CN102031237A - 一种寡养单胞菌及其制备1-薄荷醇的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种寡养单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用。其寡养单胞菌可用于作为通过分离薄荷醇异构体混合物来制备l-薄荷醇的催化剂。制备l-薄荷醇的方法包括如下步骤：(1)将寡养单胞菌加到培养基中发酵培养；(2)将发酵液处理，制备得到固体催化剂；(3)将固体催化剂和底物加到有机溶剂中进行转化反应，得到转化液，底物包括薄荷醇异构体混合物和酰化剂；薄荷醇异构体混合物含有l-薄荷醇，且含有l-异薄荷醇、l-新异薄荷醇、l-新薄荷醇、d-薄荷醇、d-异薄荷醇、d-新异薄荷醇、d-新薄荷醇中的任一种或任几种；(4)将转化液处理以除去有机溶剂和未反应的底物，得到l-薄荷醇的酯化物；(5)将l-薄荷醇的酯化物水解，收集得到l-薄荷醇。

Description

一种寡养单胞菌及其制备1-薄荷醇的方法和应用 
技术领域
本发明涉及一种寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)以及制备l-薄荷醇(即(-)-薄荷醇，化学名为(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己醇)的方法。 
背景技术
薄荷醇又名六氢化百里酚，化学名为2-异丙基-5-甲基环己醇，俗名薄荷脑。薄荷醇分子具有3个手性中心，即8种对映异构体，分别为l-薄荷醇((1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-异薄荷醇((1R，2S，5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-新异薄荷醇((1S，2S，5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-新薄荷醇((1R，2R，5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-薄荷醇((1S，2R，5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-异薄荷醇((1S，2R，5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-新异薄荷醇((1R，2R，5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-新薄荷醇((1S，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)。l-薄荷醇与其他构型的薄荷醇相比，具有特征的薄荷香气和强烈的清凉作用，气味更加新鲜轻快，另外，l-薄荷醇具有更强的生理活性，它具有杀菌止痒、兴奋镇痛、镇静、防腐杀菌、治疗疼痛等功效，因此具有更大的医疗价值。l-薄荷醇的这些性质，使它比其他构型的薄荷醇具有更高的工业价值。 
Figure BSA00000347148100011
随着社会的进步，人们对于物质生活的要求不断提高，对l-薄荷醇的需求量也日益增长。但是，由于天然提取的l-薄荷醇依赖种植的薄荷原料，故受限于地域、气候以及市场供需的影响，愈加难以满足生产与生活的需要。人们通过合成的手段制备l-薄荷醇来满足需求，由于化学法制备的产品是由薄荷醇的8种异构体组成的，l-薄荷醇的含量较低，直接降低了产品的使用功效，从8种异构体 混合物中分离出的l-薄荷醇产品，质量与天然产品相当，但价格低廉，因此l-薄荷醇的分离技术成为制约工业化过程的一个主要环节。 
目前对l-薄荷醇的合成与提取研究主要分为3个方面，即天然提取研究、化学合成研究、生物合成研究。传统的提取工艺是将薄荷草经蒸气蒸馏制得薄荷原油。经反复结晶得到l-薄荷醇，提取过程比较复杂，能耗高且生产率低。化学合成按照起始原料划分可将其分为两大类：以具有旋光性的化合物为起始原料；以大宗石油化学产品(如间甲酚、百里酚、异戊二烯等)为起始原料。其中日本高砂公司利用发明的手性催化剂(S)-BINAP-Rh催化烯丙胺不对称异构化合成得到l-薄荷醇，该技术目前年产1000吨l-薄荷醇。有关生物催化法制备l-薄荷醇的研究中，主要涉及到两种拆分反应，一种是利用微生物或酶催化的酯化或转酯化反应，另一种是利用微生物或酶催化的水解反应。南非一家研究机构(CSIR)公开了一种利用脂肪酶转化拆分薄荷醇制备l-薄荷醇的工艺过程：利用间甲酚作为原料，合成制得百里酚，然后催化加氢得到薄荷醇的八种异构体的混合物，即l-薄荷醇、l-异薄荷醇、l-新异薄荷醇、l-新薄荷醇、d-薄荷醇、d-异薄荷醇、d-新异薄荷醇、d-新薄荷醇。使用固定化的脂肪酶Amano lipase AK对这八种异构体进行立体选择性酯化，酰化剂为醋酸乙烯酯，可以得到＞95％ee的l-薄荷醇。通过蒸馏将l-薄荷酯从其他异构体中分离出来，在碱性溶液中水解得到l-薄荷醇，再通过重结晶的方法制备所需纯度的l-薄荷醇。 
尽管生物方法分离l-薄荷醇的研究取得了很大进展，但仍然普遍存在产物的光学纯度不高，转化率低、生物催化剂种类少和生物催化剂成本高等缺点，制约了工业化的应用。如果利用高选择性的微生物脂肪酶作为拆分剂，则可大大降低原料成本，提高产品纯度，目前尚未见有关于利用寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)对薄荷醇异构体混合物进行转化的方法。 
发明内容
本发明的目的是提供一种寡养单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用。 
为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产选择性转酯化l-薄荷醇的新菌株。经过16S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，命名为寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS 11)。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2010年10月22日，保藏号为CGMCC No.4254。 
寡养单胞菌CGMCC No.4254可用于作为通过分离薄荷醇异构体混合物来 制备l-薄荷醇的催化剂。 
本发明利用寡养单胞菌CGMCC No.4254制备l-薄荷醇的方法包括如下步骤： 
(1)将保藏号为CGMCC No.4254的寡养单胞菌加入到培养基中进行发酵培养； 
(2)将步骤(1)得到的发酵液进行处理，制备得到固体催化剂； 
(3)将所述固体催化剂和底物加入到有机溶剂中进行转化反应，得到转化液，所述底物包括薄荷醇异构体混合物和酰化剂；所述薄荷醇异构体混合物含有l-薄荷醇，且含有l-异薄荷醇、l-新异薄荷醇、l-新薄荷醇、d-薄荷醇、d-异薄荷醇、d-新异薄荷醇、d-新薄荷醇中的任一种或任几种； 
(4)将所述转化液进行处理以除去有机溶剂和未反应的底物，得到l-薄荷醇的酯化物； 
(5)将所述l-薄荷醇的酯化物水解，收集得到l-薄荷醇。 
进一步地，本发明所述酯化剂为乙酸乙烯酯、乙酸丁酯、乙酸异丙烯酯、乙酸酐、乙酸乙酯、乙酸对氯苯酯、丙酸对氯苯酯、戊酸对氯苯酯、正辛酸对氯苯酯、乙酸-2-氯苯酯、乙酸-2，3-二氯苯酯、乙酸-2，4-二氯苯酯、乙酸苯酯、乙酸间苯二酯、乙酸苯甲酯中的任一种或任几种的组合。 
进一步地，本发明所述薄荷醇异构体混合物相对于所述有机溶剂的加入量为1～156g/L。 
进一步地，本发明在步骤(3)中，所述固体催化剂相对于所述有机溶剂的加入量为1～100g/L。 
进一步地，本发明在步骤(3)中，所述转化反应的温度为15～60℃，转化反应时间为1～100h。 
进一步地，本发明在步骤(3)中，所述有机溶剂选自异辛烷、正庚烷、甲基环己烷、叔丁基甲基醚、二甲苯、煤油、戊烷、环己烷、己烷、苯、丁醇、甲苯、四氢呋喃、三氯甲烷、异丙醇、乳酸乙酯和丙酮。 
进一步地，本发明在步骤(1)中，所述培养基的成分为：蛋白胨1～25g/L、乳糖1～15g/L、酵母膏1～8g/L、硫酸铵0～10g/L、磷酸氢二钾1～6g/L、氯化钠0～2g/L和无水硫酸镁0～1g/L，所述培养基的pH值为5.0～10.0。 
进一步地，本发明所述酯化剂与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为0.5～20∶1。 
本发明方法相对于传统的天然提取、化学拆分方法和不对称合成法具有以 下优点： 
(1)由于传统的l-薄荷醇提取工艺能耗大产率低，而化学拆分法和不对称合成法具有反应条件苛刻、难度大、需要使用大量有机溶剂、对环境造成污染的缺点，而相比之下，本发明采用寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)催化转酯化薄荷醇异构体混合物中的l-薄荷醇，不仅具有高效选择性和反应条件温和的优点，而且可以从工艺上大量减少有机溶剂的使用，对环境友好。 
(2)本发明的转化法是利用微生物作为催化剂，可以自行发酵制备，质量稳定，存储稳定，运输方便，能大大降低原料成本，极具广大应用前景； 
(3)目前同类制备l-薄荷醇的方法，是采用化学合成的薄荷醇异构体混合物为起始原料，首先将l-薄荷醇和d-薄荷醇这一对对映体分离出来，但l-薄荷醇和d-薄荷醇与另外其他6种薄荷醇异构体分离存在困难，能耗较大。而本发明直接采用化学法合成得到的薄荷醇异构体混合物作为底物，不需要预先分离过程，方法简单，在设备投资与能耗方面优势明显。 
(4)采用本发明的寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.GS11进行催化反应，生成l-薄荷醇的酯化物纯度在99％以上；且未反应的底物可以直接回收，重新外消旋化成为底物薄荷醇异构体混合物，提高了底物利用率。 
生物材料样品的保藏信息： 
保藏的生物材料样品：寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)； 
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)； 
保藏日期：2010年10月22日； 
保藏登记号：CGMCC No.4254。 
附图说明
图1是寡养单胞菌GS11催化反应的转化液的气象色谱图，图中共有10个峰信号，由左向右依次为：十二烷，d-异薄荷醇，l-异薄荷醇，d-薄荷醇，l-薄荷醇，d-新异薄荷醇，l-新异薄荷醇，d-新薄荷醇，l-新薄荷醇，l-薄荷醇的乙酸酯；10个信号峰的出峰时间依次为6.440分钟、8.890分钟、8.957分钟、9.365分钟、9.423分钟、9.557分钟、9.715分钟、9.807分钟、9.915分钟、10.323分钟。 
图2是不同反应时间下转化率和产物非对映体过量值的变化曲线。 
具体实施方式
以下实施例中，在对薄荷醇异构体混合物进行转化反应过程中，对反应液进行底物转化率、产物非对映体过量值(dep)的测定方法具体如下(其中，所述底物为薄荷醇异构体混合物)： 
在转化反应过程中，5mL反应液离心(4℃，10000×g，5min)出去固态物得到液态有机相，进行手性气相色谱分析。该手性气相色谱分析的体系如下： 
检测仪器：GC-950气相色谱仪； 
手性气相柱：CP-CYCLODEXTRIN β-2，3，6-M-19 
(50m×0.25mm×0.25μm)； 
检测条件：柱温150℃，检测器和进样器温度分别为260℃与250℃，载气(N2)30mL/min，空气5mL/min，氢气10mL/min。 
计算公式： 
底物转化率(％)＝(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％； 
dep(％)＝[(AR-AS)/(AS+AR)]×100％ 
des＝c×dep/(1-c)×100％ 
E＝ln[1-c(1+dep％)]/ln[1-c(1-dep％)] 
其中，c为转化率，dep为产物非对映体过量值，其中AS、AR分别为气相色谱所测样品中(l)-构型产物和非(l)-构型产物的峰面积之和，E为对映体选择率。 
实施例1：菌种的筛选及鉴定 
本实施例在浙江地区的化工厂、试剂厂等处采集土壤，经过富集、初筛、复筛三个步骤，进行寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的筛选。方法如下： 
富集培养：培养基成分为(g/L)：橄榄油10.0，酵母膏5.0，蛋白胨5.0，硫酸铵2.0，磷酸氢二钾2.0，硫酸镁0.5，pH为7.0。121℃灭菌20min。称取新鲜土样1g加入到装有50ml富集培养基的250mL摇瓶中，置于30℃、200r/min摇床中培养。按2％的接种量，每隔一天进行一次转接，重复三次。 
平板初筛：培养基成分为(g/L)：三油酸甘油酯50.0，酵母膏1.0，硫酸铵2.0，磷酸氢二钾2.0，氯化钠2.0，硫酸镁0.5，琼脂20.0，pH为7.0。120 ℃灭菌20min。采用稀释涂布分离法，将已保存的富集菌液适度稀释，各取200μL涂布在平板培养基上，30℃培养2～3天。挑取平板上单菌落接种于新鲜平板培养基上，30℃培养至出现丰满的菌体细胞后置于4℃冰箱保存。 
摇瓶复筛：培养基成分为(g/L)：橄榄油100.0，蛋白胨5.0，甘油3.0，酵母膏5.0，硫酸铵5.0，磷酸氢二钾2.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，pH为7.0。120灭菌20min。将初筛获得的单菌落接入20mL复筛培养基中，30℃，200rpm下生长1天后，取新鲜发酵液制得固体催化剂。将制得的固体催化剂和薄荷醇异构体混合物、乙酸乙烯酯加入有正己烷进行反应，固体催化剂浓度为20g/L，薄荷醇异构体混合物浓度为15.6g/L，乙酸乙烯酯浓度为18.5g/L。离心出去固体物质得到液体相，用于手性气相色谱进行分析，将底物选择性较高的和产物非对映体过量值均较高的菌株保藏备用。 
菌种鉴定：油镜观察、16S rDNA鉴定和生理生化鉴定。 
经过筛选，编号为GS11的菌株，其非对映体对量值最高，且具有相对较好的转化率，气相谱图见图1。从图1可知，产物l-薄荷醇乙酸酯出峰位置在10.323min。对菌株GS11作16S rDNA PCR测序分析和生理生化实验(见表1)，测序结果如SEQ No.1所示，由测序分析和生理生化实验的结果可确定所筛选出的菌株为寡养单胞菌属，该菌株命名为寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)。 
表1寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)生理生化实验结果 
Figure BSA00000347148100061
实施例2： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏3g/L，乳糖5g/L，硫酸铵 10g/L，磷酸氢二钾2g/L，调节pH至7.0。将寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以1％(v/v)接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于50℃、200r/min恒温摇床中发酵3天后，取出5mL发酵液冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以1g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(各异构体的含量为：d-异薄荷醇12.3％，l-异薄荷醇12.3％，d-薄荷醇24.4％，l-薄荷醇24.4％，d-新异薄荷醇13.3％，l-新异薄荷醇13.3％)以1g/L的浓度、乙酸乙烯酯以0.5g/L(酰化剂乙酸乙烯酯与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为0.9∶1)的浓度加入有5ml正己烷中，置于30℃、200r/min恒温摇床中振荡反应1h，离心(10000rpm，5mins)去除固体后，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为13.3％，产物非对映体过量值99.7％。 
实施例3： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨30，乳糖3，酵母膏1，硫酸铵7，磷酸氢二钾4，氯化钠0.5，硫酸镁0.5，调节pH至8.0。将菌株GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以3％(v/v)接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于18℃、200r/min恒温摇床中发酵2天后，取出5mL发酵液通过冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以40g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(d-薄荷醇20.1％，l-薄荷醇20.1％，d-新异薄荷醇17.4％，l-新异薄荷醇17.4％，d-新薄荷醇12.5％，l-新薄荷醇12.5％)以45g/L的浓度、乙酸异丙烯酯以60g/L的浓度(酰化剂乙酸异丙烯酯与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为2.08∶1)加入5ml环己烷中，置于45℃、200r/min恒温摇床中振荡反应70h，离心(10000rpm，5mins)去除固体后，再进行气相色谱分析，如图2所示：得到最终底物的转化率为90.7％，产物非对映体过量值99.5％。 
实施例4： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨25，乳糖15，酵母膏10，硫酸铵12，磷酸二氢钾6，氯化钠1，硫酸镁1，调节pH至6.0。将寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以2％(v/v)接种量接种于70mL的上述发酵培养基中，置于30℃、150r/min恒温摇床中发酵1天后，取出5mL发酵液冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以60g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(d-异薄荷醇5.3％，l-异薄荷醇5.3％，d-薄荷醇16.9％，l-薄荷醇16.9％，d- 新异薄荷醇18.1％，l-异薄荷醇18.1％，d-新薄荷醇9.7％，l-新薄荷醇9.7％)以156g/L的浓度、乙酸酐以51g/L的浓度(酰化剂乙酸酐与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为0.5∶1)加入5ml苯中，置于15℃、200r/min恒温摇床中振荡反应30h，离心(10000rpm，5mins)去除固体得到液态有机相，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为38.72％，产物非对映体过量值为99.8％。 
实施例5： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨15，乳糖20，酵母膏8，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，氯化钠2，硫酸镁1.5，调节pH至10.0。将寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以5％(v/v)接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于40℃、200r/min恒温摇床中发酵，3天后，取出5mL发酵液冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以120g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(d-异薄荷醇5.3％，l-异薄荷醇5.3％，d-薄荷醇17.6％，l-薄荷醇45％，d-新薄荷醇13.4％，l-新薄荷醇13.4％)以14g/L的浓度、乙酸乙酯以100g/L的浓度(酰化剂乙酸乙酯与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为12.6∶1)加入5ml甲苯中，置于60℃、200r/min恒温摇床中振荡反应110h，离心(10000rpm，5mins)去除固体后，再进行气相色谱分析： 
Figure BSA00000347148100081
实施例6： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨5，乳糖1，酵母膏5，硫酸铵2，磷酸氢二钾2，氯化钠3，硫酸镁0.,8，调节pH至5.0。将寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以3％(v/v)接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于37℃、200r/min恒温摇床中发酵2天后，取出5mL发酵液冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以100g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(d-异薄荷醇13.5％，l-异薄荷醇13.5％，d-薄荷醇25.7％，l-薄荷醇25.7％，d-新异薄荷醇9.6％，l-新异薄荷醇9.6％，d-新薄荷醇1.2％，l-新薄荷醇1.2％) 以4g/L的浓度、乙酸对氯苯酯以80g/L的浓度(酰化剂乙酸对氯苯酯与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为18∶1)加入5ml二甲苯中，置于55℃、200r/min恒温摇床中振荡反应85h，离心(10000rpm，5mins)去除固体后，再进行气相色谱分析： 
Figure BSA00000347148100091
实施例7： 
选择发酵培养基成分为：蛋白胨1，乳糖5，酵母膏7，磷酸二氢钾3，氯化钠1，硫酸镁0.，2，调节pH至7.0。将寡养单胞菌GS11(Stenotrophomonas sp.GS11)的种子液以1％(v/v)接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于25℃、200r/min恒温摇床中发酵1天后，取出5mL发酵液冷冻干燥制得固体催化剂，将固体催化剂以75g/L的浓度、薄荷醇异构体混合物(d-薄荷醇50％，l-薄荷醇50％)以10g/L的浓度、乙酸乙烯酯以110g/L(酰化剂乙酸乙烯酯与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为20∶1)的浓度加入5ml甲苯中，置于40℃、200r/min恒温摇床中振荡反应100h，离心(10000rpm，5mins)去除固体后，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为65.46％，产物非对映体过量值为99.7％。 
Figure ISA00000347148300011
Figure ISA00000347148300021

Claims (10)

1.一种寡养单胞菌，其特征是：其保藏号为CGMCC No.4254。
2.一种权利要求1的寡养单胞菌的应用，其特征是：用于作为通过分离薄荷醇异构体混合物来制备l-薄荷醇的催化剂。
3.一种利用权利要求1的寡养单胞菌制备l-薄荷醇的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将保藏号为CGMCC No.4254的寡养单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；
(2)将步骤(1)得到的发酵液进行处理，制备得到固体催化剂；
(3)将所述固体催化剂和底物加入到有机溶剂中进行转化反应，得到转化液，所述底物包括薄荷醇异构体混合物和酰化剂；所述薄荷醇异构体混合物含有l-薄荷醇，且含有l-异薄荷醇、l-新异薄荷醇、l-新薄荷醇、d-薄荷醇、d-异薄荷醇、d-新异薄荷醇、d-新薄荷醇中的任一种或任几种；
(4)将所述转化液进行处理以除去有机溶剂和未反应的底物，得到l-薄荷醇的酯化物；
(5)将所述l-薄荷醇的酯化物水解，收集得到l-薄荷醇。
4.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：所述酯化剂为乙酸乙烯酯、乙酸丁酯、乙酸异丙烯酯、乙酸酐、乙酸乙酯、乙酸对氯苯酯、丙酸对氯苯酯、戊酸对氯苯酯、正辛酸对氯苯酯、乙酸-2-氯苯酯、乙酸-2，3-二氯苯酯、乙酸-2，4-二氯苯酯、乙酸苯酯、乙酸间苯二酯、乙酸苯甲酯中的任一种或任几种的组合。
5.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：所述薄荷醇异构体混合物相对于所述有机溶剂的加入量为1～156g/L。
6.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述固体催化剂相对于所述有机溶剂的加入量为1～100g/L。
7.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述转化反应的温度为15～60℃，转化反应时间为1～100h。
8.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述有机溶剂为异辛烷、正庚烷、甲基环己烷、叔丁基甲基醚、二甲苯、煤油、戊烷、环己烷、己烷、苯、丁醇、甲苯、四氢呋喃、三氯甲烷、异丙醇、乳酸乙酯和丙酮中的任一种或任几种的组合。
9.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述培养基的成分为：蛋白胨1～25g/L、乳糖1～15g/L、酵母膏1～8g/L、硫酸铵0～10g/L、磷酸氢二钾1～6g/L、氯化钠0～2g/L和无水硫酸镁0～1g/L，所述培养基的pH值为5.0～10.0。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：所述酯化剂与薄荷醇异构体混合物的摩尔比为0.5～20∶1。
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