CN101914505A - 一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法。本发明提供的生产亚硝酸还原酶的方法，包括如下步骤：发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627，得到亚硝酸还原酶。所述发酵中包括添加连二亚硫酸钠的步骤。所述添加连二亚硫酸钠的时机为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627接种在所述发酵中使用的发酵培养基中时计起，培养8h-18h后，添加所述连二亚硫酸钠。本发明的实验证明，利用本发明的方法发酵巨大芽孢杆菌(B.megateriumMPF-906)获得高酶活总体得率的亚硝酸还原酶。

Description

一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法。
背景技术
由于环境中硝酸盐、亚硝酸盐的大量富集及食品加工中添加化学合成的亚硝酸盐，使农产品原料、水源、加工食品及饲料中有大量亚硝酸盐残留。亚硝酸盐是一种对人体有害的物质，它不仅使人直接中毒、致死，而且是致癌物亚硝胺的前体。如何安全、快速地降解亚硝酸盐成为保护人体健康急需解决的问题。现在世界各国都在致力于亚硝酸盐替代物以及降低其残留研究。但是至今还未找到一种理想的、能够完全替代亚硝酸盐的物质，世界各国现在都在致力于研究减少肉制品中亚硝酸盐残留量的措施。利用微生物发酵产生的亚硝酸还原酶，可以很好的降解亚硝酸盐，减少其残留，在肉制品加工有很广泛的应用前景。
传统研究认为，进行亚硝酸盐降解成NO的细菌都是兼性厌氧微生物，因为只有在无氧条件下，才能诱导出NiR。然而，近几年人们不断地发现好氧条件下发生也会发生亚硝酸盐的降解，如Giovanni Vigliotta等研究发现一种酵母Debaryomyceshansenii TOB-Y7能够在纯化学合成培养基中、在微需氧条件下利用亚硝酸盐作为唯一氮源，降解亚硝酸盐的能力伴随YNI1基因的表达，该基因为编码同化NAD(P)H：NiR，电子传递体的添加有助于NiR的产生。由于好氧条件下微生物体内同时存在呼吸链和亚硝酸盐还原双重的电子传递系统，目前外界环境的变化对NiR的生产及电子传递的影响还不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产亚硝酸还原酶的方法。
本发明提供的发酵生产亚硝酸还原酶的方法，包括如下步骤：发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627，得到亚硝酸还原酶。
所述发酵中包括添加连二亚硫酸钠的步骤。
所述添加连二亚硫酸钠的时机为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在所述发酵中使用的发酵培养基中时计起，培养8h-18h后，添加所述连二亚硫酸钠；具体为培养8h、9h、12h、14h、16h或18h后，添加所述连二亚硫酸钠；所述添加连二亚硫酸钠的量为：每1L所述发酵培养基中加入(0.005-0.05)mol所述连二亚硫酸钠，具体为0.005mol、0.01mol、0.02mol或0.05mol。
所述发酵的方式为以下A或B：
A：1)从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627接种在所述发酵培养基中时计起，先持续振荡培养(14-18)h，具体为14h、16h或18h；
2)在步骤1的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(2-6)h，具体为2h、4h或6h；
B：1)从所述将巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养8-12h，具体为8h、9h或12h，再持续振荡培养(2-8)h，具体为2h、6h或8h；
2)在步骤1)的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(4-6)h，具体为4h、5h或6h。
所述发酵的方式还可以为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h，再持续振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h。
所述间隔性振荡培养的方式为：振荡培养，且每隔(1-4)h静置(5-15)min，具体为每隔1h、2h、3h或4h静置5min、10min或15min；
所述持续振荡培养中和所述间隔性振荡培养中的振荡的速度均为160r/min，旋转半径为12mm；
所述间隔性振荡培养和所述持续振荡培养的温度均为30℃。
所述发酵培养基为将15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、1.5g蛋白胨、1.35g磷酸氢二钾、0.7g磷酸二氢钾、1g氯化钠、0.138g亚硝酸钠、0.1g MgSO4·7H2O、0.01g MnSO4·H2O和0.02g CaCl2·2H2O溶于水中，用水补至1L；
所述发酵培养基的pH值为7.0。
所述方法中，在所述发酵后，收集菌体，超声破碎所述菌体，收集上清液得到亚硝酸还原酶。
所述超声的功率为200w；所述超声的次数为90次；所述超声的方式为：间歇10s，超声5s。
本发明的实验证明，利用本发明的方法发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627获得高酶活总体得率的亚硝酸还原酶。该方法是通过向发酵培养基中添加电子供体及厌氧发酵(间隔性振荡培养)和好氧发酵(持续振荡培养)交替进行等发酵条件的选择与控制着手，获得了高酶活总体得率的亚硝酸还原酶制备方法，为利用生物技术降解食品中的亚硝酸盐打下了基础。
本发明的有益效果为：
1.应用本发明提供的通过在发酵过程中添加电子供体及周期性间歇厌氧发酵(间隔性振荡培养)而制备亚硝酸还原酶的方法，发酵最终单位发酵醪产酶能力得到了显著提高。
2.由于本发明所用菌种产生的亚硝酸还原酶具有耐高温特性，在70-80℃下仍保留很高的酶活。因此有可能将其用于肉类产品加工，极大的降低了亚硝酸盐的残留量，保证了肉制品的食用安全，也将促进肉类制品加工企业提高质量，具有重要的社会效益。本发明用普通的微生物培养手段生产酶，方法简便，生产周期短(20-36h)。同时用来减少亚硝酸盐对人体的危害，维护公共食品安全，保证了人民的身体健康，具有重要的社会效益。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、添加电子供体连二亚硫酸钠生产亚硝酸还原酶
方法一
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备
(1)、斜面种子培养基配方：营养肉汤粉1.8％，琼脂2％，亚硝酸钠0.0138％，pH7.0。
(2)、液体种子培养基配方：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，MgSO4·7H2O浓度为0.01％、MnSO4·H2O浓度为0.001％、CaCl2·2H2O浓度为0.002％，pH7.0。
(3)、发酵培养基：将15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、1.5g蛋白胨、1.35g磷酸氢二钾、0.7g磷酸二氢钾、1g氯化钠、0.138g亚硝酸钠、0.1g MgSO4·7H2O、0.01g MnSO4·H2O和0.02g CaCl2·2H2O溶于水，用水补至1升，pH7.0。
2、种子培养：将保存于沙土管中的巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627(本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号CGMCC No.1627，可商购获得。活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。专利公开号为CN101050433。)接种到斜面培养基上，30℃培养24h，获得活化菌种；再将该活化菌种接种于种子培养基中，30℃培养20h，获得种子培养液。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V∶V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃、转速160r/min(飞鸽牌高速冷冻离心机，型号GL-20B；旋转半径12mm)下持续振荡培养16h后，添加电子供体连二亚硫酸钠再持续振荡培养4h，所述连二亚硫酸钠的添加量为在所述1升发酵培养基中添加0.02mol连二亚硫酸钠，获得发酵醪，将发酵容器中所有的产物记作发酵醪。
4、发酵醪中的菌体细胞收集，将上述发酵醪在4℃冷冻离心15min(26000×g)，沉淀菌体用磷酸缓冲液(pH6.5)重新悬浮，然后再次离心得到菌体。
5、将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL发酵醪的菌体细胞加100mL 50mM磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5)，超声波破碎，超声波条件为200w，超声5s，间歇10s，90次。4℃冷冻离心15min(26000×g)，上清液即为(亚硝酸还原酶)的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
用比浊法测定发酵结束后巨大芽孢杆菌的生物量，巨大芽孢杆菌在发酵培养基中发酵后的菌体生物量为6.07×106个/ml。
所述亚硝酸盐还原酶活性的测定：
(1)亚硝酸盐标准曲线的建立
按照GB/T 5009.33-2003测定。用北京普析仪器厂生产的UV-1900型号双光束紫外分光光度计测定。以亚硝酸盐的浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(2)亚硝酸盐还原酶活性的测定
参照Rosa(Rosa M，et al，2001)的方法，构建亚硝酸盐还原酶的活性测定方法。测定酶活反应体系共250μL∶0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，0.1M NaCl，0.1M NO2-，0.1M MV(甲基紫晶)，0.1M Na2S2O4，以及一定量酶液。20-36℃水浴中反应10min，剧烈振荡终止反应。取10μL加格利斯试剂显色，在480-620nm比色法测定亚硝酸盐的变化。
根据标准曲线，可以得出亚硝酸还原酶的酶活。
酶活定义：每分钟所还原1nmoL亚硝酸盐所需要的酶量定义为一个酶活力单位。酶活单位：U/mL发酵醪。
测定菌体生物量及粗酶液亚硝酸还原酶的酶活。对照组：除了不添加连二亚硫酸钠外，其余条件均与实验组相同。方法一获得的酶得率为144.8U的酶/ml发酵醪，对照组获得的酶得率为1.02U的酶/ml发酵醪，计算，与对照组相比，得用本实施例的方法一发酵最终单位发酵醪产酶能力(酶得率)提高了142倍。
方法二、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与方法一相同。
2、种子培养：与方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃、转速160r/min下持续振荡培养14h后，添加电子供体连二亚硫酸钠再持续振荡培养6h，连二亚硫酸钠的添加量为0.005mol/L，获得发酵醪，将发酵容器中所有的产物记作发酵醪。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与方法一相同。
5、超声破碎：与方法一相同。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与方法一相同，结果与方法一的结果无显著差别。
方法三、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与方法一相同
2、种子培养：与方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃、转速240r/min下持续振荡培养18h后，添加电子供体连二亚硫酸钠再持续振荡培养2h，连二亚硫酸钠的添加量为0.05mol/L，获得发酵醪。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与方法一相同。
5、超声破碎：与方法一相同。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与方法一相同，结果与方法一的结果无显著差别。
实施例2、周期性间歇性厌氧发酵(间歇性振荡培养)生产亚硝酸还原酶
方法一、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃先进行间隔性振荡培养8h，再进行持续振荡培养12h，获得发酵醪；所述间歇性培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔3h从摇床上拿下摇瓶静置15min；所述持续振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同。
对照组：除了一直持续振荡培养外，其余条件均与实验组相同。方法一获得的酶得率为2.19U的酶/ml发酵醪，对照组获得的酶得率为1.5U的酶/ml发酵醪，计算，与对照组相比，得用本实施例的方法一发酵最终单位发酵醪产酶的酶活提高了46％。
方法二、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃先进行间隔性振荡培养10h，再进行持续振荡培养10h，获得发酵醪；所述间隔性振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔1h从摇床上拿下摇瓶静置5min；所述持续振荡培养的方式为在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同。
测定结果与本实施例的方法一的结果无显著差别。
方法三、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，在30℃先进行间隔性振荡培养12h，再进行持续振荡培养8h，获得发酵醪；所述间隔性振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔2h从摇床上拿下摇瓶静置10min；所述持续振荡培养的方式为在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同。
测定结果与本实施例的方法一的结果无显著差别。
实施例3、添加电子供体连二亚硫酸钠并进行周期性间歇厌氧发酵(间隔性振荡培养)生产亚硝酸还原酶
方法一、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，发酵步骤如下：
1)在30℃先进行间隔性振荡培养8h，再进行持续振荡培养8h，
2)在步骤1)的基础上添加电子供体连二亚硫酸钠再持续振荡培养4h，连二亚硫酸钠的添加量为0.02mol/L发酵培养基，获得发酵醪。
所述间隔性振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔1h从摇床上拿下摇瓶静置5min；所述持续振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同，结果与实施例1的方法一的结果无显著差别。
方法二、
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，发酵步骤如下：
1)在30℃先进行间隔性振荡培养9h，再进行持续振荡培养6h，
2)在步骤1)的基础上添加电子供体连二亚硫酸钠再培养5h，连二亚硫酸钠的添加量为0.005mol/L发酵培养基，获得发酵醪。
所述间隔性振荡培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔3h从摇床上拿下摇瓶静置10min；所述持续振荡培养的方式为在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同，结果与实施例1的方法一的结果无显著差别。
方法三
一、生产亚硝酸还原酶
1、培养基制备：与实施例一的方法一相同。
2、种子培养：与实施例一的方法一相同。
3、将种子培养液以4％(体积百分含量(V/V))的接种量转接到250mL液体发酵培养基中得到发酵混合物，将发酵混合物按每个摇瓶100mL分装，初始pH为7.0，发酵步骤如下：
1)在30℃先进行间隔性振荡培养12h，再进行持续振荡培养2h，
2)在步骤1)的基础上添加电子供体连二亚硫酸钠再培养6h，连二亚硫酸钠的添加量为0.05mol/L发酵培养基，获得发酵醪。
所述间歇性培养的方式为：在摇床上振荡培养，且每隔2h从摇床上拿下摇瓶静置15min；所述持续振荡培养的方式为在摇床上振荡培养；所述摇床转速为160r/min，旋转半径为12mm。
4、发酵醪中的菌体细胞收集：与实施例一的方法一相同。
5、超声破碎：与实施例一的方法一相同，获得亚硝酸还原酶的粗酶液。
二、测定菌体生物量及粗酶液中产亚硝酸还原酶的酶活
检测方法与实施例1的方法一相同，结果与实施例1的方法一的结果无显著差别。

Claims (9)

1.一种生产亚硝酸还原酶的方法，包括如下步骤：发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627，得到亚硝酸还原酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵中包括添加连二亚硫酸钠的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述添加连二亚硫酸钠的时机为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627接种在所述发酵中使用的发酵培养基中时计起，培养8h-18h后，添加所述连二亚硫酸钠；具体为培养8h、9h、12h、14h、16h或18h后，添加所述连二亚硫酸钠；所述添加连二亚硫酸钠的量为：每1L所述发酵培养基中加入(0.005-0.05)mol所述连二亚硫酸钠，具体为0.005mol、0.01mol、0.02mol或0.05mol。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的方式为以下A或B：
A：1)从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在所述发酵培养基中时计起，先持续振荡培养(14-18)h，具体为14h、16h或18h；
2)在步骤1的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(2-6)h，具体为2h、4h或6h；
B：1)从所述将巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养8-12h，具体为8h、9h或12h，再持续振荡培养(2-8)h，具体为2h、6h或8h；
2)在步骤1)的基础上添加所述连二亚硫酸钠，继续持续振荡培养(4-6)h，具体为4h、5h或6h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的方式为：从将所述巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627接种在发酵培养基中时计起，先间隔性振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h，再持续振荡培养(8-12)h，具体为8h、10h或12h。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述间隔性振荡培养的方式为：振荡培养，且每隔(1-4)h静置(5-15)min，具体为每隔1h、2h、3h或4h静置5min、10min或15min；
所述持续振荡培养中和所述间隔性振荡培养中的振荡的速度均为160r/min，旋转半径为12mm；
所述间隔性振荡培养和所述持续振荡培养的温度均为30℃。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为将15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、1.5g蛋白胨、1.35g磷酸氢二钾、0.7g磷酸二氢钾、1g氯化钠、0.138g亚硝酸钠、0.1g MgSO4·7H2O、0.01g MnSO4·H2O和0.02g CaCl2·2H2O溶于水中，用水补至1L；
所述发酵培养基的pH值为7.0。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述方法中，在所述发酵后，收集菌体，超声破碎所述菌体，收集上清液得到亚硝酸还原酶。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述超声的功率为200w；所述超声的次数为90次；所述超声的方式为：间歇10s，超声5s。
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