CN107189991A

CN107189991A - 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

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Publication number: CN107189991A
Application number: CN201710318030.0A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 罗会颖; 涂涛; 刘伟娜; 黄火清; 柏映国; 王苑; 苏小运; 王亚茹; 孟昆
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2037-05-08
Also published as: CN107189991B

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖氧化酶突变体GODB及其编码基因与应用。本发明提供的葡萄糖氧化酶GODB突变体以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作为母本，经点突变Glu82Cys而获得。本发明提供的突变酶酶活力由野生型的229.6U/mg提高到了352.1U/mg，提高幅度为53.3％；在60℃下的半衰期由野生型的51min提高到了119min，提高幅度为133％；因此，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体GODB能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

Description

一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和遗传工程领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)又称为β-d-葡萄糖氧化还原酶，EC号为1.1.3.4，能专一的作用于β-d-葡萄糖的羟基，使其脱氢被氧化为羧基或者醛基，生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。由于GOD具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功效，被广泛的应用于食品、医药、饲料、纺织等工业中。例如，在食品工业中，GOD有效去除葡萄糖可抑制食品发生褐变，而且产物过氧化氢是一种杀菌剂，可延长食品的货架期；在医药行业中，利用GOD的底物特异性，可应用于人体生化指标中葡萄糖的定量测定，操作简易、省时省力。在饲料行业中，GOD在反应过程中消耗了胃肠道中的氧气从而形成一个厌氧环境，在促进厌氧有益菌生长的同时抑制了好氧菌和不耐酸病原微生物的存活，从而有效提高动物免疫力；在纺织工业中，利用反应产物过氧化氢对纺织物进行漂白处理，可有效降低生产成本、提高纺织品的质量。

目前，工业化生产GOD的菌株主要来源于黑曲霉和青霉。相对而言，黑曲霉产的GOD热稳定性较好，而青霉产的GOD酶活较高。传统生产GOD的方法主要集中于利用紫外诱变或者化学诱变剂诱变的方法获得高产菌株，并对菌株培养的发酵条件进行优化以进一步提高菌株的产酶能力。但是，黑曲霉和青霉的发酵过程相对复杂、并伴随有产量较低、发酵产物不均一等特点，给后期加工工艺带来了困扰。因此，近些年研究者选择利用基因工程手段来改良和提高GOD的生产。目前已成功实现异源表达的系统有毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌及木霉等。尽管利用基因工程的手段实现了GOD的异源表达，由于表达量不高导致生产成本突出的问题仍然没有得到有效解决，阻碍了GOD的大规模工业化生产及应用。所以，利用蛋白质工程的手段对GOD进行分子改良以提高其催化性能是目前的主要研究思路。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白，以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作为母本，经点突变Glu82Cys，而获得的葡萄糖氧化酶GODB突变体，本发明所述蛋白是如下1)、2)、或3)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列中的第82位半胱氨酸保留不变且将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且酶活和热稳定性均较野生型酶增强了的由1)和/或2)衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由581个氨基酸残基组成。

上述1)、2)、或3)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组异源表达得到。上述1)、2)、或3)所述的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1所示DNA序列缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明的又一个目的是提供一种编码基因。

所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)编码上述蛋白的多核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1中第244-246位核苷酸序列一致且在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

6)与1)、2)、3)、4)或5)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1746个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1743位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：2所示的蛋白质，即本发明所述的GODB蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组菌的出发菌株包括大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、和/或乳酸杆菌。

所述酵母菌包括毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞、和/或多型逊酵母细胞。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对重组菌进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在宿主菌中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化菌株。

所述重组表达载体的出发载体具体为pPIC9；所述重组菌的出发菌株具体为GS115；

所述重组表达载体具体为pPIC9-GODB；所述重组菌具体为GS115/GODB。

扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，所述方法为1)或2)所述方法：

1)所述方法包括将野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列的第82位谷氨酸变为半胱氨酸；

2)所述方法包括将与野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列同源的氨基酸序列的第82位氨基酸变为半胱氨酸；

所述方法中，所述野生型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为将序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列的第82位半胱氨酸变为谷氨酸后的氨基酸序列；所述与野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列同源的氨基酸序列具体为与所述与野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列具有90％以上同源性，且功能相同的蛋白质的氨基酸序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

所述葡萄糖氧化酶突变体与所述野生型葡萄糖氧化酶相比，具有如下至少一种性状：1)葡萄糖氧化酶酶活性增强；2)葡萄糖氧化酶热稳定性增强。

本发明的还一个目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，所述方法包括：

1)制备上述所述的编码基因；

2)制备包含步骤1)所述编码基因的重组表达载体；

3)使步骤2)所述表达载体表达以获得目的蛋白葡萄糖氧化酶突变体。

具体的，上述所述的编码基因具有序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；再具体的，上述所述的编码基因具有的序列表中SEQ ID №：1第1-1743位的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供所述编码基因、所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、所述引物对、和/或所述制备方法在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)制备葡萄糖氧化酶和/或含有葡萄糖氧化酶相关产品；

2)制备葡萄糖氧化酶突变体和/或含有葡萄糖氧化酶突变体的相关产品；

3)制备酶活性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体和/或含有酶活性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体的相关产品；

4)制备热稳定性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体和/或含有热稳定性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体的相关产品。

本发明的再一个目的是提供所述的编码基因、所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、所述引物对、和/或所述制备方法在制备应用于包括食品、医药、动物饲料和/或纺织行业领域中的添加剂中的应用。

本发明的再一个目的是提供所述的蛋白、所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、和/或所述制备方法制备得到的葡萄糖氧化酶突变体在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)制备含有和/或本身直接作为葡萄糖氧化酶相关产品；

2)制备含有和/或本身直接作为葡萄糖氧化酶突变体相关产品；

3)制备含有和/或本身直接作为酶活性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体相关产品；

4)制备含有和/或本身直接作为热稳定性较野生型增强的葡萄糖氧化酶突变体相关产品。

本发明的再一个目的是提供所述的蛋白、所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、和/或所述制备方法制备得到的葡萄糖氧化酶突变体在制备应用于包括食品、医药、动物饲料和/或纺织行业领域中的添加剂中的应用。

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高酶活力与优热稳定性的、适合于在食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的葡萄糖氧化酶。本发明提供的突变酶酶活力由野生型的229.6U/mg提高到了352.1U/mg，提高幅度为53.3％；在60℃下的半衰期由野生型的51min提高到了119min，提高幅度为133％；因此，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体GODB能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为野生型GODA和突变体GODB的酶活性比较图。

图2为野生型GODA和突变体GODB在60℃下的稳定性。

图3为野生型GODA和突变体GODB在70℃下的稳定性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9(Invitrogen)为本实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin

MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin

BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、葡萄糖氧化酶编码基因的定点突变

对葡萄糖氧化酶GODA进行同源建模，并将突变位点设计为第82位谷氨酸突变为半胱氨酸。通过Over-lap PCR的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因GODB。Over-lap PCR所用引物如表1所示：

表1.突变体GODB特异性引物

测序结果表明，上述Over-lap PCR扩增得到的核酸片段为：5'端含有酶切位点EcoRI，3'端含有酶切位点Not I，中间为具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段。其中，具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的核酸片段共1746bp，其中编码区长1743bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID №：1中第1-1743位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸序列，共581个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的片段命名为突变体基因GODB；将具有序列表中SEQ ID №：2所示氨基酸序列的蛋白命名为葡萄糖氧化酶突变体GODB。

实施例2葡萄糖氧化酶突变体GODB的制备

(一)重组质粒pPIC9-GODB的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(Eco RI+Not I)；同时将上述实施例1制备得到的核酸片段进行双酶切(Eco RI+Not I)；将上述切好的两个核酸片段进行连接，获得含有所述突变体基因GODB的重组质粒。

将上述所得重组质粒送去测序，验证序列的正确性。将所得质粒中插入的外源基因的序列为SEQ ID №：1所示的核苷酸序列的重组质粒，命名为pPIC9-GODB。

(二)重组菌GS115/GODB的制备

将重组质粒pPIC9-GODB转化毕赤酵母GS115细胞，获得重组酵母菌株GS115/GODB。提取重组菌的质粒送去测序，将测序正确的含有质粒pPIC9-GODB的重组菌命名为GS115/GODB。

(三)葡萄糖氧化酶突变体GODB的制备

取上述重组酵母菌株GS115/GODB菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇体积浓度保持在0.5％(0.5ml甲醇/100ml培养基)，同时取上清回收和亲和层析纯化葡萄糖氧化酶突变体GODB，用于酶活性检测。

实施例3葡萄糖氧化酶突变体GODB和野生型的性质分析比较

(一)酶活分析比较

采用紫外分光光度计法对GOD酶活进行测定。具体方法如下：在给定条件下进行酶促反应，酶促反应体系为：200μL的反应体系，包括50μL适当的稀释酶液，20μL 10mM的ABTS溶液，20μL 50U/mL的HRP溶液，90μL磷酸氢二钠-柠檬酸Buffer，和20μL 1M的葡萄糖溶液。在420nm波长处测定3min内光密度随时间的增长曲线，每隔30s记录一次，根据直线的斜率求得酶活力。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，单位时间内生成1μmol的氧化型ABTS所需的酶量。

将上述实施例2制备的葡萄糖氧化酶突变体GODB纯化后，与野生型葡萄糖氧化酶在pH6.5、30℃下进行酶促反应以测定其酶活性。

酶活测定结果如图1所示，野生型的酶GODA活力为229.6U/mg，葡萄糖氧化酶突变体GODB的酶活力为352.1U/mg，较野生酶提高了53.3％。

(二)热稳定性分析比较

将上述实施例2制备的葡萄糖氧化酶突变体GODB纯化后，与野生型葡萄糖氧化酶一同，测定在60℃或70℃下的热稳定性，测定方法如下:

所述突变体和野生型的热稳定性测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.5)缓冲液体系不同温度(60℃或70℃)下处理不同时间(60℃下分别处理2、5、10、20、30、60、90和120min；70℃下分别处理2、5、10、15和20min)，再在30℃下进行剩余酶活性测定。

如图2所示，野生型GODA在60℃下处理120min之后，酶活降到了91.4U/mg，剩余酶活相当于处理前的33.2％；而突变体GODB在60℃下处理120min之后，剩余酶活力为174.8U/mg，较野生型提高0.91倍。经过计算，野生型在60℃下的半衰期为51min，突变体在60℃下的半衰期为119min，提高幅度为133％。

如图3所示，野生型GODA在70℃下处理5min之后，酶活降到了80.0U/mg，剩余酶活相当于处理前的28.5％；而突变体GODB在70℃下处理5min之后，剩余酶活力为146.7U/mg，较野生型提高0.83倍。

Claims

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白为如下1)、2)、或3)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID№.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID№.2的氨基酸残基序列中的第82位半胱氨酸保留不变且将序列表中的SEQ ID№.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID№.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且酶活和热稳定性均较野生型酶增强了的由1)和/或2)衍生的蛋白质。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)编码权利要求1所述蛋白的多核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID№：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID№：1中第244-246位核苷酸序列一致且在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

6)与1)、2)、3)、4)或5)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.一种重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，其特征在于，所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌含有权利要求2所述的编码基因。

4.一种引物对，其特征在于，所述引物对可扩增权利要求2所述编码基因全长或其任意片段。

5.一种葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为1)或2)所述方法：

所述方法中，所述野生型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为将序列表中的SEQ ID№.2所示的氨基酸序列的第82位半胱氨酸变为谷氨酸后的氨基酸序列；所述与野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列同源的氨基酸序列具体为与所述与野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列具有90％以上同源性，且功能相同的蛋白质的氨基酸序列。

6.一种葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1)制备权利要求2所述的编码基因；

2)制备包含步骤1)所述编码基因的重组表达载体；

7.权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求4所述引物对、和/或权利要求5、6所述制备方法在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)制备葡萄糖氧化酶和/或含有葡萄糖氧化酶相关产品；

8.权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求4所述引物对、和/或权利要求5、6所述制备方法在制备应用于包括食品、医药、动物饲料和/或纺织行业领域中的添加剂中的应用。

9.权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、和/或权利要求5、6所述制备方法制备得到的葡萄糖氧化酶突变体在如下1)-4)至少一种中的应用：

1)制备含有和/或本身直接作为葡萄糖氧化酶相关产品；

10.权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、和/或权利要求5、6所述制备方法制备得到的葡萄糖氧化酶突变体在制备应用于包括食品、医药、动物饲料和/或纺织行业领域中的添加剂中的应用。