CN103275910A - 一种耐盐碱细菌藤黄微球菌tjtb70降解多环芳烃蒽的方法 - Google Patents

一种耐盐碱细菌藤黄微球菌tjtb70降解多环芳烃蒽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耐盐碱细菌藤黄微球菌菌株（Micrococcusluteus）TJTB70（菌种保藏号：CGMCC No.7584）降解蒽的方法，属于微生物降解多环芳烃（PAHs）的应用领域。它解决了现有的微生物降解方法不能解决PAHs中三环化合物蒽的降解修复问题。本耐盐碱菌株降解土壤中蒽的方法，包括以下步骤：（1）耐盐碱菌液的培养和制备；（2）外加碳源优化降解；（3）降解产物的检测方法。本方法工艺流程简单，成本较低，应用范围和使用条件较广，培养的耐盐碱细菌对土壤中蒽具有较强的降解能力。

Description

一种耐盐碱细菌藤黄微球菌TJTB70降解多环芳烃蒽的方法
技术领域
本发明属于微生物修复石油污染土壤的应用技术领域。涉及利用一种耐盐碱细菌Micrococcus luteus TJTB70降解多环芳烃中三环化合物蒽的方法，所述的蒽是一种含三个环的多环芳烃，与菲是同分异构体，但由于其特殊的线性结构，其降解途径与菲也有不同之处。
背景技术
自二十世纪中期，石油成为世界第一能源。随着石油的大量开采，伴随产生的环境和地质灾害日益严重。在石油勘探、开采、储运、炼制等过程中，由于操作不当或事故泄漏及检修等原因，都会使一些石油洒落到地面上，造成土壤的污染。目前，我国石油企业每年产生落地油约7×106t，各油田每作业一次遗留于井场的落地油为几十到几百公斤，一些油田井口周围5m×5m范围为最严重的污染区，地面呈黑色，50m×30m范围为严重污染区，有原油、油泥散落，地面溢油再加上遗留井场的钻井泥浆池和作业泥浆池，一般井场周围污染范围在1000～2000m2之间，经雨水冲刷还会导致污染范围不断扩大，地面溢油一方面下渗污染土壤及地下水，一方面被雨水携带污染地表水体，对环境影响严重。
石油的四个主要部分包括：饱和烃、芳香烃、树脂和沥青，其中多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是对生态系统破坏性最大的化合物之一。PAHs具有三致性、生物积累、生物放大、极难降解等特性，对于PAHs的降解过程和在环境中的迁移转化备受关注。有研究表明，微生物降解PAHs的过程中占有重要地位，是环境中去除PAHs的主要途径。
目前含油土壤的治理方法有物理方法、化学方法和生物方法。微生物降解PAHs一般有两种方式：一种是以PAHs为唯一碳源和能源，对于三环及以下的PAHs一般是选择这种代谢方式；另一种是将PAHs与其它有机质进行共代谢，多数细菌对四环及以上的PAHs选择共代谢方式进行，但对于真菌对三环以上的PAHs的代谢也多数是共代谢。共代谢是目前研究的热点。近年来研究得比较清楚的代谢途径只有萘、菲之类简单的PAHs。与菲一样，蒽也是三环化合物，但由于其特殊的线性结构，其降解途径与菲也有不同之处。目前国内对蒽降解途径的研究较少。
发明内容
本发明的目的是解决含油土壤蒽的微生物降解问题，提供一种耐盐碱细菌Micrococcus luteus TJTB70及其降解蒽的方法。该方法利用可以在盐碱条件下生长的微生物降解土壤中多环芳烃三环化合物蒽，是一种操作简单、成本低廉的降解土壤中PAHs污染物的方法。
本发明涉及的耐盐碱藤黄微球菌（Micrococcus luteus）TJTB70，该菌种已于2013年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC No.7584， 建议分类命名为微球菌属藤黄微球菌。
本发明提供的耐盐碱细菌藤黄微球菌TJTB70降解土壤中蒽的方法，具体步骤如下：
第1、降解蒽的藤黄微球菌菌液的培养和制备
以BH为基础培养基，添加蒽的量为25ug/L，在30℃、150rpm振荡培养5天，然后用流式细胞仪检测微生物藤黄微球菌生长状况；降解蒽的菌株最佳耐盐碱生长条件是：pH=8， NaCl的浓度为8.5%；
BH培养基组成以g/L计为：可溶性淀粉10、酵母粉5、蛋白胨5、K2HPO4 1、Mg2SO4٠7H2O 0.2、Na2CO3 5、NaCl 50；
第2、接种和降解蒽
以BH为基础培养基，添加蒽的量为50µg/L，以步骤1中的箘液为菌种原液，接种浓度为104~105count/mL。放入摇床中培养降解，培养条件：温度为30℃，转速为150 r/min；
第3、降解过程中藤黄微球菌的生长情况测定
利用流式细胞仪检测细菌数量变化，仪器电压设置SSC=200，FL1=280，FL3=550，speed=3。用超纯水适当稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数速度小于500 cells/s。
第4、蒽降解产物的检测
利用安捷伦Thermo DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪对蒽讲解情况进行分析，采用DB-5石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25µm）。进样口温度220℃，传输线温度260℃，EI离子源260℃；气体为高纯氦气；进样量1µL，不分流进样；全扫描质量范围：50-210amu；柱温在70℃保留4 min，再以10℃·min-1的速率升到150℃，保留2 min，最后以6℃·min-1的速度升至260℃，保持15min。
本发明的优点和积极效果：
本发明与现有修复方法或技术相比有以下显著优点和有益效果：
（1）在最佳降解条件pH=8、盐浓度为8.5%、蒽与外加碳源（葡糖糖）的比例为1:1时，本发明对蒽的降解率能达到65%。
（2）操作流程非常简单，对管理条件要求低，可用于盐碱土壤蒽的修复。
（3）除了菌种以外不需投加任何化学药品和其它添加物，不会产生二次污染。
附图说明
图1为不同pH和盐浓度对微生物量的影响。
图2为外加碳源对微生物量的影响。
图3为最佳条件下微生物数量变化和蒽浓度变化。
图4为加菌样品降解10d结果。
下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
具体实施方式
降解蒽的耐盐碱细菌藤黄微球菌菌株（Micrococcus luteus）TJTB70降解蒽的方法，具体步骤如下：
第1、降解蒽的藤黄微球菌菌液的培养和制备
以BH为基础培养基，添加蒽的量为25ug/L，在30℃、150rpm振荡培养5天，然后用流式细胞仪检测微生物藤黄微球菌生长状况；降解蒽的菌株最佳耐盐碱生长条件是：pH=8， NaCl的浓度为8.5%；
BH培养基组成以g/L计为：可溶性淀粉10、酵母粉5、蛋白胨5、K2HPO4 1、Mg2SO4٠7H2O 0.2、Na2CO3 5、NaCl 50；
第2、接种和降解降解蒽
以BH为基础培养基，添加蒽的量为50µg/L，以步骤1中的箘液为菌种原液，接种浓度为104~105count/mL。放入摇床中培养降解，培养条件：温度为30℃，转速为150 r/min；
第3、降解过程中藤黄微球菌的生长情况测定
利用流式细胞仪检测细菌数量变化，仪器增益设置为FSC=112，对数放大倍数为lin，SSC=200，FL1=280，FL3=550，speed=3，对数放大倍数为log4。用超纯水适当稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数小于500 cells/s。
第4、蒽降解产物的检测
利用安捷伦Thermo DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪对蒽讲解情况进行分析，采用DB-5石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25µm）。进样口温度220℃，传输线温度260℃，离子源260℃；气体为高纯氦气；进样量1µL，不分流进样；扫描质量范围：50-210amu；柱温在70℃保留4 min，再以10℃·min-1的速率升到150℃，保留2 min，最后以6℃·min-1的速度升至260℃，保持15min。
实施例 1
降解土壤中蒽的方法的具体步骤如上所述（此处略）。
根据耐盐碱细菌的筛选过程，设定的三组pH和盐浓度条件分别为：pH=8，NaCl含量为8.5%；pH=7，NaCl含量为8.5%；pH=8，NaCl含量为2%。检测藤黄微球菌生长结果见图1。由图1可见最适合降解蒽的菌株生长条件是：pH=8，盐浓度为8.5%。
实施例 2
降解土壤中蒽的方法的具体步骤如上所述（此处略）。
根据细菌的筛选过程，外加碳源对耐盐碱菌生长的影响：以葡萄糖作为外加碳源，分别设定三组条件：蒽作为唯一碳源；蒽：葡萄糖=2:1；蒽：葡糖糖=1:1的情况下测定耐盐碱菌株的生长情况和降解情况。结果见图2。
实施例 3
按照前面提到的方法萃取培养液，用GC-MS分析。在GC-MS测试中，有两个检测为降解中间产物峰，其m/z分别为148、179，峰图对应的化合物是邻苯二甲酸酐、邻苯二甲酸。结果见图4。
有研究表明降解蒽的中间代谢产物有邻苯二甲酸酐，可见该微生物对蒽有降解作用。

Claims (2)

1.一种降解蒽的耐盐碱细菌藤黄微球菌菌株（Micrococcus luteus）TJTB70（菌种保藏号：CGMCC No.7584 ）降解蒽的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
第1、降解蒽的藤黄微球菌菌液的培养和制备
以BH为基础培养基，添加蒽的量为25µg/L，在30℃、150rpm振荡培养5天，然后用流式细胞仪检测微生物藤黄微球菌生长状况；降解蒽的菌株最佳耐盐碱生长条件是：pH=8， NaCl的浓度为8.5%；
BH培养基组成以g/L计为：可溶性淀粉10、酵母粉5、蛋白胨5、K2HPO4 1、Mg2SO4٠7H2O 0.2、Na2CO3 5、NaCl 50；
第2、接种和降解蒽
以BH为基础培养基，添加蒽的量为50µg/L，以步骤1中的箘液为菌种原液，接种浓度为104~105count/mL；放入摇床中培养降解，培养条件：温度为30℃，转速为150 r/min；
第3、降解过程中藤黄微球菌的生长情况测定
利用流式细胞仪检测细菌数量变化，仪器电压设置SSC=200，FL1=280，FL3=550，speed=3；用超纯水适当稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数速度小于500 cells/s；
第4、蒽降解产物的检测
利用安捷伦Thermo DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪对蒽讲解情况进行分析，采用DB-5石英毛细管柱；进样口温度220℃，传输线温度260℃，EI离子源260℃；气体为高纯氦气；进样量1µL，不分流进样；全扫描质量范围：50-210amu；柱温在70℃保留4 min，再以10℃·min-1的速率升到150℃，保留2 min，最后以6℃·min-1的速度升至260℃，保持15min。
2.耐盐碱细菌藤黄微球菌菌株（Micrococcus luteus）TJTB70，菌种保藏号：CGMCC No.7584 。
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