CN104894020B - 一种蛋白酶及其生产菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种蛋白酶及其生产菌株，本发明首先提供一种藤黄微球菌(Micrococcus luteus)NH54PC02，该菌株保藏于2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.10238。本发明还提供一种从上述藤黄微球菌中分离的蛋白酶，该蛋白酶可以用于水产蛋白的水解。

Description

一种蛋白酶及其生产菌株
技术领域
本发明属于水产蛋白技术领域，具体涉及一种蛋白酶及其生产菌株。
背景技术
蛋白酶英文名Protease，又叫肽酶peptidase，是生物体内一类蛋白质水解酶，可以将蛋白质水解生成氨基酸和小分子肽。在自然环境中，蛋白酶无处不在，动物、植物、微生物都含有丰富的蛋白酶资源。蛋白酶不仅在生物体的新陈代谢中起着不可替代的作用，如细胞分化、消化吸收等，与人类的生产生活也息息相关。作为一种常见的生物催化剂，蛋白酶是最重要的工业酶之一，其生产总量占到整个工业酶市场的65％，广泛应用于食品、医药、洗涤、制革、化妆品等工业中。目前，微生物来源蛋白酶是应用最广泛的，因为微生物生长迅速易于培养并且可以相对容易的改造获得高产菌株或工程菌株。所以从自然界中筛选具有特异性活力的蛋白酶是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白酶及其生产菌株，即从微球菌发酵粗酶液中分离纯化的蛋白酶，及其制备方法和主要酶学性质，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种藤黄微球菌(Micrococcus luteus)NH54PC02，该菌株保藏于2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.10238。
本发明还提供一种从上述藤黄微球菌中分离的蛋白酶，包括有如下的性质：
1)SDS-PAGE电泳分子量为25kDa.，
2)乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和胃蛋白酶抑制剂(pepstatinA)能够完全抑制酶活，
Fe2+，Ni2+，Cu2+、Zn2+ 、二甲基亚砜、甲醇、乙醇和异丙醇能够部分抑制酶活，
Mn2+可以很好的促进酶活，
3)其在pH 6～11的范围内具有较强的酶活力，最适的pH为10.0；
4)上述的蛋白酶，在40℃保温1h后，酶活力保留90％；
上述的蛋白酶其最适的反应温度为50℃。
本发明蛋白酶可以用于水产蛋白(虾头、虾粉、鳀鱼蛋白)的水解。
附图说明
图1：本发明微球菌产酶曲线和生长曲线
图2：本发明的脂肪酶纯化过程电泳图；其中泳道1为标准分子量蛋白；泳道2为微球菌发酵液；泳道3为70％硫酸铵沉淀透析液；泳道4为DEAE离子交换层析溶液；泳道5为苯基疏水层析溶液。
图3：本发明蛋白酶Mascot评分柱状图和本发明蛋白酶测序覆盖率
图4：pH和温度对本发明蛋白酶活性和稳定性的影响。A，pH对酶活力的影响；B，pH对酶稳定性的影响；C，温度对酶活力的影响；D，温度対酶稳定性的影响；
图5：本发明蛋白酶水产品酶解效果：A，水解前后水产品氨基态氮含量；B，水解前后水产品多肽含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的酶的纯化步骤、酶的性质进行详细描述。
实施例1：蛋白酶产生菌的筛选及分离纯化步骤
本发明的酶是从微球菌发酵粗酶液中分离纯化，该菌株是验从南海沉积物中筛选得到的，具体描述如下：
菌株筛选及培养
将冻存于-20℃的南海沉积物在无菌操作台内均质后取1g于10mL灭菌的陈海水中震荡混匀。梯度稀释上述混匀液至10-7，每个稀释梯度取0.1mL均匀涂布于筛选培养基平板上，28℃恒温培养。提取在筛选平板上产生水解圈的单菌落。
筛选使用的培养基的组成如下：
筛选培养基：5g/L蛋白胨，1g/L酵母粉，0.1g/L柠檬酸铁，20g/L琼脂粉，陈海水定容，121℃蒸气灭菌20分钟。
种子培养基：5g/L蛋白胨，1g/L酵母粉，0.1g/L柠檬酸铁，陈海水定容，115℃蒸气灭菌20分钟。
发酵培养基：5g/L蛋白胨，1g/L酵母粉，0.1g/L柠檬酸铁，陈海水定容，115℃蒸气灭菌20分钟。
本发明中藤黄微球菌在液体培养基中呈黄色，镜检为球形；而且其发酵过程生产迅速、产酶周期短，在28℃和180rmp条件下培养36-48h即可高产蛋白酶；此外，该藤黄微球菌在高温40℃条件下亦可较好的生长并产蛋白酶，有利于减少发酵过程冷凝循环水的使用、降低污染杂菌的可能性，具有较高的工业应用前景。将该菌命名为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)NH54PC02，于2014年12月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.10238。
实施例2：
划线挑取筛选的藤黄微球菌单克隆于种子培养基中28℃180rpm震荡培养24小时，将种子培养液按照2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，28℃180rpm震荡培养36小时,4℃6000rpm离心10分钟得到发酵粗酶液。
粗酶液硫酸铵沉淀
离心得到的发酵粗酶液进行70％硫酸铵沉淀。冰水浴保温，磁力搅拌的条件下均匀缓慢地向发酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸铵。4℃静置过夜后离心收集沉淀，用20mMpH 8.0Tris-Hcl缓冲液复溶沉淀，并在此缓冲液中透析。
DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
用pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液充分平衡DEAE Sepharose FF离子交换柱(10cm*1.2cm)，上样吸附。然后用pH 8.0的20mM Tris-HCl含有NaCl(0.1-0.6M of NaCl)进行梯度洗脱,收集OD280出峰平衡液及洗脱液。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。
Phenyl Sepharose 6Fast Flow苯基疏水层析
上柱前，向上步0M NaCl洗脱液酶液中添加氯化钠至终浓度为2M再上柱。上柱后用高浓度到低浓度的氯化钠缓冲液先后洗脱(2M-1.5M-1.0M-0.5M-0M)，收集洗脱液，对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。
分别测定以上几个步骤样品的酶活力和蛋白质含量并进行SDS-PAGE。纯化结果见表1，粗酶液经过几步纯化后，比活从4.72U/μg提高到38.78U/μg，纯化倍数为8.22倍。蛋白电泳结果(图1)表明，纯化后的脂肪酶在电泳上为一条带，分子量约为25kDa。
切取电泳胶中的蛋白酶蛋白酶条带进行质朴鉴定，鉴定结果显示该蛋白序列属于肽酶S8家族。鉴定序列见表2。
表1脂肪酶的纯化步骤及结果
表2蛋白酶质谱鉴定序列
实施例3：本发明脂肪酶的酶学性质(30、40、50、60、70、80℃)
(1)蛋白酶分子量的测定
在SDS-PAGE电泳中蛋白质的迁移率与其相对分子质量的对数成正比。因此可以通过SDS-PAGE测定目标蛋白的相对分子质量。根据SDS-PAGE中标准分子量蛋白和目标蛋白的相对迁移率计算出目的蛋白的相对分子量为25kDa。
(2)蛋白酶的最适pH及pH稳定性
纯化后的蛋白酶在不同的pH下进行酶活测定，结果如图4所示。NH54PC02蛋白酶pH适用范围比较宽，pH 10.0为其最适反应pH，在pH 7-11之间均保留90％以上的酶活力。pH稳定性是将酶液在不同的pH缓冲液中进行10倍稀释，4℃放置过夜，然后在标准条件下测定残余酶活。结果显示在pH 6-11的范围内其能够保持70％以上的活力。具有较好的pH稳定性。
(3)蛋白酶最适温度及温度稳定性
纯化后的蛋白酶在不同的温度(30、40、50、60、70、80℃)下测定酶活，结果如图4所示。NH54PC02蛋白酶最适的反应温度为50℃，温度过高或过低对酶活力影响明显，温度高于70℃基本丧失酶活力。
酶的温度稳定性是将酶在不同的温度(30、40、50、60、70、80℃)中保温1h，结果见图4。NH54PC02蛋白酶在10-40℃时稳定性较好，保温1h能够维持85％以上的活力。在50℃保温1h基本丧失所有酶活。
(4)酶的抑制剂对蛋白酶的影响
将纯酶与蛋白酶抑制剂混合反应，结果如表3所示：半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对该本发明蛋白酶基本没有抑制作用，胃蛋白酶抑制剂和PMSF在终浓度为100μg/mL和10mM时具有强烈的抑制作用，但在低浓度时抑制作用不强，且PMSF的抑制作用要低于胃蛋白酶抑制剂。当PMSF浓度达到1mM时，蛋白酶NH54PC02依然可以保持56％的酶活力，而当存在1mM金属蛋白酶抑制剂EDTA时，该蛋白酶完全丧失活力。
(5)有机试剂和表面活性剂对蛋白酶的影响
将纯酶与表面活性剂和有机试剂按一定比例混合反应，结果如表2所示：当添加非离子表面活性剂曲拉通X-100，吐温-80和司班-80时，蛋白酶活力均有轻微的下降。但离子表面活性剂SDS则对该蛋白酶有较强烈的抑制作用，当SDS终浓度达到10mM时，蛋白酶活力仅剩余57％。
有机试剂对蛋白酶的活力影响显著，甲醇，乙醇和异丙醇均具有明显的抑制作用，但是，在20％DMSO中，蛋白酶可以保持85％的酶活力。
表3蛋白酶抑制剂、表面活性剂和有机试剂对蛋白酶影响
(6)金属离子对蛋白酶的影响
将本蛋白酶纯酶与不同金属离子混合反应，结果如表4所示：Fe2+，Ni2+，Cu2+和Zn2+在高浓度时，对蛋白酶活性有强烈的抑制作用，酶活力只剩下40％，但Mn2+对酶活有极大地促进作用，当Mn2+浓度达到10mM时，酶活力提高到原来的1.5倍，K+，Mg2+和Ba2+等对酶活的影响则相对较弱，在这些金属离子中蛋白酶可以保留80％以上的酶活力。
表4金属离子对蛋白酶影响
实施例4：本发明蛋白酶用于水产蛋白的水解
用发酵的蛋白酶酶解包括虾头，虾粉和鳀鱼蛋白在内的水产品，通过测定水解前后氨基态氮和多肽含量来检测水解效果。实验结果如图5显示，水解后，所有水产品的氨基态氮含量和多肽含量均增加。对虾粉水解前后的游离氨基酸含量进行测定，测定结果如下表5所示。水解后，虾粉中出现了原本没有的游离氨基酸，且部分氨基酸含量显著增加，如天冬氨酸增加了三倍多，谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸均增加近两倍。
表5水解前后虾粉中游离氨基酸含量

Claims (3)

1.一种藤黄微球菌，其特征在于，所述的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的保藏编号为CGMCC NO.10238。
2.权利要求1所述的藤黄微球菌在发酵代谢蛋白酶中的应用，所述的蛋白酶用于水解水产蛋白。
3.如权利要求2所述的应用，所述的水产蛋白为虾头、虾粉或鳀鱼蛋白。
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