KR101979220B1 - 인산화된 n-글리칸들의 탈-만노실화 - Google Patents

Abstract

하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-당단백질 상의 1,2 만노스 결합 또는 일부를 가수 분해할 수 있는 만노시다제를 이용하는 인산화된 N-글리칸들을 탈만노실화하는 방법이 개시된다.

Description

인산화된 N-글리칸들의 탈-만노실화{DE-MANNOSYLATION OF PHOSPHORYLATED N-GLYCANS}

본 발명은 하지의 만노스(mannose)가 인산화될 때에 말단α-1,2-만노스를 가수분해할 수 있는 알파-만노시다제들(mannosidases)에 관한 것이다.

본 출원은 2010년 9월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/387,924호를 우선권으로 수반하는 출원이다. 상기 우선권 출원의 내용은 여기에 참조로 포함된다.

고성능 발현 시스템들이 현재에 개발 중인 대부분의 생물 약제들(biopharmaceuticals)(예를 들면, 재조합 단백질들)을 생산하는 데 요구된다. 이들 생물 약제들의 생리 활성은 이들의 번역 후의 변형(예를 들면, 인산화(phosphorylation) 또는 글리코실화(glycosylation))에 의존한다. 효모 베이스 발현 시스템은 유전자 조작과 미생물 유기체의 발효의 용이성과 단백질을 분비하고 변형하는 능력을 결합시킨다. 그러나, 효모 세포들 내에서 생성된 재조합 당단백질들(glycoproteins)은 주로 이질성의 고-만노스 및 과-만노스 글리칸 구조들을 나타내며, 이는 단백질 기능기, 분리 및 회수 공정 및 후속하는 치료 용도, 특히 글리코실화가 생물학적으로 중요한 역할을 하는 경우에 유해할 수 있다.

본 발명은 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합 또는 일부를 가수 분해할 수 있는 만노시다제의 발견을 기초로 한다.

일 측면에 있어서, 본 명세서는 당단백질(glycoprotein) 상의 인산화된(phosphorylated) N-글리칸들을 탈만노실화(demannosylating)하는 방법에 특징이 있다. 상기 방법은 인산화된 N-글리칸들을 갖는 상기 당단백질을 제공하는 단계; 그리고 상기 당단백질을 하지의 만노스(mannose)가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합 또는 일부를 가수 분해할 수 있는 만노시다제(mannosidase)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 만노시다제는 아스페르길루스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)에 기인할 수 있다. 상기 방법은 상기 당단백질 containing 상기 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸을 함유하는 상기 당단백질을 분리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단백질은 진균 유기체(fungal organism) 내에 발현되는 인간 단백질일 수 있다. 예를 들면, 상기 진균 유기체는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)가 될 수 있다. 상기 진균 유기체는 또한 메틸영양체(methylotrophic) 효모(예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 혹은 사상균(filamentous fungus)(예를 들면, 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페로길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페로길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페로길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 또는 아스페로길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor))가 될 수 있다. 상기 단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장 인자, 시토키닌(cytokine), 케모키닌(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 조각, 혹은 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 상기 리소좀 단백질은 리소소말 축적 질환(lysosomal storage disorder: LSD)과 연관된 리소좀 효소와 같은 리소좀 효소일 수 있다. 리소소말 축적 질환(LSD)은 파브리 병(Fabry's disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 화버 병(Farber disease), 고셰 병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드 축적증(gangliosidosis), 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease), 샌드호프 병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질환(activator disease), 크라베 병(Krabbe disease), 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크 병(Niemann-Pick disease), 샤이에 병(Scheie disease), 헌터 병(Hunter disease), 산필립포 병(Sanfilippo disease), 모르키오 병(Morquio disease), 마로토-라미 병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로디나제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파틸그루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드 축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 시알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피 병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(cholesterol ester storage disease), 울만 병(Wolman disease), 다종 술파타제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴 축적증(cystinosis), 시알산 축적 질환(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(Marinesco-Sjgren syndrome)을 갖는 킬로미크론 함유 질환(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논 병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)일 수 있다.

본 명세서는 또한 진균 유기체(fungal organism) 내에 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 갖는 표적 단백질(target protein)을 생성하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합이나 일부를 가수 분해할 수 있는 핵산 인코딩 만노시다제를 포함하도록 유전 공학에 의해 생성된genetically engineered 진균 세포(fungal cell)를 제공하는 단계와 상기 세포 내에 핵산 인코딩 표적 단백질을 도입하는 단계를 포함한다.

본 명세서는 또한 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 당단백질들을 생성하는 분리된 유전 공학에 의해 생성된 진균 세포를 특징으로 한다. 상기 진균 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)가 될 수 있다. 상기 진균 세포는 또한 메틸영양체 효모(예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)) 혹은 사상균(예를 들면, 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페로길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페로길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페로길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 또는 아스페로길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor))일 수 있다. 상기 진균 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 증진시킬 수 있는 핵산 인코딩(nucleic acid encoding) 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 진균 세포는 OCH1 활성이 결핍되도록 유전 공학에 의해 생성될 수 있다. 상기 진균 세포는 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 핵산 인코딩 폴리펩티드를 더 포함할 수 있으며, 상기 진균 세포는 OCH1 활성이 결핍되게 유전 공학에 의해 생성된 진균 세포이다.

진균 세포는 핵산 인코딩 표적 단백질을 더 포함할 수 있고, 상기 표적 단백질은 당단백질이다. 상기 표적 단백질은 인간 단백질이 될 수 있다. 상기 표적 단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장 인자, 시토키닌, 케모키닌, 항체 또는 이의 항원-결합 조각, 혹은 융합 단백질일 수 있다. 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소일 수 있다. 상기 표적 단백질은 파브리 병(Fabry's disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 화버 병(Farber disease), 고셰 병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드 축적증(gangliosidosis), 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease), 샌드호프 병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질환(activator disease), 크라베 병(Krabbe disease), 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크 병(Niemann-Pick disease), 샤이에 병(Scheie disease), 헌터 병(Hunter disease), 산필립포 병(Sanfilippo disease), 모르키오 병(Morquio disease), 마로토-라미 병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로디나제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파틸그루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드 축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 시알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피 병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(cholesterol ester storage disease), 울만 병(Wolman disease), 다종 술파타제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴 축적증(cystinosis), 시알산 축적 질환(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(Marinesco-Sjgren syndrome)을 갖는 킬로미크론 함유 질환(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논 병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)과 같은 리소소말 축적 질환(LSD)과 연관된 단백질일 수 있다. 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드는 MNN4 폴리펩티드(예를 들면, 야로위아 리플리티카(Yarrowia liplytica), S. 세레비시아에(cerevisiae), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(albicans) 폴리펩티드))가 될 수 있다. 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드는 P. 파스토리스(pastoris) PNO1 폴리펩티드일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 명세서는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 또는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포들의 실질적으로 순수한 배양을 특징으로 하며, 이의 실질적인 숫자가 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 함유하는 당단백질들을 생성하도록 유전 공학에 의해 생성된다. 상기 세포들은 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 세포들은 OCH1 활성이 결핍되도록 유전 공학에 의해 생성될 수 있다. 상기 세포들은 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드를 더 포함할 수 있고, OCH1 활성이 결핍되게 유전 공학에 의해 생성될 수 있다.

다르게 정의하지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는바와 동일한 의미를 가진다. 비록 여기에 기재된 것들과 유사하거나 동일한 방법들 및 물질들이 본 발명의 실제 적용이나 시험을 위해 사용될 수 있지만, 다음에 기술되는 방법들 및 물질들은 예시적이다. 모든 공보들, 특허 출원들, 특허들, 젠뱅크®(Genbank®) 기탁 번호들 그리고 여기에 언급된 다른 참조 문헌들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 상충되는 경우에 있어서, 정의들을 포함하여 본 출원이 조절할 것이다. 상기 물질들, 방법들 및 실험예들은 단지 예시적인 것이고, 제한하려는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 다음의 상세한 설명과 특허 청구 범위로부터 보다 분명해질 수 있다.

도 1a는 볼드(SEQ ID NO：1) 내에 lip2 프리 서열을 갖는 인간 알파 글루코시다제(GAA)의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 묘사도이며, 도 1b는 볼드(SEQ ID NO：2) 내에 lip2 프리 서열을 갖는 인간 알파 글루코시다제(GAA)의 아미노산 배열을 묘사도이고, *는 정지 코돈(SEQ ID NO：2)을 나타낸다.
도 2는 huGAA의 클로닝을 위해 사용되는 Y. 리폴리티카(lipolytica) 발현 벡터의 개략도이다.
도 3은 DsbA-CcMan5(SEQ ID NO：3)의 개방 리딩 프레임(ORF)의 뉴클레오티드 서열의 묘사도이다.
도 4는 DsbA-CcMan4(SEQ ID NO：4)의 ORF의 뉴클레오티드 서열의 묘사도이다.
도 5는 플라스미드들 pLSAHCcMan5 및 pLSAHCcMan4의 개략도이다.
도 6은 하지의 만노스가 인산화될 경우에 α-1,2-만노시다제가 말단 α-1,2-만노스를 가수 분해도 할 수 있는 것으로 가정하여, 잠재적인 최종 가수 분해 생성물들의 개략도이다.
도 7은 인산염 무개방 효소(phosphate uncapping enzyme)를 사용하여 수득된 반응 생성물들의 개략도이다.
도 8은 HjMan 및 AsMan과 함께 Man8GlcNAc2와 인산화된 설탕 ManP-Man8GlcNAc2(Panel B)를 포함하는 N-글리칸 제조의 가수 분해를 위한 DSA-FACE 일렉트로페로그램들(electroferograms)을 포함한다.
도 9a 및 도 9b는 HjMan(9A) 및 AsMan(9B)와 함께 Man8GlcNAc2 및 인산화된 설탕 ManP-Man8GlcNAc2(패널 B)를 포함하는 N-글리칸 제조의 가수 분해를 위한 DSA-FACE 일렉트로페로그램들이며, 여기서 MNN4 설탕들은 인산염 무개방 효소 CcMan5로 먼저 처리된다.
도 10은 AsMan 또는 HjMan를 사용하는 MNN4 제조의 가수 분해를 위한 DSA-FACE 일렉트로페로그램 분석을 포함한다.
도 11은 α-1,2-만노시다제 처리 전 및 후의 N-글리칸 프로파일들을 포함한다.
도 12a 및 도 12b는 MNN4 과발현하는 스트레인으로부터 유래된 (APTS)-라벨된 N-글리칸들 상의 주변 세포질(periplasmic) 용액의 활성의 DSA-FACE 일렉트로페로그램 분석이다.
도 13은 Y. 리폴리티카(lipolytica) 내에서 발현된 huGAA로 인큐베이팅한 후의 CcMan4 및 CcMan5의 활성의 DSA-FACE 일렉트로페로그램 분석이다.
도 14는 Y. 리폴리티카(lipolytica) 내에서 발현된 huGAA로 인큐베이팅한 후에 재조합적으로 발현된 ERManI 또는 GolgiManIA의 활성의 DSA-FACE 일렉트로페로그램 분석이다.
도 15는 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi)(SEQ ID NO：5)에 기인하는 만노시다제의 아미노산 배열의 묘사도이다.

일반적으로, 본 명세서는 바로 아래의 만노스(mannose)가 인산화(phosphorylated)될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합(linkage) 또는 부분(moiety)을 가수 분해하는 방법들과 물질들을 제공한다. 여기서 설명하는 방법들과 물질들은 특히 이들의 분해에 수반되는 분해 효소들(catabolic enzymes)의 손상된 활성으로 인하여 리소좀들 내에서 저장 생성물들의 축적에 의해 특징지어지는 유전적 대사 장애들(metabolic disorders)의 다양한 그룹인 리소소말 축적 질환들(lysosomal storage disorders: LDS)을 갖는 환자들의 치료를 위한 제제들의 생산에 특히 유용하다. 저장 생성물들의 강화는 세포 기능 부전과 진행성 치료 징후들을 가져온다. 분해 효소들의 결핍은 투약된 효소가 질병이 있는 세포들의 리소좀들을 표적으로 할 수 있게 제공하는 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy: ERT)에 의해 교정될 수 있다. 리소좀 효소들은 통상적으로 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 내에서 합성되고, 분비 경로를 통해 골지체(Golgi)로 운송되며, 이후에 리소좀들에 적용되는 당단백질들(glycoproteins)이다. 여기서 설명하는 방법들과 물질들을 이용하여, 미생물을 베이스로 하는 생산 과정들이 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 갖는 치료 단백질들(therapeutic protein)을 수득하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 여기서 설명하는 방법들과 물질들은 리소소말 축적 질환들과 같은 대사 장애들의 치료를 위한 당단백질들의 제조에 유용하다.

만노시다제들( Mannosidases )

본 명세서는 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합이나 일부를 가수 분해할 수 있는 분리된 핵산들을 인코딩하는(nucleic acids encoding) 만노시다제들을 제공한다. "핵산(nucleic acid)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어들은 여기서 상호 교환 가능하게 사용되며, cDNA, 게놈 DNA, 핵산 유사체들을 함유하는 합성 DNA 및 DNA(또는 RNA)를 포함하여 RNA 및 DNA 모두를 언급한다. 폴리뉴클레오티드들은 임의의 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중-사슬 또는 단일-사슬(즉, 센스(sense) 사슬 또는 안티센스(antisense) 사슬)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 제한적이지 않은 예들은 유전자들, 유전자 조각들, 엑손들(exons), 인트론들(introns), 메신저 RNA(mRNA)), 운반 RNA), 리보솜 RNA, siRNA, 마이크로-RNA, 리보자임들(ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드들, 분지화된(branched) 폴리뉴클레오티드들, 플라스미드들(plasmids), 벡터들(vectors), 임의의 배열의 분리된 DNA, 임의의 배열의 분리된 RNA, 핵산 탐침들(probes), 그리고 프라이머들(primers)뿐만 아니라 핵산 유사체들을 포함한다.

"폴리펩티드(Polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 여기서 상호 교환 가능하게 사용되며, 길이나 번역 후 변형에 관계없이 아미노산들의 임의의 펩티드-링크된 사슬을 의미한다. 통상적으로, 여기서 설명하는 폴리펩티드(예를 들면, 만노시다제 또는 탈만노실화된 표적 단백질)는 이가 제조의 전체 단백질의 적어도 60 중량%, 예를 들면 샘플 내의 전체 단백질의 60%를 구성할 때에 분리된다. 일부 실시예들에 있어서, 여기서 설명하는 폴리펩티드는 제조의 전체 단백질의 적어도 75 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 99 중량%를 구성한다.

"분리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 자연적으로 생성되는 게놈(예를 들면, 효모 게놈) 내의 핵산의 하나 또는 양측면 옆에 정상적으로 배치되는 핵산들을 포함하여 자연적으로 생성되는 게놈 내에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 핵산을 언급한다. 여기서 핵산들에 대하여 사용되는 "분리된(isolated)"이라는 용어는 또한 비-자연적으로 생성되는 서열들이 자연 상태에서는 발견되지 않고 자연적으로 생성되는 게놈 내의 즉각적인 연속 서열을 가지지 않기 때문에 임의의 비-자연적으로 생성되는 핵산 서열들을 포함한다.

분리된 핵산은 자연적으로 생성되는 게놈 내의 DNA 분자가 제거되거나 존재하지 않는 즉시 플랭킹(flanking)되는 정상적으로 발견되는 핵산 서열들의 하나를 제공하는 DNA 분자가 될 수 있다. 따라서, 분리된 핵산은, 제한되는 것은 아니지만, 벡터, 복제 기점 염기(autonomously replicating) 플라스미드, 바이러스(예를 들면, 임의의 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)), 혹은 원핵 생물(prokaryote)이나 진핵 생물(eukaryote)의 게놈 DNA 내로 포함되는 DNA 뿐만 아니라 다른 서열들로부터 독립적인 분리 분자(예를 들면, 화학적으로 합성된 핵산 또는 cDNA 혹은 PCR이나 제한 효소 치료(restriction endonuclease treatment)에 의해 생성되는 게놈 DNA 조각)로서 존재하는 DNA 분자를 포함한다. 또한, 분리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자와 같은 유전 공학적으로 처리된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리들 또는 게놈 라이브러리들, 혹은 게놈 DNA 제한 절단들을 함유하는 겔 슬라이스들 내의 다른 수백 내지 수백만의 핵산들 가운데 존재하는 핵산은 분리된 핵산으로 간주되지 않는다.

핵산과 특정 호스트 세포를 참조하여 여기서 사용되는 바와 같은 "외인성(exogenous)"이라는 용어는 자연에서 발견되는 바와 같은 특정 세포 내에 발생되지 않는(그리고 이로부터 수득되지 않을 수 있는) 임의의 핵산을 언급한다. 따라서, 비자연적으로 생성되는 핵산은 상기 호스트 세포 내로 일단 도입되는 호스트 세포에 대해 외인성으로 여겨진다. 비자연적으로 발생되는 핵산들이 자연에서는 전체로서는 존재하지 않는 핵산을 제공하는 자연 상태에서 발견되는 핵산 하위 서열들 또는 핵선 서열들의 조각들을 함유할 수 있는 점은 중요하다. 예를 들면, 발현 벡터(expression vector) 내의 게놈 DNA 배열을 포함하는 핵산 분자는 비자연적으로 발생되는 핵산이며, 이에 따라 전체(게놈 DNA 플러스 벡터 DNA)로서 핵산 분자들이 자연에서는 존재하지 않기 때문에 상기 호스트 세포 내로 일단 도입되면 호스트 세포에 대해 외인성이 된다. 이에 따라, 자연에서는 전체로서 존재하지 않는 임의의 벡터, 복제 기점 염기 플라스미드 또는 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)는 비자연적으로 발생되는 핵산으로 간주된다. PCR 또는 제한 효소 치료에 의해 생성되는 게놈 DNA 조각들뿐만 아니라 cDNA들도 이들이 자연에서는 발견되지 않는 분리 분자들로 존재하기 때문에 비자연적으로 발생되는 핵산으로 간주되는 점도 수반된다. 또한, 자연에서는 발견되지 않는 배열 내에 프로모터(promoter) 서열과 폴리펩티드를 인코딩하는 서열(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA)을 포함하는 임의의 핵산이 비자연적으로 발생되는 핵산인 점도 수반된다. 자연적으로 발생되는 핵산은 특정 세포에 대해 외인성이 될 수 있다. 예를 들면, 효모 x의 세포로부터 분리된 전체 염색체는 일단 염색체가 효모 y 내로 도입되면 효모 y의 세포에 대하여 외인성 핵산이다.

핵산을 인코딩하는 만노시다제(mannosidase)는 SEQ ID NO：3 또는 SEQ ID NO：4 내에 설정된 뉴클레로티드 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성(sequence identity)(예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성)을 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 여기서 설명하는 핵산은 SEQ ID NOs：5 내에 설정된 아미노산 배열에 대해 적어도 70%(예를 들면, 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100 퍼센트)의 동일성을 갖는 인코드 만노시다제 폴리펩티드들일 수 있다. 특정 아미노산 배열과 SEQ ID NO：5 내에 설정된 아미노산 배열 사이의 퍼센트 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 먼저, 아미노산 배열들이 블라스트 2 배열(BLAST 2 Sequences: Bl2seq) 프로그램을 이용하여 BLASTP 버전(version) 2.0.14를 포함하는 BLASTZ의 사슬-단독 버전(stand-alone version)으로부터 정렬된다. 이러한 BLASTZ의 사슬-단독 버전은 피시 앤 리차드슨(Fish & Richardson's) 웹 사이트(예를 들면, www.fr.com/blast/) 또는 미국 정부의 국가 생물 공학 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트()로부터 얻을 수 있다. Instructions explaining how to use 상기 Bl2seq 프로그램을 어떻게 사용하는 지를 설명하는 사항들은 BLASTZ에 수반되는 리드미 파일(readme file)에서 찾아볼 수 있다. Bl2seq는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 배열들 사이의 비교를 수행한다. 2개의 아미노산 배열들을 비교하기 위하여, Bl2seq의 옵션들은 다음과 같이 설정된다. -i는 비교되는 제1 아미노산 배열을 포함하는 파일(예를 들면, C:＼seq1.txt)로 설정되고, -j는 비교되는 제2 아미노산 배열을 포함하는 파일(예를 들면, C:＼seq2.txt)로 설정되며, -p는 blastp로 설정되고, -o는 임의의 원하는 파일 이름(예를 들면, C:＼output.txt)으로 설정되며, 다른 옵션들은 이들의 디폴트 설정(default setting)에 남겨진다. 예를 들면, 후속하는 명령이 2개의 아미노산 배열들: C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt 사이의 비교를 포함하는 출력 파일을 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 2개의 비교된 배열들이 상동성(homology)을 공유할 경우, 그러면 지정된 출력 파일이 정렬된 배열들로서 상동성의 이들 영역들을 제공한다. 2개의 비교된 배열들이 상동성을 공유하지 않을 경우, 그러면 지정된 출력 파일은 정렬된 배열들을 제공하지 않는다. 유사한 과정들이 blastn이 사용되는 것을 제외하면 핵산 배열들을 위해 수반될 수 있다.

일단 정렬되면, 매치된 숫자들이 양 배열들 내에 존재하는 동일한 아미노산 잔기들의 위치들의 숫자를 계산하여 결정된다. 퍼센트 동일성은 상기 매치된 숫자들을 결과 값에 100을 곱하여 수반되는 전체 길이의 만노시다제 폴리펩티드 아미노산 배열의 길이로 나누어서 결정된다.

상기 퍼센트 동일성이 십 단위에 가장 가깝게 반올림되는 점에 유의한다. 예를 들면, 78.11, 78.12, 78.13 및 78.14는 78.1로 반올림되는 반면, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 및 78.19는 78.2로 반올림된다. 또한 상기 길이 값이 항상 정수가 되는 점에 유의한다.

수많은 핵산들이 특정 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 점을 이해할 수 있을 것이다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)는 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 즉, 많은 아미노산들을 위하여, 상기 아미노산을 위한 코돈(codon)으로 기능하는 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛(nucleotide triplet)이 존재한다. 예를 들면, 주어진 만노시다제 폴리펩티드를 위해 코딩되는 배열 내의 코돈들이 변형될 수 있으므로 이들 종들을 위한 코돈 바이어스 표들(codon bias tables)을 이용하여 특정 종들(예를 들면, 박테리아 또는 균류(fungus)) 내의 최적의 발현이 얻어진다.

또한 교잡(hybridization)이 2개의 핵산 배열들 사이의 상동성에 접근하는 데 이용될 수 있다. 여기서 설명하는 핵산 배열 또는 이의 조각 혹은 변종이 표준 교잡 기술들에 따라 교잡 탐침으로 이용될 수 있다. 테스트 소스로부터의 DNA 또는 RNA에 대한 관심이 되는 탐침(예를 들면, 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) 뉴클레오티드 배열의 일부를 포함하는 탐침)의 교잡은 상기 테스트 소스 내의 상기 탐침에 대응되는 DNA 또는 RNA(예를 들면, 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus saitoi) 뉴클레오티드 배열)의 존재의 표시이다. 교잡 조건들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, "Current Protocols in Molecular Biology"(John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991)에서 찾아볼 수 있다. 적당한 교잡 조건들은 50℃에서 1 X SSC, 0.1% SDS 내의 세정에 후속하는 30℃에서의 2X 염화나트륨(sodium chloride)/시트르산 나트륨(sodium citrate)(SSC) 내의 교잡과 동등한 것으로 정의된다. 매우 엄격한 조건들은 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 내의 세정에 후속하는 45℃에서의 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC) 내의 교잡과 동등한 것으로서 정의된다.

여기서 사용되기 위한 적절한 다른 만노시다제 폴리펩티드 후보들은 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 정렬들의 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들의 데이터베이스 상의 쿼리(query)의 수행은 만노시다제 폴리펩티드들의 상동들(homologs) 및/또는 상사들(orthologs)을 확인할 수 있다. 서열 분석은 알려진 만노시다제 아미노산 배열들을 이용하는 비리던던트(nonredundant) 데이터베이스들의 BLAST, 레시프로컬(Reciprocal) BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 수반할 수 있다. 40% 보다 큰 동일성을 가지는 상기 데이터베이스 내의 이들 폴리펩티드들은 만노시다제 폴리펩티드로의 적합성을 위한 다른 평가를 위해 후보로서 확인될 수 있다. 아미노산 배열 유사성은, 하나의 소수성 잔기를 다른 하나로의 치환 또는 하나의 극성 잔기로의 치환과 같은 보존적 아미노산 치환들을 허용한다. 원하는 경우, 계속 평가되는 후보들의 숫자를 좁히기 위하여 이러한 후보들의 수동 검사가 수행될 수 있다.

본 명세서는 또한 여기서 설명하는 만노시다제의 (i) 생물학적으로 활성인(biologically active) 변종들 및 (ii) 생물학적으로 활성인 조각들 또는 이의 생물학적으로 활성인 변종들을 제공한다. 만노시다제의 생물학적으로 활성인 조각들은 SEQ ID NOs：5 내에 설정된 아미노산 배열 또는 SEQ ID NOs：3 및 4 내에 설정된 뉴클레오티드 배열들에 의해 인코딩되는 아미노산 배열에 대한 첨가들, 결손들, 또는 치환들을 포함할 수 있다. 치환들을 갖는 단백질들은 일반적으로 50 보다 크지 않은(예를 들면, 일, 이, 삼, 사, 오, 육, 칠, 팔, 구, 십, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50 보다 크지 않은) 보존적 아미노산 치환들을 가질 것이다. 보존적 치환들은 하나의 아미노산을 유사한 특성들을 갖는 다른 하나로 치환하는 것이다. 보존적 치환들은 다음 그룹들 내의 치환들을 포함한다. 발린(valine), 아날린(alanine) 및 글리신(glycine); 류신(leucine), 발린 및 이소류신(isoleucine); 아스파트르산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid); 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine); 세린(serine), 시스테인(cysteine) 및 트레오닌(threonine); 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine); 그리고 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine). 비-극성 아미노산들은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린(proline), 페닐알라닌, 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)을 포함한다. 극성의 중성 아미노산들은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 대전된 (염기성)아미노산들은 아르기닌, 리신 및 히스티딘(histidine)을 포함한다. 음으로 대전된 (산성)아미노산들은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 상술한 극성, 염기성 또는 산성 그룹들의 하나의 물질을 동일한 그룹의 다른 하나의 물질로의 임의의 치환은 보존적 치환으로 여겨진다. 대조적으로, 비보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사하지 않은 특징들을 갖는 다른 하나로 치환하는 것이다.

결손 변종들은 (둘 또는 그 이상의 아미노산들의)하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 단편들 또는 비-연속적 단일 아미노산들이 결핍될 수 있다.

첨가(첨가 변종들)는, (a) SEQ ID NOs：3 또는 4 내에 설정된 핵산 배열들에 의해 인코딩되는 만노시다제 혹은 SEQ ID NOs：5 내에 설정되는 아미노산 배열 또는 이의 조각들을 갖는 만노시다제, 그리고 (b) 내부 또는 말단(C 또는 N)의 무관하거나 이형의(heterologous) 아미노산 배열들을 함유하는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 단백질들의 성분에 있어서, "이형의 아미노산 배열(heterologous amino acid sequences)"이라는 용어는 (a) 보다는 아미노산 배열을 언급한다. 이형의 배열은, 예를 들면, 재조합 단백질(예를 들면, FLAG, 폴리히스티딘(polyhistidine)(예를 들면, 헥사히스티딘hexahistidine)), 헤마글루타닌(hemagluttanin: HA), 글루타티온(glutathione)-S-트랜스페라제(transferase)(GST), 또는 말토스-결합(maltose-binding) 단백질(MBP))의 정제를 위해 사용되는 배열일 수 있다. 이형의 배열들은 또한 진단 또는 검출 가능한 마커들(markers), 예를 들면, 루시페라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 또는 클로암페니콜 아세틸 트랜스페라제(chloramphenicol acetyl transferase: CAT)로서 유용한 단백질들일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 다른 단백질로부터의 단일 배열을 함유한다. 특정 호스트 세포들(예를 들면, 효로 호스트 세포들)에 있어서, 표적 단백질의 발현 및/또는 분비는 이형의 단일 배열의 이용을 통해 증가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체 형성을 위한 면역 반응 또는 소포체나 골지체 체류 신호들의 제거에 유용한 운반체(carrier)(예를 들면, KLH)를 포함할 수 있다. 이형의 배열들은 변화하는 길이가 될 수 있고, 일부 경우들에서는 상기 이형의 배열들이 부착되는 전체 길이의 표적 단백질들 보다 긴 배열들이 될 수 있다.

만노시다제의 생물학적으로 활성인 조각들 또는 생물학적으로 활성인 변종들은 야생형이고 전체 길이의 성숙한 단백질의 만노시다제 활성(예를 들면, 탈만노실화)의 적어도 40%(예를 들면, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 혹은 심지어는 그 이상의)를 가진다.

여기서 설명하는 만노시다제들은 탈만노실화된 표적 분자들을 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법들은 생체 외에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.

당단백질들을 탈만노실화하는 방법들(Methods of Demannosylating Glycoproteins)

여기서 설명하는 바와 같이, 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 당단백질들은 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합 또는 일부를 가수 분해할 수 있는 만노시다제를 이용하여 탈만노실화될 수 있다. 이러한 만노시다제들의 제한적이지 않은 실시예들은 아스페르길루스 사토이(Aspergillus satoi: As)(또한 아스페르길루스(Aspergillus phoenicis)로 알려진)에 기인하는 만노시다제 혹은 셀룰로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)(예를 들면, CcMan4)에 기인하는 만노시다제를 포함한다. 상기 아스페르길루스 사토이 만노시다제의 아미노산 배열은 SEQ ID NO：5(도 15 참조)에 기재되어 있고 겐뱅크(GenBank)에 기탁 번호 제BAA08634호로 있다. CcMan4 폴리펩티드는 SEQ ID NO：4(도 4 참조)에 기재된 뉴클레오티드 배열에 의해 인코딩된다.

상기 아스페르길루스 사토이 만노시다제 및 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 만노시다제(예를 들면, CcMan4)는 재조합적으로 생성될 수 있다. 분리된 핵산 분자들을 인코딩하는 만노시다제 폴리펩티드들은 표준 기술들에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 기술들이 여기서 설명하는 분리된 핵산을 함유하는 뉴클레오티드 배열을 수득하는 데 이용될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA로부터의 배열들을 포함하여 RNA 뿐만 아니라 DNA로부터의 특정 배열들을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심의 대상이나 이를 넘는 영역의 말단들로부터의 서열 정보는 증폭되는 템플레이트(template)의 대향하는 가지들에 대한 서열과 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머들(oligonucleotide primer)을 설계하는 데 적용된다. 다양한 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 계획들도 장소 특이적(site-specific) 뉴클레오티드 배열 변형들이 템플레이트 핵산 내로 도입될 수 있는 것에 의해 사용 가능할 수 있다. 분리된 핵산들은 또한 단일 핵산 분자(예를 들면, 프스포라미티드(phosphoramidite) 기술을 이용하는 3' 에서 5' 방향으로의 자동화 DNA 합성을 이용하여) 또는 올리고뉴클레오티드들의 시리즈들로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 긴 올리고뉴클레오티드의 쌍들(예를 들면, >100 뉴클레오티드들)이 각 쌍이 상보성의 짧은 단편들을(예를 들면, 약 15 뉴클레오티드들)을 함유하는 원하는 배열을 포함하도록 합성될 수 있으므로, 상기 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐될 때에 듀플렉스(duplex)가 형성된다. DNA 중합 효소가 상기 올리고뉴클레오티드들을 연장시키는 데 사용되어, 올리고뉴클레오티드 쌍들 마다 단일, 이중-사슬핵산 분자들을 야기하며, 이는 이후에 벡터 내로 결속된다. 분리된 핵산들은 또한, 예를 들면, 자연적으로 생성되는 DNA의 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 수득돨 수 있다.

만노시다제 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하기 위하여, 핵산을 인코딩하는 만노시다제 폴리펩티드에 작동 가능하게 링크되는 프로모터(promotor)를 포함하는 벡터가 이용된다. 여기서 사용되는 바와 같이, "프로모터(promoter)"는 전사되는 유전자를 가능하게 하는 DNA 서열을 언급한다. 상기 프로모터는 RNA 중합 효소에 의해 인지되며, 이는 이후에 전사를 개시한다. 이에 따라, 프로모터는 직접적으로 구속되거나 RNA 중합 효소의 가입(recruitment)에 수반되는 DNA 배열을 포함한다. 프로모터 서열은 또한 "증폭제 영역들(enhancer regions)"을 포함할 수 있으며, 이는 유전자 클러스터(cluster) 내의 유전자들의 증폭 전사 레벨들(따라서 그 이름인)에 대한 단백질(즉, 번역 인자들의 세트와 아주 유사한 번역-작용 인자들)과 함께 결속되는 하나 또는 그 이상의 DNA 영역들이다. 통상적으로 코딩하는 영역의 5' 말단에서의 상기 증폭기(enhancer)는 또한 프로포터 서열들로부터 분리될 수 있으며, 예를 들면, 유전자의 인트론 영역(intronic region) 내에서 또는 3'에서 상기 유전자의 코딩하는 영역 내에 있을 수 있다.

여기서 사용되는 바와 같이, "작동 가능 하게 링크된(operably linked)"은 유전자 구조(예를 들면, 벡터) 내로 포함되어 발현 조절 서열들이 관심 코딩 서열의 발현을 효과적으로 조절하는 것을 의미한다.

발현 벡터들은 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 위해 호스트 세포들 내로 도입(예를 들면, 형질 전환(transformation) 또는 형질 주입(transfection)에 의해)될 수 있으며, 이후에 정제될 수 있다. 만노시다제 폴리펩티드들의 작거나 큰 규모의 생산을 위해 사용될 수 있는 발현 시스템들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 재조합 박테리오파지(bacteriophage) DNA로 형질 전환된 박테리아(예를 들면, E. 콜리(coli)), 플라스미드 DNA, 또는 핵산 분자들을 함유하는 코스미드(cosmid) DNA 발현 벡터들, 그리고 핵산 분자들을 함유하는 재조합 균류 발현 벡터들에 의해 형질 전환된 균류(예를 들면, 세레비시아에(S. cerevisiae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 또는 아스페르길루스(Aspergillus))와 같은 미생물들을 포함한다. 유용한 발현 시스템들은 또한 재조합 바이러스 발현 벡터들(예를 들면, 바쿨로바이러스(baculovirus))로 감염시킨 곤충 세포 시스템들, 그리고 재조합 바이러스 발현 벡터들(예를 들면, 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus))로 감염시키거나 상기 핵산 분자들을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터들(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질 전환된 식물 세포 시스템들을 포함한다. 만노시다제 폴리펩티드들은 또한 포유류의 발현 시스템들을 이용하여 생성될 수 있으며, 이는 포유류 세포들의 게놈(예를 들면, 메탈로티오닌(metallothionein) 프로모터)으로부터 또는 포유류의 바이러스들(예를 들면, 아데도바이러스 레이트 프로모터 및 시토메갈로바이러스 프로모터)로부터 유도된 프로모터들을 함유하는 재조합 발현 구조들을 정착시키는 세포들(예를 들면, COS 세포들, 중국 햄스터 난소 세포들, 헬라(HeLa) 세포들, 인체 배아 신장 293 세포들 및 3T3 L1 세포들과 같은 불사화 세포 라인들)을 포함한다.

통상적으로, 재조합 만노시다제 폴리펩티드들은 FLAG, 폴리히스트딘(예를 들면, 핵사히스트딘), 헤마글루타닌(HA), 글루타티온-S-트랜스페라제(GST), 또는 말토스-결합 단백질(MBP)과 같은 단백질의 정제에 도움이 되는 이형의 아미노산 배열로 태그(tag)된다. 단백질들의 정제를 위한 다른 방법들은 이온 교환, 소수성 및 역상, 사이즈 배제, 친화도, 소수성 전하 도입 크로마토그래피 및 이와 유사한 것들(예를 들면, Scopes의 "Protein Purification: Principles and Practice"(third edition, Springer-Verlag, New York (1993)); Burton 및 Harding의 "J. Chromatogr. A"(814:71-81(1998)) 참조)과 같은 크로마토그래피 기술들을 포함한다.

탈만노실화된 당단백질들을 생성하기 위하여, 하지의 만노스가 인산화되는 말단 알파-1,2 만노스 결합이나 일부를 포함하는 표적 분자는 적절한 조건들 하에서 만노시다제 또는 재조합적으로 생성된 만노시다제를 함유하는 세포 파쇄물(cell lysate)에 접촉된다. 적절한 만노시다제들은 상술하였다. 상기 세포 파쇄물은 진균 세포(fungal cell), 식물 세포 또는 동물 세포를 포함하여 임의의 유전 공학에 의해 생성된 세포에 기인할 수 있다. 동물 세포들의 제한적이지 않은 예들은 선충(nematode), 곤충, 식물, 새, 파충류 그리고 생쥐, 쥐, 토끼, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 말, 고래, 원숭이 또는 인간과 같은 포유동물들을 포함한다.

상기 표적 단백질(예를 들면, 당단백질)을 상기 정제된 만노시다제 또는 세포 파쇄물에 접촉시킴에 의해, 상기 말단 알파-1,2 만노스 결합은 탈만노실화된 표적 분자를 생성하도록 가수 분해될 수 있다. 상기 파쇄물 내의 만노시다제의 활성이나 온전성을 보존하는 세포 파쇄물들을 수득하기 위한 적절한 방법들은, 상기 세포 파쇄물 내의 N-글리코실화 활성들을 보존하거나 변화들을 최소화하는 뉴클레아제(nuclease), 프로테아제(protease) 및 포스파타아제(phosphatase) 억제제들을 포함하여 적절한 완충액들 및/또는 억제제들의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 억제제들은, 예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid: EDTA), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) bis(P-아미노에틸 에테르(aminoethyl ether)) N,N,N1,Nl-테트라아세트산(tetraacetic acid: EGTA) 등과 같은 킬레이터들(chelators), 페닐메틸술포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride: PMSF), 아프로티닌(aprotinin), 류페프틴(leupeptin), 안티파인(antipain) 및 이와 유사한 것과 같은 프로테아제 억제제들, 그리고 인산염(phosphate), 불화나트륨(sodium fluoride), 바나다테(vanadate) 및 유사한 것과 같은 포스파타아제 억제제들을 포함한다. 효소 활성들을 함유하는 파쇄물들을 수득하기 위한 적절한 완충액들과 조건들은, 예를 들면, Ausubel 등의 "Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)"(John Wiley & Sons, New York(1999)); Harlow 및 Lane의 "Antibodies"(A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988); Harlow 및 Lane의 "Using Antibodies"(A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1999); "Tietz Textbook of Clinical Chemistry"(3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia(1999)) 등에 기재되어 있다.

세포 파쇄물은 적절한 바에 따라 간섭하는 물질들을 제거하거나 최소화하도록 더 처리될 수 있다. 원하는 경우, 세포 파쇄물은 초원심 세포 분획법(subcellular fractionation)과 이온 교환, 소수성 및 역상, 사이즈 배제, 친화도, 소수성 전하 도입 크로마토그래피 및 이와 유사한 것들과 같은 크로마토그래피 기술들을 포함하는 해당 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 방법들에 의해 분별될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 세포 파쇄물은 전체 세포 기관들이 온전하거나 및/또는 기능적으로 남도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 파쇄물은 하나 또는 그 이상의 온전하고 거친 소포체, 온전하고 부드러운 소포체, 또는 온전한 골지체를 포함할 수 있다. 온전한 세포 기관들을 포함하는 파쇄물들을 제조하고 기관들의 기능성을 테스트하기 위한 적절한 방법들은, 예를 들면, Moreau 등의 "J. Biol. Chem."((1991) 266(7):4329-4333); Moreau 등의 "J. Biol. Chem."((1991) 266(7):4322-4328); Rexach 등의 "J. Cell Biol."((1991) 114(2):219-229; 그리고 Paulik 등의 "Arch. Biochem. Biophys."((1999) 367(2)：265-273)에 기재되어 있다.

표적 분자들은, 여기서 설명하는 바와 같이, 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합이나 일부를 포함하는 임의의 분자로 언급된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백질은 인간 당단백질이다. 적절한 표적 단백질들은 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 디프테리아 톡소이드(diptheria toxoid)와 같은 병원체(pathogen) 단백질들; 시토메칼로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 당단백질들 B, H 및 gCIII, 인간 면역 결핍 바이러스(immunodeficiency virus) 1(HIV-1) 외피(envelope) 당단백질들, 로우스 사르코마 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 외피 당단백질들, 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus : HSV) 외피 당단백질들, 엡스테인 바르 바이러스(Epstein Barr virus: EBV) 외피 당단백질들, 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus: VZV) 외피 당단백질들, 인간 파필로마 바이러스(papilloma virus: HPV) 외피 당단백질들, 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 당단백질들, 그리고 헤파티티스 족 표면 항원(Hepatitis family surface antigen)과 같은 바이러스 표면 단백질들; 리소좀 단백질들(예를 들면, 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 글루코시다제, 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase), 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase); 인슐린; 글루카곤들(glucagons); 성장 인자들; 시토키닌들; 케모키닌들; 그리고 항체들이나 이의 조각들을 포함할 수 있다. 성장 인자들은, 예를 들면, 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), 인슐린 유사 성장 인자(Insulin-like growth factor: IGF), 뼈 형성 유도 단백질(bone morphogenic protein: BMP), 과립구 집락 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF), 과립 대식 세포 집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor: GM-CSF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor: NGF); 신경 성장 단백질(Neurotrophin), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor: PDGF), 적혈구 생성소(Erythropoietin: EPO), 조혈촉진인자(Thrombopoietin: TPO), 마이오스타틴(Myostatin: GDF-8), 성장 차등 인자(Growth Differentiation factor)-9(GDF9), 염기성 섬유모세포증 증식 인자(basic fibroblast growth factor)(bFGF 또는 FGF2), 표피 생장 인자(Epidermal growth factor: EGF), 간세포 생장 인자(Hepatocyte growth factor: HGF) 등을 포함한다. 시토키닌들은, 예를 들면, IL-1 내지 IL-33(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13 또는 IL-15))과 같은 인터류킨들(interleukins)을 포함한다. 케모키닌들은, 예를 들면, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, 란테스(RANTES), C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1γ, 에오탁신(Eotaxin), MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, 류코탁틴(Leukotactin)-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC, 또는 에오탁신(Eotaxin)-2를 포함한다. 또한 포함되는 것들은 종양(tumor) 당단백질들(예를 들면, 종양-연관 항원들), 예를 들면, 암배 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 인간 뮤신들(mucins), HER-2/neu, 그리고 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen: PSA)이다[Henderson 및 Finn의 "Advances in Immunology"(62, pp. 217-56(1996))].

일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백질은 리소소말 축절 질환과 연관될 수 있으며, 상기 표적 단백질은, 예를 들면, 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다제(iduronidase), 베타-D-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 베타-헥소사미니다제(hexosaminidase), 베타-D-만노시다제, 알파-L-푸코시다제(fucosidase), 아릴술파타제(arylsulfatase) B, 아릴술파타제 A, 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(acetylgalactosaminidase), 아스파르틸클루코마미니다제(aspartylglucosaminidase), 이두로네이트(iduronate)-2-술파타제(sulfatase), 알파-글루코사미니드(glucosaminide)-N-아세틸트랜스페라제(acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다제(glucoronidase), 히알루로니다제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제, 알파-뉴라미니다제(neuraminidase), 포스포트랜스페라제(phosphotransferase), 산 리파제(acid lipase), 산 세라미다제(acid ceramidase), 스핀고미엘리나제(sphingomyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카테프신(cathepsin) K, 그리고 리포프로테인 리파제(lipoprotein lipase)를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백들은 상기 표적 단백질이 다른 폴리펩티드 배열, 또는 폴리머, 운반체, 보조제(adjuvant), 면역 독소(immunotoxin) 혹은 검출 가능한(예를 들면, 형광, 인광 또는 방사성) 일부에 융합되는 융합 단백질이다. 예를 들면, 표적 단백질은 작은 단백질들의 분자량을 증가시키거나 및/또는 순환 체류 시간을 증가시키도록 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)과 같은 폴리머에 결합될 수 있다.

당단백질들을 탈만노실화하는 생체 내의 방법들(In Vivo Methods of Demannosylating Glycoproteins)

여기서 기술하는 유전 공학에 의해 생성된 세포들은 탈만노실화된 표적 분자들의 생성에 이용될 수 있다. 예를 들면, 세포 기반의 방법은

can include the steps of introducing into 유전 공학에 의해 생성된 진균 세포(fungal cell) 내로 하지의 만노스가 탈인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합이나 일부를 가수 분해할 수 있는 핵산을 인코딩하는 만노시다제, 핵산을 인코딩하는 표적 분자를 포함하도록 도입하는 단계들을 포함할 수 있으며, 상기 세포들은 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 상기 표적 분자를 생성한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 핵산들을 인코딩하는 만노시다제와 표적 분자는 분비 서열을 포함하여 상기 만노시다제와 표적 분자가 공동 분비된다.

여기서 기술되는 유전 공학에 의해 생성된 세포들은 핵산 인코딩 만노시다제를 함유한다. 표적 분자들의 생체 내의 생산을 위해 적합한 세포들은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 메틸영양체(methylotrophic) 효모(칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 오오가타에아(Oogataea), 피치아(Pichia) 또는 토룰로프시스(Torulopsis) 속(genus)의 메틸영양체 효모와 같은) 혹은 사상균들(filamentous fungi) of the genus 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium) 또는 크리소스포리움(Chrysosporium) 속의 사상균들(filamentous fungi)을 포함하는 원시 균류일 수 있다. 균류 종들의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시스(Pichia canadensis), 피치아 카르소니이(Pichia carsonii), 피치아 파리노스(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄스(Pichia fermentans), 피치아플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라나에라시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 칸디다 발리다(Candida valida), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스칼라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 암픽시아에(Candida amphixiae), 칸디다 안타르크티카(Candida Antarctica), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 아트모스파에리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 블라타에(Candida blattae), 칸디다카르포팔라(Candida carpophila), 칸디다 세람비시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다차울리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코리달리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이(Candida dosseyi), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 에르가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프루크투스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 페르멘타티(Candida fermentati), 칸디다 구일미에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 하에물로니이(Candida haemulonii), 칸디다 인세크타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인세크토룸(Candida insectorum), 칸디다 인터메디아(Candida intermedia), 칸디다 제프레시이(Candida jeffresii), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 칸디다 릭소소필라(Candida lyxosophila), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 칸디다 멤브라니파시엔스(Candida membranifaciens), 칸디다 밀레리(Candida milleri), 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 오레고넨시스(Candida oregonensis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 퀴르시트루사(Candida quercitrusa), 칸디다 쉐하테아(Candida shehatea), 칸디다 템모칠라에(Candida temnochilae), 칸디다 테누이스(Candida tenuis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 트수치이아에(Candida tsuchiyae), 칸디다 시놀라보란티움(Candida sinolaborantium), 칸디다 소자에(Candida sojae), 칸디다 비스와나티이(Candida viswanathii), 칸디다우틸리스(Candida utilis), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 실베스트리스(Pichia silvestris), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 초다티(Pichia chodati), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia menbranaefaciens), 피치아 미누스쿨fp(Pichia minuscule), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 슈도폴리모르파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 퀴에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 로베르트시이(Pichia robertsii), 피치아 사이토이(Pichia saitoi), 피치아 실베스트리시(Pichia silvestrisi), 피치아 스트라스부르겐시스(Pichia strasburgensis), 피치아 테리콜라(Pichia terricola), 피치아 반리지(Pichia vanriji), 슈도지마 안타르크티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사크라로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사크라로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사크라로미세스 몸드쉬리쿠스(Saccharomyces momdshuricus), 사크라로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사크라로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사크라로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사크라로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사크라로미세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사크라로미세스 델브루에크키이(Saccharomyces delbrueckii), 사크라로미세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous), 사크라로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사크라로미세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사크라로미세스 마르시아누스(Saccharomyces marxianus), 사크라로미세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사크라로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 사크라로미세스 오룩시이(Saccharomyces rouxii), 사크라로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사크라로미세스 윌리아누스(Saccharomyces willianus), 사크라로미세스 루드위기이(Saccharomycodes ludwigii), 사크라로미세스 캡슐라리스(Saccharomycopsis capsularis), 사크라로미세스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 사크라로미세스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 엔도미세스 호르데이(Endomyces hordei), 엔도미코프시스 포불리게라(Endomycopsis fobuligera), 사투르니스포라 사이토이(Saturnispora saitoi), 쉬조사크라로미세스 옥토스포루스(Schizosaccharomyces octosporus), 쉬조사크라로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬완니오미세스 옥시텐탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 사크라로미세스 다이렌시스(Saccharomyces dairensis), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 페르멘타티(Torulaspora fermentati), 사크라로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 로세이(Torulaspora rosei), 사크라로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 사크라로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 사크라로미세스 델브루에크키이(Saccharomyces delbrueckii), 토룰라스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 사크라로미세스 델브루에크키이(Saccharomyces delbrueckii), 지고사크라로미세스 몬골리쿠스(Zygosaccharomyces mongolicus), 도룰라스포라 글로보사(Dorulaspora globosa), 데바리오미세스 글로보수스(Debaryomyces globosus), 투룰로프시스 글로보사(Torulopsis globosa), 트리초스포론 구타네움(Trichosporon cutaneum), 트리고노프시스 바리일리스(Trigonopsis variabilis), 윌리오프시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리포시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 지고사크라로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 지고사크라로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 데바리오미세스 디스포루아(Debaryomyces disporua), 사크라로미세스 비스포라스(Saccharomyces bisporas), 지고사크라로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 사크라로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 지고사크라로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 지고사크라로미세스 프리오리아누스(Zygosaccharomyces priorianus), 지고사크라로미세스 로욱심(Zygosaccharomyces rouxiim), 지고사크라로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사크라로미세스 바르케리(Zygosaccharomyces barkeri), 사크라로미세스 로욱시이(Saccharomyces rouxii), 지고사크라로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사크라로미세스 마조르(Zygosaccharomyces major), 사크라로미세스 로우시이(Saccharomyces rousii), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시스(Pichia Canadensis), 피치아 카르소니이(Pichia carsonii), 피치아 파리노세(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄흐(Pichia fermentans), 피치아 플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 슈도폴리모르파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 퀴에르쿰(Pichia quercuum), 피치아로베르트시이(Pichia robertsii), 슈도지마 안타르크티카(Pseudozyma Antarctica), 로로스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사크라로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사크라로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사크라로미세스(Saccharomyces bisporus), 사크라로미세스(Saccharomyces cerevisiae), 사크라로미세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사크라로미세스 델브루에크키이(Saccharomyces delbrueckii), 사크라로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사크라로미세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사크라로미코데스 루드위기이(Saccharomycodes ludwigii), 쉬조사크라로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰러스포라 델브루에크키이(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리오프시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리오프시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 지고사크라로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 지고사크라로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 또는 지고사크라로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)를 포함한다. 예시적인 사상균들은, 제한되는 것은 아니지만, 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 또는 아스페르길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor)를 포함하는 아스페르길루스(Aspergillus)의 다양한 종들을 포함한다. 여기서 특정되는 유전 공학적으로 생성되기 전에 이러한 세포들이, 예를 들면, American Type Culture Collection(Rockville, MD)와 같은 다양한 상업적 소스들과 리서치 소스 공장들로부터 수득될 수 있다. 표적 분자들은 여기서 설명하는 표적 단백질들(전술한 바 참조)의 임의의 것과 같은 단백질들을 포함한다.

세포의 유전 공학적 생성은, 외인성의 핵산을 인코딩하는 만노시다제 이외에도, (i) 외인성의 유전자를 인코딩하는 외측 사슬의 연장(Outer CHain elongation: OCH1) 단백질의 결손; (ii) 만노스 잔기들의 인산화를 증가시키도록 만노실 인산화(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S. 세레비시아에(cerevisiae), 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(albicans)에 기인하는 MNN4 폴리펩티드, 혹은 P. 파스토리스(pastoris)에 기인하는 PNO1 폴리펩티드)를 증진시킬 수 있는 재조합 핵산을 인코딩하는 폴리펩티드의 도입; (iii) OCH1 단백질의 기능성 발현을 간섭하는 RNA 분자의 도입 또는 발현; (iv) N-글리코실화 활성을 갖는 재조합 핵산을 인코딩하는 야생형(예를 들면, 내생의 또는 외인성의) 단백질(즉, N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 발현시키는)의 도입; (v) 재조합 핵산을 인코딩하는 전술한 표적 분자의 도입; 또는 (v) altering N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 외인성 유전자들을 인코딩하는 단백질들의 프로모터 또는 증폭제 성분들을 변경하여 이들의 인코딩된 단백질들의 발현을 변경하는 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전 변형들을 포함할 수 있다. RNA 분자들은, 예를 들면, 작은-간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 RNA 또는 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 유전 공학적인 생성은 또한 첨가들(예를 들면, 이형의 배열), 결손들 또는 치환들(얘를 들면, 점 돌연변이와 같은 돌연변이, 보존적 및 비보존적 돌연변이들)을 갖는 단백질들 생산하도록 N-글리코실화 활성을 갖는 외인성의 유전자를 인코딩하는 단백질의 변형을 포함한다. 돌연변이들은 특별히 도입(예를 들면, 장소-표적화된 돌연변이 유발적 또는 상동의 재조합들에 의해)될 수 있거나, 임의로 도입(예를 들면, 세포들은 Newman 및 Ferro-Novick의 "J. Cell Biol."((1987) 105(4)：1587)에 기재된 바와 같이 화학적으로 돌연변이를 일으킬 수 있다)될 수 있다.

여기서 기술하는 유전적 변형들은, (i) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 활성들의 증가, (ii) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 활성들의 감소, 또는 (iii) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 활성들의 국지화 또는 세포 간 분포의 변화 중에서 하나 또는 그 이상을 가져올 수 있다. 특정한 활성의 양의 증가(예를 들면, 만노실 인산화의 증진)는 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 과도하게 발현되는 하나 또는 그 이상의 단백질들, 외인성 유전자의 복제 횟수의 증가(예를 들면, 유전자 중복) 또는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현의 증가를 자극하는 외인성 유전자의 프로모터 또는 증폭제의 변경에 기인할 수 있는 점을 이해할 수 있을 것이다. 하나 또는 그 이상의 활성들의 감소는 돌연변이 형태의 과도한 발현(예를 들면, 우세한 부정적인 형태), 특정 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 간섭 RNA 분자들의 도입이나 발현, 또는 특정 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 유전자의 결손에 기인할 수 있다.

상동의 재조합에 의한 유전자를 방해하기 위하여, "유전자 대체(gene replacement)" 벡터가 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 방식으로 구성될 수 있다. 상기 선택 가능한 마커 유전자는 5' 및 3' 말단 모두에서 상동의 재조합을 완화시키도록 충분한 길이의 유전자 부분들에 대해 작동 가능하게 링크될 수 있다. 상기 선택 가능한 마커는 URA3, LEU2 및 HIS3 유전자들을 포함하여 호스트 세포 영양 요구를 보충하거나 항생 내성을 제공하는 임의의 숫자들의 유전자들 중에서 하나가 될 수 있다. 다른 선택 가능한 마커들은 효모 세포들에 클로람페니콜 내성을 제공하는 CAT 유전자, 또는 β-갈락토시다제의 발현으로 인해 블루 콜로니들(blue colonies)을 야기하는 lacZ 유전자를 포함한다. 상기 유전자 대체 벡터의 선형화된 DNA 조각들은 이후에 해당 기술 분야에서 알려진 방법들을 이용하여 세포들 내로 도입된다(하기 참조). 상기 선형의 조각들의 게놈 내로의 통합과 상기 유전자의 방해는 선택 마커에 기초하여 결정될 수 있으며, 예를 들면, 서던 블로트(Southern blot) 분석에 의해 확인될 수 있다. 선택 가능한 마커는, 예를 들면, Cre-loxP 시스템들(하기 참조)에 의해 호스트 세포의 게놈으로부터 제거될 수 있다.

선택적으로는, 유전자 대체 벡터는 방해받는 유전자의 일부를 포함하는 방식으로 구성될 수 있으며, 그 부분은 임의의 외인성 유전자 프로모터 서열이 결핍되고 상기 유전자의 코딩 서열의 비활성 조각을 인코딩하지 않는다. "비활성 조각(inactive fragment)"은, 예를 들면, 상기 유전자의 전체 길이의 코딩 서열로부터 생성되는 단백질의 활성의 약 10% 보다 작은(예를 들면, 약 9% 보다 작거나, 약 8% 보다 작거나, 약 7% 보다 작거나, 약 6% 보다 작거나, 약 5% 보다 작거나, 약 4% 보다 작거나, 약 3% 보다 작거나, 약 2% 보다 작거나, 약 1% 보다 작거나, 또는 0%) 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자의 조각이다. 상기 유전자의 이러한 부분은 알려지지 않은 프로모터 서열이 상기 유전자 서열에 작동 가능하게 링크되는 방식으로 벡터 내로 삽입되지 않지만, 정지 코돈과 전사 종료 서열은 상기 유전자 서열의 일부에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 벡터는 상기 유전자 서열 내에서 후속하여 선형화되고 세포 내로 변형된다. 단일 상동 재조합에 의하여, 이러한 선형화된 벡터는 이후에 상기 유전자의 외인성 대향자로서 통합된다.

발현 벡터들은 자율적이거나 통합적일 수 있다. 재조합 핵산(예를 들면, 하나의 인코딩 만노시다제)은 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 트랜스포손(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 입자와 같은 발현 벡터들이 형태로 상기 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 재조합 핵산은 염색체 외적으로 유지될 수 있거나, 이는 효모 세포 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 발현 벡터들은, 원하는 핵산들로 함께 변형되는 이들 세포들의 검출 및/또는 선택들 허용하도록 선택된 조건들(예를 들면, 우러실(uracil) 생합성을 위해 필요한 효소를 인코딩하는 URA3, 또는 트립토판(tryptophan) 생합성을 위해 요구되는 효소를 인코딩하는 TRP1) 하에서 세포 생존력을 위해 요구되는 선택 마커 유전자들을 인코딩하는 단백질들을 함유할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,704,362호 참조). 발현 벡터들은 또한 자율 복제 서열(autonomous replication sequence: ARS)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,837,148호에는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 내에 플러스미드들을 유지하기 위한 적절한 수단들을 제공하는 자율 복제 서열들이 기재되어 있다.

통합적인 벡터들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,882,279호에 기재되어 있다. 통합적인 벡터들은 일반적으로 적어도 제1 삽입 가능한 DAN 조각, 선택 가능한 마커 유전자 및 제2 삽입 가능한 DNA 조각의 직렬로 정렬된 배열을 포함한다. 상기 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 조각들은 각기 길이가 약 200(예를 들면, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 또는 약 1000 혹은 그 이상)의 뉴클레오티드들이고 변형되는 종들의 게놈 DNA의 부분들에 대해 상동인 뉴클레오티드 배열들을 가진다. 발현을 위한 관심이 있는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, N-글리코실화 활성을 갖는 유전자를 인코딩하는 부분)이 상기 마커 유전자의 전 또는 후에 관계없이 상기 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 조각들 사이에서 이러한 벡터 내에 삽입된다. 통합적인 벡터들은 상기 호스트 세포 게놈 내로의 관심이 있는 뉴클레오티드의 통합을 용이하게 하도록 효모 변형 이전에 선형화될 수 있다.

발현 벡터는 효모(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), P. 파스토리스(pastoris), 또는 다른 적절한 균류 종들) 프로모터의 조절 하에서 재조합 핵산을 특징으로 할 수 있고, 이는 이들을 진균 세포들 내에 발현되게 할 수 있다. 적절한 효모 세포 프로모터들은, 예를 들면, ADC1, TPI1, ADH2, hp4d, POX, 그리고 Gal10(예를 들면, Guarente 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"((1982) 79(23):7410) 참조) 프로모터들을 포함한다. 추가적인 적절한 프로모터들은, 예를 들면, Zhu 및 Zhang의 "Bioinformatics"((1999) 15(7-8)：608-611) 및 미국 특허 제6,265,185호에 기재되어 있다.

프로모터는 보존적이거나 유도성(조건적)일 수 있다. 보존적 프로모터는 표준 배양 조건들 하에서 그 발현이 일정한 프로모터로 이해된다. 유도성 프로모터들은 하나 또는 그 이상의 유도 큐들(cues)들에 반응하는 프로모터들이다. 예를 들면, 유도성 프로모터는 화학적으로 조절(예를 들면, 복사 활성이 알코올, 테트라시클린(tetracycline), 스테로이드, 금속 또는 다른 작은 분자의 존재나 부존재에 의해 조절되는 프로모터)되거나 물리적으로 조절(예를 들면, 복사 활성이 빛 또는 높거나 낮은 온도들과 같은 물리적 유인자들의 존재 또는 부존재에 의해 조절되는 프로모터)될 수 있다. 유도성 프로모터는 또한 화학적 또는 물리적 큐들에 의해 자체로 집적 조절되는 하나 또는 그 이상의 인자들에 의해 간접적으로 조절될 수 있다.

다른 유전 공학에 의해 생성된 변형들도 조건적일 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 유전자는, 예를 들면, Cre-loxP 시스템과 같은 장소-특이적 DNA 재조합 효소(recombinase)의 사용하여 조건적으로 제거될 수 있다(예를 들면, Gossen 등의 "Ann. Rev. Genetics"((2002) 36：153-173) 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0014264호 참조).

재조합 핵산은 스페로플라스트(spheroplast) 기술들 또는 전체세포 염화리튬 효모 변형 방법과 같은 다양한 방법들을 이용하여 여기서 설명하는 세포 내로 도입될 수 있다. 세포들 내로의 플러스미드들 또는 선형의 핵산 벡터들의 변형을 위해 유용한 다른 방법들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,929,555호; Hinnen 등의 "Proc. Nat. Acad. Sci."((1978) USA 75：1929); Ito 등의 "J. Bacteriol."((1983) 153：163); 미국 특허 제4,879,231호; 그리고 Sreekrishna 등의 "Gene"((1987) 59：115)에 기재되어 있으며, 이들의 기재 사항들은 여기에 참조로 포함된다. 전기 천공법(electroporation)과 PEG1000 전체 세포 변형 과정들도 Cregg 및 Russel의 "Methods in Molecular Biology"(Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp. 27-39 (1998))에 기재되어 있는 바와 같이 사용될 수 있다.

변형된 진균 세포들은, 제한되는 것은 아니지만, 요구되는 생화학적 생성물들의 부존재(세포들의 영양 요구성으로 인하여)에서 변형 후의 영양 요구성 세포들의 배양, 새로운 표현형(phenotype)을 위한 선택 및 검출, 또는 형질 전환체 내에 함유되는 내성 유전자의 부존재에서 효모에 대해 유해한 항생제의 존재에서의 배양을 포함하는 적절한 기술들을 이용하여 선택될 수 있다. 형질 전환체들은 또한 게놈 내로의 발현 카세트의 통합에 의해 선택되거나 및/또는 입증될 수 있으며, 이는 예를 들면 서던 블로트(Southern blot) 또는 PCR 분석에 의해 평가될 수 있다.

관심이 있는 표적 세포 내로의 벡터들의 도입 이전에, 상기 벡터들은 전술한 바와 같은 에스체리치아 콜리(Escherichia coli: E. coli)와 같은 박테리아 세포들 내에서 성장될(예를 들면, 증폭될) 수 있다. 상기 벡터 DNA는 해당 기술 분야에서 알려진 방법들의 임의의 것을 이용하여 박테리아 환경으로부터 벡터 DNA의 정제를 가져오는 상기 박테리아 세포들로부터 분리될 수 있다. 상기 정제된 벡터 DNA는 플라스미드 DNA 제조에서 이들 단백질들이 포유동물 세포들에 대해 유해하기 때문에 E. 콜리(coli) 단백질들이 존재하지 않는 것을 보장하도록 페놀(phenol), 클로로포름(chloroform) 및 다른 것들로 광범위하게 추출될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 유전 공학에 의해 생성된 진균 세포는 OCH1 유전자 또는 이의 유전자 생성물들(예를 들면, mRNA 또는 단백질)이 결핍되며 OCH1 활성이 결핍되어 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전 공학에 의해 생성된 세포는 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S. 세레비시아에(cerevisiae), 오오가타에아 미누타(Oogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(albicans)에 기인하는 MNN4 폴리펩티드, 또는 P. 파스토리스(pastoris)에 기인하는 PNO1 폴리펩티드)를 발현시킨다. 예를 들면, 상기 진균 세포는 Y. 리폴리티카(lipolytica)(젠뱅크 기탁 번호들: XM_503217, Genolevures Ref: YALI0D24101g)에 기인하는 MNN4 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전 공학에 의해 생성된 세포는 OCH1 활성이 결핍되고 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현시킨다.

탈만노실화에 후속하여, 상기 표적 분자가 분리될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 효모 세포 내에서 유지되고 세포 분쇄(cell lysis)에 따라 방출된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 분자는 코딩 서열(외인성 핵산 또는 상기 발현 벡터 내로 유전 공학적으로 생성된)을 경유해 배지(culture medium) 내로 분비되고, 상기 세포로부터 분자의 분비를 안내한다. 세포 파쇄물 또는 배지 내의 무개방(uncapped) 및 탈만노실화된 표적 분자의 존재는 상기 분자의 존재를 검출하기 위한 다양한 표준 프로토콜들에 의해 입증될 수 있다. 예를 들면, 변경된 표적 분자가 단백질인 경우, 이러한 프로토콜들은, 제한되는 것은 아니지만, 면역 블러팅(immunoblotting) 또는 변경된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)을 위해 특이한 항체로의 방사성 면역 침강(radioimmunoprecipitation), 상기 변경된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)을 위해 특이한 리간드의 결합, 또는 상기 변경된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)의 특이적 효소 활성의 테스팅을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 분리에 후속하여, 상기 탈만노실화된 표적 단백질은 이형의 일부(heterologous moiety)들에, 예를 들면, 효소적 또는 화학적 수단을 이용하여 부착될 수 있다. "이형의 일부(heterologous moiety)"는 상기 변경된 표적 분자에 결합되는 임의의 성분(예를 들면, 공유 결합적으로 또는 비-공유 결합적으로)을 언급하며, 상기 성분은 상기 변경된 표적 단백질 상에 존재하는 초기의 성분과는 다르다. 이형의 일부들은, 예를 들면, 폴리머들, 운반체들, 보조제들, 연역 독소들 또는 검출 가능한(예를 들면, 형광, 인광 또는 방사성) 일부들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 추가적인 N-글리칸이 상기 변경된 표적 분자에 첨가될 수 있다.

표적 분자의 글리코실화를 검출하는 방법들은 DNA 염기 서열 분석기-보조 (sequencer-assisted DSA), 형광 보조 탄화수소 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis: FACE) 또는 표면 강화 레이저 탈착/이온화 자동화 질량 분석기(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: SELDI-TOF MS)를 포함한다. 예를 들면, 분석은, 예를 들면, 당단백질들이, 예를 들면, 막 상의 면역화에 수반하여 변성되는 DSA-FACE를 활용할 수 있다. 상기 당단백질들은 이후에 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT) 또는 θ-메캅토에탄올(mercaptoethanol)과 같은 적절한 환원제로 환원될 수 있다. 상기 단백질들의 설프히드랄 기들(sulfhydryl groups)은 요오도 아세트산(iodoacetic acid)과 같은 산을 사용하여 카르복실화(carboxylated)될 수 있다. 다음에, 상기 N-글리칸들이 N-글루코시다제(glycosidase) F와 같은 효소를 사용하여 상기 단백질들로부터 방출될 수 있다. N-글리칸들은, 선택적으로, 재구성될 수 있고 환원성 아민화(amination)에 의해 유도체 합성될(derivatized) 수 있다. 상기 유도체 합성된 N-글리칸들은 농축될 수 있다. N-글리칸 분석을 위해 적절한 기기들은, 예를 들면, ABI PRISM377 DNA 염기 서열 분석기(Applied Biosystems)를 포함한다. 데이터 분석은, 예를 들면, GENESCAN 3.1 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 수행될 수 있다. 분리된 만노프로테인들(mannoproteins)은 N-글리칸들 상활을 확인하도록 송아지 십이지장 포스파타제(calf intestine phosphatase)와 같은 하나 또는 그 이상의 효소들로 더 처리될 수 있다. N-글리칸 분석의 추가적인 방법들은, 예를 들면, 질량 분석기(mass spectrometry)(예를 들면, MALDI-TOF-MS), 정상 상(phase) 상의 고압 액상 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography: HPLC), 역상 및 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 글리칸들이 라벨되지 않은 때의 펄스 전류 검출과 글리칸들이 적절하게 라벨될 때의 자외선(UV) 흡수 또는 형광)를 포함한다. 또한 Callewaert 등의 "Glycobiology"((2001) 11(4)：275-281) 및 Freire 등의 "Bioconjug. Chem."((2006) 17(2)：559-564)을 참조 바란다.

유전 공학적으로 처리된 세포들의 배양들(Cultures of Engineered Cells)

본 명세서는 또한 여기서 설명하는 유전 공학에 의해 생성된 세포들의 임의의 것의 실질적으로 순수한 배양을 제공한다. 여기서 사용되는 바와 같이, 유전 공학에 의해 생성된 세포의 "실질적으로 순수한 배양(substantially pure culture)"은, 상기 유전 공학에 의해 생성된 세포, 예를 들면, 박테리아, 균류(효모를 포함하여), 마이코플라스마(mycoplasmal), 또는 프로토조안(protozoan) 세포들이기 보다는 상기 배양 내의 생존 가능한 세포들의 전체 숫자의 약 40% 보다 작은(즉, 약 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 보다 작거나 심지어는 더 작은) 세포들이 생존 가능한 세포들인 배양이다. 본 명세서에 있어서 "약(about)"이라는 용어는 특정한 퍼센티지의 위나 아래의 특정한 퍼센티지의 15% 정도가 되는 상대적인 퍼센티지를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 약 20%는 17% 내지 23%가 될 수 있다. 유전 공학에 의해 생성된 세포들의 이러한 배양은 세포들과 생장, 저장, 또는 이송 매체를 포함한다. 매체는 액체, 반-고체(예를 들면, 젤리 같은 매체) 또는 동결될 수 있다. 상기 배양은 상기 액체 내 또는 상기 반-고체 내/상애 성장되거나 혹은 동결된 저장 또는 이송 매체를 포함하여 저장 또는 이송 매체 내에 저장되거나 이송되는 세포들을 포함한다. 상기 배양들은 배양 용기 또는 저장 용기 혹은 기판(예를 들면, 배양 접시, 플라스크 또는 튜브 혹은 저장 유리병이나 튜브) 내에 있다.

여기서 기술하는 상기 유전 공학에 의해 생성된 세포들은, 예를 들면 동결 세포 현탁액들로서, 예를 들면 감압 동결 건조된 세포들로서 글리세롤이나 수크로스(sucrose)와 같은 저온 보호 물질(cryoprotectant)을 함유하는 완충액들 내에 저장될 수 있다. 선택적으로는, 이들은, 예를 들면 동결 건조된 베드 건조에 의하거나 분무 건조. 또는 다른 적절한 건조 방법에 의해 수득되는, 예를 들면 건조된 세포 침전물들로서 저장될 수 있다.

대사 장애들(Metabolic Disorders)

탈만노실화된 분자들은 다양한 대사 장애들을 치료하는데 사용될 수 있다. 대사 장애들은 각각 인간(또는 동물) 세포들 내의 에너지의 생산에 영향을 미치는 하나이다. 대부분의 대사 장애들은 유전적이며, 이들 중 몇몇은 다이어트, 독소들, 감염들 등의 결과로 "획득될(acquired)" 수 있다. 유전적인 대사 장애들은 선천성 신진 대사로서 알려져 있다. 일반적으로, 대사 장애들은 상기 세포의 신진 대사 과정에서 몇몇의 단계를 위해 제거하거나 적절하게 형성된 효소를 초래하는 유전적인 결함에 의해 유발된다. 대사 장애들의 가장 큰 범주들은 탄수화물 대사, 아미노산 대사의 질환들, 유기산 대사의 질환들(유기산 뇨들), 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사의 질환들, 포르피린 대사 질환들, 퓨린 또는 피리미딘 대사 질환들, 스테로이드 대사의 질환들, 미토콘드리아 기능의 질환들, 페록시소말(peroxisomal) 기능의 질환들 및 리소소말 축적 질환들이 있다.

하나 또는 그 이상의 탈만노실화 분자들(또는 동일한 제약 조성물들)을 통해 치료될 수 있는 대사 장애들의 예시들은 유전 혈색소 침착증(hereditary hemochromatosis), 범발성 백색증(oculocutaneous albinism), 단백질 C 결핍증(protein C deficiency), 유형 I 유전적 혈관 부종(type I hereditary angioedema), 선천성 슈크라제-이소말타아제 결핍(congenital sucrase-isomaltase deficiency), 크리글러-나자르 유형 II(Crigler-Najjar type II), 라론 증후군(Laron syndrome), 면역 결핍증(hereditary Myeloperoxidase), 갑상선 기능 저하증(primary hypothyroidism), 선천성 QT 연장 증후군(congenital long QT syndrome), 티록신 결합 글로불린 결핍증(tyroxine binding globulin deficiency), 가족성 과콜레스테롤혈증(familial chylomicronemia, abeta-lipoproteinema), 가족성 카일로마이크론혈증(familial chylomicronemia), 아베타-리포프로테이네마(abeta-lipoproteinema), 낮은 혈장 지단백 수준들(low plasma lipoprotein A levels), 간 손상 및 유전 기종(hereditary emphysema with liver injury), 선천성 갑상선 기능 저하증(congenital hypothyroidism), 골 형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 유전적 저파이브리노젠혈(hereditary hypofibrinogenemia), 알파-1 안티키모트립신결핍(alpha-1antichymotrypsin deficiency), 신성요붕증(nephrogenic diabetes insipidus), 신경뇌하수체의 요붕증(neurohypophyseal diabetes insipidus), 아데노신데아미나아제 결손증(adenosine deaminase deficiency), 펠리쩨유스-메르쯔바하 병(Pelizaeus Merzbacher disease), 폰빌레브란트병 유형IIA(von Willebrand disease type IIA), 결합 인자들 V 및 VIII의 결핍(combined factors V and VIII deficiency), 선천성 척추뼈끝 형성 이상(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda), 맥락막 결여(choroideremia), I 세포 병(I cell disease), 바텐병(Batten disease), 모세혈관확장성운동실조(ataxia telangiectasias), 상염색체우성다낭신(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease), 미세 융모 포함 질환(microvillus inclusion disease), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 안뇌신증후군(oculocerebro-renal syndrome of Lowe), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 베어림프구증후군(Bare lymphocyte syndrome), 탄지에르질환(Tangier disease), 가족적 간내 담즙정체(familial intrahepatic cholestasis), X 염색체 유전자의 부신 백질이영양증(X-linked adreno-leukodystrophy), 스콧 증후군(Scott syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군 유형 1 및 2(Hermansky-Pudlak syndrome types 1 and 2), 젤웨거 증후군(Zellweger syndrome), 근형부 이형성증 점상(rhizomelic chondrodysplasia puncta), 상염색체 열성 기본 고수산뇨증(autosomal recessive primary hyperoxaluria), 모어-트래네제거 증후군(Mohr Tranebjaerg syndrome), 척추 및 공기 주머니 근육 위축(spinal and bullar muscular atrophy), 기본 섬모 디케네시아(primary ciliary diskenesia)(카르타게너 증후군(Kartagener's syndrome)), 거대증 및 말단 비대증(giantism and acromegaly), 유즙 분비증(galactorrhea), 에디슨병(Addison's disease), 부신성 웅성화(adrenal virilism), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 케토애시도시스(ketoacidosis), 고알도스텔론혈증 또는 속발성알도스테론증(primary or secondary aldosteronism), 밀러-디커 증후군(Miller Dieker syndrome), 뇌회결손(lissencephaly), 운동 신경 질환(motor neuron disease), 우셔 증후군(Usher's syndrome), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 옵티즈 증후군(Optiz syndrome), 헌팅턴병(Huntington's disease), 유전성 췌장염(hereditary pancreatitis), 항인산화지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 중복 결합 조직 질환(overlap connective tissue disease), 쇼그렌 증후군(Sjgren's syndrome), 강직인간증후군(stiff-man syndrome), 브루가다 증후군(Brugada syndrome), 핀란드형 선천성 신장 증후군(congenital nephritic syndrome of the Finnish type), 듀빈존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), X 염색체 유전자의 하이포포스포스파테미아(X-linked hypophosphosphatemia), 펜드리드 증후군(Pendred syndrome), 영아기 저혈당증(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy), 유전성 구상적혈구증(hereditary spherocytosis), 선천성철분대사이상증(aceruloplasminemia), 유아 신경성 세로이드 리포후스 진 침착 질환(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 가연골무형성증 및 다발성 골단 이형성(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal), 스타가르트와 같은 황반 영양 장애(Stargardt-like macular dystrophy), X 염색체 유전자의 샤르코-미러 치아 질환(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease), 상 염색체 우성 색소성 망막염(autosomal dominant retinitis pigmentosa), 울콧-랄리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 쿠싱병(Cushing's disease), 사지연결근육퇴행위축(limb-girdle muscular dystrophy), 무콥로이-삭챠리도시스 유형 IV(mucoploy-saccharidosis type IV), 핀란드의 유전 가족성 아밀로드증(hereditary familial amyloidosis of Finish), 앤더슨병(Anderson disease), 육종(sarcoma), 만성골수단구성백혈병(chronic myelomonocytic leukemia), 심근증(cardiomyopathy), 안면 성기 형성 장애(faciogenital dysplasia), 비틀림 질환(Torsion disease), 헌팅턴 및 척수소뇌실조증(Huntington and spinocerebellar ataxias), 유전성 하이퍼호모스테이네마(hereditary hyperhomosyteinemia), 말초신경병증(polyneuropathy), 근위축성 측색 경화증(lower motor neuron disease), 망막색소변성증(pigmented retinitis), 혈청 음성 다발성 관절염(seronegative polyarthritis), 간질성폐섬유증(interstitial pulmonary fibrosis), 레이노 증후군(Raynaud's phenomenon), 베게너육아종증(Wegner's granulomatosis), 단백뇨(preoteinuria), CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If, CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc, CDG-IId, 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 다발성 외골증(multiple exostoses), 그리셀리 증후군(Griscelli syndrome) 유형 1 또는 유형 2, 또는 X 염색체 유전자의 비특정 정신 지체(X-linked non-specific mental retardation)를 포함할 수 있다. 덧붙여, 대사 장애들은 또한 파브리병(Fabry disease), 점액성 다당류증 I(mucopolysaccharidosis I), 파버병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성 질환(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease)(유형들 A, B 및 C), 샤이에 증후군(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필립포 증후군(Sanfilippo disease), 모르키오 증후군(Morquio disease), 마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy disease), 히알루론산분해효소 결핍증(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코사이드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 증후군(Schindler disease), 사이알리도시스 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장 질환(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다발성 술파타아제결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis) (제II 형, 제III 형 및 제IV 형), 시스틴증(cystinosis), 시알산 저장 장애(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐그렌 증후군을 갖는 카일로마이크론보존질환(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjgren syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease) 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)과 같은 리소즘 저장 질환(lysosomal storage disorders)을 포함할 수 있다.

대사 장애의 증상들은 수많고 다양하며, 예를 들면, 빈혈(anemia), 피로(fatigue), 타박이 쉽게 일어남(bruising easily), 낮은 혈소판(low blood platelets), 간 증대(liver enlargement), 비장 증대(spleen enlargement), 골격 약화(skeletal weakening), 폐 손상(lung impairment), 감염들(예들 들면, 가슴 감염 또는 폐렴), 신장 손상(kidney impairment), 진행성 뇌 손상(progressive brain damage, 발작(seizures), 추가의 태변 착색(extra thick meconium), 기침(coughing), 천명(wheezing), 과도한 타액 또는 점액 생산(excess saliva or mucous production), 호흡 곤란(shortness of breath), 복통(abdominal pain), 창자 또는 내장 폐색(occluded bowel or gut), 불임 문제들(fertility problems), 코 폴립(polyps in the nose), 손톱들/발톱들 및 피부의 곤봉지(clubbing of the finger/toe nails and skin), 손들 또는 발들의 통증(pain in the hands or feet), 각화 혈관종(angiokeratoma), 땀의 감소(decreased perspiration), 각막 및 렌즈 혼탁(corneal and lenticular opacities), 백내장(cataracts), 승모판탈출증 및/또는 역류(mitral valve prolapse and/or regurgitation), 심장 비대(cardiomegaly), 온도 편협(temperature intolerance), 보행 장애(difficulty walking), 섭취 장애(difficulty swallowing), 진행성 시력 저하(progressive vision loss), 진행성 청력 저하(progressive hearing loss), 근긴장 저하(hypotonia), 대설증(macroglossia), 무반사증(areflexia), 하부 요통(lower back pain), 수면성 무호흡(sleep apnea), 기좌호흡(orthopnea), 경면(somnolence), 척추전만증(lordosis) 또는 척추측만증(scoliosis)을 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다. 결함이 있거나 없는 단백질들 및 결과 질병 표현형(예들 들면, 신진 대사 장애의 증상의 제시)의 다양한 특성으로 인해, 주어진 장애는 일반적으로 특정 장애에 대한 특성만을 제시하는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 파브리병(Fabry disease)을 갖는 환자는 위에서 언급한 온도 편협(temperature intoleranc), 각막 휠링(corneal whirlin), 통증, 피부 발진(skin rashes), 메스꺼움(nausea) 또는 설사(dirarrhea)와 같은 증상의 특정 하위 집합을 나타낼 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기서 설명하는 하나 또는 그 이상의 탈만노실화된 분자들의 투약 이외에도, 대사 장애는 또한 적절한 영양 및 비타민들(예를 들어, 보조 인자 치료법(cofactor therapy)), 물리적 치료법 및 통증 약물들에 의해 치료될 수 있다.

주어진 대사 장애의 특정한 특성에 따라서, 환자는 모든 연령에서 이러한 증상들을 나타낼 수 있다. 많은 경우에, 증상들은 어린 시절이나 초기 성인기에 나타날 수 있다. 예를 들면, 파브리 병(Fabry disease)의 증상은 10살 또는 11살과 같은 어린 시절에 나타날 수 있다.

여기에 기재된 바와 같이, "대사 장애 발생의 위험" 대상체는 장애를 발생시키는 소인을 갖는 대상체(즉, 산성 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다아제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다아제(beta-D-galactosidase), 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase), 베타-헥소사미니다아제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만노시다아제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다아제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타아제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타아제 A(arylsulfatase A), 알파-N-악테일갈락토사미니다아제(alpha-N-acteylgalactosaminidase), 아스파르틸글루코사미니다아제(aspartylglucosaminidase), 이두로네이트-2-설파타아제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니드-N-아세틸기전이효소(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다아제(beta-D-glucoronidase), 히알루로니다아제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다아제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴로미니다아제(alpha-neurominidase), 인산전이효소(phosphotransferase), 산 리파아제(acid lipase), 산 세라미다아제(acid ceramidase), 스핑고마이엘린나아제(sphinogmyelinase), 티오에스터라제(thioesterase), 카텝신 K(cathepsin K) 또는 지방단백질 리파아제(lipoprotein lipase)와 같은 효소의 돌연변이의 결과로서 대사 장애를 발생시키는 유전적 소인)이다. 즉, "대사 장애 발생의 위험"대상체는 관심의 종 내의 모든 대상체들이 아니다.

"장애를 갖는 것이 의심되는(suspected of having a disorder)" 대상체는 여기에 기재된 바와 같은 대사 장애의 하나 또는 그 이상의 증상들을 포함한다.

제약 조성물들 및 치료 방법들(Pharmaceutical Compositions and Methods of Treatment)

탈만노실화된 표적 분자는 상기 분자의 치료 효과적인 양을 포함하는 제약 조성물 및 하나 또는 그 이상의 보조제들(adjuvants), 부형제들(excipients), 운반체들(carriers) 및/또는 희석액들(diluents)에 통합될 수 있다. 적절한 희석액들, 운반체들 및 부형제들은 통상적으로 받는 인간의 항상성(예를 들어, 전해질 평형)에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 적절한 매개체들은 생체에 적합하거나 비활성을 갖는 소금들, 완충제들(buffering agents), 올리고-(oligo-) 또는 다당류(polysaccharides), 폴리머들(polymers), 점도가 개선된 에이전트들(viscosity-improving agents), 보존료(preservatives) 등과 같은 것을 포함한다. 일 실시예에 따른 매개체는 생리 식염수(physiologic saline)(0.15M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 다른 실시예에 따른 매개체는 50mM 인산나트륨(sodium phosphate), 100mM 염화나트륨(sodium chloride)이다. 나아가, 제약 조성물들의 제제 및 투여하기 위한 기술들에 대한 상세한 설명은 예를 들면, 레밍턴의 약학(Remington's Pharmaceutical Sciences)(마크 출판사(Maack Publishing Co), 이스턴(Easton), Pa.)에서 찾아볼 수 있다. 보조적인 활성 화합물들은 또한 상기 조성물들에 통합될 수 있다.

탈만노시화된 분자들을 포함하는 제약 조성물들의 투여는 전체적이거나 일부일 수 있다. 제약 조성물들은 경구적 투여 및/또는 비경구적 투여에 적합하게 제제될 수 있다. 특정한 관리 양식들은 피하의(subcutaneous), 정맥 주사의(intravenous), 근육 내의(intramuscular), 복강 내의(intraperitoneal), 경피의(transdermal), 척추 강내의(intrathecal), 구강의(oral), 직장의(rectal), 볼의(buccal), 국부의(topical), 코의(nasal), 눈의(ophthalmic), 내부내부하부기관지의(intraintrasubbronchial), 폐의(lymphatic), 질의(vaginal) 및 자궁 내의(intra uterine) 투여를 포함한다.

투여는 제약 조성물의 볼루스(bolus)의 정기적인 주입들에 의해 이루어지거나 외부의(예를 들면, IV 백) 또는 내부의(예를 들면, 생체 침식성 임플란트(bioerodable implant), 생체 인공 장기(bioartificial organ) 또는 N-글리코실화 분자 생산 세포들이 주입되고 변환된 집단)의 저장소(reservoir)로부터 정맥 또는 복강 내 투여에 의해 비연속적이거나 연속적일 수 있다. 예를 들면, 미국 특허들 제4,407,957호, 제5,798,113호 및 제5,800,828호를 참조 바란다. 제약 조성물의 투여는 펌프와 같은 적합한 전달 수단들을 이용하여 획득될 수 있다.(예를 들면, 약물 요법 기록(Annals of Pharmacotherapy), 27：912(1993); 암(Cancer), 41：1270(1993); 암 연구(Cancer Research), 44：1698(1984); 미세캡슐형성(microencapsulation)(예를 들면, 미국 특허들 제4,352,883호, 제4,353,888호 및 제5,084,350호 참조); 연속적인 지연 폴리머 임플란트들(continuous release polymer implants)(예를 들면, Sabel의 미국 특허 제4,883,666호 참조); 매크로캡슐화(macroencapsulation)(예를 들면, 미국 특허들 제5,284,761호, 제5,158,881호, 제4,976,859호 및 제4,968,733호 그리고 공개된 국제 특허 출원들 WO92/19195호 및 WO 95/05452 참조); 피하의(subcutaneously), 정맥 내의(intravenously), 동맥 내의(intra-arterially), 근육 내의(intramuscularly) 또는 다른 적합한 장소에의 주입 또는 캡슐, 액상의, 정제의, 알약의, 방출 지연 제제에 의한 구강 투여)

비경구적 전달 시스템의 예시들은 에틸런-비닐 아세테이트 공중 합체 입자들(ethylene-vinyl acetate copolymer particle), 삼투 펌프들(osmotic pumps), 이식 주입 시스템들(implantable infusion systems), 펌프 전달(pump delivery), 캡슐화된 세포 전달(encapsulated cell delivery), 리포좀 전달(liposomal delivery), 바늘로 전달되는 주입(needle-delivered injection), 바늘없는 주입(needle-less injection), 분무기(nebulizer), 에어로졸(aerosolizer), 일렉트로포레이션(electroporation) 및 경피 패치(transdermal patch)를 포함한다.

비경구 투여에 적합한 제제들은 받는 인간(예를 들면, 생리 식염수(physiological saline solution))의 혈액과 함께 가급적 등장성의 변환된 N-글리코실화 분자의 소독된 수용액 제재(sterile aqueous preparation)를 적당히 포함한다. 제제들은 유닛 도즈(unit dose) 또는 멀티 도즈(multi dose)로 나타낼 수 있다.

구강 투여에 적합한 제제들은 변환된 N-글리코실화 분자의 정량을 각각 함유하는 캡슐들, 특질들, 정제들 또는 캔디들과 같은 개별 유닛들 또는 수분을 함유한 리큐어(liquor) 내의 서스펜션 또는 시럽, 영약(elixir), 에멀전(emulsion) 또는 물약(draught) 등과 같이 수분을 함유하지 않은 액체로서 나타낼 수 있다.

국부 투여에 적합한 탈만노시화된 분자는 예를 들면, 크림(cream), 스프레이(spray), 폼(foam), 겔(gel), 도포제(ointment), 연고(salve) 또는 드라이 러브(dry rub)로서 포유동물(예를 들면, 인간 환자)에 투여될 수 있다. 상기 드라이 러브는 투여의 장소에서 다시 수화될 수 있다. 이러한 분자들은 직접 붕대, 거즈 또는 패치 내로 스밀 수(예를 들면, 배어들거나, 건조되거나)있다. 이후, 상기 분자들은 국부적으로 발릴 수 있다. 이러한 분자들은 또한 국부적인 투여를 위한 밴드, 거즈 또는 패드 내에서 반-액체(semi-liquid) 상태, 겔(gelled) 상태 또는 완전한 액체 상태(fully-liquid)를 유지할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,307,717호 참조).

제약 조성물의 치료적으로 효과적인 양은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 필요에 따라 정량 요법으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 예를 들면, 단위 용량 당 대상체의 체중 0.01μg/kg 내지 10,000μg/kg에서 정량이 조직적으로 대상체에 투여될 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 정량은 단위 용량 당 대상체의 체중 1μg/kg 내지 30μg/kg에서 조직적으로 대상체에 투여될 수 있다.(예를 들면, 단위 용량 당 대상체의 체중 3μg/kg 내지 10μg/kg)

치료 효과를 최적화하기 위해서 탈만노실화된 분자는 다른 투약 요법들에서 처음으로 투여될 수 있다. 요인들에 따른 유닛 도즈 및 요법은 예를 들면, 포유동물의 종들, 포유동물들의 면역 상태, 포유동물들의 체중을 포함한다. 통상적으로, 조직에서 이러한 분자의 레벨들은 예를 들면, 주어진 치료 요법의 효과를 확인하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 적절한 스크리닝 분석들(screening assays)을 사용하여 모니터링할 수 있다.

탈만노실화된 분자를 위한 투여 횟수는 기술자 및 의료 종사자(예를 들면, 의사들 및 간호사들)의 임상적 판단들에 있다. 통상적으로, 투여 요법은 최적의 투여 변수들을 설정할 수 있는 임상 시험들에 의해 설정될 수 있다. 그러나, 상기 의료 종사자들은 대상체들의 나이, 건강, 체중, 성별 및 의료 상태에 따라서 투여 요법들을 달리할 수 있다. 상기 투여 횟수는 상기 치료법이 예방적인 것인지, 치료적인 것인지에 따라서 달리될 수 있다.

이러한 분자들 또는 이의 제약 조성물들의 독성과 치료적인 효험은, 예를 들면, 세포 배양들이나 실험 동물들 내의 알려진 제약학적 과정들에 의해 결정될 수 있다. 이들 과정들은, 예를 들면, LD₅₀(모집단의 50%까지 치명적인 복용량) 및 ED₅₀(모집단의 50%까지 치료적으로 효과적인 복용량)의 결정을 위하여 이용될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 복용량의 비율은 치료 지수이며, 이는 LD₅₀/ED₅₀의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수들을 나타내는 제약 조성물들이 바람직하다. 독성 부작용들을 나타내는 제약 조성물들이 사용될 수 있지만, 정상 세포들(예를 들면, 비-표적 세포들)에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고, 이에 따라 부작용들을 감소시키기 위하여 감염된 조직의 사이트에 대한 이러한 화합물들을 표적으로 하는 전달 시스템의 설계에 주의해야 한다.

상기 세포 배양 분석들과 동울 연구들로부터 수득된 데이터는 적절한 대상체들(예를 들면, 사람 환자들) 내에 사용을 위한 용량 범위 제형에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물의 용량은 일반적으로 독성이 적거나 독성이 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도들의 범위 내에 놓인다. 상기 용량은 사용되는 용량과 활용되는 투약의 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변화될 수 있다. 여기서 설명되는 바와 같은 제약 조성물을 위하여(예를 들면, 대상체 내의 대사 장애의 치료를 위하여), 상기 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 분석들로부터 초기에 산정될 수 있다. 복용량은 세포 배양에서 결정되는 바와 같이 IC₅₀(즉, 증상들의 억제 최대 중간값을 구현하는 상기 제약 조성물의 농도)을 포함하는 순환 플라스마 농도 범위 동물 모델들 내에서 제형될 수 있다. 이러한 정보는 사람들 내에서 유용한 복용량을 보다 정확하게 결정하는 데 이용될 수 있다. 플라스마의 레벨들은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

여기에 기재된 바와 같이, 탈만노실화된 분자의 "치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 치료되는 대상체 내에 의학적으로 바람직한 결과(예를 들면, 대사 장애의 하나 또는 그 이상의 증상들의 개선)를 생성할 수 있는 상기 분자의 양이다. 치료적으로 효과적인 양(즉, 효과적인 복용량)은 대상체 또는 샘플 중량의 킬로그램 당 밀리그램 또는 마이크로그램의 양(예를 들면, 킬로그램 당 약 1마이크로그램 내지 킬로그램당 약 500밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5밀리그램, 킬로그램 당 약 1마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50마이크로그램)을 포함한다.

상기 대상체는 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간(예를 들면, 사람 환자)이나 비-인간 영장류(예를 들면, 침팬지, 비비 또는 원숭이), 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 말, 가축의 일종(예를 들면, 소, 돼지, 양 또는 염소), 개, 고양이, 혹은 고래가 될 수 있다.

여기서 설명하는 분자 또는 이의 제약 조성물은 다른 치료, 예를 들면, 대사 장애(예를 들면, 리소소말 축적 질환)의 치료와 함께 병용 요법으로 대상체에 투약될 수 있다. 예를 들면, 상기 병용 요법은 상기 대상체(예를 들면, 사람 환자)에게 대사 장애(예를 들면, 리소소말 축적 질환)를 갖거나 진행될 위험이 있는(또는 가지는 것으로 의심되는) 상기 대상체에 치료적 이익을 제공하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 제제들을 투약하는 것을 포함할 수 있다. 따라서 상기 화합물이나 제약 조성물 및 하나 또는 그 이상의 추가적인 제제들은 동시에 투약될 수 있다. 선택적으로는, 상기 분자가 첫 번째로 투약되고, 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 제제들이 두 번째로 투약되거나, 그 반대의 경우도 가능하다.

이전의 치료가 특히 독성(예를 들면, 중대한 부작용 프로파일들을 갖는 대사 장애를 위한 치료)인 예들에 있어서는 여기에 기재된 분자의 투약이 이전의 치료의 양을 독성이 없이 동일하거나 향상된 치료적 이익을 충분한 수준까지 상쇄 및/또는 저감하는 데 이용될 수 있는 점을 이해할 수 있을 것이다.

여기서 설명하는 임의의 제약 조성물들이 투약의 지시 사항들과 함께 용기, 팩 또는 분배기 내에 포함될 수 있다.

다음은 본 발명의 실제의 실험예들이다. 이들은 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로 해석되는 것은 아니다.

실험예들

실험예 1

huGAA 발현 균주의 생성

상기 인간 알파 글루코시다아제(human alpha glucosidase)(산 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase (GAA)) 또는 산 말타아제(acid maltase) EC3.2.1.3으로서도 알려진)의 복제들 세 개 및 상기 Y.리포리티카(Y.lipolytica) MNN4 유전자의 복제들 두 개를 함유하는 Y.리포리티카 균주 OXYY1589는 구성되었다. 균주 OXYY1589의 유전자형은 다음과 같다.

MatA, leu2-958, ura3-302, xpr2-322,

gut2-744, ade2-844

POX2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::제타(zeta)

POX2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::제타(zeta)

POX2-Lip2pre-hGM-CSF:GUTEx::제타(zeta)

YlMNN4-POX2-hp4d-YLMNN4::PT 표적된(targeted)

모든 변형은 상기 다른 선택적 표지들을 위한 조작들을 통해 잘 정립된 프로토콜들에 따라 수행되었다. 모든 경우에 있어서(달리 지정하지 않는 한), huGAA 통합 절편은 상기 발현 플라스미드들(plasmids)로부터 카나마이신(kanamycin) 제한 유전자를 제거하기 위하여 NotI 제한 소화에 의해 획득되었다. 상기 결과 분절들은 아라로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 이어 상기 정확한 huGAA 분절의 퀴아젠 열 정화(Qiagen column purification)에 의하여 모두 분리되었다. 균주 OXYYl589는 제1 복제된 인간 GAA(huGAA)에 의해 Y.리포리티카 발현 벡터(expression vector)에 구성되고, Y.리포리티카 MNN4 탠덤(tandem) 발현 벡터를 구성하였다. 이어 세 가지 안정한 통합적 변형들은 상기 최종 huGAA 제조 균주 OXYY1589를 획득하기 위하여 수행되었다.

huGAA 발현 벡터를 최적화한 Y.리포리티카 코돈: 상기 110 kDA 인간 GAA(huGAA) 전구체를 코드화 하는 상기 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성되었고, 코돈은 Y.리포리티카 발현을 최적화하였다. 합성 구조에 있어서, 상기 '전(pre-)' 및 '앞(pro-)' huGAA 신호 펩티드들은 제어되어 상기 단백질은 아미노산 57에서 시작한다. huGAA의 합성 ORF(도 1a 참조)는 상기 Y.리포리티카 LIP2 신호 서열의 상기 5' 말단부터 상기 3' 말단에 있는 분절에 융합되고, 이어 두 개의 Xxx-Ala 분열 부분들의 서열을 코드화 되며, 발현 벡터에서 복제를 위한 제한 부분들 BamHI 및 AvrII로 둘러싸이게 된다. 상기 구성은 상기 유도성 POX2 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 복합 단백질의 완전 아미노산 서열은 도 1b에 나타난다.

상기 발현 벡터의 일반적 규모는 도 2에 나타난다. 상기 박테리아의 모이어티(moiety)는 상기 플라스미드 pHSS6로부터 유도되었으며, 박테리아의 복제 기원(ori) 및 카나마이신에 대한 저항을 갖게 하는 카나마이신-제한 유전자(KanR)를 포함한다. 상기 통합 카세트(cassette)는 다음을 포함한다: (a) 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)로의 변형을 위한 선택 표지(URA3; LEU2; GUT2), (b)프로모터로 구성된 상기 발현 카세트, (c) 신호 서열을 통해 분절에 huGAA를 삽입하는 다중 복제 부분(MCS) 및 (d) 상기 LIP2 유전자의 종결부분. 상기 통합 카세트는 상기 Y.리포리티카 게놈으로 안정한 비-상동 통합을 위해 제타 서열들에 의해 둘러싸였다. 두 개의 NotI 제한 부분들은 변형 이전에 상기 발현 카세트의 고립을 가능하게 한다. 플라스미드들 pRAN034, pRAN036 및 OXYP183은 사용되어 URA3, LEU2 및 GUT2 변형 표지들 각각을 함유하는 huGAA 발현 벡터들 pRAN058, pRAN059 및 pRAN060을 각각 생성하였다.

탠덤 YlMNN4 발현 벡터: 상기 YlMNN4 유전자는 상기 유도성 pPOX2 프로모터 및 상기 (반)구성적 hp4d 프로모터의 조절 하에 복제되었다. YlMNN4의 이러한 발현 카세트들 두 개는 상기 게놈의 ADE2 장소(locus)로의 표적된 통합 및 선택 표지로서 상기 ADE2 유전자를 위하여 상기 ADE2 유전자의 둘러싼 영역들(PT)을 수행하는 탠덤 구성으로서 하나의 벡터로 서브복제(subcloned) 되었다.

중간 균주 OXYY1569: 상기 제1 변형은 중간 제조합체 균주 OXYY1569를 생성하기 위하여 URA3 및 LEU2표지를 사용하여 pRAN058 및 pRAN059 벡터들로부터 정화된 상기 발현 카세트의 복합변형이었다. OXYY1569는 균주 G014의 게놈에 무작위로 통합된 상기 pPOX2 프로모터의 조절 하에 huGAA의 두 개의 발현 구성들을 이송한다.

OXYY1569는 다음과 같이 선택되었다. 상기 이질적인 huGAA DNA의 Y.리포리티카의 게놈으로의 통합을 확인하기 위하여 게놈적 DNA의 PCR 검사(PCR screening)는 수행되었다. 프라이머들은 huGAA 뉴클레오티드 서열에서 기인한 2552bp의 분절을 증폭시키도록 고안되었다. 상기 게놈적 DNA의 서전 블롯 분석(Southern blot analysis)도 huGAA DNA의 최소한 두 개의 복제들의 통합을 확인하고자 수행되었다. 특히, OXYY1569 복제들에서 기인한 게놈적 DNA는 Hind III를 통해 소화되었으며, 특정 프로브(probe)로 표지된(labeled) huGAA DIG를 통해 증명되었다.

고단위(high levels)의 huGAA를 분비하는 클론(clone)을 선택하기 위하여, 상기 PCR 검사 및 서전 블롯에서 양성으로 확인된 클론들 중 무작위로 선택된 몇몇은 표준 절차에 따른 조건들을 포함하는 POX2 하에 혼합 플라스크들에서 배양되었다. 모든 경우들에 있어서, 상기 배양 상청액은 72 시간 동안 포스트-인덕션(post-induction)에서 수집되고, 표준 웨스턴 블롯(Western blot) 및 효소 활성 시금 분석으로 검진되었다(screened). OXYY1569에서 두드러진 구조로 나타난 OXYY1569의 N-클리칸 분석은 Man8GlcNAc2이다.

중간 균주 OXYY1584: 재조합 균주 OXYYl569는 상기 Y.리포리티카 MNN4 유전자의 복제들 두 개를 이것의 게놈으로 통합시켜 OXYYl584를 생성하기 위하여 변형되었다. 상기 변형은 플라스미드 OXYP1479B로부터 여기된 발현 카세트로 유도된 SacII/XmaI를 통해 수행되었다. 상기 발현 카세트는 Y.리포리티카 게놈의 ADE2 장소로의 표적된 통합을 위해 고안되었다. 상기 재조합 균주는 서전 블로팅 및 글리칸 분석(glycan analysis) 이후에 선택되어 상기 증가된 인산화 반응에 대한 상기 균주의 행동이 측정되었다. 임의로 선택된 몇몇 형질변환의 게놈적 DNA는 프로브로 표지된 MNN2 특정 DIG를 통해 소화되고 증명된 SpeI였다. MNN4 발현 카세트의 Y.리포리티카 게놈의 ADE2 장소로의 정확히 표적된 통합은 4207bp 및 5683bp 결합들(bands)을 제공해야 한다. 서전 블롯 양성 클론들은 표준 혼합 플라스크 절차에서 배양되었다. 선택된 단백질의 N-글리칸 분석은 상기 중간 클론 OXYY1584를 선택하기 위하여 수행되었다. 상기 모균주 OXXY1569와 비교해보면, MNN4 과발현(over-expression) 이후 상기 두드러진 구조들은 Man8GlcNAc2(PMan)1 및 Man8GlcNAc2(PMan)2이다.

균주 OXYYl589의 생성: 상기 최종 자가 영양(prototrophic) 생성 균주 OXYY1589를 생성하기 위하여, huGAA의 제3 복제는 재조합 OXYY1584 균주의 게놈으로 통합되었다. 상기 변형은 pRAN069에서 기인한 발현 카세트로 여기된 상기 NotI를 통해 수행되었다. 형질 변환들은 먼저 huGAA의 추가적 복제의 존재를 위한 gDNA 상에서 PCR에 의해 검진되었다(screened). huGAA 생성을 측정하기 위하여 임의로 선택된 PCR 양성 클론들이 발현을 위하여 표준 혼합 플라스크 배양 이후에 추가적으로 분석되었다. 최고 단위(highest level)의 huGAA를 발현하는 클론은 서전 블롯 분석 및 효소적 활성 시금 이후에 선택되었다. M8의 MP2-M8로의 전환 정도들(levels)이 또한 확인되었으며, MP-M8 N-글리칸들은 상기 추가적 huGAA 발현 카세트의 존재에 의해 영향을 받지 않았다.

실험예 2

균주 OXYY1589의 유가 배치 배양(Fed Batch Cultivation)

균주 OXYY1589(실험예 1)로부터 huGAA를 생성하기 위하여, 유가 배치 배양 공정이 6~8 리터의 작업량(working volume)을 통해 10L 교반 탱크를 사용하여 수행되었다. 상기 공정은 다음의 두 상태들로 나눠졌다.

(1) 바이오매스(biomass) 형성을 위한 글루코스 상의 배치 성장(batch growth)

(2) 제한된 올레산 주입의 도움을 통한 유도에 의한 산물 형성

전형적으로, 상기 배치 상태(batch phase)는 약 20 시간이었으며, 생산 상태는 대략 72 시간이었다. 상기 공정의 마지막에서, 상기 배양액은 원심분리 되어 상청액이 수집되었다. 상기 상청액은 상기 GAA의 정화를 위한 시작 물질로서 사용되었다(실험예 3 참조).

하기 파라미터들은 상기 발효 동안 제어되었다. 1.5 vvm(시간 당 부피비율(volume per volume per minute)) 공기의 상수 값으로 통기가 유지되었다. 용존 산소량(DO)은 초기에 30%로 유지되었다. 상기 교반은 상기 DO에 따라 600rpm에서 1200rpm으로 증가되었다. 상기 교반이 최고치인 1200rpm에 도달하자마자 상기 속도는 일정하게 유지되었으며, 상기 DO-설정치는 10%로 설정되었다. 10% DO를 유지하기 위하여, 산소는 50%의 최고 비율로 상기 반응기로 주입되었다. 거품 발생은 거품 조사(foam probe)에 의해 제어되었다. 거품이 감지되는 경우, 소포제가 상기 생물반응기로 첨가되었다. 상기 pH는 14% (v/v) 암모니아(염기) 또는 10% 인산을 첨가함으로써 제어되어 pH 6.8의 상수값이 유지되었다. 상기 온도는 상기 전체 공정을 통틀어 28℃로 일정하게 유지되었다.

바이오매스는 600nm의 광학 밀도 측정을 통해 모니터 되었다. 상기 샘플들은 상기 분광 광도계의 선형 범위 내에 있는 값을 얻기 위하여 희석액에 2-1000배 희석되었다. 산물 형성은 서전 블롯 분석 및 특정 효소적 활성 테스트들에 의해 감지되었다.

실험예 3

재조합 huGAA(rhGAA)의 정화

배양 이후 상기 상청액(실험예 2 참조)은 심층 여과를 통해 분류되었다. 이어, 상기 결과 물질은 TFF를 통해 10배 농축되었고, 10kDa MWCO 세포막(밀리포어 사(Millipore. Inc)) 상에서 pH 6의 인산나트륨 20mM 및 NaCl 100mM에 대하여 철저히 여과되었다.

rhGAA의 정화는 1M 농도의 황산암모늄을 첨가함으로써 시작되었다. 원심분리 이후에, 상기 상청액은 XK16/40 열로 포장된 토요펄-페닐(Toyopearl-Phenyl) 650M(토소 바이오사이언스 사(Tosoh Biosciences. Inc))로 옮겨졌다. 1 내지 0M의 황산암모늄 선형 조성은 용리(elution)를 위하여 적용되었다. 이어, rhGAA를 함유한 이러한 부분들은 모아졌으며(pooled), pH 6의 비스-트리스(BIS-TRIS) 10 mM 버퍼(buffer)로 교환되었다. 추가 정화는 0 내지 1M NaCl의 선형 염분 조성을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 트리콘(Tricorn) 10/50 또는 XK25/20 열(column)로 포장된 30Q 소스(GE 헬스케어 사(Ge Healthcare. Inc)) 상에서 달성되었다. 이어, 상기 결과 GAA-함유 부분들은 pH6의 인산나트륨 50 mM 및 NaCl 200mM를 통해 사전에 평형이 유지된 최종 Hiload 16/60 superdex 200 겔 여과 열(GE 헬스케어 사) 상으로 옮겨지기 이전에 농축되었다. 부분들은 쿠마씨-변형된(Coomassie-stained) SDS-PAGE 겔들 상에서 특정 활성 및 순도에 기반을 두어 선택된 뒤, 결합되고 5-10mg/ml의 최종 농도로 농축되었다. 단백질 농축은 10 kDa의 분자량 절단을 통해 15ml 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심 장비들(밀리포어 사) 상에서 행해졌다.

rhGAA를 위한 상기 질적 검진을 위한 상기 반응들은 10 또는 51의 용리 분율에 대하여 10:1 또는 20:1 부피 비율의 0.35 mM 4-MUG, 0.1% BSA 및 pH 4의 아세트산나트륨 100 mM로 구성된 반응 버퍼를 첨가함으로써 시작되었다. 모든 반응들은 96-웰 평탄-하부 미세적정 플레이트들(96-well flat-bottom microtiter plates)에서 수행되었다. 30분 내지 1시간의 37℃ 온도 조건의 잠복기 이후에, pH11의 글리신 100mM이 동일 부피만큼 첨가되어 상기 반응은 정지되었고, 상기 형광유전자 반응 산물 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone)의 방출은 UV 광원 하에서 관찰되었다. 특성 활성들(단위/mg 단백질)은 상기 황색 p-니트로페놀레이트 반응 산물의 효소적 방출을 측정하는 상기 합성 기질 p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG))를 통한 비색 분석을 사용하여 결정되었다. 상기 반응들은 미세적정 플레이트들의 반응 웰들에서 10㎕의 효소 용액 및 90㎕의 기질 반응 버퍼(pH4의 시트르산염-인산염 버퍼 150mM에 있는 2 mM PNPG, 1% BSA)를 혼합함으로써 시작되었고, 후속하여 37℃에서 배양되었다. 1 내지 2 시간 이후에 pH 12의 10% 탄산나트륨이 정지 버퍼와 동일한 부피만큼 첨가되어 상기 반응을 정지시키고 상기 방출된 p-니트로페놀(p-nitrophenol (PNP))을 이것의 이온화된 상태로 전환시켰다. 배경-정정된 흡수들(background-corrected absorbances) 및 p-니트로페놀레이트 표준들은 405nm 파장에서 측정되었고, 특정 활성들은 계산되었다. 단백질 농도들은 상기 비신코니닉산(bicinchoninic acid (BCA)) 방법을 통하여 결정되었다. 하나의 단위는 37℃ 및 pH 4의 시트르산염-인산염 완충 내 최종 기질 농도가 2mM인 조건에서 1nmol PNPG의 1nmol PNP 및 D-글루코스로의 분 당 전환을 촉진하는 효소의 양으로서 정의되었다.

실험예 4

CcMan5 and CcMan4의 발현

CcMan4 및 CcMan5 ORF들은 DsbA 신호 서열을 함유하고 N-종결 폴리히스티딘 태그(N-terminal polyhistidine tag)를 통한 단백질의 발현을 유발하는 상기 벡터 pLSAH36으로 복제되었다. 상기 단백질들의 발현은 E. coli BL21 세포들에서 수행되었다. 상기 주변 세포질 내에 있는 단백질들은 타론 열(Talon column)을 사용하여 고립되고 정화되었다. DsbA-CcMan5 및 DsbA-CcMan4의 ORF의 뉴클레오티드 서열들은 도 3 및 도 4에서 제공된다. 상기 플라스미드들 pLSAHCcMan5 및 pLSAHCcMan4의 전계도는 도 5에서 제공된다.

실험예 5

GH47-마노시다아제들(mannosidases)을 통한 APTS-표지된 인산화된 N-글리칸들의 디마노실레이션(De-mannosylation)

하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina, Hj)에서 기인한 상기 GH47 α-1,2-마노시다아제(α-1,2-mannosidase)(아나모프(anamorph): 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei))는 Man9GlcNAc2 올리고당에서 기인한 모든 4 α-1,4 연결된 만노오스(mannose) 당류들을 순차적으로 제거할 수 있다. (Maras, M. et al., J. 바이오에탄올(Biotechnol), 77: 255-263 (2000)) 유사한 활성은 아스퍼길러스 사토이(Aspergillus satoi (As))(아스퍼길러스 포에닉스(Aspergillus phoenicis)로도 알려진)에서 기인한 상기 α-1,2-마노시아다아제를 위하여 묘사되었다.(Ichishima E. et al., 생화학(Biochem). J., 339: 589-597).

HjMan(유전자은행 nr AAF34579)은 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 발현되었으며 Maras, M. et al., J. 바이오에탄올, 77: 255-263 (2000)에 기재된 바와 같이 정화되었다. AsMan(유전자은행 nr BAA08634)의 상업적 효소 제조는 프로자임-글리코(Prozyme-Glyco)로부터 가능하다.

H.제코리아 및 A.사토이에서 기인한 상기 α-1,2-마노시아다아제는 Man8GlcNAc2 (M8), 상기 일인산화된(monophosphorylated) ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8) 및/또는 상기 이인산화된(diphosphorylated) (ManP)2-Man8GlcNAc2 ((MP)2-M8) 당들을 함유하는 상기 MNN4 유전자를 과발현 하는 야로위아 리포리티카 세포들로부터 유도된 8-아미노-1,3,6-파이렌삼황산(pyrenetrisulfonic acid (APTS))-표지된 당분들의 혼합 상에서 시험되었다. 도 6에서, 상기 잠재 최종 가수분해 산물들은 도식적 방식으로 나타나며, 상기 근본적인 마노시다아제가 인산화될 경우, α-1,2-마노시다아제들은 또한 상기 종결 α-1,2-마노시다아제를 가수분해할 수 있을 것으로 추정된다. 인산화된 N-글리칸들 상에서의 상기 α-1,2-마노시다아제들의 활성을 개방된(uncapped) 상기 인산 잔기를 통해 시험하기 위하여, 상기 MNN4 당분들은 CcMan5 및 셀루로시마이크로비움 셀루란스(Cellulosimicrobium cellulans)에서 인산 개방 활성을 통해 기인한 GH92 효소로 처리되었다. CcMan5는 마노스(mannose)-인산-마노스 디에스터(diester) 결합에 있는 상기 종결 마노스를 제거한다.

그렇지 않으면, APTS-표지된 N-글리칸 상에서 AsMan 및 HjMan를 통한 모든 서술된 반응들은 2 mM CaCl₂를 통한 pH 5.0의 10mM 암모늄아세테이트 버퍼에서 37℃로 밤새 수행되었다. 상기 반응은 2 mM CaCl₂가 첨가된 10 mM HEPES 버퍼를 사용하여 pH 7.0 및 실온에서 수행되었다. 글리칸들이 개방된 인산의 존재를 확인하기 위하여, 또는 종결 인산을 통한 상기 고속 글리칸들의 구조를 확인하기 위하여, 소 창자 인산가수분해효소(CIP)는 상기 반응 혼합물에 순차적으로 첨가되었다. 인산 가수분해 중립 N-클리간들이 획득된 이후에 이들은 RNAseB (Man9-5GlcNAc2)로부터 방출된 상기 APTS-표지된 N-글리칸들에서 기인한 상기 일렉트로페로그램(electroferogram)을 통한 상기 비교를 통해 확인될 수 있다.

도 8에서, 상기 DSA-FACE 일렉트로페로그램들은 Man8GlcNAc2 및 HjMan 및 AsMan을 통해 일인산화된 상기 당류 ManP-Man8GlcNAc2 (패널(Panel) B)를 함유하는 N-글리칸 제조의 가수분해를 위해 나타난다. Man8GlcNAc2는 α-마노시다아제들에 의해 Man5GlcNAc2로 가수분해 된 반면, ManP-Man8GlcNAc2의 가수분해를 위하여 차이점이 관찰되었다. HjMan 대부분은 두 개의 α-1,2-연결된 마노스들(패널 C에 있는 ManP-Man6GlcNAc2)로 방출되었다. AsMan 처리 이후에 나타난 상기 약간 빠른 진행 피크는 세 개의 α-1,2-연결된 마노스들의 방출을 제안하고, 따라서 ManP-Man5GlcNAc2(패널 D)가 형성된다. 상기 새로이 형성된 산물들은 소 창자 인산가수분해 효소(CIP)를 통한 처리 이후에 사라지지 않으며, 상기 인산들이 여전히 마노스-개방된 것이 확인된다(패널 E 및 F).

상기 빠른 진행 피크가 패널 E에서 ManP-Man6GlcNAc2이며 패널D에서는 ManP-Man5GlcNAc2인 것을 확인하기 위하여(도 8 참조), HjMan 및 AsMan을 통한 실험이 효소 CcMan5(도 8에 있는 패널 C에서 얻어진 P-Man8GlcNAc2)를 개방하는 상기 인산을 통해 먼저 처리된 MNN4 당분들 상에서 반복되었다. 상기 α-1,2,-마노시다아제들을 통해 37℃에서 10, 40, 및 180분 간 배양한 이후에, 상기 반응은 100℃에서 3분간 가열된 상기 반응 혼합물에 의해 정지되었다. 다음으로 CIP 처리가 수행되었다. HjMan을 통한 상기 결과들은 도 9a에 나타난다. HjMan은 P-Man8GlcNAc2를 P-Man7GlcNAc2 및 P-Man6GlcNAc2로 순차적으로 제거한다(패널 D에서 F). AsMan은 세 개의 α-1,2-연결된 마노스들을 순차적으로 제거할 수 있고, P-Man7GlcNAc2, P-Man6GlcNAc2 및 P-Man5GlcNAc2의 형성을 유발한다(도 9b 참조).

하룻밤 동안 MNN4 글리칸들의 α-1,2-마노시다아제 소화(도 8 참조)와 함께 상기 전술한 결과들(도 9a 및 9b 참조)은 오직 상기 α-1,6 줄기(상기 N-글리칸들의 오른쪽 줄기(도 6a 및 6b에서 도식적으로 나타난))가 인산화 될 경우에만 설명될 수 있다. 상기 근본적 마노스가 인산화될 경우에 상기 A.사토이 α-1,2-마노시다아제만이 상기 종결 α-1,2-마노스를 가수분해 할 수 있다. HjMan은 오직 상기 비인산화된 α-1,3 줄기에서 기인한 상기 두 개의 α-1,2-연결된 마노스들을 제거한다.

상기 근본적인 마노스가 인산화 될 경우에 AsMan은 종결 α-1,2-마노스를 제거할 수 있고, HjMan은 그렇지 않다는 사실은 또한 일일산화된 ManP-Man8GlcNAc2 및 이인산화된 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 구성하는 MNN4 제조(도 10의 패널 C 참조)가 사용될 때 확인된다. AsMan은 패널 D에서 두 배 빠른 진행 피크들의 출현으로부터 관측된 것으로서 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 가수분해할 수 있다(대부분 (ManP)2-Man7GlcNAc2 및 (ManP)2-Man6GlcNAc2). HjMan은 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 가수분해하지 않았다(도 10의 패널 E 참조).

실시예 6

야로위아 리포리티카 균주에서 발현된 고단위의 인산화된 N-글리칸들에 의한 당단백질들의 GH47 α-마노시다아제들을 통한 디마노실레이션

상기 인간 리소좀 α-클루코시다아제(glucosidase)는 Y.리포리티카 균주 OXYY1589에서 발현되어 고단위의 인산화된 N-글리칸 구조들을 통해 당단백질을 얻었다. 상기 huGAA는 실험예 3에 기재된 바와 같이 정화되었다.

HjMan 및 AsMan은 pH 5.0의 CaCl₂ 2mM을 통해 100mM 암모늄아세테이트에 있는 huGAA 용액에 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 배양되었다. Laroy W. et al., 자연적 프로토콜들, 1: 397-405 (2006)에 기재된 바와 같이 상기 N-글리칸들은 기본적으로 PNGaseF로 방출되었고, APTS로 표지되었으며, DSA-FACE 상에서 순차적으로 분석되었다. α-1,2-마노시다아제 처리 전 및 후에 상기 N-글리칸 프로파일은 도 11에 나타난다. 정화된 huGAA로부터 방출된 상기 N-글리칸 혼합물은 주로 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc2로 구성되었다(도 11의 패널들 B 및 E 참조). ManP-Man8GlcNAc2 보다 약간 빠른 피크 진행은 ManP-Man7GlcNAc2에 할당되었다. Man8GlcNAc2 및 Man7GlcNAc2의 최소량만이 나타났다. HjMan을 통한 huGAA의 배양 이후에, ManP-Man8GlcNAc2의 ManP-Man7GlcNAc2 및 ManP-Man6GlcNAc2로의 HjMan 전환이 관측된 반면, (ManP)2-Man8GlcNAc2는 가수분해 되지 않았다(도 11의 패널 C 참조). 패널 D에 있는 상기 일렉트로페로그램은 AsMan을 통한 huGAA의 처리 이후에 얻어지는 상기 당들을 나타낸다. AsMan은 (ManP)2-Man7GlcNAc2 및 (ManP)2-Man6GlcNAc2 의 형성을 통해 상기 일렉트로페로그램의 좌측 및 ManP-Man7GlcNAc2와 ManP-Man6GlcNAc2의 옆에서 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 가수분해 한다. ManP-Man5GlcNAc2는 또한 ManP-Man8GlcNAc2의 가수분해로부터 형성되었다. 이러한 데이터는 α-1,6 줄기가 상기 ManP-Man8GlcNAc2 구조에서 인산화 되며 또한 상기 근본적인 마노스가 인산화 될 경우에 상기 당단백질 수준 상에서 AsMan이 상기 종결 α-1,2-마노스를 가수분해 할 수 있다는 것을 확인한다. 상기 HjMan 활성은 상기 중립 Man8GlcNAc2 N-글리칸들로부터의 α-1,2-연결된 마노스들의 방출 또는 ManP-Man8GlcNAc2에 있는 상기 비인산화된 α-1,3 줄기 상에서 상기 두 개의 α-1,2-연결된 마노스들의 제거에 제한된다.

실험예 7

APTS-표지된 인산화 된 N-글리칸들의 GH92 α-마노시다아제들을 통한 디마노실레이션

CcMan4 및 CcMan5는 E.coli에서 발현되었고 다른 세포 부분들은 실시예 4에 기재된 것과 같이 고립되었다. 상기 주변 세포질 용액의 활성은 균주를 과발현시키는 MNN4로부터 유도된 (APTS)-표지된 N-글리칸들 상에서 검사되었으며 DSA-FACE 상에서 분석되었다(도 12 참조). 상기 N-글리칸들은 CcMan4, CcMan5 또는 pH 7.0의 HEPES 버퍼 10mM에 있는 효소들의 CaCl₂ 2mM을 통한 혼합물을 통해 실온에서 하룻밤 동안 배양되었다. AsMan을 통한 제어 실험이 포함되었으며, 실험예 5에 기재된 것과 같이 수행되었다. 도 12a에 나타난 상기 실험에 있어서, MNN4 부분은 주로 Man8GlcNAc2 (M8) 및 일인산화된 ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8)를 함유하는 데 사용되곤 하였다(패널 B). CcMan4는 Man8GlcNAc2 및 ManP-Man8GlcNAc2를 각각 Man5GlcNAc2 및 ManP-Man5GlcNAc2로 가수분해하였다(패널 C). 상기 동일한 반응 산물들은 AsMan을 통해 얻어졌다(패널 D 및 실험예 5 참조). CcMan5는 두 개의 α-1,2 마노스들 사이 상기 배당 결합을 가수분해 하지 않았으나(그러므로 상기 Man8GlcNAc2 피크의 이동이 없음), ManP-Man8GlcNAc2에서 상기 인산을 개방하고 상기 빠른 진행 피크 P-Man8GlcNAc2를 얻었다(패널 E 참조). CIP를 통한 이러한 반응 혼합물의 배양 이후에 Man8GlcNAc2에 상응하는 피크들만이 관찰되었다(패널 F). CcMan4 및 CcMan5의 혼합물은 Man8GlcNAc2 및 ManP-Man8GlcNAc2를 각각 Man5GlcNAc2 및 P-Man5GlcNAc2로의 가수분해 하였다. 그러므로 Man5GlcNAc2에 상응하는 피크들만이 CIP 처리 이후에 관찰되었다(패널 H). 또한 CcMan4는 상기 이인산화 된 (ManP)2-Man8GlcNAc2를 (ManP)2-Man6GlcNAc2로 가수분해 하였으며, 또한 AsMan을 통해 관측되었다(패널 K 및 실험예 5 참조). CcMan4 및 CcMan5의 혼합물은 P2-Man6GlcNAc2 및 P-Man5GlcNAc2를 생산하였다(패널 N).

그러므로 만약 상기 근본적인 마노스가 인산화 될 경우, CcMan4는 상기 종결 α-1,2마노스를 가수분해 할 수도 있는 α-1,2-마노시다아제이다. 이는 효소 CcMan5를 개방하는 상기 인산을 통합 조합에 사용될 수 있다.

실험예 8

야로위아 리포리티카 균주에서 발현된 고단위의 인산화된 N-글리칸들에 의한 당단백질들의 GH92 α-마노시다아제들을 통한 디마노실레이션

CcMan4 및 CcMan5는 Y.리포리티카에서 발현된 huGAA를 통해 배양되었다. 상기 분석은 실험예 6에 기재된 바와 같이 수행되었다. CaCl₂ 2mM을 통한 pH 7.0의 HEPES 버퍼 100mM는 실온에서 하룻밤 동안 시료에 있는 CcMan4 및 CcMan5에 사용되었다. 상기 DSA-FACE 분석은 도 13dptj 나타난다. 정화된 huGAA로부터 방출된 상기 N-글리칸 혼합물은 주로 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc2로 구성되었다(패널 B). ManP-Man8GlcNAc2 보다 약간 빠른 피크 진행은 ManP-Man7GlcNAc2에 할당되었다.

CcMan4는 상기 huGAA 당단백질을 이인산화시킨다. 상기 일렉트로페로그램(패널 C)에서 (ManP)2-Man6GlcNAc2, ManP-Man5GlcNAc2 및 ManP-Man6GlcNAc2에 상응하는 피크들이 관찰되었다. CcMan5를 통한 조합에 있어서 산물들 P2-Man6GlcNAc2, P-Man5GlcNAc2 및 P-Man6GlcNAc2를 개방하는 상기 인산은 패널 E에 나타난 것과 같이 형성되었다.

실험예 9

야로위아 리포리티카 균주에서 발현된 고단위의 인산화된 N-글리칸들로 인한 당단백질들의 GH47 α-마노시다아제들을 통한 디마노실레이션의 추가적인 실험예들

ERManI 및 GolgiManIA는 GH47 계열에 속하는 두개의 분류 I α-1,2-마노시다아제들이다. 유전자 재조합 형태로 발현된 ERManI 및 GolgiManIA는 Y.리포리티카에서 발현된 huGAA를 통해 실온에서 하룻밤 동안 배양되었다. 상기 분석은 실험예 6 및 도 10에 기재된 것과 같이 수행되었다. CaCl₂ 2mM을 통한 pH 7.0의 HEPES 버퍼 100mM는 ERManI를 위해 사용된 반면, GolgiManIA를 통한 상기 배양은 CaCl₂ 2mM을 통한 pH 6.0의 MES 버퍼 100mM에서 수행되었다. 상기 DSA-FACE 분석은 도 14에 나타난다.

ERManI 및 GolgiManIA는 모두 상기 huGAA 당단백질을 이인산화 할 수 있지만, 이들의 활성은 ManP-Man8GlcNAc2에서 ManP-Man6GlcNAc2로의 가수분해에 제한되었다(각각 패널들 D 및 E 참조). 이러한 결과는 또한 H. Jecorina(HjMan, 도 11, 패널 C 참조)에서 기인한 상기 GH 47 α-1,2-마노시다아제를 통해 획득된 반면, A.사토이(AsMan, 도 11, 패널 F 참조)에서 기인한 GH 47 α-1,2-마노시다아제 및 상기 GH92 CcMan4(도 12, 패널 C 참조)는 (ManP)2-Man8GlcNAc2 및 ManP-Man8GlcNAc2를 각각 (ManP)2-Man6GlcNAc2 및 ManP-Man5GlcNAc2로 조절하였다.

다른 실시예들

본 발명을 그 상세한 설명과 함께 기술하였지만, 위의 설명은 예시적으로 의도된 것이고, 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니며, 첨부된 특허 청구 범위의 범주에 의해 한정된다. 다른 측면들, 이점들 및 변형들도 하기 특허 청구 범위의 범주에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> Oxyrane UK Limited VIB vzw Universiteit Gent <120> De-Mannosylation of Phosphorylated N-Glycans <130> 18990-0031WO1 <140> PCT/IB2011/002780 <141> 2011-09-29 <150> US 61/387,924 <151> 2010-09-29 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yarrowia codon optimized sequence encoding alpha glucosidase <400> 1 atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc ccagcaggga 60 gcctctcgac ccggaccccg agatgcccag gctcaccccg gacgacctcg agctgtgccc 120 acccagtgtg acgtgccccc caactctcga ttcgactgtg cccccgacaa ggccatcacc 180 caggagcagt gcgaggcccg aggctgttgt tacatccccg ctaagcaggg cctgcagggc 240 gctcagatgg gccagccctg gtgtttcttc cccccctctt acccctccta caagctggag 300 aacctgtcct cttcggagat gggctacacc gccaccctga cccgaaccac ccccaccttt 360 ttccccaagg acatcctgac cctgcgactg gacgtgatga tggagaccga gaaccgactg 420 cacttcacca tcaaggaccc cgccaaccga cgatacgagg tgcccctgga gaccccccac 480 gtgcactctc gagccccttc ccccctgtac tctgtggagt tctctgagga gcccttcggc 540 gtgatcgtgc gacgacagct ggacggccga gtgctgctga acaccaccgt ggcccccctg 600 ttcttcgccg accagttcct gcagctgtct acctctctgc cctctcagta catcaccggc 660 ctggccgagc acctgtcccc cctgatgctg tccacctctt ggactcgaat caccctgtgg 720 aaccgagacc tggcccccac ccccggtgcc aacctgtacg gctctcaccc cttctacctg 780 gccctggagg acggcggctc tgcccacggc gtgtttctgc tgaactctaa cgccatggac 840 gtggtgctgc agccctctcc cgccctgtct tggcgatcta ccggcggcat cctggacgtg 900 tacatcttcc tgggccctga gcccaagtct gtggtccagc agtacctgga cgtggtcgga 960 taccccttca tgccccccta ctggggcctg ggcttccacc tgtgtcgatg gggctactct 1020 tctaccgcca tcacccgaca ggtggtggag aacatgaccc gagcccactt ccccctggac 1080 gtgcaatgga acgacctgga ctacatggac tctcgacgag acttcacctt caacaaggac 1140 ggcttccgag acttccccgc catggtccag gagctgcacc agggaggacg acgatacatg 1200 atgatcgtgg accccgccat ctcttcttcc ggacccgccg gatcttaccg accctacgac 1260 gagggcctgc gacgaggcgt gttcatcacc aacgagaccg gccagcccct gatcggcaag 1320 gtgtggcccg gctctaccgc cttccccgac ttcaccaacc ccaccgccct ggcttggtgg 1380 gaggacatgg tggccgagtt ccacgaccag gtgcccttcg acggcatgtg gatcgacatg 1440 aacgagccct ctaacttcat ccgaggctct gaggacggct gtcccaacaa cgagctggag 1500 aaccccccct acgtgcccgg cgtggtgggc ggaaccctgc aggccgccac catctgtgcc 1560 tcttcgcacc agtttctgtc tacccactac aacctgcaca acctgtacgg actgaccgag 1620 gccattgcct ctcaccgagc cctggtgaag gcccgaggca cccgaccctt cgtgatctct 1680 cgatctacct tcgccggcca cggccgatac gccggacact ggaccggcga tgtgtggtcc 1740 tcttgggagc agctggcctc ttctgtgccc gagatcctgc agttcaacct gctgggcgtg 1800 cccctggtgg gcgccgacgt gtgtggcttc ctgggcaaca cctctgagga gctgtgtgtt 1860 cgatggaccc agctcggcgc cttctaccct ttcatgcgaa accacaactc cctgctgtct 1920 ctgccccagg agccctactc gttctctgag cccgctcagc aggccatgcg aaaggctctg 1980 accctgcgat acgccctgct gccccacctg tacaccctgt tccaccaggc ccacgtggct 2040 ggagagaccg tggcccgacc cctgttcctg gagttcccta aggactcttc tacctggacc 2100 gtggaccatc agctgctgtg gggcgaggcc ctcctgatca cccccgtgct gcaggccggc 2160 aaggctgagg tgaccggcta cttccctctg ggcacctggt acgacctgca gaccgtgcct 2220 gtggaggccc tgggatctct gccccctcct cccgccgctc cccgagagcc cgccatccac 2280 tctgagggcc agtgggtgac cctgcccgct cccctggaca ccatcaacgt gcacctgcga 2340 gccggctaca tcatccctct gcagggaccc ggcctgacca ccaccgagtc tcgacagcag 2400 cccatggccc tggccgtggc tctgaccaag ggcggagagg cccgaggcga gctgttctgg 2460 gacgatggcg agtctctgga ggtgctggag cgaggcgcct acacccaggt gatctttctg 2520 gcccgaaaca acaccatcgt gaacgagctg gtgcgagtga cctctgaggg cgctggtctg 2580 cagctccaga aggtgaccgt cctgggcgtg gccaccgctc cccagcaggt cctgtctaac 2640 ggcgtgcccg tgtctaactt cacctactct cccgacacca aggtgctgga catctgtgtg 2700 tctctgctga tgggcgagca gttcctggtg tcttggtgtt aac 2743 <210> 2 <211> 913 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion of Yarrowia LIP2 signal sequence to human alpha glucosidase <400> 2 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His 20 25 30 Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn 35 40 45 Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys 50 55 60 Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly 65 70 75 80 Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser 85 90 95 Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr 100 105 110 Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu 115 120 125 Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile 130 135 140 Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His 145 150 155 160 Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu 180 185 190 Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln 195 200 205 Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His 210 215 220 Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp 225 230 235 240 Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His 245 250 255 Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe 260 265 270 Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala 275 280 285 Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu 290 295 300 Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly 305 310 315 320 Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg 325 330 335 Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met 340 345 350 Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr 355 360 365 Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp 370 375 380 Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met 385 390 395 400 Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr 405 410 415 Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu 420 425 430 Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe 435 440 445 Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val 450 455 460 Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met 465 470 475 480 Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn 485 490 495 Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr 500 505 510 Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr 515 520 525 His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser 530 535 540 His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser 545 550 555 560 Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly 565 570 575 Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile 580 585 590 Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys 595 600 605 Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln 610 615 620 Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser 625 630 635 640 Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met 645 650 655 Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr 660 665 670 Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu 675 680 685 Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln 690 695 700 Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly 705 710 715 720 Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu 725 730 735 Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala 740 745 750 Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu 755 760 765 Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile 770 775 780 Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln 785 790 795 800 Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly 805 810 815 Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly 820 825 830 Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn 835 840 845 Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys 850 855 860 Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn 865 870 875 880 Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu 885 890 895 Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp 900 905 910 Cys <210> 3 <211> 5060 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding fusion of DsbA signal sequence to Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 5 <400> 3 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggccggc 60 catcaccatc atcaccacgt ggggcccggc tcggacgaag tggatgcacc ggaacctccg 120 agcgcagatt atgcaagcct ggttgatgtt tttgttggca ccgaaggtga ttttggtaat 180 gatatgcctg cagcacaggc accgaatggt ctggcaaaag ttaatccgcg taccacaccg 240 ggtcgtaata ataccggtta tgattatgcc cagagcaaaa ttagcggttt tacccatacc 300 aatctggatg gtgttggtgg tagcggtggt ggtggtgatc tgctggttgt tccgaccagc 360 ggtagctata ccgcacgtcc gggtacaggc acctatgcac atccgtttag ccatgatgat 420 gaagatgcag gtccgggttt ttatagcgtt ggtctgggta atgttgcagg caccgatggt 480 gcaattaccg gtgctccggg tacaattgaa gcagaagttg cagcagcaac ccgtagcggt 540 gttcatcgtt atgcatttcc ggcaggtagc 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gtcagtatag cgcagatgaa 1440 ctgcgtcgtg gttatgttgc aggtaatccg ggtgcaagcg ttcagcgtgg ttatgatcag 1500 tatggtctga gcgttattgc cgatgaactg ggtctgaccg aagaagcaga aaccctgcgc 1560 gaacaggcaa gctggccgat tgaaaaactg accaaaccgg gtgcatggac cgcagcagat 1620 ggtacacagg ttggtctgct gacaccgcgt gcagccgatg gtagctggca gagcgcagat 1680 catgccaaat ttgaagcagc aggtctgtat cagggcaccc tgtggcagta tcattggtat 1740 gatgcctatg atatggatgc actggttgaa gcaatgggtg gtcatgaagc agcccgtctg 1800 ggtatgcgtc atatgtttgg tgaacatgca ccggatgatg gtaaagcaat gctgcatagc 1860 aatgccaatg aaattgatct gcaggcaccg tacctgttta attataccgg tgaaccgagc 1920 ctgacccaga aatgggcacg tgcaatttat accaaagaaa cctggaatcg ctatattgca 1980 accggtagca gctctgcagt tccgtcaggt ggtggtgaat ttacacctcc gctgaaaacc 2040 aaagtttatc gtctggaccc tcgtggtatg ctgccgacca tggataatga tgcaggtaca 2100 atgagcacca tgtttgttgc agcagccgtt ggtctgtttc cggttaccgc aggtagcagc 2160 cagtttcagg ttggtagccc gttttttgat agcaccacca ttacctatga tgatggtagc 2220 gcatttaccg ttaccgcaga tggtgttagc gaagatgcct 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ggttcagtat cgcgatatga 3120 cctttgaaac cgcagccggt gatacacctc cgcgttttct gaccgttcgt tatgatacca 3180 gctttgcacc gaccgatacc ccgagcaccg ttcgtgttca tgccggtgat gtttctggtc 3240 cggttgttgc aaccgttgat ctgaaaggca ccagcggttg gggtaaatat accgaagtta 3300 ccgcagaact gggtgatgtt caggccctgg ttgatgccca ggttgttacc tttgaactgc 3360 tggcaccgag cggtcgtagc tgggttggta attttgattg gtttcgcttt agcgcagaag 3420 atccggcagc accgggtcag cctggtgaaa gcccgaccgt taccattgaa gccgaagatt 3480 ggaccgcaag cagcggtcgt ggtctgaaaa aagaaagcag cacctggacc agcggtccgg 3540 tgaccaatgt tggtggtaca gcagatggtg attggattgc ctatggtgaa gttgatctgg 3600 gtgaactgcc gctgggcgaa ctgagcgttc attatgtgca taatagcaat cgcagcggta 3660 ataatagcgc actgagcgtt tatctggatg catttgatcc ggctaatccg ggtgaaccgt 3720 ttgttaccgt tccgctgccg accaccggta gcagttggac cgcagatggc acagccaccg 3780 ttgttctgcc ggaaaccgtg cagggcaccc atgaagtttt tgttcgtctg agcaccgaac 3840 cgtatgcaga tcatccgtat gttgcaaatc tggatagcct gacctttgca ccgggtggtc 3900 cgaccagcgt tgtggttgaa agcgaagcct ggaccagcaa ttctggtcgt ggcctgaaaa 3960 atgaatcttc tacctggacc tctggtccgg ttacaaatgt gggtggcacc gctgatggcg 4020 attggctggc atatggcgaa attgatctgg gcagcgcagc actggatcag ctgtctgtgc 4080 attatgttca taattctaat cgctctggtc gtaattctgc actgtctgtg tatctggatg 4140 cctttgatcc ggcaaatccg ggtgaaccgt ttgtgacagt gccgctggca aataccggta 4200 gctcttggac caccgatggt actgcagttg tggatctgcc gtctaccgtt cgtggtaaac 4260 atcaggtttg ggttcgtctg tctaccgaag catatgccga tcatccgtat gtggccaatc 4320 tggattctat gcgctttttt accgatgcat atgatgttga agttcctccg accgatacag 4380 cagcactggc agccgttgtt gatgcagcag gtacaccgga agcagaaatt gcacgttatg 4440 gtcgtattga tgcccgtgtt tttacccgtg aactggcagc agcacgtagc gttctggccg 4500 atgccggtgc aacacaggca caggcagatg aacgtgctcg tcgtctgggt ctggcaaccg 4560 atcagctggt tccggcagaa cgtcgtcgtc tggaaaatct ggttgccagc gcagaagcac 4620 tgaccgacga aggttattct ccggaaagct ggcaggcatt tcgtaccgca ctggctgctg 4680 caaccggcac cctggatgat gcagcagcat ctgatgaagc actgcatgat gcacgtctgg 4740 cgctgcaggg tgcagttgat gcactggaag aaccggcaga tgttgttctg gttgaagttg 4800 aagtttctcc gcgttgtctg gcaggtaaac cgtatgttgc cgttcgtgca gttaatgttt 4860 ctgatgcagc cgttgatgtt gaactggcaa gctctctggg cacccgtagc tttgttggtg 4920 tggcaccggg tgcgagcgca tatcagagct ttgcagcccg tagcgcaacc ggtgatctgg 4980 atgttaccgt gaccgcaacc ggtgcagatg gtactcagac cgttgaacag gttgtgaccg 5040 ttccgagctg tagctaataa 5060 <210> 4 <211> 5388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding fusion of DsbA signal sequence to Cellulosimicrobium cellulans mannosidase 4 <400> 4 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggccggc 60 catcaccatc atcaccacgt ggggcccggc tcggacgaag tggatgcaga accgggtgat 120 tttagcagca gctttgaatc tggcgatccg gcagcactgc cgaccaccgt tgcagaacgt 180 gatggtgcac cgtggcaggc aaatgttggt agctttaccg caggtctgcc tggtagcgtt 240 ctgggtcagc tgaaaggtgt taccgcaagc gcacagaatc tgccgaatga aggtgcagca 300 aatctggcag atggtagcag cggcaccaaa tggctggcat ttgcaagcac cggttgggtt 360 cgttatgaat ttgcagaacc ggttagcttt gttgcatata ccatgaccag cggtgatgat 420 gccgcaggtc gtgatccgaa aacctggacc gttgaaggta gcaatgatgg ttctacctgg 480 gcagcactgg atcgtcgtac cgatgaagat tttccgaatc gtcagcagac ccgtaccttt 540 gaactggaag caccgaccgc agcatatacc tatctgcgtc tgaatgttac cgcaaatagc 600 ggtgatagca ttgttcagct ggcaggttgg gatctgagcg cagatctgtc tgcaggtccg 660 agcgcagcac cgatgaccac caaagttggc accggtccgc gtgttagctt taccaataaa 720 gccggtgttg gttttagcgg tctgcatagc ctgcgttatg atggtagcca tctggccgat 780 ggtgaaacct atgcaaccaa tgtgctgtat gatgatgttg atgttgtggt tggtgaagat 840 acccgtctga gctataccat ttttccggaa ctgctggatg atctgcagta tccgagcacc 900 tatgcagcag ttgatgttct gtttaccgat ggcacctatc tgagcgatct gggtgcacgt 960 gatgcacatg aaaccgttgc aaccgcacag gcacagggtg aaggtaaaat tctgtatgcc 1020 gatcagtgga atagcgttcg tgttgatctg ggtgatgttg cagaaggtaa aaccgttgat 1080 caggttctgc tgggttatga taatccgggt ggtcatgcag gcaccaaatt tgcaggttgg 1140 ctggatgatg ttgaaattac cgcagaaccg gcaaccattg atggtagctc actggcaaat 1200 tatgttgata cccgtcgtgg caccctggca agcggtagct ttagccgtgg taataatatt 1260 ccggcaaccg caaccccgaa tggttttaat ttttggaccc cgtataccaa tgcaagcagc 1320 cagagctggc tgtatgaata tcataaagcc aataatgcga ataataaacc ggttctgcag 1380 ggttttggta ttagccatga accgagcccg tggatgggtg atcgtaatca gctgaccttt 1440 ctgccgagca ccgcaagcgg tacaccggat gcaaccctga gcacccgtgg tctggaattt 1500 gatcatgcag atgaaaccgc acgtccggat tattatggtg tgacctttac caatggtagc 1560 gcaattgaag caaccccgac cgatcatggt gcagttctgc gttttagcta tccgggtgca 1620 aaaggtcatg ttctggtgga taaagttgat ggtagcagta aactgaccta tgatcaggca 1680 accggcacca ttagcggttg ggttgaaaat ggtagcggtc tgagcgttgg tcgtacccgt 1740 atgtttgttg caggcacctt tgatcgtagc ccgaccgcag ttggcacagc agcaggtaat 1800 cgtgcagatg cacgttttgc aacctttgaa accagcagcg ataaaaccgt ggaactgcgt 1860 gttgcaacca gctttattag cctggatcag gcacgtaaaa atctggatct ggaagttacc 1920 ggtaaaacct ttaccgaagt taaagcagca gcagcacagg catggaatga tcgtctgggt 1980 gttattgaag ttgaaggtgc aagcgaagat cagctggtta ccctgtatag caatctgtat 2040 cgcctgaatc tgtatccgaa tagccagttt gaaaataccg gcaccgcaca ggaaccggtt 2100 tatcgttacg catctccggt tagcgcaacc accggtagcg caaccgatac ccagaccaat 2160 gccaaaattg tggatggcaa aatttatgtg aataatggct tttgggatac ctatcgtacc 2220 gcatggcctg catatagcct gctgtatccg gaactggcag cagaactggt tgatggtttt 2280 gttcagcagt atcgtgatgg tggttggatt gcacgttgga gcagtccggg ttatgcagat 2340 ctgatgaccg gtacaagctc tgatgttgca tttgcagatg cctatctgaa aggtagcctg 2400 ccgaccggta cagcactgga agcatatgat gcagcactgc gtaatgcaac cgttgcacct 2460 ccgagcaatg cagttggtcg taaaggtctg cagacaagcc cgtttctggg ttttacaccg 2520 gaaagcaccc atgaaagcgt tagctggggt ctggaaggtc tggttaatga ttttggcatt 2580 ggcaatatgg ctgcagcact ggcagaagat ccggcaacac cggaagaacg tcgtgaaacc 2640 ctgcgtgaag aaagcgcata ttttctggaa cgtgccaccc attatgttga actgtttgat 2700 ccggaagtgg atttttttgt tccgcgtcat gaagatggta catgggcagt tgatccggaa 2760 acctatgatc cggaagcatg gggtggtggt tataccgaaa ccaatggctg gaattttgca 2820 tttcatgcac cgcaggatgg tcagggtctg gcaaatctgt atggtggtaa acagggtctg 2880 gaagataaac tggatgaatt ttttagcaca ccggaaaaag gtgcaggtaa tggtggtatt 2940 catgaacagc gtgaagcacg tgatgttcgt atgggtcagt ggggtatgag caatcaggtt 3000 agccatcata ttccgtggct gtatgatgca gccggtgctc cgagcaaagc acaggaaaaa 3060 gttcgcgaag ttacccgtcg tctgtttgtt ggtagcgaaa ttggtcaggg ttatccgggt 3120 gatgaagata atggtgaaat gtcctcctgg tggatttttg caagcctggg tttttatccg 3180 ctgcaggttg gtagcgatca gtatgcagtt ggttctccgc tgtttgataa agcaaccgtt 3240 catctgccgg atggtgatct ggttgttaat gccgaaaata atagcgtgga taatgtgtat 3300 gttcagagcc tggcagttga tggtgaagca cgtaccagca ccagcctgag ccaggcagat 3360 ctgagcggtg gcaccaccct ggattttgtt atgggtccgg aaccgagcga ttggggcacc 3420 ggtgaagatg atgcacctcc gtcactgacc gaaggtgatg aacctccgac accggttcag 3480 gatgcaacca ccgcaggcct gggcaccacc accgttgccg atggtgatgc caccacctct 3540 gcagcagccc tgaccgataa taccagcggc acccgtacca cctttgcaac caccaccccg 3600 agcattacat gggcaggtaa tggcattcgt ccgaccgttg gtagctatac cctgacctct 3660 ggtgcaagcg gcaccgcaag cccgtctgca tggaccctgg aaggttctga tgatggcgaa 3720 acctggacca cactggatga acgtagcggt gaacagtttc gttgggcact gcagacccgt 3780 ccgtttaccg ttgccgaacc gaccgcattt gcacgttatc gtgttaccgt taccgcaacc 3840 agcggttctg gtgcactgag cctggcagaa gttgaactgc tggcagatcc gaaagaaagc 3900 ggtgcagaag aactgaccct gtctgcagca ccggatcgtg atggcgttac cggtcgtgaa 3960 gttagcggtt cttttgcaac cctgaccggt gttgaaggtg atgttgccgc actggatgtt 4020 caggttgcat ttggtgatgg tagcgaaccg gttgcaggta cactgcgtgc cggtgcattt 4080 ggtggttatg cagttgatgc agcacatacc tggaccgcac cgggtgttta tccggttacc 4140 gtgaccgtta gcggtgaagg tattgaaacc gttagcgcaa gcagctatgt tagcgttagc 4200 ctgctgcgtg aaggttctct gctggcagca tatgataatg tgtgcattgg tgatgcaggt 4260 acaaccgttg gttcttgtga tggtcagggc gttttttttg atcgtgcaca gctggcagca 4320 aaaggttttg tgcagggtga acgtgcaacc gttccgggta cagatctggc atttgatgtt 4380 ccggcagttc cggctggtca gcctgataat gcaaccggtg atggtcagac cattgaactg 4440 gatgttccgg ctgatgcaga acagctgagc gttattggca ccggcaccga aaaaaatcag 4500 caggcaaccg gtacactgac ctttgatgat ggttctaccc agccgattga tctgagcttt 4560 ggtgattgga gcggtgcagc acgtaatccg gtgtttggta atattccggt tgcagttacc 4620 gatagccgtc tgcgtggtgg ttctccgcag accggtacac cggcagcatt ttttgccacc 4680 gcaccgatta ccctgccgga aggtaaacgt ccggttagcc tgaccctgcc ggatcagcct 4740 ggtgaactga gccgtgatgg tcgtattcat gttgttgcag ttgcacatga tggcaccttt 4800 gcagaacatc ctgcactgga agtgaccgca gcagaaggtg ttaccctggc agttggtcag 4860 acctcagatg ttgcactggc acaggttgcc ggtggtcgtg aaggtgcaga tctgcgtgcc 4920 gcagttacct ggggtgatgg ttctgatgtg gcagccggtg ccgttaccga tggtagcgtt 4980 agcggtagcc atgcatatac cgcagcaggc acctataccg catatgttgt tgtggatgat 5040 ggttggacca gccaggttgt tgaagttccg gtgaccgtta cagaagccga accggcactg 5100 gccgttgatg tcaccgttag cacccgttgc ctggcaggta aagcatatgt tgcagtgcgt 5160 gcagaaaatg gtgaagatgt tccgctggca attcgtctgg ttaccccgtt tggcaccaaa 5220 gaagttgcag cagttgctcc gggagccaat gcatatcaga gctttgcaac ccgtgttacc 5280 gcagttgaag caggcaccgt taccgttgaa gccacccgtg gcaccggtga tgaagaagtt 5340 accgccagca ttcaggcaga ttatgcagcc gttacctgcg gttaataa 5388 <210> 5 <211> 513 <212> PRT <213> Aspergillus saitoi <400> 5 Met His Leu Pro Ser Leu Ser Leu Ser Leu Thr Ala Leu Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser Ala Ala Tyr Pro His Phe Gly Ser Ser Gln Pro Val Leu 20 25 30 His Ser Ser Ser Asp Thr Thr Gln Ser Arg Ala Asp Ala Ile Lys Ala 35 40 45 Ala Phe Ser His Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Gln Tyr Ala Phe Pro His 50 55 60 Asp Glu Leu His Pro Val Ser Asn Gly Tyr Gly Asp Ser Arg Asn Gly 65 70 75 80 Trp Gly Ala Ser Ala Val Asp Ala Leu Ser Thr Ala Val Ile Met Arg 85 90 95 Asn Ala Thr Ile Val Asn Gln Ile Leu Asp His Val Gly Lys Ile Asp 100 105 110 Tyr Ser Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Phe Glu Thr Thr Ile Arg 115 120 125 Tyr Leu Gly Gly Met Leu Ser Gly Tyr Asp Leu Leu Lys Gly Pro Val 130 135 140 Ser Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Lys Ile Asp Val Leu Leu Thr Gln 145 150 155 160 Ser Lys Asn Leu Ala Asp Val Leu Lys Phe Ala Phe Asp Thr Pro Ser 165 170 175 Gly Val Pro Tyr Asn Asn Leu Asn Ile Thr Ser Gly Gly Asn Asp Gly 180 185 190 Ala Lys Thr Asn Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu Ala Leu Glu Trp 195 200 205 Thr Arg Leu Ser Asp Leu Thr Gly Asp Thr Thr Tyr Ala Asp Leu Ser 210 215 220 Gln Lys Ala Glu Ser Tyr Leu Leu Asn Pro Gln Pro Lys Ser Ala Glu 225 230 235 240 Pro Phe Pro Gly Leu Val Gly Ser Asn Ile Asn Ile Ser Asn Gly Gln 245 250 255 Phe Thr Asp Ala Gln Val Ser Trp Asn Gly Gly Asp Asp Ser Tyr Tyr 260 265 270 Glu Tyr Leu Ile Lys Met Tyr Val Tyr Asp Pro Lys Arg Phe Gly Leu 275 280 285 Tyr Lys Asp Arg Trp Val Ala Ala Ala Gln Ser Thr Met Gln His Leu 290 295 300 Ala Ser His Pro Ser Ser Arg Pro Asp Leu Thr Phe Leu Ala Ser Tyr 305 310 315 320 Asn Asn Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ser Gln His Leu Thr Cys Phe Asp 325 330 335 Gly Gly Ser Phe Leu Leu Gly Gly Thr Val Leu Asn Arg Thr Asp Phe 340 345 350 Ile Asn Phe Gly Leu Asp Leu Val Ser Gly Cys His Asp Thr Tyr Asn 355 360 365 Ser Thr Leu Thr Gly Ile Gly Pro Glu Ser Phe Ser Trp Asp Thr Ser 370 375 380 Asp Ile Pro Ser Ser Gln Gln Ser Leu Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Ile Thr Ser Gly Ala Tyr Ile Leu Arg Pro Glu Val Ile Glu Ser Phe 405 410 415 Tyr Tyr Ala Trp Arg Val Thr Gly Gln Glu Thr Tyr Arg Asp Trp Ile 420 425 430 Trp Ser Ala Phe Ser Ala Val Asn Asp Tyr Cys Arg Thr Ser Ser Gly 435 440 445 Phe Ser Gly Leu Thr Asp Val Asn Ala Ala Asn Gly Gly Ser Arg Tyr 450 455 460 Asp Asn Gln Glu Ser Phe Leu Phe Ala Glu Val Met Lys Tyr Ser Tyr 465 470 475 480 Met Ala Phe Ala Glu Asp Ala Ala Trp Gln Val Gln Pro Gly Ser Gly 485 490 495 Asn Gln Phe Val Phe Asn Thr Glu Ala His Pro Val Arg Val Ser Ser 500 505 510 Thr

Claims (57)

1. 당단백질(glycoprotein) 상의 인산화된 N-글리칸(glycan)들을 탈만노실화하는 방법에 있어서,
   하지의 만노스가 인산화되는 말단 알파-1,2 만노스(mannose) 결합 또는 일부를 포함하는 당단백질을, 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합 또는 일부를 가수 분해하는 만노시다제(mannosidase) 또는 상기 만노시다제의 생물학적으로 활성인 조각에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉은 탈만노실화된 당단백질을 생성하도록 상기 말단 알파-1,2 만노스 결합의 가수 분해를 야기하고, 상기 만노시다제는 글리코시드 하이드로레이즈(Glycoside Hydrolase: GH))47 족(family)이거나 글리코시드 하이드로레이즈(GH)92 족인 것을 특징으로 하는 방법.
2. 탈만노실화되고 인산화된 N-글리칸들을 포함하는 당단백질을 생산하는 방법에 있어서,
   진균 세포(fungal cell) 내로 상기 당단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하고, 상기 당단백질은 하지의 만노스가 인산화되는 말단 알파-1,2 만노스 결합을 포함하며, 상기 진균 세포는, 탈만노실화된 당단백질을 생성하도록 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합을 가수 분해하는 만노시다제 또는 상기 만노시다제의 생물학적으로 활성인 조각을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 유전 공학에 의해 생성되고, 상기 만노시다제는 GH47 족이거나 GH92 족인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 만노시다제는 아스페르길루스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 85% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 95% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 98% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 의해 인코딩된 아미노산 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 방법은 상기 탈만노실화된 당단백질을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 접촉은 진균 유기체 내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 진균 유기체는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 진균 유기체는 메틸영양체 효모(methylotrophic yeast)이거나, 상기 진균 유기체는 사상균(filamentous fungus)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 메틸영양체 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 사상균은 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페로길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페로길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페로길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 아스페로길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor), 뉴로스포라(Neurospora), 트리크데르마(Trichoderma), 푸사리움(Fusarium) 그리고 크리소스포리움(Chrysosporium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 당단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장 인자, 시토키닌(cytokine), 케모키닌(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 조각, 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 리소소말 축적 질환(lysosomal storage disorder: LSD)과 연관되는 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 리소소말 축적 질환(LSD)은 파브리 병(Fabry's disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 화버 병(Farber disease), 고셰 병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드 축적증(gangliosidosis), 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease), 샌드호프 병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질환(activator disease), 크라베 병(Krabbe disease), 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크 병(Niemann-Pick disease), 샤이에 병(Scheie disease), 헌터 병(Hunter disease), 산필립포 병(Sanfilippo disease), 모르키오 병(Morquio disease), 마로토-라미 병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로디나제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파틸그루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드 축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 시알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피 병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(cholesterol ester storage disease), 울만 병(Wolman disease), 다종 술파타제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴 축적증(cystinosis), 시알산 축적 질환(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(Marinesco-Sjgren syndrome)을 갖는 킬로미크론 함유 질환(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논 병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 2 항에 있어서, 상기 만노시다제는 아스페르길루스 사토이(Aspergillus satoi) 또는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 85% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 95% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 대해 적어도 98% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 의해 인코딩된 아미노산 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 방법은 상기 탈만노실화된 당단백질을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 당단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 진균 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 진균 세포는 메틸영양체 효모이거나, 상기 진균 세포는 사상균인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 메틸영양체 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 23 항에 있어서, 상기 사상균은 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페로길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페로길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페로길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 아스페로길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor), 뉴로스포라(Neurospora), 트리크데르마(Trichoderma), 푸사리움(Fusarium) 그리고 크리소스포리움(Chrysosporium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 2 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 당단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장 인자, 시토키닌, 케모키닌, 항체 또는 이의 항원-결합 조각, 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 리소좀 효소는 리소소말 축적 질환(LSD)과 연관되는 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 리소소말 축적 질환(LSD)은 파브리 병(Fabry's disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 화버 병(Farber disease), 고셰 병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드 축적증(gangliosidosis), 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease), 샌드호프 병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질환(activator disease), 크라베 병(Krabbe disease), 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크 병(Niemann-Pick disease), 샤이에 병(Scheie disease), 헌터 병(Hunter disease), 산필립포 병(Sanfilippo disease), 모르키오 병(Morquio disease), 마로토-라미 병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로디나제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파틸그루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드 축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 시알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피 병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(cholesterol ester storage disease), 울만 병(Wolman disease), 다종 술파타제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴 축적증(cystinosis), 시알산 축적 질환(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(Marinesco-Sjgren syndrome)을 갖는 킬로미크론 함유 질환(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논 병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 하지의 만노스가 인산화될 때에 말단 알파-1,2 만노스 결합을 가수 분해하는 만노시다제 또는 상기 만노시다제의 생물학적으로 활성인 조각을 발현시키기 위한 유전 공학에 의해 생성되며, 상기 만노시다제는 GH47 족이거나 GH92 족인 것을 특징으로 하는 분리된 진균 세포.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 만노시다제는 아스페르킬루스 사토이(Aspergillus satoi)에 기인하거나, 상기 만노시다제는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)에 기인하는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
32. 제 30 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5와 적어도 85% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：5를 포함하는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
33. 제 30 항에 있어서, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4와 적어도 85% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4와 적어도 95% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4와 적어도 98% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하거나, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO：4에 의해 인코딩되는 아미노산 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
34. 제 30 항에 있어서, 상기 진균 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르슐라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)의 세포인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
35. 제 30 항에 있어서, 상기 진균 세포는 메틸영양체 효모의 세포이거나, 상기 진균 세포는 사상균의 세포인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 메틸영양체 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 오오가테에아 미누타(Oogataea minuta) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
37. 제 35 항에 있어서, 상기 사상균은 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페로길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페로길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페로길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 아스페로길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor), 뉴로스포라(Neurospora), 트리크데르마(Trichoderma), 푸사리움(Fusarium) 그리고 크리소스포리움(Chrysosporium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
38. 제 30 항에 있어서, 상기 세포는 만노실 인산화(mannosyl phosphorylation)를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 더 포함하거나, 상기 세포는 외측 사슬 신장(Outer CHain elongation: OCH)1 활성이 결핍된 유전 공학에 의해 생성되거나, 상기 세포는 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 더 포함하며, 상기 세포는 OCH1 활성이 결핍되게 유전 공학에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
39. 제 30 항에 있어서, 상기 세포는 표적 당단백질을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진균 세포.
40. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 당단백질은 인간 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
41. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 당단백질은 병원체 단백질, 리소좀 단백질, 성장 인자, 시토키닌, 케모키닌, 항체 또는 이의 항원-결합 조각, 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
42. 제 41 항에 있어서, 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
43. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 당단백질은 리소소말 축적 질환(LSD)과 연관되는 단백질인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
44. 제 43 항에 있어서, 상기 리소소말 축적 질환(LSD)은 파브리 병(Fabry's disease), 점액성 다당류증(mucopolysaccharidosis) I, 화버 병(Farber disease), 고셰 병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드 축적증(gangliosidosis), 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease), 샌드호프 병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질환(activator disease), 크라베 병(Krabbe disease), 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크 병(Niemann-Pick disease), 샤이에 병(Scheie disease), 헌터 병(Hunter disease), 산필립포 병(Sanfilippo disease), 모르키오 병(Morquio disease), 마로토-라미 병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로디나제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파틸그루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 푸코시드 축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 시알리도시스 1형(sialidosis type 1), 폼피 병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질환(cholesterol ester storage disease), 울만 병(Wolman disease), 다종 술파타제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴 축적증(cystinosis), 시알산 축적 질환(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(Marinesco-Sjgren syndrome)을 갖는 킬로미크론 함유 질환(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논 병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
45. 제 38 항에 있어서, 상기 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드는 만노실트랜스페라제(mannosyltransferase: MNN)4 폴리펩티드이거나, 상기 만노실 인산화를 증진시킬 수 있는 폴리펩티드는 P. 파스토리스(pastoris) N-연결 올리고당들의 포스포만노실화(Phosphomannosylation of N-linked Oligosaccharides: PNO)1 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
46. 제 45 항에 있어서, 상기 만노실트랜스페라제(MNN)4 폴리펩티드는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 사크카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 오오가티에아 미누타(Oogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 진균 세포.
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