CN108265072A - 用于基因编辑的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于基因编辑的组合物及其应用，所述组合物包括基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。本发明通过对一株植物乳杆菌进行全基因组测序，发现其存在内源性II型CRISPR/Cas系统。经分子克隆，获得表达内源性Cas9蛋白的表达系统，在植物乳杆菌株中表达表现出蛋白质毒性，其产生了核酸切割活性，该Cas9蛋白(LpCas9)可在植物乳杆菌中的基因编辑中进行应用。通过构建含有表达Cas9蛋白的基因的载体，同时与诱导肽进行配合，可获得Cas9蛋白的表达，并且表现出基因编辑的活性。

Description

用于基因编辑的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体。

背景技术

自2013年，CRISPR/Cas系统已经成为最有效的基因编辑工具，已经在多种真核生物、原核生物成功应用。尤其是II型CRISPR/Cas系统，最先应用于基因编辑工作研究中。利用该系统能够高效、快速获得基因修饰产物，广泛用于细胞基因的敲除、基因突变模式生物的建立和原核细胞的敲除与插入领域。尽管该系统能够有效对真核生物进行编辑，但仍无法对所有原核生物实行有效的编辑。

目前只有链球菌、大肠杆菌和罗氏乳杆菌成功运用该系统进行基因敲除，只有在大肠杆菌开发出有效的基因敲入手段。然而，随着共生菌群、益生菌研究的深入，微生物发酵工业领域的蓬勃发展，越来越多的新型治疗制剂和工程菌株亟待开发，也对基因编辑工作提出了更高的要求，推动了原核生物基因编辑研究的发展。

目前，益生菌研究在我国蓬勃发展，应用于食品和医药领域，但相关菌株编辑研究仍开展缓慢。亟待研发处一种基于益生菌II型CRISPR/Cas系统的基因编辑工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于基因编辑的组合物及其应用，用以解决现有没有针对益生菌II型CRISPR/Cas系统对益生菌基因进行编辑的工具的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种用于基因编辑的组合物，所述组合物包括基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

本发明的一个实施例中，所述Cas9基因连接在pSIP411质粒形成的。

本发明的一个实施例中，所述Cas9基因的前可操作性的连接有启动子，所述启动子为PorfX启动子。

本发明的一个实施例中，还包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的诱导肽。

本发明的一个实施例中，所述诱导肽的浓度为40-60ng/mL。

所述的用于基因编辑的组合物在乳杆菌基因组编辑中的应用。

此外，本发明还提供一种基因编辑方法，所述方法为通过所述基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体与诱导肽共同作用，实现对目标基因的编辑。

本发明的一个实施例中，所述基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

本发明的一个实施例中，所述诱导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明具有如下优点：

本发明通过对一株植物乳杆菌进行全基因组测序，发现其存在内源性II型CRISPR/Cas系统。经分子克隆，获得表达内源性Cas9蛋白的表达系统，在植物乳杆菌株中表达表现出蛋白质毒性，其产生了核酸切割活性，该Cas9蛋白(LpCas9)可在植物乳杆菌中的基因编辑中进行应用。通过构建含有表达Cas9蛋白的基因的载体，同时与诱导肽进行配合，可获得Cas9蛋白的表达，并且表现出基因编辑的活性。

附图说明

图1为本发明的植物乳杆菌CGMCC 1.557分子鉴定图。

图2为本发明的植物乳杆菌CGMCC 1.557全基因组图。

图3为本发明的植物乳杆菌CRISPR/Cas系统位点示意图。

图4为本发明的PCR扩增LpCas9基因电泳图。

图5为本发明克隆PCR扩增电泳验证图。

图6为本发明的基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体质粒的示意图。

图7为本发明的基因编辑载体剪切基因的原理图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下面将更详细地描述本发明的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明用于基因编辑的组合物，其包括基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因，Cas9基因连接在pSIP411质粒形成的基因编辑载体，Cas9基因的前可操作性的连接有启动子，启动子为PorfX启动子。

本发明的用于基因编辑的组合物还包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的诱导肽，其中，诱导肽的使用浓度为40-60ng/mL。

下面通过具体的试验例对本发明的技术方案进一步说明：

本发明还提供一种基因编辑方法，该方法为通过基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体与诱导肽共同作用，实现对目标基因的编辑。其中，基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因，诱导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明选择CGMCC 1.557菌株进行培养培养，取出CGMCC 1.557保菌液，使用接种环蘸去少量菌液涂布于固体MRS培养基中，放入培养箱中；37℃厌氧环境培养24h；取出培养皿，用无菌枪头挑取单克隆菌落，转接新的MRS液体培养基，继续培养；每隔12h再次以1％体积转接，连续传代50次；再次涂布于固体培养基中，挑取单克隆用于实验或冷冻保藏。

CGMCC 1.557菌株菌种保藏，本发明使用含有30％甘油MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，保藏方法如下：121℃湿热灭菌保菌管和甘油15min，以备使用；每管分装300uL甘油，并将连续转接3次的菌液加入分装的甘油中；将菌液转移到保菌管中，混匀后低温保藏。

本发明的CGMCC 1.557菌株总DNA的提取，将单个菌落接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养至平台期，离心加入20ug/mL溶菌酶；37℃处理30min，除去溶菌酶，加入SDS，蛋白酶K等除去杂质蛋白，高盐环境下沉淀获得基因组DNA；利用苯酚：氯仿：异戊醇法进行抽提；乙酸盐沉淀法获得基因组DNA沉淀，放入70～75％乙醇洗涤一次，室温晾干；RTE中充分溶解。

本发明的细菌通用引物和特异性引物PCR扩增，以基因组DNA为模板，按照Taq预混液说明书进行PCR扩增；Tm值根据引物说明进行设定；如图1所示的分别以细菌通用引物20F/1500R以及植物乳杆菌特异性检测引物PCR产物的凝胶电泳示意图，完成后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；回收扩增产物进行连接，交付测序。

表一：细菌通用因为以及植物乳杆菌特异性引物

表一中：20F/1500R为16S rRNA检测引物，F1/R1为植物乳杆菌特异性检测引物。

本发明的CGMCC 1.557菌株全基因组测序，超声破碎基因组，构建文库；上机测序；去除接头序列，组装基因组序列；使用二代测序对三代测序进行矫正；如图2所示，本发明绘制CGMCC 1.557菌株全基因组完成图。

本发明的CGMCC 1.557菌株功能基因组及系统进化分析，NCBI数据库进行基因注释，如表二所示：

表二

CRISPRFinder预测CRISPR位点，根据CRISPR预测结果，本发明的一个CRISPR位点，长度630bp，保守的Direct Repeat序列为GTCTTGAATAGTAGTCATATCAAACAGGTTTAGAAC，共包括9个空隔(spacer)。根据这些重复序列的特点，对其之前的PAM部分进行了预测，在上游3-5位的核苷酸为GAA保守序列，该位点代表了植物乳杆菌来源的Cas9系统将这一保守序列作为PAM位点。

经搜索发现存在Cas及相关蛋白基因，经注释比对后，发现植物乳杆菌CGMCC1.557中的CRISPR/Cas系统为典型的二型CRISPR系统，只具有Cas9蛋白及Cas1/2，Csn2三个相关蛋白，仅有Cas9蛋白发挥酶切活性，该基因簇示意图如图3，表达Cas9蛋白的核苷酸序列标记为LpCas9基因，核苷酸序列如SEQ ID：1所示。

本发明的LpCas9基因表达载体构建，pSIP411质粒线性化，利用NEB NcoI/XhoI双酶切表达质粒pSIP411，经胶回收获得线性化质粒pSIP411；PCR扩增使用NEB High-Fidelity 2X Master Mix，SIP-LC9-F/R扩增LpCas9基因，成功扩增LpCas9基因，连接至线性化质粒pSIP411上，形成pSIP-LpCas9基因编辑载体，载体质粒pSIP411上带有启动子PorfX，pSIP411引物使用见下表三：

表三

转化后进行克隆PCR，使用4t-F/5'-LpC9-R和3'-LpC9-F/4t-R两对引物，配合rTaqMix验证LpCas9基因是否连接到SIP411载体上，如图5所示5个克隆的基因组PCR产物的凝胶电泳图，结果表明5个克隆均为阳性克隆。将回收的线性化pSIP411和LpCas9基因片段与Gibson Assembly Master Mix(2×)混合，配置成20ul的反应体系，50℃30min获得无缝克隆产物。

电转化将Gibson组装产物加入新鲜制备的NZ3900感受态细胞，冰上孵育20min，电击5ms，加入预热M17复苏培养基。

红霉素平板抗性筛选获得阳性克隆，扩增培养后，收集菌体，如图6所示，经溶菌酶处理后按照Axygen质粒提取说明书提取质粒pSIP-LpCas9的示意图。本发明的植物乳杆菌CGMCC 1.557诱导表达LpCas9蛋白，将复苏的植物乳杆菌CGMCC 1.557培养至平台期，以1％体积接种含有2％Gly的MRS培养基中，37℃培养至OD值为0.3～0.5，10,000×g/min离心10min，收集Gly刺激培养的培养物，弃上清，加入高压灭菌的洗液重悬菌体，离心弃上清，重复两次(共清洗三次)，再利用洗液重悬菌体，完成植物乳杆菌CGMCC 1.557感受态的制备，分装至各个小管，40或者80μL/管备用。

将质粒pSIP411和重组质粒pSIP-LpCas9加入制备的感受态中，冰浴20min，加入预冷的电转杯中，以1750kV电击5ms，迅速转移电击后菌体于37℃温育的无抗性MRS液体培养基中，37℃温箱中培养3h，离心收集细菌，全部涂布于红霉素抗性平板中，继续培养24-48h，观察阳性克隆转化子。挑取阳性克隆，进行克隆PCR。挑选鉴定阳性的克隆继续培养12～24h至平台期。

以1％接种量接种阳性植物乳杆菌CGMCC 1.557于红霉素抗性液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时加入诱导剂SppIP，其中诱导剂为诱导肽SppIP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：MAGNSSNFIHKIKQIFTHR，其浓度为50ng/mL，继续培养7～8h，获得表达重组蛋白的细菌。

或者以1％接种量接种阳性植物乳杆菌CGMCC 1.557于红霉素抗性液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时加入诱导剂SppIP，其中诱导剂为诱导肽SppIP，其氨基酸序列为MAGNSSNFIHKIKQIFTHR，浓度为40ng/mL，继续培养7～8h，获得表达重组蛋白的细菌。

或者以1％接种量接种阳性植物乳杆菌CGMCC 1.557于红霉素抗性液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时加入诱导剂SppIP，其中诱导剂为诱导肽SppIP，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:12所示MAGNSSNFIHKIKQIFTHR，浓度为60ng/mL，继续培养7～8h，获得表达重组蛋白的细菌。

GUS酶活力检测，收集菌体，洗涤液洗涤菌体两遍，最后用PBS重悬至OD＝0.2，取50uL菌液加入450uL GUS Buffer，再加入12.5uL0.1％SDS和25uL氯仿，37℃5min，再加入X-Gluc(终浓度0.1％)，37℃温育直至变色。

GUS酶活力检测发现SppIP诱导转入pSIP411的植物乳杆菌CGMCC1.557能有效表达GUS蛋白。如图7所示，本发明的基因编辑载体剪切基因的原理图，诱导表达LpCas9蛋白后，发现植物乳杆菌CGMCC 1.557细菌浓度与对照相比显著降低，LpCas9蛋白在植物乳杆菌CGMCC 1.557具有毒性作用，其毒性主要来自对于基因组的切割作用。本发明中的LpCas9蛋白能够实现在pSIP表达系统下的诱导表达，并且发挥切割作用，本发明pSIP-LpCas9载体可在植物乳杆菌中用于基因组编辑的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 用于基因编辑的组合物及其应用

<130> 20171206

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4077

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum;)

<400> 1

atgaaagaac catacggtgt aggcttggat attggtacga actcggttgg ctggacggtt 60

gtggatgcaa gtggtcatgt cagaaaaatt aaggggcaga ctgggattgg tgtacggtta 120

tttaaagaag gggcagccgc agcagaccgg cggggatttc gaacaacgcg tcgtcggttg 180

aaacgggtga aatggcggtt acgattacta cgcgaattct ttgaccaacc aatcagcaag 240

gtggatatca atttctttgc gcggcgcaaa tattcggata tttcacctcg tgatcctaat 300

tataacggtc ttgaaaaaac gttgtttaat gatcggagtg atcaggattt ctatcatgat 360

tatccaacga tttatcattt acgtgaggcg ctgatgactc agcaccgcaa gtttgatgtg 420

cgtgaaattt acctagcgat tcaccatatt gtcaaatatc gcggcaattt tttgcgtaat 480

gatgcagcga cagcgtatcg aagtgggaca cttgatttac agcagcactt tgaaactttg 540

aatcatttgt ttagtcaggc tgatctggag ctgaacttga acctgacaac cgatgtagcg 600

ttgcttgaca gcatcaaaca aacattggta cgaactgata tctcgcgtag tgaccgccaa 660

aaattaatta tgccactatt agcagtttta actggcgcga ctactgcgga aaagaagcgc 720

caaaaggcag tggtaacaga atttgcgaaa gccctcgttg gaaataaaac caagattgat 780

gtgctgactc taacggacat cgacgctact gaagcaaagg attgggcctt tagtttagag 840

gaaaatcaag acaaacttcc tggcattgaa gaccgtttta gcgaagtggg ccaacaaatt 900

attgatgagg taattcggtt atacgccagc gtcaaccttg cacagcttat tccagaaggt 960

aaacggttct cacagagtat ggttgagaag tataaacgcc atggcgaaga tttgaagtta 1020

ttgaaagcgt atattcgctc tcagtcagac gccaagcgcg ggcgggccat tcgggcaacc 1080

tacgatcaat atattgatgg tgtgaaaagt aaacaggtga cgcaagaagc gtttcaaaag 1140

gccttgggaa aatttgttga cgccgatgta gatttgaata gttgggcagc tcaaattaag 1200

caagctattg actctgaaca attcatgcct aaattacgga taaagcagaa tggagccatt 1260

ccttatcagg ttcaacaaaa tgagctagat caaattatta gtaatcagaa ggaatactac 1320

ccgtggttgg gtgaagaaaa tccggtcatc aagcgacgcg gtaagtttcc atacaaactt 1380

gatgagcttg tcggtttccg ggtgccttat tatgttggac cgctgattac taaagaaatg 1440

caggcagcaa ctgccaatgc aggttttgca tggatggtac gtaaggctga tgggccaatc 1500

acgccatgga attttgatga taaggtcgat cgggtggcct cggcgactgc tttcattcag 1560

cggatgcaga cgacggatac gtatttgatt ggtgaggaag tactacccgc acgaagcttg 1620

atttaccaac gctttatggt gctcaatgag ctgaataata ttcgagttga tgatgggcaa 1680

ttaacacccc ggcaaaaaca acgactatac aaccaagtgt ttaagaaaca caaacgagta 1740

acagctaaga atattcaaga caatttagtt gcagcgggag agtttcccac tgcgccacga 1800

attacggggc ttgcggatcc gaaagtattc aatagttcgt tatccacgta tcatgatttg 1860

aaacaggtgt tgcctgaagc tatgtcagac gtgcgtaagc aagctgatat tgaaaaaatc 1920

attttatggt caactatttt tgaagatagt acgattttta agcaaaaact gacagagatt 1980

tcctggctga cagcggccca acttaagcaa ctaggtcaat tacgatatcg tggctgggga 2040

caattatcac gaaaattatt aacaggtctc aaagatgata ataatcgttc aatcatggac 2100

ggcttgtggg agacaaacgc taatttcatg caattacgaa gccaacctgc cattgagaat 2160

caaattaaat cggcaaacca ggccaaccta acaacggcgg atcttcaaga taccatcaat 2220

gaattatata cgtcaccgca aaataagaag gctattcgcg aagtgatggt ggtgttagct 2280

gacattaaag atgcgatgca tggtcaaaca cctaactgga tatttgtgga agcggctcgt 2340

ggtggtggcg ttgctggtcg gcggacacaa tcacggtcaa aacaaattgt tgcagcctat 2400

cagggaacag ctcaggccat tgtcagtgat caagtccaac gtgaattaaa agagaaaatc 2460

aagaacaaag ctaatttcaa tacgcggctc gtactttatt tcctacaaaa tggccgcgat 2520

ttgtataccg gtgatgcgat taatatcgat cgattgtcag aatatgatat cgaccacatc 2580

ttgccacaat ctctggtgaa agatgactca ttagataatc gagtactgac aaatgcacga 2640

atcaatcgtg agaaaaatga tacgtttgct agtgaaaagt ttgggaaaaa gatgggtgct 2700

aagtggaaag agatgcaccg aatggggctg atgaccaaac ggaagcttga ccacttactg 2760

atgcgtcctg atgaaatcag caagtacgcg actggtttta ttaatcggca gttggttgag 2820

acacgtcagg ttatcaaact agttgaagag ctgattaatg cagaatatcc atccaccgct 2880

attgtgtcgg ttaaagcgaa cttgacacat caatttcgac aaacgtttga ttttccgaag 2940

attcgtgagg tcaatgacta ccatcatgca tttgacgcag ccttaactgc tttcattggc 3000

acctatttgt tgaagcgata tccgaagctg gaacgattct tcgtctacgg taagttcgct 3060

aaacagccgg ttaacctaac acgtttcaat gttatccgaa aactagctaa gactgatacc 3120

ccaattacgg atatcgatac tggtgaagtt ttgtgggata agttaaccga tattaaatat 3180

tttgagacgc tttatgatta caagcgatta ttggtgacgc gtgaggtatc cgaaaactat 3240

ggggcaatgt ttgatcaaac tctcttgaag gcaagtgata atggcaagcg attaattcgg 3300

aaaaaacaat ccttcgatac agctatttat ggtggttata cgggaaaaac gctggcttac 3360

atggctatcg tgaaagtatc gactaaaaag gatgtccagt accaagttgt aggtgtacct 3420

acaactatgg tgacacaaat tgagcagttg gaacaacaag gaatgacaaa caagcaagcg 3480

gtgacgaaag taattgaacc gctcattgct gccaacaaca agaagatgct gacgtatgaa 3540

gtgttattgc cgaaggtacg gtttgaacag gtggttcgag atagaattaa aggtcaaacg 3600

caccgcttcg cacttggtac tgatacgtat tatcacaaca ttcaagagct gtatttacca 3660

ttaactttac agcgcgcatt tttaggtaag cagaatgagt ctgaagtgca attaaatcag 3720

aatttactga ctgtttttga cgcaacgctt gcccaggtta accgatactt tccactttac 3780

gagatgaaca agttcaagaa gatacttaat tctgctcgtg atcagattga gctgctggaa 3840

gcgaaaaatc aatttgttaa gaataagctg gttttaggga agcaaggaat tttgaccaat 3900

atgtttattg gcttacatgc gaatgcctcg tatggtgatt taaaggtgct aggtgtgaaa 3960

acagattttg gtaagttaca ggttcctggt ggcattaagt taacgggtga cgctgaaatt 4020

atatatcaat caccaactgg tttgttcgag cgaaaaattt cattaaaaga tttatag 4077

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gccgcctaag gtgggacaga t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ttacctaacg gtaaatgcga 20

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tattacaagg agattttagc catgaaagaa ccatacggtg tag 43

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ccggggtacc gaattcctcg agggatgaca tctttttttc gc 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gcttcccaca cgcatttcag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cgctgtcgct gcatcattac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

cggtttgaac aggtggttcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

attctgctcc cgcccttatg 20

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ile His Lys Ile Lys Gln Ile Phe

1 5 10 15

Thr His Arg

Claims (9)

1.一种用于基因编辑的组合物，其特征在于，所述组合物包括基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

2.根据权利要求1所述的用于基因编辑的组合物，其特征在于，

所述Cas9基因连接在pSIP411质粒形成的。

3.根据权利要求1所述的用于基因编辑的组合物，其特征在于，

所述Cas9基因的前可操作性的连接有启动子，所述启动子为PorfX启动子。

4.根据权利要求1所述的用于基因编辑的组合物，其特征在于，还包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的诱导肽。

5.根据权利要求4所述的用于基因编辑的组合物，其特征在于，

所述诱导肽的浓度为40-60ng/mL。

6.权利要求1-5任一项所述的用于基因编辑的组合物在乳杆菌基因组编辑中的应用。

7.一种基因编辑方法，其特征在于，所述方法为通过所述基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体与诱导肽共同作用，实现对目标基因的编辑。

8.根据权利要求7所述的基因编辑方法，其特征在于，

所述基于植物乳杆菌CRISPR/Cas系统的基因编辑载体包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

9.根据权利要求7所述的基因编辑方法，其特征在于，

所述诱导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。