CN106566817A - 海洋微生物菌株ys0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达 - Google Patents

海洋微生物菌株ys0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达 Download PDF

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CN106566817A CN201610968480.XA CN201610968480A CN106566817A CN 106566817 A CN106566817 A CN 106566817A CN 201610968480 A CN201610968480 A CN 201610968480A CN 106566817 A CN106566817 A CN 106566817A
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Abstract

本发明涉及海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达,该海洋过氧化氢酶基因序列及氨基酸序列如基因序列表所示，基因序列长度为1443bp。该过氧化氢酶可广泛被使用于食品加工、纺织、造纸、医械器具的消毒及抗肿瘤药物等领域中。

Description

海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达
技术领域
本发明涉及海洋微生物技术领域，特别是涉及一种海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达。
背景技术
微生物过氧化氢酶又称触酶(Catalase，缩称CAT)，普遍存在于好氧微生物体内,广泛分布于动物、植物和微生物中，清除机体内过量的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害作用，广泛应用于医药、食品、纺织、造纸和环保等产业中，具有广阔的应用价值，开发生产高效、经济并稳定性高的商品过氧化氢酶非常必要。
近年来，过氧化氢酶在纺织工业中的应用而倍受关注，微生物过氧化氢酶必将成为过氧化氢酶工业化发展的重要方向。微生物过氧化氢酶种类多，且能适应各种不同的环境，由于海洋微生物为了适应海洋这一生命极限环境，如高压、低温、高盐等各种极端环境的过程中，海洋微生物酶表现比陆源微生物酶更有独特的生理功能与酶学特性，尤其是海洋微生物过氧化氢酶更具有独特的生理功能和特异的性质,其开发应用潜力巨大，愈来愈引起世界各国的重视与开发的一个热点。
目前，已经获得基因序列的不同来源CAT至少有260多个。构建表达载体，导入相应受体细胞内，可以实现CAT的高表达，同时还能优化其性状。2011年周丽萍获得来自枯草芽孢杆菌的CAT基因，并将其在大肠杆菌JM109中进行表达，得到了重组大肠杆菌基因工程菌；2014年林峻将梅花鹿CAT的基因在大肠杆菌中进行了克隆与表达等等。
商品过氧化氢酶主要来源于牛肝和经基因改良过的黑曲霉，但这些来源的过氧化氢酶稳定性不好。直接以海洋微生物Acinetobacter sp.YS0810进行发酵制备高纯度过氧化氢酶存在培养基条件高和酶制备条件高等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于以获得的海洋微生物菌株YS081所产的过氧化氢酶为基础,开发提供一种海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆及表达。
本发明提供的海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆及表达为：一、海洋微生物YS0810过氧化氢酶的基因克隆：
1、海洋微生物YS0810基因组DNA的提取
海洋微生物YS0810的基因组DNA提取采用酚/氯仿提取法：
(1)海洋微生物YS0810细菌培养
接种活化菌种于5.0mL液体培养基(蛋白胨1wt％，牛肉膏1wt％，NaCl 0.5wt％，调至pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。)中，37℃，220rpm，摇床培养12h,得细菌培养液。
(2)菌体收集
取上述细菌培养液至Eppendorf管中，室温12000g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH 8.0)中。
(3)菌体裂解
先加入50mg/mL的溶菌酶6μL，37℃作用2h。再加2M NaCl 50μL，10wt％SDS(十二烷基磺酸钠)110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h，使菌体充分裂解,得菌体裂解液。
(4)抽提
菌体裂解液转至新的Eppendorf管中，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后室温放置10min，12000g离心10min。抽提两次。
(5)沉淀
取上清液于新的Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，12000g离心10min，弃上清。
(6)洗涤
沉淀用75wt％的乙醇洗涤2次，弃上清后室温风干。
(7)溶解
沉淀溶于50μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 7.4)中，取2-5μL电泳，其余样品用作PCR模板。
由上述提取基因组DNA溶液经过1％琼脂糖凝胶电泳观察其完整性和纯度,如图1，图中1是去除了RNA的基因组DNA,可以看出所提取的基因组完整、纯度高。
2、PCR引物的设计
根据所测海洋过氧化氢酶的N端序列N-SQDPK KCPVT HLTTE设计上游引物FF：ATGAGTCAAGACCCTAAAAAATG；根据与海洋过氧化氢酶的N端序列同源性较高的其它过氧化氢酶的C段序列C-ETDPAKGLPSFL设计下游引物FR，AAGAAAACTTGGTAAACCTTTAG；引物由上海生工生物技术有限公司合成。
3、PCR扩增
PCR反应体系(50μL)：
PCR反应条件:预变性94℃，4min；变性94℃，1min；退火48℃，1min；延伸72℃，1min；30个循环后，72℃延伸7min。
4、PCR结果观察
取2μL PCR产物，在1×TAE配制加有适量GoldView的1wt％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳电压100V，电泳时间30min，使用凝胶成像系统观察分析结果。
利用引物FF和FR，以YS0810菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果见图2，图中1为PCR结果：PCR克隆海洋过氧化氢酶基因全长片段大小约为1.5kb。5、PCR产物的胶回收
将PCR所有产物加入琼脂糖凝胶上样孔中，100V电泳30min后，在紫外灯下切下目标带，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目标带，回收纯化操作过程如下(参照试剂盒说明书)。
(1)将目的条带从电泳后的琼脂糖凝胶上切下来，称取质量后放入干净的离心管中。
(2)离心管中加入3倍体积的溶胶液，50℃保温10min,须确保胶块完全溶解。
(3)将上述溶胶液转移至吸附柱中,室温12000g离心30s,弃废液。
(4)吸附柱中加入漂洗液700μL,室温12000g离心30s,弃废液。
(5)吸附柱中加入500μL漂洗液,室温12000g离心30s,弃废液，吸附柱13000g离心2min，弃废液。
(6)将吸附柱放至一个干净的离心管中，向吸附柱中间悬空滴加洗脱液40μL,室温放置2min,12000g离心2min，离心管中的溶液即为PCR胶回收产物。
6、PCR胶回收产物与T载体连接
PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶在双链DNA 3’末端增加一个腺嘌呤核苷酸(A)，从而使扩增产物具有A突出末端。因此可将PCR产物与含有T末端的pEASY-T1连接载体连接。
连接体系(10μL)：
25℃连接2小时。
7、CaCl2制备大肠杆菌感受态
CaCl2制备大肠杆菌感受态制备步骤如下：
(1)从LB平板(37℃，培养16-20h)上挑取一个大肠杆菌DH5α单菌落，转到含有25mLLB培养基(在LB液体培养基中加入琼脂粉，终浓度2wt％，121℃蒸汽灭菌20min，倒入平板中，冷却。)的三角瓶(250mL)中，37℃，300r/min，摇床震荡培养。
(2)当培养液OD600nm达到0.5时，培养物冰浴10min，4℃下2500g离心10min。
(3)收集菌体，弃培养液。
(4)用40mL冰浴的100mM CaCl2-MgCl2溶液(80mM MgCl2，20mM CaCl2)轻轻重悬菌体。
(5)4℃下2500g离心10min，回收菌体。
(6)倒尽培养液，用2mL冰浴的100mM CaCl2重悬菌体。
(7)吸取100μL细胞悬液分装至无菌离心管中，液氮速冻后-80℃冷冻保藏。8、大肠杆菌的转化
将后琼脂糖凝胶回收的PCR产物与T载体连接，所得重组体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化步骤如下：
(1)制备好的DH5α感受态细胞冰浴解冻后，每管加入待转化的DNA，混匀后冰上放置30min。
(2)离心管放至42℃水浴中准确计时90s。
(3)快速将离心管转移至冰上，放置2min。
(4)加LB液体培养基750μL至离心管中，然后将管转移到摇床上，37℃，280rpm，摇床振荡培养1h。(LB液体培养基为胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH7.4，121℃蒸汽灭菌20min。)
(5)培养的大肠杆菌离心，去除800μL培养液后重悬细菌，然后均匀涂布于在含有Ap(100μg/mL)、X-gal(40μg/mL)和IPTG(24μg/mL)的LB固体培养基平板上(LB固体培养基为：在LB液体培养基中加入琼脂粉，终浓度2wt％，121℃蒸汽灭菌20min，倒入平板中，冷却。)。
(6)将涂好的平板置于37℃培养箱中培养。
9、阳性克隆的筛选
依据α互补，利用X-gal进行阳性克隆的初步筛选。蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落为阳性菌落。用无菌牙签挑取白斑克隆于含有Ap(100μg/mL)的LB液体溶液中，用PCR法进一步验证。阳性克隆37℃，280rpm，摇床振荡培养15h后提取质粒。
10、质粒提取
质粒的提取使用质粒提取试剂盒，操作过程参照试剂盒说明书进行同1。
11、目的基因全长的获得和生物信息学分析
提取的质粒送至华大基因科技服务有限公司进行测序。所测序列提交NCBI数据库，并进行生物信息学分析。
本发明提供的海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆中：
PCR克隆海洋过氧化氢酶基因全长
海洋过氧化氢酶全长测序及基因序列分析
海洋过氧化氢酶基因全长测序，测序结果用DNAMAN软件进行核苷酸序列分析及拼接，得到整个海洋过氧化氢酶基因全长。
完整的ORF由1521个碱基组成，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子，编码506个氨基酸(图3基因序列表)。
二、本发明提供的海洋微生物YS0810过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的表达：
1、海洋微生物(Acinetobacter sp.)YS0810染色体基因组的提取采用酚/氯仿提取法(同上基因克隆所述)。
2、基因的PCR扩增
根据已克隆的海洋过氧化氢酶基因序列，去除海洋过氧化氢酶基因本身的终止密码子设计引物，同时添加核酸内切酶BamH1和Xho I的酶切位点
上游引物F2F：5’-GGATCCATGAGTCAAGACCCTAAAAAATG-3’，GGATCC是BamH1酶切位点，
下游引物F2R：5’-CTCGAGAAGAAAACTTGGTAAACCTTTAGC-3’，CTCGAG是Xho I的酶切位点。
PCR反应体系(50μL)：
PCR反应条件：预变性94℃，4min；变性94℃，1min；退火50℃，1min；延伸72℃，1min；30个循环后，72℃，延伸7min。
3、PCR产物的胶回收、连接pEASY-T1及转化大肠杆菌DH5α
取2μL PCR产物，1wt％琼脂糖凝胶电泳分析发现扩增出预期大小条带，大量上样进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后采用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收，方法参照试剂盒说明书进行。PCR产物经1wt％琼脂糖凝胶回收后与pEASY-T1克隆载体连接。连接反应体系(10μL)：
25℃连接2h，得重组克隆载体pEASY-T1-CAT，转化大肠杆菌DH5α，转化方法同第三章3.1.4.8，均匀涂布于在含有Ap(100μg/mL)、X-gal(40μg/mL)和IPTG(24μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃培养15h。
以Acinetobacter sp.YS0810基因组为模板，F2F、F2R为引物，PCR产物为一条1500bp左右的片段，如图4所示，图中1即为PCR扩增结果，大小为1500bp，与预期大小一致。
4、阳性克隆质粒pEASY-T1-CAT提取
挑取白色阳性菌落进行PCR反应。PCR阳性菌落再进行扩大培养，参照试剂盒说明提取质粒。送华大基因测序。
将PCR产物回收,连接pEASY-T1载体,重组体命名为pEASY-T1-CAT，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提重组质粒pEASY-T1-CAT。用BamH1和XhoI双酶切质粒pEASY-T1-CAT和载体pET 28。电泳检测酶切结果如图5,图中1，2为质粒pEASY-T1-CAT酶切结果；图6中1为质粒pET 28酶切结果。分别回收1500bp和4000bp大小片段，
将两回收片段进行连接，构建表达载体pET 28-CAT。
5、pEASY-T1-CAT和PET28载体酶切
BamH1和Xho I酶切质粒pEASY-T1-CAT和载体pET 28.
酶切体系(20μL)：
37℃酶切2h，1wt％琼脂糖凝胶电泳，并用试剂盒回收酶切片断。重组克隆载体pEASY-T1-CAT酶切产物回收1500bp左右大小片段，即目的片段；载体pET 28酶切产物回收4000bp左右大小片段。
6、pEASY-T1-CAT和pET 28载体酶切片断连接
将回收的目的片断及质粒进行连接。
连接反应体系(10μL)：
25℃连接2h，将构建好的表达载体命名为pET 28-CAT。
pET28CAT/BL 21扩大培养后提取质粒，并进行BamH1和Xho I双酶切验证，结果如图7，其中2为阳性质粒pET 28-CAT酶切电泳结果，1空质粒pET 28。由图8可以看出，酶切后表达片断大小约为1500bp，线形化pET 28大小为4.0Kb，与预期大小相符。
7、大肠杆菌BL 21感受态的制备及转化
大肠杆菌BL 21感受态的制备方法参照《分子克隆实验指南》第三版[101]，表达载体pET 28-CAT转化大肠杆菌BL 21方法同转化大肠杆菌DH 5α，转化后的大肠杆菌BL 21涂于含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上。含表达载体pET 28-CAT的重组大肠杆菌BL 21命名为pET 28CAT/BL 21，所表达的重组海洋过氧化氢酶命名为重组CAT。
8、阳性克隆检测
挑取pET 28CAT/BL 21单菌落扩大培养，提取质粒(使用试剂盒提取)，进行双酶切检测，同时质粒送华大基因测序，检测基因序列有无移码。
9、pET 28-CAT在大肠杆菌BL 21中的诱导表达
pET 28-CAT在大肠杆菌BL 21中的诱导表达参考陈金峰、Xunlong Shi修改后的方法。
(1)取测序鉴定的阳性重组菌pET 28CAT/BL 21接入到装有100mL含卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基的1L的摇瓶中，37℃，220rpm，摇床震荡培养至OD600为0.5左右。
(2)摇瓶中加入诱导剂IPTG至0.5mM，继续培养4h。
(3)收集培养液，10000g离心10min。上清液用于过氧化氢酶活性测定和SDS-PAGE电泳；菌体冰上超生破碎，200W，30S超声，30S间隔，6个循环，10000g离心2min；超生破碎后的上清液同样用于过氧化氢酶活性测定和SDS-PAGE电泳。以化空质粒pET 28的受体菌为阴性对照，含空pET 28的大肠菌BL 21命名为pET 28/BL 21。将表达载体pET 28-CAT导入大肠杆菌BL21，过夜培养。挑单菌落进行PCR阳性菌的筛选，电泳结果如图7所示。
重组海洋过氧化氢酶重组CAT的活性测定和SDS-PAGE电泳方法同野生型的海洋过氧化氢酶(参见上所述)。
10、重组海洋过氧化氢酶(重组CAT)诱导表达的条件优化
挑取经测序鉴定的阳性重组菌pET 28CAT/BL 21接入5mL含卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养12h，以1.5％接种量放大培养至OD600＝0.4～0.6。加入IPTG使其终浓度分别为0.3、0.5、0.8和1.0mM，37℃诱导培养6h，收集菌体，超声破碎后取上清液进行SDS-PAGE以确定IPTG最佳诱导浓度；加入IPTG至其最佳终浓度，分别放入20℃、30℃和37℃培养箱中诱导培养6h，收集菌体，超声破碎后取上清液进行SDS-PAGE以确定IPTG最佳诱导温度；加入IPTG使其终浓度为最佳诱导浓度，在最佳诱导温度下诱导培养，分别在4、6和8h取样一次，收集菌体，超声破碎后取上清液进行SDS-PAGE以确定IPTG最佳诱导时间。
将阳性重组菌(不含重组载体的菌为对照)经0.5mM IPTG诱导6h后，培养液上清无过氧化氢酶活性，SDS-PAGE电泳也检测不到目的蛋白；菌体超声破碎后过氧化氢酶活性为200U/mL，总蛋白经SDS-PAGE电泳检测，结果显示可诱导表达出分子量大小约为57kDa的目的蛋白，与来自原始菌的海洋过氧化氢酶大小一致，表明海洋过氧化氢酶可在大肠杆菌中表达(图9),重组型的海洋过氧化氢酶称为重组CAT。11、重组海洋过氧化氢酶(重组CAT)的性质分析
以最优条件进行重组CAT在大肠杆菌中的诱导表达，然后对重组CAT进行酶学性质研究，并与野生型海洋过氧化氢酶(以下简称野生型CAT)进行性质对比。
重组CAT的光学性质：取重组CAT酶液，以50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7.0)作为空白，在室温下用UV-2550紫外可见分光光度计在200～800nm波长范围内进行全波段扫描，测样品的Soret带。
重组CAT的催化性质：以0.3mM邻苯二胺为底物，牛肝过氧化氢酶为阴性对照，辣根过氧化物酶为阳性对照，测其过氧化物酶活性。
重组CAT最适作用温度：重组CAT与野生型CAT分别在20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃和80℃的温度下，pH 7.0的缓冲体系中，测定重组CAT与野生型CAT的活力。
重组CAT的温度稳定性：重组CAT与野生型CAT分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保育30min后，在30℃下的pH 7.0的缓冲体系中，测定重组CAT与野生型CAT的活力。
重组CAT最适作用pH值：重组CAT与野生型CAT分别在pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的H2O2溶液中，30℃进行反应，测定不同pH条件下重组CAT与野生型CAT的活力。
重组CAT的pH稳定性：将重组CAT与野生型CAT分别在pH 4.0～13.0的相应缓冲体系中于4℃保存3h后，在30℃下的pH 7.0的缓冲体系中测定重组CAT与野生型CAT的活力。
重组CAT活性为4528U/mL；低于原始菌酶活性(6818U/mL)。重组CAT在405nm有吸收峰，说明重组CAT含有血红素辅基；该酶的Reinheitzal比值(A405/A280)为0.55，比野生型CAT(0.68)略低。以0.3mM邻苯二胺为底物，测其过氧化物酶活性，结果显示重组CAT无过氧化物酶活性；故重组CAT与野生型CAT一样，属于单功能过氧化氢酶。
重组CAT最适作用温度为60℃，与野生型CAT相同；从10℃到60℃，相对酶活野生型CAT比重组CAT略高；60℃到80℃，相对酶活力野生型CAT比重组CAT略低。说明重组CAT比野生型CAT的热稳定性得到了一定的提高。
从此可以看出，反应温度在30～50℃范围内，重组CAT与野生型CAT的活力都较为稳定，50℃酶活力开始不同程度的下降。野生型CAT在50℃保温30min后其相对酶活力保留92％，60℃保温30min后相对酶活保留78％，70℃保温30min后相对酶活力仅保留4％；重组CAT 50℃保温30min后相对酶活力保留90％，60℃保温30min后，相对酶活力保留83％，70℃保温30min后，相对酶活力仍有53％，结果说明，在高温下的稳定性，重组CAT高于野生型CAT。重组CAT的最适反应pH值为11.0，与野生型CAT的最适反应pH相同。反应体系pH值为5.0时，野生型CAT相对酶活力为32％，随着体系pH值的升高，野生型CAT活力逐渐增大，体系pH值为11.0时活力达到最大值，后随着反应体系碱性的增强，野生型CAT活力呈降低趋势，当体系pH值为12.0时，相对酶活力为66％，当体系pH值为13.0时，相对酶活力为25％；而重组CAT当pH值为5.0时，其相对酶活力为18％，随着体系中pH增大，重组CAT活力逐渐增大，在pH值为11.0时，重组CAT活力达到最大值，而后随着体系pH值的增大，重组CAT活力降低，在pH值达到13.0时，相对酶活力降为16％。将重组CAT和野生型CAT分别在pH 5.0～12.0的相应缓冲液体系中于4℃保温3h，分别测定其对应的酶活力，以未处理的样品作为对照样可知，重组CAT活力稳定范围为pH8.0～10.0，pH为9.0时稳定性最好，野生型CAT在pH 10.0稳定性最好。结果说明相对野生型CAT而言，重组CAT耐酸耐碱性略低。
本发明提供的海洋微生物YS0810过氧化氢酶进行了在大肠杆菌BL 21中的外源表达。
(1)构建了pET 28CAT表达载体，将克隆得到的海洋过氧化氢酶基因在大肠杆菌BL21原核表达体系中进行了表达。
(2)重组大肠杆菌pET 28CAT/BL 21经0.5mM IPTG诱导6h后，培养液上清无过氧化氢酶活性，SDS-PAGE电泳也检测不到目的蛋白。菌体超声破碎后过氧化氢酶活性为200U/mL；总蛋白经SDS-PAGE电泳检测，结果显示，可诱导表达出分子量大小约为57kDa的目的蛋白，与原始菌野生型海洋过氧化氢酶大小一致，表明海洋过氧化氢酶可在大肠杆菌中表达。
(3)为提高重组海洋过氧化氢酶的表达量，对IPTG诱导剂的浓度、诱导温度和诱导时间进行了优化，其最优诱导条件为：诱导剂IPTG浓度0.8mM；诱导温度37℃；诱导时间8h。
(4)重组海洋过氧化氢酶的性质分析：以最优条件进行重组海洋过氧化氢酶在大肠杆菌中的诱导表达，然后对重组海洋过氧化氢酶进行了酶学性质研究。大肠杆菌培养液中重组海洋过氧化氢酶活性为4528U/mL，低于原始菌酶活性(6818U/mL)。重组海洋过氧化氢酶在405nm有吸收峰，说明其含有血红素辅基；以0.3mM邻苯二胺为底物，测其过氧化物酶活性，结果显示无过氧化物酶活性；故重组海洋过氧化氢酶与野生型海洋过氧化氢酶一样，属于单功能过氧化氢酶。重组海洋过氧化氢酶最适作用温度为60℃，与野生型海洋过氧化氢酶相同；重组海洋过氧化氢酶比野生型海洋过氧化氢酶的热稳定性略高。重组海洋过氧化氢酶的最适反应pH值11.0，与野生型海洋过氧化氢酶的最适反应pH值相同；耐酸碱性重组海洋过氧化氢酶低于野生型海洋过氧化氢酶。
本发明提供的产海洋过氧化氢酶的海洋微生物菌株YS0810是从青岛海域底泥样品中获得一种产碱性过氧化氢酶的海洋微生物菌株(Acinetobacter sp.),为不动杆菌属(Acinetobacter),为高产碱性过氧化氢酶的新型海洋微生物菌株YS0810(Acinetobactersp.YS0810于2013年7月6日保藏在中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2013315,保藏证明已记载在公开号CN103525738A中)。
本发明提供的海洋过氧化氢酶酶学性质(特征)纯化的海洋微生物YS0810过氧化氢酶的酶学性质：
海洋过氧化氢酶在405nm有吸收峰，说明海洋过氧化氢酶含有血红素辅基；海洋过氧化氢酶在1mM连二亚硫酸钠溶液中，Soret band的位置和峰型基本未变，表明海洋过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用。
海洋过氧化氢酶酶活受NaN3、3-氨基-1,2,4-三唑抑制和盐酸羟胺抑制，对有机溶剂氯仿和乙醇耐受，无过氧化物酶活性，故海洋过氧化氢酶不是过氧化氢一过氧化物酶，而是典型的单功能过氧化氢酶。
海洋过氧化氢酶酶分子是同源四聚体，亚基分子量为57.256kDa，属于小亚基单功能过氧化氢酶。
海洋过氧化氢酶的最适底物(H2O2)浓度为50mM，底物H2O2浓度低于50mM时，该酶活性与底物H2O2浓度呈现较好的线性关系，采用Lineweaver-Burk作图法计算出海洋过氧化氢酶对底物H2O2的表观Km值为40.35mM，Vmax为48309U/mg。
海洋过氧化氢酶的肽段氨基酸序列的质谱分析，检出8个肽段与NCBI数据库中7种来源不同的CAT肽段的氨基酸序列相匹配，证明纯化到的蛋白为CAT，另外，有3个肽段无法与数据库中的蛋白相匹配，故海洋过氧化氢酶应为一种新的过氧化氢酶。海洋过氧化氢酶的N端测序结果为：N-SQDPK KCPVT HLTTE。
附图说明
图1 YS0810基因组DNA；
1:YS0810基因组；M:DNA Marker(自上至下10、8、7、6、5、4、3、2和1kb)。图2海洋过氧化氢酶基因全长PCR结果。
图3海洋过氧化氢酶基因序列及氨基酸序列。
图4海洋过氧化氢酶基因表达片段的PCR扩增；
1:过氧化氢酶基因片段；M:DNA marker(自上至下2000、1000、750、500、250和100bp)。
图5组质粒pEASY-T1-CAT的双酶切；
1,2:双酶切后的pEASY-T1-CAT；M1:DNA marker(自上至下2000、1000、750、500、250和100bp):M2:DNA marker(自上至下10、8、7、6、5、4、3、2和1kb)
图6 pET 28质粒双酶切图；
1:双酶切后的pET28；M1:DNA marker(自上至下2000、1000、750、500、250和100bp)；
M2:DNA marker(自上至下10、8、7、6、5、4、3、2和1kb)。
图7大肠杆菌BL21pET28-CAT阳性克隆的菌落PCR筛选；
1,2:阳性菌落；3:阴性菌落；M:DNA marker(自上至下10、8、7、6、5、4、3、2和1kb)；
1：过氧化氢酶基因；M：DNA Marker(自上至下2000、1000、750、500、250和100bp)；
图8 pET 28-CAT质粒双酶切图；
1：双酶切后的pET28-CAT；2：pET28；M：1kb ladde(自上至下10、8、7、6、5、4、3、2和1kb)。
图9 IPTG诱导重组CAT表达；
1.IPTG诱导空载BL21/PET28；2.IPTG诱导BL21/PET28-CAT；M.蛋白Marker。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列。实施例1
本发明提供的海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆及表达为：1、海洋微生物YS0810基因组DNA的提取
海洋微生物YS0810的基因组DNA提取采用酚/氯仿提取法：
(1)海洋微生物YS0810细菌培养
接种活化菌种于5.0mL液体培养基(蛋白胨1wt％，牛肉膏1wt％，NaCl 0.5wt％，调至pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。)中，37℃，220rpm，摇床培养12h,得细菌培养液。
(2)菌体收集
取上述细菌培养液至Eppendorf管中，室温12000g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH 8.0)中。
(3)菌体裂解
先加入50mg/mL的溶菌酶6μL，37℃作用2h。再加2M NaCl 50μL，10wt％SDS(十二烷基磺酸钠)110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h，使菌体充分裂解,得菌体裂解液。
(4)抽提
菌体裂解液转至新的Eppendorf管中，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后室温放置10min，12000g离心10min。抽提两次。
(5)沉淀
取上清液于新的Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，12000g离心10min，弃上清。
(6)洗涤
沉淀用75wt％的乙醇洗涤2次，弃上清后室温风干。
(7)溶解
沉淀溶于50μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 7.4)中，取2-5μL电泳，其余样品用作PCR模板。
由上述提取基因组DNA溶液经过1％琼脂糖凝胶电泳观察其完整性和纯度,如图1，图中1是去除了RNA的基因组DNA,可以看出所提取的基因组完整、纯度高。
2、PCR引物的设计
根据所测海洋过氧化氢酶的N端序列N-SQDPK KCPVT HLTTE设计上游引物FF：ATGAGTCAAGACCCTAAAAAATG；根据与海洋过氧化氢酶的N端序列同源性较高的其它过氧化氢酶的C段序列C-ETDPAKGLPSFL设计下游引物FR，AAGAAAACTTGGTAAACCTTTAG；引物由上海生工生物技术有限公司合成。
3、PCR扩增
PCR反应体系(50μL)：
PCR反应条件：预变性94℃，4min；变性94℃，1min；退火48℃，1min；延伸72℃，1min；30个循环后，72℃延伸7min。
利用引物FF和FR，以YS0810菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果见图2，图中1为PCR结果：PCR克隆海洋过氧化氢酶基因全长片段大小约为1.5kb。
4、PCR结果观察
取2μL PCR产物，在1×TAE配制加有适量GoldView的1wt％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳电压100V，电泳时间30min，使用凝胶成像系统观察分析结果。
5、PCR产物的胶回收
将PCR所有产物加入琼脂糖凝胶上样孔中，100V电泳30min后，在紫外灯下切下目标带，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目标带，回收纯化操作过程如下(参照试剂盒说明书)。
(1)将目的条带从电泳后的琼脂糖凝胶上切下来，称取质量后放入干净的离心管中。
(2)离心管中加入3倍体积的溶胶液，50℃保温10min,须确保胶块完全溶解。
(3)将上述溶胶液转移至吸附柱中,室温12000g离心30s,弃废液。
(4)吸附柱中加入漂洗液700μL,室温12000g离心30s,弃废液。
(5)吸附柱中加入500μL漂洗液,室温12000g离心30s,弃废液，吸附柱13000g离心2min，弃废液。
(6)将吸附柱放至一个干净的离心管中，向吸附柱中间悬空滴加洗脱液40μL,室温放置2min,12000g离心2min，离心管中的溶液即为PCR胶回收产物。
6、PCR胶回收产物与T载体连接
PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶在双链DNA 3’末端增加一个腺嘌呤核苷酸(A)，从而使扩增产物具有A突出末端。因此可将PCR产物与含有T末端的pEASY-T1连接载体连接。
连接体系(10μL)：
25℃连接2小时。
7、CaCl2制备大肠杆菌感受态
CaCl2制备大肠杆菌感受态制备步骤如下：
(1)从LB平板(37℃，培养16-20h)(在LB液体培养基中加入琼脂粉，终浓度2wt％，121℃蒸汽灭菌20min，倒入平板中，冷却。)上挑取一个大肠杆菌DH5α单菌落，转到含有25mLLB培养基的三角瓶(250mL)中，37℃，300r/min，摇床震荡培养。
(2)当培养液OD600nm达到0.5时，培养物冰浴10min，4℃下2500g离心10min。
(3)收集菌体，弃培养液。
(4)用40mL冰浴的100mM CaCl2-MgCl2溶液(80mM MgCl2，20mM CaCl2)轻轻重悬菌体。
(5)4℃下2500g离心10min，回收菌体。
(6)倒尽培养液，用2mL冰浴的100mM CaCl2重悬菌体。
(7)吸取100μL细胞悬液分装至无菌离心管中，液氮速冻后-80℃冷冻保藏。8、大肠杆菌的转化
将后琼脂糖凝胶回收的PCR产物与T载体连接，所得重组体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化步骤如下：
(1)制备好的DH5α感受态细胞冰浴解冻后，每管加入待转化的DNA，混匀后冰上放置30min。
(2)离心管放至42℃水浴中准确计时90s。
(3)快速将离心管转移至冰上，放置2min。
(4)加LB培养基750μ(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH7.4，121℃蒸汽灭菌20min。)L至离心管中，然后将管转移到摇床上，37℃，280rpm，摇床振荡培养1h。
(5)培养的大肠杆菌离心，去除800μL培养液后重悬细菌，然后均匀涂布于在含有Ap(100μg/mL)、X-gal(40μg/mL)和IPTG(24μg/mL)的LB固体培养基平板上(将X-gal溶于二甲基酞胺中，配成20mg/mL浓度的溶液，装于Eppendorf管中，锡箔或黑纸包裹，-20℃避光保存。
IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)的配制：将2.0g IPTG溶于8mL的水中，定容至终体积10mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃避光保存。)。
(6)将涂好的平板置于37℃培养箱中培养。
1×TAE电泳缓冲液：40mM Tris-乙酸，2mM EDTA。
TE(pH7.4)：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 7.4)。
X-gal(贮存液的配制)：将X-gal溶于二甲基酞胺中，配成20mg/mL浓度的溶液，装于Eppendorf管中，锡箔或黑纸包裹，-20℃避光保存。
9、阳性克隆的筛选
依据α互补，利用X-gal进行阳性克隆的初步筛选。蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落为阳性菌落。用无菌牙签挑取白斑克隆于含有Ap(100μg/mL)的LB液体溶液中，用PCR法进一步验证。阳性克隆37℃，280rpm，摇床振荡培养15h后提取质粒。
10、质粒提取
质粒的提取使用质粒提取试剂盒，操作过程参照试剂盒说明书进行。
PCR克隆海洋过氧化氢酶基因全长测序，测序结果用DNAMAN软件进行核苷酸序列分析及拼接，得到整个海洋过氧化氢酶基因全长。海洋过氧化氢酶基因提交Genbank，其登录号为KJ612073。完整的ORF由1521个碱基组成，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子，编码506个氨基酸(图3)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 产过氧化氢酶的海洋微生物菌株YS0810
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1551
<212> DNA
<213> 不动杆菌种（Acinetobacter sp.）
<220>
<221> misc_feature
<222> (201)..(201)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (694)..(694)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (844)..(844)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
atgagtcaag accctaaaaa atgtcctgta acccacctga ctactgaagc tggtgcccct 60
gtggtcgaca atcagaacag tatgacggca ggtgcgcgtg gacctttact tgcccaagat 120
ttatggttga atgaaaaatt agcaaacttc gtccgcgaag tgattccaga gcgtcgtatg 180
cacgctaaag gttcaggtgc ttttggtacc tttaccgtga ccaatgatat tacccaatat 240
actcgcgcta aaattttctc tgaagtcggc aaaaaaaccg aaatgtttgc gcgtttctca 300
acggtggcgg gtgaacgtgg cgcggccgat gcagaacgtg atattcgagg ttttgccctg 360
aaattctata ctgaagaggg caactgggat ctggtcggca ataatacccc ggtgtttttc 420
ctgcgggatg cccgtaagtt ccctgacctg aataaagcag tcaaacgtga cccaaaaacc 480
aacaagcgca gtgccaccaa taactgggat ttctggacat tattgcctga agccttgcat 540
caggtgacca ttgtgatgtc ggatcgcggt attcctgctg gctaccgtca tatgcatggt 600
tttggcagcc ataccttcag ttttatcaat gcccaaaatg aacgcttctg ggtgaaattc 660
catatgcgta cccagcaagg catccagaac ctgaccgatg ctgaagcagc agacttgatt 720
gccaaagacc gtgaaagcag ccagaccgac ctgtttgatg ccatcgaacg tggcgactat 780
ccaaaatgga aaatgtacgt tcaagtcatg ccagaactgg aagccgaaac agtgccttat 840
catccatttg acctgaccaa agtctggccg aagggcgatt atccactgat tgaagtcggt 900
gaatttgagc tgaaccgcaa tccggaaaac tatttccagg atgtagaaca ggcagccttt 960
gcacctagta atcttgtacc gggcatcagc tactcaccgg accgtatgtt acaggcacgt 1020
ttagtgaact atgccgacgc agcgcgttac cgtgttggtg taaatcattc acaggttccg 1021
gtcaatgctg cacgctgccc tgtaaactct aatcgtcgtg atggtcaggg ccgcatggat 1081
ggcaactatg gttcattgcc acattatgaa ccgaacagtt ttaaccagtg gcaggaacaa 1141
cctcagttta aagaaccagc attaaagatt accggtgatg ctgatttctg ggacttccgc 1201
gaagatgaca atgactactt cagccagccc cgtgccctgt tcaatttgat gaatgatgag 1261
cagaaacaag cattgtttaa taacacggcc gcagcgatgg gtgatgcgct agatttcatc 1321
aaataccgtc atatccgcaa ctgttatgct tgcgatccag cttatgggca aggcgttgct 1381
aatgccttag gtatgactgt agcagatgct caagcggcac gtgaaacaga tcctgctaaa 1441
ggtttaccaa gttttcttta a 1501

Claims (1)

1.一种海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达，其特征在于该海洋过氧化氢酶的基因序列及氨基酸序列如基因序列表所示。
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