CN102533775A

CN102533775A - 牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及其应用

Info

Publication number: CN102533775A
Application number: CN2012100039267A
Authority: CN
Inventors: 高虹; 孙金生; 耿绪云; 潘宝平; 吴恋
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102533775B

Abstract

本发明公开了一种牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及克隆和检测方法。该序列全长3687bp，含2922bp的开放阅读框，编码973个氨基酸。本发明通过以近源物种TLR21的cds序列保守区设计兼并引物，通过反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆TLR21的全长cDNA序列。TLRs家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”，通过感知识别病原体的相关分子模式，激活天然免疫系统。本基因的获得为研究鱼类TLR21的基因表达调控机理及免疫学功能奠定基础，还可为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供分子水平材料。

Description

牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及其应用

本发明得到天津市自然科学基金基础研究计划（10JCYBJC09100）；天津师范大学博士基金项目(自然科学) 项目号：52XB1004；天津师范大学市级重点实验室开放研究基金的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是牙鲆模式识别受体TLR21基因全长表达序列和所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。

背景技术

随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑，掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。

在人类免疫学研究的历史舞台上, 细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下, 固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识, 明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代, Janeway 等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出, 标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在两种免疫应答类型：固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族是动物识别入侵病原体的主要 “模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。一般认为TLR 1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21～23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现，有研究报道TLR21即可识别细菌成分，也可识别病毒成分。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目，鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重,该病从苗种到成鱼均有发生,死亡率可达50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。

TLRs是宿主免疫的必需分子之一, 通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR21作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。牙鲆模式识别受体TLR21基因结构的阐明，有助于人们更加深入地了解TLR21的功能及其与鱼类免疫应答的关系，加深人们对鱼类精细而复杂免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗相关鱼病的新策略以及抗病育种设计、抗病性转基因鱼设计、基因疫苗的设计和疫苗的安全使用等提供重要的理论基础，并在鱼类疾病防治，环境监测以及生态系统保护等方面发挥作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA序列及克隆方法。

本发明采用的技术方案是通过以近源物种TLR21基因的CDS序列保守区设计兼并引物，通过RT-PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得牙鲆TLR21基因的全长表达序列。

TLR21基因cDNA全长3687 bp，含有2922 bp的开放阅读框，编码973个氨基酸，其中前23个氨基酸序列为信号肽序列。TLR21基因的起始密码子上游有五个中止密码子TAA，距poly(A)尾16个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为TLR21基因的全长cDNA序列。TLR21基因编码的蛋白质，分子量为112.7 KDa，等电点为8.66。

本发明进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR21的基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步骤：

(1) 健康牙鲆经免疫原免疫刺激后解剖分离头肾组织：

由于TLR21基因为免疫相关基因，在病原感染后其表达量通常会有提高，因此在提取总RNA之前对健康牙鲆首先进行免疫刺激。选择鱼类的常见细菌感染源鳗弧菌为免疫原物，腹腔注射牙鲆体内，免疫24 h后处死解剖分离头肾组织。

(2) 总RNA的提取和纯化：

采用Trizol法从牙鲆头肾中提取得到牙鲆头肾总RNA。总RNA纯化采用DNA酶消化法。

(3) 中间片段的克隆测序：

（3.1）cDNA第一链的合成

以纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以Oligo(dT)₁₆为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。

（3.2）PCR扩增

由于该基因较长，所以本发明选择将中间片段分为两段区域分别进行扩增。以前述所得的cDNA第一链作为模板，利用下述两对引物进行TLR21基因中间片段1和中间片段2的扩增：

正向引物1： TLR21-F1 ：5'-TATCGTTACAACMGHATYCT-3'

反向引物1： TLR21-R1 ：5'-AAGATTYCCRAAAACMTC -3'

正向引物2： TLR21-F2 ：5'-AATBTGTCCTBTAACWACAT-3'

反向引物2： TLR21-R2 ：5'-GTTCCTCAAGCCTTCTCA-3'

扩增得到牙鲆TLR21基因cDNA的两个中间片段，通过克隆测序，得到两个中间片段序列。

本步骤中，扩增体系可优选如下：

扩增程序参数可优选为：

94℃ 4 min ；

94℃ 50 s；52℃ 40 s；72℃ 1 min (30个循环);

72℃ 7 min；12℃保温。

(4) 3’端的克隆测序：

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，设计并合成用于3'端巢式PCR的两个正向引物以及通用性反向引物AP，分别为:

正向引物1：TLR21.3-F1 ：5'-GGAAACAACCTCAAACAC-3'

正向引物2：TLR21.3-F2 ：5'-CTCACCAACAATAATCTCAA-3'

通用性反向引物AP：5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'

以前述步骤(3)纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以Oligo(dT)₁₆AP：5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)₁₆-3' 为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢式PCR扩增的cDNA模板。以TLR21.3-F1和AP为正反向引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，TLR21.3-F2和AP为正反向引物进行第二轮PCR扩增（扩增体系及程序参数同中间片段扩增）。

(5) 5’端的克隆测序：

(5.1) 合成5’端的cDNA第一链

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，设计并合成特异性反转录引物：

TLR21.5-R ：5'-AGTGAGGGATGTGGGTAG-3'

以前述步骤(2)纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以特异性反向引物TLR21.5-R为反转录引物，进行反转录，反转录产物使用RNase H消化残余RNA，并用末端转移酶在3'端添加poly(A)尾巴，得到5’端的cDNA第一链。

(5.2) PCR扩增

根据上述步骤(3)得到的中间片段序列，使用Primer 5软件设计两个特异性反向引物，用于5'端巢式PCR。

TLR21.5-R1：5'-GGTTAGATTGAGATTGGTAG-3'

TLR21.5-R2：5'-GGGTCAGAGAGAGAAAGGT-3'

首先以通用性正向引物Oligo(dT)₁₆AP和特异性反向引物TLR21.5-R1为引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，以通用性正向引物AP和特异性反向引物TLR21.5-R2为引物进行第二轮PCR扩增（扩增体系及程序参数同中间片段扩增）。

(6) 将上述步骤(3)所得两段中间片段序列、步骤(4)所得3’端序列、和步骤(5)所得5’端序列用软件进行拼接，获得牙鲆TLR21基因的全长cDNA序列，如SEQ ID NO.1所述，并由基因序列推导出氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所述。

MSRLTYQFLSVALILGAAQLIRSYSYDNCIEKPYSKGKIFNCIHRKGNLSAIISDLPSSVTNLTISLDPVVHILNYSFDHLTELQNLRLDHNLLRSIDQFAFHNLHQLHSLNLSFNNISQLKPRAFRGLHNLTFLSLTHNKLKQLPERIFSTNLNLTKLIMRENLLTNFSGIVESVSHLTNLKTLDLCVNSLTSLSHSNVSLPTSLTVLYLCRNNLSTLGCESSFLRFINVLDLSNNSMLQTMAFQGVNLKRVNYLRLRSTSVKVVEFLNISNIDARRVDFSGTGLQNDSLLTELCRLLKRKVEQIKDLQLGFNGITTLTSYTLYYCPQITRSLDLSRNRLHKSTNCLTFLHRHTQIKSLTMEHNLLTSLQSCNNTNNVHFKDLESLSYRYNRILSVNALAFYHLPNIKTLLLNINTIAFLHQKALTGLRRLEELRLDNNLLTDLFKDNFKDNVNLKILNLRNNRISVIFNETFCTLSNLTTLDLGGNKIAHIRPSGFDGLISLSKLYLDGNNLKHIDTSLYHIFQDTLTVLDLQNNQFSFLTETTESPFKNLIKLSDLKLDRQRPHGMTILPHAYFRGLHSLRSLYLTNNNLNNLAPDAFDDLKGLRFLNLESCCVGVVKLQPGIFKNLRNLTKLIVENMGIQNFSKEVFGNLTQLHVLQMNRNVMQSIPVDALQSLPKLNYLDIRSIPLSCTCKNSLLQNWLQNNSNVQIVYLHSLKCQNEPSIKFYNFDTKVCYIDLGEYLFLSTAAVVFLLTVCPLLYVKLYWKFKYSYYVFRSWFSEQWRRLREKEDNCKYDAFISYNSSDEQWVMDQLVPNLEGNGSSFKLCLHHRDFELGRDIVDNIVSAVYSSRKTICVVSRNFLQSEWCSLEIQLASYRLFDEHRDVLLLVFLEPISERQLSSYHRMRKVMLKKTYLQWPGSNCTDPMQAQELFWNQLRRGMRMESRLETEDSTRSDDEMDHLETSDENYYLQP

本发明的有益效果是：

（1）本发明来源于牙鲆的模式识别受体TLR21的基因序列是一种新的TLR21基因序列，使人们对TLR21基因的研究对象从少数有限的鱼类进一步扩展到牙鲆等多种鱼类。

（2）本基因的获得不仅为研究鱼类TLR21基因表达的调控机理以及TLR21受体蛋白与鱼体抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯化蛋白，为进一步研究TLR21的蛋白质结构和免疫学功能奠定理论基础。本基因还可为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供分子水平材料，同时可以进行抗病相关性及抗病辅助育种的研究。

（3）TLRs家族是动物识别入侵病原体的主要 “模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，作为宿主免疫的必需分子之一, 通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR21参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此TLR21基因的表达水平是鱼类免疫力的指示器，通过检测TLR21的mRNA丰度，可以对鱼体免疫系统的活化程度进行评价，作为鱼类疾病防治过程中免疫监测的指标，并在环境监测以及生态系统保护等方面发挥作用。

（4）疫苗接种可激发宿主产生保护性免疫应答反应，以达到预防疾病的目的。有效的疫苗不仅需要含有保护性的抗原成分，而且还需要含有能活化天然免疫系统以提高疫苗免疫原性的佐剂组分。大多数疫苗佐剂都是TLRs家族的配体，因此了解TLR21的结构及功能机制，对于研制更安全、更高效的疫苗至关重要。

附图说明：

图1为牙鲆TLR21基因中间片段第一段电泳检测结果；其中Marker条带从下而上依次为：200、400、600、800、1000、1500bp；

图2为牙鲆TLR21基因中间片段第二段电泳检测结果；其中Marker条带从下而上依次为：200、400、600、800、1000、1500 bp；

图3为牙鲆TLR21基因3’端电泳检测结果；其中Marker条带从下而上依次为：200、400、600、800、1000、1500 bp；

图4为牙鲆TLR21基因5’端电泳检测结果；其中Marker条带从下而上依次为：200、400、600、800、1000、1500 bp；

图5为牙鲆TLR21基因实时荧光RT-PCR产物电泳结果；TLR21产物长度198 bp， Marker条带从下而上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp；

图6为牙鲆内对照基因β-actin实时荧光RT-PCR产物电泳结果；β-actin产物长度150 bp， Marker条带从下而上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp；

图7为感染牙鲆头肾组织中TLR21基因的相对表达量。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。

实施例1：

牙鲆头肾组织分离：

鳗弧菌（由天津市水产病害防治中心提供）接种于pH值7.5、补加了2％NaCl的Luriai-Bertani液体培养基中，于28℃恒温振荡(150 r/min)培养24 h。在550 nm下测定OD值，计算菌体浓度及细胞总数。离心收集菌体，并用PBS离心洗涤菌体两次，细胞沉淀悬浮于0.5%甲醛溶液中28℃灭活36 h，再用PBS离心洗涤菌体三次，配制成10⁶个/mL浓度的灭活鳗弧菌菌液。

市场上购买的健康牙鲆（0.5 kg左右）于水族箱内25℃暂养三天，腹腔注射1 mL上述经甲醛灭活的鳗弧菌（或未灭活的鳗弧菌），24 h后断颈处死牙鲆，于超净台上解剖并分离头肾组织。以上步骤全为无菌操作。

实施例2：

总RNA的提取和纯化：

(1) 取头肾组织100 mg用剪刀剪碎加入1 mL的Trizol试剂（美国invitrogen公司) 和10μL肝素于匀浆器里彻底研磨匀浆，然后转移至1.5mL无RNase的离心管中震荡混匀，室温放置5min，使其充分裂解。

(2) 4℃、12000 rpm 离心5min，将上清液转入新的无RNase的离心管中。

(3) 向每管加入0. 1 mL 5 mol/L的NaCl混合均匀，再向每管加入0. 3 mL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置3 min, 4℃、12000 r/min离心15 min，在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的1. 5 mL离心管中。

(4) 向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混匀后，室温放置10 min, 4℃、 12000 r/min离心10 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。

(5) 4℃、7500 r/min离心5 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，再加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500 r/min离心5 min,，所得沉淀即为牙鲆头肾总RNA，-70℃保存。

（6）提取的总RNA可用DNase I酶（Invitrogen公司）进一步纯化，以去除RNA中残存的DNA，具体如下：往0.2 mL离心管中加入1 μg 提取的总RNA、1 μL 10×DNase I 反应缓冲液、1 μL DNase I（1U/μL）、DEPC水补至总体积到10μL，室温或37℃ 放置15 min，加入1 μL 25 mM EDTA，65℃ 10 min。既得纯化的总RNA。

实施例3：

中间片段的克隆测序：

(1) 引物设计：

首先从GeneBank中下载模式生物斑马鱼TLR21基因的全长cDNA序列及氨基酸序列，用下载的序列在NCBI上blast同斑马鱼同源性高的鱼类TLR21基因，根据鱼类分类学，得知牙鲆的分类地位同石斑鱼最近，引物设计使用Primer 5引物设计软件，以石斑鱼TLR21序列（GU198366）为模板，结合以石斑鱼、红鳍东方鲀、斑马鱼的序列比对结果为校正，由于该基因较长，所以设计两对兼并引物用于TLR21中间序列扩增。

TLR21-F1 ：5'-TATCGTTACAACMGHATYCT-3'

TLR21-R1 ：5'-AAGATTYCCRAAAACMTC -3'

TLR21-F2 ：5'-AATBTGTCCTBTAACWACAT-3'

TLR21-R2 ：5'-GTTCCTCAAGCCTTCTCA-3'

(2) cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，使用QIAGEN公司的QIAGEN Quantitect Reverse Transcription试剂盒，以Oligo(dT)₁₆为反转录引物，按照试剂盒推荐方法反转录合成cDNA第一链。扩增体系总体积为2 0 μL，得到中间片段的cDNA第一链。

(3) PCR扩增：

用上述反转录产物做模板PCR扩增TLR21的中间序列。PCR体系见下表

PCR反应循环参数如下：

94℃ 4 min ；

94℃ 50 s；52℃ 40 s；72℃ 1 min (30个循环);

72℃ 7 min；12℃保温。

取所得扩增产物10 μL经1%非变性琼脂糖凝胶80 V电泳40 min, EB染色后紫外线检测扩增片段，检测结果如图1、图2所示。

(4) 克隆测序：

目的片段的回收与纯化：将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1. 5 mL离心管中，用上海生工的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，按照试剂盒推荐方法回收胶中的DNA片段。

重组连接：使用上海生工的T-载体PCR产物克隆试剂盒，将回收的DNA片段克隆于pUCm-T载体中。连接反应体系总体积10 μL, 16℃连接12 h。

感受态细胞的制备： ① 从LB平板上挑取新活化的E. col i DH5 a单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃、225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期;将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3 h至OD600=0. 35-0. 5左右。 ② 将培养液转入离心管中，冰上放置10 min，然后于4℃下3000 r/min离心10 min。 ③ 弃去上清，用预冷的0.05 mol/L的CaCl2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 min后，4℃下3000 r/min离心10 min。 ④ 弃去上清，加入4 mL预冷含15%甘油的0. 05 mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 ⑤ 将感受态细胞分装成200 uL的小份，贮存于-80℃冰箱（海尔超低温保存箱）可保存半年。

质粒DNA的转化：① 从-80℃冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5 a，置于冰上融化。② 在无菌条件下加入10 μL连接反应液，轻轻涡旋混匀后，在冰上放置30 min。③ 42℃水浴热击90 s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min。④ 加入700 μL无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃, 100 r/min摇床振摇培养，温育45 min。⑤ 取100 μL已转化的菌液涂布在含Amp（100μg/mL），并含X-gal和IPTG的平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，然后倒转培养皿，37℃避光培养20 h，随后筛选阳性菌落。 ⑥ 用灭菌的白枪头挑取白色单菌落，连枪头一起打入含Amp（100 μg/mL）的3 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12~16 h。

重组质粒验证：① 取10 uL上述白色单菌落培养扩增出的菌液于1.5 mL离心管中，加入90 μL ddH2O,煮沸10 min，离心，取上清液2 μL作为模板，用原来的上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件均同前，用1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果产物为预期大小的目的条带时，此重组菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。 ② 取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750 u L，加入250 u L的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存备用。 ③ 菌液测序委托上海迈浦生物科技有限公司进行，所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

TLR21中间片段1序列如下：

TATCGTTACAACAGAATCCTCTCAGTGAATGCTTTAGCTTTCTATCATTTACCAAATATCAAGACGCTACTCCTTAACATAAACACAATTGCTTTTCTCCATCAGAAGGCTCTCACAGGGCTGAGAAGGCTTGAGGAACTCCGCTTGGACAACAACCTCTTAACGGATTTGTTCAAGGATAACTTTAAAGATAATGTCAATCTGAAAATCCTTAACCTACGCAACAATCGTATTTCTGTCATCTTCAATGAGACCTTCTGTACGCTCAGCAACCTGACTACATTGGACCTTGGAGGTAATAAGATCGCTCATATACGGCCGTCAGGTTTTGATGGACTAATAAGTCTGTCCAAACTCTATCTAGATGGAAACAACCTCAAACACATTGACACGTCCCTGTATCATATATTTCAAGATACACTCACAGTGCTGGATCTACAAAATAATCAGTTTAGTTTTCTCACTGAAACTACGGAGTCACCATTTAAGAATCTCATCAAACTCAGTGATCTGAAGTTGGACAGGCAGCGGCCTCATGGCATGACTATTTTACCCCATGCTTATTTCCGTGGCCTCCACTCATTGAGATCACTGTATCTCACCAACAATAATCTCAATAATCTTGCCCCTGATGCGTTTGATGATCTGAAAGGCTTGCGTTTCCTCAACCTGGAGAGCTGCTGCGTCGGGGTGGTAAAACTGCAACCAGGAATCTTCAAAAATCTGAGAAATTTGACCAAATTGATTGTAGAAAATATGGGCATTCAGAACTTCTCAAAGGATGTTTTCGGAAATCTT

TLR21中间片段2序列如下：

AATTTGTCCTTTAACTACATATCCCAGCTGAAGCCTAGAGCGTTTCGGGGGCTTCACAACCTCACCTTTCTCTCTCTGACCCACAATAAATTAAAGCAGCTTCCTGAGAGAATTTTCTCTACCAATCTCAATCTAACCAAGTTAATCATGAGGGAAAACCTTCTGACAAATTTCTCTGGGATTGTCGAGTCTGTGTCACATCTGACGAATCTAAAGACACTAGACCTCTGCGTTAACAGTTTGACCTCCCTTAGCCACTCAAATGTGTCACTAcCCACATCCCTCACTGTTTTGTATTTGTGTAGAAATAATTTGTCCACGTTAGGATGTGAGAGTTCATTTCTCAGGTTCATTAACGTTCTAGACTTGTCGAACAATTCTATGCTCCAAACGATGGCTTTTCAAGGAGTGAATTTGAAACGTGTGAACTATTTGCGTTTGCGTTCAACGAGTGTCAAGGTAGTGGAGTTTTTAAACATCAGTAACATTGATGCAAGACGAGTTGATTTCTCTGGCACAGGTCTACAAAATGACAGCCTGCTCACAGAGCTATGCAGATTGTTAAAAAGAAAAGTGGAACAGATAAAAGATTTGCAGCTGGGTTTTAATGGGATTACGACTCTTACCAGCTACACACTGTACTATTGTCCTCAGATCACAAGGTCTCTGGATCTATCCCGCAATCGCCTGCACAAAAGCACAAATTGCCTTACATTCCTCCATAGACATACACAGATAAAGAGCCTAACTATGGAGCATAACCTTCTCACCTCCCTCCAATCCTGTAACAATACAAACAATGTACATTTCAAAGATCTAGAATCACTGAGCTATCGTTACAACCGCATCCTCTCAGTGAATGCTTTAGCTTTCTATCATTTACCAAATATCAAGACGCTACTCCTTAACATAAACACAATTGCTTTTCTCCATCAGAAGGCTCTCACAGGGCTGAGAAGGCTTGAGGAAC

实施例4：

3’端的克隆测序：

(1) 引物设计：

根据得到的TLR21中间序列，使用Primer 5引物设计软件，设计并合成两个正向引物，以及通用反向引物AP用于3'端巢式PCR。

TLR21.3-F1 ：5'-GGAAACAACCTCAAACAC-3'

TLR21.3-F2 ：5'-CTCACCAACAATAATCTCAA-3'

AP：5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'

Oligo(dT)₁₆AP：5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)₁₆-3'

(2) PCR扩增：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₆AP：5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)₁₆-3' 为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢式PCR扩增的cDNA模板。以TLR21.3-F1和AP为上下游引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物做模板，TLR21.3-F2和AP为上下游引物进行第二轮PCR扩增（扩增体系及程序参数同中间片段扩增）。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

(3) 克隆测序及重组质粒验证：

克隆测序及重组质粒验证参照实施例3所述中间片段的测序方法。

TLR21的3’端序列如下：

CTCACCAACAATAATCTCAATAATCTTGCCCCTGATGCGTTTGATGATCTGAAAGGCTTGCGTTTCCTCAACCTGGAGAGCTGCTGCGTCRGGGTGGTAAAACTGCAACCAGGAATCTTCAAAAATCTGAGAAATTTGACCAAATTGATTGTAGAAAATATGGGCATTCAGAACTTCTCAAAGGAGGTTTTTGGGAATCTTACACAGTTACACGTGTTGCAGATGAACCGCAATGTGATGCAGAGTATTCCTGTTGATGCACTTCAAAGTCTACCTAAACTCAACTACCTTGACATACGTAGTATTCCTTTAAGCTGCACCTGCAAGAACAGCTTGCTGCAAAACTGGCTACAAAATAACTCAAATGTCCAGATAGTCTATCTCCACAGTCTGAAATGCCAGAATGAACCATCAATTAAATTCTACAACTTTGATACTAAAGTTTGCTACATAGATCTAGGTGAGTACCTGTTCTTGAGCACAGCAGCTGTGGTCTTCCTGTTAACAGTCTGTCCCTTACTTTATGTAAAACTCTATTGGAAATTTAAGTACAGCTACTATGTTTTCCGTTCCTGGTTTAGTGAGCAGTGGCGCAGACTCAGGGAGAAGGAGGATAACTGCAAATATGATGCATTTATTTCCTACAATTCCTCTGATGAACAGTGGGTCATGGATCAGTTAGTGCCTAACCTGGAGGGAAATGGATCATCTTTTAAACTTTGCCTACATCACAGGGACTTTGAACTGGGCCGTGACATCGTGGACAACATTGTCTCTGCTGTTTACAGCAGCCGGAAAACTATTTGTGTGGTGAGCAGGAATTTCCTACAAAGTGAGTGGTGTTCTCTGGAAATCCAGCTCGCCAGCTACCGACTCTTCGATGAGCACAGAGATGTTCTTCTGCTCGTGTTTCTGGAGCCGATCTCTGAGAGGCAGTTGTCGTCCTATCACCGCATGAGGAAAGTCATGCTAAAAAAGACTTATCTGCAGTGGCCGGGCTCAAACTGCACTGATCCAATGCAGGCCCAAGAACTGTTCTGGAACCAGCTACGTAGGGGGATGAGAATGGAGAGCAGGCTCGAAACAGAAGACAGCACCAGAAGTGATGATGAAATGGATCATTTAGAGACATCTGATGAGAACTATTACTTGCAACCTTAAAAAAAAAAAATTAAGTGATAAACCCTTCAGCATTTTAAACGAATAATTAAATTAGGCTGTAGGGAGAGGGTCATGTAAATATCTTAATGTACAGTGTGATGCATTGTATGATCAACAAAAACATAATTTATATGAAAATGAATCAGCATTCATTTAATATCTGGTGATCGGAATTTTTATTTTATTTTGTATATTTGATGTTTGGCATTCCTCTATTGTACAATTGCACAATGTGTTTCTTGCATGTTAATGCAGCCCACACACAAAAAGAATAACTGACTAACTATTATAATAGCACAGCCTTTGCAAAACATATTCCTCTGTACAGAATTTCCCATTATAGCACGTGTTAATTAAAGTGTGTTCTGTAAATTAAAACAATGCTCTAGAGATACAGACTCCTAATTGTGTTTTTCTTTATCTGTTAAACAAGACAAATTAATAAAAGAGGAAACTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

实施例5：

5’端的克隆测序：

(1) 引物设计：

根据得到的TLR21中间片段序列，使用Primer 5引物设计软件，设计三个反向引物，其中一个作为特异性反转录引物用于反转录，其余两个用于5'端巢式PCR。

TLR21.5-R ：5'-AGTGAGGGATGTGGGTAG-3'

TLR21.5-R1：5'-GGTTAGATTGAGATTGGTAG-3'

TLR21.5-R2：5'-GGGTCAGAGAGAGAAAGGT-3'

(2) cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以特异性反向引物TLR21.5-R为反转录引物，进行反转录合成cDNA第一链，反转录产物使用RNase H消化残余RNA，并用末端转移酶在3'端添加poly(A)尾巴，得到5’端的cDNA第一链。

(3) PCR扩增：

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

(4) 克隆测序及重组质粒验证：

TLR21的5’端序列如下：

CTTCTTTTGTACTGTCGATTTCTCTGGAAACACATCCCCAGTTGGTGAGATCCCAGGCGAGGACTGCAGCTGATTTAAGAAACCTGGTGACAGCGGAGTTCGGTTCTGGTGAGATGCAGTAACATCACTAATTGGACGTGCAGTGCAGACCATCATAAAAAGGATTCCTGTGCCACGATCAACGAATGAACGACCCAGAGGTCTTTTCCACATATTCAAACAAACCAAATCTAAAGAGACCAGCGATTTGAAAGGCCTTTCTCTGGACTGCAACAAGAAAAAATGTCCCGTCTAACTTATCAGTTCTTGTCAGTTGCCCTTATTCTTGGTGCTGCTCAACTCATCAGAAGTTACAGCTATGACAACTGCATTGAAAAACCGTACTCAAAGGGAAAAATCTTCAACTGCATCCATCGAAAGGGAAACCTATCTGCTATTATAAGTGATCTGCCGTCATCTGTCACCAATCTCACCATCTCACTTGATCCAGTAGTGCACATTCTCAACTACAGCTTTGATCATCTAACTGAACTTCAGAACCTCAGATTAGATCATAACCTCTTGAGGAGCATCGATCAATTTGCTTTCCATAACTTGCATCAACTTCACTCCCTAAATTTGTCTTTTAACAACATATCCCAGCTGAAGCCTAGAGCGTTTCGGGGGCTTCACAACCTCACCTTTCTCTCTCTGACCC

实施例6：

TLR21全长表达序列：

CTTCTTTTGTACTGTCGATTTCTCTGGAAACACATCCCCAGTTGGTGAGATCCCAGGCGAGGACTGCAGCTGATTTAAGAAACCTGGTGACAGCGGAGTTCGGTTCTGGTGAGATGCAGTAACATCACTAATTGGACGTGCAGTGCAGACCATCATAAAAAGGATTCCTGTGCCACGATCAACGAATGAACGACCCAGAGGTCTTTTCCACATATTCAAACAAACCAAATCTAAAGAGACCAGCGATTTGAAAGGCCTTTCTCTGGACTGCAACAAGAAAAAATGTCCCGTCTAACTTATCAGTTCTTGTCAGTTGCCCTTATTCTTGGTGCTGCTCAACTCATCAGAAGTTACAGCTATGACAACTGCATTGAAAAACCGTACTCAAAGGGAAAAATCTTCAACTGCATCCATCGAAAGGGAAACCTATCTGCTATTATAAGTGATCTGCCGTCATCTGTCACCAATCTCACCATCTCACTTGATCCAGTAGTGCACATTCTCAACTACAGCTTTGATCATCTAACTGAACTTCAGAACCTCAGATTAGATCATAACCTCTTGAGGAGCATCGATCAATTTGCTTTCCATAACTTGCATCAACTTCACTCCCTAAATTTGTCTTTTAACAACATATCCCAGCTGAAGCCTAGAGCGTTTCGGGGGCTTCACAACCTCACCTTTCTCTCTCTGACCCACAATAAATTAAAGCAGCTTCCTGAGAGAATTTTCTCTACCAATCTCAATCTAACCAAGTTAATCATGAGGGAAAACCTTCTGACAAATTTCTCTGGGATTGTCGAGTCTGTGTCACATCTGACGAATCTAAAGACACTAGACCTCTGCGTTAACAGTTTGACCTCCCTTAGCCACTCAAATGTGTCACTAcCCACATCCCTCACTGTTTTGTATTTGTGTAGAAATAATTTGTCCACGTTAGGATGTGAGAGTTCATTTCTCAGGTTCATTAACGTTCTAGACTTGTCGAACAATTCTATGCTCCAAACGATGGCTTTTCAAGGAGTGAATTTGAAACGTGTGAACTATTTGCGTTTGCGTTCAACGAGTGTCAAGGTAGTGGAGTTTTTAAACATCAGTAACATTGATGCAAGACGAGTTGATTTCTCTGGCACAGGTCTACAAAATGACAGCCTGCTCACAGAGCTATGCAGATTGTTAAAAAGAAAAGTGGAACAGATAAAAGATTTGCAGCTGGGTTTTAATGGGATTACGACTCTTACCAGCTACACACTGTACTATTGTCCTCAGATCACAAGGTCTCTGGATCTATCCCGCAATCGCCTGCACAAAAGCACAAATTGCCTTACATTCCTCCATAGACATACACAGATAAAGAGCCTAACTATGGAGCATAACCTTCTCACCTCCCTCCAATCCTGTAACAATACAAACAATGTACATTTCAAAGATCTAGAATCACTGAGCTATCGTTACAACCGCATCCTCTCAGTGAATGCTTTAGCTTTCTATCATTTACCAAATATCAAGACGCTACTCCTTAACATAAACACAATTGCTTTTCTCCATCAGAAGGCTCTCACAGGGCTGAGAAGGCTTGAGGAACTCCGCTTGGACAACAACCTCTTAACGGATTTGTTCAAGGATAACTTTAAAGATAATGTCAATCTGAAAATCCTTAACCTACGCAACAATCGTATTTCTGTCATCTTCAATGAGACCTTCTGTACGCTCAGCAACCTGACTACATTGGACCTTGGAGGTAATAAGATCGCTCATATACGGCCGTCAGGTTTTGATGGACTAATAAGTCTGTCCAAACTCTATCTAGATGGAAACAACCTCAAACACATTGACACGTCCCTGTATCATATATTTCAAGATACACTCACAGTGCTGGATCTACAAAATAATCAGTTTAGTTTTCTCACTGAAACTACGGAGTCACCATTTAAGAATCTCATCAAACTCAGTGATCTGAAGTTGGACAGGCAGCGGCCTCATGGCATGACTATTTTACCCCATGCTTATTTCCGTGGCCTCCACTCATTGAGATCACTGTATCTCACCAACAATAATCTCAATAATCTTGCCCCTGATGCGTTTGATGATCTGAAAGGCTTGCGTTTCCTCAACCTGGAGAGCTGCTGCGTCGGGGTGGTAAAACTGCAACCAGGAATCTTCAAAAATCTGAGAAATTTGACCAAATTGATTGTAGAAAATATGGGCATTCAGAACTTCTCAAAGGAGGTTTTTGGGAATCTTACACAGTTACACGTGTTGCAGATGAACCGCAATGTGATGCAGAGTATTCCTGTTGATGCACTTCAAAGTCTACCTAAACTCAACTACCTTGACATACGTAGTATTCCTTTAAGCTGCACCTGCAAGAACAGCTTGCTGCAAAACTGGCTACAAAATAACTCAAATGTCCAGATAGTCTATCTCCACAGTCTGAAATGCCAGAATGAACCATCAATTAAATTCTACAACTTTGATACTAAAGTTTGCTACATAGATCTAGGTGAGTACCTGTTCTTGAGCACAGCAGCTGTGGTCTTCCTGTTAACAGTCTGTCCCTTACTTTATGTAAAACTCTATTGGAAATTTAAGTACAGCTACTATGTTTTCCGTTCCTGGTTTAGTGAGCAGTGGCGCAGACTCAGGGAGAAGGAGGATAACTGCAAATATGATGCATTTATTTCCTACAATTCCTCTGATGAACAGTGGGTCATGGATCAGTTAGTGCCTAACCTGGAGGGAAATGGATCATCTTTTAAACTTTGCCTACATCACAGGGACTTTGAACTGGGCCGTGACATCGTGGACAACATTGTCTCTGCTGTTTACAGCAGCCGGAAAACTATTTGTGTGGTGAGCAGGAATTTCCTACAAAGTGAGTGGTGTTCTCTGGAAATCCAGCTCGCCAGCTACCGACTCTTCGATGAGCACAGAGATGTTCTTCTGCTCGTGTTTCTGGAGCCGATCTCTGAGAGGCAGTTGTCGTCCTATCACCGCATGAGGAAAGTCATGCTAAAAAAGACTTATCTGCAGTGGCCGGGCTCAAACTGCACTGATCCAATGCAGGCCCAAGAACTGTTCTGGAACCAGCTACGTAGGGGGATGAGAATGGAGAGCAGGCTCGAAACAGAAGACAGCACCAGAAGTGATGATGAAATGGATCATTTAGAGACATCTGATGAGAACTATTACTTGCAACCTTAAAAAAAAAAAATTAAGTGATAAACCCTTCAGCATTTTAAACGAATAATTAAATTAGGCTGTAGGGAGAGGGTCATGTAAATATCTTAATGTACAGTGTGATGCATTGTATGATCAACAAAAACATAATTTATATGAAAATGAATCAGCATTCATTTAATATCTGGTGATCGGAATTTTTATTTTATTTTGTATATTTGATGTTTGGCATTCCTCTATTGTACAATTGCACAATGTGTTTCTTGCATGTTAATGCAGCCCACACACAAAAAGAATAACTGACTAACTATTATAATAGCACAGCCTTTGCAAAACATATTCCTCTGTACAGAATTTCCCATTATAGCACGTGTTAATTAAAGTGTGTTCTGTAAATTAAAACAATGCTCTAGAGATACAGACTCCTAATTGTGTTTTTCTTTATCTGTTAAACAAGACAAATTAATAAAAGAGGAAACTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

使用DNAStar软件包中的EditSeq软件编辑得到的TLR21基因全长cDNA寻找开放阅读框，翻译成氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所述。 TLR21基因编码的蛋白质，分子量为112.7KDa，等电点为8.66。

TLR21基因cDNA全长3687 bp，含有2922bp的开放阅读框，编码973个氨基酸，其中前23个氨基酸序列为信号肽序列。TLR21基因的起始密码子上游有五个中止密码子TAA，距poly A尾12个碱基位置存在加尾信号AATAAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为TLR21基因的全长cDNA序列。

应用实例：

本发明进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR21基因序列在制备作为实时荧光RT-PCR检测牙鲆疾病防治方面的应用。

主要是采用TLR21基因序列的实时荧光RT-PCR检测：

(1) 引物设计：

根据SEQ ID NO 1所述TLR21的全长序列，使用Primer 5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：

TLR21-q-F：5'-TAAACTTTGCCTACATCACA-3'

TLR21-q-R：5'- AACACGAGCAGAAGAACAT -3'

TLR21的PCR产物预计长度为198 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。

同时，根据NCBI里提供的牙鲆β-actin的cds序列(EU090804)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：

β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3'

β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'

β-actin的PCR产物预计长度为150 bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。

(2) 牙鲆感染实验：近期未施用过疫苗的健康牙鲆（体长8-10 cm）50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射活菌0.1 mL（10⁵个鳗弧菌）继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离头肾组织。

(3) 总RNA提取与纯化：同实施例2。

(4) cDNA第一链合成：cDNA第一链的合成采用上海生工的Protocol-BS249&BS250 MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的随机六合引物或Oligo(dT)18引物，以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL。

(5) 实时荧光PCR：实时荧光PCR采用上海生工的Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)试剂盒进行。以上述（3）中合成的cDNA第一链为模板，用上述（1）中所设计的特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

Components每管成分	Volume体积(μL)
		Hotstart Fluc-PCR mix 热启动荧光PCR混合物	25
Sense primer正向引物 (25 pmol/μL)	1
		Anti-sense primer反向引物 (25 pmol/μL)	1
cDNA第一链 (μL)	3
		ddH₂O (μL)	20
Total Volume总体积 (μL)	50

实时荧光PCR扩增参数设置如下：

94℃ 4 min ；

94℃ 30 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s (40个循环);

72℃ 10 min；12℃保温。

(6) 感染牙鲆的头肾组织中TLR21基因的相对表达量计算：

实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算牙鲆病源感染各时间段下的△Ct、△△Ct，及2^-(ΔΔCt) 值，计算方式如下：

△ Ct = Ct — Ct内对照（β-actin）

△△Ct = △Ct — △Ct（未感染的健康牙鲆）

以2^-(ΔΔCt)数值表示感染牙鲆头肾中TLR21基因相对于健康牙鲆的表达倍数。

图7为感染牙鲆头肾组织中TLR21基因的相对表达量。从图中看出鳗弧菌感染48 h及120 h的牙鲆其头肾组织中TLR21基因表达量远远高出健康牙鲆（即0时间的表达量），结果提示TLR21基因参与了牙鲆的免疫调节，当TLR21基因相对表达量增高时，牙鲆可能处于病原感染状态，虽然此时还不能从肉眼观察到牙鲆体表上有任何感染病症。因此TLR21基因表达量在一定程度上反映了牙鲆的免疫系统活度，可以通过监测牙鲆头肾组织TLR21基因表达量的变化，初步判断牙鲆是否感染病源，提早采取预防治疗措施，避免势态严重发展造成不可挽回的损失。

序列表

<110> 天津师范大学

<120> 牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3687

<212> DNA

<213> 牙鲆TLR21基因

<400> 1

cttcttttgt actgtcgatt tctctggaaa cacatcccca gttggtgaga tcccaggcga 60

ggactgcagc tgatttaaga aacctggtga cagcggagtt cggttctggt gagatgcagt 120

aacatcacta attggacgtg cagtgcagac catcataaaa aggattcctg tgccacgatc 180

aacgaatgaa cgacccagag gtcttttcca catattcaaa caaaccaaat ctaaagagac 240

cagcgatttg aaaggccttt ctctggactg caacaagaaa aaatgtcccg tctaacttat 300

cagttcttgt cagttgccct tattcttggt gctgctcaac tcatcagaag ttacagctat 360

gacaactgca ttgaaaaacc gtactcaaag ggaaaaatct tcaactgcat ccatcgaaag 420

ggaaacctat ctgctattat aagtgatctg ccgtcatctg tcaccaatct caccatctca 480

cttgatccag tagtgcacat tctcaactac agctttgatc atctaactga acttcagaac 540

ctcagattag atcataacct cttgaggagc atcgatcaat ttgctttcca taacttgcat 600

caacttcact ccctaaattt gtcttttaac aacatatccc agctgaagcc tagagcgttt 660

cgggggcttc acaacctcac ctttctctct ctgacccaca ataaattaaa gcagcttcct 720

gagagaattt tctctaccaa tctcaatcta accaagttaa tcatgaggga aaaccttctg 780

acaaatttct ctgggattgt cgagtctgtg tcacatctga cgaatctaaa gacactagac 840

ctctgcgtta acagtttgac ctcccttagc cactcaaatg tgtcactacc cacatccctc 900

actgttttgt atttgtgtag aaataatttg tccacgttag gatgtgagag ttcatttctc 960

aggttcatta acgttctaga cttgtcgaac aattctatgc tccaaacgat ggcttttcaa 1020

ggagtgaatt tgaaacgtgt gaactatttg cgtttgcgtt caacgagtgt caaggtagtg 1080

gagtttttaa acatcagtaa cattgatgca agacgagttg atttctctgg cacaggtcta 1140

caaaatgaca gcctgctcac agagctatgc agattgttaa aaagaaaagt ggaacagata 1200

aaagatttgc agctgggttt taatgggatt acgactctta ccagctacac actgtactat 1260

tgtcctcaga tcacaaggtc tctggatcta tcccgcaatc gcctgcacaa aagcacaaat 1320

tgccttacat tcctccatag acatacacag ataaagagcc taactatgga gcataacctt 1380

ctcacctccc tccaatcctg taacaataca aacaatgtac atttcaaaga tctagaatca 1440

ctgagctatc gttacaaccg catcctctca gtgaatgctt tagctttcta tcatttacca 1500

aatatcaaga cgctactcct taacataaac acaattgctt ttctccatca gaaggctctc 1560

acagggctga gaaggcttga ggaactccgc ttggacaaca acctcttaac ggatttgttc 1620

aaggataact ttaaagataa tgtcaatctg aaaatcctta acctacgcaa caatcgtatt 1680

tctgtcatct tcaatgagac cttctgtacg ctcagcaacc tgactacatt ggaccttgga 1740

ggtaataaga tcgctcatat acggccgtca ggttttgatg gactaataag tctgtccaaa 1800

ctctatctag atggaaacaa cctcaaacac attgacacgt ccctgtatca tatatttcaa 1860

gatacactca cagtgctgga tctacaaaat aatcagttta gttttctcac tgaaactacg 1920

gagtcaccat ttaagaatct catcaaactc agtgatctga agttggacag gcagcggcct 1980

catggcatga ctattttacc ccatgcttat ttccgtggcc tccactcatt gagatcactg 2040

tatctcacca acaataatct caataatctt gcccctgatg cgtttgatga tctgaaaggc 2100

ttgcgtttcc tcaacctgga gagctgctgc gtcggggtgg taaaactgca accaggaatc 2160

ttcaaaaatc tgagaaattt gaccaaattg attgtagaaa atatgggcat tcagaacttc 2220

tcaaaggagg tttttgggaa tcttacacag ttacacgtgt tgcagatgaa ccgcaatgtg 2280

atgcagagta ttcctgttga tgcacttcaa agtctaccta aactcaacta ccttgacata 2340

cgtagtattc ctttaagctg cacctgcaag aacagcttgc tgcaaaactg gctacaaaat 2400

aactcaaatg tccagatagt ctatctccac agtctgaaat gccagaatga accatcaatt 2460

aaattctaca actttgatac taaagtttgc tacatagatc taggtgagta cctgttcttg 2520

agcacagcag ctgtggtctt cctgttaaca gtctgtccct tactttatgt aaaactctat 2580

tggaaattta agtacagcta ctatgttttc cgttcctggt ttagtgagca gtggcgcaga 2640

ctcagggaga aggaggataa ctgcaaatat gatgcattta tttcctacaa ttcctctgat 2700

gaacagtggg tcatggatca gttagtgcct aacctggagg gaaatggatc atcttttaaa 2760

ctttgcctac atcacaggga ctttgaactg ggccgtgaca tcgtggacaa cattgtctct 2820

gctgtttaca gcagccggaa aactatttgt gtggtgagca ggaatttcct acaaagtgag 2880

tggtgttctc tggaaatcca gctcgccagc taccgactct tcgatgagca cagagatgtt 2940

cttctgctcg tgtttctgga gccgatctct gagaggcagt tgtcgtccta tcaccgcatg 3000

aggaaagtca tgctaaaaaa gacttatctg cagtggccgg gctcaaactg cactgatcca 3060

atgcaggccc aagaactgtt ctggaaccag ctacgtaggg ggatgagaat ggagagcagg 3120

ctcgaaacag aagacagcac cagaagtgat gatgaaatgg atcatttaga gacatctgat 3180

gagaactatt acttgcaacc ttaaaaaaaa aaaattaagt gataaaccct tcagcatttt 3240

aaacgaataa ttaaattagg ctgtagggag agggtcatgt aaatatctta atgtacagtg 3300

tgatgcattg tatgatcaac aaaaacataa tttatatgaa aatgaatcag cattcattta 3360

atatctggtg atcggaattt ttattttatt ttgtatattt gatgtttggc attcctctat 3420

tgtacaattg cacaatgtgt ttcttgcatg ttaatgcagc ccacacacaa aaagaataac 3480

tgactaacta ttataatagc acagcctttg caaaacatat tcctctgtac agaatttccc 3540

attatagcac gtgttaatta aagtgtgttc tgtaaattaa aacaatgctc tagagataca 3600

gactcctaat tgtgtttttc tttatctgtt aaacaagaca aattaataaa agaggaaact 3660

tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3687

<210> 2

<211> 973

<212> 氨基酸序列

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 2

Met Ser Arg Leu Thr Tyr Gln Phe Leu Ser Val Ala Leu Ile Leu Gly

1 5 10 15

Ala Ala Gln Leu Ile Arg Ser Tyr Ser Tyr Asp Asn Cys Ile Glu Lys

20 25 30

Pro Tyr Ser Lys Gly Lys Ile Phe Asn Cys Ile His Arg Lys Gly Asn

35 40 45

Leu Ser Ala Ile Ile Ser Asp Leu Pro Ser Ser Val Thr Asn Leu Thr

50 55 60

Ile Ser Leu Asp Pro Val Val His Ile Leu Asn Tyr Ser Phe Asp His

65 70 75 80

Leu Thr Glu Leu Gln Asn Leu Arg Leu Asp His Asn Leu Leu Arg Ser

85 90 95

Ile Asp Gln Phe Ala Phe His Asn Leu His Gln Leu His Ser Leu Asn

100 105 110

Leu Ser Phe Asn Asn Ile Ser Gln Leu Lys Pro Arg Ala Phe Arg Gly

115 120 125

Leu His Asn Leu Thr Phe Leu Ser Leu Thr His Asn Lys Leu Lys Gln

130 135 140

Leu Pro Glu Arg Ile Phe Ser Thr Asn Leu Asn Leu Thr Lys Leu Ile

145 150 155 160

Met Arg Glu Asn Leu Leu Thr Asn Phe Ser Gly Ile Val Glu Ser Val

165 170 175

Ser His Leu Thr Asn Leu Lys Thr Leu Asp Leu Cys Val Asn Ser Leu

180 185 190

Thr Ser Leu Ser His Ser Asn Val Ser Leu Pro Thr Ser Leu Thr Val

195 200 205

Leu Tyr Leu Cys Arg Asn Asn Leu Ser Thr Leu Gly Cys Glu Ser Ser

210 215 220

Phe Leu Arg Phe Ile Asn Val Leu Asp Leu Ser Asn Asn Ser Met Leu

225 230 235 240

Gln Thr Met Ala Phe Gln Gly Val Asn Leu Lys Arg Val Asn Tyr Leu

245 250 255

Arg Leu Arg Ser Thr Ser Val Lys Val Val Glu Phe Leu Asn Ile Ser

260 265 270

Asn Ile Asp Ala Arg Arg Val Asp Phe Ser Gly Thr Gly Leu Gln Asn

275 280 285

Asp Ser Leu Leu Thr Glu Leu Cys Arg Leu Leu Lys Arg Lys Val Glu

290 295 300

Gln Ile Lys Asp Leu Gln Leu Gly Phe Asn Gly Ile Thr Thr Leu Thr

305 310 315 320

Ser Tyr Thr Leu Tyr Tyr Cys Pro Gln Ile Thr Arg Ser Leu Asp Leu

325 330 335

Ser Arg Asn Arg Leu His Lys Ser Thr Asn Cys Leu Thr Phe Leu His

340 345 350

Arg His Thr Gln Ile Lys Ser Leu Thr Met Glu His Asn Leu Leu Thr

355 360 365

Ser Leu Gln Ser Cys Asn Asn Thr Asn Asn Val His Phe Lys Asp Leu

370 375 380

Glu Ser Leu Ser Tyr Arg Tyr Asn Arg Ile Leu Ser Val Asn Ala Leu

385 390 395 400

Ala Phe Tyr His Leu Pro Asn Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asn Ile Asn

405 410 415

Thr Ile Ala Phe Leu His Gln Lys Ala Leu Thr Gly Leu Arg Arg Leu

420 425 430

Glu Glu Leu Arg Leu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Asp Leu Phe Lys Asp

435 440 445

Asn Phe Lys Asp Asn Val Asn Leu Lys Ile Leu Asn Leu Arg Asn Asn

450 455 460

Arg Ile Ser Val Ile Phe Asn Glu Thr Phe Cys Thr Leu Ser Asn Leu

465 470 475 480

Thr Thr Leu Asp Leu Gly Gly Asn Lys Ile Ala His Ile Arg Pro Ser

485 490 495

Gly Phe Asp Gly Leu Ile Ser Leu Ser Lys Leu Tyr Leu Asp Gly Asn

500 505 510

Asn Leu Lys His Ile Asp Thr Ser Leu Tyr His Ile Phe Gln Asp Thr

515 520 525

Leu Thr Val Leu Asp Leu Gln Asn Asn Gln Phe Ser Phe Leu Thr Glu

530 535 540

Thr Thr Glu Ser Pro Phe Lys Asn Leu Ile Lys Leu Ser Asp Leu Lys

545 550 555 560

Leu Asp Arg Gln Arg Pro His Gly Met Thr Ile Leu Pro His Ala Tyr

565 570 575

Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Arg Ser Leu Tyr Leu Thr Asn Asn Asn

580 585 590

Leu Asn Asn Leu Ala Pro Asp Ala Phe Asp Asp Leu Lys Gly Leu Arg

595 600 605

Phe Leu Asn Leu Glu Ser Cys Cys Val Gly Val Val Lys Leu Gln Pro

610 615 620

Gly Ile Phe Lys Asn Leu Arg Asn Leu Thr Lys Leu Ile Val Glu Asn

625 630 635 640

Met Gly Ile Gln Asn Phe Ser Lys Glu Val Phe Gly Asn Leu Thr Gln

645 650 655

Leu His Val Leu Gln Met Asn Arg Asn Val Met Gln Ser Ile Pro Val

660 665 670

Asp Ala Leu Gln Ser Leu Pro Lys Leu Asn Tyr Leu Asp Ile Arg Ser

675 680 685

Ile Pro Leu Ser Cys Thr Cys Lys Asn Ser Leu Leu Gln Asn Trp Leu

690 695 700

Gln Asn Asn Ser Asn Val Gln Ile Val Tyr Leu His Ser Leu Lys Cys

705 710 715 720

Gln Asn Glu Pro Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Phe Asp Thr Lys Val Cys

725 730 735

Tyr Ile Asp Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Leu Ser Thr Ala Ala Val Val

740 745 750

Phe Leu Leu Thr Val Cys Pro Leu Leu Tyr Val Lys Leu Tyr Trp Lys

755 760 765

Phe Lys Tyr Ser Tyr Tyr Val Phe Arg Ser Trp Phe Ser Glu Gln Trp

770 775 780

Arg Arg Leu Arg Glu Lys Glu Asp Asn Cys Lys Tyr Asp Ala Phe Ile

785 790 795 800

Ser Tyr Asn Ser Ser Asp Glu Gln Trp Val Met Asp Gln Leu Val Pro

805 810 815

Asn Leu Glu Gly Asn Gly Ser Ser Phe Lys Leu Cys Leu His His Arg

820 825 830

Asp Phe Glu Leu Gly Arg Asp Ile Val Asp Asn Ile Val Ser Ala Val

835 840 845

Tyr Ser Ser Arg Lys Thr Ile Cys Val Val Ser Arg Asn Phe Leu Gln

850 855 860

Ser Glu Trp Cys Ser Leu Glu Ile Gln Leu Ala Ser Tyr Arg Leu Phe

865 870 875 880

Asp Glu His Arg Asp Val Leu Leu Leu Val Phe Leu Glu Pro Ile Ser

885 890 895

Glu Arg Gln Leu Ser Ser Tyr His Arg Met Arg Lys Val Met Leu Lys

900 905 910

Lys Thr Tyr Leu Gln Trp Pro Gly Ser Asn Cys Thr Asp Pro Met Gln

915 920 925

Ala Gln Glu Leu Phe Trp Asn Gln Leu Arg Arg Gly Met Arg Met Glu

930 935 940

Ser Arg Leu Glu Thr Glu Asp Ser Thr Arg Ser Asp Asp Glu Met Asp

945 950 955 960

His Leu Glu Thr Ser Asp Glu Asn Tyr Tyr Leu Gln Pro

965 970

Claims

1.牙鲆模式识别受体TLR21的基因序列，该TLR21基因cDNA全长3687 bp，含有2922 bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的基因序列，其中所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；该序列编码973个氨基酸，分子量为112.7 KDa，等电点为8.66。

3. 权利要求1所述牙鲆模式识别受体TLR21基因序列在制备作为实时荧光RT-PCR检测牙鲆疾病防治方面的应用。