CN104212739B - 一种蜡样芽孢杆菌及其在制备亚硝酸盐还原酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜡样芽胞杆菌及其在制备亚硝酸盐还原酶中的应用，所述芽孢杆菌从豆瓣酱中分离，经鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01，已于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9360。菌株LJ01用于制备亚硝酸盐还原酶(NiR)，从蜡样芽胞杆菌LJ01提取的NiR的活力高，NiR降解亚硝酸盐的条件简单；本发明所公开的条件可使NiR的酶活损失少，得到的NiR纯度高，NiR为解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及利用来自传统豆瓣酱中的蜡样芽孢杆菌，及其在制备亚硝酸盐还原酶中的应用。
背景技术
亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染，肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，水产养殖水体亚硝酸盐超标导致潜在食品安全问题等一系列的问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的微生物外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，简称为NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是，目前对如何得到大量的食用安全的NiR还没有很好的方法。
NiR是一种胞内酶，在高等植物、藻类植物和许多微生物中广泛存在。这些胞内酶在细胞内能有效地发挥作用，但在细胞外效果较差。NiR是一种氧化还原酶，反应过程中需要电子传递体的参与，而且受氧气的抑制。硝酸盐还原和亚硝酸盐还原是自然界中无机氮转化为有机氮的极其重要的过程，由于NiR是生物体在厌氧环境中产生的胞内酶，所以其活性受环境条件的影响较大，如pH、温度、化学物质、光照等。
降解亚硝酸盐的方法主要有：(1)氧化法，亚硝酸根离子中的氮为中间价态，具有被氧化的特性，当介质中的NO2 -遇氧化剂时则会改变氮的价态，发生得失电子的变化而被氧化，最终NO2 -会被转变为毒性较小甚至无毒的物质，此法很少采用的主要原因是在这些强氧化剂在常规使用浓度下对亚硝酸盐减降解率低，此外氧化法降解亚硝酸盐还存在容易反弹的弱点；(2)还原法，利用NO2 -在酸性条件下具有氧化性而被还原的特点，将其还原降解为易挥发气体而自动溢出，常冬寅发现铸铁屑对NO2 -有一定的脱除效果(常冬寅，陈天虎，刘海波，等.氢气还原针铁矿去除水中的亚硝酸盐，硅酸盐学报，2012，40(8)：1197-1203)，且随铸铁屑量的增加，脱除效果增加，但是其降解率只能达到90％，不能完全将亚硝酸盐降解掉(尹伦甫，陈昌福.降解亚硝酸盐的方法与“调水降亚灵”的开发，五指峰科技专栏，2008，7：77)；(3)微生物降解法，采用具有降解亚硝酸盐活力的微生物来降解亚硝酸盐，主要有假单胞菌属[陈瑞芳，徐长安，刘丽梅，等.一株假单胞菌的亚硝酸盐降解特性及其对鱼池底泥的净化作用，研究报告，2011，35(6)：30-33]，芽孢杆菌属，乳杆菌[张馨月，刘冬梅，许喜林，等.LCR6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原的初步定位，现代食品科技，2013，11(29)：2627-2632]等，而在芽孢杆菌属中，最常见的是枯草芽孢杆菌[丁祥力，王震，陈薇，等.枯草芽孢杆菌WH-5的分离鉴定及净水研究，湖南农业科学，2011，(01)：15-19]，蜡样芽孢杆菌降亚硝酸盐未见报道。另外，在食品以及食品源头中进行降解亚硝酸盐，首先必须考虑是保证食用安全，但上述的氧化法中加强氧化剂、还原法中加铁屑、微生物降解中假单胞菌有一定毒性等必将影响食用安全，因此寻求一种食用安全、降解亚硝酸盐效果好的方法势在必行。
发明内容
本发明目的在于提供一种蜡样芽胞杆菌及其NiR生产方法和应用，利用传统豆瓣酱中的蜡样芽胞杆菌，通过培养制备粗酶液，进一步通过层析分离制备电泳纯NiR。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明从传统豆瓣酱中分离出一株芽孢杆菌，编号为LJ01，根据菌株的形态特征、生理生化和16S rDNA克隆分子鉴定的结果，确定LJ01菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01已于2014.6.19保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9360。
Bacillus cereus LJ01的16S rDNA测序用引物、反应试剂、测序仪、方法：引物为M13F(-47)为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO.2)；M13R(-48)为AGCGGATAACAATTTCACACAGGA(SEQ ID NO.3)；反应试剂： Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)；测序仪：ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer；克隆所用试剂及耗材：感受态细胞E.coli DH5α，pMD18-T(TaKaRa公司，如图1)，氨苄青霉素；克隆测序方法：(1)PCR扩增，以菌株LJ01的DNA为模板，以M13F(-47)和M13R(-48)引物在一定条件下扩增；(2)样品鉴定，利用琼脂糖电泳鉴定PCR产物的特异性；(3)割胶回收纯化目的PCR产物；(4)将经纯化的PCR产物装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞E.coli DH5α；(5)测序验证重组克隆中PCR产物的序列信息。重组克隆条件：氨苄青霉素抗性；质粒DNA体积：10μl～20μl；含质粒的菌液体积：200μl～300μl；储存条件：-20℃。根据16SrDNA测序的结果(如附16SrDNA的核苷酸序列SEQ ID NO.1)，绘制如图3的进化树，菌株LJ01与蜡样芽胞杆菌的同源性高达100％。
Bacillus cereus LJ01(CGMCC NO.9360)菌株具有如下特征，(1)形态特征：革兰氏阳性，杆状，菌体单个，成对排列，有芽孢(如图2)，菌落表面干燥不透明，边缘不整齐，呈蜡状；液体培养基中呈沉淀性混浊。(2)生理生化特征：接触酶阳性，氧化酶阴性，液化明胶，还原硝酸盐，淀粉水解阳性，苯丙氨酸脱氨酶阴性，能耐2％～10％的NaCl，柠檬酸盐利用阴性，卵凝脂酶阳性，吲哚试验阴性，脲酶试验阴性，酪素水解阴性，酪氨酸水解阴性，V-P试验阳性，革兰氏染色为阳性菌，兼性厌氧菌，不可利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄糖产气，可以利用D-葡萄糖，能运动，能在30℃、40℃温度下生长，在50℃温度不生长。
根据LJ01保守序列16S rDNA的信息、形态特征和生理生化特征，鉴定LJ01菌株为蜡样芽胞杆菌。
上述蜡样芽孢杆菌在制备亚硝酸盐还原酶中的应用。具体包括如下步骤：
(1)将处于对数期生长的蜡样芽孢杆菌LJ01的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，接种量为1％～5％(体积百分比)，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心得菌泥，用无菌水清洗后离心，得菌体并称重；所述的发酵诱导培养基为含50mg/mL～100mg/mL亚硝酸钠的肉汤培养基，pH7.0～7.6；
(2)加入提酶缓冲液，使LJ01菌体浓度为100mg/mL～500mg/mL，加入溶菌酶，混匀后进行LJ01菌体破壁(2h～5h)，破壁后的菌液经离心后的上清液即为亚硝酸盐还原酶粗酶液。
步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，150r/min～250r/min摇床培养，发酵时间为18h～30h。优选地，所述发酵培养条件为30℃，180r/min摇床培养，发酵时间24h。
步骤(2)所述溶菌酶的浓度为5mg/mL～20mg/mL。
所述提酶缓冲液中含有1μg/mL～3μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL的二硫苏糖醇(DTT)。
所述亚硝酸盐还原酶粗酶液还经过如下分离纯化步骤：所述粗酶液经过DEAESepharose Fast Flow(高流速离子型琼脂糖凝胶)阴离子交换层析柱和Sephadex G-150(葡聚糖凝胶)葡聚糖凝胶层析柱中的一种或两种层析，制得纯亚硝酸盐还原酶。
其中，阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～500mM的NaCl的HEPES缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶的组分，并用聚乙二醇20000浓缩；
葡聚糖凝胶层析是经阴离子交换层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱上，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶酶活的组分。
所述HEPES缓冲液(无NaCl和含NaCl)的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.6；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.8～8.6；
所述阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明中使用的蜡样芽孢杆菌LJ01是发明人从豆瓣酱中筛选得到的，并进行了急性毒理实验证明是食用安全的，其发酵产酶稳定，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有良好的商业前景。
(2)利用本发明方法的培养蜡样芽孢杆菌LJ01，得到的亚硝酸盐酶活力高，例如以亚硝酸钠为底物测定粗酶液的酶活，其最大酶活达到227.93U，最大降解亚硝酸盐的量为250μg/mL。
(3)所制备的NiR活力高，NiR降解亚硝酸盐的条件简单，最适酶催化温度为37℃，最适pH为7.4，在30℃～40℃内具有稳定的酶活。本发明所公开的条件可使NiR的酶活损失少，得到的NiR纯度高，NiR为解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题提供了一种新方法。
附图说明
图1为用于蜡样芽孢杆菌LJ01的16S rDNA克隆测序的质粒pMD18-T图谱。
图2为本发明所得蜡样芽孢杆菌LJ 01的显微镜观察图(10×100倍放大)。
图3为本发明实施所得蜡样芽孢杆菌LJ01的16S rDNA基因进化树。
图4为蜡样芽孢杆菌LJ01粗酶液用阴离子交换层析柱(DEAE Sepharose FastFlow)分离后的蛋白质曲线图(其中第3个峰有NiR活性)。
图5为蜡样芽孢杆菌LJ01粗酶液经阴离子柱分离后第3个峰的蛋白质用葡聚糖凝胶层析柱(Sepharose G-150)分离后的蛋白质曲线图(其中第2个峰有NiR活性)。
图6是本发明经分离后酶液的SDS-PAGE凝胶电泳图(分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4％，从左至右各条泳道分别为标记蛋白、粗酶液、经阴离子柱分离后酶液、经葡聚糖凝胶柱分离后19管、18管酶液)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
从LJ01试管斜面上挑取一环菌体至含100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于30℃和180r/min的恒温摇床上培养24h后，为LJ01种子液。所述种子培养基组成为：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，NaCl5g，蒸馏水1L，最终pH7.4±0.2。
配制含50mg/mL～100mg/mL亚硝酸钠，调节其pH为7.4的发酵诱导培养基，于121℃下灭菌冷却后，按1％～5％(体积百分比)接种量接入LJ01种子液，于30℃～40℃和150r/min～250r/min下培养18h～30h后，得发酵液于4℃和9000r/min下离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液，使LJ01菌体浓度为100mg/mL～500mg/mL，加入溶菌酶并使其浓度为5mg/mL～20mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁2h～5h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，测定其亚硝酸盐酶的酶活。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.0～7.6的20mM～100mM的HEPES缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含50mM～500mM的NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，合并具有NiR组分，并用聚乙二醇20000浓缩，备用。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH7.8～8.6的20mM～100mM的Tris-HCl缓冲液平衡的葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的NiR酶活，合并具有NiR酶活的组分，备用。
以亚硝酸钠为底物，采用分光光度法测定各步骤得到的酶液的NiR酶活。具体测定和计算方法如下：称取5mg亚硝酸钠溶于1L蒸馏水中得到浓度为5μg/L的亚硝酸盐溶液；分别吸取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL的5μg/L亚硝酸盐溶液于25mL容量管中，加蒸馏水定容至20mL，再分别加入2mL的0.4％对氨基苯磺酸，摇匀，静置3min～5min，最后加入1mL的0.2％盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容25mL，摇匀，静置15min，用分光光度计测定前述的反应液在538nm的吸光度，以亚硝酸盐浓度为横坐标，以测的的吸光度为纵坐标，制订亚硝酸盐-吸光度的标准曲线和方法；取1mL待测样品加入到25mL容量瓶，加蒸馏水定容至20mL，再分别加入2mL的0.4％对氨基苯磺酸，摇匀，静置3min～5min，最后加入1mL的0.2％盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容25mL，摇匀，静置15min，用分光光度计测定其在538nm的吸光度，该吸光度代入标准曲线方程后，可计算出待测样品中的亚硝酸盐含量，单位为μg/L。
NiR反应体系(总体积为500μL)：在300μL的pH7.4的50mM的HEPES缓冲溶液为反应液中，加入100μL的500μg/mL亚硝酸盐(使亚硝酸盐浓度为100μg/mL)，再加入100μL酶液，于30℃～37℃下静置反应16h～24h后，灭酶，最后测定反应体系中亚硝酸盐含量。
NiR的酶活单位：在反应体系每小时每毫克蛋白质降解亚硝酸钠的纳克(ng)数为一个酶活单位(U)。酶活计算公式如下：Activity(U)＝m/(M×t)，其中m为降解的亚硝酸钠的质量，单位为ng；M为反应物中酶蛋白质的质量，单位为mg；t为反应时间，单位为min。
实施例2
蜡样芽孢杆菌生产制备NiR的方法
将含100mg/mL亚硝酸钠、pH为7.4的发酵诱导培养基(肉汤培养基)，于121℃下灭菌冷却后，按2％(体积百分比)接种量接入LJ01种子液，于30℃和250r/min下培养24h后，得发酵液于4℃和9000r/min离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液(含有3μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和0.5μmol/mL的DTT)，使LJ01菌体浓度为200mg/mL，加入溶菌酶，使溶菌酶浓度为20mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁3h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，其NiR酶活为227.93U。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.4的50mM的HEPES缓冲液平衡好的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～200mM的NaCl的HEPES缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、100mM、200mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰(图4)，在测定酶活时发现在测定酶活时发现第3个峰具有NiR活性，合并具有NiR活性的组分，并用聚乙二醇20000浓缩，其NiR酶活为2540.67U。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH8.0的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G-150葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现3个不同的蛋白质峰(图5)，在对各个洗脱峰进行活性测定时，分部收集并合并具有NiR活性的组分，其NiR酶活为4004.89U。
以上阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析等步骤中，NiR的纯化倍数和得率如下表1所示。各步骤分离后获得的NiR的SDS-PAGE电泳图如图6所示，经葡聚糖凝胶层析收集的NiR经SDS-PAGE电泳后可以看到较明显的条带，经过葡聚糖凝胶过滤后的目的蛋白条带含量很少，因此跑出来的条带颜色很浅，NiR的分子量最可能为60KDa，与文献(Javier Vigara,María I,García-Sánchez,et al.Purification and characterization of ferredoxin-nitrite reductase from the eukaryotic microalga Monoraphidium braunii.PlantPhysiology and Biochemistry,2002(40):401-405)的粒藻中含铁氧还原蛋白的亚硝酸盐还原酶(其分子量为63KDa)接近，说明本发明的NiR种类可能与粒藻中的NiR种类相同，这种差异与NiR的亚基结构有关。
表1蜡样芽孢杆菌LJ01的NiR纯化
备注：No.1、No.2、No.3的酶样品分别为NiR粗酶、阴离子柱纯化后NiR、葡聚糖凝胶纯化后NiR。
实施例3
配制含75mg/mL亚硝酸钠，调节pH为7.4的发酵诱导培养基，于121℃下灭菌冷却后，按3％(体积百分比)接种量接入种子液，于35℃和180r/min下培养20h后，得发酵液于4℃和9000r/min离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液(含有1μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和2μmol/mL的DTT)，使LJ01菌体浓度为300mg/mL，加入溶菌酶，使溶菌酶浓度为5mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁4h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，其NiR酶活为195.64U。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.2的35mM的HEPES缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～150mM的NaCl的HEPES缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、50mM、150mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定酶活时发现在测定酶活时发现第3个峰具有NiR活性，合并具有NiR活性的组分，并用聚乙二醇20000浓缩，其NiR酶活为2276.43U。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH8.6的75mM的Tris-HCl缓冲液平衡的葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现3个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行活性测定时，分部收集并合并具有NiR活性的组分，其NiR酶活为3621.59U。
实施例4
配制含90mg/mL亚硝酸钠，调节pH为7.4的发酵诱导培养基，于121℃下灭菌冷却后，按1％(体积百分比)接种量接入种子液，于40℃和220r/min下培养18h后，得发酵液于4℃和9000r/min离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液(含有2μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1μmol/mL的DTT)，使LJ01菌体浓度为500mg/mL，加入溶菌酶，使溶菌酶浓度为15mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁5h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，其NiR酶活为205.73U。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.4的75mM的HEPES缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～250mM的NaCl的HEPES缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、150mM、250mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定酶活时发现在测定酶活时发现第3个峰具有NiR活性，合并具有NiR活性的组分，并用聚乙二醇20000浓缩，其NiR酶活为2483.98U。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH8.4的100mM的Tris-HCl缓冲液平衡的葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现3个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行活性测定时，分部收集并合并具有NiR活性的组分，其NiR酶活为3892.15U。
实施例5
配制含60mg/mL亚硝酸钠，调节pH为7.4的发酵诱导培养基，于121℃下灭菌冷却后，按1％(体积百分比)接种量接入种子液，于37℃和180r/min下培养20h后，得发酵液于4℃和9000r/min下离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液(含有2.5μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1.5μmol/mL的DTT)，使LJ01菌体浓度为400mg/mL，加入溶菌酶，使溶菌酶浓度为5mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁2h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，其NiR酶活为177.23U。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.6的100mM的HEPES缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～350mM的NaCl的HEPES缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、250mM、350mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定酶活时发现在测定酶活时发现第3个峰具有NiR活性，合并具有NiR活性的组分，并用聚乙二醇20000浓缩，其NiR酶活为1926.41U。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH7.8的20mMTris-HCl缓冲液平衡的葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现3个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行活性测定时，分部收集并合并具有NiR活性的组分，其NiR酶活为3067.99U。
实施例6
配制含50mg/mL亚硝酸钠，调节pH为7.4的发酵诱导培养基，于121℃下灭菌冷却后，按5％(体积百分比)接种量接入种子液，于37℃和150r/min下培养18h后，得发酵液于4℃和9000r/min下离心10min后，除上清液，菌泥用无菌水洗后在4℃和9000r/min下离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得菌体并称重，加入提酶缓冲液(含有1.5μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和2.0μmol/mL的DTT)，使LJ01菌体浓度为100mg/mL，加入溶菌酶，使溶菌酶浓度为20mg/mL，混匀后于30℃和180r/min下进行LJ01菌体破壁2.5h，然后在4℃用8000r/min离心20min，离心后的上清液为NiR粗酶液，其NiR酶活为147.63U。
将NiR粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.0的20mM的HEPES缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～500mM的NaCl的HEPES缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、350mM、500mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定酶活时发现在测定酶活时发现第3个峰具有NiR活性，合并具有NiR活性的组分，并用聚乙二醇20000浓缩，其NiR酶活为1845.38U。
经阴离子交换层析后所得的NiR组分上样至预先用pH7.6的35mM的Tris-HCl缓冲液平衡的葡聚糖凝胶层析柱上，用相同的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现3个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行活性测定时，分部收集并合并具有NiR活性的组分，其NiR酶活为2965.78U。
Claims (10)
1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01，已于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9360。
2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌在制备亚硝酸盐还原酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将处于对数期生长的蜡样芽孢杆菌LJ 01的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，接种量为1％～5％体积百分比，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心得菌泥，用无菌水清洗后离心，得菌体并称重；
(2)加入提酶缓冲液，使LJ 01菌体浓度为100mg/mL～500mg/mL，加入溶菌酶，混匀后进行LJ 01菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液即为亚硝酸盐还原酶粗酶液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，150r/min～250r/min摇床培养，发酵时间为18h～30h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述溶菌酶的浓度为5mg/mL～20mg/mL。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述的提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL～3μg/mL和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL。
7.根据权利要求3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶粗酶液还经过如下分离纯化步骤：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose FastFlow阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶Sephadex G-150层析柱中的一种或两种层析，制得纯亚硝酸盐还原酶。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～500mM的NaCl的HEPES缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶的组分，并用聚乙二醇20000浓缩；
葡聚糖凝胶层析是经阴离子交换层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱上，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶酶活的组分。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述HEPES缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.6；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.8～8.6；
所述阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发酵诱导培养基为含50mg/mL～100mg/mL亚硝酸钠的肉汤培养基，pH 7.0～7.6。
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