SEQ ID NO:50）和它的19个同源物的比对。链霉菌属NP_630514，SEQ ID NO:26；链霉菌属ZP_02866543，SEQ ID NO:36，ZP_06527366链霉菌属，SEQ ID NO:37；YP_003013376类芽孢杆菌属，SEQ ID NO:38；NP_812442拟杆菌属，SEQ IDNO:28；ZP_04848482拟杆菌属，SEQ ID NO:39；ZP_03677957拟杆菌属，SEQID NO:40；YP_003584502王祖农菌属，SEQ ID NO:29；ZP_01061975列文虎克菌属（Leeuwenhoekiella），SEQ ID NO:41；ZP_07083984鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），SEQ ID NO:42；YP_003120664噬几丁质菌属，SEQ IDNO:30；ZP_01885202土地杆菌属，SEQ ID NO:43；ZP_02866543梭菌属，SEQID NO:27；XP_367221稻瘟菌属（Magnaporthe），SEQ ID NO:44；ZP_07042437拟杆菌属，SEQ ID NO:45；ZP_05759807拟杆菌属，SEQ ID NO:46；ZP_05287524拟杆菌属，SEQ ID NO:47；ZP_06076108拟杆菌属，SEQ IDNO:48；YP_001302992 Parabacteroides，SEQ ID NO:49。

图33含有围绕CcMan5_1-774的活性位点的残基的结构坐标。

图34含有PDB入口2xsg中的两个CcMan5_1-774分子的不对称单元中的蛋白Cα原子和催化性Ca2+原子，描述了蛋白质的整体折叠。

详细说明

一般而言，本文件提供了水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接，产生具有脱帽的磷酸-6-甘露糖（M6P）残基的靶分子（例如，靶蛋白）的方法和材料。本文描述的方法和材料特别有效的用于产生治疗患有溶酶体贮积症（LSD）的患者的试剂），LSD是一大类遗传性的代谢功能障碍，其特征是由于涉及降解作用的异化酶活性受损，储藏产物在溶酶体中累积。储藏产物的积累导致细胞功能障碍和进行性的临床表现。可以通过酶替换疗法（ERT）校正异化酶的缺陷，只要所施用的酶可以靶向到疾病细胞的溶酶体中。溶酶体酶通常是在内质网（ER）中合成的糖蛋白，通过分泌通路运输到高尔基体中，然后被募集到溶酶体。溶酶体酶向溶酶体递送的一种方式是通过阳离子依赖性（CD）的甘露糖6-磷酸受体（MPR）。M6P末端的聚糖在跨高尔基体网络（TRN）中被2种MPR识别，介导溶酶体酶从分泌通路分选病将酶递送至溶酶体。使用本文描述的方法和材料，可以使用基于微生物的生产方法获得含脱帽M6P的聚糖的治疗性蛋白质，所述蛋白质可以利用同一M6P依赖性通路递送至溶酶体中。因而，本文描述的方法和材料可用于制备治疗代谢功能障碍的糖蛋白，例如LSD。

甘露糖苷酶

本文件提供了编码能够水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶多肽分离的核酸，以及能够水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的分离的甘露糖苷酶。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换的使用，指RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和含有核酸类似物的DNA（或RNA）。多核苷酸可以具有任何的三维结构。核酸可以是双链的或单链的（即，正义链或反义链）。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转运RNA、核糖体RNA、siRNA、微RNA、核酶、cDNA、重组的多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物，以及核酸类似物。

“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换的使用，意指任何肽键连接的氨基酸链，不论长度或翻译后修饰。通常，当本文描述的多肽（例如，甘露糖苷酶或具有脱掉的M6P残基的靶蛋白）按重量计构成制品中的总蛋白质的至少60%时，所述多肽是分离的，例如样品中60%的总蛋白。在一些实施方案中，本文描述的多肽由按重量计制品中至少75%、至少90%或至少99%的总蛋白构成。

“分离的核酸”指与存在于天然存在的基因组中的其他核酸分子分开的核酸，包括通常在天然存在的基因组（例如，酵母基因组）中位于核酸一侧或两侧的侧翼的核酸。术语“分离的”在本文中涉及核酸时，还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在的序列不可见于自然界，且在天然存在的基因组中没有直接连续的序列。

分离的核酸可以是例如DNA分子，只要去除或缺少了在紧靠天然存在的基因组中的DNA分子侧翼通常可见的一种核酸序列。因而，分离的核酸包括但不限于作为独立于其他序列的分隔的分子存在的DNA分子（例如，化学合成的核酸，或由PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段），以及整合到载体、自主复制的质粒、病毒（例如，任何的副粘病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或肝病毒）中或整合到原核细胞或真核细胞的基因组DNA中的DNA。此外，分离的核酸可以包括改造过的核酸，例如部分是杂合体或融合核酸的DNA分子。在例如cDNA文库或基因组文库中，或者含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片中，与数百至数百万种其他核酸共存的核酸不被认为是分离的核酸。

术语“外源性”在本文中涉及核酸和特定的宿主细胞时，指在自然界中可发现的特定细胞中不存在（且不能获得）的任何核酸。因而，非天然存在的的核酸一旦被导入宿主细胞中，则被认为是对宿主细胞外源性的。重要的是，应注意非天然存在的核酸可以含有自然界中发现的核酸序列的核酸子序列或片段，只要所述核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体中的含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因而一旦导入宿主细胞中，对宿主细胞就是外源性的，因为所述核酸分子作为整体（基因组DNA加载体DNA）不存在于自然界。因而，任何作为整体不存在于自然界中的载体、自主复制的质粒或病毒（例如，逆转录病毒、腺病毒或肝病毒）都被认为是非天然存在的核酸。由此可见，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA被认为是非天然存在的核酸，因为它们作为分隔的分子存在，不可见于自然界。还由此可见，任何含有启动子序列和多肽编码序列（例如，cDNA或基因组DNA）处于自然界中不可见的排列的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对特定的细胞而言可以是外源性的。例如，从酵母X的细胞中分离的完整染色体对于酵母y的细胞是外源性的核酸，只要所述染色体被导入酵母细胞中。

编码甘露糖苷酶的核酸可以与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所述的核苷酸序列至少70%序列同一性（例如，至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%或100%序列同一性）。在一些实施方案中，本文描述的核酸可以编码与SEQ ID NOs：7,9,11,13,15,50所述的氨基酸序列具有至少70%（例如，至少75,80,85,90,95,99或100%）同一性的甘露糖苷酶多肽。例如，核酸可以编码与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:50所述的氨基酸序列，或其一部分具有至少90%（例如，至少95或98%）同一性的甘露糖苷酶。例如，核酸可以编码与SEQ ID NO:50的1至774位残基具有至少90%同一性的甘露糖苷酶。如下确定特定的氨基酸序列和SEQ IDNO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:50所述氨基酸序列之间的百分比同一性。首先，使用含有BLASTP 2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2 Sequences（Bl2seq）程序比对氨基酸序列。该单机版BLASTZ可自Fish & Richardson的网站（例如，www.fr.com/blast/）或美国政府的国立生物技术信息中心的网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）获得。 解释如何使用Bl2seq程序的说明可见于BLASTZ所附的readme文件中。Bl2seq在两条氨基酸序列之间使用BLASTP算法实施比较。为了比较两条氨基酸序列，Bl2seq的选项设置如下：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件（例如，C:\seq1.txt）；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件（例如，C:\seq2.txt）；-p设为blastp；-o设为任何理想的文件名（例如，C:\output.txt）；所有其他选项都保持原有的默认设置。例如，可以使用下列命令产生含有两条氨基酸下列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-pblastp–o c:\output.txt。如果两条比较序列具有同源性，则设计的输出文件将展现比对序列的同源性区域。如果两条比较序列没有同源性，则设计的输出文件将不展现比对的序列。对于除使用blastn以外，对核酸序列遵循相似的程序。

一经比对，通过计数两条序列中都存在的相同氨基酸残基的位置数，来确定匹配数。通过将匹配数除以全长甘露糖苷酶多肽氨基酸序列的长度，再将获得的值乘以100，确定百分比同一性。例如，当与SEQ ID NO:7所述序列比对时具有700个匹配的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所述序列77.8%相同（即，700÷900*100=77.8）。

应注意，百分比同一性值四舍五入至最接近的十分之几。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入至78.2。还应注意，长度值总是整数。

应理解，多个核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域普遍已知的；即，对于许多氨基酸，有一个以上的核苷酸三联体作为所述氨基酸的密码子。例如，可以修饰给定的甘露糖苷酶多肽的编码序列中的密码子，使得获得在特定物种（例如，细菌或真菌）中的最佳表达。例如，可以将SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所述的核酸密码子优化用于E.coli表达，如图14-18所述（参见SEQ ID NOs:16-20）。

还可以使用杂交来评估两条核酸序列之间的同源性。本文中描述的核酸序列或其片段可用作根据标准杂交技术的杂交探针。目标探针（例如，含有一部分CcMan5核苷酸序列的探针）与来自测试来源的DNA或RNA的杂交是测试来源中存在与探针对应的DNA或RNA（例如，CcMan5核苷酸序列）的指针。杂交条件是本领域技术人员已知的，可见于Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6,1991中。中等的杂交条件定义为与以下条件等价的条件，即，30℃下在2X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中杂交，再在50℃下在1X SSC，0.1% SDS中洗涤。高严谨度的条件定义为与以下条件等价的条件，即，45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中杂交，再在65℃下在0.2X SSC，0.1% SDS中洗涤。

还可以基于本文描述的一部分C.cellulans甘露糖苷酶的三维结构（SEQID NO:50的1-774位残基，也称为CcMan5_1-774），来鉴别能够杂交寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶多肽。可以通过例如X射线衍射CcMan5_1-774的晶体，确定三维结构。CcMan5_1-774的结构坐标（例如，储藏在Protein Data Bank（世界范围的网站PDB.org中的PDB ID No.2xs下）中的CcMan5_1-774的坐标），图33中所述关于CcMan5的催化中心的坐标，或者图34中所述关于PDB入口2xsg中的两个CcMan5_1-774分子的不对称单元中的蛋白Cα原子和催化性Ca2+原子的坐标，可用于多种用途，包括但不限于表征能够水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶的三维结构，以及可视化、鉴别和表征这样的甘露糖苷酶区域，所述区域参与接受甘露糖-6-磷酸α,1-甘露糖（后文中称为Man-P-Man）作为底物并赋予所述酶水解Man-P-Man产生末端磷酸-6-甘露糖的能力。“结构坐标”是与分子或分子复合物中原子相对于其他原子的空间关系对应的笛卡尔坐标。结构坐标可使用X射线衍射技术或NMR技术获得，或者可以使用分子取代分析或同源性建模推断。各种软件程序允许图示结构坐标组，获得分子或分子复合物的三维展示。可以通过数学操作修饰由图33或图34提供的原始组得到本文描述的结构的结构坐标，例如通过倒置或整体加入或减去。由此，应认识到本发明的结构坐标是相对的，不以任何方式受图33或图34的实际x、y、z坐标的具体限制。

如实施例8所述，CcMan5_1-774的结构由两个结构域组成，N端的β-夹心结构域（SEQ ID NO:50的8-271位残基）和C端的(αα)6桶状结构域（SEQ IDNO:50的291-771位残基），通过α-螺旋接头（SEQ ID NO:50的272-290位残基）连接。两个结构域之间的界面产生了携带保守的催化性Ca2+离子的空洞形状，并产生-1底物结合位点（命名如Davies等人，Biochem.J.321:557-9(1997)所述）和催化中心的形状。SEQ ID NO:50的22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658、660和662位残基形成底物结合位点。

可以使用PDB ID No.2xs的结构坐标或图33所示的摘要（包括CcMan5_1-774的活性位点周围的残基）或图34所示的摘要（包括PDB入口2xsg中的两个CcMan51-774分子的不对称单元中的蛋白Cα原子和催化性Ca2+原子），部分或全部的表征CcMan5_1-774的三维结构，并描述蛋白质的整体折叠。例如，可以通过根据PDB ID No.2xs的7-771位氨基酸残基的结构坐标，±不超过

的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根误差，来表征CcMan5_1-774的三维结构。在一些实施方案中，CcMan5_1-774的三维结构包括根据PDB ID No.2xs的氨基酸的全部结构坐标，±不超过

的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根误差（例如，不超过

或

）。在本文中，“均方根误差”是偏离均值的方差平方的算数平均值的均方根，是表示本文所述结构坐标的偏差或方差的方式。本公开内容包括所有包含所示氨基酸残基的保守性取代的实施方案，所述保守性取代导致落入所述均方根误差范围内的相同结构坐标。

本文提供的结构坐标可用于表征甘露糖苷酶多肽的三维结构。根据此类结构，可以将底物结合位点例如通过计算机可视化、鉴别和表征，基于分子的表面结构、表面电荷、位阻排列、反应氨基酸的存在、疏水性或亲水性的区域等。为了使用本文所述结构产生的结构坐标，如图33、图34或PDB ID No.2xs所述，可以将相关的坐标展示为或转化为三维形状或图像呈现。能够从结构坐标组产生分子或其部分的三维图像呈现的软件程序是可商购的。可商购的软件程序实例包括但不限于以下的：GRID (Oxford University，Oxford，UK)；MCSS(Molecular Simulations，San Diego，CA)；AUTODOCK(ScrippsResearch Institute，La Jolla，CA)；DOCK(University of California，SanFrancisco，CA)；Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)；Ludi(MolecularSimulations，San Diego，CA)；QUANTA(Molecular Simulations，San Diego，CA)；Insight(Molecular Simulations，San Diego，CA)；SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)；和LEAPFROG(TRIPOS，Inc.，St.Louis，MO)。

本文描述的结构坐标可以用于标准的同源性建模技术，从而确定分子或分子复合物的未知三维结构。同源性建模涉及使用一个或多个相关蛋白质分子、分子复合物或其部分的结构坐标，构建未知的结构模型。同源性建模可以通过拟合蛋白质中被解析的三维结构与已知分子的同源性结构元件的三维结构中共同的或同源的蛋白质部分来进行，尤其是使用由本文的图33和34提供的相关（即，同源的）结构坐标。可以使用氨基酸序列同一性、同源的次级结构元件和/或同源的三级折叠，来确定同源性。同源性建模可以包括用已解析的相关结构替代氨基酸（或其他元件），重建部分或全部的三维结构。相应的，可以使用本文描述的CcMan5_1-774的三维结构生成未知分子的三维结构，并使用多种本领域普遍已知的技术细化。

基于本文描述的三维结构，可以在CcMan5_1-774或其他甘露糖苷酶的一些原子或侧基中产生取代，从而改善或修饰它的选择性。例如，CcMan5在536和588位含有非酸性残基，允许甘露糖苷酶的磷酸连接耐受在Man-P-Man底物中的异头氧。由此，可以将其他甘露糖苷酶中的相应残基变为非酸性残基，增加甘露糖苷酶接受Man-P-Man底物的能力。

可以通过分析核苷酸和多肽序列比对，鉴别适用于本文中的其他甘露糖苷酶多肽候选物。例如，在核苷酸或多肽序列的数据库中实施搜索，可以鉴别甘露糖苷酶多肽的同源物和/或类似物。序列分析可以涉及使用已知的甘露糖苷酶氨基酸序列对非冗余数据库进行BLAST、相互Reciprocal或PSI-BLAST分析。数据库中那些具有大于40%序列同一性的多肽可以鉴别为进一步评估作为甘露糖苷酶多肽适用的候选物。氨基酸序列相似性允许保守型氨基酸取代，例如用另一个疏水性残基取代一个疏水性残基，或者用另一个极性残基取代一个极性残基。需要时，可以人工检查此类候选物，从而缩小进一步评估的候选物数量。可以通过选择表现出具有这样的结构域的候选物，来实施人工检查，其中所述结构域被怀疑存在于能够水解末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶中，例如一个或多个（例如，1、2、3、4或更多个）保守的结构域或功能区（例如，底物结合空穴）。此类结构域可包括富含甘氨酸的基序GVGXXGXGG，其中X是Gly、Ser、Thr、Val、Ala、Cys或Gln（或其他具有小侧链的氨基酸）。该基序可见于SEQ ID NO:50的69-77位残基。该区域形成环，为-1甘露糖和酶的活性位点中的磷酸-结合子位点提供了关键性的氢键。

保守基序的另一个实例包括VRXE基序，其中Arg(R)与-1环，并可能与+1环形成氢键，Glu(E)处于与该R残基的盐键桥中，可能使该基序成形；而X是Trp或除Pro以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ ID NO:50的404-407位残基。

合适的基序还可以是X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr或Met，X₂是Thr、Ser或Asn。该基序可见于SEQ ID NO:50的534-538位残基。该基序中的Gln(Q)作为E是重要的，存在不具有水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的能力的甘露糖苷酶中。该基序中的Tyr(Y)被认为对+1位点形成而言是重要的。

此外，由SEQ ID NO:50的22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658、660和662位残基定义的区域形成了CcMan5的底物结合空穴。作为最低需求，G71、G72、D355、R405、Q536、N588、Q589、T626、D660、D662形成了催化中心，其中N588、Q589和D660参与协调催化性Ca2+离子，D662和D660参与活化亲核的水，Q536稳定跃迁状态过程中的异头氧，而G71、G71、D355、R405和T626参与-1位点的底物结合。参见图30关于最小催化中心的展示。由此，当位于最小的催化中心（例如，图30所述）的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内时，可以选择甘露糖苷酶作为能够水解末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的候选甘露糖苷酶。

保守基序还可以是在蛋白质的N端结构域中的GDXGN基序，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ ID NO:50的21-25位残基，形成酶的部分底物结合口袋，如图24所示。特别的是，D和N的侧链框出了底物结合空穴，并可能形成结合+1甘露糖的备选子口袋。

如实施例14所述，在多肽序列的数据库中实施搜索在下了生物中鉴别出CcMan5的同源物：天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）（GenBank登录号：NP_630514）、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）（GenBank登录号：ZP_05522540）、变铅青链霉菌（GenBank登录号：ZP_06527366）、螺状梭菌（Clostridium spiroforme）（GenBank登录号：ZP_02866543）、多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）（GenBank登录号：NP_812442）、Zunongwangia profunda（GenBank登录号：YP_003584502)；Chitinophagapinensis（GenBank登录号：YP_003120664）；类芽孢杆菌属（GenBank登录号：YP_003013376）；拟杆菌属（GenBank登录号：ZP_04848482）；Bacteroidescellulosilyticus（GenBank登录号：ZP_03677957)；Leeuwenhoekiella blandensis（GenBank登录号：ZP_01061975)；Sphingobacterium spiritivorum（GenBank登录号：ZP_07083984)和土地杆菌属（GenBank登录号：ZP_01885202）。天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中的甘露糖苷酶是相似的（与CcMan5 GH92结构域66%序列同一性，在765个BLASTP比对的残基中有501个相同），不仅在上述基序而且在三维结构的许多环中。

可以通过标准技术生产编码甘露糖苷酶多肽的分离的核酸分子。例如，可以使用聚合酶连锁反应（PCR）技术获得含有本文所述核苷酸序列的分离的核酸。PCR可用于从DNA以及RNA中扩增特定的序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。一般而言，来自目标区域末端或远端的序列信息被用于设计与待扩增的模板的反向链序列相同或相似的寡核苷酸引物。还可以利用多种PCR对策，其中可以位点特异性的核苷酸序列修饰导入模板核酸中。还可以化学合成分离的核酸，不论是作为单个核酸分子（例如，使用phosphoramidite技术按3’至5’方向用自动化DNA合成）或作为一系列的寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一个或多个成对的长寡核苷酸（例如，>100个核苷酸），其中每一对含有互补的短片段（例如，约15个核苷酸），使得将寡核苷酸对退火时形成二聚体。使用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每个寡核苷酸对获得单个双链核酸分子，之后可连接成载体。本发明的分离的核酸还可以通过诱变例如天然存在的DNA而获得。

本文件还提供了本文描述的甘露糖苷酶的（i）生物学活性的变体和（ii）生物学活性的片段或其生物学活性的变体。相对于SEQ ID NOs：7、9、11、13、15或50所述的序列，甘露糖苷酶的生物学活性的变体可以含有添加、删除或取代。含取代的蛋白一般具有不超过50个（例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个）保守氨基酸取代。保守取代是用具有相似特征的另一个氨基酸取代一个氨基酸。保守取代包括以下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中的一个成员被另一个同组成员的任意取代都可视为保守取代。相反，非保守取代是用具有不相似特征的另一个氨基酸取代一个氨基酸。图31和32所述的序列比对提供了进行多个氨基酸取代的实例。

缺失变体可以缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸片段（2个或多个氨基酸）或非连续的单个氨基酸。

添加（添加变体）包括这样的融合蛋白，所述融合蛋白含有：（a）SEQID NOs：7、9、11、13或15所述甘露糖苷酶，或其片段；和（b）内部或末端（C或N）的不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语“异源的氨基酸序列”指除（a）以外的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列（例如，FLAG、多聚组氨酸（例如，六组氨酸）、gluttanin（HA）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）或麦芽糖结合蛋白（MBP））。异源序列还可以是用作诊断的蛋白或可检测的标志物，例如，荧光素酶、绿色荧光蛋白（GFP）或氯霉素乙酰转移酶（CAT）。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞（例如，酵母宿主细胞）中，可以通过使用异源信号序列增加靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有载体（例如，KLH，可用于例如引发免疫应答产生抗体），或者内质网或高尔基体细胞器的滞留信号。异源序列的长度可以改变，在一些情况下可以是比异源序列连接的全长靶蛋白更长的序列。

甘露糖苷酶的生物学活性片段或生物学活性变体具有野生型、全长、成熟蛋白质的至少40%（例如，至少50%；60%；70%；75%；80%；85%；90%；95%；97%；98%；99%；99.5%或100%或甚至更高的）甘露糖苷酶活性（例如，脱帽M6P残基）。例如，甘露糖苷酶的生物学活性片段可含有SEQ IDNO:50的1-774位残基。

本文描述的甘露糖苷酶可用于生产具有脱帽末端磷酸-6-甘露糖（M6P）残基的分子（例如，靶蛋白）。方法可以在体外或体内实施。

脱帽(uncapping)M6P残基的体外方法

本文描述的甘露糖苷酶可以是重组生产的，用于在体外脱帽/打开(uncapping)寡糖上的M6P残基。为了重组生产甘露糖苷酶，使用含有与编码甘露糖苷酶多肽的核酸有效连接的启动子的载体。在本文中，“启动子”指能够使基因转录的DNA序列。启动子被RNA聚合酶识别，之后起始转录。因而，启动子含有被RNA聚合酶直接结合或涉及募集RNA聚合酶的DNA序列。启动子序列还可以包括“增强子区”，这是一个或多个可以结合蛋白质（即，反式作用因子，大部分类似转录因子）来增强基因簇中的基因转录水平（由此得名）的DNA区域。增强子通常位于编码区的5’区，也可以与启动子序列分隔，例如可以位于基因的内含子区域或基因编码区的3’。

在本文中，“有效连接”意指整合到遗传构建体（例如，载体）中，使得表达控制序列有效的控制目标编码序列的表达。

可以将表达载体导入宿主细胞（例如，通过转化或转染）中，用于表达编码的多肽，之后可以纯化所述多肽。可用于小规模或大规模生产甘露糖苷酶多肽的表达系统包括但不限于微生物，例如用含有核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌（例如，E.coli），和用含有核酸分子的重组真菌表达载体转化的真菌（例如，酿酒酵母、解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、毕赤酵母、多形汉逊酵母或曲霉）。有效的表达系统还包括用含有核酸分子的重组病毒表达载体（例如，杆状病毒）感染的昆虫细胞系统，和用含有核酸分子的重组病毒表达载体（例如，烟草花叶病毒）感染的或用重组质粒表达载体（例如，Ti质粒）转化的植物细胞细胞。还可以使用哺乳动物表达系统生产甘露糖苷酶多肽，所述表达系统包括锚定了重组表达构建体的细胞（例如，永生化细胞系，如COS细胞、中华田鼠卵巢细胞、Hela细胞、人胎肾293细胞和3T3 L1细胞），所述构建体沿着本文描述的核酸含有源自哺乳动物细胞基因组（例如，金属硫蛋白启动子）或来自别哺乳动物病毒（例如，腺病毒晚期启动子和巨细胞病毒启动子）的启动子。

通常，用帮助纯化蛋白质的异源氨基酸序列标记重组的甘露糖苷酶多肽，例如FLAG、多聚组氨酸（例如，六组氨酸）、gluttanin（HA）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）或麦芽糖结合蛋白（MBP）。纯化蛋白质的其他方法包括层析技术，例如离子交换层析、疏水和逆向层析、尺寸排阻层析、亲和层析、疏水电荷诱导层析等（参见例如，Scopes,Protein Purification：Principlesand Practice，第3版，Springer-Verlag,New York(1993)；Burton和Harding,J.Chromatogr.A 814:71-81(1998)）。

为了在体内生产具有脱帽末端M6P的分子，在合适的条件下将含有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的靶分子与纯化的甘露糖苷酶或含有重组生产的甘露糖苷酶的细胞裂解物接触。细胞裂解物可来自遗传改造过的细胞，包括真菌细胞、植物细胞或动物细胞。动物细胞的非限制性实例包括线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物和哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、田鼠、沙鼠、狗、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人。在将靶分子（例如寡糖或糖蛋白）与纯化的甘露糖苷酶或含有重组生产的甘露糖苷酶的细胞裂解物接触的基础上，甘露糖苷酶水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接，并产生具有一个或多个脱帽末端M6P残基的靶分子。实施例2中描述的方法可用于确定是否已经脱帽了末端M6P残基。在通过甘露糖苷酶加工后，可以分离已脱帽末端M6P残基的靶分子。

用于获得细胞裂解物并保持裂解物中的甘露糖苷酶的活性或完整性的合适方法可以包括使用恰当的缓冲液和/或抑制剂，包括保持或使细胞裂解物中的N糖基化活性变化最小化的核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂。此类抑制剂包括例如螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙二醇二（P-氨乙基乙酯）N,N,N1,Nl-四乙酸（EGTA），蛋白酶抑制剂例如苯甲基磺酸氟化物（PMSF）、aprotinin、leupeptin、antipain等，磷酸酶抑制剂如磷酸盐、氟化钠、钒酸盐等。获得含有酶活性的裂解物的恰当缓冲液和条件描述在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47),John Wiley & Sons,New York(1999)；Harlow和Lane,Antibodies：A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)；Harlow和Lane,Using Antibodies：A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press(1999)；Tietz Textbook of Clinical Chemistry，第3版，Burtis和Ashwood编著，W.B.Saunders,Philadelphia,(1999)中。

需要时，可以进一步加工细胞裂解物，消除或最小化存在的干扰物质。需要时，可以通过多种本领域技术人员普遍已知的方法将细胞裂解物分级，包括亚细胞分级，和层析技术，例如离子交换层析、疏水和逆向层析、尺寸排阻层析、亲和层析、疏水电荷诱导层析等。

在一些实施方案中，可以制备细胞的细胞器仍然完整和/或有功能的细胞裂解物。例如，含有一个或多个完整的粗面内质网、完整的光面内质网或完整的高尔基体配置的裂解物。制备含有完整的细胞器和用于测试细胞器功能性的裂解物的合适方法描述在例如：Moreau等人，(1991)J.Biol.Chem.266(7):4329-4333；Moreau等人，(1991)J.Biol.Chem.266(7):4322-4328；Rexach等人，(1991)J.Cell Biol.114(2):219-229；和Paulik等人，(1999)Arch.Biochem.Biophys.367(2):265-273中。

靶分子在本文中指任何含有末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的分子，或者当在真菌来源的细胞中表达时，含有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的任何分子。合适的靶分子包括病原体蛋白，例如破伤风类毒素或白喉类毒素；病毒表面蛋白，例如巨细胞病毒（CMV）糖蛋白B、H和gCIII，人免疫缺陷病毒（HIV-1）衣壳糖蛋白，劳氏肉瘤病毒（RSV）衣壳糖蛋白，单纯疱疹病毒（HSV）衣壳糖蛋白，Epstein Barr病毒（EBV）衣壳糖蛋白，varicella-zoster病毒（VZV）衣壳糖蛋白，人乳头瘤病毒（HPV）衣壳糖蛋白，流感病毒糖蛋白和肝炎家族表面抗原；溶酶体蛋白（例如，酸性α葡萄糖苷酶、α半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、脑苷脂酶或半乳糖脑苷脂酶）；胰岛素；胰高血糖素；生长因子；细胞因子；趋化因子；和抗体或其片段。生长因子包括例如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、骨形态发生蛋白（BMP）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、神经生长因子（NGF）、神经营养素、血小板来源的生长因子（PDGF）、红细胞生成素（EPO）、Thrombopoietin（TPO）、Myostatin（GDF-8）、生长分化因子-9（GDF9）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF2）、表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）。细胞因子包括例如白介素，如IL-1至IL-33（例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13或IL-15）。趋化因子包括例如I-309、TCA-3、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1γ、Eotaxin、MCP-5、MCP-4、NCC-1、Ckβ10、HCC-1、Leukotactin-1、LEC、NCC-4、TARC、PARC或Eotaxin-2。还包括肿瘤糖蛋白（例如，肿瘤相关抗原），例如，癌胚抗原（CEA）、人粘液素、HER-2/neu和前列腺特异性抗原（PSA）（Henderson和Finn,Advances in Immunology,62,pp.217-56(1996)）。

在一些实施方案中，靶蛋白可以是与溶酶体贮积症相关的，所述靶蛋白包括例如酸性α葡萄糖苷酶、α半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、α-N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸(iduronate)-2-硫酸酯酶、α-葡萄糖胺-N-乙酰转移酶、β-D-葡萄糖酸酶、透明质酸酶、α-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸苷酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、神经磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。

在一些实施方案中，靶蛋白是融合蛋白，其中靶蛋白与另一种多肽序列、或与聚合物、载体、佐剂、免疫毒素或可检测的部分（例如，荧光素、冷光素或放射性）融合。例如，靶蛋白可以与聚合物（例如，聚乙二醇）连接，增加小蛋白的分子量和/或增加循环驻留时间。

脱帽M6P残基的体内方法

本文描述的遗传改造过的细胞可用于生产含有脱帽M6P残基的靶分子。例如，基于细胞的方法可以包括导入遗传改造过的真菌细胞中，使得包括编码甘露糖苷酶的核酸、编码靶分子的核酸，其中细胞生产含有脱帽末端M6P残基的靶分子。在一些实施方案中，编码甘露糖苷酶和靶分子的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和靶分子共同分泌。

本文描述的遗传改造过的细胞含有编码甘露糖苷酶的核酸，可用于产生一种或多种具有脱帽末端M6P残基的靶分子。适合体内生产脱帽末端M6P残基的细胞可以是真菌来源的，包括解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、甲基营养型酵母（例如，假丝酵母属、汉逊酵母属、Oogataea、毕赤酵母属或隐球酵母属的甲基营养型酵母）或者曲霉属、木霉属、链胞霉属、镰刀霉属或金孢子菌属的丝状真菌。示例性的真菌物种包括但不限于Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia canadensis、Pichia carsonii、Pichia farinose、Pichiafermentans、Pichia fluxuum、Pichia membranaefaciens、Pichiamembranaefaciens、Candida valida、Candida albicans、Candidaascalaphidarum、Candida amphixiae、Candida Antarctica、Candida atlantica、Candida atmosphaerica、Candida blattae、Candida carpophila、Candidacerambycidarum、Candida chauliodes、Candida corydalis、Candida dosseyi、Candida dubliniensis、Candida ergatensis、Candida fructus、Candida glabrata、Candida fermentati、Candida guilliermondii、Candida haemulonii、Candidainsectamens、Candida insectorum、Candida intermedia、Candida jeffresii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、Candida lyxosophila、Candida maltosa、Candida membranifaciens、Candida milleri、Candidaoleophila、Candida oregonensis、Candida parapsilosis、Candida quercitrusa、Candida shehatea、Candida temnochilae、Candida tenuis、Candida tropicalis、Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantium、Candida sojae、Candidaviswanathii、Candida utilis、Oogataea minuta、Pichia membranaefaciens、Pichiasilvestris、Pichia membranaefaciens、Pichia chodati、Pichia membranaefaciens、Pichia menbranaefaciens、Pichia minuscule、Pichia pastoris、Pichiapseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichiasilvestrisi、Pichia strasburgensis、Pichia terricola、Pichia vanriji、PseudozymaAntarctica、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Saccharomycesbayanus、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces momdshuricus、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces bisporus、Saccharomyces chevalieri、Saccharomyces delbrueckii、Saccharomyces exiguous、Saccharomyces fermentati、Saccharomyces fragilis、Saccharomyces marxianus、Saccharomyces mellis、Saccharomyces rosei、Saccharomyces rouxii、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces willianus、Saccharomycodes ludwigii、Saccharomycopsis capsularis、Saccharomycopsisfibuligera、Saccharomycopsis fibuligera、Endomyces hordei、Endomycopsisfobuligera.Saturnispora saitoi、Schizosaccharomyces octosporus、Schizosaccharomyces pombe、Schwanniomyces occidentalis、Torulasporadelbrueckii、Torulaspora delbrueckii、Saccharormyces dairensis、Torulasporadelbrueckii、Torulaspora fermentati、Saccharomyces fermentati、Torulasporadelbrueckii、Torulaspora rosei、Saccharomyces rosei，Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces rosei、Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces delbrueckii、Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces delbrueckii、Zygosaccharomycesmongolicus、Dorulaspora globosa、Debaryomyces globosus、Torulopsis globosa、Trichosporon cutaneum、Trigonopsis variabilis、Williopsis californica、Williopsissaturnus、Zygosaccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces bisporus、Debaryomyces disporua.Saccharomyces bisporas、Zygosaccharomycesbisporus、Saccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、Zygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces barkeri、Saccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces major、Saccharomyces rousii、Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia Canadensis、Pichia carsonii、Pichiafarinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichia membranaefaciens、Pichiapseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium toruloides、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bisporus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces chevalieri、Saccharomycesdelbrueckii、Saccharomyces fermentati、Saccharomyces fragilis、Saccharomycodes ludwigii、Schizosaccharomyces pombe、Schwanniomycesoccidentalis、Torulaspora delbrueckii、Torulaspora globosa、Trigonopsisvariabilis、Williopsis californica、Williopsis saturnus、Zygosaccharomycesbisporus、Zygosaccharomyces mellis或Zygosaccharomyces rouxii。示例性的丝状真菌包括曲霉的多个物种，包括但不限于Aspergillus caesiellus、白曲霉（Aspergillus candidus）、肉色曲霉（Aspergillus carneus）、棒曲霉（Aspergillusclavatus）、弯头曲霉（Aspergillus deflectus）、黄曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）、构巢曲霉、黑曲霉、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、米曲霉、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus )、Aspergillus penicilloides、局限曲霉（Aspergillus restrictus)、酱油曲霉、Aspergillus sydowi、Aspergillustamari、土曲霉（Aspergillus terreus）、焦曲霉(Aspergillus ustus）或采色曲霉（Aspergillus versicolor）。在如本文所述的遗传改造前的此类细胞可以从多个商业来源和研究资源机构中获得，例如美国典型培养物收藏中心（Rockville，MD）。靶分子包括蛋白质，例如本文所述的任何靶蛋白（见上文）。

除编码甘露糖苷酶的外源性核酸外，遗传改造过的细胞可以包括一个或多个遗传修饰，例如：（i）删除了编码外部链延伸（OCH1）蛋白的内源性基因；（ii）导入编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的重组核酸（例如，来自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽），增加甘露糖残基的磷酸化；（iii）导入或拨打干扰OCH1蛋白功能性表达的RNA分子；（iv）导入编码具有N-糖基化活性的野生型（例如，内源性或外源性）蛋白质的重组核酸（即，表达具有N-糖基化活性的蛋白质）；（v）导入编码上述靶分子的重组核酸；或（v）改变一个或多个编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源性基因的启动子或增强子元件，从而改变其编码的蛋白质的表达。RNA分子包括例如小干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）、反义RNA或微RNA（miRNA）。遗传改造还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源性基因，产生具有添加（例如，异源序列）、删除或取代（例如，突变如点突变；保守或非保守突变）的蛋白质。突变可以是特异性导入的（例如，通过定点诱变或同源重组）或者可以是随机导入的（例如，可以化学诱变细胞，如中所述Newman和Ferro-Novick(1987)J.CellBiol.105(4):1587）。

本文所述的遗传修饰可以导致一种或多种的（i）在遗传改造过的细胞中，一种或多种活性的增加，（ii）在遗传修饰过的细胞中，一种或多种活性的减少，或（iii）在遗传修饰过的细胞中，一种或多种活性的定位或胞内分布改变。可以理解，特定活性的量的增加（例如，促进甘露糖基磷酸化）可能是由于过表达一种或多种能够促进甘露糖基磷酸化的蛋白质，内源性基因拷贝数的增加（例如，基因复制），或内源性基因的启动子或增强子的改变，刺激由基因编码的蛋白质的表达增加。一种或多种特定活性的减少可能是由于过表达突变形式（例如，显性负突变形式）、导入或表达一种或多种干扰RNA分子，降低具有特定活性的蛋白质的表达，或者删除一种或多种编码具有特定活性的蛋白质的内源基因。

为了通过同源重组破坏基因，可以以包括可选择的标志物的方式构建“基因替代”载体。可选择的标志物基因可以与长度足以介导同源重组的基因部分的5’和3’端有效连接。可选择的标志物可以是任何一种补偿宿主细胞营养缺陷型的基因或者提供抗体耐受性的基因，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其他合适的可选择的标志物包括使酵母细胞产生氯霉素抗性的CAT基因，或由于表达-半乳糖苷酶而导致蓝色克隆的lacZ基因。然后，使用本领域普遍已知的方法（见下文），将基因替代载体的线性化DNA片段导入细胞中。可以基于选择标志物确定线性片段与基因组的整合和基因的破坏，并可以通过例如Southern印迹分析验证。可以通过例如Cre-loxP系统（见下文）从宿主细胞的基因组中去除选择标志物。

可选的，可以以包括待破坏的基因部分的方式构建基因替代载体，所述部分缺少任何内源基因启动子序列，并不编码基因编码序列或只编码基因编码序列的失活片段。“失活片段”是编码蛋白质的基因的片段，具有从全长基因编码序列产生的蛋白质的少于约10%（例如，少于约9%、少于约8%、少于约7%、少于约6%、少于约5%、少于约4%、少于约3%、少于约2%、少于约1%或0%）的活性。此类基因部分插入到载体中，插入的方式使得没有任何已知的启动子序列与基因序列有效连接，但终止密码子和转录终止序列与基因序列部分有效连接。之后，可以将该载体线性化为基因序列部分，并转化到细胞中。通过单同源重组，该线性化载体之后整合到基因的内源配对物中。

表达载体可以是自主型或整合型。可以将重组核酸（例如，编码甘露糖苷酶的核酸）以表达载体的形式导入到细胞中，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒。重组核酸可以在染色体外维持，或者可以整合到酵母细胞染色体DNA中。表达载体可以忽悠选择标志物基因，所述基因编码在选择条件下细胞存活必需的蛋白质（例如，编码尿嘧啶生物合成必需的酶的URA3，或编码色氨酸生物合成必需的酶的TRP1），允许检测和/或选择那些被所需核酸转化的细胞（参见例如，美国专利号4,704,362）。表达载体还可以包括自主复制序列（ARS）。例如，美国专利号4,837,148描述了为在毕赤酵母中维持质粒提供核酸手段的自主复制序列。

整合型载体公开在例如美国专利号4,882,279中。整合型载体一般至少包括如下连续排列的序列：第一可插入的DNA片段、可选择的标志物基因和第二可插入的DNA片段。第一和第二可插入的DNA片段都是长度约200个（例如，约250、约300、约350、约400、约450、约500个，或约1000个或更多个）核苷酸，并具有与待转化的物种的基因组DNA部分同源的核苷酸序列。将含有用于表达的目标基因的核苷酸序列（例如，编码具有N糖基化活性的蛋白质的基因）插入到该载体的第一和第二可插入的DNA片段之间，不论是在标志物基因之前或之后。可以在转化前将整合型载体线性化，以促进目标核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中。

表达载体的特征可以是处于酵母（例如，解脂耶氏酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或其他合适的真菌物种）启动子控制下的重组核酸，使得其能够在真菌细胞中表达。合适的酵母启动子包括例如ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、POX和Gal10（参见例如，Guarente等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(23):7410）启动子。其他合适的启动子描述在例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8):608-611和美国专利号6,265,185中。

启动子可以是组成型或诱导型（条件性）的。组成型启动子理解为其表达在标准培养条件下恒定的启动子。诱导型启动子是响应一种或多种诱导条件的启动子。例如，诱导型启动子可以是化学调控的（例如，转录活性受化学诱导剂的存在或缺失调控的启动子，例如乙醇、四环素、类固醇、金属或其他小分子）或物理调控的（例如，转录活性受物理诱导因子的存在或缺失调控的启动子，例如光或高温、低温）。诱导型启动子还可以受一种或多种转录因子的间接调控，所述转录因子自身受化学或物理条件的直接调控。

可以理解，其他的遗传改造修饰也可以是条件性的。例如，可以使用如定点DNA重组条件性的删除基因，例如Cre-loxP系统（参见例如，Gossen等人，(2002)Ann.Rev.Genetics 36:153-173和美国申请公开号20060014264）。

可以使用多种方法将重组核酸导入本文描述的细胞中，例如原生质体技术或完整的细胞氯化锂酵母转化方法。其他可用于转化质粒或线性核酸载体的方法描述在例如美国专利号4,929,555；Hinnen等人，(1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 75:1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153:163；美国专利号4,879,231；和Sreekrishna等人，(1987)Gene 59:115，其公开内容通过引用全文整合到本文中。也可以使用电穿孔和PEG1000完整细胞转化方法，如Cregg和Russel,Methods in Molecular Biology：Pichia Protocols，第3章，Humana Press,Totowa,N.J.，第27-39页(1998)所述。

可以使用恰当的技术选择转化的真菌细胞，包括但不限于在缺少所需的生物化学产物（由于细胞的营养缺陷型）的条件下，培养转化后的营养缺陷型细胞，选择和检测新的表型，或者培养在存在对缺少包含在转化子中的抗性基因的酵母有毒的抗生素的条件下。还可以通过基因组中整合的表达盒选择和/或验证转化子，可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评估。

在将载体导入目标靶细胞之前，载体可以在如上所述的细菌细胞中生长，例如大肠杆菌（E.coli）。可以通过任何本领域已知的从细菌环境中获得纯化载体DNA的方法，从细菌细胞中分离载体DNA。可以用苯酚、氯仿和乙醇专门提取纯化的载体DNA，确保质粒DNA制品中不存在任何E.coli蛋白，因为这些蛋白质对于哺乳动物细胞而言是有毒的。

在一些实施方案中，遗传改造过的真菌细胞缺少OCH1基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质），是OCH1活性缺陷的。在一些实施方案中，遗传改造过的细胞表达能够促进甘露糖基磷酸化的多肽（例如，来自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽，或来自毕赤酵母的PNO1多肽）。例如，真菌细胞可以表达解脂耶氏酵母的MNN4多肽（

登录号：XM 503217；Genolevures Ref：YALI0D24101g）。在一些实施方案中，遗传改造过的细胞是OCH1活性缺陷的，并表达能够促进甘露糖基磷酸化的多肽。

在脱帽M6P残基后，可以分离靶分子。在一些实施方案中，靶分子留在酵母细胞内，并在细胞裂解时释放。在一些实施方案中，靶分子通过编码序列提供的机制（外源性核酸天然的，或者改造到表达载体中）被分泌到培养基中，所述机制指导分子从细胞的分泌。可以通过多种用于检测分子存在的标准规程验，证存在于细胞裂解物或培养基中的脱帽后的靶分子。例如，当改变的靶分子是蛋白质时，此类规程可以包括但不限于用特异性针对改变的靶蛋白（或靶蛋白本身）的抗体进行免疫印迹或放射性免疫沉淀，结合特异性针对改变的靶蛋白（或靶蛋白本身）的配体，或者测试改变的靶蛋白（或靶蛋白本身）的特定酶活性。

在使用本文描述的方法生产的靶分子中，糖蛋白上至少47%（例如，至少50,55,60,65,70,75,80,85或90%）的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖残基。可以从DSA-FACE电色谱图s的峰面积中估计具有末端磷酸-6-甘露糖残基的N-聚糖的百分比。

在一些实施方案中，分离后，可以将脱帽的靶分子连接到异源部分上，例如使用酶手段或化学手段。“异源部分”指任何与改变的靶分子连接（例如，共价或非共价的）的组件，所述组件不同于最初存在于改变的靶分子中的组件。异源部分包括例如聚合物、载体、佐剂、免疫毒素或可检测的部分（例如，荧光素、冷光素或放射性）部分。在一些实施方案中，可以向改变的靶分子上添加额外的N-聚糖。

用于检测靶分子糖基化的方法包括DNA测序仪辅助的（DSA）、荧光团辅助的碳水化合物电泳（FACE），或表面增强的激光吸附/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF MS）。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中例如糖蛋白被变形，然后固定在例如膜上的。然后，可以用合适的还原剂还原糖蛋白，例如二硫苏糖醇（DTT）或β巯基乙醇。可以使用酸将蛋白质的巯基羧化，例如碘乙酸。之后，可以使用酶从蛋白质中释放N-聚糖，例如N-葡萄糖苷酶F。任选的，可以通过还原性的胺化作用重建和衍生N-聚糖。然后，可以浓缩衍生的N-聚糖。适合N-聚糖分析的仪器包括例如ABI

377DNA测序仪（Applied Biosystems）。可以使用例如

3.1软件（AppliedBiosystems）实施数据分析。任选的，可以用一种或多种酶进一步处理分离的甘露糖蛋白，验证其N-聚糖状态。N-聚糖分析的其他方法包括例如质谱（例如，MALDI-TOF-MS）、正常相的高压液相色谱（HPLC）、逆相层析和离子交换层析（例如，当未标记聚糖时，用脉冲安培电流检测，如果恰当的标记了聚糖，则用UV吸光值或荧光检测）。还参见Callewaert等人，(2001)Glycobiology 11(4):275-281和Freire等人，(2006)Bioconjug.Chem.17(2):559-564。

培养改造过的细胞

本文件还提供了本文描述的任何改造细胞的基本纯的培养物。在本文中，遗传改造过的细胞的“基本纯的培养物”是这样的细胞培养物，所述培养物中少于约40%（即，少于约35%；30%；25%；20%；15%；10%；5%；2%；1%；0.5%；0.25%；0.1%；0.01%；0.001%；0.0001%；或者甚至更少）的总活细胞数是遗传改造过的细胞以外的活细胞，例如，细菌、真菌（包括酵母）、真菌原生质或原生动物细胞。术语“约”在上下文中意指相关的百分比可以是比所述百分比高或低15%。因而，例如，约20%可以是17%至23%。此类遗传改造过的细胞的培养物包括细胞和生长培养基、储藏培养基或运输培养基。基质可以是液体、半固体（例如，凝胶状基质）或冷冻的。培养物包括生长在液体中的细胞，或生长在半固体基质中/上的细胞，或者在储藏或运输基质中储藏或运输的细胞，包括冷冻储藏或运输基质。培养物是在培养容器或储藏容器或底物（例如，培养皿、瓶或管，或者储藏瓶或管）中的。

本文描述的遗传改造过的细胞可以作为例如冷冻的细胞悬浮液储藏，例如在含有冷冻保护剂（如甘油或蔗糖）的缓冲液中，或作为冻干的细胞储藏。可选的，可以作为干燥的细胞制品储藏，所述细胞制品是通过例如流体床干燥或喷雾干燥或任何合适的干燥方法获得的。

代谢功能障碍

具有脱帽末端M6P残基的分子可用于治疗多种代谢功能障碍。代谢功能障碍是影响单个人（或动物）细胞中的能量产生的功能障碍。大部分的代谢功能障碍是遗传的，虽然一些可以是“作为饮食、毒素、感染等的结果而“获得的”。遗传性代谢功能障碍也称为先天性代谢错误。一般而言，遗传性代谢功能障碍是由遗传缺陷引起的，所述缺陷导致细胞代谢过程中一些步骤必需的酶缺失或错误的构建。最大类的代谢功能障碍是碳水化合物代谢功能障碍、氨基酸代谢功能障碍、有机酸代谢功能障碍（有机酸尿）、脂肪酸氧化和线粒体代谢功能障碍、卟啉代谢功能障碍、嘌呤或嘧啶代谢功能障碍、类固醇代谢功能障碍、线粒体功能障碍、过氧化物酶体功能障碍和溶酶体贮积症（LSD）。

可以通过施用一种或多种具有脱帽末端M6P残基的分子（或同一分子的药物组合物）治疗的代谢功能障碍的实例可以包括遗传性血色素沉积症、眼皮肤白化病、蛋白C缺陷、I型遗传性血管性水肿、先天性蔗糖酶-异麦芽糖缺陷、II型Crigler-Najjar综合征、Laron综合征、遗传性髓过氧化物酶、原发性甲状腺机能减退、先天性长QT综合征、酪氨酸结合球蛋白缺陷、家族性高胆固醇血症、家族性高乳糜微粒血症、Abeta-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白A水平、伴随肝损伤的遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能减退、成骨不全症、遗传性低纤维蛋白原血症、α-抗糜蛋白酶缺陷、肾源性尿崩症、腺苷脱氨酶缺陷、Pelizaeus Merzbacher病、IIA型血管性血友病、因子V和VIII组合缺陷、迟发型脊稚骨N发育不良、无脉络膜症、I细胞病、Batten病、毛细管共济失调、ADPKD-常染色体显性遗传多囊肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、眼脑肾Lowe综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、骨髓发育不良症候群、Tangier病、家族性肝内胆汁淤积症、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、Scott综合征、1型和2型Hermansky-Pudlak综合征、Zellweger综合征、肢近端型点状软骨发育不良、常染色体隐性原发性高草酸盐尿、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓和bullar肌肉萎缩、原发性ciliary diskenesia（Kartagener综合征）、巨人症和肢端肥大症、乳漏、Addison病、肾上腺性男性化、Cushing综合征、酮酸中毒、原发性或继发性醛甾酮症、Miller Dieker综合征、无脑回、运动神经元病、Usher综合征、Wiskott-Aldrich综合征、Optiz综合征、亨廷顿氏病、遗传性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、

综合征、僵人综合征、Brugada综合征、Finnish型先天性肾脏综合征、Dubin-Johnson综合征、X连锁的低磷酸盐血症、Pendred综合征、持续性胰岛素低血糖婴儿、遗传性球形红细胞增多症、无血浆铜蓝蛋白、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症、假性软骨发育不全和多发性骨骺、Stargardt样黄斑营养不良、X连锁的进行性神经性腓骨肌萎缩症、常染色体显性色素性视网膜炎、Wolcott-Rallison综合征、Cushing病、肢节型肌营养不良症、IV型粘多糖症、遗传性家族性Finish淀粉样病变、肝糖储积病、肉瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿氏病和脊髓小脑性共济失调、遗传性高同型半胱氨酸血症、多神经病、低运动神经元病、色素性视网膜炎、血清阴性关节炎、间质性肺纤维化、Raynaud症状、Wegner氏肉芽肿、preoteinuria、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、Ehlers-Danlos综合征、多发性外生骨疣、Griscelli综合征（1型或2型）或X连锁的非特异性智力迟钝。此外，代谢功能障碍还可以包括溶酶体贮积症，例如但不限于：费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GM1-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病（A、B和C型）、V型粘多糖病（Scheie disease）、II型粘多糖病（Hunter disease）、IV型粘多糖病（Sanfilippo disease）、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病（Maroteaux-Lamy disease）、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症（II、III和IV型）、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco-

综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon氏病或Geleophysic发育不良。

代谢功能障碍的症状是多种多样的，可以包括一种或多种的例如贫血、疲劳、易怒、低血小板、肝肿大、脾肿大、骨骼衰弱、肺损伤、感染（例如，胸腔感染或肺炎）、肾损伤、进行性脑损害、癫痫发作、超厚胎粪、咳嗽、哮鸣、过多的唾液或粘液产生、呼吸短促、腹痛、肠闭塞、繁殖力问题、鼻息肉、指甲/趾甲和皮肤的增生性病变、手足痛、血管角质瘤、少汗、角膜和晶状体浑浊、白内障、二尖瓣脱垂和/或回流、心脏扩大症、不耐低温、行走困难、吞咽困难、进行性视力丧失、进行性听力丧失、张力减退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暂停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前弯症或脊柱侧凸。可以理解，由于缺陷或缺少的蛋白质和导致的疾病表型（例如，代谢功能障碍的症状表现）的不同性质，给定的功能障碍一般将只表现出特定功能障碍的特征性症状。例如，患法布里病（Fabry disease）的患者可以表现出上述症状特定子集，例如但不限于不耐低温、角膜旋转、疼痛、皮肤发红、恶心或腹泻。患有高歇氏病的患者可以表现出脾肿大、肝硬化、抽搐、张力亢进、窒息、骨质疏松或皮肤褪色。

除了施用一种或多种本文描述的脱帽的分子外，还可以通过正确的营养和维生素（例如，辅助因子疗法）、物理疗法和疼痛药物治疗代谢功能障碍。

根据给定的代谢功能障碍的特定性质，患者可以在任何年龄表现出这些症状。在许多情况下，症状可以出现于儿童期或早成年期。例如，法布里病（Fabry disease）的症状可以出现于较早的年龄段，例如10岁或11岁。

在本文中，“处于出现代谢功能障碍的风险”的对象是这样的对象，所述对象具有出现功能障碍的倾向，即，由于酶突变的结果导致出现代谢功能障碍的遗传倾向，例如酸性α葡萄糖苷酶、α半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、α-N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、α-葡萄糖胺-N-乙酰转移酶、β-D-葡萄糖酸酶、透明质酸酶、α-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸苷酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、神经磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。显而易见的，“处于出现代谢功能障碍的风险”的对象不是目标物种中的所有对象。

“怀疑具有功能障碍”的对象是这样的对象，所述对象具有一种或多种代谢功能障碍的症状，例如本文描述的任何功能障碍的症状

药物组合物和治疗方法

具有脱帽的M6P残基的靶分子可以整合到含有治疗有效量的分子和一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂的药物组合物中。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常不会负面的影响受体的内稳态（例如，电解质平衡）。可接受的载体包括生物可兼容的、惰性的或生物可吸收的盐、缓冲试剂、寡糖或多糖、聚合物、改善粘性的试剂、防腐剂等。一个示例性的载体是生理盐溶液（0.15M NaCl，pH 7.0至7.4）。另一个示例性的载体是50mM磷酸钠，100mM氯化钠。制备和施用药物组合物的其他细节可见于例如Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.,Easton,Pa.)中。组合物中还可以整合补充的活性化合物。

含具有脱帽的M6P残基的分子组合物的施用可以使系统性的或局部的。药物组合物可以如下制备使得它们适合不经肠道的和/或经肠道的施用。

特定的施用方式包括皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、透皮的、鞘内的、口腔的、直肠的、脸颊的、局部的、鼻腔的、眼的、关节内的、动脉内的、蛛网膜下的、支气管的、阴道的和子宫内的施用。

施用可以是周期性的注射药物组合物的大药丸（bolus），或者可以通过外部（例如，IV袋）或内部（例如，生物可侵蚀的植入物、生物人工器官或植入后改变的N糖基化分子生产细胞的克隆）的储槽进行静脉内或腹腔内不间断或持续的施用。参见例如美国专利号4,407,957、5,798,113和5,800,828。药物组合物的施用可以使用合适的递送手段实现，例如：泵（参见例如，Annals of Pharmacotherapy,27:912(1993)；Cancer，41:1270(1993)；CancerResearch,44:1698(1984)）；微胶囊（参见例如，美国专利号4,352,883；4,353,888和5,084,350）；连续释放的聚合物植入物（参见例如，Sabel，美国专利号4,883,666）；大胶囊（参见例如，美国专利号5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733，和公开的PCT专利申请WO92/19195、WO 95/05452）；皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或其他合适位点的注射；或口服施用，以胶囊、液体、片剂、丸剂或缓释配方的形式。

不经肠道的递送系统的实例包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统、泵递送、封闭的细胞递送、脂质体递送、针头递送的注射、无针头注射、喷雾器、烟雾器和透皮贴。

适合不经肠道的施用的配方通常含有改变的N糖基化分子的无菌含水制品，优选是与受体的血液等渗的（例如，生理盐水）。配方可以存在单元剂量或多剂量形式。

适合口服施用的配方可以作为分散单元存在，例如胶囊剂、扁囊剂（cachet）、片剂或润喉糖，都含有预定量的改变的N糖基化分子；或作为含水液体或不含水液体中的悬浮液存在，例如糖浆、酏剂、乳化液或饮剂（draught）。

适合局部施用的具有脱帽的M6P残基的分子可以作为例如：乳膏、喷雾、泡沫剂、凝胶、油膏、软膏或干擦剂（dry rub）施用给哺乳动物（例如，人类患者）。干擦剂可以在施用位点再水合。此类分子还可以直接融合到（例如，浸泡到或干燥为）可以之后应用于局部的绷带、纱布或贴剂上。此类分子还可以在局部施用的绷带、纱布或贴剂上维持成半固体、凝胶状或完全的液体状态（参见例如，美国专利号4,307,717）。

药物组合物的治疗有效量可以按本领域技术人员可认知的剂量方案向需要的对象施用。例如，可以向对象系统性的施用组合物，按例如每次剂量0.01μg/kg至10,000μg/kg对象体重。在另一个实例中，剂量是从每次剂量1μg/kg至100μg/kg对象体重。在另一个实例中，剂量是从每次剂量1μg/kg至30μg/kg对象体重，例如从每次剂量3μg/kg至10μg/kg对象体重。

为了使治疗效果最佳，可以首先以不同的剂量方案施用具有脱帽的M6P残基的分子。单元剂量和方案取决于这样的因素，包括例如哺乳动物的物种、其免疫状态、哺乳动物的体重。通常，可以使用恰当的筛选测定监控此类分子在组织中的水平，所述测定作为临床测试程序的一部分，例如确定给定治疗方案的功效。

具有脱帽的M6P残基的分子的给药频率落入医学实践人员（例如，医生或护士）的技能和临床判断范围内。通常，施用方案是通过建立最佳施用参数的临床试验建立的。然而，实践人员可以根据对象的年龄、健康、体重、性别和医学状态，改变此类施用方案。给药频率可以根据治疗是否是预防性或治疗性的而改变。

可以通过例如细胞培养或实验动物中已知的制药方法，确定此类分子或其药物组合物的毒性和治疗功效。这些方法可用于例如确定LD50（50%的群体致死的剂量）和ED50（在50%的群体中治疗有效的剂量）。在毒性效应和治疗效应之间的剂量比例是治疗指数，可表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的药物组合物是优选的。可以使用表现出毒副作用的药物组合物，但是应该仔细的设计递送系统，将此类混合物靶向到受影响组织的位点，从而使对正常细胞（例如，非靶细胞）的潜在损伤最小化，从而降低副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配置在恰当对象（例如，人类患者）中使用的剂量范围。此类药物组合物的剂量一般落入循环浓度范围内，包括没有或只有极小毒性的ED50。剂量可以在该范围内改变，取决于使用的制剂类型和利用的施用途径。对于所使用的本文描述的药物组合物（例如，用于治疗对象中的代谢功能障碍），可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制成这样的剂量，所述剂量实现了包括细胞培养中确定的IC50（即，实现了症状的半最大抑制的药物组合物浓度）在内的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更精确的确定人中的有效剂量。可以通过例如高性能的液相色谱测量血浆中的水平。

如本文中定义的，具有脱帽的M6P残基的分子的“治疗有效量”是能够在治疗对象中产生医学上理想的结果（例如，减轻一种或多种代谢功能障碍的症状）的分子的量。治疗有效量（即，有效剂量）可以包括毫克或微克量的化合物/千克对象或样品重量（例如，约1微克/千克至约500毫克/千克，约100微克/千克至约5毫克/千克，或约1微克/千克至约50微克/千克）。

对象可以是任何哺乳动物，例如人（例如，人类患者）或非人灵长类（例如，黑猩猩、狒狒或猴子）、小鼠、大鼠、兔、荷兰猪、沙鼠、田鼠、马、家畜类（例如，牛、绵羊或山羊）、狗、猫、或鲸。

本文描述的分子或其药物组合物可以作为与另一只治疗的组合疗法向对象施用，例如，代谢功能障碍（例如，溶酶体贮积症）的治疗。例如，组合疗法可以不看向对象（例如，人类患者）施用一种或多种其他试剂，所述试剂为患有或有风险出现（或怀疑患有）代谢功能障碍（例如，溶酶体贮积症）的对象提供了治疗益处。因而，化合物或药物组合物和一种或多种其他试剂可以同时施用。可选的，可以首先施用分子，其次施用一种或多种其他试剂，反之亦然。

应理解，处于在先治疗特别毒性（例如，具有显著副作用的代谢功能障碍治疗）的情况下时，本文描述的分子的施用可用于抵消和/或减少在先治疗的量至足以产生相同或改善的治疗益处但没有毒性的水平。

本文描述的任何药物组合物可以与施用说明一起包括在容器、包装或分配器中。

下文是实践本发明的实施例。实施例不以任何方式视为对本发明范围的限制。

实施例

实施例1

产生具有高度磷酸化的N-聚糖的解脂耶氏酵母菌株

为了上调解脂耶氏酵母的聚糖磷酸化，用2种额外的MNN4基因拷贝转化MTLY60菌株，每种基因拷贝位于分离的表达载体中。MNN4基因参与增加酵母中的聚糖磷酸化。图1含有克隆了MNN4基因的pYLTmAX质粒的示意图，所述质粒用于生产pYLTmAXMnn4，含有处于TEF启动子控制下的MNN4开放阅读框。制备含有2种额外的MNN4基因拷贝的菌株，1种处于hp4d启动子的控制下，1种处于TEF1启动子的控制下。从MTLY60Δoch1菌株（1份MNN4野生型拷贝）、MTLY60Δoch1+Hp4dMNN4菌株（1WT+1份额外的MNN4拷贝）和MTLY60Δoch 1+Hp4dMNN4+TEFMNN4菌株（1WT+2份额外的MNN4拷贝）制备N聚糖，和通过DNA测序仪辅助的（DSA）、荧光团辅助的碳水化合物电泳（FACE）。参见Callewaert等人，Glycobiology 11(4):275-281(2001)。基于图2中的结果，可以推断含1份额外拷贝的菌株中磷酸化峰是上调的，并出现双磷酸化的峰。在含2份额外拷贝的菌株中，双磷酸化的峰高得多，而中性的Man₈GlcNAc₂糖的峰低得多。

实施例2

鉴别可以脱帽真菌来源的磷酸化聚糖中存在的加盖(capping)的甘露糖 残基的甘露糖苷酶活性

酵母和丝状真菌对糖的磷酸化导致甘露糖-磷酸-甘露糖二酯连接（图3）。为了获得磷酸处于单酯连接中的结构，需要能够水解甘露糖-磷酸连接的甘露糖苷酶，使磷酸保持连接在高甘露糖聚糖结构的6位上。Chiba等人，Glycobiology,12(12):821-8(2002)指出，纤维单胞菌物种中的甘露糖苷酶能够脱帽甘露糖。然而，Chiba等人仅部分的纯化了甘露糖苷酶蛋白，不能鉴别编码蛋白质的基因。

从LMG细菌收藏中心获得纤维化纤维单胞菌（Cellulosimicrobiumcellulans，也称为溶黄嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineolytica)和藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)）的分离物，并测试所生产的甘露糖苷酶活性。细菌在30℃和含甘露糖的基质中生长，向培养基中分泌甘露糖苷酶。从培养物获得细菌上清液（SN），通过将SN与分离的源自实施例1所述过表达MNN4的菌株中的N-聚糖孵育，测试所需的甘露糖苷酶活性。在孵育后，通过DSA-FACE测定聚糖（图4）。

在用SN处理后，聚糖获得了额外的电荷，在电场中迁移更快，并移动到electroferogram的左手侧。如果这些跑动快的结构确实是磷酸单酯取代的高甘露糖聚糖，则它们的尺寸将比运动到相同位置的中性产物更大。用磷酸酶处理此类聚糖可获得跑得更慢的中性寡糖。如图5所示，用胎牛肠磷酸酶（CIP）处理，获得了表现出较低电泳迁移率的峰，证明磷酸是末端的且甘露糖是脱帽的。

实施例3

部分纯化和进一步鉴别甘露糖苷酶

为了纯化甘露糖苷酶，将纤维化纤维单胞菌生长在1L的培养基B（Bagiyan等人，Eur.J.Biochem.249(1):286-92(1997)）或培养基A（Chiba等人，2002，见上文）上。参见表1。之后，用40%和80%硫酸铵沉淀培养基，通过SDS-PAGE分析样品。用含1mM CaCl₂的20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5透析硫酸铵级分，然后在源自MNN4过表达菌株（实施例1）的寡糖上测试活性。

表1

培养基组分

培养基A（1升）	培养基B（1升）
		2g甘露聚糖	2g甘露聚糖
0.5g(NH4)2SO4	2g(NH4)2SO4
		0.4g MgSO4.7H2O	0.02g MgSO4.7H2O
20mg FeSO4.7H2O	1mg FeSO4.7H2O
		60mg CaCl2.2H2O	1g酵母提取物
1g酵母提取物	4.2g KOH
		7.54g K2HPO4	14g KH2PO4
2.32g KH2PO4

两种培养条件都导致产生了脱帽活性。仅源自培养基B的40%硫酸铵级分表现出活性，而培养基A上清液的两种级分都表现出活性。

将源自培养基A培养的40%硫酸铵级分在硅胶凝胶过滤柱上进一步纯化（图6）。这导致具有约670kDa肩部的峰。

将所有的洗脱级分与源自MNN4过表达的解脂耶氏酵母菌株（实施例1所述）的寡糖孵育（有或无后续的CIP消化），测试磷酸脱帽的活性。在所有的样品中都观察到脱帽和甘露糖苷酶活性。还在SDS-PAGE上分析样品（图7），表现出不止一条蛋白质条带，而是若干蛋白质条带。从凝胶上切出若干条带，使用质谱重新(de novo)肽测序分析它们的部分序列。

从头测序结果揭示了若干肽序列，使用BLAST将其余非冗余数据库中的序列比较。鉴别出与下列蛋白质具有同源性的肽：磷酸二酯酶、假定的蛋白质、假定的α-1,2甘露糖苷酶（鉴别的肽显示在表2中）（与磁螺菌属(Magnetospirillum)的甘露糖苷酶同源）和氨基肽酶Y。磷酸二酯酶是可能的侯选物，但6种肽中仅有2种具有命中。甘露糖苷酶还是2种不同的甘露糖苷酶的3/5和5/5命中的候选物。

表2

肽序列

肽序列	SEQ ID NO
		SAYQSFTTR	1
VWGFSHR	2
		VEGGWLPR	3
TQGNNFALLLPER	4
		DVHAELTAMAR	5

实施例4

基于全基因组测序鉴别具有理想序列的甘露糖苷酶

为了鉴别编码理想活性的甘露糖苷酶基因，使用Titanium 454测序（Eurofins MWG Operon）对纤维化纤维单胞菌的基因组测序。由于高GC含量，测序只是部分的（1.96Mb）和低质量的（仅有低的平均重叠群大小）。基因组的高GC含量在乳化PCR（emPCR）的过程中导致环形成，导致删除和非常短的序列。

使用可自Roche的β测试中获得的新的emPCR测序化学克服了这一问题。这产生了极大改善的序列（4.7Mb），允许鉴别出属于糖基水解酶家族92的5个甘露糖苷酶基因，其中之一（CcMan1，SEQ ID NO:6）对应于实施例3描述的肽的序列。没有发现家族38和47的任何甘露糖苷酶。通过MetaGeneAnnotator（参见世界范围的网站：metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/metagene/）预测CcMan1-CcMan4中每一个的起始密码子，并与已知基因的Blast比较。由于缺少序列，所以不能预测CcMan5的起始密码子。通过两种方法（中性网络和隐藏的马尔可夫模型），用signalP预测每个基因的信号序列（参见世界范围的网站：cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。

图8-12含有纤维化纤维单胞菌的5个甘露糖苷酶基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列。

实施例5

用于体外或体内的甘露糖脱帽的甘露糖苷酶异源表达

为了允许通过甘露糖苷酶脱帽酵母型磷酸化，需要在不同的宿主中或在表达用于治疗用途的蛋白质的同一真菌宿主中异源的表达。在后一种情况下，可以共同分泌或靶向到胞内区室（例如，高尔基体装置或内质网）中。这可以通过克隆基因（是靶宿主密码子优化或未优化的）有效连接到表达载体中的启动子之后来实现。可以用表位标签标记甘露糖苷酶，允许方便的检测和纯化或表达。可以分泌到细菌细胞的周质空间中，或者在细胞内表达。在真菌宿主中表达的情况下，序列可以含有分泌信号或将蛋白质靶向到胞内区室的靶向(导向)信号，或同时含有二者。表3含有用于在真菌生物中表达的分泌和靶向信号的列表。此类表达载体的实例呈现在图13中。

表3

用于在真菌生物中表达的分泌和靶向信号

可以将CcMan1-Man5基因密码子优化用于在E.coli中表达。密码子优化的序列参见图14-18。表4含有每个密码子优化的核苷酸序列的长度，和不含信号序列的每个多肽的预测分子量。

表4

密码子优化的基因

实施例6

纤维化纤维单胞菌糖基水解酶（GH）家族92酶的克隆和活性

将CcMan1-CcMan5密码子优化的核酸克隆到E.coli载体pLSH36中，所述载体含有Spy信号序列，和/或pLSAH36中，其含有DsbA信号序列用于细胞周质的表达。pLSH36和pLSAH36都导致编码多肽具有多聚组氨酸标签和小鼠的caspase-3位点，所述位点用于在纯化过程中去除His6-标签。图19含有pLSH36和pLSAH36载体的示意图用于将纤维化纤维单胞菌GH92基因导入载体中。在克隆后，将不同的甘露糖苷酶转化到E.coli BL21+pICa2表达菌株中。转化的菌株生长至0.5至1的光密度（OD），并用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。使用抗His6抗体，通过SDS PAGE和Western印迹分离和分析不同的细胞级分（培养基、细胞周质、可溶性和不可溶性级分）。对于CcMan1、CcMan2和CcMan3，在所有的级分中检测到表达。对于CcMan4和CcMan5，在可溶性级分中检测到最高的表达，但也在其他级分中检测到一些表达。

为了检测CcMan1-CcMan5蛋白质的活性，如Chiba等人，2002，见上文中所述使用甲基伞形酮α甘露糖苷（MUM）。对于CcMan1和CcMan2，培养基和细胞周质样品能够微弱的水解MUM，而CcMan3和CcMan5则不能水解MUM。CcMan4可溶性级分产生最强的荧光信号，表示CcMan4是仅有的具有α1,2-甘露糖苷酶活性的甘露糖苷酶。

还在源自实施例1所述过表达MNN4的菌株中的糖（本文中称为MNN4糖）上测试所需的甘露糖苷酶活性5种不同的纤维化纤维单胞菌甘露糖苷酶的所有培养基和细胞周质样品，观察它们是否能够降解糖和脱帽甘露糖-6-磷酸的甘露糖。将糖孵育过夜，并通过DNA测序仪辅助的、荧光团辅助的碳水化合物电泳（DSA-FACE）来分析。由于培养基展示中的荧光团分子导致electroferogram中不相关的峰，因此不能分析培养基样品的糖谱。CcMan1、CcMan2和CcMan3的细胞周质的糖谱既没有表现出降解也没用表现出脱帽。CcMan4表现出降解，CcMan5表现出脱帽活性（图20）。由于脱磷酸化的峰移动到中性Man8，对脱帽糖的CIP消化验证了CcMan5的脱帽活性。

将活性的甘露糖苷酶CcMan4和CcMan5与具有已知结构的家族92甘露糖苷酶的Bt3990（744AA）和Bt2199（739AA）比对（参见Zhu等人，Nat.Chem.Biol.,6(2):125-32Epub 2009Dec 27(2010)）。参见图21。由于仅第一部分的CcMan4和CcMan5与Bt3990和Bt2199比对，且由于它们是大蛋白，因此决定分别克隆每个蛋白质的第一结构域并测试活性。将CcMan4domain（1-3357bp，即，SEQ ID NO:20的1-3357位核苷酸）和CcMan5domain（1-2322bp，即，SEQ ID NO:20的1-2322位核苷酸）克隆到pLSAH36E.coli表达载体中。参见图19关于pLSAH36克隆载体的示意图。将表达载体转化到生长至0.5至1的OD的E.coli BL21+pICa2表达菌株中，并用1mM IPTG诱导。使用抗His6抗体，通过SDS PAGE和Western印迹分离和分析不同的细胞级分（培养基、细胞周质、可溶性和不可溶性级分）。在所有4种细胞级分中都检测到表达。

在Mnn4糖上测试结构域的活性。据此，在存在Mnn4糖的条件下孵育每个CcMan4domain和CcMan5domain的细胞周质级分（图22），并通过DSA-FACE分析。该实验显示CcMan4domain丢失了它的甘露糖苷酶活性，因为不能检测到任何降解（图22，第4道）。相反，CcMan5domain保持了它的脱帽活性（图22，第6道）。

实施例7

生产和纯化CcMan5及其家族92同源结构域

在E.coli菌株BL21codon+pICA2中表达重组CCman5（SEQ ID NO:20的1-4995位核苷酸）和CCman5结构域（SEQ ID NO:20的1-2322位核苷酸），所述E.coli菌株已转化了表达载体pLSAHCcMan5和pLSAHCcMan5domain。通过处于λpL-启动子（参见WO 98/48025和WO 04/074488）控制下的IPTG诱导表达。参见实施例6和图19关于pLSAH的描述。转化的细菌在1/100接种20升发酵罐前，在补充了青霉素（100μg/ml）和卡那霉素（50μg/ml）的LuriaBertani（LB）培养基中28°C生长过夜，发酵罐中使用补充了青霉素（100μg/ml）和1%甘油。初始的搅拌和气流分别是200rpm和1.5l/min，并自动调适保持在30%的pO₂。温度保持在28℃。细胞生长至A_600nm=1.0的光密度，转移至20℃，并通过添加1mM IPTG过夜诱导表达。在-20℃收获和冷冻细胞。在冻融后，在50mM NaH₂PO₄pH 8.0、300mM NaCl、1mM PMSF和10μg/mlDNaseI中，按3ml/g的浓度将细胞温和的重悬。通过在4℃搅拌细胞悬浮液1h，制备细胞周质级分，并通过在18,000xg离心30分钟分离。所有的步骤都在4℃进行。将清澈的上清液应用于用20mM NaH₂PO₄pH 7.4、300mM NaCl、20mM咪唑、0.1%CHAPS平衡过的20ml Ni-Sepharose 6FF柱（GEHealthcare）。在用同一缓冲液中的50mM咪唑进行额外的洗涤步骤后，用20mM NaH₂PO₄pH 7.4、20mM NaCl、400mM咪唑、0.1%CHAPS洗涤柱。用20mM Tris pH 8.0、0.1%CHAPS将洗脱级分1/10稀释，并上样到14ml Source15Q柱（GE Healthcare）上，去除污染物。在平衡后，通过10倍柱床体积的线性梯度洗脱目标蛋白，所述梯度为在20mM Tris、0.1%CHAPS中的0至1M的NaCl。将含有CcMan5和CcMan5结构域的级分进一步注射到用PBS预梯度的HiLoad 26/60Superdex 200上作为走样溶液。使用抗His6抗体，通过SDSPAGE和Western印迹分析所获得的级分。最后，使用BCA测定（Pierce）确定浓度。全长CcMan5蛋白质的纯化产量是5.7mg，而对于CcMan5家族92结构域，这20L发酵物的产量是110mg，显示仅家族92结构域可以以更高的产量生产和纯化。在实施例6所述的Mnn4分离糖上测试纯化CcMan5结构域的活性。获得了脱帽的糖谱。

实施例8

CcMan5domain的结构

在E.coli BL21(DE3)的细胞周质中作为融合产物表达CcMan5_1-774（SEQID NO:50的1-774位残基，由SEQ ID NO:20的1-2322位核苷酸编码；对应于去除了天然前导序列的成熟蛋白质），所述融合产物以N端6xHis标签起始，在DsbA前导序列后接9个氨基酸的接头（VGPGSDEVD，SEQ ID NO:21）。在含有100μg/ml卡那霉素和100μg/ml青霉素的M9培养基中，28℃培养细胞。在OD₆₀₀=0.4时，通过添加1mM IPTG并在18°C进一步生长过夜，诱导CcMan5_1-774表达。通过离心从过夜培养物中收获细胞，洗涤并在4℃用含有20mM Tris/HCl pH 8.0、20%蔗糖、5mM EDTA和0.1mg/ml溶菌酶的缓冲液中孵育20min，产生原生质球。通过在20,000xg离心20min，从原生质球中分离细胞周质蛋白。通过金属离子亲和层析（HisTrap HP，GE Healthcare，在含有50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl的缓冲液下上样，并使用多达400mM的咪唑梯度洗脱）、离子交换层析（HiTrap Q FF，GE Healthcare，缓冲液：20mM Tris-HCl pH 8.0、40mM NaCl和多达1M的NaCl梯度）和疏水相互作用层析（HiTrap Phenyl HP，GE Healthcare，上样缓冲液：20mMTris-HCl pH 8.0、10mM NaCl、1M(NH₄)₂SO₄和用多达0mM的(NH₄)₂SO₄梯度洗脱），从细胞周质提取物中纯化CcMan5_1-774。

将纯化的CcMan5_1-774在10mM Tris–HCl pH 8.0、10mM NaCl中浓缩至130mg/ml，并使用含有0.2M氟化钠、0.1M Bis-Tris丙烷pH 7.5和20% PEG3350的结晶溶液，通过蒸汽扩散生长平板样晶体（0.2x0.07x0.01mm³）。将晶体简单的转移到含有补充了10%(v/v)甘油的结晶溶液的冷冻保护溶液中，在液氮中速冻。在Swiss Light Source(SLS,Villigen,Swiss)的PXIII光束下，和European Synchrotron Radiation Facility(ESRF,Grenoble,France)的BM30A光束下，收集100K的单晶衍射数据。使用KAuCl4浸泡的晶体，从11.958keV的SAD实验计算实验相，解析CcMan5_1-774的结构，对应于Au L-III吸收边缘。图33含有催化中心的结构坐标。通过最大可能性方法精细化从实验相构建的CcMan5模型，针对天然晶体收集到的

解析度数据，分别至最终的R-和freeR-因子为19.3和23.9%。最终模型的每个不对称单元含有2CcMan5_1-774分子（8-771位残基），包括11.513个蛋白质因子，860个溶剂原子，2个Ca²⁺离子和各1个二-三-丙烷和甘油分子。

基于序列相似性。CcMan5落入糖基水解酶家族92（GH92）中，所述家族定义为外切α甘露糖苷酶。两个具有α1,2-甘露糖苷酶活性的GH92家族成员的X射线结构是可获得的：Bt3990和Bt2199（PDB登录码分别是2WVX和2WVY）。本文解析了从CcMan5_1-774结构观察到的整体折叠，储藏为PDB入口2xsg，与Bt3990和Bt2199中观察到的对应良好，在624和621个匹配的Cα原子中，r.m.s.d（均方根标准误）值分别为

和

CcMan5_1-774由两个结构域组成，N端的β-夹心结构域（8-271位残基）和C端的(αα)6桶状结构域（291-771位残基），通过α-螺旋接头（272-290位残基）连接。两个结构域之间的界面产生了怀抱保守的催化性Ca2+离子的空洞形状，并产生-1底物结合位点（命名：Davies等人，Biochem.J.321:557-9(1997)）和催化中心（图23和24）。

GH92家族糖基水解酶是Ca²⁺-依赖性的α甘露糖苷酶，通过单取代机制催化糖苷键水解，导致释放的甘露糖中异头构象的反转（Zhu等人，2010，见上文）。在CcMan5_1-774中，通过位于赤道坐标平面中的Asn 588的羰基氧、Glu589和Asp662的各一个羧基氧和3个水分子（W1、W2、W3——参见图23），将催化性Ca²⁺的八面体坐标定位。额外的水分子（W4）存在于催化中心附件，结合Asp 660和Asp 662保守对的羧基。围绕催化性Ca²⁺的底物结合空穴通过残基Asn 588、Gln 589、Thr 626、Thr 658、Asp 22、Asn 25、Gly 71、Gly 72、Phe 195、Tyr 196、Arg 405、Trp 354、Tyr 535和Gln536约束（图23）。

CcMan5使其自身与GH92家族的其他α甘露糖苷酶分离，因为其独特的接受甘露糖-α-1-磷酸-6-甘露糖（Man-P-Man）作为底物的能力，以及缺少α-1,2-、α-1,3-、α-1,4-或α-1,6-甘露糖苷酶活性。为了获得对区分CcMan5活性位点中产生该独特底物特异性的残基的领悟，将Man-P-Man建模到非对称性单元的分子B的CcMan5_1-774活性位点中（图25）。-1甘露糖的定位是基于在Bt3990中观察到的总结合构象的，并受存在于apo活性位点中的2个水分子（W2和W3）和甘油分子的位置的指导。以该方式，-1甘露糖的O2、O3、O4和O6羟基分别采用与水分子W2、W3和甘油分子的O1和O3羟基观察到的位置等价的位置。因而，甘露糖-1O2和O3羟基位于八面体Ca²⁺坐标球的赤道平面。O3与Asp 355羧基产生了一个额外的氢键。后者进一步为O4羟基提供了H键，O4羟基也落入Arg 405胍基的H键范围内。O6羟基和O5氧可以参与与Gly 71酰胺的H键合。对于建模，-1甘露糖保持在其基态椅式构象。如Bt3990观察到的，O2羟基与Ca²⁺的相对位置进入理想的坐标将导致糖环扭曲为半椅式构象（参见图25）。这与这样的一般概念一致，即催化过程中糖环的扭曲是α甘露糖苷酶的乙缩醛中心中的亲核取代所必需的，为了用O2羟基破坏进入的亲核基团的1,2-双轴相互作用（Vocadlo等人，Curr.Opin.Chem.Biol.12:539-55(2008)）。所获得的-1位点的底物结合模型进一步显示水分子W4位于作为亲核基团线性进攻乙缩醛碳的良好位置上。W4处于与Asp 660和Asp 662的羧基H键相互作用中，其在GH92酶之间是保守的，并被假设形成碱催化剂用于活化亲核基团。因此，在-1位点建模的底物结合和催化残基与亲核基团的位置和在释放的甘露糖中具有异头中心倒置的亲核取代的机制需求一致。如上所述，CcMan5通过结合和水解Man-P-Man的能力使其自身与众不同。所获得的Man-P-Man结合CcMan5活性位点的模型现在为这些观察结果提供了理论依据。在已知的GH92家族成员中，产生糖苷键的异头氧处于与保守性谷氨酸残基（Bt3990中的Glu 533）的羧基的静电相互作用中。谷氨酸残基已表现出作为催化酸、稳定由结合异头氧介导的转位和支配离去基团中发挥作用（Zhu等人，2010，见上文）。在CcMan5中，将与Bt3990 Glu533等价的残基突变为谷氨酰胺，后者不能作为质子供体发挥作用，因此解释了CcMan5对甘露二糖水解的功能丧失。然而，在Man-P-Man底物中，与异头氧的磷酸键构成了更强的离去基团，不需要酸催化剂来支配异头氧，解释了为何诸如CcMan5的酶可以保留对Man-P-Man底物的催化活性。伴随对催化酸的取代，在CcMan5中用Thr（Thr 626）取代了Bt3990中的Glu 585的等价物。在Bt3990中，Glu 585与Glu 533相互作用，并提示调控后者的pK_a和/或在结合2连接的甘露糖苷离去基团中发挥作用（Zhu等人，2010，见上文）。

在Gln 536和Thr 626对突变为非酸性残基似乎减轻了结合位点的部分负电势，从而使磷酸连接更耐受Man-P-Man底物中的异头氧。在CcMan5中，Thr 626和Gly 72的酰胺构成了建模的磷酸结合位点（图25中的P）的形状，两者都能够支配与磷酸中的非糖苷氧的H键合。

最后，基于CcMan5_1-774活性位点中建模的Man-p-Man结合，在2个酪氨酸残基Tyr 535和Tyr 196附近产生还原性末端甘露糖，提示后者与残基形成部分的+1甘露糖结合位点。两个残基都位于可能参与与聚糖树的还原端的聚糖进一步相互作用的浅裂的边缘。

实施例9

在解脂耶氏酵母中表达α甘露糖苷酶A

使用解脂耶氏酵母的密码子优化，合成编码没有前序列和原序列的人α-甘露糖苷酶A的核酸，并添加Myc-His标签。将所获得的序列框内克隆到lip2基因的前序列之后。图26A中述及密码子优化的核苷酸序列（SEQ ID NO:22）的核苷酸序列，图26B中展示了氨基酸序列（SEQ ID NO:23）。

在较大的培养中诱导含2份额外的MNN4拷贝和1份α-甘露糖苷酶A的拷贝的解脂耶氏酵母MTLY60，在Ni-NTA柱纯化。因而，在YTG中生长，并在48小时的过程中，在2x225ml（2L摇瓶）油酸培养基中诱导。将培养物离心，在经过0.22μm滤器过滤培养基。过滤的培养基在sephadex G25XK50/100柱（GE Healthcare）脱盐至20mM NaH₂PO₄pH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑，在Ni-sepharose 6FF纯化前去除非蛋白质的干扰性污染物。将脱盐的蛋白质级分上样到4.3ml Ni-sepharose 6FF柱（GE Healthcare）上，该柱用20mMNaH₂PO₄pH 7.4、0.5M NaCl、20mM咪唑平衡过，用同一缓冲液中的50mM咪唑洗涤，并用20mM NaH₂PO₄pH 7.4、20mM NaCl、400mM咪唑洗脱。使用抗His6抗体，在SDS PAGE和Western印迹上分析Ni-sepharose柱后的样品3-10和36-49。通过SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色揭示，在样品40和41的考马斯亮蓝中展现了约50kDa和65kDa的蛋白质条带。在Western印迹中，仅检测到50kDa的条带，最可能是α甘露糖苷酶A。估计的纯化α甘露糖苷酶A产量是100-125μg/L培养基。

纯化的样品用于确定重组α甘露糖苷酶A的糖类型。将糖去除到溶液中，之后用APTS标记。在通过凝胶过滤清洁样品后，在DSA-FACE上分析糖。预期的糖作为主峰存在，所述糖是单甘露糖磷酸化的Man₈GlcNAc₂峰（P）和双甘露糖磷酸化的Man₈GlcNAc₂峰（PP）。

实施例10

在解脂耶氏酵母中表达人α葡萄糖苷酶

构建含有3份人α葡萄糖苷酶拷贝（也称为酸性α葡萄糖苷酶（GAA）或酸性麦芽糖酶EC3.2.1.3）和2份解脂耶氏酵母MNN4基因拷贝的解脂耶氏酵母菌株OXYYl589。菌株OXYl589的基因型如下：

MatA,leu2-958,ura3-302,xpr2-322,

gut2-744,ade2-844

POX2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta

POX2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta

POX2-Lip2pre-h GM-CSF:GUTEx::zeta

YlMNN4-POX2-hp4d-YLMNN4:ADE2::PT targeted

根据普遍建立的规程进行所有的转化，用不同的选择标志物修饰。在所有的情况下（除非另外说明），通过NotI限制性消化获得huGAA整合片段，从而从表达质粒中去除了卡那霉素抗性基因。在Qiagen柱纯化正确的huGAA片段后，通过琼脂糖凝胶电泳分离所获得的片段。通过首先将人GAA（huGAA）克隆到解脂耶氏酵母表达载体中并构建解脂耶氏酵母MNN4串联表达载体，来构建菌株OXYYl589。然后，为了获得最终的huGAA生产菌株OXYY1589，实施3次稳定的整合转化。

解脂耶氏酵母密码子优化的huGAA表达载体：化学合成编码110kDA人GAA（huGAA）前体的核苷酸序列，并密码子优化用于解脂耶氏酵母表达。在合成构建体中，消除前huGAA信号肽和原huGAA信号肽，使得蛋白质从57位氨基酸起始。将合成的huGAA的ORF（图27A）框内融合于解脂耶氏酵母LIP2信号（前）序列的5’端至3’端，后接两个Xxx-Ala切割位点的编码序列，侧翼是BamHI和AvrII限制性酶切位点，用于克隆到表达载体中。构建体处于诱导型POX2启动子的控制下。融合构建体的完整氨基酸序列显示在图27B中。

表达载体的一般构造展示在图28中。细菌部分源自质粒pHSS6，包括细菌来源的复制起点（ori）和赋予卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因（KanR）。整合盒包括a）用于转化解脂耶氏酵母的选择标志物（URA3；LEU2；GUT2），b）包括启动子的表达盒，c）将huGAA框内插入信号序列的多克隆位点（MCS），和d）LIP2基因的终止子。整合盒的侧翼是用于稳定的非同源整合到解脂耶氏酵母基因组中的zeta序列。两个NotI限制性酶切位点使得能够在转化前分离表达盒。质粒pRAN034、pRAN036和OXYP183分别用于产生huGAA表达载体pRAN058、pRAN059和pRAN060，分别含有URA3、LEU2和GUT2转化标志物。

串联YlMNN4表达载体：克隆YlMNN4基因，使其处于诱导型pPOX2启动子和（半）组成型hp4d启动子的控制下。将这两个YlMNN4表达盒亚克隆到一个载体中，作为携带ADE2基因的侧翼区（PT）的串联构建体，用于靶向整合到基因组的ADE2基因座中，ADE2基因作为选择标志物。

中间菌株OXYY1569：第一次转化是共转化从pRAN058和pRAN059载体纯化的表达盒，使用URA3和LEU2标志物产生中间重组菌株OXYY1569。OXYY1569携带了处于pPOX2启动子控制下的huGAA的两个表达构建体随机整合到菌株G014的基因组中。

如下选择OXYY1569。为了验证外源huGAA DNA整合到解脂耶氏酵母的基因组中，实施基因组DNA的PCR筛选。设计引物从huGAA核苷酸序列中扩增2552bp片段。实施基因组DNA的Southern印迹分析，从而验证整合了至少2份huGAA DNA拷贝。特别的是，用HindIII消化OXYY1569克隆的基因组DNA，并用huGAA DIG标记的特异性探针搜索。

为了选择分泌高水平的huGAA的克隆，根据标准程序，在POX2诱导条件下，在摇瓶中生长PCR筛选和Southern印迹中鉴别为阳性的若干个随机选择的克隆。在所有的情况下，在诱导72h后，收集培养上清液，在标准的Western印迹和酶活性测定分析中筛选。OXYY1569的N-聚糖分析表示OXYY1569中的主要结构是Man₈GlcNAc₂。

中间菌株OXYYl584：为了在基因组中整合2份解脂耶氏酵母MNN4基因拷贝产生OXYYl584，转化重组菌株OXYYl569。转化是用从质粒OXYP1479B中切出的SacII/XmaI来源的表达盒实施的。表达盒设计用于靶向整合到解脂耶氏酵母基因组的ADE2基因座中。在Southern印迹和聚糖分析后选择重组菌株，评估涉及增加的磷酸化的菌株行为。用SpeI消化若干人为选定的转化子的基因组DNA，并用MNN4特异性的DIG标记探针搜索。MNN4表达盒正确的靶向整合到解脂耶氏酵母基因组的ADE2基因座中应该产生4207bp和5683bp的条带。在标准的摇瓶程序中生长Southern印迹阳性克隆。为了选择中间克隆OXYY1584，实施分泌蛋白质的N-聚糖分析。与亲代菌株OXXY1569相比，MNN4过表达后的主要结构是Man₈GlcNAc₂(PMan)₁和Man₈GlcNAc₂(PMan)₂。

生产菌株OXYYl589：为了产生最终的原养型生产菌株OXYY1589，将第3份huGAA拷贝整合到重组OXYY1584菌株的基因组中。转化是用来自pRAN069的Not I切出的表达盒实施的。首先通过PCR对gDNA中存在的huGAA的额外拷贝来筛选转化子。为了评估huGAA生产，进一步分析人为选择的PCR阳性克隆在标准摇瓶培养后的表达。在Western印迹分析和酶活性测定后，选择表达最高huGAA水平的克隆。还再次验证了M8向MP2-M8和MP-M8N-聚糖的转化水平不受额外的huGAA表达盒的存在的影响。

实施例11

补料分批培养菌株OXYY1589

为了从菌株OXYY1589（实施例10）生产huGAA，使用10L搅拌罐建立补料分批方法，工作体积为6-8升。方法分为两个阶段：

1）在葡萄糖上分批生长进行生物量形成；

2）在有限的油酸补料的帮助下，诱导产物形成。

通常，分批阶段是约20个小时，生产阶段约72个小时。在方法结束时，离心培养肉汤，收集上清液。上清液用作纯化GAA的起始材料（参见实施例12）。

在发酵过程中控制下列参数。

将鼓气维持在1.5vvm空气（体积/体积/分钟）的恒定值。溶解氧（DO）最初保持在30%。根据DO水平，将搅拌从600增加至1200rpm。一旦达到最大1200rpm，保持该速度恒定，并将DO设定点设为10%。为了维持10%DO，将氧气按50%的最大百分比冲入反应罐中。通过泡沫探针控制泡沫发生。在检测泡沫的情况下，向生物反应罐中添加抑泡剂。通过添加14%(v/v)氨水（碱）或10%磷酸控制pH，维持pH 6.8的恒定值。在整个过程中，将温度保持恒定在28°C。

通过测量600nm的光密度（OD600）监控生物量。在蒸馏水中将样品稀释2-1000倍，获得在分光光度计线性范围内的值。通过Western印迹分析和特定酶活性测试来检测产物形成。

实施例12

纯化重组huGAA（rhGAA）

通过深层过滤澄清培养后的上清液（参见实施例11）。然后，通过TFF将获得的材料浓缩20倍，并在10kDa MWCO膜（Millipore）上，用20mM磷酸钠pH6和100mM NaCl渗滤。

通过添加多达1M浓度的硫酸铵开始纯化rhGAA。在离心后，将上清液上样到Toyopearl-Phenyl 650M（Tosoh Biosciences）装填的XK16/40柱上。将从1至0M硫酸铵的线性梯度用于洗脱。然后，混合含有rhGAA的那些级分，并经过缓冲液交换为10mM BIS-TRIS pH 6。通过在source 30Q装填的Tricorn10/50或XK25/20柱（GE Healthcare）上的阴离子交换层析，使用从1至0M的NaCl线性梯度实现进一步纯化。然后，在上样到最终的Hiload 16/60superdex200凝胶过滤柱（GE Healthcare）之前，浓缩所获得的含GAA的级分，所述凝胶过滤柱已用50mM磷酸钠pH6和200mM NaCl平衡过。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的比活和纯度的基础上，选择级分，然后将所述级分组合并浓缩至最终5-10mg/ml的浓度。在15ml Amicon Ultra离心装置（Millipore）上，用10kDa的MWCO进行蛋白质离心。

通过向10或5μl洗脱级分中按10:1或20:1的体积比，添加由0.35mM4-MUG、0.1%BSA和100mM醋酸钠pH 4组成的反应缓冲液，开始rhGAA定性筛选的反应。所有的反应都在96孔平底微滴度板中进行。在37°C下30分钟至1小时的孵育期后，加入等体积的100mM甘氨酸pH11终止反应，在UV光下观察荧光反应产物4-甲基羟基香豆素的释放。使用合成底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）的比色测定，确定比活（单位/mg蛋白质），所述测定测量呈黄色的对硝基苯酚反应产物的酶促释放。通过在微滴度板的反应孔中混合10μl酶溶液和90μl底物反应缓冲液（2mM PNPG在150mM柠檬酸-磷酸缓冲液pH4，1%BSA中）开始反应，之后在37℃孵育。在1至2小时后，加入等体积的终止缓冲液10%碳酸钠pH12淬灭反应，使释放的对硝基苯酚（PNP）处于其离子化状态。在405nm波长测量背景-校正吸收和对硝基苯酚标准，计算比活。用二喹啉甲酸（BCA）方法确定蛋白质浓度。一个单位定义为在37℃下，在最终底物浓度为2mM的柠檬酸-磷酸缓冲液pH 4.0中，每分钟催化1nmol PNPG转化为1nmol PNP和D-葡萄糖的酶量。

实施例13

异源表达的CcMan5对具有较高程度的磷酸化N-聚糖的解脂耶氏酵母菌株中表达的糖蛋白的磷酸脱帽活性

在解脂耶氏酵母菌株OXYYl589中表达huGAA，产生具有高度磷酸化N-聚糖结构的糖蛋白（参见实施例10）。如实施例12所述纯化huGAA。

向含2mM CaCl₂的100mM HEPES缓冲液pH 7.0中的4μg huGAA溶液中添加CcMan5（70μg/ml浓度下分别1和5μl）。20μl反应混合物在室温孵育过夜。用PNGaseF释放N-聚糖，用APTS标记，之后在DSA-FACE上分析，基本如Laroy W.等人，Nature Protocols,1：397-405(2006)中所述。在CcMan5处理之前和之后的N-聚糖谱显示在图29中。从纯化的huGAA中释放的N-聚糖混合物主要包括ManP-Man8GlcNAc₂和(ManP)2-Man8GlcNAc₂（图29，B道）。比ManP-Man8GlcNAc₂跑得略快的峰可以归于ManP-Man7GlcNAc₂。仅存在非常少量的Man₈GlcNAc₂和Man₇GlcNAc₂。在huGAA与CcMan5孵育后，观察到ManP-Man8GlcNAc₂和(ManP)2-Man8GlcNAc₂分别向P-Man8GlcNAc₂和P2-Man8GlcNAc₂的转化（图29，C和D道）。电色谱图中走样在P-Man8GlcNAc₂和P2-Man8GlcNAc₂之间的峰对应于存在磷酸二酯和磷酸单酯连接的部分脱帽的双磷酸化(ManP)2-Man8GlcNAc₂（图29中的(MP)-M8-P，C和D道）。当使用更高浓度的CcMan5或更长的孵育时间时，该产物被进一步水解为完全脱帽的P2-Man8GlcNAc₂。

根据测量DSA-FACE电色谱图中的峰面积（图29），估计磷酸化N-聚糖相当于中性N-聚糖的百分比。附图相对于曲线下方的面积表示huGAA上在CcMan5处理之前（B道）和之后（D道）存在的不同N-聚糖。在huGAA中（B道），存在(ManP)2-Man8GlcNAc₂(11597)、ManP-Man6GlcNAc₂(1261)、ManP-Man7GlcNAc₂(5901)、ManP-Man8GlcNAc₂(15576)、Man6GlcNAc₂(680)、Man7GlcNAc₂(1716)、Man8GlcNAc₂(1572)。重组huGAA上的约90%的N-聚糖由含有甘露糖-磷酸的结构组成。

在用CcMan5处理重组huGAA过夜后（D道），存在P2-Man8GlcNAc₂(16182)、(ManP)P-Man8GlcNAc₂(1997)、P-Man7GlcNAc₂(8254)、P-Man8GlcNAc₂(17893)、ManP-Man6GlcNAc₂(500)、ManP-Man7GlcNAc₂(2495)、ManP-Man8GlcNAc₂(1326)、Man6GlcNAc₂(1097)、Man7GlcNAc₂(2143)、Man8GlcNAc₂(1599)。存在从huGAA释放的N-聚糖，所述N-聚糖由83%的脱帽磷酸化结构、8%仍然加盖了甘露糖-磷酸的结构和9%中性N-聚糖组成。当使用更高浓度的CcMan5或更长的孵育时间时，可以增加脱帽的磷酸化结构的百分比。

实施例14

鉴别可能具有脱帽活性的同源物

为了鉴别具有相似的预测催化位点拓扑学和功能性的其他GH92家族成员，分析从世界范围的网址cazy.org/GH92 all.html发掘的额定的（curated）GH92家族成员，使用NCBI的非冗余蛋白质序列数据库中的CcMan5结构域序列Blastp搜索获得的前500位命中。之后，使用这392条序列作为多重序列比对包MUSCLE（MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation）的输入，所述包还按“系统发育”距离排列序列（从最密切相关的至最远相关的）。

基于Cazy数据库的额定的GH92家族成员，MUSCLE比对所有的GH92蛋白质序列（392条）和CcMan5结构域序列鉴别出下列序列作为CcMan5最接近的同源物：

天蓝色链霉菌CAA18915（GenBank登录号：NP_630514）

螺状梭菌（Clostridium spiroforme）（GenBank登录号：ZP_02866543）

多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron AAO78636）（GenBank登录号：NP_812442）

Zunongwangia profunda ADF52306（GenBank登录号：YP_003584502）

Chitinophaga pinensis ACU58463（GenBank登录号：YP_003120664）

图31中比对了它们的序列和之后的5个最接近的同源物。

基于MUSCLE比对500个最高分的blastp蛋白质命中与CcMan5结构域，认为以下是CcMan5最接近的同源物：

天蓝色链霉菌（GenBank登录号：NP_630514）

变铅青链霉菌（GenBank登录号：ZP_05522540）

变铅青链霉菌（GenBank登录号：ZP_06527366）

类芽孢杆菌（GenBank登录号：YP_003013376）

多形拟杆菌（GenBank登录号：NP_812442）

拟杆菌（GenBank登录号：ZP_04848482）

Bacteroides cellulosilyticus（GenBank登录号：ZP_03677957）

Zunongwangia profunda（GenBank登录号：YP_003584502）

Leeuwenhoekiella blandensis（GenBank登录号：ZP_01061975）

Sphingobacterium spiritivorum（GenBank登录号：ZP_07083984）

Chitinophaga pinensis（GenBank登录号：YP_003120664）

土地杆菌（GenBank登录号：ZP_01885202）

螺状梭菌（GenBank登录号：ZP_02866543）

这些和5个次佳同源物的比对可见于图32中。来自标引的GH92数据库的所有5个最佳命中也都可见于完整序列数据库的Blast搜索的这13条最佳命中中。

图31中的前5个命中和图32中的前13个命中独有的共享了下列3个基序，所述基序在实施例8的晶体结构中显示不同于α-1,2-甘露糖苷酶GH92家族成员，后者的结构报道在Zhu等人，2010，见上文中。

1）富含甘氨酸的基序GVGXXGXGG，其中X是G、S、T、V、A、C或Q（小侧链），CcMan5结构域的晶体结构残基编号：69-77。该区域形成环，为-1和酶的活性位点中的磷酸-结合子位点提供了关键性的氢键。

2）VRXE基序。R与-1环，并可能与+1环形成氢键。E处于与该R残基的盐键桥中，可能使该基序成形。X在最密切相关的亚家族（CcMan5的前3个同源物）中是W，或者可以是20种氨基酸中除P以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ ID NO:50的404-407位残基。

3）LYQGT基序，含有Q（在甘露糖苷酶中是E）（质子供体），并含有对+1位点形成而言是重要的Y535。在一些序列中，L是A或Y，还可以合理的预期是I、V、A、F或M，在其中一些中，T是N，可以预期还耐受S。两条柄细菌属的序列具有E代替Q，因而预期对磷酸化聚糖不起作用。

4）GDXGN基序。D和N构成部分的底物结合空穴，并可能形成结合+1甘露糖的备选子口袋。X可以是除P以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ IDNO:50的21-25位残基。

基于上述食物信息学工作流和基于结构的基序搜索，因而能够过滤存在于非冗余蛋白质序列数据库中的GH92序列（目前还有超过1220条序列）中稀有的家族成员，所述成员是具有与CcMan5相同底物特异性的良好候选物，即，能够脱帽Man-6-Pi-Man结构。特别的是，来自天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌的3条序列不仅在上述基序中，而且在结构的许多环中与CcMan5相似。

使用基于CcMan5及其最密切的同源物所独有的序列元件的隐马尔可夫模型的搜索，揭示了没有其他还有所有这些元件的GH92序列，强烈暗示没有此类GH92成员通过趋同进化获得这些元件（存在不是多重序列比对中排名靠前的成员）。

实施例15

多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的GH92葡萄糖苷酶中存在磷酸脱帽活性

Zhu,Y.等人，2010，见上文已经报道了对多形拟杆菌的23个家族GH92α-甘露糖苷酶的酶学分析。这类酶中存在具有α1,2-、α1,4-、α1,3-或α1,6-甘露糖苷酶活性的酶，但是一些变体表现出非常低的活性。两个α1,2-甘露糖苷酶的三维结构（Bt3990和Bt2199）允许鉴别对于α1,2-甘露糖苷酶活性似乎是签名基序的关键性氨基酸残基，即，Bt3990中的His584-Glu585和Trp99。测试了多形拟杆菌的3个GH92酶——Bt3530（Genbank nr AAO78636.1）、Bt3965（Genbank nr AAO79070.1）和Bt3994（Genbank nr AAO79099.1），对磷酸化N-聚糖（实施例1中描述的MNN4糖）的活性。这些酶表现出低的α1,4-甘露糖苷酶活性，并缺少His-Glu和Pro-Trp基序。

在E.coli中表达Bt3530、Bt3965和Bt3994，并如Zhu等人，2010，见上文所述纯化。在室温下的过夜测定中，将样品（浓度为0.1mg/ml的1μl酶）与溶解在含2mM CaCl₂的10mM HEPES缓冲液pH 7.0中的7μl APTS-标记的MNN4糖孵育。包括含CcMan5的对照测定。为了验证存在末端磷酸，将反应混合物与CIP孵育。使用含有Man8GlcNAc₂(M8)和单磷酸化ManP-Man8GlcNAc₂(MP-M8)的N-聚糖制品作为底物。在上述测定条件下，没有检测到Bt3530、Bt3965和Bt3994的任何脱帽活性。相比CcMan5对照反应（出现快速移动的P-M8峰），在CIP处理后（P-M8消失），没有观察到峰的电泳迁移率的改变。

在额外的实验中，将1μl酶，即分别是Bt3530（0.1mg/ml）、Bt3965（4.75mg/ml）和Bt3994（1.37mg/ml），在pH 7.0（含2mM CaCl₂的10mM HEPES缓冲液pH 7.0）和pH 5.0（含2mM CaCl₂的10mM醋酸铵pH 5.0）与MNN4N-聚糖在室温下孵育60小时。Bt3530在pH 7.0下观察到非常小的α1,2-甘露糖苷酶活性，在电色谱图中出现了小的Man5GlcNAc₂(M5)峰。另一方面，在pH5.0，不存在任何α1,2-甘露糖苷酶活性，但电色谱图的左手侧出现了快速移动的峰。该峰具有与P-Man8GlcNAc₂(P-M8)相同的电泳迁移率，且在CIP孵育后末端磷酸被水解。CcMan5（使用与Bt3530相同的浓度）在室温和pH 7.0孵育20小时内，将ManP-Man8GlcNAc₂完全脱帽；因此，观察到的Bt3530活性相当低。在纯化后，当储藏在4℃下含300mM NaCl的20mM TRIS缓冲液pH 8.0中时，Bt3530样品缓慢沉淀。因此，可能是Bt3530蛋白质的不稳定性影响了在所使用的测定条件下的活性。Bt3965使用高40倍的浓度时，在pH 7.0（G和H道）和pH 5.0（I和J道）下产生与Bt3530相似的结果。在相同的反应条件下，用Bt3994完全没有观察到任何活性（K至N道）。

根据这些实验，可以概括磷酸的脱帽活性只是三种在MNN4糖上测试的多形拟杆菌GH 92酶中的两种的微小的副活性。

其他方案

已结合详细的说明描述了本发明，上述说明意在示例而非限制本发明的范围，所述范围是由所附权利要求的范围定义的。其他方面、优点和修饰都落入下列权利要求的范围内。

Claims (61)

1.脱帽(uncapping)寡糖上的甘露糖-6-磷酸残基的方法，所述方法包括：

A）提供所述具有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接的寡糖；和

B）将所述寡糖与能够水解所述甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接触。

2.权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQ ID NO:50的1至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQ ID NO:50的1至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQ ID NO:50的1至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

6.权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶包括以下氨基酸序列，所述序列具有（i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；（ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr，Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

7.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述接触步骤是使用纯化的甘露糖苷酶、重组的甘露糖苷酶、含有所述重组的甘露糖苷酶的细胞裂解物，或者含有所述重组的甘露糖苷酶的真菌细胞来实施的。

8.权利要求1-7的任一项的方法，其中所述寡糖与蛋白质连接。

9.权利要求7的方法，其中所述蛋白质是在真菌生物中表达的人蛋白。

10.权利要求9的方法，其中所述真菌生物是解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）或Arxula adeninivorans。

11.权利要求9的方法，其中所述真菌生物是甲基营养型酵母。

12.权利要求11的方法，其中所述甲基营养型酵母是毕赤酵母（Pichiapastoris）、甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）、Oogataea minuta或多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）。

13.权利要求9的方法，其中所述真菌生物是丝状真菌。

14.权利要求13的方法，其中所述丝状真菌选自浅蓝灰曲霉（Aspergilluscaesiellus）、亮白曲霉（Aspergillus candidus）、肉色曲霉（Aspergillus carneus）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）、弯头曲霉（Aspergillus deflectus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、灰绿曲霉（Aspergillusglaucus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、Aspergillus penicilloides、局限曲霉（Aspergillusrestrictus）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）、聚多曲霉（Aspergillus sydowi）、Aspergillus tamari、土曲霉（Aspergillus terreus）、焦曲霉（Aspergillus ustus）和花斑曲霉（Aspergillus versicolor）。

15.权利要求8的方法，其中所述蛋白质是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。

16.权利要求15的方法，其中所述溶酶体蛋白是溶酶体酶。

17.权利要求16的方法，其中所述溶酶体蛋白与溶酶体贮积症（LSD）相关。

18.权利要求17的方法，其中所述LSD是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GM1-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病（Scheie disease）、II型粘多糖病（Hunter disease）、IV型粘多糖病（Sanfilippo disease）、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病（Maroteaux-Lamy disease）、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco-

综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon氏病或Geleophysic发育不良。

19.权利要求18的方法，其中所述LSD是庞贝氏症或费波瑞病。

20.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述甘露糖苷酶包括靶向序列。

21.生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法，所述方法包括：

提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖；和

向所述细胞导入编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生产包括所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的所述靶蛋白。

22.权利要求21的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

23.权利要求21的方法，其中所述甘露糖苷酶包括a）与SEQ ID NO:50的1至774位氨基酸或SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b）具有以下序列的氨基酸序列：i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr,Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

24.权利要求21-23的任一项的方法，其中所述真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。

25.权利要求21-24的任一项的方法，其中所述真菌细胞是经过改造而缺少OCH1活性的。

26.权利要求21-25的任一项的方法，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）或变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）的甘露糖苷酶。

27.在真菌生物中生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法，所述方法包括：

A）提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖，且所述真菌细胞进一步包括编码靶蛋白的核酸；和

B）分离所述具有所述末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。

28.权利要求27的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

29.权利要求27的方法，其中所述甘露糖苷酶包括（i）与SEQ ID NO:50的1至774位氨基酸或SEQ ID NO:50所述氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或（ii）具有以下序列的氨基酸序列：（i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；（ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr,Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

30.权利要求27-29的任一项的方法，其中所述靶蛋白和所述甘露糖苷酶是共同分泌的。

31.经过遗传改造生产包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白的分离的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，其中所述甘露糖苷酶在所述真菌细胞中的表达产生了包含所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白。

32.权利要求31的真菌细胞，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

33.权利要求31的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括（a）与SEQ IDNO:50的1至774位氨基酸或SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或（b）具有以下序列的氨基酸序列：（i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；（ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr,Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

34.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞还包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。

35.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞经过遗传改造缺少OCH1活性。

36.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，且其中所述真菌细胞经过遗传改造缺少OCH1活性。

37.权利要求31-36的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞还包括编码靶蛋白的核酸，其中所述靶蛋白是糖蛋白。

38.权利要求31-36的任一项的真菌细胞，其中所述靶蛋白是人蛋白。

39.权利要求38的真菌细胞，其中所述靶蛋白是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。

40.权利要求39的真菌细胞，其中所述溶酶体蛋白是溶酶体酶。

41.权利要求40的真菌细胞，其中所述溶酶体酶是酸性α葡萄糖苷酶或α半乳糖苷酶。

42.权利要求38的真菌细胞，其中所述靶蛋白是与LSD相关的蛋白质。

43.权利要求42的真菌细胞，其中所述LSD是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GM1-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病（Scheie disease）、II型粘多糖病（Hunter disease）、IV型粘多糖病（Sanfilippo disease）、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病（Maroteaux-Lamydisease）、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco-综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon氏病或Geleophysic发育不良。

44.权利要求31-43的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans的细胞。

45.权利要求32的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是MNN4多肽。

46.权利要求45的真菌细胞，其中所述MNN4多肽是解脂耶氏酵母、酿酒酵母（S.cerevisiae）、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌（C.albicans）的多肽。

47.权利要求46的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是毕赤酵母PNO1多肽。

48.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天蓝色链霉菌或变铅青链霉菌的甘露糖苷酶。

49.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括分泌信号。

50.权利要求33-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括将所述甘露糖苷酶靶向胞内区室区域的靶向信号。

51.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括将所述甘露糖苷酶靶向胞内区室区域的分泌信号和靶向信号。

52.解脂耶氏酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、Arxula adeninivorans、甲醇毕赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉细胞的基本纯的培养物，其大部分被遗传改造为生产包括末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白，所述细胞包括编码能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。

53.权利要求52的培养物，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标

偏差以内。

54.权利要求52的培养物，其中所述甘露糖苷酶包括a）与SEQ ID NO:50的1至774位氨基酸或SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b）具有以下序列的氨基酸序列：（i）GVGXXGXGG基序，其中X是Gly,Ala,Ser,Thr或Cys；（ii）VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；（iii）X₁YQGX₂基序，其中X₁是Leu,Ile,Val,Ala,Phe,Tyr或Met，其中X₂是Thr,Ser或Asn；或（iv）GDXGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。

55.权利要求52-54的培养物，其中所述细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。

56.权利要求55的培养物，其中所述细胞经过遗传改造而缺少OCH1活性。

57.包含末端磷酸-6-甘露糖残基的分离的糖蛋白，其中所述蛋白是由权利要求1-30的任一项的方法生产的。

58.包含糖蛋白的组合物，其中所述糖蛋白上至少47%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。

59.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少50%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。

60.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少75%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。

61.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少90%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。

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