MX2012004381A

MX2012004381A - Metodo para producir proteinas en pichia pastoris que carecen de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos contra antigenos de la celula hospedera.

Info

Publication number: MX2012004381A
Application number: MX2012004381A
Authority: MX
Inventors: Natarajan Sethuraman; Terrance A Stadheim; Stefan Wildt; Piotr Bobrowicz; Sujatha Gomathinayagam; Stephen Hamilton; Huijuan Li
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2012-06-01
Also published as: KR20120084734A; CA2776392A1; US20140200180A1; WO2011046855A1; RU2012120102A; CN104031961A; US9139632B2; BR112012008862A2; US20120232007A1; JP2013507921A; EP2488657B1; ES2589655T3; AU2010307098A1; EP2488657A4; CN102648286A; EP2488657A1

Abstract

Se describen métodos para producir proteínas y glucoproteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera; en particular, se describen métodos en donde cepas de Pichia pastoris recombinantes que no exhiben una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y que no exhiben por lo menos una actividad seleccionada de una actividad de ß-manosiltransferasa 1, 3 y 4, producen proteínas y glucoproteínas recombinantes; estas cepas de Pichia pastoris recombinantes pueden producir proteínas y glucoproteínas que carecen de residuos de ß-manosa resistentes a a-manosidasa detectables en las mismas y, de esta manera, carecen de actividad de entrelazamiento con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera; se describen además métodos para producir eritropoyetina humana bi-sialilada en Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR PROTEÍNAS EN PICHIA PASTORIS QUE CARECEN DE ACTIVIDAD DE ENTRELAZAMIENTO DETECTABLE CON ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DE LA CÉLULA HOSPEDERA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para producir proteínas y glucoproteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En particular, la presente invención se refiere al uso de cepas de Pichia pastoris recombinantes que no exhiben una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhiben por lo menos una actividad seleccionada del grupo que consiste de actividad de ß-manosiltransferasa 1 , 3 y 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano. Estas cepas de Pichia pastoris recombinantes pueden producir proteínas y glucoproteínas que carecen de residuos de ß-manosa resistentes a a-manosidasa detectables en las mismas. La presente invención se refiere además a métodos para producir eritropoyetina humana bi-sialilada en Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos contra antígenos de la célula hospedera.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La capacidad para producir proteínas humas recombinantes ha llevado a avances importantes en el cuidado de la salud humana, y continúa siendo un área activa de descubrimiento de fármacos. Muchas proteínas terapéuticas requieren la adición post-traducción de glucanos a residuos de asparagina específicos (N-glucosilación) de la proteína, para asegurar actividad adecuada de estructura-función y estabilidad subsiguiente en el suero humano. Para uso terapéutico en humanos, las glucoproteínas requieren N-glucosilación tipo humano. Las líneas de células de mamífero (por ejemplo, células CHO, células de la retina humana) que pueden imitar el procesamiento de glucoproteínas tipo humano, tienen varios inconvenientes que incluyen bajos títulos de proteína, largos tiempos de fermentación, productos heterogéneos, y contención viral continua. Es por lo tanto deseable usar un sistema de expresión que no sólo produzca altos títulos de proteína con cortos tiempos de fermentación, sino también pueda producir glucoproteínas tipo humano.

Hongos hospederos tales como la levadura metilotrófica Pichia pastoris tienen distintas ventajas para la expresión de proteínas terapéuticas, por ejemplo, no secretan altas cantidades de proteínas endógenas, están disponibles fuertes promotores inducibles para producir proteínas heterólogas, pueden crecer en medios químicos definidos y sin el uso de suero de animales, y pueden producir altos títulos de proteínas recombinantes (Cregg et al., FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66 (2000)). Sin embargo, las proteínas glucosiladas expresadas en P. pastoris contienen generalmente azúcares mañosa adicionales que resultan en glucanos de "alto contenido de mañosa", así como grupos manosilfosfato los cuales imparten una carga negativa en las glucoproteínas. Las glucoproteínas con glucanos de alto contenido de mañosa o mananos cargados, presentan el riesgo de que inducen una respuesta inmune no deseada en humanos (Takeuchi, Trends in Glycosci. Glycotechnol. 9: S29-S35 (1997); Rosenfeld y Ballou, J. Biol. Chem. 249: 2319-2321 (1974)). Por consiguiente, es deseable producir glucoproteínas terapéuticas en células hospederas de hongos, en donde el patrón de glucosilación en la glucoproteína sea idéntico o similar al que ocurre en glucoproteínas producidas en humanos, y las cuales no tengan ß-manosilación detectable.

Como es evidenciado por la presencia de anticuerpos protectores en individuos no infectados, es probable que los mananos ß-enlazados sean inmunógenos o que afecten adversamente al individuo al que se le administra una proteína o glucoproteína terapéutica que comprenda mananos ß-enlazados. Además, los grupos mañosa expuestos en las proteínas terapéuticas son rápidamente depurados por los receptores de mañosa en los macrófagos, resultando en baja eficacia del fármaco. De esta manera, la presencia de residuos de mañosa ß-enlazados o glucanos N- u O-enlazados de proteínas terapéuticas heterólogas expresadas en un hongo hospedero, por ejemplo P. pastoris, no es deseable dado su potencial inmunógeno y su capacidad para unirse a los factores de depuración.

Se ha reportado que las glucoproteínas producidas en P. pastoris contienen residuos de mañosa ß-enlazados. En 2003, Trimble et al. (Glycobiol. 14: 265-274, publicado en Diciembre 23) reportaron la presencia de residuos de mañosa p-1 ,2-enlazados en la lipasa estimulada por sales biliares humana (hBSSL) recombinante expresada en P. pastoris. Los genes que codifican para varias ß-manosiltransferasas se han identificado en Pichia pastoris y Candida albicans (véase la patente de E.U.A. No. 7,465,577, y Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008)).

A la luz de lo anterior, existe la necesidad de proveer métodos para producir proteínas o glucoproteínas terapéuticas recombinantes en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, que carezcan de epítopes que podrían inducir una reacción adversa en un individuo a quien se le administra la proteína o glucoproteína terapéutica recombinante. Un método para determinar si una proteína o glucoproteína terapéutica recombinante provee un riesgo de que induzca una reacción adversa cuando se administra a un individuo, es poner en contacto la proteína o glucoproteína terapéutica recombinante con un anticuerpo preparado contra antígenos totales de la célula hospedera. Esto es de interés particular para proteínas o glucoproteínas destinadas para administración crónica. La falta de entrelazamiento con el anticuerpo, indica que la proteína o glucoproteína terapéutica recombinante carece de actividad de entrelazamiento detectable con el anticuerpo, y es improbable que induzca una reacción adversa cuando se administra a un individuo. De esta manera, existe la necesidad de métodos para producir una proteína o glucoproteína terapéutica recombinante que carezca de actividad de entrelazamiento detectable con el anticuerpo, y es improbable que induzca una reacción adversa cuando se administra a un individuo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para producir proteínas y glucoproteínas en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, que carecen de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En particular, la presente invención provee métodos que usan levaduras metilotróficas recombinantes tales como cepas de Pichia pastoris, las cuales no exhiben actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano y no exhiben por lo menos una actividad con respecto a un N-glucano u O-glucano seleccionado de ß-manosiltransferasa 1 , ß-manosiltransferasa 3 y ß-manosíltransferasa 4, para producir proteínas y glucoproteínas recombinantes. En un aspecto, la célula hospedera es una cepa de Pichia pastoris en la cual el gen BMT2 que codifica para ß-manosiltransferasa 2 y por lo menos un gen que codifica para una ß-manosiltransferasa seleccionada de ß-manosíltransferasa 1 , 3 y 4 (genes BMT1, BMT3, BMT4, respectivamente), han sido deletados o perturbados o mutados para producir una ß-manosiltransferasa inactiva para producir proteínas y glucoproteínas recombinantes. En otros aspectos, la actividad de una o más de la ß-manosiltransferasa 1 , ß-manosiltransferasa 3 y ß-manosiltransferasa 4 es anulada usando inhibidores de ß-manosiltransferasa que incluyen, pero no están limitados a, compuestos químicos, ADN antisentido para uno o más ARNm que codifican para una ß-manosiltransferasa, o ARNsi para uno o más ARNm que codifican para una ß-manosiltransferasa.

Estas cepas de Pichia pastoris recombinantes pueden producir proteínas y glucoproteínas que carecen de residuos de ß-manosa resistentes a a-manosidasa detectables en las mismas. La presente invención provee además métodos para producir erítropoyetina humana bi-sialilada en Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. Los métodos y células hospederas permiten que se produzcan proteínas y glucoproteínas terapéuticas recombinantes que tienen un riesgo reducido de que induzcan una reacción adversa en un individuo a quien se le administraron las proteínas y glucoproteínas terapéuticas recombinantes, en comparación con las mismas que se producen en cepas no modificadas como se describe en la presente. Los métodos y las células hospederas son también útiles para producir proteínas o glucoproteínas recombinantes que tienen un menor potencial para unirse a factores de depuración.

En un aspecto, la presente invención provee una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N- glucano u O-glucano y no exhibe por lo menos una actividad con respecto a un N-glucano u O-glucano seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, y que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína recombinante. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe además actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

En otro aspecto, la presente invención provee una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que tiene una deleción o perturbación del gen que codifica para actividad de ß-manosiltransferasa 2 y una deleción o perturbación de por lo menos un gen seleccionado de un gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína recombinante. En otras modalidades, la célula hospedera tiene una deleción o perturbación de los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3. En otras modalidades, la célula hospedera tiene una deleción o perturbación del gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante en la cual el gen de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2) y por lo menos un gen seleccionado de ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 (BMT3) han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante. En otras modalidades, los genes de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2), ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 {BMT3) son deletados. En otras modalidades, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación del gen de ß-manosiltransferasa 4 (BMT4).

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una glucoproteína recombinante en una levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera recombinante que no exhibe una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhibe por lo menos una actividad con respecto a un N-glucano u O-glucano seleccionado de ß-manosiltransferasa 1 y ß-manosiltransferasa 3, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la glucoproteína recombinante; y recuperar la glucoproteína recombinante del medio para producir la glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe además actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una glucoproteína recombinante en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera recombinante que tiene una deleción o perturbación del gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 2 y una deleción o perturbación de por lo menos un gen que codifica para una actividad seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la glucoproteína recombinante; y recuperar la glucoproteína recombinante del medio para producir la glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, la célula hospedera tiene una deleción o perturbación de los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3. En otras modalidades, la célula hospedera tiene una deleción o perturbación del gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una glucoproteína recombinante en Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antigenos de la célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante en la cual el gen de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2) y por lo menos un gen seleccionado de ß-manosiltransferasa 1 {BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 (BMT3) han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la glucoproteína recombinante; y recuperar la glucoproteína recombinante del medio para producir la glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, los genes de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2), ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 (BMT3), han sido deletados o perturbados. En otras modalidades, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación del gen de ß-manosiltransferasa 4 (BMT4).

En general, la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, se determina en una prueba tal como ELISA en sandwich o un Western blot. El método es particularmente útil para producir proteínas o glucoproteínas terapéuticas. Ejemplos de proteínas o glucoproteínas terapéuticas incluyen, pero no están limitados a, eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; e inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1 -antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; y agonista del receptor de IL-2.

En modalidades particulares de la célula hospedera o el método, los codones de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante, son optimizados para expresión en Pichia pastoris.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera no exhibe además actividad de a1 ,6-manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína, e incluye un dominio catalítico de a1 ,2-manosidasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de a1 ,2-manosidasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de GlcNAc transferasa I fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de GlcNAc transferasa I hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de manosidasa II fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de manosidasa II hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de GlcNAc transferasa II fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de GlcNAc transferasa II hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de galactosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de galactosiltransferasa hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de sialiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de sialiltransferasa hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de fucosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de fucosiltransferasa hacia el ER o aparato de Golgi de la célula hospedera.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera incluye además una o más GIcNAc transferasas seleccionadas del grupo que consiste de GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI y GnTIX.

En otra modalidad de la célula hospedera o el método, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen predominantemente un N-glucano seleccionado de MansGlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2> GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2> GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(i. 4)Man3GlcNAc2, Gal(1-4)GlcNAC(i-4)Man3GlcNAc2 y NANA(1-4)Gal(i.4)GlcNAC(i. 4)Man3GlcNAc2, en donde el subíndice indica el número de los residuos de azúcar particulares en la estructura de N-glucano. Ejemplos de estructuras de N-glucano incluyen, pero no están limitados a, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc4Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2 y NANA4Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2.

Provistas además son composiciones, que comprenden una o más glucoproteínas recombinantes obtenidas mediante el método anterior, usando cualquiera de las células hospederas anteriores.

En otro aspecto, la presente invención provee una levadura metllotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2 y por lo menos una actividad seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteina de fusión está en el ER. En modalidades particulares, la célula hospedera no exhibe además actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee una levadura metllotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que tiene una deleción o perturbación de los genes que codifican para actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER. En modalidades particulares, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación del gen que codifica para actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante que tiene una deleción o perturbación del gen de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2) y por lo menos un gen seleccionado de un gen de ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 {BMT3), y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteina de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER. En modalidades particulares, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación del gen que codifica para actividad de ß-manosiltransferasa 4 (BMT4).

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una eritropoyetina humana madura en una levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris, que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende: proveer una célula hospedera recombinante que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhibe por lo menos una actividad con respecto a un N-glucano u O-glucano seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, y es genéticamente diseñada para producir N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese y procese la primera y segunda proteínas de fusión; y recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe además actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una eritropoyetina humana madura en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende: proveer una célula hospedera recombinante genéticamente diseñada para producir N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y en la cual el gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 2 y por lo menos un gen que codifica para una actividad seleccionada de una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3 ha sido deletado o perturbado y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese y procese la primera y segunda proteínas de fusión; y recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, el hospedero comprende una deleción o perturbación de los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3, y los cuales han sido deletados o perturbados. En otras modalidades, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación de un gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 4.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una eritropoyetina humana madura en Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende; proveer una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante genéticamente diseñada para producir N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y en la cual el gen de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2) y por lo menos un gen seleccionado de un gen de ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y ß-manosiltransferasa 3 (BMT3) han sido deletados o perturbados, y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese y procese la primera y segunda proteínas de fusión; y recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, el hospedero comprende una deleción o perturbación del gen de ß-manosiltransferasa 2 (BMT2), gen de ß-manosiltransferasa 1 (BMT1) y gen de ß-manosiltransferasa 3 (BMT3) que han sido deletados o perturbados. En otras modalidades, la célula hospedera incluye además una deleción o perturbación de un gen de ß-manosiltransferasa 4 (BMT4).

En modalidades particulares de la célula hospedera o el método, el péptido de señal fusionado con el extremo N-terminal de la eritropoyetina es un péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo.

En otras modalidades de la célula hospedera o el método, por lo menos una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión en donde la eritropoyetina es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae, y por lo menos una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión en donde la eritropoyetina es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo.

En otras modalidades de la célula hospedera o el método, los codones de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica para la eritropoyetina, son optimizados para expresión en Pichia pastoris.

En otras modalidades del método, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de intercambio catiónico.

En otras modalidades del método, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antigenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de hidroxiapatita.

En otras modalidades del método, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de intercambio aniónico.

En otras modalidades del método, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antigenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de intercambio catiónico seguido de un paso de cromatografía de hidroxiapatita, el cual va seguido opcionalmente por un paso de cromatografía de intercambio aniónico.

La presente invención provee además una composición que comprende una eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera obtenidos del método anterior usando las células hospederas anteriores y una sal farmacéuticamente aceptable. En modalidades particulares, aproximadamente 50 a 60% de los N-glucanos comprenden residuos de ácido siálico en ambas antenas; en otras modalidades, más de 70% de los N-glucanos comprenden residuos de ácido siálico en ambas antenas; en otras modalidades, más de 80% de los N-glucanos comprenden residuos de ácido siálico en ambas antenas. En otros aspectos, menos de 30% de los N-glucanos son N-glucanos neutros (es decir, no están sialilados en por lo menos un extremo en el extremo no reductor del N-glucano). En otros aspectos, menos de 20% de los N-glucanos son N-glucanos neutros. En aspectos particulares, aproximadamente 99% de los N-glucanos contienen uno o más residuos de ácido siálico, y menos de 1% de los N-glucanos son N-glucanos neutros. En otros aspectos, se proveen composiciones en donde existen 4.5 moles o más de ácido siálico por mol de rhEPO. En otros aspectos, se proveen composiciones en donde existen por lo menos 5.0 moles de ácido siálico por mol de rhEPO.

En otras modalidades de la composición, la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera es conjugada con un polímero hidrofílico, el cual en aspectos particulares es un polímero de polietilenglicol. En modalidades particulares, el polímero de polietilenglicol es conjugado con el extremo N-terminal de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Definiciones Como se usa en la presente, los términos "N-glucano" y "glucoforma" se usan recíprocamente, y se refieren a un oligosacárido N-enlazado, por ejemplo, uno que es unido por un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a un residuo de asparagina de un polipéptido. Las glucoproteínas N-enlazadas contienen un residuo de N-acetilglucosamina enlazado con el nitrógeno de amida de un residuo de asparagina en la proteína. Los azúcares predominantes encontrados en las glucoproteínas son glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GIcNAc) y ácido siálico (por ejemplo, ácido N-acetil-neuramínico (NANA)). El procesamiento de los grupos azúcar ocurre por medio de co-traducción en el lumen del ER, y continúa post-traducción en el aparato de Golgi para las glucoproteínas N-enlazadas.

Los N-glucanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a mañosa; "Glc" se refiere a glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GIcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). Los N-glucanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GIcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura central de Man3GlcNAc2 ("Man3"), la cual es referida también como el "núcleo de trimanosa", el "núcleo de pentasacárido" o el "núcleo de paucimanosa". Los N-glucanos se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, de alto contenido de mañosa, complejos o híbridos). Un N-glucano del tipo de "alto contenido de mañosa" tiene cinco o más residuos de mañosa. Un N-glucano de tipo "complejo" tiene típicamente por lo menos una GIcNAc unida con el brazo de 1 ,3-manosa y por lo menos una GIcNAc unida con el brazo de 1 ,6-manosa de un núcleo de "trimanosa". Los N-glucanos complejos pueden tener también residuos de galactosa ("Gal") o N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que son opcionalmente modificados con ácido siálico o derivados (por ejemplo, "NANA" o "NeuAc", en donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico, y "Ac" se refiere a acetilo). Los N-glucanos complejos pueden tener también sustituciones ¡ntracadena que comprenden "bisectar" la GIcNAc, y fucosa central ("Fue"). Los N-glucanos complejos pueden tener también antenas múltiples en el "núcleo de trimanosa", referidos con frecuencia como "glucanos antenarios múltiples". Un N-glucano "híbrido" tiene por lo menos una GIcNAc en la terminal del brazo de 1 ,3-manosa del núcleo de trimanosa, y cero o más mañosas en el brazo de 1 ,6-manosa del núcleo de trimanosa. Los varios N-glucanos son referidos también como "glucoformas".

Las abreviaturas usadas en la presente son de uso común en la técnica; véase, por ejemplo, las abreviaturas de azúcares anteriores. Otras abreviaturas comunes incluyen "PNGasa" o "glucanasa" o "glucosidasa", las cuales se refieren todas al péptido N-glucosidasa F (EC 3.2.2.18).

Se pretende que el término "célula hospedera recombinante" ("célula hospedera de expresión", "sistema hospedero de expresión", "sistema de expresión" o simplemente "célula hospedera"), como se usa en la presente, se refiera a una célula en la cual un vector recombinante ha sido introducido. Debe entenderse que se pretende que dichos términos se refieran no sólo a la célula sujeto particular, sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser de hecho idéntica a la célula progenitora, pero se incluye aún dentro del alcance del término "célula hospedera" como se usa en la presente. Una célula hospedera recombinante puede ser una célula aislada o línea de células mantenida en cultivo, o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo. Células hospederas preferidas son levaduras y hongos.

Una célula hospedera que "no exhibe" una actividad enzimática, se refiere a una célula hospedera en la cual la actividad enzimática ha sido anulada o perturbada. Por ejemplo, la actividad enzimática puede ser anulada o perturbada deletando o perturbando el gen que codifica para la actividad enzimática (incluida la deleción o perturbación de las secuencias reguladoras hacia el extremo 3' o hacia el extremo 5' que controlan la expresión del gen; la actividad enzimática puede ser anulada o perturbada mutando el gen que codifica para la actividad enzimática, para hacer que el gen que codifica para la actividad enzimática sea no funcional; la actividad enzimática puede ser anulada o perturbada por el uso de un inhibidor químico, de péptidos o de proteínas de la actividad enzimática; la actividad enzimática puede ser anulada o perturbada por el uso de inhibidores de la expresión basados en ácidos nucleicos tales como ADN antisentido y ARNsi; y la actividad enzimática puede ser anulada o perturbada por el uso de inhibidores de la transcripción o inhibidores de la expresión o actividad de factores reguladores que controlan o regulan la expresión del gen que codifica para la actividad enzimática.

Cuando se hace referencia al "por ciento en moles" de un glucano presente en una preparación de una glucoproteína, el término significa el por ciento molar de un glucano particular presente en el grupo de oligosacáridos N-enlazados liberados cuando la preparación de proteína se trata con PNG'asa, y entonces se cuantifica mediante un método que no es afectado por la composición de la glucoforma (por ejemplo, marcación de un grupo de glucanos liberados de PNG'asa con un marcador fluorescente tal como 2-aminobenzamida, y entonces separación por cromatografía de líquidos de alto rendimiento o electroforesis capilar, y entonces cuantificación de los glucanos por la intensidad de la fluorescencia). Por ejemplo, 50 por ciento en moles de NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 significa que 50 por ciento de los glucanos liberados son NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2l y el 50% restante comprenden otros oligosacáridos N-enlazados. En otras modalidades, el por ciento en moles de un glucano particular en una preparación de glucoproteína estará entre 20% y 100%, de preferencia arriba de 25%, 30%, 35%, 40% o 45%, más preferiblemente arriba de 50%, 55%, 60%, 65% o 70%, y muy preferiblemente arriba de 75%, 80% 85%, 90% o 95%.

Como se usa en la presente, se entenderá que el término "predominantemente" o variaciones tales como "la predominante" o "la cual es predominante", significa la especie de glucano que tiene el más alto por ciento (%) en moles del total de N-glucanos después de que la glucoproteína ha sido tratada con PNG'asa y glucanos liberados analizados por espectroscopia de masa, por ejemplo, MS MALDI-TOF. En otras palabras, la frase "predominantemente" se define como una entidad individual, de modo que una glucoforma específica está presente en mayor por ciento en moles que cualquier otra entidad individual. Por ejemplo, si una composición consiste de la especie A en 40 por ciento en moles, la especie B en 35 por ciento en moles y la especie C en 25 por ciento en moles, la composición comprende predominantemente la especie A.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de la eritropoyetina recombinante de la invención que da un incremento en hematócrito que provee beneficio a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro, y dependerá de muchos factores que incluyen la condición física general del paciente y la causa subyacente de anemia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de eritropoyetina de la presente invención para un paciente que sufre de falla renal crónica, puede estar en la escala de 20 a 300 unidades/kg o 0.5 pg/kg a 500 pg/kg con base en la indicación terapéutica. El término "unidad" se refiere a unidades comúnmente conocidas en la técnica para evaluar la actividad de composiciones de eritropoyetina. Un miligramo de eritropoyetina pura es aproximadamente equivalente a 150,000 unidades. Un plan de dosificación puede ser de aproximadamente tres meses por semana a aproximadamente una vez cada cuatro o seis semanas. El plan real dependerá de muchos factores que incluyen el tipo de eritropoyetina administrada a un paciente (EPO o EPO PEGilada), y la respuesta del paciente individual. Las escalas de dosis mayores no se usan típicamente en aplicaciones en anemia, pero pueden ser útiles en otras aplicaciones terapéuticas. Los medios para lograr y establecer una dosis adecuada de eritropoyetina para un paciente, son bien conocidos y practicados comúnmente en la técnica.

Las variaciones en la cantidad dada y el plan de dosificación de paciente a paciente se incluyen haciendo referencia al término "aproximadamente" en conjunto con una cantidad o plan. La cantidad de eritropoyetina usada para terapia, da un por ciento aceptable de incremento del hematócrito y mantiene el hematócrito a un nivel benéfico (por ejemplo, usualmente por o menos aproximadamente 30% y típicamente en una escala de 30% a 36%). Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede ser indagada fácilmente por los expertos en la técnica usando materiales y procedimientos públicamente disponibles. Además, puede darse hierro al paciente para mantener una eritropoyesis incrementada durante la terapia. La cantidad que se dará puede determinarse fácilmente mediante métodos usados comúnmente por los expertos en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 I muestran la genealogía de la cepa YGLY3159 de P. pastoris (figura 1 E) y las cepas YGLY71 13 a YGLY7122 (figura 11), comenzando de la cepa NRRL-Y1 1430 de tipo silvestre (figura 1A).

La figura 2 muestra un mapa del plásmido pGLY6. El plásmido pGLY6 es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa o la unidad de transcripción (ScSUC2) de S cerevisiae, flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-3').

La figura 3 muestra un mapa del plásmido pGLY40. El plásmido pGLY40 es un vector de integración que elige como objetivo el locus OCH1 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), que a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen OCH1 (PpOCH1-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen OCH1 (PpOCHI-3').

La figura 4 muestra un mapa del plásmido pGLY43a. El plásmido pGLY43a es un vector de integración que elige como objetivo el locus BMT2, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen del transportador de UDP-/V-acetilglucosamina (UDP-GIcNAc) o la unidad de transcripción (KIGIcNAc Transp.) de K. lactis adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). Los genes adyacentes son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen BMT2 (PpPBS2-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen BMT2 (PpPBS2-3').

La figura 5 muestra un mapa del plásmido pGLY48. El plásmido pGLY48 es un vector de integración que elige como objetivo el locus MNN4L1, y contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo de ratón del transportador de UDP-GIcNAc (MmGIcNAc Transp.) en el marco de lectura abierto (ORF) enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (promotor de PpGAPDH), y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae (ScCYC TT) adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), y en la cual los cassettes de expresión son flanqueados en conjunto en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen MNN4L1 de P. pastoris (?????4?_1-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4L1 (?????4?_1-3').

La figura 6 muestra un mapa del plásmido pGLY45. El plásmido pGLY45 es un vector de integración que elige como objetivo los loci PN01/MNN4 que contienen una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de LacZ), que a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen PN01 (????01-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4 (?????4-3').

La figura 7 muestra un mapa del plásmido pGLY247. El plásmido pGLY247 es un vector de integración que elige como objetivo el locus MET16, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) que a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen MET16 (?????16-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MET16 (??????6-3').

La figura 8 muestra un mapa del plásmido pGLY248. El plásmido pGLY248 es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen MET16 o la unidad de transcripción (????? T) de P. pastoris, flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 (PpURA5-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 (PpURA5-3').

La figura 9 muestra un mapa del plásmido pGLY582. El plásmido pGLY582 es un vector de integración que elige como objetivo el locus HIS1, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1 ) la UDP-glucosa epimerasa de S. cerevisiae (ScGALIO), (2) el dominio catalítico de galactosiltransferasa 1 (hGaIT) de humano fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía KRE2-S de S. cerevisiae (33), (3) el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), y (4) el transportador de UDP-galactosa de D. melanogaster (DmUGT), todos flanqueados por la región 5' del gen HIS1 (PpHIS1-5') y la región 3' del gen HIS1 (PpHIS1-3'). PMA1 es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación PMA1 de P. pastoris; GAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris, y ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastorís, y PpALG12 TT es la secuencia de terminación ALG12 de P. pastorís.

La figura 10 muestra un mapa del plásmido pGLY167b. El plásmido pGLY167b es un vector de integración que elige como objetivo el locus ARG1, y contiene tres cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) el dominio catalítico de manosidasa II de D. melanogaster (optimizado en codones) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guia MNN2 de S. cerevisiae (CO-KD53), (2) el gen HIS1 o la unidad de transcripción de P. pastorís, y (3) el dominio catalítico de N-acetilglucosamina (GIcNAc) transferasa II de rata (optimizado en codones) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía MNN2 de S. cerevisiae (CO-TC54), todos flanqueados por la región 5' del gen ARG1 (PpARG1-5') y la región 3' del gen ARG1 (PpARG1-3'). PpPMAl Prom es el promotor PMA 1 de P. pastorís; PpPMAl TT es la secuencia de terminación PMA1 de P. pastorís; PpGAPDH es el promotor GADPH de P pastorís; ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastorís; y PpALG12 TT es la secuencia de terminación ALG12 de P. pastorís.

La figura 1 1 muestra un mapa del plásmido pGLY1430. El plásmido pGLY1430 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus ADE1 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) el dominio catalítico de GIcNAc transferasa I de humano (optimizado en codones) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía SEC12 de P. pastoris (CO-NA10), (2) el homólogo de ratón del transportador de UDP-GIcNAc (MmTr), (3) el dominio catalítico de manosidasa IA de ratón (FB) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía SEC12 de S. cerevisiae (FB8), y (4) el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (lacZ), todos flanqueados por la región 5' del gen ADE1 y el ORF (ADE1 5' y ORF) y la región 3' del gen ADE1 (PpADE1-3'). PpPMAl Prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación PMA1 de P. pastoris; SEC4 es el promotor SEC4 de P. pastoris; OCH1 TT es la secuencia de terminación OCH1 de P pastoris; ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris; y PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris.

La figura 12 muestra un mapa del plásmido pGFI165. El plásmido pGFI165 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus PR01 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1) el dominio catalítico de a-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal con el péptido de señal ctMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan) que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula, y (2) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), todos flanqueados por la región 5' del gen PR01 y el ORF (5'PR01orf) y la región 3' del gen PR01 (3'PRO). ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae; PpALG3 TT es la secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris, y PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastorís.

La figura 13 muestra un mapa del plásmido pGLY2088. El plásmido pGLY2088 es un vector de integración que elige como objetivo el locus TRP2 o AOX7, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1 ) la eritropoyetina humana madura (co-hEPO) optimizada en codones fusionada en el extremo N-terminal con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (alfa MF-pre) que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula, y (2) la proteína de resistencia a zeocina (ZeocinR). Los cassettes son flanqueados en un extremo con el promotor AOX1 de P. pastoris (PpAOXI Prom), y en el otro extremo con el gen TRP2 o la unidad de transcripción (PpTRP2) de P. pastoris. ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae, y ScTEF Prom es el promotor TEF1 de S. cerevisiae.

La figura 14 muestra un mapa del plásmido pGLY2456. El plásmido pGLY2456 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus TRP2 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene seis cassettes de expresión que codifican para (1) el codón del transportador de CMP-ácido siálico de ratón optimizado (CO mCMP-Sia Transp), (2) el codón de UDP-GIcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina cinasa de humano optimizado (CO hGNE), (3) el gen ARG1 o la unidad de transcripción de Pichia pastoris, (4) el codón de CMP-ácido siálico sintasa de humano optimizado en codones (CO hCMP-NANA S), (5) el codón de N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa de humano optimizado (CO hSIAP S), y (6) el codón del dominio catalítico de a-2,6-sialiltransferasa de ratón optimizado fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía KRE2 de S. cerevisiae (comST6-33), todos flanqueados por la región 5' del gen TRP2 y el ORF (PpTRP2 5') y la región 3' del gen TRP2 (PpTRP2-3'). PpPMAl Prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación PMA1 de P pastoris; CYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae; PpTEF Prom es el promotor TEF1 de P. pastoris: PpTEF TT es la secuencia de terminación TEF1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris; y pGAP es el promotor GAPDH de P. pastoris.

La figura 15 muestra un mapa del plásmido pGLY341 1 (pSH1092). El plásmido pGLY3411 (pSH1092) es un vector de integración que contiene el cassette de expresión que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT4 de P. pastoris (PpPBS4 5'), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT4 de P. pastoris (PpPBS4 3').

La figura 16 muestra un mapa del plásmido pGLY3430 (pSH1 1 15). El plásmido pGLY3430 (pSH11 15) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el gen de resistencia a nourseotricina en el ORF (NAT) enlazado operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii (PTEF) y la secuencia de terminación TEF1 de Ashbya gossypii (TTEF) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleotidos 5' del gen BMT1 de P. pastorís (PBS1 5'), y en el otro lado con la secuencia de nucleotidos 3' del gen BMT1 de P. pastorís (PBS1 3').

La figura 17 muestra un mapa del plásmido pGLY4472 (pSH1186). El plásmido pGLY4472 (pSH1186) contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el gen de higromicina B fosfotransferasa de E. coli en el ORF (Hyg) enlazada operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii (pTEF) y la secuencia de terminación TEF1 de Ashbya gossypii (TRFtt), flanqueado en un lado con la secuencia de nucleotidos 5' del gen BMT3 de P. pastorís (PpPBS3 5'), y en el otro lado con la secuencia de nucleotidos 3' del gen BMT3 de P. pastorís (PpPBS3 3').

La figura 18 muestra un mapa del plásmido pGLY2057. El plásmido pGLY2057 es un plásmido de integración que elige como objetivo el locus ADE2, y contiene un cassette de expresión que codifica para el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastorís, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). El cassette de expresión es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos de la región 5' del gen ADE2 (PpADE2-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos de la región 3' del gen ADE2 (PpADE2-3').

La figura 19 muestra un mapa del plásmido pGLY2680. El plásmido pGLY2680 es un vector de integración que puede elegir como objetivo el locus TRP2 o AOX1, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1 ) la eritropoyetina humana madura optimizada en codones (co-hEPO) fusionada en el extremo N-terminal con el péptido de señal de lisozima de pollo (lisozima ss de pollo), y (2) el gen ADE2 de P. pastoris sin un promotor (PpADE2). Los cassettes son flanqueados en un extremo con el promotor AOX1 de P. pastoris (PpAOXI Prom), y en el otro extremo con el gen TRP2 o la unidad de transcripción (PpTRP2) de P. pastoris. ScCYC TT es la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae.

La figura 20 muestra un mapa del plásmido pGLY2713. El plásmido pGLY2713 es un vector de integración que contiene el ORF de PN01 de P. pastoris (PpPNOI ORF) adyacente al cassette de expresión que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris, flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), y flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen PEP4 de P. pastoris (PpPEP4 5'), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen PEP4 de P. pastoris (PpPEP4 3').

La figura 21 muestra un diagrama esquemático que ilustra el flujo del procedimiento de fermentación.

La figura 22 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY3159 tiene actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie que muestra la posición de la rhEPO, y el panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA de conejo (SL rProA purificado de conejo: 9161 ) a dilución 1 :3,000. Se detectó el anticuerpo anti-HCA unido usando anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1 :5,000 en PBS. La detección del anticuerpo secundario unido usó el substrato 3'3 diaminobencidina (DAB).

La figura 23 muestra que la actividad de entrelazamiento de la rhEPO producida en la cepa YGLV3 59 con los anticuerpos anti-HCA, no se detecta cuando la rhEPO es desglucosilada usando PNGasa F. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie que muestra la posición de las formas glucosilada y desglucosilada de rhEPO, y el panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22.

La figura 24 muestra que un anticuerpo recombinante (rhlgG) producido en P. pastoris de tipo silvestre y una cepa GS2.0 de P. pastoris glucodiseñada en la cual el gen BMT2 ha sido perturbado o deletado, mostró actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, y el panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22. GS 2.0 es una cepa de P. pastoris que produce glucoproteínas que tienen predominantemente N-glucanos Man5GlcNAc2. La cepa GS 2.0 mostrada produjo rhlgG con aproximadamente 5% de N-glucanos Man9GlcNAc2. WT es P. pastoris de tipo silvestre.

La figura 25 compara la actividad de entrelazamiento de la rhEPO producida en la cepa YGLY3159 con otras proteínas glucosiladas que contienen patrones de glucosilación complejos, pero no producidos en P. pastoris para anticuerpos anti-HCA. El panel superior muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie que muestra la posición de las formas glucosilada y desglucosilada de la rhEPO producida en P. pastoris y de la fetuína humana recombinante, asialofetuína (fetuína humana con residuos de ácido siálico terminales removidos), albúmina de suero humano (HSA), y LEUKINE recombinante producida en S. cerevisiae, y el panel inferior muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22. Los grupos S30S son rhEPO purificada mediante cromatografía de intercambio catiónico.

La figura 26 y el cuadro A muestran que la rhEPO producida en la cepa YGLY3159 y purificada mediante cromatografía de hidroxiapatita, tiene aún actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie de los grupos de elución por cromatografía 1 , 2, y 3 que muestra la posición de la rhEPO (reducida o no reducida), y el panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22. Abajo del panel se muestran los resultados de un análisis por CLAR de los N-glucanos en los grupos 1 , 2 y 3.

CUADRO A Análisis de N-glucanos mediante CLAR La figura 27A muestra un cromatograma de la purificación, mediante cromatografía de intercambio aniónico Q SEPHAROSE FF, de la rhEPO producida en la cepa YGLY3159 a partir del grupo 1 de hidroxiapatita.

La figura 27B y el cuadro B muestran una ELISA en sandwich que muestra que el grupo de Q SEPHAROSE FF que contiene a la rhEPO de la cromatografía de intercambio aniónico Q SEPHAROSE FF no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, mientras que el flujo pasante contenía actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El anticuerpo de captura era el anticuerpo anti-hEPO, y la actividad de entrelazamiento se detectó con anticuerpos anti-HCA de conejo a una dilución de partida de 1 :800 en PBS la cual se diluyó entonces en serie 1 :1 en PBS a través de una hilera que termina con la onceava cavidad a una dilución de 1 :819,200 (cavidad 12: control negativo). El anticuerpo anti-HCA unido se detectó usando anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) a una dilución de 1 :10,000 en PBS. La detección del anticuerpo secundario unido usó el substrato fosfato de 4-metilumbeliferilo (4-MUPS).

CUADRO B Diluciones de antisueros en placa * Azúl oscuro La figura 28 muestra que la rhEPO producida en las cepas YGLY6661 (Abmt2, Abmt4 y Abmtl) e YGLY7013 (Abmt2 y Abmt4) y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules), tiene aún actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie de los grupos azules con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. El panel central muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-hEPO conjugados con HRP a una dilución de 1 : 1 ,000 y DAB como el substrato. El panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22.

La figura 29 y el cuadro C muestran en una ELISA en sandwich que detecta la actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA, que la rhEPO producida en las cepas YGLY6661 (Abmt2, Abmt4 y Abmtl) e YGLY7013 (Abmt2 y Abmt4) y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules), tiene aún actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. La prueba de ELISA se realizó como en la figura 27B y el cuadro B.

CUADRO C Diluciones de antisueros en placa O En la figura 29, YGLY 6661 y 7013 mostraron actividad de entrelazamiento asociada con la rhEPO. * Azúl Oscuro La figura 30 y el cuadro D muestran pruebas de ELISA en sandwich usadas para detectar la actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA, de la rhEPO producida en las cepas YGLY6661 (Abmt2, Abmt4 y Abmtl) e YGLY7013 (Abmt2 y Abmt4), capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF, y purificada mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1 de HA). La rhEPO en el grupo 1 de HA de la cepa YGLY6661 no tuvo actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. Las pruebas de ELISA se realizaron como en la figura 27B y el cuadro B.

CUADRO D Diluciones de antisueros en placa t> En la figura 30, YGLY 6661 - el grupo 1 de HA no mostró actividad de entrelazamiento asociada con la rhEPO. * Azúl Oscuro La figura 31 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY6661 (Abmt2, Abmt4 y Abmtl) y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules), tiene aún actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, de los grupos azules con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. El panel central muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-hEPO conjugados con HRP a una dilución de 1 :1 ,000 y DAB como el substrato. El panel derecho muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22.

La figura 32A muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie de los grupos de captura mediante Blue Sepharose 6 FF (grupos azules) preparados de las cepas YGLY7361-7366 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. Las cepas se cultivaron en termentadores SixFors de 500 mL.

La figura 32B muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, de los grupos de captura mediante Blue Sepharose 6 FF (grupos azules) preparados de las cepas YGLY7393-7398 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. Las cepas se cultivaron en termentadores SixFors de 500 mL.

La figura 33 y el cuadro E muestran los resultados de pruebas de ELISA en sandwich usadas para detectar la actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA, de la rhEPO producida en la cepas YGLY7361-7366 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) e YGLY7393-7398 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3), y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules). Sólo la rhEPO en los grupos azules de las cepas YGLY7363 e YGLY7365 tuvo actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. Las pruebas de ELISA se realizaron como en la figura 27B y el cuadro B.

CUADRO E Diluciones de antisueros en placa La figura 34 muestra en forma de diagrama los resultados del análisis por CLAR de los N-glucanos en la rhEPO en los grupos azules preparada a partir de las cepas YGLY7361-7366 e YGLY7393-7398 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3). "Bi" se refiere a los N-glucanos en los cuales ambos brazos del N-glucano biantenario están sialilados. "Mono" se refiere a los N-glucanos en los cuales sólo un brazo del N-glucano biantenario está sialilado. "Neutros" se refiere a los N-glucanos que no están sialilados.

La figura 35A muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, de la cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules) y los grupos de purificación mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1s de HA), preparados a partir de las cepas YGLY7362, YGLY7366, YGLY7396 e YGLY7398 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) e YGLY3159 (Abmt2).

La figura 35B muestra un Western blot de un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% de la cromatografía mediante Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules) y los grupos de purificación mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1s de HA), preparados a partir de las cepas YGLY7362, YGLY7366, YGLY7396 e YGLY7398 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) e YGLY3159 (Abmt2) y sondeados con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22.

La figura 36 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY7398 (Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules) y purificada mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1s de HA), no tuvo actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. El panel izquierdo muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, del grupo azul y el grupo 1 de HA preparado de la cepa YGLY7398 en comparación con la rhEPO preparada de la cepa YGLY3159. El panel central muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22. El panel central muestra un Western blot de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22, salvo que los anticuerpos anti-HCA fueron de otra preparación de anticuerpos (GiF policlonal de conejo:: 6316 a 1 :2,000).

La figura 37 y el cuadro F muestran los resultados de pruebas de ELISA en sandwich usadas para detectar la actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA de la rhEPO producida en las cepas YGLY7113-7122 (Abmt2, Abmt4, Abmtl y AbmtS) y capturada mediante cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules). La cepa YGLY71 18 mostró actividad de entrelazamiento muy poco detectable con anticuerpos anti-HCA. Ninguna de las otras cepas mostró actividad de entrelazamiento detectable alguna con anticuerpos anti-HCA. Las pruebas de ELISA se realizaron como en la figura 27B y el cuadro B.

CUADRO F Diluciones de antisueros en placa * Azúl oscuro La figura 38 muestra en forma de diagrama los resultados del análisis por CLAR de los N-glucanos en la rhEPO en los grupos azules preparados a partir de las cepas YGLY71 13-7122 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3). "Bi" se refiere a los N-glucanos en los cuales ambos brazos del N-glucano biantenario están sialilados. "Mono" se refiere a los N-glucanos en los cuales sólo un brazo del N-glucano biantenario está sialilado. "Neutros" se refiere a los N-glucanos que no están sialilados.

La figura 39A muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie, de la cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules) y grupos de purificación mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1 s de HA) preparados de las cepas YGLY71 15, YGLY71 17, YGLY7394, YGLY7395 e YGLY7120 (todas Abmt2, Abmt4, ABmtl y Abmt3) e YGLY3159 (Abmt2).

La figura 39B muestra un Western blot de un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% de la cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules) y grupos de purificación mediante cromatografía de hidroxiapatita (grupo 1s de HA) preparados de las cepas YGLY7115, YGLY71 17, YGLY7394, YGLY7395 e YGLY7120 (todas Abmt2, Abmt4, Abmtl y Abmt3) e YGLY3159 (Abmt2) y sondeados con anticuerpos anti-HCA como en la figura 22.

La figura 40A y el cuadro G muestran un trazo de CLAR de los N-glucanos de la rhEPO producidos en YGLY3159 {Abmt2) y purificados mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita (es decir, análisis del grupo 1 de HA).

CUADRO G La figura 40B y el cuadro H muestran un trazo de CLAR de los N-glucanos de la rhEPO producidos en YGLY71 17 (Abmt2, Abmt4, ABmtl y Abmt3) y purificados mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita (es decir, análisis del grupo 1 de HA).

CUADRO H DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para producir proteínas y glucoproteínas en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, que carecen de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. Los antígenos de la célula hospedera pueden incluir también proteínas y contaminantes de la pared celular residuales de la célula hospedera que pueden llevar a composiciones de proteínas recombinantes que pueden ser inmunogenas, y las cuales pueden alterar la eficacia terapéutica o seguridad de una proteína terapéutica. Una composición que tiene reactividad cruzada con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, significa que la composición contiene algún material contaminante de la célula hospedera, usualmente N-glucanos con residuos de fosfomanosa o residuos de ß-mañosa, o similares. Las cepas de tipo silvestre de Pichia pastoris producirán glucoproteínas que tienen estas estructuras de N-glucano. Se esperaría que las preparaciones de anticuerpos producidas contra las proteínas totales de la célula hospedera, incluyan anticuerpos contra estas estructuras. Sin embargo, las proteínas que no contienen N-glucanos podrían incluir también material contaminante (proteínas o similares) que reaccionará en forma cruzada con anticuerpos producidos contra la célula hospedera.

Los métodos y las células hospederas permiten que las proteínas y glucoproteínas terapéuticas recombinantes que se producirán, tengan un riesgo reducido de que induzcan una reacción adversa en un individuo a quien se le administran las proteínas y glucoproteínas terapéuticas recombinantes, en comparación con las mismas que se producen en cepas no modificadas como se describe en la presente. Una reacción adversa incluye la inducción de una respuesta inmune no deseada en el individuo, o una unión a, congregación en, o interacción no deseada o inadecuada con, un sitio en el individuo que en general afecta adversamente la salud del individuo. El riesgo de que se induzca una reacción adversa en un individuo a quien se le administra la proteína o glucoproteína terapéutica, es de interés particular para proteínas o glucoproteínas destinadas para ser administradas al individuo crónicamente (por ejemplo, terapias destinadas para ser llevadas a cabo durante un período extendido). Las proteínas o glucoproteínas terapéuticas recombinantes producidas de conformidad con los métodos en la presente, no tienen actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos contra antígenos de la célula hospedera y, de esta manera, presentan un riesgo reducido de que se induzca una reacción adversa en un individuo a quien se le administran las proteínas o glucoproteínas recombinantes. Los métodos y las células hospederas son también útiles para producir proteínas o glucoproteínas recombinantes que tienen un menor potencial para unión a factores de depuración.

Los inventores han encontrado que las glucoproteínas particulares que se producen en algunas cepas de Pichia pastoris, pueden tener N- u O-glucanos en las mismas en las cuales uno o más de los residuos de mañosa en las mismas están en un enlace ß1 ,2. Las glucoproteínas destinadas para usos terapéuticos y las cuales tienen uno o más residuos de mañosa i ,2-enlazados en las mismas, proveen un riesgo de que sean capaces de inducir una respuesta inmune no deseable en el individuo a quien se le administra la glucoproteína. Estos residuos de mañosa ß-enlazados pueden detectarse usando anticuerpos producidos contra los antígenos totales de la célula hospedera. Debido a que no puede predecirse qué glucoproteínas terapéuticas tendrán N- u O-glucanos que comprendan uno o más residuos de mañosa p ,2-enlazados, y si una glucoproteína terapéutica que tiene N- u O-glucanos que comprenden residuos de mañosa ß1 ,2-enlazados en las mismas producirá una respuesta inmunogena no deseada en el individuo que recibe la glucoproteína, es deseable producir glucoproteínas terapéuticas en cepas de Pichia pastoris que hayan sido genéticamente diseñadas para que carezcan de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. Dichas cepas pueden producirse deletando o perturbando las actividades de por lo menos tres de las cuatro ß-manosiltransferasas (Bmtp) conocidas en la familia de genes de ß-manosiltransferasa (BMT) de Pichia pastoris. Como se muestra en la presente, las cepas de Pichia pastoris que incluyen una deleción o perturbación de por lo menos tres de estos genes BMT, proveen una cepa de Pichia pastoris que puede producir proteínas o glucoproteínas que carecen de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. Estas cepas son útiles, produciendo proteínas y glucoproteínas terapéuticas. Se ha demostrado que la presencia de estructuras de ß-manosa en los N- y/u O-glucanos, induce una respuesta inmune.

Se reportó la identificación de genes de ß-manosiltransferasa en Pichia pastoris y Candida albicans en la patente de E.U.A. No. 7,465,577, y en Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008), que describieron que la ß-manosilación fue efectuada por una ß-manosiltransferasa que fue designada como AMR2 o BMT2, y que la perturbación o deleción del gen en Pichia pastoris resultó en un hospedero recombinante que fue capaz de producir glucoproteínas con ß-manosilación reducida. La patente describió también tres homólogos del gen, BMT1, BMT3 y BMT4. Sin embargo, cuando se investigaba la fuente de la actividad de entrelazamiento de algunas preparaciones de glucoproteínas con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, los inventores descubrieron que la actividad de entrelazamiento era una consecuencia de la ß-manosilación residual que persistía en algunas cepas de las células hospederas de P. pastoris recombinantes en las cuales el gen BMT2 ha sido perturbado o deletado. De esta manera, las glucoproteínas heterólogas producidas en estas células hospederas recombinantes tenían N-glucanos que contenían aún residuos de ß-manosa. Estos residuos de ß-manosa eran detectables en pruebas de ELISA y Western blots de las glucoproteínas heterólogas obtenidas de los cultivos de estas células hospederas recombinantes sondeadas con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera (HCA). Los anticuerpos anti-HCA son anticuerpos policlonales producidos contra una cepa de Pichia pastoris de tipo silvestre o una cepa NORF: una célula hospedera recombinante que se construye de la misma manera que la célula hospedera recombinante que produce la glucoproteína heteróloga, salvo que el marco de lectura abierto (ORF) que codifica para la proteína heteróloga ha sido omitido. Para las glucoproteínas terapéuticas producidas en Pichia pastoris, estos residuos de ß-manosa residuales presentan el riesgo de que se induzca una respuesta inmune en algunos individuos que reciben la proteína terapéutica en un tratamiento para una enfermedad o trastorno. La presente invención provee un método para producir glucoproteínas en Pichia pastoris que no contienen alguna ß-manosilación detectable y, como tales, no se entrelazan con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

BMT1, BMT2 y BMT3 demuestran un alto grado de homología de secuencia, mientras que BMT4 es homólogo a un menor grado, y se piensa que es una alfa-manosiltransferasa bloqueadora. Sin embargo, los cuatro miembros de la familia BMT parecen estar implicados en la síntesis de N- y/u O-glucanos que tienen estructuras de mañosa ß-enlazadas. Aunque un MALDI-TOF de los N-glucanos de una proteína de prueba producida en una cepa de Pichia pastoris en la cual el gen BMT2 ha sido deletado podría fallar para detectar la ß-manosilación, las pruebas sensibles basadas en anticuerpos en la presente fueron capaces de detectar ß-manosilación en las cepas Abmt2. De esta manera, los métodos de detección basados en anticuerpos anti-HCA enseñados en la presente, mostraron que la deleción o perturbación de también los genes BMT1 y BMT3 y opcionalmente el gen BMT4 era necesaria para remover todas las estructuras de ß-manosa detectables. La deleción o perturbación de los genes que codifican para las tres ß-manosiltransferasas, puede lograrse mediante (1 ) la expresión bloqueada completa o parcial del gen (incluyendo las secuencias de promotor, marco de lectura abierto (ORF) y/o las secuencias de terminación de la transcripción); (2) la introducción de un cambio de estructura en el ORF; (3) la inactivación o regulación del promotor; (4) la expresión derribada del mensaje por el ARNsi o el ARN antisentido; (5) o el uso de inhibidores químicos. El resultado es la producción de una célula hospedera que es capaz de producir una glucoproteína que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA.

Para ejemplificar los métodos para producir una glucoproteína que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, una cepa de Pichia pastoris, la cual había sido genéticamente diseñada para que careciera de la expresión o actividad de BMT2 y fuese capaz de producir eritropoyetina (EPO) humana madura recombinante con N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, fue además genéticamente diseñada para que careciera de la expresión de los genes BMT1 y/o BMT3 y/o BMT4. La cepa en la cual sólo la expresión del gen BMT2 había sido perturbada, produjo EPO humana madura recombinante que tenía cierta actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. Se encontró que la actividad de entrelazamiento detectable se debe a la presencia de residuos de mañosa ß-enlazados en la molécula de EPO (véase las figuras 22 a 27B, ejemplo 6). Cuando los genes que codifican para BMT1 y BMT4 fueron perturbados o deletados en la cepa, la EPO producida tenía aún actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA (véase las figuras 28 a 31 ). Sin embargo, cuando los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4 fueron perturbados o deletados, la mayoría de las cepas produjeron EPO humana recombinante glucosilada que carecía de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, y de esta manera carecía de residuos de ß-manosa detectables (véase las figuras 33 y 35B, por ejemplo).

De esta manera, la presente invención provee además un método para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que implica construir células hospederas destinadas para ser usadas para producir la proteína recombinante que no exhibe más varias combinaciones de actividades de ß-manosiltransferasa. A manera de ejemplo, se construye una célula hospedera que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano. La célula hospedera que carece de exhibición de actividad de ß-manosíltransferasa 2 detectable, se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA, usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa. Una cepa NORF es una cepa igual a la cepa hospedera, salvo que carece del marco de lectura abierto que codifica para la glucoproteína recombinante. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera, entonces la célula hospedera es útil para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la célula hospedera es manipulada adicionalmente para que no exhiba actividad de ß-manosiltransferasa 1 , ß-manosiltransferasa 3 o ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano. Por ejemplo, la célula hospedera que carece de actividad de ß-manosiltransferasa 2 es manipulada adicionalmente para que carezca de actividad de ß-manosiltransferasa 1. La célula hospedera se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antigenos de la célula hospedera, entonces la célula hospedera es útil para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la célula hospedera es manipulada adicionalmente para que no exhiba actividad de ß-manosiltransferasa 3 o actividad de ß-manosiltransferasa 4. Por ejemplo, la célula hospedera que carece de actividad de ß-manosiltransferasa 2 y actividad de ß-manosiltransferasa 1 , es manipulada adicionalmente para que carezca de actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano. La célula hospedera se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera, entonces la célula hospedera es útil para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la cepa es manipulada adicionalmente para que no exhiba actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano. La célula hospedera se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa para confirmar que la proteína o glucoproteína recombinante carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera.

A manera de otro ejemplo, se construye una célula hospedera de Pichia pastoris en la cual varias combinaciones de genes BMT son deletadas o perturbadas. A manera de ejemplo, se construye una célula hospedera de Pichia pastoris que tiene una perturbación o deleción en BMT2. La célula hospedera Abmt2 se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa. Una cepa NORF es una cepa igual a la cepa hospedera, salvo que carece del marco de lectura abierto que codifica para la glucoproteína recombinante. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera Abmt2 carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera, entonces la deleción o perturbación de BMT2 es suficiente para permitir que la célula hospedera produzca la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la célula hospedera es manipulada adicionalmente para que tenga una deleción de los genes BMT1, BMT3 o BMT4. Por ejemplo, la célula hospedera que tiene una perturbación o deleción del gen BMT2, es manipulada adicionalmente para que tenga una deleción o perturbación del gen BMT1. La célula hospedera Abmt2 Abmtl se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera Abmt2 Abmtl carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera, entonces las deleciones o perturbaciones de BMT1 y BMT2 son suficientes para permitir que la célula hospedera produzca la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la célula hospedera es manipulada adicionalmente para que tenga una deleción de los genes BMT3 o BMT4. Por ejemplo, la célula hospedera que tiene una perturbación o deleción de los genes BMT1 y BMT2 es manipulada adicionalmente para que tenga una perturbación o deleción del gen BMT3. La célula hospedera Abmt2 Abmtl Abmt3 se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la célula hospedera. Si la proteína o glucoproteína recombinante producida por la célula hospedera Abmt2 Abmtl Abmt3 carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera, entonces las deleciones o perturbaciones de BMT1, BMT2 y BMT3 son suficientes para permitir que la célula hospedera produzca la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento con los anticuerpos contra antígenos de la célula hospedera.

Sin embargo, si se detecta actividad de entrelazamiento detectable, entonces la célula hospedera es manipulada adicionalmente para que tenga una deleción del gen BMT4. La célula hospedera Abmt2 Abmtl Abmt3 Abmt4 se usa para producir la proteína o glucoproteína recombinante, la cual se evalúa entonces mediante Western blot o ELISA usando un anticuerpo que se ha producido contra una versión NORF de la cepa, para confirmar que la proteína o glucoproteína recombinante carece de unión detectable con el anticuerpo producido contra antígenos de la célula hospedera.

La presente invención provee además una célula hospedera de levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris, en la cual la célula hospedera no exhibe una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhibe por lo menos una de una actividad de ß-manosiltransferasa 1 o una actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante. En otras modalidades, la célula hospedera no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3, con respecto a un N-glucano u O-glucano. En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera recombinante que no exhibe una actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 , actividad de ß-manosiltransferasa 3 y actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante.

La presente invención provee además un método general para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que no exhibe una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhibe por lo menos una actividad seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, la célula hospedera carece de actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

En otro aspecto, la presente invención provee un método general para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 , actividad de ß-manosiltransferasa 3 y actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

La presente invención provee además una célula hospedera de levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris, en la cual el gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano ha sido deletado o perturbado, y por lo menos un gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 1 o actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano ha sido deletado o perturbado, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteina o glucoproteína recombinante. En otras modalidades, los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano, han sido deletados o perturbado. En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera recombinante cuyos genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 , una actividad de ß-manosiltransferasa 3 y una actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteina recombinante.

La presente invención provee además un método general para producir una proteina o glucoproteina recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastorís, en la cual el gen que codifica para una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano ha sido deletado o perturbado, y por lo menos un gen que codifica para una actividad seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano ha sido deletado o perturbado, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteina recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteina recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u 0-glucano, han sido deletados o perturbados.

En otro aspecto, la presente invención provee un método general para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una levadura metilotrófica recombinante tal como una célula hospedera de Pichia pastoris en la cual los genes que codifican para una actividad de ß-manosiltransferasa 2, una actividad de ß-manosiltransferasa 1 , una actividad de ß-manosiltransferasa 3 y una actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

La presente invención provee además una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante en la cual el gen BMT2 y por lo menos uno del gen BMT1 y gen BMT3 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteina o glucoproteína recombinante. En otras modalidades, el gen BMT2, gen BMT1 y gen BMT3 han sido deletados o perturbados. En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante en la cual el gen BMT1, gen BMT2, gen BMT3 y gen BMT4 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante.

La presente invención provee además un método general para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante en la cual el gen BMT2 y por lo menos uno del gen BMT1 y el gen BMT3 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. En otras modalidades, el gen BMT2, gen BMT1 y gen BMT3 han sido deletados o perturbados.

En otro aspecto, la presente invención provee un método general para producir una proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-antígenos de la célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera de Pichia pastorís recombinante en la cual el gen BMT1, gen BMT2, gen BMT3 y gen BMT4 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la proteína o glucoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glucoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

La presente invención provee además una célula hospedera de Pichia pastorís recombinante en la cual el gen BMT2 y por lo menos uno del gen BMT1 y el gen BMT3 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante. En otras modalidades, el gen BMT2, gen BMT1 y gen BMT3 han sido deletados o perturbados. En otro aspecto, la presente invención provee una célula hospedera de Pichia pastorís recombinante en la cual el gen BMT1, gen BMT2, gen BMT3 y gen BMT4 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante.

En general, la proteína o glucoproteína recombinante es una glucoproteína terapéutica. Ejemplos de glucoproteínas terapéuticas contempladas incluyen, pero no están limitados a, eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como el factor VIII, factor IX y proteína humana C; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como proteínas de fusión de Fc-receptor de FNT soluble; proteínas de fusión RAGE-Fc; interleucinas; urocinasa; quimasa; e inhibidor de urea tripsina; proteína de unión a IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor de progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1 -antitripsina; a-fetoproteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 de plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; y agonista de receptor de IL-2.

En aspectos particulares de la invención, la molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína o glucoproteína recombinante es optimizada en codones para mejorar la expresión de la proteína o glucoproteína recombinante en la célula hospedera. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, la molécula de ácido nucleico que codifica para la forma humana madura de eritropoyetina, fue optimizada en codones para la expresión mejorada de la eritropoyetina en una levadura metilotrófica tal como una cepa de Pichia pastoris que había sido genéticamente diseñada para producir una variante de eritropoyetina que comprende N-glucanos biantenarios, en la cual la glucoforma predominante comprende ambas antenas terminalmente sialiladas.

La presente invención provee además composiciones que comprenden una o más proteínas o glucoproteínas que carecen de entrelazamiento detectable con anticuerpos contra antígenos de la célula hospedera, producidos usando los métodos de la presente y en las células hospederas descritas en la presente. Las composiciones pueden incluir además vehículos y sales farmacéuticamente aceptables.

Células hospederas adecuadas incluyen cualquier célula hospedera que incluya homólogos de los genes BMT1, BMT2, BMT3 y/o BMT4 de Pichia pastoris. Actualmente, ejemplos de dichas células hospederas incluyen Candida albicans y la levadura metilotrófica Pichia pastoris. De esta manera, en aspectos particulares de la invención, la célula hospedera es una levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris, y mutantes de la misma y variantes genéticamente diseñadas de la misma. Las levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris que se contemplan para su uso en la presente invención pueden ser genéticamente modificadas, de modo que expresen glucoproteínas en las cuales el patrón de glucosilación sea de tipo humano o humanizado. De esta manera, pueden producirse composiciones de glucoproteína en las cuales una glucoforma deseada específica sea predominante en la composición. Esto puede lograrse, eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas, y/o diseñando genéticamente las células hospederas y/o suministrando enzimas exógenas que imiten la totalidad o parte de la vía de glucosilación en mamíferos como se describe en el documento US 2004/0018590. Si se desea, puede llevarse a cabo ingeniería genética adicional de la glucosilación, de modo que la glucoproteína pueda producirse con o sin fucosilación central. El uso de células hospederas eucarióticas inferiores es además ventajoso, porque estas células son capaces de producir composiciones altamente homogéneas de glucoproteína, de modo que la glucoforma predominante de la glucoproteína puede estar presente en más de 30% en moles de la glucoproteína en la composición. En aspectos particulares, la glucoforma predominante puede estar presente en más de 40% en moles, 50% en moles, 60% en moles, 70% en moles y más preferiblemente, más de 80% en moles de la glucoproteína presente en la composición. Esto puede lograrse eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas y/o suministrando enzimas exógenas como se describe en Gerngross et al., patente de E.U.A. No. 7,029,872, y en la patente de E.U.A. No. 7,449,308. Por ejemplo, una célula hospedera puede ser seleccionada o diseñada para que sea agotada en actividades de 1 ,6- manosiltransferasa, lo cual de otra manera añadiría residuos de mañosa en el N-glucano en una glucoproteina.

En una modalidad, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de a1 ,2-manosidasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de a1 ,2-manosidasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de una glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma Man5GlcNAc2. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,029,872, la patente de E.U.A. No. 7,449,308, y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0170452, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteina que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa I (GlcNAc transferasa I o GnT I) fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de GlcNAc transferasa I hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2. La patente de E.U.A. No. 7,029,872, la patente de E.U.A. No. 7,449,308, y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0170452, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteina que comprende una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2. La glucoproteina producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de manosidasa II fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de manosidasa II hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAcMan3GlcNAc2. La patente de E.U.A. No. 7,029,872 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2004/0230042, describen células hospederas eucarióticas inferiores que expresan enzimas manosidasa II y son capaces de producir glucoproteínas que tienen predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3Glc Ac2. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II (GlcNAc transferasa II o GnT II) fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de GlcNAc transferasa II hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2. La patente de E.U.A. No. 7,029,872 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. Nos. 2004/0018590 y 2005/0170452, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteína que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de galactosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de galactosiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GalGlc Ac2Man3Glc Ac2 o Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de las mismas, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 o glucoforma Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de las mismas. La patente de E.U.A. No. 7,029,872 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2006/0040353, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteína que comprende una glucoforma Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una galactosidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de sialiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de sialiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 o glucoforma NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de las mismas. Para células hospederas eucarióticas inferiores tales como levaduras y hongos filamentosos, es útil que la célula hospedera incluya además medios para proveer CMP-ácido siálico para transferencia al N-glucano. La solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0260729 describe un método para diseñar genéticamente eucariontes inferiores para que tengan una vía de síntesis de CMP-ácido siálico, y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2006/0286637 describe un método para diseñar genéticamente eucariontes inferiores para que produzcan glucoproteínas sialiladas. La glucoproteina producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una neuraminidasa, para producir una glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma Gal2GlcNAc2 an3GlcNAc2 o glucoforma GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de las mismas.

Cualquiera de las células hospederas anteriores puede incluir además una o más GIcNAc transferasas seleccionadas del grupo que consiste de GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI y GnT IX, para producir glucoproteínas que tengan estructuras de N-glucano bisectadas (GnT III) y/o multiantenarias (GnT IV, V, VI y IX), tal como se describe en la solicitud de patente publicada de E.U.A. Nos. 2004/074458 y 2007/0037248.

En otras modalidades, la célula hospedera que produce glucoproteínas que tienen predominantemente N-glucanos GlcNAcMan5GlcNAc2, incluye además un dominio catalítico de galactosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de galactosiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende predominantemente la glucoforma GalGlcNAcMan5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior que produce glucoproteínas que tienen predominantemente los N-glucanos GalGlcNAcMan5GlcNAc2, incluye además un dominio catalítico de sialiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico, y seleccionado para dirigir la actividad de sialiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2.

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente, la célula hospedera es modificada adicionalmente para que incluya una fucosiltransferasa y una vía para producir fucosa y para transportar fucosa en el ER o el aparato de Golgi. Ejemplos de métodos para modificar a Pichia pastoris para hacerla capaz de producir glucoproteínas en las cuales uno o más de los N-glucanos en las mismas sean fucosilados, se describen en la solicitud internacional del PCT No. PCT/US2008/002787. En aspectos particulares de la invención, la célula hospedera de Pichia pastoris es modificada adicionalmente para que incluya una vía de fucosilación que comprende una GDP-manosa-4,6-deshidratasa, GDP-ceto-desoxi-manosa-epimerasa/GDP-ceto-desoxi-galactosa-reductasa, transportador de GDP-fucosa, y una fucosiltransferasa. En aspectos particulares, la fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de a1 ,2-fucosiltransferasa, a1 ,3-fucosiltransferasa, a1 ,4-fucosiltransferasa y a1 ,6-fucosiltransferasa.

Varias de las células hospederas anteriores incluyen además uno o más transportadores de azúcar tales como transportadores de UDP-GIcNAc (por ejemplo, transportadores de UDP-GIcNAc de Kluyveromyces lactis y Mus musculus), transportadores de UDP-galactosa (por ejemplo, el transportador de UDP-galactosa de Drosophila melanogaster) y el transportador de CMP-ácido siálico (por ejemplo, transportador de ácido siálico de humano). Debido a que células hospederas eucarióticas inferiores tales como las levaduras y los hongos filamentosos carecen de los transportadores anteriores, es preferible que las células hospederas eucarióticas inferiores tales como las levaduras y los hongos filamentosos, sean genéticamente diseñados para que incluyan los transportadores anteriores.

Las células hospederas incluyen además células hospederas de Pichia pastoris que son genéticamente diseñadas para que eliminen glucoproteínas que tienen residuos de fosfomanosa, deletando o perturbando uno de los genes o ambos genes de la fosfomanosiltransferasa PN01 y MNN4B (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 7,198,921 y 7,259,007) que, en otros aspectos, pueden incluir también deletar o perturbar el gen MNN4A. La perturbación incluye perturbar el marco de lectura abierto que codifica para las enzimas particulares, o perturbar la expresión del marco de lectura abierto, o anular la traducción de las moléculas de ARN que codifican para una o más de las ß-manosiltransferasas y/o fosfomanosiltransferasas usando ARN de interferencia, ARN antisentido, o similares. Las células hospederas pueden incluir además cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente modificadas para producir estructuras de N-glucano particulares.

Las células hospederas incluyen además células eucarióticas inferiores (por ejemplo, levaduras tales como Pichia pastoris) que son genéticamente modificadas para que controlen la O-glucosilación de la glucoproteína, deletando o perturbando uno o más de los genes de la proteína manosiltransferasa, O-manosiltransferasa (Dol-P-Man:proteína (Ser/Thr)) (PMTs) (véase la patente de E.U.A. No. 5,714,377), o cultivadas en presencia de inhibidores de Pmtp y/o una alfa-manosidasa como se describe en la solicitud internacional publicada No. WO 2007061631 , o ambas. La perturbación incluye perturbar el marco de lectura abierto que codifica para Pmtp, o perturbar la expresión del marco de lectura abierto, o anular la traducción de las moléculas de ARN que codifican para una o más de las Pmtps, usando ARN de interferencia, ARN antisentido, o similares. Las células hospederas pueden incluir además cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente modificadas para producir estructuras de N-glucano particulares.

Los inhibidores de Pmtp incluyen, pero no están limitados a, bencilidentiazolidinodionas. Ejemplos de bencilidentiazolidinodionas que pueden usarse son ácido 5-[[3,4-bis(fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético; ácido 5-[[3-(1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético; y ácido 5-[[3-(1-fenil-2-hidroxi)etoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético.

En modalidades particulares, la función o expresión de por lo menos un gen PMT endógeno, es reducida, perturbada o deletada. Por ejemplo, en modalidades particulares, la función o expresión de por lo menos un gen PMT endógeno seleccionado del grupo que consiste de genes PMT1, PMT2, PMT3 y PMT4, es reducida, perturbada o deletada; o las células hospederas se cultivan en presencia de uno o más inhibidores de PMT. En otras modalidades, las células hospederas incluyen una o más deleciones o perturbaciones del gen PMT, y las células hospederas se cultivan en presencia de uno o más inhibidores de Pmtp. En aspectos particulares de estas modalidades, las células hospederas expresan también una alfa-1 ,2-manosidasa secretada.

Las deleciones o perturbaciones de PMT y/o los inhibidores de Pmtp controlan la O-glucosilación reduciendo la ocupación de la O-glucosilación; es decir, reduciendo el número total de sitios de O-glucosilación en la glucoproteína que son glucosilados. La adición adicional de una alfa-1 ,2-manosidasa que es secretada por la célula, controla la O-glucosilación reduciendo la longitud de la cadena de la mañosa de los O-glucanos que están en la glucoproteína. De esta manera, la combinación de las deleciones o perturbaciones de PMT y/o los inhibidores de Pmtp con la expresión de una alfa-1 ,2-manosidasa secretada, controla la O-glucosilación reduciendo la ocupación y la longitud de la cadena. En circunstancias particulares, la combinación particular de deleciones o perturbaciones de PMT, inhibidores de Pmtp y alfa-1 ,2-manosidasa, se determina empíricamente como glucoproteínas heterólogas particulares (anticuerpos, por ejemplo) que pueden ser expresadas y transportadas a través del aparo de Golgi con diferentes grados de eficiencia, y de esta manera puede requerir una combinación particular de deleciones o perturbaciones de PMT, inhibidores de Pmtp y alfa-1 ,2-manosidasa. En otro aspecto, genes que codifican para una o más enzimas manosiltransferasa endógenas, son deletados. Estas deleciones pueden estar en combinación con la provisión de la alfa-1 ,2-manosidasa secretada y/o los inhibidores de PMT, o pueden estar en lugar de la provisión de la alfa-1 ,2-manosidasa secretada y/o los inhibidores de PMT.

De esta manera, el control de la O-glucosilación puede ser útil para producir glucoproteínas particulares en las células hospederas descritas en la presente en mejor rendimiento total o en rendimiento de la glucoproteína adecuadamente ensamblada. La reducción o eliminación de la O-glucosilación parece tener un efecto benéfico sobre el ensamble y el transporte de glucoproteínas tales como anticuerpos enteros, conforme atraviesan la vía secretoria y son transportados hacia la superficie de la célula. De esta manera, en células en las cuales la O-glucosilación es controlada, el rendimiento de glucoproteínas adecuadamente ensambladas tales como fragmentos de anticuerpo, se incrementa sobre el rendimiento obtenido en las células hospederas en las cuales la O-glucosilación no es controlada.

El rendimiento de glucoproteínas puede mejorarse en algunas situaciones sobreexpresando moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas chaperones de humano o de mamífero, o reemplazando los genes que codifican para una o más proteínas chaperones endógenas con moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero. Además, la expresión de proteínas chaperones de humano o de mamífero en la célula hospedera, parece también controlar la O-glucosilación en la célula. De esta manera, incluidas además son las células hospederas en la presente en donde la función de por lo menos un gen endógeno que codifica para una proteína chaperón ha sido reducida o eliminada, y un vector que codifica para por lo menos un homólogo de la proteína chaperón de humano o de mamífero es expresado en la célula hospedera. Incluidas también son células hospederas en las cuales los chaperones endógenos de la célula hospedera y las proteínas chaperones de humano o de mamífero, son expresados. En otros aspectos, la célula hospedera eucariótica inferior es una célula hospedera de levadura u hongo filamentoso. Ejemplos del uso de los chaperones de las células hospederas en las cuales las proteínas chaperones de humano se introducen para mejorar el rendimiento y reducir o controlar la O-glucosilación de proteínas recombinantes, se han descrito en la solicitud internacional del PCT No. PCT/US2009/033507. Como anteriormente, incluidas además son células hospederas eucarióticas inferiores en donde, además de que se reemplazan los genes que codifican para una o más de las proteínas chaperones endógenas con moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero o que sobreexpresan una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero como se describió anteriormente, la función o expresión de por lo menos un gen endógeno que codifica para una proteína O-manosiltransferasa (PMT) es reducida, perturbada o deletada. En modalidades particulares, la función de por lo menos un gen PMT endógeno seleccionado del grupo que consiste de los genes PMT1, PMT2, PMT3 y PMT4, es reducida, perturbada o deletada.

Por lo tanto, los métodos descritos en la presente pueden usar cualquier célula hospedera que haya sido genéticamente modificada para producir glucoproteínas en donde el N-glucano predominante se selecciona del grupo que consiste de N-glucanos complejos, N-glucanos híbridos y N- glucanos de alto contenido de mañosa, en donde los N-glucanos complejos se seleccionan del grupo que consiste de Man3GlcNAc2, GlcNAC(1. 4)Man3GlcNAc2, Gal(i-4)GlcNAC(i-4)Man3GlcNAc2 y NANA(1-4)Gal(i. 4)Man3GlcNAc2; los N-glucanos híbridos se seleccionan del grupo que consiste de Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2) GalGlcNAcMan5GlcNAc2 y NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2; y los N-glucanos de alto contenido de mañosa se seleccionan del grupo que consiste de Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, an8GlcNAc2 y Man9GlcNAc2. Ejemplos de estructuras de N-glucano incluyen, pero no están limitados a, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2l GlcNAc4Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2) NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2 y NANA4Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2.

Marcadores seleccionables de levadura que pueden usarse para construir las células hospederas recombinantes, incluyen marcadores de resistencia a fármacos y funciones genéticas que permiten que la célula hospedera de levadura sintetice nutrientes celulares esenciales, por ejemplo, aminoácidos. Los marcadores de resistencia a fármacos que se usan comúnmente en levaduras incluyen cloranfenicol, kanamicina, metotrexato, G418 (geneticina), zeocina, y similares. Funciones genéticas que permiten que la célula hospedera de levadura sintetice nutrientes celulares esenciales, se usan con cepas de levadura disponibles que tengan mutaciones auxotróficas en la función genómica correspondiente. Marcadores seleccionables de levadura comunes proveen funciones genéticas para la síntesis de leucina (LEU2), triptófano {TRP1 y TRP2), prolina (PR01), uracilo {URA3, URA5, URA6), histidina (H/S3), lisina (LYS2), adenina (ADE1 o ADE2), y similares. Otros marcadores seleccionables de levadura incluyen el gen ARR3 de S. cerevisiae, el cual confiere resistencia a arsenito en células de levadura que crecen en presencia de arsenito (Bobrowicz et al., Yeast, 13: 819-828 (1997); Wysocki et al., J. Biol. Chem. 272: 30061-30066 (1997)). Muchos sitios de integración adecuados incluyen los enumerados en la patente de E.U.A. 7,479,389, e incluyen homólogos de loci conocidos para Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras u hongos. Métodos para la integración de vectores en levaduras son bien conocidos (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,479,389, la patente de E.U.A. No. 7,514,253, la solicitud publicada de E.U.A. No. 2009012400 y el documento WO2009/085135). Ejemplos de sitios de inserción incluyen, pero no están limitados a, genes ADE de Pichia; genes TRP de Pichia (incluyendo TRP1 a TRP2); genes MCA de Pichia; genes CYM de Pichia; genes PEP de Pichia; genes PRB de Pichia; y genes LEU de Pichia. Los genes ADE1 y ARG4 de Pichia se han descrito en Lin Cereghino et al., Gene 263: 159-169 (2001 ), y en la patente de E.U.A. No. 4,818,700, los genes HIS3 y TRP1 se han descrito en Cosano et al., Yeast 14: 861-867 (1998), y HIS4 se ha descrito en el acceso del GenBank No. X56180.

La presente invención provee además un método para producir una eritropoyetina humana madura en levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera. El método comprende proveer una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante genéticamente diseñada para producir N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, y en la cual por lo menos los genes BMT1, BMT2 y BMT3 han sido deletados o perturbados, y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER o el aparato de Golgi, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER o el aparato de Golgi; cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese y procese la primera y segunda proteínas de fusión; y recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

En aspectos particulares, la molécula de ácido nucleico que codifica para la eritropoyetina humana madura es optimizada en codones para expresión óptima en la levadura metilotrófica tal como Pichia pasto s. Como se muestra en los ejemplos, la eritropoyetina humana madura es codificada como una proteína de fusión en la cual la EPO es fusionada en el extremo N-terminal de la forma madura de la eritropoyetina, con el extremo C-terminal de un péptido de señal que dirige la proteína de fusión hacia la vía secretoria para procesamiento, incluyendo glucosílación. Ejemplos de péptidos de señal incluyen, pero no están limitados a, el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo. Pueden usarse otras secuencias de señal en lugar de las descritas en la presente, por ejemplo, el péptido de señal de a-amilasa de Aspergillus niger y el péptido de señal de albúmina de suero humano (HSA). En una modalidad, una primera molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión, en donde la eritropoyetina madura es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae, y una segunda molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión en donde la eritropoyetina madura es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo. El péptido de señal puede ser fusionado con la eritropoyetina humana madura por un péptido enlazador que puede contener uno o más sitios de desdoblamiento de proteasa.

En otros aspectos, la célula hospedera incluye entre dos y doce copias de los cassettes de expresión que codifican para la proteína de fusión que comprende la eritropoyetina humana madura. En algunos aspectos, la célula hospedera incluye aproximadamente ocho a once copias de los cassettes de expresión que codifican para la proteína de fusión que comprende la eritropoyetina humana madura. En otros aspectos, la célula hospedera incluye aproximadamente tres a cuatro copias del primer ácido nucleico, y cinco a siete copias del segundo ácido nucleico.

La célula hospedera es genéticamente diseñada para que produzca N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, en la cual por lo menos los genes BMT1, BMT2 y BMT3 han sido deletados o perturbados. Dicha célula hospedera incluye además por lo menos un deleción o perturbación de los genes OCH1, PN01, MNN4 y MNN4L1. La célula hospedera incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para por lo menos las siguientes enzimas de glucosilación quiméricas: dominio catalítico de a1 ,2-manosidasa fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera; dominio catalítico de GIcNAc transferasa I fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera; dominio catalítico de manosidasa II fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera; dominio catalítico de GIcNAc transferasa II fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera; dominio catalítico de pi ,4-galactosiltransferasa fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera; y dominio catalítico de a1 ,2-sialiltransferasa fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. Estas enzimas de glucosilación se seleccionan para que sean activas en el sitio en el ER o el aparato de Golgi hacia los cuales son dirigidas. Métodos para seleccionar las enzimas de glucosilación y dirigir las enzimas hacia regiones particulares del ER o el aparato de Golgi para actividad óptima, se han descrito en las patentes de E.U.A. No. 7,029,872 y 7,449,308, y en la solicitud de E.U.A. publicada Nos. 2006/0040353 y 2006/0286637. Las células hospederas son además modificadas para que incluyan las enzimas de una vía como se describe en la solicitud de E.U.A. publicada Nos. 2006/0040353 y 2006/0286637 para producir CMP-ácido siálico, y para incluir transportadores de galactosa y GIcNAc y una UDP-galactosa-4-epimerasa. Por último, el hospedero incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica para un dominio catalítico de a1 ,2-manosidasa de hongos fusionado con un péptido de determinación del blanco celular que dirige el dominio catalítico hacia la vía secretoria para secreción, y el cual efectúa una reducción en la ocupación de los N-glucanos y la longitud de la cadena.

La detección de la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, puede determinarse en una ELISA en sandwich o en un Western blot.

En otros aspectos, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, incluye un paso de cromatografía de intercambio catiónico y/o un paso de cromatografía de hidroxiapatita y/o un paso de cromatografía de intercambio aniónico. En una modalidad, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, comprende un paso de cromatografía de intercambio catiónico seguido de un paso de cromatografía de hidroxiapatita. Opcionalmente, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, incluye un paso de cromatografía de intercambio aniónico.

Provista además es una composición que comprende una eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera obtenidos como se describe en la presente, y una sal farmacéuticamente aceptable. En modalidades particulares, aproximadamente 50 a 60% de los N-glucanos comprenden residuos de ácido siálico en ambas antenas; en otras modalidades, más de 70% de los N-glucanos comprenden residuos de ácido siálico en ambas antenas. En otros aspectos, menos de 30% de los N-glucanos son N-glucanos neutros (es decir, no están sialilados en por lo menos un extremo en el extremo no reductor del N-glucano). En otros aspectos, menos de 20% de los N-glucanos son N-glucanos neutros.

En aspectos particulares, la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera es conjugada con un polímero hidrofílico, el cual en modalidades particulares es un polímero de polietilenglicol. Ejemplos de eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico conjugada con polímeros de polietilenglicol, se han descrito en la solicitud publicada de E.U.A. comúnmente reconocida No. 2008/0139470.

El grupo polímero de polietilenglicol (PEG) puede ser de cualquier peso molecular conveniente, y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG variará de preferencia de aproximadamente 2 kiloDaltons ("kDa") a aproximadamente 100 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 60 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 50 kDa; muy preferiblemente de aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 40 kDa. Estos polímeros de PEG pueden proveerse de cualquier proveedor comercial que incluye NOF Corporation (Tokio, Japón), Dow Pharma (ChiroTech Technology, Cambridge, Reino Unido), Nektar (San Carlos, CA) y SunBio (Anyang City, Corea del Sur). Porciones de PEG adecuadas incluyen, por ejemplo, metoxi poli(etilenglicol) propionaldehído de 40 kDa; metoxi poli(etilenglicol) propionaldehído de 60 kDa; alfa-metil-w-(3-oxopropoxi) de 31 kDa, polioxietileno; PEG de 30 kDa: metoxi poli(etilenglicol) propionaldehído de 30 kDa y 2,3-bis(metilpolioxietilen-oxi)-1-[(3-oxopropil)polioxietilen-oxi]-propano de 45 kDa. Los grupos PEG serán unidos generalmente a la eritropoyetina por medio de acilación o aminación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción de PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster), a un grupo reactivo en la proteína o polipéptido de interés (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster). Por ejemplo, la porción de PEG puede ser enlazada con el residuo de aminoácido N-terminal de la eritropoyetina, ya sea directamente o a través de un enlazador.

Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste de combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y una porción de PEG, cada uno teniendo una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva entre sí. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con síntesis de fase sólida convencional (véase, por ejemplo, el ejemplo 4). Los péptidos son "preactivados" con un grupo funcional adecuado en un sitio específico. Los precursores son purificados y completamente caracterizados antes de que reaccionen con la porción de PEG. La ligación del péptido con el PEG usualmente ocurre en fase acuosa, y puede monitorearse fácilmente mediante CLAR analítica de fase invertida. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente mediante CLAR preparativa, y pueden caracterizarse mediante CLAR analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masa-desorción láser.

Se pretende que los siguientes ejemplos promuevan un mejor entendimiento de la presente invención.

EJEMPLO 1 La cepa YGLY3159 de Pichia pastoris genéticamente diseñada, es una cepa que produce eritropoyetina humana recombinante con N-glucanos sialilados (rhEPO). La construcción de la cepa se ha descrito en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20080139470, y se ilustra esquemáticamente en las figuras 1A-1 I. En resumen, la cepa se construyó como sigue.

La cepa YGLY3159 se construyó a partir de la cepa NRRL-Y 11430 de Pichia pastoris de tipo silvestre, usando métodos descritos en un principio (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,449,308; la patente de E.U.A. No. 7,479,389; la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000; la solicitud del PCT publicada No. WO2009085135; así como Nett y Gerngross, Yeast 20: 1279 (2003); Choi et al., Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 100: 5022 (2003); y Hamilton et al., Science 301 : 1244 (2003)). Todos los plásmidos se obtuvieron en un plásmido pUC19 usando procedimientos estándar de biología molecular. Para las secuencias de nucleótidos que fueron optimizadas para expresión en P. pastoris, las secuencias de nucleótidos nativas se analizaron usando el software GENEOPTIMIZER (GeneArt, Regensburg, Alemania), y los resultados se usaron para generar secuencias de nucleótidos en las cuales los codones fueron optimizados para expresión en P. pastoris. Las cepas de levadura fueron transformadas mediante electroporación (usando técnicas estándar como es recomendado por el fabricante del electroporador BioRad).

Glosario: ScSUC2 Invertasa de S. cerevisiae OCH1 Alfa-l,6-manosiltransferasa K1MNN2-2: Transportador de UDP-GIcNAc de K. lactis BMT1, Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT2. Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT3. Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT4. Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) MNN4L1: MNN4 tipo 1 (eliminación de la carga) MmSLC35A3 Homólogo de ratón del transportador de UDP-GIcNAc PNOl: Fosfomanosilación de N-glucanos (eliminación de la carga) MNN4. Manosiltransferasa (eliminación de la carga) ScGALlO UDP-glucosa 4-epimerasa XB33 HsGalTl truncada fusionada con el péptido guía ScKRE2 DmUGT Transportador de UDP-galactosa KD53 Dm NSII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 TC54 RnGNTII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 NA10 HsGNTI truncado fusionado con el péptido guía PpSEC12 FB8: MmMNSlA truncado fusionado con el péptido guía S SEC12 ITMDSI MNS1 secretada de 7*. reesei Sh ble: Marcador de resistencia a zeocina ScaMFpre- Fusión de la pre-secuencia del factor de acoplamiento alfa de Se con GFI800 HsEPO MmCST Transportador de CMP-ácido siálico de ratón HsGNE UDP-GIcNAc 2-epimerasa/A/-acetilmanosamina cinasa de humano HsCSS CMP-ácido siálico sintasa de humano HsSPS W-acet¡lneuraminato-9-fosfato sintasa de humano MmST6-33 a-2,6-sialiltransferasa truncada de ratón fusionada con el péptido guía ScKRE2 ADE2U Marcador truncado de ADE2 CLSP Péptido guía de lisozima de pollo PEP4 Proteinasa A El plásmido pGLY6 (figura 2) es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5 que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa o la unidad de transcripción (ScSUC2; SEQ ID NO: 1 ) de S. cerevisiae, flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 (SEQ ID NO: 59) de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 (SEQ ID NO: 60) de P. pastoris. El plásmido pGLY6 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa NRRL-Y1 1430 de tipo silvestre, para producir muchas cepas en las cuales el gen ScSUC2 fue insertado en el locus URA5 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY1-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para uracilo.

El plásmido pGLY40 (figura 3) es un vector de integración que elige como objetivo el locus OCH1, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (SEQ ID NO: 61 ) de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (SEQ ID NO: 62), el cual a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen OCH1 (SEQ ID NO: 64), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen OCH1 (SEQ ID NO: 65). El plásmido pGLY40 fue linealizado con Sffl, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY1-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ, ha sido insertado en el locus OCH1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY2-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para URA5. La cepa YGLY2-3 fue contraseleccionada en presencia de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA), para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido, y sólo las repeticiones de lacZ permanecen en el locus OCH1. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. Se seleccionó la cepa YGLY4-3.

El plásmido pGLY43a (figura 4) es un vector de integración que elige como objetivo el locus BMT2, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen del transportador de UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GIcNAc) o la unidad de transcripción (KIMNN2-2, SEQ ID NO: 3) de K. lactis adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los genes adyacentes son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen BMT2 (SEQ ID NO: 66), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen BMT2 (SEQ ID NO: 67). El plásmido pGLY43a fue linealizado con S /'l, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY4-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen KIMNN2-2 y el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ, ha sido insertado en el locus BMT2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen BMT2 se ha descrito en Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008), y en la patente de E.U.A. No.7,465,557. La cepa YGLY6-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo. La cepa YGLY6-3 fue contraseieccionada en presencia de 5-FOA para producir cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido, y sólo permanecen las repeticiones de lacZ. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. Se seleccionó la cepa YGLY8-3.

El plásmido pGLY48 (figura 5) es un vector de integración que elige como objetivo el locus MNN4L1, y contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo de ratón del transportador de UDP-GIcNAc (SEQ ID NO: 17) en el marco de lectura abierto (ORF) enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (SEQ ID NO: 53), y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 56) adyacentes a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ, y en el cual los cassettes de expresión en conjunto son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen MNN4L1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 76), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4L1 (SEQ ID NO: 77). El plásmido pGLY48 fue linealizado con S /1, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY8-3, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión que codifica para el transportador de UDP-GIcNAc de ratón y el gen URA5, ha sido insertado en el locus MNN4L1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen MNN4L1 (referido también como MNN4B), se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,259,007. La cepa YGLY10-3 se seleccionó de las cepas producidas, y entonces fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido, y sólo permanecen las repeticiones de lacZ. Se seleccionó la cepa YGLY12-3.

El plásmido pGLY45 (figura 6) es un vector de integración que elige como objetivo los loci PN01/MNN4, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ que a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen PN01 (SEQ ID NO: 74), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4 (SEQ ID NO: 75). El plásmido pGLY45 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY12-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ ha sido insertado en los loci MNN4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen PN01 se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,198,921 , y el gen MNN4 (referido también como MNN4B) se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,259,007. La cepa YGLY14-3 se seleccionó de las cepas producidas, y entonces fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido y sólo permanecen las repeticiones de lacZ. Se seleccionó la cepa YGLY16-3.

El plásmido pGLY247 (figura 7) es un vector de integración que elige como objetivo el locus MET16, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden las repeticiones de lacZ, el cual a su vez es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen MET16 (SEQ ID NO: 84), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MET16 (SEQ ID NO: 85). El plásmido pGLY247 fue linealizado con Sfft, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY16-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ, ha sido insertado en el locus MET16 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. Se seleccionó la cepa YGLY20-3.

El plásmido pGLY248 (figura 8) es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen MET16 de P. pastoris (SEQ ID NO: 86) flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 (SEQ ID NO: 59), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 (SEQ ID NO: 60). El plásmido pGLY248 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY20-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen ScSUC2 insertado en el locus URA5, ha sido reemplazado con el gen MET16 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY22-3 se seleccionó, y entonces fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 insertado en el locus MET16 se ha perdido, y sólo permanecen las repeticiones de lacZ. Se seleccionó la cepa YGLY24-3.

El plásmido pGLY582 (figura 9) es un vector de integración que elige como objetivo el locus HIS1, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) la UDP-glucosa epimerasa de S. cerevisiae (ScGALIO), (2) el dominio catalítico de galactosiltransferasa I de humano (hGaIT) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía KRE2-S de S. cerevisiae (33) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (3) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por las repeticiones de lacZ, y (4) el transportador de UDP-galactosa de D. melanogaster (DmUGT). El cassette de expresión que codifica para ScGALW comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de ScGALW (SEQ ID NO: 21 ) enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 45), y enlazado operablemente en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 46). El cassette de expresión que codifica para la galactosiltransferasa I quimérica comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del dominio catalítico de hGaIT optimizado para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 23) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía KRE2-S 33 (SEQ ID NO: 13), el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. El cassette de expresión que codifica para DmUGT comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de DmUGT (SEQ ID NO: 19) enlazado operablemente en el extremo 5" con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor OCH1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 47), y enlazado operablemente en extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de P. pastoris (SEQ ID NO: 48). Los cuatro cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen HIS1 (SEQ ID NO: 87), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen HIS1 (SEQ ID NO: 88). El plásmido pGLY582 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY24-3, para producir muchas cepas en las cuales los cuatro cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus HIS1 mediante recombinación homologa. La cepa YGLY58 se seleccionó, y es auxotrófica para histidina y prototrófica para uridina.

El plásmido pGLY167b (figura 10) es un vector de integración que elige como objetivo el locus ARG1, y contiene tres cassettes de expresión en tándem que codifican para (1 ) el dominio catalítico de manosidasa II de D. melanogaster (KD) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía MNN2 de S. cerevisiae (53) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (2) el gen HIS1 o la unidad de transcripción de P. pastoris, y (3) el dominio catalítico de N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa II (TC) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía MNN2 de S. cerevisiae (54) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi. El cassette de expresión que codifica para KD53 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de manosidasa II de D. melanogaster optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 33) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía MNN2 53 (SEQ ID NO: 5), el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión HIS1 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen HIS1 o la unidad de transcripción (SEQ ID NO: 89) de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para TC54 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de GlcNAc transferasa II de rata optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 31 ) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía MNN2 54 (SEQ ID NO: 7), el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA 1 de P. pastoris. Los tres cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen ARG1 (SEQ ID NO: 79), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen ARG1 (SEQ ID NO: 80). El plásmido pGLY167b fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY58, para producir muchas cepas en las cuales los tres cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus ARG1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY73 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y prototrófica para uridina e histidina. La cepa fue contraseleccionada entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. Se seleccionó la cepa YGLY1272.

El plásmido pGLY1430 (figura 11) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus ADE1 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1 ) el dominio catalítico de GlcNAc transferasa I de humano (NA) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía SEC12 de P. pastons (10), que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (2) el homólogo de ratón del transportador de UDP-GIcNAc (MmTr), (3) el dominio catalítico de manosidasa IA de ratón (FB) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía SEC12 de S. cerevisiae (8) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, y (4) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris. Los vectores de integración KINKO (Knock-ln with little or No Knock-Out = expresión reemplazada con poca o ninguna expresión bloqueada), permiten la inserción del ADN heterólogo en un locus elegido como objetivo sin que se perturbe la expresión del gen en el locus elegido como objetivo, y se han descrito en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000. El cassette de expresión que codifica para NA10 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de GlcNAc transferasa I de humano optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO:25), fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía SEC12 10 (SEQ ID NO: 1 1 ), el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA 1 de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para MmTr comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo de ratón del ORF del transportador de UDP-GIcNAc enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor SEC4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 49), y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación OCH1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 50). El cassette de expresión que codifica para FB8 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de manosidasa IA de ratón (SEQ ID NO: 27) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía SEC12-m 8 (SEQ ID NO: 15), el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GADPH de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión de URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastorís, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los cuatro cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF completo del gen ADE1 (SEQ ID NO: 82) seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 54), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' gel gen ADE1 (SEQ ID NO: 83). El plásmido pGLY1430 fue linealizado con Sf/1, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY1272, para producir muchas cepas en las cuales los cuatro cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus ADE1 inmediatamente después del ORF de ADE1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY1305 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y ahora prototrófica para uridina, histidina y adenina. La cepa fue contraseleccionada entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. La cepa YGLY1461 se seleccionó, y es capaz de producir glucoproteínas que tienen predominantemente N-glucanos terminados en galactosa.

El plásmido pGFI165 (figura 12) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus PR01 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1 ) el dominio catalítico de a-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan), que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y la secreción de la célula, y (2) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para aMATTrMan comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de T. reesei (SEQ ID NO: 29) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 9), el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión de URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris, flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los dos cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF completo del gen PR01 (SEQ ID NO: 90), seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen PR01 (SEQ ID NO: 91). El plásmido pGFI165 fue linealizado con Sfft, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY1461 , para producir muchas cepas en las cuales los dos cassettes de expresión han sido insertados en el locus PR01 inmediatamente después del ORF de PR01 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY1703 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y prototrófica para uridina, histidina, adenina y prolina. Estas cepa es capaz de producir glucoproteínas que tienen O-glucosilación reducida (véase la solicitud de E.U.A publicada No. 20090170159).

El plásmido pGLY2088 (figura 13) es un vector de integración que elige como objetivo el locus TRP2 o AOX1, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1) eritropoyetina humana madura (EPO) fusionada en el extremo N-terminal con un péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (alfa MF-pre) que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula, y (2) la proteína de resistencia a zeocina (Sh ble o ZeocinR). El cassette de expresión que codifica para la EPO comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para la EPO humana madura optimizada en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 92) fusionada en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae, el cual es enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor AOX1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 55), y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión ZeocinR comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de Sh ble (SEQ ID NO: 58) enlazado operablemente en el extremo 5' con el promotor TEF1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 57), y en el extremo 3' con la secuencia de terminación CYC de S. cerevisiae. Los dos cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende el gen TRP2 (SEO. ID NO: 78). El plásmido pGLY2088 fue linealizado en el sitio Pmel y transformado en la cepa YGLY1703, para producir muchas cepas en las cuales los dos cassettes de expresión han sido insertados en el locus AOX1 mediante bamboleo en recombinación homologa de cruzamiento simple, lo cual resulta en copias múltiples del cassette de expresión de EPO insertado en el locus AOX1 sin que perturba el locus AOX1. La cepa YGLY2849 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y ahora prototrófica para uridina, histidina, adenina y prolina. La cepa contiene aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de EPO, según se determinó midiendo la intensidad de los datos de secuenciación del ADN aislado de la cepa. Durante el procesamiento de la EPO quimérica en el ER y el aparato de Golgi, el péptido guía es removido. De esta manera, la rhEPO producida es la forma madura de la EPO.

El plásmido pGLY2456 (figura 14) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus TRP2 sin que se perturbe la expresión del locus, y contiene seis cassettes de expresión que codifican para (1) el transportador de CMP-ácido siálico de ratón (mCMP-Sia Transp), (2) la UDP-GIcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina cinasa de humano (hGNE), (3) el gen ARG1 o la unidad de transcripción de Pichia pastorís, (4) la CMP-ácido siálico sintasa de humano (hCMP-NANA), (5) la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa de humano (hSIAP S), y (6) el dominio catalítico de a-2,6- sialiltransferasa de ratón (mST6) fusionado en el extremo N-terminal con el péptido guía KRE2 de S. cerevisiae (33) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, y el gen ARG1 o la unidad de transcripción de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para el transportador de CMP-ácido siálico de ratón, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del ORF del transportador de mCMP Sia optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 35), el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para la UDP-GIcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina cinasa de humano, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del ORF de hGNE optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 37), el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión que codifica para el gen ARG1 de P. pastoris comprende (SEQ ID NO: 81 ). El cassette de expresión que codifica para la CMP-ácido siálico sintasa de humano comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del ORF de hCMP-NANA S optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 39), el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastorís, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión que codifica para la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa de humano, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del ORF de hSIAP S optimizado en codones para expresión en P. pastorís (SEQ ID NO: 41), el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastorís, y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastorís. El cassette de expresión que codifica para la a-2,6-sialiltransferasa quimérica de ratón, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del dominio catalítico mST6 optimizado en codones para expresión en P. pastorís (SEQ ID NO: 43) fusionado en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal KRE2 de S. cerevisiae, el cual está enlazado operablemente en el extremo 5' con una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor TEF de P. pastorís (SEQ ID NO: 51), y en el extremo 3' con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción TEF de P. pastorís (SEQ ID NO: 52). Los seis cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del ORF que codifica para Trp2p que termina en el codón de detención (SEQ ID NO: 98), seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen TRP2 (SEQ ID NO: 99). El plásmido pGLY2456 fue linealizado con Sfñ, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY2849, para producir muchas cepas en las cuales los seis cassettes de expresión han sido insertados en el locus TRP2 inmediatamente después del ORF de TRP2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY3159 se seleccionó de las cepas producidas, y es ahora prototrófica para uridina, histidina, adenina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina, y contiene aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de EPO. La cepa produjo rhEPO; sin embargo, mediante el uso de los métodos en el ejemplo 5, la rhEPO tiene unión por reactividad cruzada con anticuerpos producidos contra HCA (véase el ejemplo 6).

Mientras que los varios cassettes de expresión fueron integrados en los loci particulares del genoma de Pichia pastoris en el ejemplo en la presente, se entiende que la operación de la invención es independiente de los loci usados para la integración. Otros loci diferentes de los descritos en la presente pueden usarse para la integración de los cassettes de expresión. Los sitios de integración adecuados incluyen aquellos enumerados en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20070072262, e incluyen homólogos para loci conocidos para Saccharomyces cerevisiae y otros hongos o levaduras.

EJEMPLO 2 La cepa YGLY3159 en el ejemplo 1 fue además genéticamente diseñada para perturbar los genes BMT1, BMT3 y BMT4, como sigue.

La cepa YGLY3159 fue contraseleccionada en presencia de 5- FOA para producir la cepa YGLY3225, la cual es ahora auxotrófica para uridina.

El plásmido pGLY3411 (pSH1092) (figura 15) es un vector de integración que contiene el cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastorís flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueados en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT4 de P. pastorís (SEQ ID NO: 72), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT4 de P. pastorís (SEQ ID NO: 73). El plásmido pGLY341 1 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY3159, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión de URA5 ha sido insertado en el locus BMT4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY4439 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina, y contiene aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de rhEPO. La cepa tiene una perturbación o deleción de los genes BMT2 y BMT4.

El plásmido pGLY3430 (pSH1 115) (figura 16) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de resistencia a nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de EROSCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-1352 Bad Homburg, Alemania; véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)) (SEQ ID NO: 102) enlazado operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 105) y las secuencias de terminación TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 106) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 68), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 69). El plásmido pGLY3430 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY4439, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión de NATR ha sido insertado en el locus BMT1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY6661 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina y nourseotricina, y contiene aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de EPO. La cepa tiene una perturbación o deleción de los genes BMT1, BMT2 y BMT4. La cepa YGLY7013 se seleccionó también; sin embargo, esta cepa tuvo sólo una perturbación parcial del gen BMT1. Se designó que esta cepa tiene una perturbación o deleción de los genes BMT1, BMT2 y BMT4.

El plásmido pGLY4472 (pSH1 186) (figura 17) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF del gen de higromicina B fosfotransferasa de E. coli (HygR) (SEQ ID NO: 103) enlazado operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 105) y secuencias de terminación TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 106) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 70), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 71 ). El plásmido pGLY3430 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY6661 , para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión de HygR ha sido insertado en el locus BMT3 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. Las cepas YGLY7361 a YGLY7366 y las cepas YGLY7393 a YGLY7398 se seleccionaron de las cepas producidas, y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. Las cepas son resistentes a zeocina, nourseotricina e higromicina, y contienen aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de EPO. Las cepas tienen perturbaciones o deleciones de los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4, y producen rhEPO que carece de unión por reactividad cruzada con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera (HCA).

EJEMPLO 3 La cepa YGLY3159 en el ejemplo 1 fue además genéticamente diseñada para producir cepas en las cuales los genes BMT1, BMT3 y BMT4 han sido perturbados o deletados, y para incluir varias copias de un cassette de expresión que codifica para la EPO humana madura fusionada con el péptido guía de lisozima de pollo. En resumen, la construcción de estas cepas a partir de YGLY3159 se muestra en la figura 1 , y se describe brevemente como sigue.

La cepa YGLY3159 fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA para producir la cepa YGLY3225, la cual es ahora auxotrófica para uridina.

El plásmido pGLY2057 (figura 18) es un vector de integración que elige como objetivo el locus ADE2, y contiene un cassette de expresión que codifica para el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ. El cassette de expresión es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen ADE2 (SEQ ID NO: 100), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen ADE2 (SEQ ID NO: 101). El plásmido pGLY2057 fue linealizado con S /1, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY3225, para producir muchas cepas en las cuales el cassette URA5 ha sido insertado en el locus ADE2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY3229 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para adenina y prototrófica para uridina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa resistente a zeocina, y contiene aproximadamente tres a cuatro copias del cassette de expresión de EPO.

El plásmido pGLY2680 (figura 19) es un vector de integración que puede elegir como objetivo el locus TRP2 o AOX1, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1 ) una EPO quimérica que comprende la eritropoyetina humana madura (EPO) fusionada en el extremo N-terminal con el péptido de señal de lisozima de pollo que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y la secreción de la célula, y (2) el gen ADE2 de P. pastorís sin un promotor. El gen ADE2 es poco transcrito de un promotor críptico. De esta manera, la sección de las cepas de levadura ade2A transformadas con el vector en medio no complementado con adenina, requiere copias múltiples del vector que sean integradas en el genoma para hacer que el recombinante sea prototrófico para adenina. Puesto que el vector incluye además el cassette de expresión de EPO, la levadura recombinante incluirá también copias múltiples del cassette de EPO integrado en el genoma. Este vector y el método se han descrito en la solicitud del PCT publicada WO2009085135. La secuencia de ADN que codifica para el péptido de señal de lisozima de pollo se muestra en SEQ ID NO: 94, el ORF optimizado en codones que codifica para la EPO humana madura se muestra en SEQ ID NO: 92, y el gen ADE2 de P. pastorís sin su promotor pero incluyendo sus secuencias de terminación se muestra en SEQ ID NO: 96. La EPO quimérica es enlazada operablemente con el promotor AOX1 y las secuencias de terminación CYC de S. cerevisiae. Los dos cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende el gen TRP2.

El plásmido pGLY2680 fue linealizado en el sitio Pme\ y transformado en la cepa YGLY3229, para producir muchas cepas en las cuales los dos cassettes de expresión han sido insertados en el locus AOX1 mediante bamboleo en recombinación homologa de cruzamiento simple, lo cual resulta en copias múltiples del cassette de expresión de EPO insertado en el locus AOX1 sin perturbación del locus AOX1. La cepa YGLY4209 se seleccionó de las cepas producidas. Esta cepa tiene aproximadamente 5 a 7 copias del cassette de expresión de EPO, según se determina midiendo la intensidad de los datos de secuenciación del ADN aislado de la cepa que es insertado en el locus. La cepa es prototrófica para adenina, uridina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa contiene en total aproximadamente ocho a once copias de los cassettes de expresión de EPO. Durante el procesamiento de la EPO quimérica en el ER y el aparato de Golgi, el péptido guía es removido. De esta manera, la rhEPO producida es la forma madura de la EPO.

La cepa YGLY4209 fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas que fueron auxotróficas para uracilo. A partir de los transformantes producidos, se seleccionó la cepa YGLY4244.

El plásmido pGLY2713 (figura 20), un vector de integración que elige como objetivo el gen PEP4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 104), contiene el ORF de PN01 de P. pastoris adyacente al cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de iacZ y flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen PEP4 de P. pastoris, y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen PEP4 de P. pastoris. El plásmido pGLY2713 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY4244, para producir muchas cepas en las cuales el ORF de PN01 y el cassette de expresión de URA5 han sido insertados en el locus PEP4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY5053 se seleccionó de las cepas producidas, y fue contraseleccionada en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión de URA5 se ha perdido del genoma. La cepa YGLY5597 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina, y contiene aproximadamente ocho a once copias del cassette de expresión de rhEPO.

El plásmido pGLY341 1 (pSH1092) (figura 15) es un vector de integración que contiene el cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ, flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 72), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 73). El plásmido pGLY3411 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY5597, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión de URA5 ha sido insertado en el locus BMT4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY5618 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina y nourseotricina, y contiene aproximadamente ocho a once copias del cassette de expresión de rhEPO. La cepa tiene perturbaciones de los genes BMT2 y BMT4.

El plásmido pGLY3430 (pSH1 115) (figura 16) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de resistencia a nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de EROSCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Alemania; véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)) (SEQ ID NO: 102) enlazado operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii, y secuencias de terminación TEF1 de Ashbya gossypii flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 68), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 69). El plásmido pGLY3430 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformando en la cepa YGLY5618, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión NATR ha sido insertado en el locus BMT1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY71 10 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a zeocina y nourseotricina, y contiene aproximadamente ocho a once copias del cassette de expresión de rhEPO. La cepa tiene perturbaciones de los genes BMT1, BMT2 y BMT4.

El plásmido pGLY4472 (pSH1 86) (figura 17) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF del gen de higromicina B fosfotransferasa (HygR) de E. coli (SEQ ID NO: 103) enlazado operablemente con el promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación TEF1 de Ashbya gossypii, flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 70), y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 71). El plásmido pGLY3430 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY7110, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión Hyg ha sido insertado en el locus BMT3 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. Las cepas YGLY71 3 a YGLY7122 se seleccionaron de las cepas producidas, y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. Las cepas son resistentes a zeocina, nourseotricina e higromicina, y contienen aproximadamente ocho a once copias del cassette de expresión de EPO. Las cepas tienen perturbaciones de los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4, y producen rhEPO que carece de unión por reactividad cruzada detectable con anticuerpos producidos contra HCA.

EJEMPLO 4 Varias de las cepas en los ejemplos 1 a 3 se usaron para producir rhEPO como se describe a continuación y se muestra esquemáticamente en la figura 21. En resumen, la producción comienza inoculando matraces de agitación que contienen medio de cultivo con células del banco de células de trabajo, y procede a través de una serie de inoculaciones, incubaciones y transferencias de los cultivos en expansión, en recipientes de tamaño creciente hasta que está disponible biomasa suficiente para inocular el biorreactor de producción. El glicerol es la fuente de carbono primaria durante la fase intermitente, entonces el crecimiento en cultivo se mantiene a través de la provisión de glicerol y sales. Cuando el glicerol se agota, las células son inducidas para que expresen la proteína rhEPO cambiando a una provisión de metanol. Se añaden inhibidores en la inducción, para reducir al mínimo la O-glucosilación (por ejemplo, PMTi 3, ácido 5-[[3-(1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético (véase la solicitud del PCT publicada No. WO 2007061631)), y para reducir al mínimo la proteólisis. Inhibidores de proteólisis se añaden de nuevo al final de la fase para reducir al mínimo la proteólisis. El cultivo se enfría a aproximadamente 4°C y se cosecha.

Se llevó a cabo el cultivo de las cepas a escala de laboratorio en fermentadores SixFors de 500 mL y 3 L, usando en general los siguientes procedimientos. Se hacen exámenes en biorreactor (SIXFORS) en recipientes de 0.5 L (sistema de fermentación múltiple Sixfors, ATR Biotech, Laurel, MD), bajo las siguientes condiciones: pH 6.5, 24°C, 0.3 SLPM, y una velocidad inicial del agitador de 550 rpm con un volumen de trabajo inicial de 350 mL (330 ml_ de medio BMGY y 20 ml_ de inoculo). Se usa el software IRIS para fermentadores múltiples (ATR Biotech, Laurel. MD) para incrementar linealmente la velocidad del agitador de 550 rpm a 1200 rpm durante 10 horas, una hora después de la inoculación. Los cultivos de siembra (200 mL de BMGY en un matraz inclinado de 1 L) se inoculan directamente de placas de agar. Los matraces de siembra se incuban por 72 horas a 24°C hasta alcanzar densidades ópticas (D06oo) entre 95 y 100. Los fermentadores se inoculan con cultivos en matraz de fase estacionaria de 200 mL que fueron concentrados hasta 20 mL mediante centrifugación. La fase intermitente terminó al concluir la fermentación con glicerol de la carga inicial (18-24h), y va seguida de una segunda fase intermitente que se inicia por la adición de 17 mL de solución de provisión de glicerol (glicerol a 50% [en p/p], 5 mg/L de biotina, 12.5 mLA de sales de PMTi (65 g/L de FeS047H20, 20 g/L de ZnCI2, 9 g/L de H2S04, 6 g/L de CuS04 5H20, 5 g/L de H2S04, 3 g/L de MnS047H20, 500 mg/L de CoCI2 6H2O, 200 mg/L de NaMo04-2H20, 200 mg/L de biotina, 80 mg/L de Nal, 20 mg/L de H3B04)). Tras concluir la segunda fase intermitente, según es señalado por una espiga en el oxígeno disuelto, la fase de inducción se inicia proveyendo una solución de provisión de metanol (MeOH a 100%, 5 mg/L de biotina, 12.5 mL/L de PMTi) en 0.6 g/h por 32-40 horas. El cultivo se cosecha mediante centrifugación.

Se hacen cultivos en biorreactor (3 L) en biorreactores de vidrio de 3 L (Applikon, Foster City, CA) y 15 L (Applikon, Foster City, CA) y un biorreactor de acero inoxidable de 40 L (Applikon, Foster City, CA) en lugar de vapor. Se preparan cultivos de siembra inoculando medio BMGY directamente con viales de repuesto congelados a una relación volumétrica de 1%. Los matraces de siembra se incuban a 24°C por 48 horas hasta obtener una densidad óptica (D06oo) de 20±5 que asegure que las células estén creciendo exponencialmente tras la transferencia. El medio de cultivo contenía 40 g de glicerol, 18.2 g de sorbitol, 2.3 g de K2HP04, 11.9 g de KH2P04, 10 g de extracto de levadura (BD, Franklin Lakes, NJ), 20 g de peptona (BD, Franklin Lakes, NJ), 4 x 10 3 g de biotina y 13.4 g de base nitrogenada de levadura (BD, Franklin Lakes, NJ) por litro. El biorreactor se inocula con una relación volumétrica de 10% de siembra a medio inicial. Los cultivos se hacen en modo intermitente bajo las siguientes condiciones: ajuste de temperatura a 24+0.5°C, pH controlado a 6.5±0.1 con NH4OH, y se mantuvo el oxígeno disuelto a 1.7±0.1 mg/L mediante velocidad de agitación en cascada tras la adición de 02. El régimen de flujo de aire se mantiene a 0.7 vvm. Después de la depleción del glicerol de la carga inicial (40 g/L), se suministra exponencialmente una solución de glicerol a 50% que contiene 12.5 mL/L de sales de PTM1 a 50% de la velocidad de crecimiento máxima por ocho horas hasta que se alcanzan 250 g/L de peso húmedo de células. Se inicia la inducción después de una fase de inanición de 30 minutos cuando se suministró exponencialmente metanol para mantener una velocidad de crecimiento especifica de 0.01 h-1. Cuando se alcanza un régimen de absorción de oxígeno de 150 mM/L/h, el régimen de suministro de metanol se mantiene constante para evitar la limitación de oxígeno. El cultivo se cosecha mediante centrifugación.

Después de clarificación por centrifugación y microfiltración, el filtrado se concentra 10X mediante ultrafiltración, y la proteína rhEPO se purifica a través de una secuencia de dos pasos de cromatografía usando una cromatografía de afinidad por colorante azul y una cromatografía de hidroxiapatita.

Se realiza clarificación primaria mediante centrifugación. El caldo de células enteras se transfiere en tubos de centrífuga de 1 ,000 ml_, y se centrifuga a 4°C por 15 minutos a 13,000 x g. Puede usarse un paso de ultrafiltración para fermentadores más grandes (10 L a 40 L y más grandes). Este paso puede realizarse usando hojas planas Sartorious con un tamaño de poro de 10K hasta una concentración de cinco veces.

Se realiza un paso de captura usando cromatografía de flujo rápido Blue SEPHAROSE 6 (pseudo-afinidad). Una columna de flujo rápido (FF) de SEPHAROSE 6 (GE Healthcare) se equilibra con MOPS 50 mM, pH 7.0. El sobrenadante de cultivo se ajusta con NaCI 100 mM y se hace pasar a través de un filtro de extremo cerrado (Whatman, Polycap TC) antes de la carga a la columna. El tiempo de residencia se mantiene hasta aproximadamente 10 minutos con un lavado de 3 volúmenes de columna (CV) después de la carga. La elución es elución de 4 CV con NaCI 1 M en MOPS 50 mM, pH 7.0. La EPO se eluye a la concentración de NaCI 1 M.

Se realiza un paso intermediario usando cromatografía de hidroxiapatita (HA). Se usa una cerámica Macro-prep de hidroxiapatita tipo I de 40 pm (Bio-Rad) después del paso de captura. Esta columna se equilibra con solución de equilibrio: MOPS 50 mM, pH 7.0 conteniendo NaCI 1 M y CaC 10 mM. Se añade CaCI2 a aproximadamente 10 mM a la rhEPO reunida de la columna azul antes de la carga. El lavado de la columna se ejecuta con 3 CV de solución de equilibrio, seguida de un paso de elución de 10 CV en fosfato de sodio 12.5 mM en MOPS pH 7.0, para proveer el grupo 1 de HA que contiene rhEPO.

Puede usarse un paso de cromatografía de intercambio catiónico para purificar adicionalmente la rhEPO. La muestra reunida después del paso de cromatografía de hidroxiapatita (por ejemplo, grupo 1 de HA), es dializado contra acetato de sodio 50 mM, pH 5.0 durante la noche a 4°C y una columna Source 30S o columna de intercambio catiónico Poros (GE Healthcare) es equilibrada con el mismo regulador de pH. La muestra dializada se aplica a la columna, y se aplica un gradiente lineal de 10 CV de NaCI 0 a 750 mM con rhEPO eluyendo entre NaCI 350 a 500 mM, para proveer la rhEPO.

El extremo N-terminal de la molécula de rhEPO purificada puede conjugarse con polietilenglicol (PEG) lineal de 40 kDa mediante aminación reductiva (PEGilación). El PEG activado se añade a la muestra de rhEPO (concentración de aproximadamente 1 mg/mL) en regulador de pH de acetato de sodio 50 mM a pH 5.2 a una relación de proteína:PEG de 1 :10. La reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones reductoras añadiendo cianoborohidruro de sodio 10 mM a la mezcla de reacción con agitación durante la noche. La reacción se detiene añadiendo Tris 10 mM, pH 6.0.

El producto de rhEPO mono-PEGilada se purifica usando un paso de cromatografía de intercambio catiónico antes de la diafiltración en el regulador de pH de la formulación final (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 120 mM, polisorbato 20 a 0.005% (en p/v), pH 7.0).

El producto final se diluye a una concentración adecuada para llenado, y se filtra estéril en el contenedor de almacenamiento de la sustancia de fármaco. La rhEPO PEGilada puede almacenarse a 2 a 8°C hasta llenado, tiempo en el cual se vierte asépticamente en viales de vidrio que se sellan entonces con un tapón de caucho y tapa de aluminio.

Formulaciones comerciales de proteínas se conocen y pueden usarse. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, solución de ARANESP®: polisorbato: cada mL contiene 0.05 mg de polisorbato 80, y se formula a pH 6.2 ± 0.2 con 2.12 mg de monohidrato monobásico de fosfato de sodio, 0.66 mg de fosfato de sodio dibásico anhidro, y 8.18 mg de cloruro de sodio en agua para inyección, USP (a 1 mL). Solución de albúmina: Cada mL contiene 2.5 mg de albúmina (humana), y se formula a pH 6.0 ± 0.3 con 2.23 mg de monohidrato monobásico de fosfato de sodio, 0.53 mg de fosfato de sodio dibásico anhidro, y 8.18 mg de cloruro de sodio en agua para inyección USP (a 1 mL). Se formula EPOGEN® como un líquido incoloro estéril en una solución isotónica regulada en su pH de citrato de sodio/cloruro de sodio o una solución de fosfato de sodio/cloruro de sodio regulada en su pH, para administración intravenosa (IV) o subcutánea (SC). Vial de una sola dosis libre de conservador: cada mL de solución contiene 2000, 3000, 4000 ó 10,000 unidades de Epoetín alfa, 2.5 mg de albúmina (humana), 5.8 mg de citrato de sodio, 5.8 mg de cloruro de sodio y 0.06 mg de ácido cítrico en agua para inyección, USP (pH 6.9 ± 0.3). Esta formulación no contiene conservador. Los viales conservados contienen alcohol bencílico a 1 %.

EJEMPLO 5 Los métodos usados para analizar la presencia o ausencia de antígenos de la célula hospedera (HCA), incluyeron análisis Western blot y prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) en sandwich.

Se prepararon anticuerpos de antígenos de células hospederas (HCA) en conejos, usando el sobrenadante de cultivos de la cepa NORF. La cepa NORF es genéticamente igual a YGLY3159, salvo que carece del ORF que codifica para la EPO humana madura. El sobrenadante de fermentación de la cepa NORF preparado en adyuvante completo de Freund se inyectó en conejos, el cual se refuerza entonces tres veces con el sobrenadante de fermentación preparado en adyuvante incompleto de Freund. Después de 45 días se sangró a los conejos, y se prepararon anticuerpos policlonales para HCA usando métodos estándar, por ejemplo, IgG 9161 F072208-S policlonal de conejo, la cual era proteína A purificada SLr, y GiF2 policlonal de conejo:: 6316 suero entero de conejo. El anticuerpo GiF2 no era proteína A purificada.

Se realizaron Western blots para detectar HCA de P. pastoris, como sigue. Muestras que contenían rhEPO PEGilada o no PEGilada purificada fueron reducidas en regulador de pH de carga de muestras, de las cuales se aplicó entonces 1 µ?_ a las cavidades de geles de poliacrilamida-SDS a 4 a 20%, Tris-HCI (SDS-PAGE a 4 a 20%) (Bio RAD), y sometidas a electroforesis a 150V por aproximadamente 60 minutos. Las proteínas resultas fueron electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa a 00V por aproximadamente 60 minutos. Después de la transferencia, las membranas fueron bloqueadas por una hora con solución de bloqueo a 1 % (Roche Diagnostics). Después del bloqueo, las membranas fueron sondeadas con el anticuerpo policlonal anti-HCA de conejo (anticuerpo primario) diluido 1 :3000. Después, las membranas se lavaron y la detección del anticuerpo anti-HCA de conejo fue con el anticuerpo secundario, IgG anti-conejo de cabra (H+L) (Pierce #31460, lote # H51015156) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), a una dilución 1 :5000. Después del lavado de las membranas, se hizo la detección del anticuerpo secundario unido usando 3,3' diaminobencidina (DAB). Para la detección de la proteína EPO, el anticuerpo primario fue anticuerpo conjugado con HRP EPO (B-4) usado a una dilución 1 :1000 (SC5290 lote # A0507, Santa Cruz Biotechnology). No se usó un anticuerpo secundario. Habitualmente, las muestras de EPO se sometieron a electroforesis en paralelo con muestras de rhEPO que habían sido desglucosiladas mediante tratamiento con PNGasa F. La desglucosilación se realizó con muestras de 50 pL a las cuales se añadió 1 pL de enzima PNGasa F a 500 unidades/pL. Después de incubación a 37°C por dos horas, las muestras fueron reducidas en el regulador de pH de carga de muestras, y se removieron alícuotas de 1 pL y se aplicaron a los geles de SDS como se hizo anteriormente.

Las pruebas de ELISA en sandwich para la detección de HCA de P. pastoris, se realizaron como sigue. Las cavidades de placas de ELISA de 96 cavidades fueron recubiertas con 1 pg/cavidad de anticuerpo monoclonal anti-hEPO de ratón. Las cavidades fueron bloqueadas entonces por 30 minutos con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Se añadieron a las cavidades aproximadamente 100 pL de muestras que contenían rhEPO no PEGilada purificada concentrada a aproximadamente 200 ng/mL. La detección primaria usó el anticuerpo policlonal anti-HCA de conejo a una dilución de partida de 1 :800 en PBS, la cual fue entonces diluida en serie 1 :1 en PBS a través de una hilera que termina con la onceava cavidad a una dilución 1 :819,200. La doceava cavidad sirvió como un control negativo. El estándar para la ELISA fue rhEPO purificada de YGLY3 59. Después de 60 minutos, las cavidades se lavaron con PBS tres veces. La detección del anticuerpo anti-HCA de conejo usó anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) a una dilución 1 :10,000 en PBS. Después de 60 minutos, las cavidades se lavaron tres veces con PBS, y la detección del anticuerpo secundario unido usó fosfato de 4-metilumbeliferilo (4-MUPS). Las placas de ELISA se leyeron usando un lector de microplacas de detección múltiple Tecan Genios a una longitud de onda de excitación de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

EJEMPLO 6 Este ejemplo muestra que YGLY3159 produce rhEPO con actividad de entrelazamiento (CBA) con anticuerpos anti-HCA, y que la actividad de entrelazamiento se debió a la presencia de residuos de ß-1 ,2-manosa (resistentes a a-1 ,2-manosidasa) en por lo menos una porción de los N-glucanos en la rhEPO, aún cuando la rhEPO se había producido en la cepa en la cual el gen BMT2 de ß-1 ,2-manosiltransferasa había sido deletado o perturbado.

Se recuperó rhEPO mediante una separación cromatográfica de tres pasos del sobrenadante de fermentación de la cepa de producción YGLY3159 de P. pastoris glucodiseñada que mostró aproximadamente 95% de pureza de la proteína, según se determinó mediante SDS-PAGE, RP-CLAR y SEC-CLAR. Se separó la rhEPO mono-PEGilada mediante un paso cromatográfico de intercambio catiónico de sus conjugados hiperPEGilados y no PEGilados con aproximadamente 96% de pureza, según se determinó mediante gel de SDS-PAGE. Sin embargo, el anticuerpo contra HCA de la cepa YGLY3159 detectó una glucoproteína en preparaciones de rhEPO producidas de la cepa, que co-emigró con la rhEPO en los Western blots. La figura 22 muestra que el anticuerpo anti-HCA identificó una proteína que coemigra con la rhEPO sobre geles de SDS-PAGE a 4 a 20%. La remoción del ácido siálico de la rhEPO no suprimió la actividad de entrelazamiento; sin embargo, la remoción del N-glucano entero de la rhEPO usando PNGasa F produjo una forma desglucosilada de rhEPO que no fue detectable en los Western blots sondeados con el anticuerpo anti-HCA. Esto se muestra en la figura 23, que muestra que sólo la forma desglucosilada de la rhEPO careció de actividad de entrelazamiento con el anticuerpo anti-HCA.

Para determinar si la actividad de entrelazamiento era específica de la rhEPO o podía identificarse en preparaciones purificadas de glucoproteínas de otras cepas de P. pastoris recombinantes, las glucoproteínas producidas en otras cepas se aislaron, se resolvieron mediante geles de SDS-PAGE a 4 a 20%, y los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. En el caso de un anticuerpo entero recombinante de humano (rhlgG) producido en una P. pastoris recombinante, se detectó actividad de entrelazamiento en preparaciones de proteínas producidas en P. pastoris de tipo silvestre (hipermanosiladas de la región N- y O-glucosilada), y en una cepa GS2.0 recombinante que produce predominantemente N-glucanos Man5GlcNAc2, pero contenía también N-glucanos Man9GlcNAc2 detectables que eran resistentes a a-1 ,2-manosidasa (figura 24, flecha). Sin embargo, las preparaciones de rhlgG de P. pastoris de tipo silvestre contenían actividad de entrelazamiento con un peso molecular aparente mayor que el de la rhlgG, sugiriendo que las preparaciones contenían glucoproteinas contaminantes de la célula hospedera. La actividad de entrelazamiento no fue removida por la digestión con PNGasa F (encerrada en un círculo en la figura 24).

La figura 25 muestra que la rhEPO glucosilada producida en YGLY3159 tuvo actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA, pero que la fetuina humana, asialofetuína humana, albúmina de suero humano (HSA) y LEUKINE (un factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos humanos recombinante (rhu GM-CSF) producido en S. cerevisiae), no tuvieron actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. Las fetuínas son glucoproteinas de la sangre altamente glucosiladas que se producen en el hígado y se secretan en el torrente sanguíneo. Pertenecen a un gran grupo de proteínas de unión que median el transporte y la disponibilidad de una amplia gama de sustancias de carga en el torrente sanguíneo. El representante mejor conocido de estas proteínas portadoras es la albúmina de suero, la proteína más abundante en el plasma sanguíneo de los animales adultos. La fetuina es más abundante en la sangre fetal, de ahí el nombre de "fetuina" (del latín, feto). El suero de ternera fetal contiene más fetuina que albúmina, mientras que el suero del adulto contiene más albúmina que fetuina. Las asialofetuinas son fetuínas de las cuales el ácido siálico terminal de los N- y O-glucanos es removido mediante hidrólisis leve o tratamiento con neuraminidasa. Actualmente, no existen reportes de mañosas ß-enlazadas en S. cerevisiae. La HSA no es una proteína glucosilada.

Los datos a escala de laboratorio demostraron que la purificación del paso cromatográfico intermediario de la rhEPO a partir del grupo de captura de Blue SEPHAROSE 6 FF usando resina de hidroxiapatita (HA) tipo I de 40 µ?t?, puede separar la rhEPO que tiene actividad de entrelazamiento casi indetectable (grupo 1 de HA) de la rhEPO que tuvo N-glucanos del tipo de alto contenido de mañosa (grupos 2 y 3 de HA). El grupo 1 de HA contenía aproximadamente 90.40% de N-glucanos bi-sialilados (la forma deseada de N-glucano), y menos de 3.5% de N-glucanos neutros. En contraste, una elución de gradiente lineal de fosfato de sodio 0 a 100 mM mostró que las fracciones de elución posteriores (grupos 2 y 3 de HA) contenían N-glucanos del tipo de alto contenido de mañosa y actividad de entrelazamiento incrementada con anticuerpos anti-HCA en Western blots. Esto puede verse en el análisis de N-glucanos por CLAR y Western blots, de geles de SDS-PAGE a 4 a 20% mostrados en la figura 26 y el cuadro A.

Se pusieron a prueba también resinas de intercambio aniónico Q SEPHAROSE FF o Source 30Q usando cromatografía en columna aniónica. Los grupos 1 a 3 de HA se combinaron y se dializaron contra acetato de sodio 50 mM, pH 5.0 durante la noche a 4°C. La muestra dializada se aplicó a la columna, y se aplicó un gradiente lineal de 10 CV de NaCI 0 a 750 mM con rhEPO eluyendo entre NaCI 350 a 500 mM, para proveer la rhEPO. La figura 27A muestra un ejemplo de una purificación de rhEPO por Q SEPHAROSE FF. Los datos mostraron que los glucanos del tipo de alto contenido de mañosa (Man6,7,8,9 >9, principalmente resistentes a a ,2manosidasa) que muestran actividad de entrelazamiento correspondientemente mayor, no se unieron a las resinas de intercambio aniónico cuando se analizó el material unido y no unido en una ELISA en sandwich (figura 27B y cuadro B). El cuadro 1 muestra los resultados del análisis por CLAR del contenido de N-glucanos de la rhEPO en la fracción unida (grupo 1 de Q SEPHAROSE FF) y la fracción de flujo pasante (flujo pasante de Q SEPHAROSE FF). El cuadro 2 muestra el contenido de N-glucanos de los N-glucanos neutros mostrados en el cuadro 1.

CUADR0 1 CUADRO 2 Las figuras y los cuadros muestran que la rhEPO con actividad de entrelazamiento no detectable con anticuerpos anti-HCA y buena calidad de proteínas y glucanos, puede ser unida/eluida por lo tanto de las resinas de intercambio aniónico. Estos datos sugieren también que la familia de genes de hongos implicada en la biosíntesis de oligomanósidos p-1 ,2-enlazados {BMT1, BMT2, BMT3, BMT4), fue responsable del bajo nivel de impurezas del entrelazamiento en las preparaciones de rhEPO.

Por lo tanto, cuando se observan como un todo, los resultados sugirieron que la actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA no fue específica para la rhEPO, pero se debió a los N-glucanos resistentes a la a-1 ,2-manosidasa en las glucoproteínas. Se había generado YGLY3159 bloqueando la expresión de cinco genes de glucosilación endógenos, e introduciendo 15 genes heterólogos. YGLY3159 es una cepa con expresión bloqueada de bmt2A. Los estudios de microscopía de MN sugieren que las cepas con expresión bloqueada de bmt2A pueden producir glucoproteínas con cantidades variables de N-glucanos de p-1 ,2-manosa residuales. Puesto que YGLY3159 es bmt2A, se postuló que BMT1 y BMT3 fueron responsables del bajo nivel de transferencia de la -1 ,2-manosa residual en los N-glucanos centrales.

Mientras que una combinación de los pasos de cromatografía para purificar la rhEPO puede producir preparaciones de rhEPO libres de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, sería particularmente deseable modificar genéticamente las cepas hospederas de P. pastoris para reducir o eliminar la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA en estas cepas. Esto reduce al mínimo el riesgo de contaminación posible de las preparaciones de rhEPO con actividad de entrelazamiento, debido a la variabilidad durante la purificación. Además, debido a que cada paso de purificación puede resultar en una pérdida de rhEPO, las cepas de P. pastoris genéticamente modificadas pueden reducir el número de pasos de purificación, y pueden reducir de esta manera la cantidad de rhEPO perdida durante los pasos eliminados. Por lo tanto, la expresión de los cuatro genes BMT fue deletada o perturbada en serie para identificar las cepas que no produjeron actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA.

EJEMPLO 7 Para reducir la presencia de N-glucanos del tipo de mañosa ß-enlazada hasta niveles no detectables, los genes BMT1 y BMT4 fueron perturbados, y la rhEPO se analizó para la presencia de N-glucanos resistentes a a-1 ,2-manosidasa.

Las cepas YGLY6661 e YGLY70 3 se construyeron como se describió en el ejemplo 2, y se analizaron para la presencia de N-glucanos resistentes a a-1 ,2-manosidasa usando anticuerpos anti-HCA. La cepa YGLY7013 era bmt2A y bmt4A, y la cepa YGLY6661 era bmt2A, bmt4A y bmtIA. La rhEPO producida de las cepas se sometió a cromatografía Blue SEPHAROSE 6FF, y se trataron alícuotas del grupo de captura de Blue SEPHAROSE 6FF con PNGasa F a velocidad cero. Las alícuotas tratadas y no tratadas se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE, los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y las membranas se sondearon con anticuerpo anti-EPO o anticuerpos anti-HCA. La figura 28 muestra en Western blots de geles de SDS-PAGE a 4 a 20% de alícuotas de los grupos de captura de Blue SEPHAROSE 6 FF, que la rhEPO producida en cualquier cepa tenía aún N-glucanos resistentes a a-1 ,2-manosidasa que reaccionaron en forma cruzada con los anticuerpos anti-HCA. Los cuadros 3 y 4 muestran la distribución de las especies de N-glucanos en la rhEPO en los grupos de captura de Blue Sepharose 6 FF de cultivos de fermentación y SixFors. Como se muestra en los cuadros, ambas cepas produjeron una cantidad sustancial de N-glucanos neutros de los cuales una porción era resistente a la digestión con a1 ,2-manosidasa in vitro.

CUADRO 3 CUADRO 4 Una ELISA en sandwich de la rhEPO en los grupos de captura de Blue SEPHAROSE 6 FF obtenidos de ambas cepas, en comparación con YGLY3159, mostró que ambas cepas tenían actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA (figura 29 y cuadro C). Más purificación de la rhEPO mediante cromatografía de hidroxiapatita (HA) y el análisis de las muestras mediante ELISA en sandwich, mostró que el grupo 1 de HA que contenía la rhEPO producida de YGLY6661 (bmt2A, bmt4A y bmtIA), pareció carecer de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, pero que la rhEPO producida en YGLY7013 (bmt2A y bmt4A) tenía aún actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA (figura 30 y cuadro D). Los resultados sugirieron que la deleción de los genes BMT2 y BMT1 no fue suficiente para remover toda la actividad de entrelazamiento detectable. Los resultados muestran también que la cromatografía de hidroxiapatita puede remover la actividad de entrelazamiento detectable en el grupo 1 de HA. La figura 31 es un Western blot de geles de SDS-PAGE a 4 a 20% que muestra que la rhEPO en otro grupo de captura de Blue SEPHAROSE 6 FF preparada de la cepa YGLY6661 , continuó teniendo actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA, y que la actividad de entrelazamiento pudo hacerse aún que fuese indetectable desglucosilando la rhEPO. Los resultados indicaron que para producir rhEPO que no tuviera actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA, la expresión del gen BMT3 necesitaba ser anulada por perturbación o deleción.

EJEMPLO 8 Para lograr más efectivamente la eliminación de los glucanos del tipo de mañosa ß-enlazada detectables, los cuatro genes BMT implicados en la vía de manosiltransferasa fueron perturbados. Se evaluaron las cepas YGLY7361-7366 e YGLY7393-7398 (ejemplo 2) para la capacidad para producir rhEPO que careciera de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA.

Varias cepas de YGLY7361-7366 e YGLY7393-7398 en las cuales los cuatro genes BMT implicados en la vía de ß-manosiltransferasa fueron perturbados, se cultivaron en termentadores SixFors de 500 mL, y se procesaron entonces para rhEPO a través de los grupos Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules). Alícuotas de los grupos azules se analizaron mediante SDS-PAGE a 4 a 20%. La figura 32 muestra geles de SDS-PAGE a 4 a 20% teñidos con azul de Coomassie, de los grupos azules de las varias cepas con y sin tratamiento con PNGasa F. Los geles muestran que todas las cepas puestas a pruebas produjeron rhEPO glucosilada. Varias de las cepas se evaluaron para actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA mediante ELISA en sandwich. La figura 33 y el cuadro E muestran que la mayoría de las cepas carecían de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. Sin embargo, las cepas YGLY7363 e YGLY7365 tuvieron actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. La reconfirmación de YGLY7365 mediante PCR, indicó que esta cepa no exhibía expresión bloqueada completa del gen BMT3, explicando la unión relativamente alta observada con el anticuerpo anti-HCA presente en la ELISA (figura 33 y cuadro E). El análisis de N-glucanos mediante CLAR de las cepas YGLY7361-7366 se muestra en el cuadro 5, y las cepas YGLY7393-7398 se muestran en el cuadro 6. Los datos en los cuadros se muestran gráficamente en la figura 34.

CUADRO 5 CUADRO 5 (CONTINUACIÓN) CUADRO 6 CUADRO 6 (CONTINUACIÓN) Las cepas YGLY7362, 7366, 7396 y 7398 se cultivaron en termentadores de 3 L, y se procesaron a través de cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF seguida de cromatografía de hidroxiapatita (HA). Alícuotas de los grupos azules y los grupos de HA fueron reducidas y analizadas mediante SDS-PAGE a 4 a 20%. Se incluyeron grupos correspondientes para YGLY3159 como controles positivos. La figura 35A muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie que muestra que los grupos azules (mitad izquierda del gel) y los grupos de HA (mitad derecha del gel) produjeron rhEPO. La figura 35B muestra un Western blot de las mismas muestras sondeadas con anticuerpos anti-HCA. Ninguna de las cepas puestas a prueba tuvo actividad de entrelazamiento detectable alguna con anticuerpos anti-HCA en el grupo azul o el grupo 1 de HA.

La figura 36 analiza el grupo azul y el grupo 1 de HA para la rhEPO aislada de cultivos SixFors de 500 mL de YGLY7398 para actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. El panel más a la derecha muestra un Western blot sondeado con otra preparación de anti-HCA: GiF2 policlonal de conejo: :6316. Este anticuerpo dio los mismos resultados que se obtuvieron usando el anticuerpo F072208-S, el cual se había usado para realizar las pruebas de ELISA y los Western blots mostrados en la presente. El anticuerpo 6316 muestra que la actividad de entrelazamiento no es específica del anticuerpo.

Estos resultados muestran que la deleción o perturbación de los cuatro genes BMT puede resultar en cepas que no producen actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA en la rhEPO después del paso de captura preliminar de Blue SEPHAROSE 6 FF o el paso intermediario de hidroxiapatita usando hidroxiapatita 40 µ? tipo I. Estas cepas reducen al mínimo el riesgo de que se produzcan preparaciones de rhEPO que contengan actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. Esto permite la producción de rhEPO con menos riesgo de que se induzca una respuesta inmune adversa en el individuo que recibe la rhEPO.

EJEMPLO 9 Se hizo una comparación de la farmacocinética de la rhEPO producida en las cepas producidas en el ejemplo 2 con los cuatro genes BMT perturbados o deletados y PEGilados, con la rhEPO PEGilada producida de la cepa YGLY3159. La comparación mostró que la EPO PEGilada tuvo una vida media in vivo reducida y menor potencia in vivo (véase los cuadros 7 y 8). La rhEPO producida en las cepas producidas en el ejemplo 2 sin actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA tuvo farmacocinética generalmente similar a la de EPOGEN, y no la farmacocinética mayor de ARANESP. Se encontró que la farmacocinética reducida, es una función de la cantidad de IM-glucanos biantenarios bi-sialilados. Los mayores niveles de N-glucanos biantenarios bi-sialilados en la rhEPO, se correlacionaron con una mayor farmacocinética. Estos resultados son consistentes con los datos publicados, que muestran que una vida media más larga se correlaciona con un mayor contenido de ácido siálico en la eritropoyetina humana recombinante producida en células CHO (Egrie er a/., Exp. Hematol. 31 : 290-299 (2003)).

CUADRO 7 EJEMPLO 10 Para lograr efectivamente la eliminación de los glucanos detectables tipo mañosa ß-enlazada y producir una cepa que produzca rhEPO con mayor farmacocinética, las cepas YGLY71 13-7122 descritas en el ejemplo 3 se obtuvieron y se evaluaron por su capacidad para producir rhEPO que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. Estas cepas fueron modificadas para expresar también EPO humana madura como una proteína de fusión fusionada con la secuencia guía de lisozima de pollo. De esta manera, estas cepas expresan la EPO humana madura fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae, y la EPO humana madura como una proteína de fusión fusionada con la secuencia guía de lisozima de pollo.

Varias cepas YGLY71 13-YGLY7122 en las cuales los cuatro genes BMT implicados en la vía de ß-manosiltransferasa fueron perturbados se cultivaron en termentadores SixFors de 500 ml_, y se procesaron entonces para rhEPO a través de grupos Blue SEPHAROSE 6 FF (grupos azules). Alícuotas de los grupos azules para varias cepas se analizaron mediante ELISA en sandwich usando anticuerpos anti-HCA. La figura 37 y el cuadro F muestran que la cepa YGLY7118 tuvo actividad de entrelazamiento muy baja con anticuerpos anti-HCA, pero las demás cepas no mostraron actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA. El análisis de los N-glucanos por CLAR de las cepas YGLY7113-7117 se muestra en el cuadro 9, y las cepas YGLY71 18-7122 se muestran en el cuadro 10. Los cuadros se presentan gráficamente en la figura 38.

CUADRO 9 CUADRO 9 (CONTINUACIÓN) CUADRO 10 CUADRO 10 (CONTINUACIÓN) X074822 (YGLY 7122) 55.77 24.44 19.79 1.8 17.28 ND ND 0.71 a1 ,2 manosidasa X074824 55.56 21.47 22.97 0.33 2.98 1 1.85 6.59 1.22 (YGLY 71 18) X074824 (YGLY 71 18) 54.68 21.67 23.65 0.4 22.5 ND ND 0.75 a1 ,2 manosidasa G2 - N-glucanos Ga 2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glucanos Man6GlcNAc2 a Man8GlcNAc2 M9 - N-glucanos Man9GlcNAc2 9+ - N-glucanos Man9GlcNAc2 y más largos Hyb - N-glucanos híbridos Las cepas YGLY7115, 7117 y7120 se cultivaron en fermentadores de 3 L, y se procesaron a través de cromatografía Blue SEPHAROSE 6 FF seguida de cromatografía de hidroxiapatita (HA). Alícuotas de los grupos azules y los grupos de HA fueron reducidas y analizadas mediante SDS-PAGE a 4 a 20%. Se incluyeron grupos correspondientes para YGLY3159 como controles positivos. Se incluyeron grupos correspondientes para YGLY7395 como controles negativos. La figura 39A muestra un gel de SDS-PAGE a 4 a 20% teñido con azul de Coomassie que muestra que los grupos azules (mitad izquierda del gel) y los grupos de HA (mitad derecha del gel) produjeron rhEPO. La figura 39B muestra un Western blot de las mismas muestras sondeadas con anticuerpos anti-HCA. Ninguna de las cepas puestas a prueba tuvo actividad de entrelazamiento detectable alguna con anticuerpos anti-HCA en el grupo azul o el grupo 1 de HA.

Estos resultados muestran también que la deleción o perturbación de los cuatro genes BMT puede resultar en cepas que no producen actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos anti-HCA en la rhEPO después del paso de captura preliminar de Blue SEPHAROSE 6 FF o el paso intermediario de hidroxiapatita usando hidroxiapatita 40 µ? tipo I. Estas cepas reducen al mínimo el riesgo de que se produzcan preparaciones de rhEPO que contengan actividad de entrelazamiento con anticuerpos anti-HCA. Esto permite la producción de rhEPO con menos riesgo de que se induzca una respuesta inmune adversa en el individuo que recibe la rhEPO.

EJEMPLO 11 Los grupos azules que contenían la rhEPO producida por la cepa YGLY7117, se sometieron adicionalmente a cromatografía en columna de hidroxiapatita, y la rhEPO en los grupos de HA se analizó para contenido de sialilación. La figura 40A y el cuadro G y la figura 40B y el cuadro H muestran trazos por CLAR de los N-glucanos de la rhEPO producida en la cepa YGLY3159, en comparación con los N-glucanos de la rhEPO producida en la cepa YGLY7117, respectivamente. Las figuras muestran también que la columna de hidroxiapatita removió contaminantes adicionales; de esta manera, en este análisis el contenido de sialilación de la rhEPO producida por la cepa YGLY7 17 fue de aproximadamente 99% (los N-glucanos neutros fueron aproximadamente 1%), de los cuales aproximadamente 89% fue A2 o bi-sialilados y aproximadamente 10% fue A1 o mono-sialilados.

El análisis de la sialilación de la rhEPO producida en la cepa YGLY7117 después de la PEGilación de acuerdo con el procedimiento en el ejemplo 3, fue similar a la cantidad de sialilación antes de la PEGilación; sin embargo, la cantidad de sialilación puede variar a un grado limitado dependiendo, por ejemplo, de qué modificaciones se hicieron a las condiciones de crecimiento, por ejemplo, composiciones del medio, régimen de alimentación, etc. (véase el cuadro 11). De esta manera, los métodos de la presente producen composiciones de rhEPO que tienen por lo menos aproximadamente 75% de sialilación de A2 o entre aproximadamente 75 y 89% de sialilacion de A2. De esta manera, el contenido de ácido siálico total es de por lo menos 4.5 moles de ácido siálico por mol de rhEPO, más específicamente, de aproximadamente 4.6 a 5.7 moles de ácido siálico por mol de rhEPO.

CUADRO 11 Se hizo una comparación de la farmacocinética de la rhEPO producida en la cepa YGLY71 17 producida en el ejemplo 3, con los cuatro genes BMT perturbados o deletados y PEGilados con la rhEPO PEGilada producida de la cepa YGLY3159. La comparación mostró que la rhEPO PEGilada producida en la cepa YGLY7117 tuvo una vida media in vivo y potencia in vivo similar a la de la cepa YGLY3159 y ARANESP (véase los cuadros 12 y 13).

CUADRO 12 CUADR0 13 Secuencias Las secuencias que se usaron para producir algunas de las cepas descritas en los ejemplos 1 a 11 , se proveen en el cuadro 14.

Manll de TTGATGTCCAGATGTTGGAGTTGTACGATAGAATGTCCTTCAAGG Drosophila ACATTGATGGTGGTGTTTGGAAGCAGGGTTGGAACATTAAGTAC melanogaster GATCCATTGAAGTACAACGCTCATCACAAGTTGAAGGTCTTCGTT GTCCCACACTCCCACAACGATCCTGGTTGGATTCAGACCTTCGAG optimizado en GAATACTACCAGCACGACACCAAGCACATCTTGTCCAACGCTTT codones (KD) GAGACAT1 GCACGACAACCCAGAGATGAAGTTCATCTGGGCTG AAATCTCCTAC1TCGCTAGATTCTACCACGATTTGGGTGAGAACA AGAAGTTGCAGATGAAGTCCATCGTCAAGAACGGTCAGTTGGAA TTCGTCACTGGTGGATGGGTCATGCCAGACGAGGCTAACTCCCA CTGGAGAAACGTTTTGTTGCAGTTGACCGAAGGTCAAACTTGGTT GAAGCAATTCATGAACGTCACTCCAACTGCTTCCTGGGCTATCGA TCCATTCGGACACTCTCCAACTATGCCATACATI TGCAGAAGTC TGGTTTCAAGAATATGTTGATCCAGAGAACCCACTACTCCGTTAA GAAGGAGTTGGCTCAACAGAGACAGTTGGAGTTCTTGTGGAGAC AGATCTGGGACAACAAAGGTGACACTGCTTTGTTCACCCACATG ATGCCATTCTACTCTTACGACATTCCTCATACCTGTGGTCCAGAT CCAAAGGTTTGTTGTCAGTTCGATTTCAAAAGAATGGGTTCCTTC GGTTTGTCTTGTCCATGGAAGGTTCCACCTAGAACTATCTCTGAT CAAAATGTTGCTGCTAGATCCGATTTGTTGGTTGATCAGTGGAAG AAGAAGGCTGAGTTGTACAGAACCAACGTCTTGTTGATTCCATTG GGTGACGACTTCAGATTCAAGCAGAACACCGAGTGGGATGTTCA GAGAGTCAACTACGAAAGATTGTTCGAACACATCAACTCTCAGG CTCÁCTTCAATGTCCAGGCTCAGTTCGGTACTTTGCAGGAATACT TCGATGCTGTTCACCAGGCTGAAAGAGCTGGACAAGCTGAGTTC CCAACCTTGTCTGGTGACTTCTTCACTTACGCTGATAGATCTGAT AACTACTGGTCTGGTTACTACACTTCCAGACCATACCATAAGAG AATGGACAGAGTCTTGATGCACTACGTTAGAGCTGCTGAAATGT TGTCCGCTTGGCACTCCTGGGACGGTATGGCTAGAATCGAGGAA AGATTGGAGCAGGCTAGAAGAGAGTTGTCCTTGTTCCAGCACCA CGACGGTATTACTGGTACTGCTAAAACTCACGTTGTCGTCGACTA CGAGCAAAGAATGCAGGAAGCTTTGAAAGCTTGTCAAATGGTCA TGCAACAGTCTGTCTACAGATTGTTGACTAAGCCATCCATCTACT CTCCAGACTTCTCCTTCTCCTACTTCACTTTGGACGACTCCAGAT GGCCAGGTTCTGGTGTTGAGGACTCTAGAACTACCATCATCTTGG GTGAGGATATCTTGCCATCCAAGCATGTTGTCATGCACAACACCT TGCCACACTGGAGAGAGCAGTTGGTTGACTTCTACGTCTCCTCTC CATTCGTTTCTGTTACCGACTTGGCTAACAATCCAGTTGAGGCTC AGGTTTCTCCAGTTTGGTCTTGGCACCACGACACTTTGACTAAGA CTATCCACCCACAAGGTTCCACCACCAAGTACAGAATCATCTTCA AGGCTAGAGTTCCACCAATGGGTTTGGCTACCTACGTTTTGACCA TCTCCGATTCCAAGCCAGAGCACACCTCCTACGCITCCAATTTGT TGCTTAGAAAGAACCCAACTTCCTTGCCATTGGGTCAATACCCAG AGGATGTCAAGTTCGGTGATCCAAGAGAGATCTCCTTGAGAGTT GGTAACGGTCCAACCTrGGCTTTCTCTGAGCAGGGTTTG'lTGAAG TCCATTCAGTTGACTCAGGATTCTCCACATGTTCCAG1 CAC1TC AAGTTCTTGAAGTACGGTGTTAGATCTCATGGTGATAGATCTGGT GCTTACTTGTTCTTGCCAAATGGTCCAGCTTCTCCAGTCGAGTTG GGTCAGCCAGTTGTCTTGGTCACTAAGGGTAAATTGGAGTCTTCC GTTTCTGTTOGTTTG G.G. A TGTGTGfiTTG A CC A G ACf] A TCATGAG A Mientras que la presente invención se describe en la presente con relación a modalidades ilustradas, debe entenderse que la invención no se limita a las mismas. Quienes tengan la aptitud ordinaria en la técnica y acceso a las enseñanzas de la presente, reconocerán modificaciones y modalidades adicionales dentro del alcance de la misma. Por lo tanto, la presente invención es limitada sólo por las reivindicaciones anexas a la misma.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una glucoproteína recombinante en Pichia pastoris que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende: (a) proveer una célula hospedera recombinante de Pichia pastoris que no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y no exhibe por lo menos una actividad seleccionada de actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína recombinante; (b) cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese la glucoproteína recombinante; y (c) recuperar la glucoproteína recombinante del medio para producir la glucoproteína recombinante que carece de actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera no exhibe actividad de ß-manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera no exhibe adicionalmente actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, se determina en una ELISA en sandwich.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, se determina en un Western blot.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la glucoproteina recombinante es una glucoproteína terapéutica.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la glucoproteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste de eritropoyetina (EPO); citocinas tales como ¡nterferón a, interferón ß, ¡nterferón ? e ¡nterferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM, inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocínasa; quimasa; e inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1 -antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasmínógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de cíclofilina; proteína 1 tipo glucagon; y agonista del receptor de IL-2.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera es genéticamente diseñada para que produzca glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera es genéticamente diseñada para que produzca glucoproteínas que tienen predominantemente un N-glucano seleccionado de MansGlcNAc2, GlcNAcMansGlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2, Gald^GIcNAc,!. 4)Man3GlcNAc2 y ANA(i.4)Gal(i^)GlcNAC(i-4)lv1an3GlcNAc2.

10. - Una composición que comprende una o más glucoproteínas recombinantes obtenidas mediante el método de la reivindicación 1.

1 1.- Un método para producir una eritropoyetina humana madura en Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, que comprende: (a) proveer una célula hospedera recombinante de Pichia pastoris genéticamente diseñada para producir N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no exhibe una actividad de ß-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glucano u O-glucano, y que no exhibe por lo menos una actividad seleccionada de una actividad de ß-manosiltransferasa 1 y una actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano y la cual incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando para una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido de señal que elige como objetivo el ER, y el cual es removido cuando la proteína de fusión está en el ER; (b) cultivar la célula hospedera en un medio bajo condiciones efectivas para que exprese y procese la primera y segunda proteínas de fusión; y (c) recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera.

12 - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la célula hospedera no exhibe actividad de ß- manosiltransferasa 2, actividad de ß-manosiltransferasa 1 y actividad de ß-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la célula hospedera no exhibe adicionalmente actividad de ß-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glucano u O-glucano.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el péptido de señal es un péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque por lo menos una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión, en donde la eritropoyetina es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae, y por lo menos una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión en donde la eritropoyetina es fusionada con el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae o un péptido de señal de lisozima de pollo.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque los codones de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica para la eritropoyetina, son optimizados para expresión en Pichia pastoris.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, se determina en una ELISA en sandwich.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, se determina en un Western blot.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antigenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de intercambio catiónico.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de hidroxiapatita.

21. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera del medio, incluye un paso de cromatografía de intercambio amónico.

22. - Una composición que comprende una eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico, y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera obtenidos del método de la reivindicación 18, y una sal farmacéuticamente aceptable.

23. - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glucanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de entrelazamiento detectable con anticuerpos producidos contra antígenos de la célula hospedera, es conjugada con un polímero hidrofilico.

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el polímero hidrofilico es un polímero de polietilenglicol.