CN104946675A - 一种鸡蛋清溶菌酶基因(rjm)的克隆及其酵母表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物基因工程领域，公开了一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，通过获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)、测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列、构建基因表达载体、鉴定基因表达载体、将酵母表达质粒转化入酵母细胞、诱导表达鸡蛋清溶菌酶及免疫印迹实验验证实现鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达。本发明可以高密度发酵酵母，大量表达鸡蛋清溶菌酶基因，由于酵母菌属于真核微生物，表达出的溶菌酶蛋白对其无杀伤作用，可有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌的杀伤，本发明属于分泌表达，易于获取目的蛋白，可简化操作步骤，与化学合成目的蛋白相比，本发明具有节约成本的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因的克隆及其酵母表达方法，尤其是一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，属于生物基因工程领域。
背景技术
溶菌酶(Lysozyme)是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，其也广泛存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞及其它体液(如淋巴液)和组织(如肝、肾)细胞内，其中蛋清中含量最丰富，多数商品溶菌酶是由蛋清中提取纯化的。鉴于抗生素的使用会带来畜禽产品药物残留、耐药基因转移等负面作用，近年来许多国家包括我国开始逐步限制使用饲用抗生素，因此研发新型、安全、高效的抗生素替代品迫在眉睫。溶菌酶因其优良的理化性质符合人们对食品安全性的需求，同时具有抗菌的活性，在新型添加剂产品研发中具有重要的地位。
鸡蛋清溶菌酶是使用和研究最广泛的一种，作为一种无毒、无副作用的天然蛋白质，在食品防腐、保鲜，医疗保健等方面己经成功应用，鸡蛋清溶菌酶的有效杀菌能力使其在替代抗生素、作为抗生素辅助制剂或者作为新型饲料添加剂等方面有着广阔的前景。过去，蛋清溶菌酶都是从鸡蛋清中提取，但因原料来源受限和含量较少，提取纯化过程步骤繁琐，产量低，成本高，无法大量获取。若采用化学合成方法成本昂贵，极大的限制了其在畜牧等低附加值行业中的应用。与此相比，若采用基因工程的方法来合成溶菌酶，则具有操作简单、成本廉价、重复性好、能大量获取、实现工业化生产的特点，有着广阔的市场应用前景。
利用基因工程的方法表达外源蛋白质目前主要有原核表达和真核表达两种主要的方式，原核表达是将外源基因转化到低等的原核微生物中进行表达，其步骤比较繁琐，而且通常表达的蛋白不能够进行正确的空间折叠而丧失活性，需要变性和复性处理；而真核表达系统能有效的避免上述问题，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来应用最广泛的一种甲醇营养型表达系统。
常用的酵母表达载体pPIZα-A,B,C为含有醇氧化酶(AOX)启动子的整合载体，基因中含有与酵母染色体区同源的序列，通过同源重组而将外源基因整合于酵母染色体中。这样的表达系统具有继代稳定，可以高密度发酵，在发酵过程中自身分泌的蛋白少，外源蛋白表达量高等优点，而且在其分泌表达溶菌酶时自身不受其杀菌活性的影响，还能保证溶菌酶分子的正确结构和适度的糖基化，从而保证其天然活性，是一种高效蛋白表达体系。目前，鸡蛋清溶菌酶(RJM)未见有酵母系统成功表达的报道。
发明内容
本发明的主要目的是为了解决上述方法中的缺陷，提供一种可以高密度发酵酵母、大量表达鸡蛋清溶菌酶基因、并可以有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌杀伤的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法。
本发明的目的是通过采用如下技术方案达到的：
一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，包括如下步骤：
步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)
利用Primer引物设计软件设计一对引物，合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶-F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶-R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；
步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列
将步骤1中经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定；
步骤3：构建基因表达载体
采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19-T-RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；
步骤4：鉴定基因表达载体
挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA-RJM；
步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞
挑取YPD平板上X33单菌落制备X33酵母感受态细胞，取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入X33感受态细胞并轻轻混匀，经电转化获得饱满的单克隆，挑取单克隆至3ml含100μg/ml zeocin的YPD培养基中，待重组菌长起来后，利用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，并对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定；
步骤6：诱导表达鸡蛋清溶菌酶
利用甲醇诱导X33酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶；
步骤7：免疫印迹实验验证
利用兔抗6×His血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤1中RT-PCR扩增的反转录反应体系为：
总计10μL样品经
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤1中PCR反应为：
向所述反转录反应结束后的反应管中再加入下列试剂：
总量为50μL，轻轻混匀后短暂离心，按以下条件进行PCR反应：
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤2中测定的序列结果如序列表3所示，鸡蛋清溶菌酶基因ORF碱基长度为357bp，编码118个氨基酸。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤3中的酶切反应体系为：
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤3中的连接体系为：
先将目的片段与pPICZαA载体片段混合均匀，45℃作用5min，短暂离心混匀后，16℃连接12h。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤5中电转化的工艺为：
挑取YPD平板上X33单菌落接种于20mlYPD培养基中，30℃，250rpm培养至OD＝1.3-1.5；4℃，1500g，离心5min，用10ml冷的无菌去离子水重悬细胞；4℃，1500g，离心5min，用5ml冷的无菌去离子水悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用1ml，1M预冷的山梨醇重悬细胞，移入1.5ml EP管中；接着用冷的无菌1M山梨醇清洗细胞两次；4℃，1500g，离心5min，用200ul，1M预冷的山梨醇重悬，获得的细胞即为X33酵母感受态细胞；分装，每80ul一管；
取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入90ul X33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷的电转杯，冰上静置5min，放入电转仪，电击，电压为1500V，电击时间为5.4ms；电击结束后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇和YPD等体积混合液，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止45min，每200μl均匀涂布至含100μg/ml zeocin的YPD平板；30℃，静置培养2d，直至长出分散，饱满的单克隆。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤5中对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定的鉴定结果如图3所示；PCR鉴定的参数：55℃退火30s，72℃延伸75s，30个循环，选用AOX1通用引物，1％琼脂糖凝胶电泳检测；采用AOX1通用引物扩增，阳性片段大小约为1000bp，如图3所示。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤6中鸡蛋清溶菌酶的高效表达的工艺为：
种子放大培养基为BMGY，诱导表达培养基为BMMY，接种量200μl，30℃，240rpm振荡培养至OD为3左右时开始诱导，甲醇诱导浓度1％，诱导温度28℃，转速240rpm，诱导时间72h，诱导后每隔12h补加甲醇至终浓度为0.5％，每隔一天取样；上清样品装入透析袋，利用聚乙二醇20000(PEG20000)进行浓缩，10倍浓缩后，取10ul进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为16％，考马斯亮蓝G250染色，脱色后进行观察，结果如图4所示。
作为一种优选的，所述一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，所述步骤7中免疫印迹实验验证的工艺为：
将6个RJM阳性转化子72小时的表达产物置于1.5mm聚丙烯酰胺凝胶中电泳，300mA，50min；转印至NC膜，显色后进行观察，结果如图5所示。
本发明的有益技术效果是：
本发明可以高密度发酵酵母，大量表达鸡蛋清溶菌酶基因；由于酵母菌属于真核微生物，表达出的溶菌酶蛋白对其无杀伤作用，可有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌的杀伤；本发明属于分泌表达，易于获取目的蛋白，可简化操作步骤；与化学合成目的蛋白相比，本发明具有节约成本的优点。
附图说明
图1和图2为本发明pPICZαA-RJM质粒的酶切鉴定结果图谱，其中：M为DNA Marker，1为质粒未酶切，2为质粒被XbaI和HindIII双酶切结果；
图3为本发明X33/pPICZαA-RJM溶菌酶的PCR鉴定结果图谱，其中：M：20000、10000、7000、5000、4000、3000、2000、1500、1000、700、500、400、300、200bp，阳性：pPICZαA-RJM质粒模板，阴性：无菌去离子水，R1-R6：转化子X33/pPICZαA-RJM 1-6；
图4为本发明X33/pPICZαA-RJM甲醇诱导表达SDS-PAGE图谱，其中：M为蛋白Marker，7条带分别为116.2、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4(KDa)，1-6泳道为溶菌酶阳性转化子1-6表达72小时的结果，7泳道为X33/pPICZαA空载体对照；
图5为本发明Western-blot检测结果图谱，其中：M为蛋白marker，分子量分别为120、85、50、35、25、20(KDa)；R1-R6泳道分别是鸡蛋清溶菌酶基因1-6阳性转化子Western-blot检测结果，R0为X33/pPICZαA空载体对照。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，包括如下步骤：
步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)
利用Primer引物设计软件设计一对引物，合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶-F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶-R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；
RT-PCR扩增的反转录反应体系为：
总计10μL样品经
PCR反应为：
向所述反转录反应结束后的反应管中再加入下列试剂：
总量为50μL，轻轻混匀后短暂离心，按以下条件进行PCR反应：
步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列
将步骤1中经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定，测定的序列结果如序列表3所示，鸡蛋清溶菌酶基因ORF碱基长度为357bp，编码118个氨基酸。
步骤3：构建基因表达载体
采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19-T-RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；
所述的酶切反应体系为：
所述的连接体系为：
先将目的片段与pPICZαA载体片段混合均匀，45℃作用5min，短暂离心混匀后，16℃连接12h。
步骤4：鉴定基因表达载体
挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA-RJM。
步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞
挑取YPD平板上X33单菌落制备X33酵母感受态细胞，取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入X33感受态细胞并轻轻混匀，经电转化获得饱满的单克隆，挑取单克隆至3ml含100μg/ml zeocin的YPD培养基中，待重组菌长起来后，利用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，并对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定；
所述电转化的工艺为：
挑取YPD平板上X33单菌落接种于20ml YPD培养基中，30℃，250rpm培养至OD＝1.3-1.5；4℃，1500g，离心5min，用10ml冷的无菌去离子水重悬细胞；4℃，1500g，离心5min，用5ml冷的无菌去离子水悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用1ml，1M预冷的山梨醇重悬细胞，移入1.5ml EP管中；接着用冷的无菌1M山梨醇清洗细胞两次；4℃，1500g，离心5min，用200ul，1M预冷的山梨醇重悬，获得的细胞即为X33酵母感受态细胞；分装，每80ul一管；
取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入90ul X33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷的电转杯，冰上静置5min，放入电转仪，电击，电压为1500V，电击时间为5.4ms；电击结束后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇和YPD等体积混合液，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止45min，每200μl均匀涂布至含100μg/ml zeocin的YPD平板；30℃，静置培养2d，直至长出分散，饱满的单克隆。
所述对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定的鉴定结果如图3所示；PCR鉴定的参数：55℃退火30s，72℃延伸75s，30个循环，选用AOX1通用引物，1％琼脂糖凝胶电泳检测；采用AOX1通用引物扩增，阳性片段大小约为1000bp，如图3所示，X33/pPICZαA-RJM-1-2-3-4-5-6均为阳性克隆，表明目的基因已成功整合到酵母基因组中。
步骤6：诱导表达鸡蛋清溶菌酶
利用甲醇诱导X33酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶；
所述鸡蛋清溶菌酶的高效表达的工艺为：
种子放大培养基为BMGY，诱导表达培养基为BMMY,接种量200μl，30℃，240rpm振荡培养至OD为3左右时开始诱导，甲醇诱导浓度1％，诱导温度28℃，转速240rpm，诱导时间72h，诱导后每隔12h补加甲醇至终浓度为0.5％，每隔一天取样；上清样品装入透析袋，利用聚乙二醇20000(PEG20000)进行浓缩，10倍浓缩后，取10ul进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为16％，考马斯亮蓝G250染色，脱色后进行观察，结果如图4所示，X33/pPICZαA-RJM-1-2-3-4-5-6均已成功表达。
步骤7：免疫印迹实验验证
利用兔抗6×His血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹。
所述免疫印迹实验验证的工艺为：
将6个RJM阳性转化子72小时的表达产物置于1.5mm聚丙烯酰胺凝胶中电泳，300mA，50min；转印至NC膜，显色后进行观察，结果如图5所示，溶菌酶基因的6个阳性重组子均已经成功表达。
本发明可以高密度发酵酵母，大量表达鸡蛋清溶菌酶基因；由于酵母菌属于真核微生物，表达出的溶菌酶蛋白对其无杀伤作用，可有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌的杀伤；本发明属于分泌表达，易于获取目的蛋白，可简化操作步骤；与化学合成目的蛋白相比，本发明具有节约成本的优点。
以上所述，仅为本发明专利优选的实施例1，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。
1溶菌酶-F基因序列
5′-GGGCTCGAGAAAAGAAAAGTCTTTGGACGATGTGAG-3′
2溶菌酶-R基因序列
5′-CCCTCTAGATCACAGCCGGCAGCCTCTGAT-3′
3溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列
Claims (10)
1.一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)
利用Primer引物设计软件设计一对引物，利用该引物合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶-F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶-R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；
步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列
将步骤1中经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定；
步骤3：构建基因表达载体
采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19-T-RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；
步骤4：鉴定基因表达载体
挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA-RJM；
步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞
挑取YPD平板上X33单菌落制备X33酵母感受态细胞，取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入X33感受态细胞并轻轻混匀，经电转化获得饱满的单克隆，挑取单克隆至3ml含100μg/ml zeocin的YPD培养基中，待重组菌长起来后，利用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，并对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定；
步骤6：诱导表达鸡蛋清溶菌酶
利用甲醇诱导X33酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶；
步骤7：免疫印迹实验验证
利用兔抗6×His血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹。
2.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤1中RT-PCR扩增的反转录反应体系为：
总计10μL样品经
3.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤1中PCR反应为：
向所述反转录反应结束后的反应管中再加入下列试剂：
总量为50μL，轻轻混匀后短暂离心，按以下条件进行PCR反应：
4℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤2中测定的序列如序列表3所示，鸡蛋清溶菌酶基因ORF碱基长度为357bp，编码118个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤3中的酶切反应体系为：
6.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤3中的连接体系为：
先将目的片段与pPICZαA载体片段混合均匀，45℃作用5min，短暂离心混匀后，16℃连接12h。
7.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤5中电转化的工艺为：
挑取YPD平板上X33单菌落接种于20ml YPD培养基中，30℃，250rpm培养至OD＝1.3-1.5；4℃，1500g，离心5min，用10ml冷的无菌去离子水重悬细胞；4℃，1500g，离心5min，用5ml冷的无菌去离子水悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用1ml，1M预冷的山梨醇重悬细胞，移入1.5ml EP管中；接着用冷的无菌1M山梨醇清洗细胞两次；4℃，1500g，离心5min，用200ul，1M预冷的山梨醇重悬，获得的细胞即为X33酵母感受态细胞；分装，每80ul一管；
取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入90ul X33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷的电转杯，冰上静置5min，放入电转仪，电击，电压为1500V，电击时间为5.4ms；电击结束后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇和YPD等体积混合液，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止45min，每200μl均匀涂布至含100μg/ml zeocin的YPD平板；30℃，静置培养2d，直至长出分散，饱满的单克隆。
8.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤5中对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定的鉴定结果如图3所示；PCR鉴定的参数：55℃退火30s，72℃延伸75s，30个循环，选用AOX1通用引物，1％琼脂糖凝胶电泳检测；采用AOX1通用引物扩增，阳性片段大小约为1000bp，如图3所示。
9.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤6中鸡蛋清溶菌酶的高效表达的工艺为：
种子放大培养基为BMGY，诱导表达培养基为BMMY，接种量200μl，30℃，240rpm振荡培养至OD为3左右时开始诱导，甲醇诱导浓度1％，诱导温度28℃，转速240rpm，诱导时间72h，诱导后每隔12h补加甲醇至终浓度为0.5％，每隔一天取样；上清样品装入透析袋，利用聚乙二醇20000(PEG20000)进行浓缩，10倍浓缩后，取10ul进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为16％，考马斯亮蓝G250染色，脱色后进行观察，结果如图4所示。
10.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤7中免疫印迹实验验证的工艺为：
将6个RJM阳性转化子72小时的表达产物置于1.5mm聚丙烯酰胺凝胶中电泳，300mA，50min；转印至NC膜，显色后进行观察，结果如图5所示。
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|---|---|---|---|---|
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