CN103667201A

CN103667201A - 海洋微生物菌株ys0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法

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Publication number: CN103667201A
Application number: CN201310507023.7A
Authority: CN
Inventors: 孙谧; 王伟; 徐甲坤; 郝建华; 刘均忠
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-10-24
Also published as: CN103667201B

Abstract

本发明涉及由海洋微生物菌株YS0810高产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法,大小为201.2kDa，具有四聚体，SDS-PAGE测定的结果显示该酶的一个亚基的分子量为50kDa，最适作用温度为60℃，最适作用pH为12.0，pH6.0-10.0之间较稳定;Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响；Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺能够一定程度的抑制过氧化氢酶的酶活；Cu²⁺、Al³⁺是过氧化氢酶活性的抑制剂；Mg²⁺、Ba²⁺离子能够提高过氧化氢酶的活性。该酶分离纯化后，目的蛋白的纯化倍数为37.5，其比活力为112446.70U/mg，得率为19.23%。可应用于临床分析、食品加工、纺织、造纸、医械器具的消毒及药物等。

Description

海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及由海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法。

背景技术

微生物过氧化氢酶（EC 1.11.1.6）又称触酶（Catalase，简称CAT），普遍存在于好氧微生物体内。作为一种酶类清除剂，其主要功能是催化过氧化氢分解成氧气和水，防止体内羟基自由基的过量积累。基于其高效的催化活性，现已被广泛应用于临床分析、食品加工、纺织、造纸、医械器具的消毒及抗肿瘤药物的研究。近年来，过氧化氢酶由于其在纺织工业中的应用而倍受关注。多数的过氧化氢酶的应用是在碱性高温条件下进行的，而商品化的过氧化氢酶很少具有这一特性，因而限制了过氧化氢酶更多的推广应用。虽然近些年过氧化氢酶产生菌的相关研究有些报道，但碱性过氧化氢酶产生菌的筛选及应用研究鲜见。尽管目前国内微生物过氧化氢酶仍处于应用开发阶段，但随着人们对微生物过氧化氢酶的日益关注，以及研究技术和方法不断完善成熟，微生物过氧化氢酶必将成为许多应用发展的重要方向。

现代发酵工业主要是以微生物纯培养为主，依据不同菌株的特性，应用不同的手段获得所需微生物，也可通过筛选方法最终获得新菌种。过氧化氢酶是广泛存在于各种动植物和微生物中。目前国内外对微生物源的过氧化氢酶研究有大肠杆菌、黑曲霉、芽孢杆菌、球形红假单孢菌和溶壁微球菌等。但对不动杆菌特别是海洋源的不动杆菌的研究尚未见报道。微生物过氧化氢酶种类多，且能适应各种不同的环境，尤其是海洋微生物过氧化氢酶更具有独特的生理功能和特异的性质。目前，不同来源的过氧化氢酶的研究仍是一个热点。海洋微生物为适应海洋这一生命极限环境，海洋微生物酶表现了比陆源微生物酶更为独特的生理功能与酶学特性，其开发应用潜力巨大，愈来愈引起世界各国的重视与开发。

国内目前报道过氧化氢酶以动植物源和微生物发酵为主，其研究主要集中在菌株的筛选，培养基和培养条件的优化，基于过氧化氢酶在纺织工业的应用的重要性，仍需开发更适碱性的过氧化氢酶。

发明内容

本发明的目的在于经发明人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践,开发提供一种新型海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法。

本发明提供一种由新型海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶（简称过氧化氢酶）是一个亚基分子量约为50kDa的同源四聚体的单功能过氧化氢酶，该酶分子量约为201.2kDa，最适反应温度为60℃，最适pH为12.0，pH6.0-10.0之间较稳定。Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响的；Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺能够一定程度的抑制过氧化氢酶的酶活；Cu²⁺、Al³⁺是过氧化氢酶活性的抑制剂；Mg²⁺、Ba²⁺离子能够提高过氧化氢酶的活性。

本发明提供的新型海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧氢酶及其分离纯化方法中,所述新型海洋微生物菌株YS0810是从青岛海域底泥样品中筛选获得一株（种）高产碱性过氧化氢酶（简称过氧化氢酶）的海洋微生物菌株（Acinetobacter sp.）,将其命名为海洋微生物菌株YS0810（简称菌株YS0810）。对其16S rDNA基因序列同源性的系统发育分析,PCR产物测序结果显示菌株YS0810的16S rDNA基因序列以及基因序列长度为1443bp。应用Blast程序与EzTaxon数据库（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）进行16S rDNA序列分析，通过BioEdit程序进行多重序列比对后，利用MEGA5.1软件，采用Neighbor-Joining分析法最大似然法（Maximum-Likelihood Method）构建系统发育树。应用MEGA 5.1软件进行系统发育树分析，结合形态学观察结果，将高产碱性过氧化氢酶的海洋微生物菌株YS0810鉴定为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。该菌株YS0810于2013年7月6日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M2013315。

本发明提供的新型海洋微生物菌株YS0810经下列发酵培养：乙酸钠、蛋白胨和蔗糖的添加量分别为10.36g/L、16.68g/L和16.22g/L，发酵最佳接种量为4wt%；MgSO₄·7H₂O、NaCl、KH₂PO₄添加量分别为0.09wt%、0.5wt%和0.15wt%时，培养时间为24-48h，起始pH为7时，温度25℃以下，高产碱性过氧化氢酶,过氧化氢酶酶活力达到6814U/ml。

本发明提供的新型海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧氢酶酶学性质的表征。

1、过氧化氢酶活性的测定：

采用焦性没食子酸法，即邻苯三酚法，反应总体系3mL：蒸馏水、0.1mol/L pH6.0磷酸钾盐缓冲液、0.5wt%H₂O₂和5wt%焦性没食子酸分别为2.1mL、0.32mL、0.16mL和0.32mL。H₂O₂溶液和焦性没食子酸试剂需现配现用，20℃水浴中加入0.1mL待测样，以加蒸馏水作为空白，420nm下测定5min吸光度变化值，以每20s生成1mg红紫棓精为一个活力单位。活力计算公式：U/mL=(ΔA酶液-ΔA对照)×3mL/(12 ×0.1mL)。

2、SDS-PAGE蛋白电泳

1）蛋白染色

变性染色：

Marker经SDS-PAGE电泳分离后，用染色液染色30min，然后用脱色液脱色3-10h，期间多次更换脱色液至背景清楚。

活性染色：

电泳完成后，用蒸馏水冲洗凝胶3-5次，并用吸水纸吸干四周的水，加入配制好的0.03wt%的H₂O₂溶液，摇床上轻摇10min左右，倒掉H₂O₂溶液，再用蒸馏水冲洗3-5次，使用吸水纸吸干加入2wt％三氯化铁-铁氰化钾显色剂，轻摇5min（此时已能看到墨绿色背景和黄色的活性条带），弃去显色剂，蒸馏水冲洗掉背景，凝胶成像仪拍摄照片。

2）过氧化氢酶分子量的测定

采用SDS-PAGE垂直板电泳法，求出各种标准蛋白的迁移率（Rm值），再以分子量的对数（lgM）对Rm作图，依据过氧化氢酶的Rm求得其分子量约为201.2kDa。

经上述分子量的测定及活性电泳分析,过氧化氢酶发酵液经饱和硫酸铵、阴离子层析和凝胶过滤层析等步骤纯化后，SDS-PAGE变形电泳如下图2所示，以标准蛋白的相对迁移率（Rf值）和分子量的对数绘制标准曲线如图1所示，求得回归方程为：

lgMr=2.01-1.01Rf，R2=0.98

式中，Mr为标准蛋白的分子量；Rf为相对迁移率，Rf=样品移动距离/溴酚蓝移动距离；同时由上式求得过氧化氢酶的单个亚基分子量约为50kDa。

3、过氧化氢酶最适作用温度及热稳定性

将过氧化氢酶溶液置于不同温度（0-70℃）下，测定其残余酶活。酶反应最适温度及温度稳定性实验分别在0-70℃和30-70℃条件下进行。将50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）在不同的温度条件下（4-70℃）预热30min，考察酶的最适反应温度，结果（图3）显示，该酶的最适反应温度为60℃。将酶液在不同温度下（30-70℃），预处理15min和30min后测定酶活力，以30℃条件下的酶活力为100%，结果如图4所示，可以明显看出该酶的热稳定性较好，60℃保温15min，剩余酶活90%以上，30min仍能保留70%的酶活力。

酶的催化活性受温度影响较大，这主要由于酶是蛋白质，酶对温度有很高的敏感性。一定条件下，酶的反应速度随着温度的升高，超过某一特定温度后，反应速度反而下降，最终将变性失活。

4、过氧化氢酶最适作用pH及pH稳定性

按照过氧化氢酶活性测定方法，在pH4-12的缓冲液中测定过氧化氢酶的最适pH和pH稳定性。其中缓冲液：（pH4.0-5.0）为50mM乙酸钠-乙酸缓冲液;（pH6.0-8.0）为50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液;（pH9.0-10.0）为50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液;（pH11.0-12.0）为50mM磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。

用50mM不同pH（4-12）的缓冲液同倍数稀释过氧化氢酶溶液，常温下静置3h；然后在pH7.0的缓冲体系中测定过氧化氢酶的活性。酶的pH特性均在室温条件进行。酶的反应最适pH实验在pH4-11缓冲溶液中进行，pH稳定性实验在pH4-13的范围内进行。

酶在不同的pH缓冲液下与底物反应，检查过氧化氢酶活力。采用不同pH条件的缓冲液取代原反应体系的缓冲液，测定不同pH下过氧化氢酶酶活力及不同pH条件下的残留酶活力。结果如图5所示，表明pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。表明菌株YS0810所产的过氧化氢酶的最适反应pH12。酶溶液在不同pH条件下，4℃保存3h，检查过氧化氢酶的剩余活力，以未处理的初酶液为100%。结果（见图5）表明，该酶在pH10保存3h，酶活力基本不变，在pH11条件下，保存3h，仍能保留80%的酶活。

5、金属离子对过氧化氢酶活性的影响

在过氧化氢酶测活体系中，用双蒸水代替缓冲液，加入各种金属离子，其终浓度为10mM，常温下静置2h后测定过氧化氢酶活力，以不加任何离子的反应为对照。

表1为金属离子对过氧化氢酶活性的影响，由此可以看出，Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响；Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺能够一定程度的抑制过氧化氢酶的酶活；Cu²⁺、Al³⁺是过氧化氢酶活性的抑制剂；Mg²⁺、Ba²⁺离子能够提高过氧化氢酶的活性。

表1

本发明提供的菌株YS0810所产过氧化氢酶经纯化浓缩后，经过SDS-PAGE变性电泳后发现，该酶大小约为201.2kDa，最适反应温度为60℃，最适pH为12.0，pH6.0～10.0之间较稳定。过氧化物酶活性测定显示，该酶不具有过氧化物酶活性。Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响的；Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺能够一定程度的抑制过氧化氢酶的酶活；Cu²⁺、Al³⁺是过氧化氢酶活性的抑制剂；Mg²⁺、Ba²⁺离子能够提高过氧化氢酶的活性。同时本发明中获得的过氧化氢酶是一个亚基分子量约为50kDa的同源四聚体的单功能过氧化氢酶。

本发明提供一种新型海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢的分离纯化方法,其特征在于包括下列步骤：

1）种子培养

从保存的斜面中挑取一环菌体接入含有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，25℃、200r/min培养18-20h。所述斜面培养基（wt%）:蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，添加2%的琼脂。所述种子培养基（wt%）：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。

2）发酵培养

种子培养基按照4%（V/V）接种量转接到发酵培养基（50ml/250ml）中，200r/min，25℃培养24h，按照4-10%（V/V）接种量再转接到大锥形瓶中（300ml/1L），200r/min，25℃培养24h，收集发酵液，10000r/min离心5min，取上清检测酶活。所述发酵培养基（wt%）：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，pH调至7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。

3）过氧化氢酶粗酶液的制备

经发酵培养的发酵液，4℃下10000rpm离心20min，收集沉淀；pH7.0的50mM的磷酸盐缓冲液悬浮菌体；冰浴中超声波间歇细胞破碎10min；再通过超滤机10kDa的超滤膜进一步浓缩，经过以上操作浓缩后的酶浓缩液为粗酶液1。

4）硫酸铵分级沉淀

取100mL粗酶液1，在冰浴中边加入边搅拌缓慢加入研磨的硫酸铵，至饱和度为30%，继续搅拌15min后，4℃冰箱中放置沉淀2h；4℃、10000r/min离心10min，取上清，继续加入硫酸铵至饱和度为60%，4℃冰箱放置过夜，4℃、10000r/min离心10min，沉淀中加入50mmol/L pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解沉淀蛋白，再12000r/min冷冻离心10min，上清液即为粗酶液Ⅱ。

硫酸铵分级沉淀使用不同饱和度的硫酸铵来分级沉淀目的蛋白过氧化氢酶，通过测定沉淀中的酶活力，来确定最佳的沉淀方法。由图7可以明显看出，过氧化氢酶酶活力主要集中在硫酸铵饱和度为50%和60%之间，考虑到酶活力损失情况，最终硫酸铵沉淀实验方法：先使用30%饱和度硫酸铵去除杂质，弃沉淀，上清再加到饱和度为60%，收集沉淀溶解于缓冲液中，获得进一步纯化浓缩的粗酶制品。

蛋白质含量的测定

蛋白含量的测定采用Bradford法：以牛血清白蛋白为标准物，制作标准曲线图6，回归系数R2=0.9907。由图6可得到蛋白含量的标准曲线为：

y=130.94x-3.6931，（公式3）

R²=0.9907,y的单位为μg/ml，A595为反应后在波长595nm处测得的吸光度。

过氧化氢酶经硫酸分级沉淀结果如图7通过硫酸铵分级沉淀法可以大量粗制品中去除一些杂质，从而达到纯化浓缩蛋白的目的。盐析就是利用高浓度盐会破坏蛋白质表面的水化层使溶液中的蛋白质失去水分子的竞争，降低了蛋白质的溶解度，使蛋白质沉淀出来的方法。

5）透析

将粗酶液Ⅱ浓缩后，装入30mL、10kDa透析卡中，4℃透析24h，期间更换缓冲液4-5次。

6）离子交换层析

缓冲液：A流动相Tris-HCl pH8.0 50mM

B洗脱液：Tris-HCl pH8.0 50mM含1mol/L NaCl

柱子及条件：HiPrep DEAE FF 16/10，15%B洗脱1个柱体积左右，30%B洗脱1个柱体积收集峰，100%B冲洗柱子至基线不变化为止。

用50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡HiPrep DEAE FF 16/10阴离子柱。将硫酸铵沉淀溶于磷酸盐缓冲液后粗酶液用50mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液（使用离心管浓缩）替换，先以50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未被柱子结合的蛋白，再用含0-0.8mol/L NaCl的50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，并收集其中的活性部分于4℃冰箱保存。

7）凝胶过滤层析

凝胶过滤：Superdex 200 10/300GL。缓冲液含0.10mol/L NaCl的0.05mol/LpH7.5PBS。100μl样品上柱（10×300-310mm），流速0.30mL/min。收集活性峰，10kDa分子截留量超滤浓缩。

预先用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液平衡SuperdexTM 200 10/300GL凝胶过滤层析柱，将经HiPrep DEAE FF 16/10柱得到的活性部分浓缩液用pH7.5磷酸缓冲液替换并上样，采用相同缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min。

变性电泳及蛋白质染色SDS-PAGE采用12%分离胶和5%的浓缩胶，控制电压在200V。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色。凝胶成像仪拍摄照片。拍摄结果如图7，从右到左依次为BSA，marker，原发酵液浓缩液，硫胺沉淀结果，HiPrep DEAE FF 16/10，分子筛SuperdexTM 200 10/300GL过柱产物，SuperdexTM 200 10/300GL分子筛测定的实验结果显示，过氧化氢酶与分子量在201kDa左右，故该酶具有四聚体，SDS-PAGE测定的结果显示该酶的一个亚基的分子量为50kDa左右，两者呼应，说明该酶的分子量为201kDa。

紫外检测器的检测波长为280nm，流动相流速为1.0ml/min，上样量为2ml。对上样后未被HiPrep DEAE FF 16/10柱结合的蛋白进行酶活测定，结果表明，（穿透峰部分）未结合蛋白没有酶活。然后用NaCl溶液梯度洗脱，结果如图8和9所示，阴离子交换层析可将目的蛋白与色素及其他杂蛋白有效的分离，在NaCl浓度为0.30mol/L时目的蛋白表现出较高的蛋白质含量及CAT酶活力，故0.30mol/L NaCl为目的蛋白的洗脱收集条件。

经HiPrep DEAE FF16/10柱分离后收集并经超滤浓缩样品用于SuperdexTM 200 10/300GL凝胶层析，SuperdexTM 200 10/300GL凝胶过滤洗脱峰为3个，其中目的蛋白活性主要在第二个峰，对此峰收集、浓缩，用于SDS-PAGE及其他性质实验。

对粗过氧化氢酶进行纯化通过超滤浓缩、硫酸铵盐析、HiPrep DEAE FF 16/10离子交换层析、SuperdexTM 200 10/300GL凝胶柱层析得到有效分离，收集的样品经活性检测后，过氧化氢酶的纯化结果于表2，目的蛋白的纯化倍数为37.5，其比活力为112446.70U/mg，得率为19.23%。过氧化氢酶得到有效分离纯化。

表2

本发明提供的海洋微生物菌株YS0810高产过氧化氢酶及其分离纯化的特点为：通过超滤浓缩、硫酸铵盐析、HiPrep DEAE FF 16/10离子交换层析、SuperdexTM 200 10/300GL凝胶柱层析得到有效分离纯化，收集的样品经活性检测后，目的蛋白的纯化倍数为37.5，其比活力为112446.70U/mg，得率为19.23%。过氧化氢酶得到有效分离纯化。

本发明提供的海洋微生物菌株YS0810高产过氧化氢酶可广泛应用于临床分析、食品加工、纺织、造纸、医械器具的消毒及抗肿瘤药物等。

附图说明

图1蛋白分子量标准曲线

图2SDS-PAGE电泳分析：1-Marker,2-过氧化氢酶

图3过氧化氢酶最适作用温度

图4过氧化氢酶温度稳定性

图5pH对酶活力和稳定性的影响

图6蛋白含量标准曲线图

图7过氧化氢酶硫酸铵分级沉淀

图8HiPrep DEAE FF16/10柱层析图示说明：1—紫外吸收；2—电导率；3—洗脱液盐浓度百分比；4—加样标志线

图9凝胶过滤柱层析图示说明：1—紫外吸收；2—分部收集标志线；3—流速；4—加样标志线

图10各步纯化中收集的活性峰电泳图及活性电泳

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1---过氧化氢酶的分离纯化

1）种子培养

2）发酵培养

种子培养基按照4%（V/V）接种量转接到发酵培养基（50ml/250ml）中，200r/min，25℃培养24h，按照4-10%（V/V）接种量再转接到大锥形瓶中（300ml/1L），200r/min，25℃培养24h，收集发酵液，10000r/min离心5min，取上清检测酶活。所述发酵培养基（wt%）：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，pH调至7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。

3）过氧化氢酶粗酶液的制备

4）硫酸铵分级沉淀

硫酸铵分级沉淀使用不同饱和度的硫酸铵来分级沉淀目的蛋白过氧化氢酶，通过测定沉淀中的酶活力，来确定最佳的沉淀方法。由图7可以明显看出，CAT酶活力主要集中在硫酸铵饱和度为50%和60%之间，考虑到CAT酶活力损失情况，最终硫酸铵沉淀实验方法：先使用30%饱和度硫酸铵去除杂质，弃沉淀，上清再加到饱和度为60%，收集沉淀溶解于缓冲液中，获得进一步的粗酶制品。

蛋白质含量的测定

y=130.94x-3.6931，（公式3）

过氧化氢酶经硫酸分级沉淀结果如图7通过硫酸铵分级沉淀法可以大量粗制品中去除一些杂质，从而达到纯化浓缩蛋白的目的]。盐析就是利用高浓度盐会破坏蛋白质表面的水化层，使溶液中的蛋白质失去水分子的竞争，降低了蛋白质的溶解度，使蛋白质沉淀出来的方法。

5）透析

将粗酶液Ⅱ浓缩后，装入30mL、10kDa透析卡中，4℃透析24h，期间更换缓冲液4～5次。

6）离子交换层析

缓冲液：A流动相Tris-HCl pH8.0 50mM

B洗脱液：Tris-HCl pH8.0 50mM含1mol/L NaCl

柱子及条件：HiPrep DEAE FF16/10，15%B洗脱1个柱体积左右，30%B洗脱1个柱体积收集峰，100%B冲洗柱子至基线不变化为止。

用50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡HiPrep DEAE FF16/10阴离子柱。将硫酸铵沉淀溶于磷酸盐缓冲液后粗酶液用50mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液（使用离心管浓缩）替换，先以50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未被柱子结合的蛋白，再用含0-0.8mol/L NaCl的50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，并收集其中的活性部分于4℃冰箱保存。

7）凝胶过滤层析

凝胶过滤：Superdex 200 10/300GL。缓冲液含0.10mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.5PBS(磷酸缓冲液)。100μl样品上柱（10×300-310mm），流速0.30mL/min。收集活性峰，10kDa分子截留量超滤浓缩。预先用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液平衡SuperdexTM 200 10/300GL凝胶过滤层析柱，将经HiPrep DEAE FF 16/10柱得到的活性部分浓缩液用pH7.5磷酸缓冲液替换并上样，采用相同缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min。

变性电泳及蛋白质染色

SDS-PAGE采用12%分离胶和5%的浓缩胶，控制电压在200V。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色。凝胶成像仪拍摄照片。拍摄结果如图7，从右到左依次为BSA，marker，原发酵液浓缩液，硫胺沉淀结果，HiPrep DEAE FF 16/10，分子筛SuperdexTM 200 10/300GL过柱产物，SuperdexTM 200 10/300GL分子筛测定的实验结果显示，过氧化氢酶与分子量在201kDa左右，故该酶具有四聚体，SDS-PAGE测定的结果显示该酶的一个亚基的分子量为50kDa左右，两者基本呼应，说明该酶的分子量为201kDa。

Claims

1.一种由海洋微生物菌株YS0810（Acinetobacter sp.）产的碱性过氧化氢酶,其特征在于该碱性过氧化氢酶是一个亚基分子量约为50kDa的同源四聚体的单功能过氧化氢酶，该酶分子量为201.2kDa，最适作用温度为60℃，最适作用pH为12.0，pH6.0-10.0之间较稳定;Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺对酶活没有影响；Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺能够一定程度的抑制过氧化氢酶的酶活；Cu²⁺、Al³⁺是过氧化氢酶活性的抑制剂；Mg²⁺、Ba²⁺离子能够提高过氧化氢酶的活性。

2.一种由海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶的分离纯化方法,其特征在于包括下列步骤

1）种子培养

从保存的斜面中挑取一环菌体接入含有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，25℃、200r/min培养18-20h;所述种子培养基：蛋白胨1wt%，牛肉膏0.3wt%，NaCl 0.5wt%，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min;

2）发酵培养

种子培养基按照4V/V%接种量转接到50ml/250ml发酵培养基中，200r/min，25℃培养24h，按照4-10V/V%接种量再转接到300ml/1L大锥形瓶中，200r/min，25℃培养24h，收集发酵液，10000r/min离心5min，取上清检测酶活;所述发酵培养基：葡萄糖1wt%%，酵母膏0.5wt%，蛋白胨0.5wt%，KH₂PO₄ 0.1wt%，MgSO₄·7H₂O 0.02wt%，pH调至7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min;

3）粗酶液的制备

经发酵培养的发酵液，4℃下10000rpm离心20min，收集沉淀；pH7.0的50mM的磷酸盐缓冲液悬浮菌体；冰浴中超声波间歇细胞破碎10min；再通过超滤机10kDa的超滤膜进一步浓缩，经过以上操作浓缩后的酶为粗酶液1;

4）硫酸铵分级沉淀

取100mL粗酶液1，在冰浴中边加入边搅拌缓慢加入研磨的硫酸铵，至饱和度为30%，继续搅拌15min后，4℃冰箱中放置沉淀2h；4℃、10000r/min离心10min，取上清，继续加入硫酸铵至饱和度为60%，4℃冰箱放置过夜，4℃、10000r/min离心10min，沉淀中加入50mmol/L pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解沉淀蛋白，再12000r/min冷冻离心10min，上清液即为粗酶液Ⅱ;

5）透析

将粗酶液Ⅱ浓缩后，4℃透析24h，期间更换缓冲液4—5次；

6）离子交换层析

缓冲液：A流动相Tris-HCl pH8.050mM

B洗脱液：Tris-HCl pH8.050mM含1mol/L NaCl

柱子及条件：HiPrep DEAE FF16/10，15%B洗脱1个柱体积左右，30%B洗脱1个柱体积收集峰，100%B冲洗柱子至基线不变化为止;

用50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡HiPrep DEAE FF16/10阴离子柱;将硫酸铵沉淀溶于磷酸盐缓冲液后粗酶液用50mmol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液使用离心管浓缩替换，先以50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未被柱子结合的蛋白，再用含0-0.8mol/L NaCl的50mmol/L，pH8.0Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，并收集其中的活性部分于4℃冰箱保存;

7）凝胶过滤层析

凝胶过滤：Superdex20010/300GL;缓冲液含0.10mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.5PBS。100μl样品上10×300-310mm柱，流速0.30mL/min。收集活性峰，10kDa分子截留量超滤浓缩;

预先用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液平衡SuperdexTM200 10/300GL凝胶过滤层析柱，将经HiPrep DEAE FF16/10柱得到的活性部分浓缩液用pH7.5磷酸缓冲液替换并上样，采用相同缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min;该酶分离纯化后，目的蛋白的纯化倍数为37.5，其比活力为112446.70U/mg，得率为19.23%。