CN102586349B - 一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法 - Google Patents

一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法 Download PDF

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Abstract

以博伊丁假丝酵母Candida boidinii CGMCC 2159整细胞为生物催化剂，区域选择性和对映选择性催化2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯为（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯，收率92%，ee99%。（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯利用Pd-C催化氢化为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，收率98%，ee99%。本发明提出的方法具有收率和光学纯度高，环境友好的特点，适合血管紧张素转化酶抑制剂-普利类抗高血压药物手性中间体（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的高效制备。

Description

一种微生物还原和化学催化氢化组合制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法
技术领域
本发明涉及一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法，属于生物-化学催化还原手性药物中间体技术领域。
背景技术
（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是血管紧张素转化酶抑制剂-普利类抗高血压药物的关键手性中间体，其制备方法主要包括化学法和生物法。
化学法：化学法包括化学拆分法和化学不对称合成法。
化学拆分法通常采用手性有机胺如（S）-1-对苯基乙胺、（S）-2-苯基-3-甲基丁胺、氯霉素中间体D-（-）-苏式-2-氨基-1（4-硝基苯基）-1，3-丙二醇为拆分剂对（R,S）-2-羟基-4-苯基丁酸进行拆分，然后酯化为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。由于手性胺价格通常比较昂贵，拆分收率低，因而使用价值不大。
以D-苹果酸等为手性源合成（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（例如公开号EP0759424），不仅手性源价格昂贵，而且步骤繁多，副产物多，导致分离纯化困难。采用Pt/Al2O3/H2体系，以10，11-二氢辛可尼定和10，11-二氢辛可尼定甲醚为手性修饰催化氢化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，需要高温高压，对映选择性不高（ee 91%）（J Am Chem Soc，1999，121，4920-4921）。
生物法：生物法包括生物拆分法和生物合成法。
生物拆分法通常以脂肪酶如Novozymes 435、Pseudomonas cepacia脂肪酶为生物催化剂催化（R,S）-2-羟基-4-苯基丁酸（乙酯）的对映选择性酰化或水解制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸（乙酯）。尽管这些脂肪酶具有高度的对映选择性，但生物拆分同化学拆分一样，产物的分离困难，理论收率仅为50%，而且另一对映体（S）-2-羟基-4-苯基丁酸（乙酯）很难消旋化。
与生物拆分法相比，以产羰基还原酶菌株的整细胞为生物催化剂，通过2-羧基-4-苯基丁酸（乙酯）对映选择性还原制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸（乙酯）更有潜在的应用价值。Stewart等（J Mol Catal B: Enzymatic, 2002, 17, 101-105）采用源于Saccharomyces cerevisiae的脱氢酶Yprlp，以NADH为辅酶，还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，得到（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（97% ee）。Yun等人（Biotechnol Prog, 2005, 21, 366-371）采用重组E.coli BL21，在NADPH存在下，还原2-羰基-4-苯基丁酸得到97% ee的（R）-2-羟基-4-苯基丁酸。Baskar等（J Mol Catal B: Enzymatic, 2004, 27, 13-17）报道了采用野生胡萝卜细胞还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，尽管ee达到99%，但反应时间太长，需要10天。以Candida boidinii CGMCC 2.2159整细胞催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯还原制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，收率92%，ee 99%（CN101314784，Adv Synth Catal, 2008, 350, 426-430）。
以微生物整细胞为生物催化剂催化还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，由于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯在水中的溶解度太差，不得不采用低的底物浓度，因而转化效率太低。此外，作为原料的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯通常是苯乙基溴和草酸二乙酯通过格氏反应合成的，因而成本较高。因此，开发更清洁的环境友好的（R）-2-羟基羟基-4-苯基丁酸乙酯制备方法是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，提高（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的收率和光学纯度。
本方法以廉价的2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯为原料，利用微生物中的羰基还原酶，区域选择性和对映选择性催化还原为（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯并进一步利用Pd-C催化氢化为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
技术路线如下：
一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法，包括如下步骤：
（1）细胞培养：将粪产碱杆菌、节杆菌或木糖氧化无色杆菌用培养基Ⅰ，28℃培养48h，离心，获得湿菌体Ⅰ；或将博伊丁假丝酵母或皮状丝孢酵母用培养基Ⅱ，28℃培养48h，离心，获得湿菌体Ⅱ；
（2）按如下反应体系催化2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯还原为（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯：每10mg 2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯与50mg葡萄糖和1g湿菌体Ⅰ或湿菌体Ⅱ以及10mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液混合，pH7.0，30℃下搅拌反应12~24h。
（3）将（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯溶解在1mol/L HCl-乙醇溶液中，加入Pd-C催化剂，通入氢气，反应6h，过滤，减压浓缩至干，得到（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：1）筛选的产羰基还原酶菌株Candida boidinii CGMCC 2159具有高度的区域选择性和对映选择性，能够有效催化2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯还原为（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯，无副产物产生，简化了分离过程；2）生物催化与Pd-C催化氢化的组合制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，收率和光学纯度高，过程绿色，成本低廉。
具体实施方式
以下是以博伊丁假丝酵母Candida boidinii CGMCC 2159细胞为生物催化剂，催化2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯区域选择性和对映选择性还原，制备（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯并进一步采用Pd-C催化剂催化氢化为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1：2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯制备
    将13.6g 乙醇钠加入100mL苯中，5~10℃下滴加29.2ml（0.2mol）草酸二乙酯，然后搅拌下滴加22.8mL（0.2mol）苯乙酮，5~10℃下搅拌过夜，过滤，黄色固体用苯洗涤（2×50mL），然后分散在50mL盐酸溶液中（6mol/L），加入50mL异丙醚萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，减压蒸干，得黄色油状物，用正己烷重结晶，得淡黄色固体42g，收率90%。      
实施例2：产羰基还原酶菌株筛选
Alcaligenes faecalis CGMCC 1786、1837、2006或Arthrobacter sp.CGMCC 1008或Achrombacter xylosoxidans subsp. denitrificans CGMCC 2679或Achromobater xylosoxidans subsp. xylosoxidans CGMCC 2007的培养基Ⅰ组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏3、氯化钠5，培养基ⅠpH7.0。
Candida boidinii CGMCC 2162、2159或 Trichosporon cutaneum CGMCC 570的培养基Ⅱ组成为（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5、葡萄糖1，培养基ⅡpH7.0。
上述菌株细胞在28℃下培养48h，离心10min（8000rpm），收集菌体，用冷生理盐水洗涤两次，得细胞湿菌体Ⅰ或湿菌体Ⅱ。
筛选反应条件：1g湿菌体Ⅰ或湿菌体Ⅱ悬浮在10mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（50mmol/L，pH7.0）中，加入50mg葡萄糖和10mg 2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯，30℃下摇床反应12或24h，离心，上清液用乙酸乙酯萃取(3×10mL)，有机层合并，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，手性液相色谱测定产率和对映体过量（ee）。
分析方法：色谱柱：Chiracel OD-H（5×250mm），流动相：正己烷/异丙醇（90：10，v/v），流速：1.0ml/min，检测波长：254nm，温度：25℃。
序号 菌株 时间（小时） 产率(%) 对映体过量(%)
1 粪产碱杆菌 CGMCC 1786 24 95 10 (R)
2 粪产碱杆菌CGMCC 1837 12 22 13 (R)
3 粪产碱杆菌 CGMCC 2006 24 37 55 (R)
4 节杆菌CGMCC 1008 24 91 48 (R)
5 木糖氧化无色杆菌反硝化亚种CGMCC 2679 24 88 16 (R)
6 木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种CGMCC 2007 24 89 56 (R)
7 博伊丁假丝酵母 CGMCC 2162 12 44 16 (R)
8 博伊丁假丝酵母CGMCC 2159 12 88 99 (R)
9 皮状丝孢酵母CGMCC 570 12 13 39 (R)
    由上表，对映体过量（ee）最高的为博伊丁假丝酵母Candida boidinii CGMCC 2159的99%，所以最优的选用博伊丁假丝酵母Candida boidinii CGMCC 2159细胞。
实施例3：（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯制备
    将1000g 博伊丁假丝酵母Candida boidinii CGMCC 2159湿菌体悬浮在10L 0.1mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中（pH7.0），加入50g葡萄糖和10g 2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯，30℃下搅拌反应12h，TLC跟踪反应。反应完全后，离心去除细胞，滤液浓缩至500ml左右，用乙酸乙酯萃取（3×500ml），有机层合并，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，减压蒸出溶剂，得淡黄色（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯固体9.5g，收率95%，对映体过量ee99%。
实施例4：（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯制备
    将2.2g（10mmol）（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸溶解在20ml 1M HCl-乙醇溶液中，加入0.2g 5% Pd-C催化剂，通入氢气，反应6h。反应完成后，过滤，减压浓缩至干，得（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯2.1g，收率98%，对映体过量ee99%。

Claims (1)

1.一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法，包括如下步骤：
（1）细胞培养：将博伊丁假丝酵母用培养基Ⅱ，28℃培养48h，离心，获得湿菌体Ⅱ；其中，所述博伊丁假丝酵母为Candida boidinii CGMCC 2.2159，所述培养基Ⅱ组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L、葡萄糖1g/L，培养基pH7.0；
（2）按如下反应体系催化2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯还原为（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯：每10mg 2，4-二羰基-4-苯基丁酸乙酯与50mg葡萄糖和1g湿菌体Ⅱ以及10mL 50mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液混合，pH7.0，30℃下搅拌反应12~24h；
（3）将（R）-2-羟基-4-羰基-4-苯基丁酸乙酯溶解在1mol/L HCl-乙醇溶液中，加入Pd-C催化剂，通入氢气，反应6h，过滤，减压浓缩至干，得到（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
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