CN101338287A

CN101338287A - 枯草芽孢杆菌酯酶及其用于生产l-薄荷醇的应用

Info

Publication number: CN101338287A
Application number: CNA2008100409889A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 郑高伟; 潘江; 郁慧蕾
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2009-01-07
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: CN101338287B

Abstract

本发明公开了一株产对映选择性酯酶的枯草芽孢杆菌以及利用该酯酶生产高浓度l－薄荷醇的应用和方法，以克服现有技术存在的缺陷。所述的酯酶为利用土壤分离菌－保藏号为CGMCC2548的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ECU0554培养所得的整细胞或细胞破碎所得的提取物。采用本发明的枯草芽孢杆菌酯酶催化dl－薄荷酯的对映选择性水解生产l－薄荷醇的工艺具有显著的优点，不仅反应条件温和，而且选择性高，当底物转化率接近50％时，产物的光学纯度仍达96％ee以上。特别是生物催化剂的稳定性好，并能耐受较高的底物或产物浓度，产物l－薄荷醇的浓度可达182mM，具有很好的工业应用前景。

Description

枯草芽孢杆菌酯酶及其用于生产l-薄荷醇的应用

技术领域

本发明涉及一株耐受高底物浓度的枯草芽孢杆菌以及利用该菌株所产的酯酶催化dl-薄荷酯的对映选择性水解生产l-薄荷醇的应用和方法。

技术背景

薄荷醇有八种异构体，它们的呈香性质各不相同，其中l-薄荷醇不但具有特殊香气和香味而且还有清凉效果，被大量用于香烟、化妆品、牙膏、口香糖、甜食、药物和涂擦剂中，是目前世界上销量最大的香料化合物之一。l-薄荷醇主要是从天然植物-薄荷中提取的，所以又叫天然薄荷醇。

随着社会经济的飞速发展，人们物质水平的不断提高，对薄荷产品的需求也日益上升。然而，由于受天气、季节、区域和市场价格等的影响，天然薄荷醇已经无法满足现代工业迅猛增长的需要。为了弥补市场上天然薄荷醇的不足，人们通过合成的方法来制备薄荷醇。然而由于合成的薄荷醇多数是外消旋混合物，相对于天然薄荷醇，虽也有清凉效果，但是由于其中d-薄荷醇的存在，其气味和味道均明显劣于天然存在的l-薄荷醇。所以，为了使人工合成的薄荷醇得到实际应用，必须将dl-薄荷醇的对映体进行拆分，得到具有和天然薄荷醇相同香气和香味的单一构型l-薄荷醇。尽管合成法制备的l-薄荷醇需要从外消旋体中进行分离，分离步骤多且得率不高，但所得产物的品质并不亚于从薄荷叶中提取的天然薄荷醇，而且合成的l-薄荷醇具有产量高和价格低的优势。

dl-薄荷醇对映体的拆分通常使用的技术主要包括：化学与物理相结合的方法和生物催化手性拆分的方法。

所谓的化学与物理相结合的拆分方法，一种是通过光学活性试剂的方法拆分，即利用光学活性试剂与dl-薄荷醇反应生成的两种非对映体化合物的物理性质的不同，通过分步结晶将其分开，然后分别进行水解，从而实现dl-薄荷醇分离的一种技术。例如，光学活性试剂-薄荷氧基乙酸与dl-薄荷醇进行酯化反应，然后通过分步结晶的方法将这两种非对映化合物分离，继而水解得到单一构型的薄荷醇。另外一种是通过非光学活性试剂的方法拆分，即在外消旋混合物的饱和溶液中，加入单一对映体作为晶种，相应构型的对映体就会被优先诱导结晶而析出，而另一种对映体仍保留在溶液中，从而实现对应体分离的一种技术。例如，Harrmann&Reimer公司(J.Fleischer，K.Bauer，R.Hopp，DE 2 109 456，1971；US Patent 3 491 381，1976)报道了将薄荷醇的外消旋体通过化学的方法转酯化生成相对应的安息香酸薄荷酯的外消旋体，然后引入具有光学活性的安息香酸薄荷酯的左旋对映体晶种，诱导安息香酸薄荷酯中的左旋对映体优先结晶析出，从而实现这两种薄荷酯对映体的分离。分离后l-安息香酸薄荷酯再进行化学水解，即可得到l-薄荷醇单一对映体。

上述这种分离方法存在很多缺点。首先，适合手性拆分的化合物类型不多，价格昂贵，且通常无法回收利用。其次，这种方法工艺繁琐，需要反复多次的分步结晶，损失比较大，拆分产率较低，且在生产过程中为了使外消旋混合物饱和，经常采用间歇式结晶，这无疑延长生产周期，增加生产成本。上述这些缺点极大地限制了其在工业上的应用步伐。

所谓生物催化的手性拆分方法，即是指利用微生物或酶对外消旋混合物中某一个异构体具有高度的立体化学选择性，而对另一个异构体不起催化作用(或作用很小)，从而实现对映体分离的一种技术。由于该法反应条件温和，低能高效，绿色环保，最近几十年来引起了人们极大的关注。

从上世纪80年代起，dl-薄荷醇的生物催化手性拆分就引起了国内外的很大关注。到目前为止，国内外已经对其进行了大量的研究，主要是利用微生物或酶不对称催化酯化或转酯化反应，或者不对称催化酯的对映选择性水解反应。1981年，Omata等(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1981，11(4)，199-204)利用固定化的Rhodotorula minutavar.texensis细胞在水饱和的正庚烷中立体选择性水解dl-琥珀酸薄荷酯，得到＞99％ee的l-薄荷醇，但是得到的产物浓度低于15mM，而且细胞活性也不高，反应48h后转化率只有30％。2004年，Gatfield等(Gatfield I.L.，Hilmer J.M.，et al.，US Patent 6 706 500，2004)利用重组的Candida rugosa Lipase LIP1催化dl-安息香酸薄荷酯的对映选择性水解制备l-薄荷醇，虽然该酶催化所得的产物l-薄荷醇纯度很高(ee_p＞99％)，但是该反应的底物浓度非常低(0.5mM)，没有实际应用价值。南非的CSIR组织(Chaplin J.A.，Gardiner N.S.，etal.，WO 0 236 975，2002)利用来自Pseudomonas fluorscens的脂肪酶Amano AK对映选择性地转酯化拆分dl-薄荷醇制备l-薄荷醇，但是该过程的转化率也较低，只有20％左右。

综上所述，利用生物催化法拆分dl-薄荷醇，虽然已经取得了很大的进展，具有广阔的发展前景，但是目前仍普遍存在着底物或产物浓度低，转化率低等这样或那样的缺点。这些缺点的存在势必造成反应体系中产物浓度不高，给产品的分离带来很大的困难，增加分离的成本，因而在很大程度上影响其工业化的应用。

发明内容

本发明的目的在于(1)：提供一株能够对映选择性地催化水解高浓度底物的产酯酶的枯草芽孢杆菌；(2)：提供一种利用该酯酶催化dl-薄荷醇的芳香酸酯或者脂肪酸酯的对映选择性水解生产高浓度产物l-薄荷醇的应用和方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明提到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ECU0554)，是本发明的发明人从来自山东的土壤样品中，经初筛、复筛及分离纯化而得到的一株能够产酯酶和耐受高浓度底物的新菌株。根据它的16S rDNA序列，鉴定为Bacillus subtilis。该菌株已于2008年6月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC2548。

本发明的菌种具有如下微生物学特征：

1.形态特征：

杆状，很少成链，染色均匀，鞭毛侧生，为内生孢子，大小为0.7～0.9μm×1.5～2.0μm。

2.平板固体培养基上的菌落特征(30℃，24h)：

圆形，1～4mm；培养初期为透明、粘稠状，而后菌落表面出现褶皱。

3.生长环境

可在温度10～50℃下生长，pH 3～8，盐浓度0～10％的条件下生存。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548可用于催化dl-薄荷醇的芳香酸酯或者脂肪酸酯的对映选择性水解生产l-薄荷醇，包括如下步骤：

(1)对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548进行培养：

培养基的组成及浓度(g/L)：甘油10～80，蛋白胨1～20，酵母膏1～20，NaCl0.1～3，MgSO₄0.1～3和KH₂PO₄0.1～3，pH 5～9，基于培养基体积，接种量为1～10％(v/v)，培养温度为15～40℃，培养时间为12～48h。培养结束后，离心收集细胞或经过进一步处理制备粗酶。

(2)将上述步骤(1)制备所得的生物催化剂(细胞或粗酶)加入到含有助溶剂的缓冲液中，催化底物酯的对映选择性水解，然后从反应混合物中收集水解生成的产物-光学纯的l-薄荷醇，具体步骤如下：

对映选择性地催化水解的反应条件：细胞浓度为10～200g/L，酯酶浓度为1～100g/L，底物浓度为10～500mM，反应温度为20～45℃，pH5～9.5，反应时间为0.5～24h。产物的对映体过量值(ee)和底物的转化率采用气相色谱分析，分析条件如下：GammaDex^TM120手性柱(Supelco，30m×0.25mm×0.25μm)；以N₂作为载气；进样口温度280℃，检测器温度350℃；采用程序升温：110℃保持15min后，以10℃/min的速度升温至180℃，保持2min。

所述的催化剂可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC2548)培养后离心收集的湿菌体或冷冻干燥的菌体，也可以是菌体经破碎后，通过无机盐、有机溶剂或聚合物进行沉淀所得的粗酶。

所述的缓冲液可以是pH为5～9.5的磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液。

所述的助溶剂可选择各种与水互溶的有机溶剂，优选的助溶剂为乙醇，加入量为反应体积的5～20％v/v。

所述的底物包括但不限于：氯乙酸薄荷酯，乙酸薄荷酯，丁酸薄荷酯，苯甲酸薄荷酯，琥珀酸薄荷酯。

本发明优选的底物为dl-乙酸薄荷酯。

采用本发明的枯草芽孢杆菌生产l-薄荷醇，具有显著的优点，在底物的转化率接近50％时，所得产物l-薄荷醇的光学纯度在96％ee以上，而且催化剂的稳定性好，能耐受较高浓度的底物和产物，反应条件温和。使用本发明的拆分工艺，能简单、方便地获得高光学纯度和高浓度的l-薄荷醇，且该法节能、环保，高浓度的产物有利于产物的回收，是一种高效的l-薄荷醇的生产方法，具有很好的工业应用前景。下面通过具体的实施例对本发明的内容作进一步的阐述。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548的发酵培养

发酵培养基(g/L)：甘油30，蛋白胨5，酵母膏5，NaCl1，MgSO₄0.2和KH₂PO₄0.5，pH7。121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却、接种，接种量6％(v/v)，在30℃，180rpm转速条件下进行发酵，培养18h后，菌体湿重可达20g/L，产酶可达97U/L，比活为4.9U/g湿细胞。

实施例28株候选菌株对dl-乙酸薄荷酯的对映选择性水解性能

取1.5g各菌株的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.0)中，分别加入20mg的dl-乙酸薄荷酯，反应混合物在30℃，180rpm的恒温摇床上反应，在表1中所示的时间取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)。各菌株的催化性能如表1所示。

表1候选菌株的催化性能比较

表1说明从土壤中筛选的这8株菌均具有很高的对映选择性催化活性，其中ECU0554和ECU0532反应速度最快，转化率最高。

实施例3候选菌株对不同浓度的dl-乙酸薄荷酯的耐受能力

取1.5g各菌株的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.0)中，分别加入不同浓度的dl-乙酸薄荷酯，反应混合物在30℃，180rpm的恒温摇床上反应24h。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率。各菌株对不同浓度的底物耐受情况如表2所示。

表2候选菌株对不同浓度的底物耐受情况的对比

表2说明随着底物浓度的增加，多数菌株的活性受到较高底物浓度的抑制，水解产物增加很少甚至减少，而只有菌株ECU0554在较高的底物浓度下(500mM)，仍能维持较高的转化率，得到高浓度的产物，说明该菌株具有很高的底物和产物耐受性，所以该菌株被筛选作为最优菌株用于以后的工作。

实施例4～7枯草芽孢杆菌酯酶对几种dl-薄荷醇的芳香酸酯或脂肪酸酯的酶促水解

以从Bacillus subtilis ECU055中的提取的粗酶为催化剂，dl-氯乙酸薄荷酯，dl-乙酸薄荷酯，dl-丁酸薄荷酯，dl-苯甲酸薄荷酯为底物，底物浓度为100mM，冻干粗酶粉20mg，0.2mL乙醇，缓冲体系是磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)，反应总体积为2mL。反应混合物在30℃，180rpm的恒温摇床上反应。反应时间如表3所示，反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)。结果如表3所示。

表3枯草芽孢杆菌酯酶对几种dl-薄荷醇的芳香酸酯或脂肪酸酯化合物的酶促水解

从上述实验结果可以看出，该酯酶虽能快速水解dl-氯乙酸薄荷酯，但是该水解过程是非专一性水解，催化其它三种底物的水解都能得到比较高的转化率和ee_p，但是催化dl-乙酸薄荷酯时，它的活性最高，时间大大缩短，3h转化率几乎接近50％，不仅反应速度快，而其专一性也很高，产物的光学纯度高达98％ee。

实施例8 温度对dl-乙酸薄荷酯的酶促水解的影响

将40mg的dl-乙酸薄荷酯(0.202mmol)、0.2mL乙醇、20mg冻干的粗酶粉加入到1.8mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中，混合均匀后分别置于20，30，40&50℃，180rpm的恒温摇床上反应振荡反应3h。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)。如表4所示，温度在20～40℃时，该酯酶具有很高的转化率，说明该温度范围内，该酯酶是比较稳定的，活性没有受到很大的损失。温度超过50℃时，该酯酶的转化能力大大下降，这可能是高温导致该酯酶的催化活性基团的构型发生变化，从而导致酶的活性下降。

表4温度对枯草芽孢杆菌酯酶催化dl-乙酸薄荷酯的酶促水解的影响

实施例9枯草芽孢杆菌酯酶对不同浓度薄荷酯的酶促水解

将浓度为100、250和500mM的dl-乙酸薄荷酯和0.2mL乙醇加入到磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)中，再分别加入相应量的酶(20、50&100mg)，反应混合物置于30℃，180rpm的恒温摇床上振荡反应，反应时间如表5所示。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_p)。结果如表5所示。

表5枯草芽孢杆菌酯酶对不同浓度的dl-乙酸薄荷酯的酶促水解

表5显示，该酯酶催化不同浓度的dl-乙酸薄荷酯时，产物浓度随着底物浓度的增加而增加，最高可达182mM，且仍保留较高的产物光学纯度。说明较高浓度的底物和产物对该枯草芽孢杆菌酯酶的活性没有造成太大的影响，该酯酶可以耐受高浓度的底物和产物。这是至今报道的生物催化法生产l-薄荷醇的方法中，生成产物浓度最高的例子。所以本发明的方法具有很广阔的实际工业应用前景。

实施例10l-薄荷醇的克级制备

将3.0gdl-乙酸薄荷酯与15mL乙醇和135mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)混合均匀后，加入0.5g粗酶。反应在恒温30℃的500-mL圆底烧瓶中进行，200rpm下机械搅拌。通过手性气相色谱监测底物的转化率和产物的对映体过量值。9h后停止反应，过滤除酶后，用乙酸乙酯萃取产物和底物，然后通过硅胶柱层析将二者分离，流动相为石油醚-乙酸乙酯(30∶1，v/v)，收集的组分经减压蒸馏脱除溶剂以及真空干燥后，得到目标产物和未反应的底物。最后所得的产物为具有特殊香气的无色固体，分离后总得率为42％(0.98g)，光学纯度为98％ee。

Claims

1.一种产酯酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ECU0554，保藏号为CGMCC2548。

2.一种以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌应用于生产l-薄荷醇。

3.一种以权利要求2所述的枯草芽孢杆菌应用于生产l-薄荷醇，其特征在于：将所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548进行发酵培养，将培养后的细胞或处理后得到的粗酶作为催化剂，在含有助溶剂的磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液中，催化dl-薄荷酯的对映选择性水解，然后从反应混合物中收集水解生成的l-薄荷醇。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养的培养基组成和浓度如下：甘油10～80g/L，蛋白胨1～20g/L，酵母膏1～20g/L，NaCl 0.1～3g/L，MgSO₄0.1～3g/L和KH₂PO₄ 0.1～3g/L。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的条件为：pH 5～9，温度15～40℃，相对于发酵培养基体积的接种量为1～10％v/v，培养时间为12～48h。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，催化剂为下列形式中的任意一种：

(1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548进行培养后，分离所得的细胞；

(2)采用匀浆方法将上述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC2548的细胞破碎后，制备得到的粗酶。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂为各种与水互溶的有机溶剂。

8.根据权利要求3和7所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂的添加量为反应总体积的5～30％。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的底物dl-薄荷酯为dl-薄荷醇与脂肪族或芳香族羧酸形成的酯。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的底物浓度为10～500mM，反应温度为20～50℃，反应时间为1～24h。