CN102925381B

CN102925381B - 一种产酯酶b1的海洋枯草芽孢杆菌c5及其酯酶b1

Info

Publication number: CN102925381B
Application number: CN201210334607.4A
Authority: CN
Inventors: 孙谧; 郝建华; 刘均忠; 徐甲坤
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: CN102925381A

Abstract

本发明涉及一种产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌C5及产酯酶B1,该海洋枯草芽孢杆菌C5基因序列长1462bp,16S rDNA基因序列如图1所示,该酯酶B1最适温度为45℃，最适pH为8.0，温度稳定范围为0～30℃，pH稳定范围为7.0～10.0,其分子量为83.8kDa,金属离子中Na⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响,Al³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺能够一定程度的抑制酯酶B1的酶活,Ag⁺、Hg⁺、Fe³⁺对酯酶B1活性抑制,Ba²⁺离子能够提高酯酶B1的活性，EDTA对酯酶B1活性有抑制作用。该酯酶B1可广泛应用于食品、医药、化工、降解农药及环保等行业。

Description

一种产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌C5及其酯酶B1

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，特别涉及一种产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌C5及其所产酯酶B1。

背景技术

海洋是地球上最大的生态系统，海洋中分布的微生物数量巨大，总类繁多。海洋微生物具有种群多样性、生理生化类群多样性、生态功能多样性和遗传特征多样性，拥有不同于其他环境微生物来源的遗传资源。

近年来，随着海洋生物技术的发展和人们对开发海洋资源意识的增强，国内外对海洋微生物及其酶的研究进展很快，寻找具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点。海洋微生物为适应海洋低温、高压、高盐这一生命极限环境，海洋微生物酶表现了比陆源微生物酶更为独特的生理功能与酶学特性，其开发应用潜力巨大，愈来愈引起世界各国的重视与开发,海洋微生物酯酶就是其中之一。

酯酶（Esterase，EC3.1.1），是一类能够对酯键作用的水解酶，可以催化不同底物的水解和合成反应,并可应用于食品、医药、化工、环保等行业。从海洋微生物中开发、寻找、筛选,采用各种遗传变异手段，开发出新的产酶菌株,正是当今世界各国开发海洋微生物酯酶的重要方向。

发明内容

本发明的目在于从海洋微生物中开发、寻找、筛选出繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制培养条件大幅提高酯酶产量的新的产酯酶菌株，从而开发提供一种产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌株C5及其所产酯酶B1。

本发明提供的产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌株C5（简称菌株C5）是从渤海底泥样品中筛选分离出一株产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌株C5（为Bacillussubtilis)，该海洋枯草芽孢杆菌株C5的16S rDNA基因序列长1462bp,其16S rDNA基因序列如图1所示,该海洋枯草芽孢杆菌株C5保藏在中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2012306。

菌落形态特征：

菌株C5在牛肉膏蛋白胨培养基上呈大而扁平的白色菌落，斜面置4℃保存下一段时间，菌落变成黑色，能够产生黑色素。革兰氏染色反应呈阳性；杆状，单个或短链排列；芽孢中生或偏中生，使菌体明显膨大。

菌株C5生理生化特征

对菌株C5进行了生理生化鉴定实验，结果见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）所述，该菌株C5的各项生理生

化特征与Bacillus subtilis基本相同。

表1菌株C5和模式菌株的特征比较

注：+为阳性反应，-为阴性反应

菌株C5的筛选

初筛：

（1）取10g样品，加入到90ml无菌水中进行梯度稀释，取30μl 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的悬液涂布基础培养基平板中，30℃培养箱中静止培养24h。所述基础培养基：蛋白胨1wt%，牛肉膏1wt%，葡萄糖1wt%，NaCl 0.5wt%，固体另加2wt%琼脂，调至pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

(2）固体测活平板分为8个小格，把基础培养基平板上形态大小不同的单菌落依次挑取点接入小格中，30℃培养箱中培养24h后观察透明圈的大小。

（3）将透明圈较大的菌落反复传代培养，直至获得纯培养菌株，接种于基础培养基斜面内，4℃冰箱保存。初筛培养基分离筛选出3株产酯酶活性较高的菌株，编号为1号、5号、10号菌。5号菌降解底物透明圈见图3。所述初筛培养基：基础培养基中加入2wt%三丁酸甘油酯；除三丁酸甘油酯外将培养基各成分加入水中，调pH至7.0，取出少量培养基（约20ml）与三丁酸甘油酯混合乳化均匀灭菌，两部分分开灭菌，115℃高压蒸汽灭菌30min。因为三丁酸甘油酯不溶于水，经过酯酶降解后生成可溶于水的三丁酸和甘油，所以能够产生透明圈,以透明圈直径和菌落直径之比值越大判定为酯酶活性越高。

复筛

分别取一环初筛保存的菌接入含有3ml基础培养液的试管中进行活化，30℃、200r/min振荡培养18h，取此培养液1ml转接入装有25ml发酵培养基的250ml三角烧瓶中，同样条件下培养48h。发酵液10000rpm离心3min，取上清液测定酯酶活力大小。所述发酵培养基：葡萄糖1wt%，酵母膏0.5wt%，蛋白胨0.5wt%，0.1wt%KH₂PO₄，0.02wt%MgSO₄·7H₂O，0.1wt%NaCO₃，自然pH下，115℃高压蒸汽灭菌30min；

复筛实验表明，5号菌的酶活性为41.3U/ml，1号菌酶活力23.7U/ml，10号菌的酶活力为20.1U/ml；5号菌的活性明显高于1号和10号菌，且都是胞外分泌酶。由此，确定5号菌为下一步的实验菌株，命名为菌株C5，其所产的酯酶命名为酯酶B1。以三丁酸甘油酯作为初筛的底物，再通过摇瓶检测酯酶的酶活，产酶活力达42.18U/ml。

通过对菌株C5的形态特征、生理生化反应及16S rDNA分子分类鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌,最终定为海洋枯草芽孢杆菌株C5（简称菌株C5）。

海洋枯草芽孢杆菌株C5菌种鉴定

菌落形态特征：

菌株C5在牛肉膏蛋白胨培养基上呈大而扁平的白色菌落，见图4。斜面置4℃保存下一段时间，菌落变成黑色，能够产生黑色素,革兰氏染色反应呈阳性；杆状，单个或短链排列；芽孢中生或偏中生，使菌体明显膨大

海洋枯草芽孢杆菌株C5生理生化特征

将经过筛选确定的菌株平板划线，30℃培养过夜，观察菌落形态并进行革兰氏染色，测定菌株生理生化反应。

1）无菌操作台上，将菌接种至葡糖糖发酵培养基中，30℃恒温培养箱中培养1-2d（天），若培养液保持原色，其结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖；若培养基呈黄色，反应结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸产气；若杜氏小管内没有气泡为阴性反应。所述葡萄糖发酵培养基：蛋白胨0.5wt%，酵母膏0.3wt%，NaCl 0.5wt%，葡萄糖1wt%，pH调至7.0，溴甲酚紫含量为0.008g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min。

2）乙酰甲基甲醇实验（V.P实验）：接种实验菌于甲基红培养基中，30℃培养1-2d。取培养液(约2ml)和等量的40ｗｔ%NaOH相混合，充分振荡2-10min后，如培养液呈现红色，即为V.P阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行。所述甲基红实验（M.R.实验）培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000ml，pH7.0-7.2，每管分装3ml，115℃灭菌30min。

3）甲基红实验（M.R.实验）：接种实验菌于甲基红实验培养基中，30℃培养1-2d，在培养液中加入几滴甲基红指示剂，如培养基上层呈现红色，即为阳性反应，黄色反应为阴性。(甲基红变色范围为pH4.4红色-pH6.0黄色)。

4）吲哚实验：将菌接入吲哚实验培养基中，置30℃恒温培养箱中培养1-2d。取出以上培养试管，在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分震荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚产生，乙醚层呈现玫瑰红色，即为阳性反应，否则为阴性反应。所述吲哚实验培养基：蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，水100ml，pH调至7.0，分装于试管中，每支3ml，121℃灭菌30min。

5）柠檬酸盐实验：将菌接种到柠檬酸盐试管斜面上做“之”字形划线，置30℃恒温培养箱中培养1-2d。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0~7.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。所述柠檬酸盐实验培养基：柠檬酸2g作为碳源，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，NaCl 5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml，琼脂20g，水1000ml，调pH至7.0，分装试管，每管3.5ml，121℃灭菌30min后制成斜面。

6）H₂S实验：用接种针到H2S试管中做穿刺接种，置30℃恒温箱中培养1-2d，以未接种培养基作为对照，有黑色沉淀产生即为阳性反应。H₂S实验培养基：甲基红实验培养基中加入0.1wt%的硫代硫酸钠，2wt%琼脂，分装试管，每管3.5ml。

7）淀粉水解实验：用接种环挑取菌种到培养皿中点接，置30℃恒温培养箱中培养1-2d。取出平板，加上少量碘液，轻轻摇动，使碘液铺满平板表面，若菌落周围出现透明圈即为阳性。所述淀粉水解实验培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，水1000ml，调节pH至7.0，121℃灭菌30min，灭菌后倒平板。

对菌株C5进行了生理生化鉴定实验，结果见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）所述，该菌株C5的各项生理生化特征与Bacillus subtilis基本相同。

菌株C516S rDNA基因序列分析和系统发育树的构建

采用16S rDNA基因直接测序法进行分子生物学鉴定。PCR扩增采用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’)。PCR反应条件：95℃5min，95℃40s，55℃1min，72℃1.5min，30个循环，最后72℃10min。

PCR产物测序,将所测定菌株的16S rDNA序列通过BLAST检索已有序列，进行相似性比较分析，下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列比对，采用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining method）进行系统发育分析。

基于16S rDNA基因序列同源性的系统发育分析

PCR扩增到菌株C5的16S rDNA长1462bp的基因序列，其GenBank登录号为JN942155，基因序列如图1所示。

将图1的序列在GenBank中进行序列同源性检索，在显示的100个相似性较高的菌株中，75个为Bacillus subtilis，15个为未鉴定种，3个Bacillus tequilensis，2个Bacillus mojavensis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus licheniformis，Bacillus axarquiensis各一个。

以16S rDNA序列同源性为基础，选取不同序列相似度的相关种属菌株，通过BioEdit程序进行多重序列比对后，利用MEGA软件，采用Neighbor-Joining分析法计算出Bootstrap值（已标注在图上）构建系统发育树，见图2。菌株C5与Bacillussubtilis subsp.的序列同源性最高，达到99%。细菌分类学家普遍认为，当16S rDNA序列同源性高于97%可以认为是属内的同种，低于93%~95%，则可能为属外成员。因此，根据菌株C5的生理生化特征和系统发育学分析，将其鉴定为Bacillus subtilis,为枯草芽孢杆菌菌株（为海洋枯草芽孢杆菌C5）。

产酯酶B1的发酵条件

发酵液酶活测定

根据K.Van Asperen所述方法改进，具体方法如下：

α-萘酚标准曲线的制作：配制不同浓度的α-萘酚乙醇溶液；向各试管中分别加入4ml pH 7.0，0.04mol/L的磷酸盐缓冲液和100μl不同浓度的α-萘酚乙醇溶液，30℃下振荡反应15min；加入1ml显色基质液（0.03wt%的固兰B盐，溶剂为4wt%的SDS溶液，现用现配）摇匀，30℃下静置15min后，在595nm处测其吸光值，以不加α-萘酚的空白管调零。以α-萘酚含量为纵坐标，吸光值为横坐标，制作标准曲线（图5）。

酯酶活力的测定：在试管中依次加入3.50ml pH 7.00.04mol/L的磷酸盐缓冲液、100μl 0.4wt%α-乙酸萘酯的乙醇溶液和0.5ml稀释十倍的酶液，混匀后在30℃下振荡反应15min，然后按照上面继续操作。

酶活性单位定义为：30℃条件下，每小时催化得到1μmol α-萘酚所需的酶量为1个酶活单位，即1U。

单因素实验设计与分析

在其他发酵条件不变的前提下，分别改变氮源、碳源、接种量、起始pH、装液量、发酵温度和摇床转速7个因素的水平，每个实验重复3次，通过测定3次实验酯酶B1酶活的均值来评价各因素对产酶的影响。

氮源对酯酶B1产量的影响

图6为各种氮源及其浓度对酯酶B1产量的影响，可以看出，玉米浆对该菌产酶有明显的促进作用，该菌生长的氮源为20—35ml/L,最适宜生长的氮源30ml/L，且在30ml/L的浓度下，酶活达到最大。

碳源对酯酶B1产量的影响

在30ml/L的玉米浆浓度下，该菌生长的碳源为20—35g/L,最适宜生长的源35g/L。由图7可知，麦芽糖为碳源酶活最高，而且酶活随着麦芽糖浓度增加而增大。实验也证实，当麦芽糖的浓度继续增大时，酶活降低。因此，该菌最佳碳源为麦芽糖，浓度是35g/L。

接种量对酯酶B1产量的影响

图8为接种量对该菌产酶的影响，接种量3-8,最适宜生长为4%（V/V)，产酶量最高；接种量过低，产酶效果不佳；若接种量过大，前期菌体增长迅速，而后期则营养不良，也不利于产酶。

起始pH对酯酶B1产量的影响

图9可以看出，发酵起始pH在6.0～8.0之间对酯酶B1产量是先增大后减小的趋势，在pH为7.0时，产酶量最大，最适合产酶。

装液量对酯酶B1产量的影响

图10可以看出，随着装液量的增加，酯酶B1产量在减少；250ml摇瓶，当装液量在30ml以内，酯酶B1的含量减少很小；装液量高于30ml，酶活急剧降低，同样的转速下，已经不能达到菌体生长所需要的氧气，也不利于产酶。

培养温度对酯酶B1产量的影响

图11为发酵温度对该菌产酶的影响，总体来说先增大后降低，在36℃达到最高点，30～39℃这个温度范围应该是该菌比较适宜生长的温度，而低于或者高于这个温度区间，该菌生长缓慢或者不适宜生长，产酶量也大幅降低。

转速对产酯酶B1的影响

图12可以看出，在实验室条件下，摇床转速越大，该菌产酶量越高。转速越大，通气量越大，菌生长旺盛，产酶量也增大。

Plackett-Burman（PB）实验设计与结果

根据以上单因素实验的结果，用每ml发酵液中所含的酶活单位数作为响应值Y₁（U/ml），选择氮源玉米浆、碳源麦芽糖、接种量、起始pH、装液量、发酵温度和摇床转速7个因素作为研究对象，另外在实验运行次数不增加的情况下选择3个虚拟项，PB实验设计选用10因素12次实验的表格。

利用SAS 9.1.3软件分析PB实验结果可以确定氮源玉米浆的浓度、起始pH值和发酵温度为主要影响因素（P＜0.10），因此选这3个因素进行后期实验分析。

由SAS软件分析可知，Y₁预测最大值为139.18U/ml，预测标准误差为6.92U/ml，此时玉米浆浓度为28.7ml/L，起始发酵pH为7.10，发酵温度为35.8℃。在该条件下对模型预测值进行实验验证，结果为138.40U/ml，在模型预测误差范围内。在原发酵条件下进行发酵后得酯酶活力为42.18U/ml，提高了228.15%。

生长曲线和酶活曲线的测定

取斜面菌种一环接入基础培养基中，200rpm 30℃活化培养18h；取1ml基础培养基接入250ml含有25ml发酵培养基中36℃振荡培养72h。期间，平均每隔6h取样，稀释一定的倍数，在595nm下检测菌悬液的浓度，同时测定发酵液的酶活力。以发酵时间为横坐标，发酵液的相对酶活力和595nm下的吸光值为纵坐标，得出酶活曲线和生长曲线图13。

图13看出，菌株C5在培养24h后达到了稳定期，而培养42h产酶达到最高值，因此菌量最大的时间与产酶最高的时间不同步的。后期的发酵培养时间选为42h。响应面分析法能克服单因素实验等方法带来的一些弊端，通过合理的实验设计，能用较少的实验次数和时间对实验进行比较全面的研究，并以回归方法作为函数估算工具，将多因子实验中因子与实验结果的相互关系用于多项式，把因子与实验结果的关系函数化，是十分有效的优化实验方法。

本实验首先利用单因素实验筛选了氮源、碳源、接种量、pH、装液量、发酵温度和转速这7个因素对海洋枯草芽孢杆菌C5产酯酶B1的影响；通过PB实验和响应面法的优化，确定了玉米浆、发酵pH和发酵温度这3个主要影响因素的最佳配比值。由此，最佳的发酵培养条件为：30ml/L的玉米浆，35g/L的麦芽糖，KH₂PO₄0.1wt%，MgSO₄·7H₂O 0.02wt%，无水NaCO₃0.1wt%，pH 7.10，115℃高压蒸汽灭菌30min；活化好的种子培养液以4%（V/V)的体积比接入此发酵培养液中，35.8℃、200r/min培养48h。实验最终酶活达到138.40U/ml，而原发酵液酶活为42.18U/ml，提高了2倍多；而对农药甲基对硫磷的降解作用也明显提高，由图14可以看出，优化后的发酵液上清液对甲基对硫磷的降解透明圈增大了一倍。同时，回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程能较真实地反映各筛选因素的影响，建立模型与实际情况比较吻合，因此利用响应面法优化海洋枯草芽孢杆菌C5产酯酶B1发酵条件是有效可行的。

酯酶B1酶学性质

酯酶B1的初步纯化

经培养好的发酵液，4℃下12000rpm离心20min，收集上清液；缓慢加入固体硫酸铵达80ｗｔ%的饱和度，待硫酸铵完全溶解后4℃下12000rpm离心10min，弃上清；沉淀用pH7.0的40mM的磷酸盐缓冲液溶解；将处理好的酶液装入透析袋内，4℃透析过夜；最后通过一万的超滤膜进一步浓缩，经过以上操作提纯后的酶即为实验所用的酶。酯酶B1的活力测定参照上所述。

SDS-PAGE蛋白电泳

蛋白染色

变性染色：经SDS-PAGE电泳分离的蛋白样品，用染色液染色30min，然后用脱色液脱色3～10h，期间多次更换脱色液至背景清楚。

活性染色：在电泳后，用含10%甲醇的40mM磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸洗3次，每次15min。然后在不含甲醇的上述缓冲液中浸洗5min后，将胶置于含底物α-乙酸萘酯的同样缓冲液中反应30min，再向反应液中加入少量固兰B盐显色。

酯酶B1分子量的测定

采用SDS-PAGE垂直板电泳法，求出各种标准蛋白的迁移率（Rm值），再以分子量的对数（1gM）对Rm作图，依据酯酶B1的Rm求得其分子量。

酯酶B1发酵液经饱和硫酸铵初步纯化后，SDS-PAGE变形电泳再经活性染色后电泳图如下图15所示，可以看出，酯酶B1是由一条蛋白亚基构成，分子量为83.8KDa。

酯酶B1理化性质

酯酶B1最适作用温度及热稳定性

按照酯酶B1活性测定方法，在0～60℃下测定酯酶B1的水解活性。

酯酶B1酶液置于不同温度（0～60℃）下，恒温水浴静置2h，测定其残余酶活。酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面，酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。

图16显示了酯酶B1的最适温度和温度稳定性。酯酶1的最适作用温度是45℃；在30-50℃之间，具有较好的酶活性；酯酶B1在0～35℃的水浴中孵育2h，酶活仍能达到60%以上。

酯酶B1最适作用pH及pH稳定性

按照酯酶B1活性测定方法，在pH4～12的缓冲液中测定酯酶B1的水解活性。其中，40mM乙酸钠-乙酸缓冲液（pH4.0～5.0），40mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0～8.0），40mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0～10.0），40mM磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液（pH11.0～12.0）。

用40mM不同pH（4～12）的缓冲液同倍数稀释酯酶B1粗酶液，常温下静置2h；然后在pH 7.0的缓冲体系中测定酯酶B1的活性。

pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。

图17显示，酯酶B1的最适pH在7.5到8.0之间；pH7.0～8.0之间，具有较高酶活。该酶在7.0～10.0的pH范围内孵育2h，酶活仍能保持在80%以上。由此可知，酯酶B1在弱碱性体系中比酸性更加稳定。

金属离子对酯酶B1活性的影响

在酯酶B1测活体系中，用双蒸水代替缓冲液，加入各种金属离子，其终浓度为5mM，常温下静置2h后测定酯酶B1的活力，以不加任何离子的反应为对照。可以看出，Na⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响的；Al³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺能一定程度抑制酯酶B1的酶活,Ag⁺、Hg⁺、Fe³⁺是酯酶B1活性的抑制剂；Ba²⁺离子能够提高酯酶B1的活性；EDTA对酯酶B1活性有抑制作用，说明该酯酶B1是金属依赖酶（表4）。

表4金属离子对酯酶B1活性的影响

常用化学试剂和表面活性剂对酯酶B1活性的影响

在酯酶B1测活体系中，加入各种常用化学试剂终浓度为0.5%，常温下静置1h后测定酯酶B1活力，以不加任何化学试剂的反应为对照。

采用表面活性剂，脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES）、直链烷基苯磺酸钠（LAS）、椰油烷基酰胺（6501），终浓度分别为5%、10%下酯酶B1的活力。表2显示了各种常用化学试剂和表面活性剂对酯酶B1活性的影响。表面活性剂TritonX-100及Tween 40对酯酶B1活性有一定的激活作用，均能促使酯酶B1活性提高1.5倍以上。其他表面活性剂PCMB、十二烷基硫酸钠（SDS）、CTAB、苯甲基硫酰氟（PMSF)对酯酶B1具有不同程度的抑制作用。表面活性剂AES、AEO、LAS、6501对酯酶B1都具有强烈的抑制作用。

PMSF能抑制丝氨酸酯酶B1的活性，表2显示的实验结果证实了酯酶B1活性中心部位具有丝氨酸残基。

表2化学物质对酯酶B1活性的影响

酯酶B1经过SDS-PAGE变性电泳活性染色证明，该酶分子量为83.8KD，最适反应温度为45℃,最适pH为8.0，pH7.0～10.0之间较稳定。

酯酶B1在已经报道的微生物酯酶B1中（表3）属于中温酶,多数酯酶最适pH及酸碱稳定性以碱性和中性条件为多；分子量分布在27kDa～95kDa之间，而酯酶B1分子量较大为83.8kDa。

表3不同来源酯酶性质的比较

酯酶B1对农药甲基对硫磷的降解

样品处理:

甲基对硫磷（化学名称为0，0-二甲基-0-（4-硝基苯基）硫代磷酸酯）为高效有机磷杀虫剂。

100ml的圆底蒸馏烧瓶中，加入15.6ml pH7.0的磷酸缓冲液、0.4ml(10mg/ml)的甲基硫磷农药液及4ml的酶液，反应一定时间后，减压蒸馏至干，再加入20ml的色谱纯甲醇溶解，过膜供检测。

高效液相法检测

检测条件：流动相—甲醇/水（80/20），

流速—1.0ml/min，

检测波长—274nm。

采用外标法定量，农药甲基对硫磷的降解率计算：

降解率=（对照含量-反应后含量）/对照含量×100%酶液对甲基对硫磷的降解如下图18—22和23所示，2d内甲基对硫磷的降解率为60%，有对硝基苯酚的产生，除了检测出甲基对硫磷和对硝基苯酚外，另外检测到的代谢产物无法确认，可能是苯环开环后形成的代谢产物或者是降解中间产物。因此，海洋枯草芽孢杆菌C5产酯酶B1对甲基对硫磷具有降解作用。

.本发明提供的产酯酶B1的及产酯酶B1的特点:

海洋枯草芽孢杆菌株C5繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制培养条件大幅提高酯酶B1产量的新菌株,所产酯酶B1的酶学性质独特,该酯酶B1可广泛应用于食品、医药、化工、环保等行业,特别对甲基对硫磷农药具有降解作用。

附图说明

图1、海洋枯草芽孢杆菌株C5的16S rDNA基因序列

图2、海洋枯草芽孢杆菌株C516S rDNA序列同源性构建的系统发育树

图3、5号菌降解底物透明圈

图4、5号菌的

图5、酯酶B1活力标准曲线

图6、氮源种类及其浓度对产酶的影响

△-△酵母膏，□-□玉米浆，○-○豆饼粉，■-■牛肉膏，▲-▲蛋白胨，●-●玉米浆粉

图7、碳源种类及其浓度对产酶的影响

●-●玉米淀粉，■-■麸皮，▲-▲葡萄糖，△-△糊精，□-□蔗糖，○-○麦芽糖MgSO₄·7H₂O 0.02wt%，

图8、接种量对该菌产酶的影响

图9、起始pH对产酶的影响

图10、装液量对产酶的影响

图11、发酵温度对产酶的影响

图12、转速对产酶的影响

图13、菌株C5生长曲线和产酶曲线

图14、优化后发酵液上清与原发酵液上清对甲基对硫磷的解透明圈对比X-优化后发酵液上清，J-原发酵液上清

图15、电泳图1-Marker 2-酯酶B1

图16、酯酶B1最适温度及温度稳定性

图17、酯酶B!最适pH及pH稳定性

图18—22、高效液相检测色谱图

1-甲基对硫磷，2-对硝基苯酚，3-未知物

图23、TOF质谱图

具体实施方式

本发明将用下列实施例进一步说明本发明，但本发明保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

海洋枯草芽孢杆菌株C5的筛选和鉴定。

初筛：

（1）取10g样品，加入到90ml无菌水中进行梯度稀释，取30μl 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的悬液涂布上述基础培养基平板中，30℃培养箱中静止培养24h。

（3）将透明圈较大的菌落反复传代培养，直至获得纯培养菌株，接种于基础培养基斜面内，4℃冰箱保存。上述初筛培养基分离筛选出3株产酯酶活性较高的菌株，编号为1号、5号、10号菌。5号菌的降解透明圈如图3。所述初筛培养基：基础培养基中加入2wt%三丁酸甘油酯；除三丁酸甘油酯外将培养基各成分加入水中，调pH至7.0，取出少量培养基（约20ml）与三丁酸甘油酯混合乳化均匀灭菌，两部分分开灭菌，115℃高压蒸汽灭菌30min。因为三丁酸甘油酯不溶于水，经过酯酶降解后生成可溶于水的三丁酸和甘油，所以能够产生透明圈,以透明圈直径和菌落直径之比值越大判定为酯酶活性越高。

复筛

分别取一环初筛保存的菌接入含有3ml基础培养液的试管中进行活化，30℃、200r/min振荡培养18h，取此培养液1ml转接入装有25ml上述发酵培养基的250ml三角烧瓶中，同样条件下培养48h。发酵液10000rpm离心3min，取上清液测定酯酶活力大小。

复筛得到5号菌的酶活性为41.3U/ml，1号菌酶活力23.7U/ml，10号菌的酶活力为20.1U/ml；5号菌的活性明显高于1号和10号菌，且都是胞外分泌酶。由此，确定5号菌为下一步的实验菌株，命名为菌株C5，其所产的酯酶命名为酯酶B1。以三丁酸甘油酯作为初筛的底物，再通过摇瓶检测酯酶的酶活，从而筛选到一株高产酯酶的菌株C5，产酶活力达42.18U/ml。通过对菌株C5的形态特征、生理生化反应及16S rDNA分子分类鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌,最终定为海洋枯草芽孢杆菌株C5。

海洋枯草芽孢杆菌株C5的菌落形态特征：

菌株C5在牛肉膏蛋白胨培养基上呈大而扁平的白色菌落，见图3、4，斜面置4℃保存下一段时间，菌落变成黑色，能够产生黑色素。革兰氏染色反应呈阳性；杆状，单个或短链排列；芽孢中生或偏中生，使菌体明显膨大。

海洋枯草芽孢杆菌株C5生理生化特征:

将经过筛选确定的菌株平板划线，36℃培养过夜，观察菌落形态并进行革兰氏染色，测定菌株生理生化反应。

1）无菌操作台上，将菌接种至上葡糖糖发酵培养基中，37℃恒温培养箱中培养1-2d，若培养液保持原色，其结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖；若培养基呈黄色，反应结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸产气；若杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

2）乙酰甲基甲醇实验（V.P实验）：接种实验菌于上述甲基红培养基中，37℃培养1-2d。取培养液(约2ml)和等量的40%NaOH相混合，充分振荡2-10min后，如培养液呈现红色，即为V.P阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行。

3）甲基红实验（M.R.实验）：接种实验菌于上述甲基红实验培养基中，37℃培养1-2d，在培养液中加入几滴甲基红指示剂，如培养基上层呈现红色，即为阳性反应，黄色反应为阴性。(甲基红变色范围为pH4.4红色-pH6.0黄色)。

4）吲哚实验：将菌接入上述吲哚实验培养基中，置37℃恒温培养箱中培养1-2d。取出以上培养试管，在培养液中加入乙醚1~2ml，经充分震荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚产生，乙醚层呈现玫瑰红色，即为阳性反应，否则为阴性反应。

5）柠檬酸盐实验：将菌接种到柠檬酸盐试管斜面上做“之”字形划线，置37℃恒温培养箱中培养1-2d。麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0~7.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。所述柠檬酸盐实验培养基：柠檬酸2g作为碳源，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，NaCl 5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml，琼脂20g，水1000ml，调pH至7.0，分装试管，每管3.5ml，121℃灭菌30min后制成斜面。

6）H₂S实验：用接种针到H₂S试管中做穿刺接种，置37℃恒温箱中培养1-2d，以未接种培养基作为对照，有黑色沉淀产生即为阳性反应。H₂S实验培养基：甲基红实验培养基中加入0.1wt%的硫代硫酸钠，2wt%琼脂，分装试管，每管3.5ml

7）淀粉水解实验：用接种环挑取菌种到培养皿中点接，置37℃恒温培养箱中培养1-2d。取出平板，加上少量碘液，轻轻摇动，使碘液铺满平板表面，若菌落周围出现透明圈即为阳性。所述淀粉水解实验培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，水1000ml，调节pH至7.0，121℃灭菌30min，灭菌后倒平板。

菌株C5的16S rDNA基因序列分析和系统发育树的构建

PCR产物送北京华大基因测序。将所测定菌株的16S rDNA序列通过BLAST检索已有序列，进行相似性比较分析，下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列比对，采用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining method）进行系统发育分析。

基于16S rDNA基因序列同源性的系统发育分析

PCR扩增到菌株C5的16S rDNA基因序列长1462bp，其GenBank登录号为JN942155，基因序列如图1所示。

将图1的基因序列在GenBank中进行序列同源性检索，在显示的100个相似性较高的菌株中，75个为Bacillus subtilis，15个为未鉴定种，3个Bacillustequilensis，2个Bacillus mojavensis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacilluslicheniformis，Bacillus axarquiensis各一个。

以16S rDNA序列同源性为基础，选取不同序列相似度的相关种属菌株，通过BioEdit程序进行多重序列比对后，利用MEGA软件，采用Neighbor-Joining分析法计算出Bootstrap值（已标注在图上）构建系统发育树，见图2。菌株C5与Bacillussubtilis subsp.的序列同源性最高，达到99%,细菌分类学家普遍认为，当16S rDNA序列同源性高于97%可以认为是属内的同种，低于93%~95%，则可能为属外成员。因此，根据菌株C5的生理生化特征和系统发育学分析，将其鉴定为Bacillus subtilis，为枯草芽孢杆菌菌株（为海洋枯草芽孢杆菌C5）。

实施例2

产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌C5的发酵

海洋枯草芽孢杆菌C5（由中国水产研究院黄海水产研究所海洋产物资源与酶工程实验室筛选保藏,并保藏在中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2012306。

初始培养方法

从保存的斜面中挑取一环接入含有100ml上述种子培养基的500ml的锥形瓶中，30℃、200r/min下活化培养18h，以4%（V/V)的接种量接种至装有25ml上述发酵培养基的250ml锥形瓶中，30℃、200r/min培养48h，收集发酵液，12000r/min离心3分钟，取上清液检测酶活。检测酶活的方法同上。

根据以上单因素实验的结果（见图6-12），用每ml发酵液中所含的酶活单位数作为响应值Y₁（U/ml），选择氮源玉米浆、碳源麦芽糖、接种量、起始pH、装液量、发酵温度和摇床转速7个因素作为研究对象，另外在实验运行次数不增加的情况下选择3个虚拟项，PB实验设计选用10因素12次实验的表格。

由SAS软件分析可知，Y₁预测最大值为139.18U/ml，预测标准误差为6.92U/ml，此时玉米浆浓度为28.7ml/L，起始发酵pH为7.10，发酵温度为35.8℃。在该条件下对模型预测值进行实验验证，结果为138.40U/ml，在模型预测误差范围内。在原发酵条件下进行发酵后得酯酶B1活力为42.18U/ml，提高了228.15%。

通过生长曲线和酶活曲线的测定如图13，并以回归方法作为函数估算工具，将多因子实验中因子与实验结果的相互关系用于多项式，把因子与实验结果的关系函数化，是十分有效的优化实验方法。实验首先利用单因素实验筛选了氮源、碳源、接种量、pH、装液量、发酵温度和转速这7个因素对海洋枯草芽孢杆菌C5产酯酶B1的影响；通过PB实验和响应面法的优化，确定了玉米浆、发酵pH和发酵温度这3个主要影响因素的最佳配比值。由此，最佳的发酵培养条件为：30ml/L的玉米浆，35g/L的麦芽糖，KH₂PO₄0.1wt%，MgSO₄·7H₂O 0.02wt%，无水NaCO₃0.1wt%，pH 7.10，115℃高压蒸汽灭菌30min；活化好的种子培养液以4%（V/V)的体积比接入此发酵培养液中，35.8℃、200r/min培养48h。实验最终酶活达到138.40U/ml，而原发酵液酶活为42.18U/ml，提高了2倍多；而对农药甲基对硫磷的降解作用也明显提高，由图14可以看出，优化后的发酵液上清液对甲基对硫磷的降解透明圈增大了一倍。同时，回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程能较真实地反映各筛选因素的影响，建立模型与实际情况比较吻合，因此利用响应面法优化海洋枯草芽孢杆菌C5产酯酶B1发酵条件是有效可行的。

实施例3

酯酶B1的酶学性质

酯酶B1的初步纯化

SDS-PAGE蛋白电泳

蛋白染色

变性染色：经SDS-PAGE电泳分离的蛋白样品，用染色液染色30min，然后用脱色液脱色3~10h，期间多次更换脱色液至背景清楚。

酯酶B1分子量的测定

采用SDS-PAGE垂直板电泳法，求出各种标准蛋白的迁移率（Rm值），再以分子量的对数（lgM）对Rm作图，依据酯酶B1的Rm求得其分子量。

酯酶B1理化性质

酯酶B1最适作用温度及热稳定性

图16显示了酯酶B1的最适温度和温度稳定性。酯酶1的最适作用温度是45℃；在30-50℃之间，具有较好的酶活性；酯酶1在0～35℃的水浴中孵育2h，酶活仍能达到60%以上。

酯酶B1最适作用pH及pH稳定性

金属离子对酯酶B1活性的影响

常用化学试剂和表面活性剂对酯酶B1活性的影响

采用表面活性剂，脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES）、直链烷基苯磺酸钠（LAS）、椰油烷基酰胺（6501），终浓度分别为5%、10%下酯酶B1的活力。表2显示了各种常用化学试剂和表面活性剂对酯酶B1活性的影响。表面活性剂TritonX-100及Tween 40对酯酶B1活性有一定的激活作用，均能促使酯酶B1活性提高1.5倍以上。其他表面活性剂PCMB、SDS、CTAB、PMSF对酯酶B1具有不同程度的抑制作用。表面活性剂AES、AEO、LAS、6501对酯酶B1都具有强烈的抑制作用。

酯酶B1经过SDS-PAGE变性电泳活性染色证明，该酶分子量为83.8KD，最适反应温度为45℃,最适pH为8.0，pH7.0～10.0之间较稳定。提供酯酶B1在已经报道的微生物酯酶B1中（表3）属于中温酶,已报道的酯酶最适pH及酸碱稳定性以碱性和中性条件为多；分子量分布在27kDa～95kDa之间，而酯酶B1分子量较大为83.8kDa。

Claims

1.由渤海底泥筛选获得的海洋枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C5,其特征在于该产酯酶B1的海洋枯草芽孢杆菌C5在牛肉膏、蛋白胨培养基上呈大而扁平的白色菌落，斜面置4℃保存下一段时间，菌落变成黑色，能够产生黑色素,革兰氏染色反应呈阳性,杆状，单个或短链排列,芽孢中生或偏中生，使菌体明显膨大;

海洋枯草芽孢杆菌C5的16S rDNA基因序列长1462bp,其16S rDNA基因序列如图1所示,该海洋枯草芽孢杆菌C5保藏在中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012306。

2.一种权利要求1的海洋枯草芽孢杆菌C5产的酯酶B1，其特征在于该酯酶B1的酶学性质为：酯酶B1是由蛋白亚基构成，分子量为83.8KDa，酯酶B1的最适作用温度为45℃,最适pH为8.0，pH7.0～10.0之间较稳定,pH7.0—8.0之间，酶活能保持80%以上,该酯酶B1在7.0—10.0的pH范围内孵育2h，酶活仍能保持在80%以上;金属离子Na⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响,Al³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺能够一定程度的抑制酯酶B1的酶活,Ag⁺、Hg⁺、Fe³⁺是酯酶B1活性的抑制剂,Ba²⁺离子能够提高酯酶B1的活性,EDTA对活性有抑制作用，说明该酯酶B1是金属依赖酶；非离子型表面活性剂TritonX-100及阴离子表面活性剂Tween40对酯酶B1活性有一定的激活作用，均能促使酯酶B1活性提高1.5倍以上,其它表面活性剂PCMB、十二烷基硫酸钠、CTAB、苯甲基硫酰氟、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、直链烷基苯磺酸钠、椰油烷基酰胺对酯酶B1活性具有抑制作用。