CN101586086A - 一种耐有机溶剂蛋白酶及其产生菌株 - Google Patents

一种耐有机溶剂蛋白酶及其产生菌株 Download PDF

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CN101586086A CNA2009100278092A CN200910027809A CN101586086A CN 101586086 A CN101586086 A CN 101586086A CN A2009100278092 A CNA2009100278092 A CN A2009100278092A CN 200910027809 A CN200910027809 A CN 200910027809A CN 101586086 A CN101586086 A CN 101586086A
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Abstract

本发明提供一种具有有机溶剂耐受性的沙雷氏菌属菌株，命名为Serratiamarcescens MH6，其保藏登记号为：CCTCC M 208205。本发明还提供该菌株产生的耐有机溶剂蛋白酶，该耐有机溶剂蛋白酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明提供的菌株Serratia marcescens MH6是能够耐受有机溶剂的极端微生物，能够产生耐有机溶剂蛋白酶，丰富了极端微生物的种类和耐有机溶剂蛋白酶的来源。该蛋白酶较其它的天然蛋白酶具有良好的有机溶剂耐受性，有望应用于非水相中多肽的合成及关于其有机溶剂耐受机理的理论研究。

Description

一种耐有机溶剂蛋白酶及其产生菌株
技术领域
本发明涉及一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌株以及该耐有机溶剂蛋白酶，属于微生物学与酶学领域。
背景技术
蛋白酶广泛应用于洗涤剂、食品、制药、制革、诊断试剂、污水处理等领域。1984年，Klibanov等人发现蛋白酶在一些有机溶剂中保存较长时间仍然具有活性，而且可以催化合成肽键的反应。这一发现促进了非水酶学的兴起。大量研究表明，有机溶剂中进行酶促反应有许多优点，如有机底物的溶解性大大增强、酶的稳定性提高、防止微生物污染、产物易纯化等。更重要的是，在有机溶剂中利用蛋白酶催化合成肽，可以避免氨基酸的外消旋作用，不需要对氨基酸侧链进行保护及脱保护，因此降低成本。研究表明，只有当酶分子具有一定的构象时，才能表现出催化活力。水直接或间接地参与维持酶分子构象的非共价作用力，维持酶的活性构象变化所需的“柔性”。因此，有机溶剂尤其是亲水性有机溶剂对天然来源的蛋白酶分子的催化活性影响很大。为了改善酶在有机溶剂中的稳定性，人们采用各种方法如酶的定向进化或化学修饰、固定化等策略。但是效果并不能满足实际催化的需要。
耐有机溶剂极端微生物能在富含有机溶剂的环境中生存，因此其所产胞外蛋白酶很有可能具有一定的有机溶剂耐受性。在已报道的有机溶剂耐受性微生物中以革兰氏阴性菌为主，仅有少量文献报道了具有有机溶剂耐受性的革兰氏阳性菌如Bacillus(芽孢杆菌属)，Rhodococcus(红球菌属)和Arthrobacter(节杆菌属)等。目前已报道的产溶剂稳定性蛋白酶的微生物多为Pseudomonas(假单胞菌属)菌株。国内关于耐有机溶剂微生物产蛋白酶的相关报道并不多。其中也未见Serratia marcescens产耐有机溶剂蛋白酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有优良有机溶剂耐受性能的蛋白酶及其产生菌株。
本发明提供一种具有有机溶剂耐受性的沙雷氏菌属菌株，命名为Serratiamarcescens MH6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武汉大学)，保藏日期2008年11月7日，其保藏登记号为：CCTCCNO：M208205。
菌株Serratia marcescens MH6为耐有机溶剂蛋白酶产生菌。筛选过程如下：
初筛：采用不同浓度环己烷、DMF、DMSO等有机溶剂为筛选压力从油污土样中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。然后，采用牛奶琼脂平板培养基，从上述耐有机溶剂极端微生物中筛选蛋白酶产生菌株，共获得6株蛋白酶高产菌。
复筛：通过检测各菌株产蛋白酶能力及所产蛋白酶的有机溶剂耐受性，从初筛菌中选取具有优良有机溶剂耐受性能的蛋白酶的产生菌。菌株MH6产蛋白酶能力最强，活力高达1204U/mL；该菌株的粗酶液具有优良有机溶剂耐受性能因此，最终选择菌株MH6作为耐有机溶剂蛋白酶产生菌。
菌株MH6经过BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析，表明该菌株属于沙雷氏菌属，为Serratia marcescens，并命名Serratia marcescens MH6。
菌株Serratia marcescens MH6为革兰氏阴性短杆菌株，无芽孢，周生鞭毛，菌落为红色，大小为1μm×1.5～0.7×1.0μm。在LB培养基中生长24小时后，菌落大小为1.5～2.5mm。该菌株生长温度范围为20～45℃，最适生长温度为35℃，生长pH为5～9，最适pH为8.0，在有氧条件下生长。
本发明对菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶进行了纯化：(1)硫酸铵沉淀法初步纯化耐有机溶剂蛋白酶。将粗酶液置于冰浴中，加入50％饱和度的(NH4)2SO4沉淀杂蛋白，然后向上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度60％，获得沉淀。经检测，沉淀中的蛋白酶活力回收达到69.1％。(2)离子交换层析法进一步纯化耐有机溶剂蛋白酶。通过SDS-PAGE电泳分析，表明：经过两步纯化，该蛋白酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为52～54kDa；最终，蛋白酶纯化倍数(表3)为5.98，回收率为19.87％，比活达到42388.57U/mg。该耐有机溶剂蛋白酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为52-54KDa。
菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶具有良好的有机溶剂耐受性，在考察的15种有机溶剂中，多数有机溶剂对蛋白酶的酶活力几乎没有影响；DMSO、DMF对蛋白酶酶活力有一定影响，但处理24h后相对酶活力仍然保持在60％以上；异丙醇、丙酮、乙醇、乙腈对酶活影响较大，在24h以后，相对酶活力小于10％以下。
菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶在50％(v/v)的长链烷烃如十二烷、环己烷、乙酸乙酯中比水相中稳定。
菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶的最适反应pH为8.0-8.5，在pH6～8.5，能保留最大活力的50％以上；该酶在pH6～8的范围具有很好的稳定性。该酶的最适反应温度为40-45℃，在30、40和45℃放置一小时后，仍然能保留初始活力的70％以上，较稳定。当温度大于等于50℃时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。
Ca2+、Mg2+和Ni2+离子对该耐有机溶剂蛋白酶有激活作用，而高浓度的离子溶液对酶活有抑制作用。
丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)对该酶活力有轻微抑制，表面活性剂Tween80、TritonX-100等对蛋白酶活有激活作用，而SDS对该酶活有显著抑制；巯基乙醇对该蛋白酶活有明显的抑制作用，表明该蛋白酶结构中有二硫键存在。
本发明分离克隆了菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶，所述的耐有机溶剂蛋白酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该耐有机溶剂蛋白酶的编码基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。LC/MS/MS(HPLC-mass spectrometry analysis)分析结果显示，该耐有机溶剂蛋白酶属于Serratia marcescens金属蛋白酶家族。在NCBI上进行比对，发现该蛋白酶编码基因与Serratia marcescens metalloprotease gene(Serratia marcescens SM6金属蛋白酶)同源性为98％。CDS区域编码基因对应的氨基酸比对结果发现相似度为99％，有四个氨基酸不同。
本发明提供的菌株Serratia marcescens MH6是能够耐受有机溶剂的极端微生物，能够产生耐有机溶剂蛋白酶，丰富了极端微生物的种类和耐有机溶剂蛋白酶的来源。该蛋白酶与其它的天然蛋白酶相比，具有良好的有机溶剂耐受性，有望应用于非水相中多肽的合成及关于其有机溶剂耐受机理的理论研究。
附图说明
图1是牛奶琼脂平板筛选照片；
图2是耐有机溶剂蛋白酶的SDS-PAGE电泳分析，其中1-标准分子量蛋白，2-硫酸铵沉淀后蛋白酶液，3-DEAE-Sepharose FF离子交换后蛋白酶液；
图3表示不同有机溶剂对蛋白酶的影响；
图4表示蛋白酶在有机溶剂中的稳定性；
图5表示耐有机溶剂蛋白酶的最适反应pH和pH稳定性，其中图5(1)表示耐有机溶剂蛋白酶的最适反应pH，图5(1)表示耐有机溶剂蛋白酶的pH稳定性；
图6表示耐有机溶剂蛋白酶的最适反应温度和热稳定性，其中图6(1)表示耐有机溶剂蛋白酶的最适反应温度，图6(2)表示耐有机溶剂蛋白酶的温度稳定性。
具体实施方式
实施例一
本实验说明产耐有机溶剂蛋白酶的天然菌株的筛选程序。
初筛：获得能够耐受有机溶剂并产蛋白酶的菌株。采用不同浓度环己烷、DMF、DMSO等有机溶剂为筛选压力从油污土样中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。然后，采用牛奶琼脂平板培养基从上述耐有机溶剂极端微生物中筛选蛋白酶产生菌株。根据各菌株在牛奶琼脂平板培养基上形成的菌落与透明圈直径之比值，初步筛选到6株蛋白酶高产菌(图1)。由于此6株菌能够耐受有机溶剂，其产生的蛋白酶也很有可能具有有机溶剂耐受性。
复筛：通过检测各菌株产蛋白酶能力及所产蛋白酶的有机溶剂耐受性，从初筛菌中选取具有优良有机溶剂耐受性能的蛋白酶的产生菌。将初筛获得的菌株接种到产酶发酵培养基，于35℃，摇床转速为180r/min，培养24h。将发酵液离心(4℃，9000r/min离心15min)，上清液为粗酶液。检测各粗酶液的蛋白酶活性，其中菌株MH6产蛋白酶能力最强，活力高达1204U/mL。取菌株MH6粗酶液1mL，分别加入等体积的十六烷、十四烷、十二烷、癸烷、乙酸乙酯、正辛烷、丙酮、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)等，于30℃、180rpm震荡处理24h后，以酪蛋白为底物检测蛋白酶剩余酶活；实验表明该酶具有优良有机溶剂耐受性能。在DMF中处理后仍能保持60％以上酶活，尤其在疏水有机溶剂中处理24h后保持80％以上酶活。因此，最终选择菌株MH6作为耐有机溶剂蛋白酶产生菌，进行后续研究。
牛奶琼脂平板培养基(MLB)：胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，脱脂奶粉12g/L，琼脂18g/L。
产酶发酵培养基：胰蛋白胨10g/L，(NH4)2SO41.8g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.3g/L，CaCl21.0g/L，NaCl 1.0g/L，甘油5ml/L。
蛋白酶活力检测方法为：配制酪蛋白含量为2％(W/V)的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液作为反应底物。取1mL稀释适当倍数的粗酶液，加入1mL反应底物，40℃保温10min后加入4mL TCA反应终止液(含有0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸钠，0.33M醋酸)。将该反应混合物于4℃静置15min，12000rpm离心25min，取上清液于280nm处检测紫外吸光值。每一个单位(U)蛋白酶活力定义为，在40℃，pH为8.0的反应条件下，每毫升粗酶液每分钟催化产生1μg酪氨酸所需的酶量。
实施例二
本实验说明耐有机溶剂蛋白酶产生菌MH6的生理生化性质及其鉴定
菌株Serratia marcescens MH6为革兰氏阴性短杆菌株，无芽孢，周生鞭毛，大小为1μm×1.5～0.7×1.0μm。在LB培养基中生长24小时后，菌落为红色，菌落大小为1.5～2.5mm。该菌株生长温度范围为20～45℃，最适生长温度为35℃，生长pH为5～9，最适pH为8.0，在有氧条件下生长。其生理生化性质见(表1)。
LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 1.0g/L。
表1菌株MH6的部分生理生化特征
  特征   结果   特征   结果
  尿素   -   山梨醇   +
  氧化酶反应   -   D-果糖   +
  蔗糖   +   乳糖   -
  明胶反应   +   麦芽糖   -
  葡萄糖   +   甘露糖   +
注：+(阳性)：能利用；-(阴性)：不能利用。
经过BIOLOG自动细菌鉴定仪和16S rDNA序列分析，菌株MH6属于沙雷氏菌属，为Serratia marcescens，并命名Serratia marcescens MH6。
考察Serratia marcescens MH6的溶剂耐受性。500mL三角瓶中MLB培养基的装液量为40mL，菌株Serratia marcescens MH6的接种量为2％(体积百分数)。在各培养体系中分别加入不同的有机溶剂溶剂(11种)，添加量为20％(体积百分数)，其中有机溶剂含量为20％，总体系为50ml，以橡胶塞封口，于37℃，摇床180rpm培养，培养时间24h取样检测OD660(表2)。实验结果表明，菌株MH6能在含有不同有机溶剂的培养基中生长(对照中不添加有机溶剂)，具有一定的有机溶剂耐受性。Log Po/w大于2.0的有机溶剂如十二烷，庚烷，环己烷对MH6的生长影响较小；Log Po/w小于2.0的有机溶剂如异丙醇，乙醇能明显抑制菌株MH6的生长。
表2有机溶剂对菌株Serratia marcescensMH6生长的影响
  溶剂   LogP   生长
  空白   -   ++
  十二烷   5.6   ++
  正庚烷   4.0   ++
  环己烷   3.2   ++
  苯   2.5   -
  甲苯   2.0   +
  正丁醇   0.8   -
  乙酸乙酯   0.68   ++
  异丙醇   0.05   -
  乙醇   -0.24   -
  DMF   -1.0   +
  DMSO   -1.35   +
注：++：生长良好；+：可以生长；-：不可以生长。
实施例三
本实验说明菌株Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶的纯化程序。
菌株Serratia marcescens MH6在产酶培养基中培养28h，将所得的发酵液离心(9000rmp，4℃)20min，取上清液作为粗酶液。
硫酸铵沉淀法初步纯化耐有机溶剂蛋白酶。将粗酶液置于冰浴中，一边搅拌一边缓慢加入(NH4)2SO4至50％饱和度，然后离心(9000rmp，4℃)20min，取上清液继续加入(NH4)2SO4至60％饱和度，再次离心(9000rmp，4℃)20min，将所得沉淀用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.0)溶解。经检测，沉淀中的蛋白酶活力回收率达到69.1％。
离子交换层析法进一步纯化耐有机溶剂蛋白酶。DEAE Fast Flow离子交换层析柱事先采用Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH7.5)平衡，将硫酸铵沉淀法所得沉淀的Tris-HCl溶液作为进一步纯化的样品，上样至DEAE Fast Flow离子交换层析柱，然后用含盐(NaCl浓度为1mol/L)的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH7.5，)进行梯度洗脱，收集具有蛋白酶活性的洗脱液。通过SDS-PAGE电泳分析(图2)，表明：经过两步纯化，该蛋白酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为52～54kDa；最终，蛋白酶纯化倍数(表3)为5.98，回收率为19.87％，比活达到42388.57U/mg。
表3耐有机溶蛋白酶MH6的纯化步骤及结果
  总活力(U)   总蛋白(mg)   比活力(U/mg)   回收率(％) 纯化倍数
  粗酶液   74672   10.53   7091.35   100   1
  (NH4)2SO4   51535   5.04   10221.14   69.1   1.44
  (60％)
  DEAE Fast Flow   14836   0.35   42388.57   19.87   5.98
注：蛋白质浓度采用考马斯亮兰法测定
实施例四
本实验说明菌株Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶的酶学性质。
(1)溶剂耐受性
采用实施例三的方法，获得耐有机溶剂蛋白酶。将该蛋白酶稀释液分别加入等体积有机溶剂如十六烷、十四烷、环己烷、DMF、DMSO、丙酮、乙醇，在30℃、180rpm振荡24h后，检测残留蛋白酶活力(图3)。对照中加入等体积Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH8.0)。实验结果表明，该蛋白酶具有良好的有机溶剂耐受性，在考察的15种有机溶剂中，多数有机溶剂对蛋白酶的酶活力几乎没有影响；DMSO、DMF对蛋白酶酶活力有一定影响，但处理24h后相对酶活力仍然保持在60％以上；异丙醇、丙酮、乙醇、乙腈对酶活影响较大，在24h以后，相对酶活力小于10％以下。
(2)溶剂稳定性
通常，疏水有机溶剂不直接与酶接触，所以抑制酶活力能力较亲水性有机溶剂小，本研究中考查了几种疏水有机溶剂对蛋白酶的稳定性的影响。如图4所示，此蛋白酶在50％(v/v)的长链烷烃如十二烷、环己烷、乙酸乙酯中比水相(control中添加的是缓冲液)中稳定。
(3)耐有机溶剂蛋白酶最适反应pH值和pH稳定性
以不同pH值的酪蛋白为底物，检测菌株Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶的最适反应pH。由图5(1)可见，该耐有机溶剂蛋白酶的最适反应pH为8.0-8.5，反应pH为6～8.5时，蛋白酶活力能保留最大活力的50％以上(以pH8.0条件下的蛋白酶活力为100％)。
向该耐有机溶剂蛋白酶中加入不同pH(pH介于6～9)的缓冲溶液，于40℃保温1h后，检测蛋白酶活力(以初始蛋白酶活力为对照)，以考察pH对该耐有机溶剂蛋白酶稳定性的影响。由图5(2)可知，该蛋白酶在pH6～8的范围具有很好的稳定性。
(4)最适反应温度和热稳定性
在Tris-HCl缓冲体系(0.05M，pH8.0)下，检测菌株Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶的最适反应温度。从图6(1)可以看出，该酶最适反应温度为40-45℃。
将菌株Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃下分别放置1h以后，测定残留蛋白酶活力，以考察温度对该蛋白酶稳定性的影响(图6(2))。该蛋白酶在30、40和45℃水浴中处理后，仍然能保留初始活力的70％以上，较稳定。当温度大于等于50℃时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。
(5)金属离子对蛋白酶活力的影响
向该耐有机溶剂蛋白酶中加入不同浓度的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和1，10-Phenathroline(邻菲罗林)，4℃下放置30min后，检测残留蛋白酶活力(表4(1))。结果显示，随着EDTA浓度的增加，抑制作用逐渐加强，10mM的EDTA对酶活有明显的抑制作用；1mM的1，10-Phenathroline几乎完全抑制该酶活力。
向该耐有机溶剂蛋白酶中，加入各种金属离子，考察金属离子对其酶活力的影响。操作过程如下：向该耐有机溶剂蛋白酶中加入EDTA除去溶液中的微量离子，使其终浓度分别为为1mmol L-1和5mmol L-1，于4℃下放置30min后，分别添加Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Mn2+等二价金属离子(对应于EDTA浓度，各金属离子终浓度为分别为1mmol L-1和5mmol L-1)，于4℃下放置30min后，检测蛋白酶活力。对照中不加入任何金属离子。由表4(2)可见，1mmol L-1的Ca2+、Mg2+、Ni2+离子对该蛋白酶有激活作用，而高浓度的离子溶液对酶活有抑制作用。
表4(1)金属离子鳌合剂对蛋白酶活力的影响
Figure A20091002780900111
Figure A20091002780900121
表4(2)金属离子对蛋白酶活力的影响
Figure A20091002780900122
(6)表面活性剂及抑制剂对蛋白酶活性的影响
向该耐有机溶剂蛋白酶中，分别加入不同浓度的表面活性剂和抑制剂，在25℃放置10min后，检测蛋白酶活力，考察其对该酶活力的影响。对照中不添加任何抑制剂和表面活性剂。由表5可见，丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)对该酶活力有轻微抑制，表面活性剂Tween80、TritonX-100等对蛋白酶活有激活作用，而SDS对该酶活有显著抑制；巯基乙醇对该蛋白酶活有明显的抑制作用，表明该蛋白酶结构中有二硫键存在。
表5变性剂和表面活性剂的影响
Figure A20091002780900123
Figure A20091002780900131
注：PMSF二苯基氟磷酸，glutathione还原型的谷胱甘肽，DTT二硫苏糖醇，Urea尿素，Mercaptoethanol巯基乙醇，SDS十二烷基磺酸钠，L-Cysteine L-半胱氨酸，CTAB十二烷基三甲基溴化铵。
实施例五
本实验说明粘质沙雷氏菌Serratia marcescens MH6所产耐有机溶剂蛋白酶的LC/MS/MS分析以及其编码基因的分离克隆程序。
纯化后的耐有机溶剂蛋白酶经SDS-PAGE电泳分析后，切出含有目的蛋白的单一条带。将该目的蛋白经过胰蛋白酶水解后获得中间肽段，(片段1)GNGIQINGK，(片段2)FSSTNVAGDTGLSK，(片段3)TGDTVYGFNSNTGR和(片段4)SFSDVGGLK，委托国家生物医学分析中心(NBCA)进行LC/MS/MS序列分析。将所得的片段信息通过NCBI蛋白酶数据库比对，结果显示四条肽段序列与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SM6金属蛋白酶氨基酸相应序列相同，因此根据该金属蛋白酶的序列设计引物来扩增目的蛋白的基因序列。
采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。根据粘质沙雷氏菌Serratia marcescensSM6金属蛋白酶基因序列，设计简并引物(PF：GTGGCTTACGGGGAGGTTAT；PR：TCCGTTGCTGTGTTACACGA)，扩增该耐有机溶剂蛋白酶的编码序列。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min；55℃退火2min；72℃延伸2min；循环30轮后，72℃保温10min。根据该反应条件，扩增到了约1.6kb的PCR片段。根据测定此蛋白的分子量，推断此酶蛋白的编码基因长度不超过1.5kb。将此片段连接到pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，本实验克隆的基因序列包括了之前LC/MS/MS分析得到的肽段序列。在NCBI上进行比对，发现该蛋白酶编码基因与Serratia marcescens metalloprotease gene(Serratia marcescens SM6金属蛋白酶)同源性为98％。CDS区域编码基因对应的氨基酸比对结果发现相似度为99％，有四个氨基酸不同。该蛋白酶片段含信号肽序列17个氨基酸，编码成熟蛋白酶的氨基酸个数为487。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种耐有机溶剂蛋白酶及其产生菌株
<130>njut2009
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1515
<212>DNA
<213>Serratia marcescens MH6
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1512)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(51)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(100)..()
<400>1
atg tct atc tgt ctg att gat atc aat cag gta atg agt gga atc gaa     48
Met Ser Ile Cys Leu Ile Asp Ile Asn Gln Val Met Ser Gly Ile Glu
            -30                 -25                 -20
cca atg caa tct act aaa aag gca att gaa att act gaa tcc agc ctt     96
Pro Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu
        -15                 -10                 -5
gcg gcc gcg gca acc ggc tac gat gct gta gat gac ctg ctg cat tat    144
Ala Ala Ala Ala Thr Gly Tyr Asp Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr
-1  1               5                   10                  15
cat gag cgg ggt aac ggg att cag att aat ggc aag gat tca ttt tct    192
His Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Ile Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser
                20                  25                  30
aac gag caa gct ggg ttg ttt att acc cgc gag aac caa acc tgg aac    240
Asn Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn
            35                  40                  45
ggt tac aag gta ttt ggc cag ccg gtc aaa tta acc ttc tcc ttc ccg    288
Gly Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro
        50                  55                  60
gac tat aag ttc tct tcc acc aac gtc gcc ggc gat acc ggg ctg agc    336
Asp Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser
    65                  70                  75
aag ttc agc gcg gaa cag cag cag cag gct aag ctg tcg ctg cag tcc    384
Lys Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser
80                  85                  90                  95
tgg gcc gac gtc gcc aat atc acc ttc acc gaa gtg gcg gcc ggt caa    432
Trp Ala Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Ala Ala Gly Gln
                100                 105                 110
aag gcc aat atc acc ttc ggc aat tac agc cag ggt cgt ccc ggc cac    480
Lys Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Gly Arg Pro Gly His
            115                 120                 125
tat gat tat ggt acc cag gcc tac gcc ttc ctg ccg aac acc att tgg    528
Tyr Asp Tyr Gly Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Trp
        130                 135                 140
cag ggc cag gat ttg ggc ggc cag acc tgg tac aac gtc aac caa tcc    576
Gln Gly Gln Asp Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser
    145                 150                 155
aac gtg aag cat ccg gcg acc gaa gac tac ggc cgc cag acg ttc acc    624
Asn Val Lys His Pro Ala Thr Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr
160                 165                 170                 175
cat gag att ggc cat gcg ctg ggc ctg agc cac ccg ggc gac tac aac    672
His Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn
                180                 185                 190
gcc ggt gag ggc aac ccg acc tat aac gac gtc acc tat gcg gaa gat     720
Ala Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Asn Asp Val Thr Tyr Ala Glu Asp
            195                 200                 205
acc cgc cag ttc agc ctg atg agc tac tgg agt gaa acc aat acc ggt     768
Thr Arg Gln Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly
        210                 215                 220
ggc gac aac ggc ggt cac tat gcc gcg gct ccg ctg ctg gat gac att     816
Gly Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile
    225                 230                 235
gcc gcc att cag cat ctg tat ggc gcc aac ctg tcg acc cgc acc ggc     864
Ala Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Leu Ser Thr Arg Thr Gly
240                 245                 250                 255
gac acc gtg tac ggc ttt aac tcc aat acc ggt cgt gac ttc ctc agc     912
Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser
                260                 265                 270
acc acc agc aat tcg cag aaa gtg atc ttt gcg gcc tgg gat gcg ggt     960
Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly
            275                 280                 285
ggc aac gat acc ttc gac ttc tcc ggt tat acc gct aac cag cgc atc    1008
Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile
        290                 295                 300
aac ctg aat gag aaa tcg ttc tcc gac gtg ggc ggc ctg aag ggc aac    1056
Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn
    305                 310                 315
gtc tcg atc gcc gcc ggt gtg acc att gag aac gcc act ggc ggt tcc    1104
Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Thr Gly Gly Ser
320                 325                 330                 335
ggc aac gac gtg atc gtc ggc aac gcg gcc aac aac gtg ctg aaa ggc    1152
Gly Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly
                340                 345                 350
ggc gcg ggt aac gac gtg ctg ttc ggc ggc ggc ggg gcg gat gaa ctg    1200
Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu
            355                 360                 365
tgg ggc ggt gcc ggc aaa gac atc ttt gtg ttc tct gcc gcc agc gat    1248
Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Val Phe Ser Ala Ala Ser Asp
        370                 375                 380
tct gca ccg ggt gct tcc gac tgg atc cgc gac ttc caa aaa ggg atc    1296
Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gln Lys Gly Ile
    385                 390                 395
gac aag atc gac ctg tcg ttc ttc aat aaa gaa gcg aat agc agt gat    1344
Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala Asn Ser Ser Asp
400                 405                 410                 415
ttc atc cac ttc gtc gat cac ttc agc ggc acg gcc ggt gag gcg ctg    1392
Phe Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Thr Ala Gly Glu Ala Leu
                420                 425                 430
ctg agc tac aac gcg tcc agc aat gtg acc gat ttg tcg gtg aac atc    1440
Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Asn Val Thr Asp Leu Ser Val Asn Ile
            435                 440                 445
ggc ggg cat cag gcg ccg gac ttc ctg gtg aaa atc gtc ggc cag gta    1488
Gly Gly His Gln Ala Pro Asp Phe Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val
        450                 455                 460
gac gtc gcc acg gac ttt atc gtg taa                                1515
Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile Val
    465                 470
<210>2
<211>504
<212>PRT
<213>Serratia marcescens MH6
<400>2
Met Ser Ile Cys Leu Ile Asp Ile Asn Gln Val Met Ser Gly Ile Glu
            -30                 -25                 -20
Pro Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu
         -15                -10                 -5
Ala Ala Ala Ala Thr Gly Tyr Asp Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr
-1  1               5                       10              15
His Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Ile Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser
                20                  25                  30
Asn Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn
            35                  40                  45
Gly Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro
        50                  55                  60
Asp Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser
    65                  70                  75
Lys Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser
80                  85                  90                  95
Trp Ala Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Ala Ala Gly Gln
                100                 105                 110
Lys Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Gly Arg Pro Gly His
            115                 120                 125
Tyr Asp Tyr Gly Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Trp
        130                 135                 140
Gln Gly Gln Asp Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser
    145                 150                 155
Asn Val Lys His Pro Ala Thr Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr
160                 165                 170                 175
His Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn
                180                 185                 190
Ala Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Asn Asp Val Thr Tyr Ala Glu Asp
            195                 200                 205
Thr Arg Gln Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly
        210                 215                 220
Gly Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile
    225                 230                 235
Ala Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Leu Ser Thr Arg Thr Gly
240                 245                 250                 255
Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser
                260                 265                 270
Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly
            275                 280                 285
Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile
        290                 295                 300
Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn
    305                 310                  315
Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Thr Gly Gly Ser
320                 325                 330                 335
Gly Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly
                340                 345                 350
Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu
            355                 360                 365
Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Val Phe Ser Ala Ala Ser Asp
        370                 375                 380
Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gln Lys Gly Ile
    385                 390                 395
Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala Asn Ser Ser Asp
400                 405                 410                 415
Phe Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Thr Ala Gly Glu Ala Leu
                420             425                     430
Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Asn Val Thr Asp Leu Ser Val Asn Ile
            435             440                     445
Gly Gly His Gln Ala Pro Asp Phe Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val
        450             455                     460
Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile Val
    465             470
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>PF
<400>3
gtggcttacg gggaggttat    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>PR
<400>4
tccgttgctg tgttacacga    20

Claims (3)

1、一种具有有机溶剂耐受性的沙雷氏菌属菌株，命名为Serratia marcescensMH6，其保藏登记号为：CCTCC NO：M208205。
2、一种权利要求1所述菌株产生的耐有机溶剂蛋白酶，其特征在于所述耐有机溶剂蛋白酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3、根据权利要求2所述的耐有机溶剂蛋白酶，其特征在于所述耐有机溶剂蛋白酶的编码基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
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