CN101104075A - 基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗，其特征在于它是含有哈维氏弧菌溶血素基因的质粒pYD1－1的酿酒酵母工程菌EBY100，该酿酒酵母菌的表面有哈维氏弧菌的溶血素蛋白。本发明的活疫苗可用于海水养殖鱼类的免疫。所用的菌种保藏号为CGMCC No.2007。制备时先分离病原哈维氏弧菌，从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因，构建溶血素基因表达载体，再将该表达载体转化酿酒酵母菌，然后发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗。本发明的优点是没有物理化学处理过程和回复突变的危险，不用培养病原菌，培养方法简便易行，便于大规模生产，本身可以为动物提供营养成分。

Description

基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术，具体讲涉及一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

在现代水产养殖中，接种疫苗已作为鱼类养殖技术的一个组成部分。疫苗分为灭活疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗。灭活疫苗的制备方法是通过细胞或生物接种，大量扩增和收集病原体，然后以物理或化学方法，在确保免疫活力的情况下，将病原灭活，然后作为抗原刺激机体产生抗体。减毒活疫苗是将病原体在各种条件下通过物理化学诱变产生的减毒株。这两种疫苗在人类和家禽动物中已经大规模的使用，因为需要培养大量的病原菌，所以存在潜在的危险。DNA疫苗是将编码保护性抗原蛋白的基因构建成真核表达质粒，直接导入动物组织细胞，使抗原蛋白经过内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异的体液免疫和细胞免疫。DNA疫苗有许多优点，但也有许多缺点，如克隆的基因能否在动物组织中表达，必须通过人工方法给动物注射DNA疫苗，费时费力且易造成动物损伤，必须培养大量含有重组质粒的大肠杆菌并从中提取重组质粒，还得使用佐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用，它能用来免疫水产养殖鱼类，从而保护养殖鱼类免受病原菌哈维氏弧菌的感染。

一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗，其特征在于它是含有哈维氏弧菌溶血素基因的质粒pYD1-1的酿酒酵母工程菌EBY100，所述的酿酒酵母工程菌的表面有哈维氏弧菌的溶血素蛋白。

上述以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酵母菌活疫苗的制备方法，包括分离病原哈维氏弧菌，从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因，其特征在于构建溶血素基因表达载体，再将该基因表达载体转化酿酒酵母菌，然后发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗。

上述以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗在海水养殖鱼类免疫中的应用。

本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的优点在于，可以克服现有疫苗的许多缺点，如没有减毒疫苗的物理化学处理过程和回复突变的危险，不需要大量培养病原菌，不需要在动物组织中表达，不必使用佐剂，而且，所用的酿酒酵母菌非常安全，培养方法简单易行，经济价廉，便于大规模生产，酿酒酵母菌除了作为疫苗以外，其本身可以为动物提供营养成分。

具体实施方式

1分离病原哈维氏弧菌

本发明采用的2216E培养基平板含有蛋白胨0.5％(重量百分数，下同)、酵母粉0.1％、磷酸铁0.01％、琼脂2.0％、其余为陈海水，pH7.6；用无菌操作法取患病花鲈病灶部位的组织，用无菌匀浆器将该组织匀浆，用无菌生理盐水对组织匀浆进行10倍系列稀释，以平板稀释涂布法在2216E培养基平板上进行平板涂布，在25-30℃下培养24-48h后，挑取优势菌种，在2216E培养基平板上划线纯化，即得到病原哈维氏弧菌。将纯化后的菌种置于含有12.0-15.0％(体积百分数)甘油的生理盐水(0.85％NaCl水溶液)中，并保存于-80℃的冷冻箱中备用。对分离出的菌种进行了64项形态、生理生化特征鉴定，鉴定结果为该菌种为病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。通过感染实验确定，该菌种对花鲈有致病性。

上述2216E培养基平板可以含有蛋白胨0.1-2.5％、酵母粉0.05-0.4％、磷酸铁0.005-0.1％、琼脂1.5-3.0％，pH值为6.8-8.6。

2从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因

1)哈维氏弧菌DNA模板的制备：将上述哈维氏弧菌接种于2216E培养基平板上，在28℃下培养过夜，将单菌落悬浮于50μl无菌蒸馏水中，于100℃下水浴5min，离心，取上清液作为哈维氏弧菌的DNA模板。

2)引物设计：按照GenBank中哈维氏弧菌溶血素基因序列(登录号为AF293430)与质粒载体pYD1上的多克隆位点，设计如下两条引物，并在上、下游引物的两端分别添加BamH1和EcoR1两种限制性内切酶位点，进行PCR扩增。

上游引物A 5′-CGCGGATCCATGAATAAAACTATTACGTTACT-3′，

下游引物B 5′-CCGGAATTCGAAAGGATGGTTTGACAAT-3′，上、下游引物的下划线上的碱基序列分别为BamH1和EcoR1两种限制性内切酶位点。

3)PCR扩增

PCR扩增条件为在94℃下预变性10min，在94℃下变性1min，在55℃下退火30s，在72℃下延伸1min，共30个循环，最后在72℃下延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。

4)DNA测序

克隆出的基因片段经鉴定，由上海生工生物工程有限公司测序。所得序列如下：

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3构建溶血素基因表达载体

1)用BamH1和EcoR1两种限制性内切酶将上述PCR产物与pYD1空载体分别双酶切后，进行琼脂糖电泳。

2)按照DNA回收试剂盒说明割胶回收DNA，分别与同样双酶切后割胶回收的线形pYD1空载体用T₄DNA连接酶在14-18℃下连接过夜。

3)将所得连接产物转化入感受态大肠杆菌TOP10，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，35-40℃下培养过夜。

4)挑取转化子，并以转pYD1空载体的TOP10为阴性对照，以原PCR产物为阳性对照，分别用两对特异性引物通过菌落PCR筛选带有插入目的基因的阳性克隆。

5)从获得的阳性转化子中提取带有插入溶血素基因的目的质粒(命名为pYD1-1)，即为溶血素基因表达载体。

4将基因表达载体转化酿酒酵母菌

1)将提纯的阳性质粒pYD1-1转化入EBY100菌株的感受态细胞。

2)将转化产物涂布在不含色氨酸的YNB选择培养基[含0.5-0.67％YNB(不含氨基酸，含硫酸铵)、1.0-2.0％葡萄糖、0.005-0.01％亮氨酸、1.5-2.5％琼脂]平板上，25-35℃培养24-48h。

3)在选择培养基平板上挑取长出的单菌落，用两对溶血素特异引物，用酵母菌落PCR的方法筛选阳性转化子。将含表达质粒的转化子命名为EBY100/pYD1-1。基因工程酿酒酵母菌活疫苗酵母菌种的保藏，基因工程酿酒酵母菌活疫苗菌种，编号为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)EBY100 pYD1-1，菌种保藏号为CGMCC No.2007，保藏日期为2007年4月16日。保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国科学院微生物研究所。

5发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗

1)从新鲜活化的培养基上取基因工程酿酒酵母菌活疫苗菌株的菌种接种于含1.0-2.0％葡萄糖的YNB-CAA的培养基中[含0.5-0.67％YNB(不含氨基酸，含硫酸氨)、0.2-0.5％水解酪蛋白氨基酸]，在25-35℃下振荡培养过夜，使其菌悬液OD_600nm值介于2到5之间。

2)室温下用PBS缓冲液(含有8.0g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na₂HPO₄、0.25g KH₂PO₄、1000ml蒸馏水、pH7.4)4000g 5min洗涤2次，洗去多余的培养基，菌体用生理盐水悬浮。

3)把悬浮在生理盐水的菌体接入含1.0-2.0％D-半乳糖的YNB-CAA液体培养基中，使起始OD_600nm值为0.6-1.0，180rpm在20℃-25℃下诱导培养36-48小时，诱导溶血素蛋白的表达到达最高水平，测培养液OD_600nm值，取少量相当于8-10个OD_600nm值的酵母细胞量，与对照株同时测溶血活性。

4)经溶血活性结果确定哈维氏弧菌溶血素蛋白已在基因工程酿酒酵母菌活疫苗菌株的表面表达后，将培养物根据其OD_600nm值计算浓度(对于酿酒酵母菌，1 OD_600nm＝10⁷Cells)，并在4℃下用PBS缓冲液，4000g 5min离心洗涤2次，洗去多余培养基，重悬于PBS缓冲液，即得基因工程酿酒酵母菌活疫苗。

5)基因工程酿酒酵母菌活疫苗对鱼体的安全性检测

将浓度分别为5×10⁹cells/ml、5×10⁸cells/ml、5×10⁷cells/ml的基因工程酿酒酵母菌活疫苗分三个组腹腔注射试验牙鲆鱼和大菱鲆鱼(体长8-12cm，体重7-12g)0.2ml/尾，每组16尾，正常饲养观察一到三周计算死亡鱼尾数。

6)基因工程酿酒酵母菌活疫苗的免疫接种

免疫程序：分别设5×10⁹cells/ml高剂量组与5×10⁸cells/ml低剂量组注射接种基因工程酿酒酵母菌活疫苗，并以含空质粒的菌株EBY100/pYD1作为对照组按高剂量5×10⁹cells/ml进行腹腔注射免疫，每组16尾，每间隔一周每组以相同剂量加强免疫两次。

7)双向免疫扩散检测抗体

①采血与血清制备：于第一次免疫后第4周、6周，使用一次性注射器于牙鲆和大菱鲆尾静脉采血，室温静置2h后，在4℃下过夜，10000g离心15分钟，取上层血清在-20℃下储存。

②抗原的准备：参照《抗体技术实验指南》第一版附录中的蛋白质定量-紫外分光光度法计算第三章中制备的重组哈维氏弧菌溶血素蛋白各洗脱组分的浓度，以计算总蛋白量。根据计算公式：蛋白质浓度(mg/ml)＝(1.55×A₂₈₀)-(0.76×A₂₆₀)，得出第一洗脱组分浓度约0.7mg/ml，直接用于双向免疫扩散。

③抗体的检测：参照《微生物学实验方法》(赵斌，何绍江)。取洁净的玻片，将含1.5％NaCl琼脂盐水4ml趁热浇于玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板，凝固后在玻片上打孔，直径3mm，孔间距5-10mm，根据需要在相邻孔间加入约10μl抗原或抗体，加满但不溢出，放入湿盒，置37℃保温箱24h观察结果。

8)作攻毒感染试验检测免疫效果

在首次免疫后3-5周，取免疫鱼5-20尾/组进行感染试验。根据预攻毒实验结果，用新鲜培养12-36小时的哈维氏病原弧菌适当稀释，对各组免疫鱼进行腹腔注射感染实验，同时进行平板记数。观察一周每日累计死亡鱼尾数，计算最终存活率或死亡率。

本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗在海水养殖鱼类免疫中的应用

(1)基因工程酿酒酵母菌活疫苗使鲈鱼苗免疫：取健康海捕的鲈鱼鱼苗50尾，体重10-15g，体长10-15cm，将该鱼苗在水泥池暂养一周，养殖水温24-26℃，取含本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的缓冲液(浓度为1-9×10⁸cells/ml)，每尾鲈鱼苗注射0.1-0.5ml，一到三周后再对每尾鲈鱼苗注射0.1-0.5ml免疫一次，三到五周后测得该鲈鱼对哈维氏弧菌的免疫保护力为80-96％。所述的暂养时间可为1-3周。

(2)基因工程酿酒酵母菌活疫苗使牙鲆鱼免疫：取健康养殖的牙鲆鱼50尾，体重100-150g，水温21-26℃，取含本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的缓冲液(浓度为1-9×10⁸cells/ml)，每尾牙鲆鱼注射0.1-0.5ml，40-50d后再注射免疫一次，三到五周后测得该牙鲆鱼对哈维氏弧菌的免疫保护力为87-96％。

(3)基因工程酿酒酵母菌活疫苗使大菱鲆鱼免疫：取健康养殖的大菱鲆鱼苗50尾，体长2-4cm，水温18-24℃，取含本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗终浓度为1-9×10⁷cells/ml的海水溶液，不断充气，将大菱鲆鱼苗浸泡10-30min进行免疫，三到五周后测得该大菱鲆鱼对哈维氏弧菌的免疫保护力为84-95％。

(4)基因工程酿酒酵母菌活疫苗使牙鲆鱼免疫：取健康养殖的牙鲆鱼50尾，体重10-25g，水温21-26℃，取本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗终浓度为1-9×10⁸cells/ml与饵料原料混合共同制成颗粒饵料，按液体基因工程酿酒酵母菌活疫苗为10-50ml/kg鱼体重，连续投喂5-10天，三到五周后测得此牙鲆鱼对哈维氏弧菌的免疫保护力为83-97％。

(5)基因工程酿酒酵母菌活疫苗使大菱鲆鱼免疫：取健康养殖的大菱鲆鱼苗50尾，体重20-40g，水温18-24℃，取本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗终浓度为1-9×10⁸cells/ml与饵料原料混合共同制成颗粒饵料，按基因工程酿酒酵母菌活疫苗为10-50ml/kg鱼体重，连续投喂5-10天，三到五周后测得此大菱鲆鱼对哈维氏弧菌的免疫保护力为81-94％。

Claims (7)

1.一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗，其特征在于它是含有哈维氏弧菌溶血素基因的质粒pYD1-1的酿酒酵母工程菌EBY100，所述的酿酒酵母工程菌的表面有哈维氏弧菌的溶血素蛋白。

2.权利要求1所述的以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酵母菌活疫苗的制备方法，包括分离病原哈维氏弧菌，从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因，其特征在于构建溶血素基因表达载体，再将该表达载体转化酿酒酵母菌，然后发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗。

3.权利要求1所述的以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗在海水养殖鱼类免疫中的应用。

4.权利要求1所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的菌种的编号为酿酒酵母菌EBY100 pYD1-1，该菌种保藏号为CGMCC No.2007，保藏日期为2007年4月16日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、地址为中国科学院微生物研究所。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于构建所述的溶血素基因表达载体时，先用BamH1和EcoR1两种限制性内切酶将PCR产物与pYD1空载体分别双酶切，然后将纯化的PCR产物与线形pYD1空载体连接，再将连接产物转化入感受态大肠杆菌TOP10，挑取转化子，筛选带有插入目的基因的阳性克隆，最后从获得的阳性转化子中提取带有插入溶血素基因的目的质粒，即得溶血素基因表达载体。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于将所述的表达载体转化入酿酒酵母菌时，先将提纯的阳性质粒pYD1-1转化入EBY100菌株的感受态细胞，再将转化产物涂布在YNB选择培养基上于25-35℃下培养24-48h，挑取长出的单菌落，用酵母菌落PCR的方法筛选阳性转化子，含表达质粒的转化子即为基因工程酿酒酵母菌活疫苗酵母菌种。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于发酵生产所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗时，先将所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗菌种接种于含1.0-2.0％葡萄糖的YNB-CAA的培养基中，在25-35℃下振荡培养过夜，使其菌悬液OD_600nm值介于2到5之间，再用PBS缓冲液洗涤，使菌体在生理盐水中悬浮，把悬浮在生理盐水的菌体接入含D-半乳糖的YNB-CAA液体培养基中，在20℃-25℃下诱导培养36-48小时，将所得的培养物在4-6℃下用PBS缓冲液离心洗涤，重新悬于PBS缓冲液，即得基因工程酿酒酵母菌活疫苗。