CN101412981B - 沙雷氏菌wj39菌株,由其获得的低温蛋白酶及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，以及从中获得的低温蛋白酶及其纯化方法。该方法包括发酵上清液的硫酸铵沉淀、用10KDa的超滤管进行离心浓缩，最后进行DEAE SepharoseTM FF阴离子交换层析，最终得到电泳纯的低温蛋白酶。本发明纯化的低温蛋白酶作用温度低、具有较宽的pH适应范围、较低的活化能，在洗涤剂、农业、环境、食品加工等领域蕴藏一定的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，以及从中获得的低温蛋白酶及其纯化方法。
背景技术：
地球表面大部分地区属于低温环境，其中90％属于低于5℃的海洋环境，其余为包括永久冻结带、冰川、极地冰山以及雪山等环境，这些环境中都存在着大量的低温微生物，它们是低温酶的主要来源。
蛋白酶是目前应用最多的一种酶，已广泛应用于农业、环境、食品、洗涤、皮革、饲料等领域。但目前应用的主要为中温蛋白酶，其最适酶活温度一般在50℃左右，而低温蛋白酶由于具有产酶最适温度低、对热敏感、低温下高效催化等特点，使其在食品、化妆、废物处理、饲料等领域具有广泛的应用前景。低温蛋白酶代替洗衣粉中的中温蛋白酶，可以提高效率，节省用量，因此低温蛋白酶在洗涤工业中有着很好的应用前景。而且在国外如日本、美国等国家，低温蛋白酶己因应用于洗涤、食品等行业。
因此对低温蛋白酶进行纯化，并对其生物学特性进行分析，将为今后低温蛋白酶冷适应性机制研究及其在工农业上的应用研究提供一定的理论依据。
发明内容：
本发明旨在提供一种能在低温下产生具有较高酶活性的低温蛋白酶菌株。
本发明的另一目的在于提供一种从沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株中获得的低温蛋白酶及其纯化方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，菌种保藏号为CGMCC No.2638。
低温蛋白酶，从沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株产生，其酶学性质为：最适反应温度为37℃，并在0-25℃保持稳定；最适pH为8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持稳定；蛋白酶的分子量为47.6KDa。
低温蛋白酶，以沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株为原料由下述方法制备而得：
(1)制备粗酶液：沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的发酵培养条件为温度10-25℃，pH7.0-9.0，培养时间15-48小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；
(2)硫酸铵沉淀：粗酶液加硫酸铵至30-40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60-70％饱和度，离心弃上清，沉淀在50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0中透析过夜；
(3)DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析：将透析的酶液离心，上清进行浓缩，上样于磷酸盐缓冲液预平衡过的DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯酶。
低温蛋白酶的纯化方法，以沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株为原料，其步骤包括：
(1)制备粗酶液：沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的发酵培养条件为温度10-25℃，pH7.0-9.0，培养时间15-48小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；
(2)硫酸铵沉淀：粗酶液加硫酸铵至30-40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60-70％饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜；
(3)DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析：将透析的酶液离心，上清进行浓缩，上样于磷酸盐缓冲液预平衡过的DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯酶。
步骤(1)中发酵条件的优化；步骤(2)中分离纯化所用的缓冲液为50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0；进一步将步骤(3)得到的纯酶样品进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。
沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，分离自冷冻肉联厂。菌株筛选培养基为(g/L)：酵母提取物，1；NaCl，10；干酪素，20；琼脂，20；pH7.0-7.2。沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，菌落为圆形，湿润，浅黄色，粘稠；细胞为短杆状，革兰氏阴性菌，生长pH范围是5.0-9.0，最适pH为7.2；温度范围是4-37℃，最适生长温度为13℃。
经形态学和生理生化特征鉴定，结合16S rRNA基因序列分析，将分离的低温细菌鉴定为沙雷氏菌属的一个菌株，命名为Serratia sp.WJ39。
本发明的新菌株Serratia sp.WJ39已经于2008年8月26日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国北京)保藏，保藏号为：CGMCCNo.2638。
本发明所涉及的沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的低温蛋白酶的纯化步骤为：
(1)制备粗酶液：沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的发酵培养条件为温度10-25℃，pH7.0-9.0，培养时间15-48小时。将发酵液离心，取上清即为粗酶液。
(2)硫酸铵沉淀：粗酶液加硫酸铵至30-40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60-70％饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜。
(3)DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析：将透析的酶液离心，上清进行浓缩，上样于磷酸盐缓冲液预平衡过的DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯酶。
在步骤(2)中分离纯化所用的缓冲液为50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0。
在步骤(3)中分离纯化中所说的洗脱采用含0.5-1.0mol/LNaCl线性梯度的磷酸盐缓冲液洗脱；分离纯化中采用电泳纯化，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。
低温蛋白酶，由沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株产生，沙雷氏菌(Serratiasp.)WJ39菌株所产低温蛋白酶具有以下酶学性质：
1.纯化的沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株所产低温蛋白酶最适酶活温度为7℃，并在0-25℃保持稳定。
2.最适pH为8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持稳定。
3.蛋白酶的分子量为47.6KDa。
附图说明：
图1为WJ39菌株产生的低温蛋白酶的反应温度和相对酶活关系曲线；
图2为WJ39菌株产生的低温蛋白酶的热稳定性曲线；
图3为WJ39菌株产生的低温蛋白酶的反应pH和相对酶活关系曲线；
图4为WJ39菌株产生的低温蛋白酶的pH稳定性曲线；
图5为WJ39菌株产生的低温蛋白酶的底物浓度和反应速率关系曲线；
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明。
实施例1：
雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的分离筛选及鉴定：
沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，分离自昆明市东站冷冻肉联厂。菌株筛选培养基为(g/L)：酵母提取物，1；NaCl，10；干酪素，20；琼脂，20；pH7.0-7.2。
采用细菌系统鉴定方法对沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株进行鉴定。该菌的形态学特征如下：菌落为圆形，湿润，浅黄色，粘稠；细胞为短杆状，革兰氏阴性菌，生长pH范围是5.0-9.0，最适pH为7.2；生长温度范围是4-37℃，最适温度为13℃。
经形态学和生理生化特征鉴定，结合16S rRNA基因序列分析，将分离的低温细菌鉴定为沙雷氏菌属的一个菌株，命名为Serratia sp.WJ39。
沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株保藏于微生物菌种保藏普通微生物中心。保藏号为：CGMCC No.2638。
实施例2：
低温蛋白酶的纯化：
(1)制备粗酶液：沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的发酵培养条件为温度13℃，pH7.2，培养时间48小时。将发酵液离心，取上清即为粗酶液。
(2)硫酸铵沉淀：粗酶液加硫酸铵至30-40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60-70％饱和度，离心弃上清，沉淀在50mM，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中透析过夜。
(3)DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析：将透析的酶液离心弃杂质，上清进行浓缩，上样于用50mM，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液预平衡过的DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析柱，流速为0.4ml/min，NaCl浓度梯度(0.05mol/L、0.18mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L)洗脱，收集洗脱峰，检测蛋白浓度及酶活性部分，用10KDa的浓缩管于4℃离心收集浓缩液透析过夜，即为纯酶，冷冻保存。将浓缩的样品进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％，得到单一条带，表明纯化的低温蛋白酶已经达到电泳纯，分子量为47.6KDa。
低温蛋白酶活性的测定：酶活力测定方法为使用酪蛋白为底物进行蛋白酶活性测定(张树政.酶制剂工业.北京：科学出版社，1984，387-449)。低温蛋白酶的水解活力单位定义为：在一定温度下，每分钟催化酪蛋白水解生成1毫克酪氨酸的酶量，定义为1个活力单位(U)。
蛋白质浓度的测定：采用LOWRY法进行测定(LOWRY.OH，1951)。
SDS-PAGE垂直凝胶电泳：按Laemmli法进行(Laemmli U K，1970)。
实施例3.：
低温蛋白酶的特性：
①最适酶活温度
将酶液加到磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.2)中，在底物浓度为2％干酪素的条件下，测定WJ39菌株所产蛋白酶在0-60℃范围内不同温度下的酶活。结果如图1所示，表明该低温蛋白酶的最适酶活温度为37℃。
②热稳定性
将酶液加到磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.2)中，并在不同温度的恒温水浴中保温，在不同的时间(0-90min，取样间隔为15min)取样，然后按照标准的酶活测定方法测定酶活。温度对酶稳定性的影响表示为在一定时间后残存酶活所占原来酶活的百分比，WJ39菌株所产低温蛋白酶的热稳定曲线如图2所示，表明该低温蛋白酶在45℃下保温15min，残留酶活为最大酶活的60％。
③最适pH
用pH5.0至pHl1.0的不同的缓冲液稀释酶液，分别加入相应pH的2％的干酪素，在37℃下测定酶活力，结果如图3所示，表明WJ39菌株所产的低温蛋白酶在pH8.0时酶活最高。
④pH稳定性
将酶液加到不同pH的缓冲液中，并在4℃保温10小时，在不同的时间取样，然后按照标准的酶活测定方法测定酶活。pH对酶稳定性的影响表示为在一定时间后残存酶活所占原来酶活的百分比，WJ39菌株所产低温蛋白酶的pH稳定性如图4所示，表明WJ39菌株所产的低温蛋白酶在pH6.0-10.0保持稳定。
⑤酶促反应动力学
将酶液加到磷酸盐缓冲液中，在不同的底物浓度(0-2.0％，间隔为0.2％)和温度梯度下(4-60℃)保温10min，测定相应酶活。将不同温度下，利用底物浓度的倒数和反应速率的倒数做曲线，计算相应的Km和Kcat，并计算出活化能(Ea)。如图4和表1所示，表明WJ39菌株所产的低温蛋白酶的Km在37℃时最小，说明在37℃时酶与底物的结合能力最强，而且在4-37℃，随着温度升高，Km逐渐降低，这是低温酶具有的典型特征。WJ39菌株所产的低温蛋白酶的Ea值为23.0KJ·mol-1，高于目前报道的很多低温酶的值，这进一步表明纯化的蛋白酶为典型的低温酶。
表1：WJ39菌株产生的低温蛋白酶的酶促反应动力学参数曲线
Claims (1)
1.低温蛋白酶的纯化方法，以沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株，菌种保藏号为GGMCC No.2638为原料，其步骤包括：
(1)、制备粗酶液：沙雷氏菌(Serratia sp.)WJ39菌株的发酵培养条件为温度13℃，pH7.2，培养时间48小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；
(2)、硫酸铵沉淀：粗酶液加硫酸铵至30-40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至60-70％饱和度，离心弃上清，沉淀在50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0中透析过夜；
(3)、DEAE SepharoseTMFF阴离子交换层析：将透析的酶液离心弃杂质，上清进行浓缩，上样于用50mM，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液预平衡过的DEAE SepharoseTM FF阴离子交换层析柱，流速为0.4ml/min，NaCl浓度梯度为0.05mol/L、0.18mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L洗脱，收集洗脱峰，检测蛋白浓度及酶活性部分，用10KDa的浓缩管于4℃离心收集浓缩液透析过夜，即为纯酶，冷冻保存；将浓缩的样品进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％，得到单一条带，表明纯化的低温蛋白酶已经达到电泳纯，分子量为47.6KDa。
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