CN100422207C

CN100422207C - 二肽生产方法,所用的l-氨基酸酰胺水解酶,以及l-氨基酸酰胺水解酶生产方法

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Publication number: CN100422207C
Application number: CNB028148452A
Authority: CN
Inventors: 野崎博之; 吉良郁夫; 铃木园子; 横关健三
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: US7037673B2; CN101982546A; RU2280077C2; US7288388B2; KR20040023686A; DK1911839T3; EP1411060A1; US20070048838A1; EP1411060A4; EP1411116B1; US20050037453A1; US7754466B2; CN1535279A; EP1411116A4; WO2003010187A1; DE60226243T2; JPWO2003010189A1; CN1268742C; JPWO2003010307A1; DK1411116T3

Abstract

本发明提供了一种用于通过常规途径用较廉价的并且容易获得的材料作为起始材料生产二肽的方法。即，通过使用能够由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸合成二肽的微生物培养物，从所述培养物中分离的微生物细胞或来自所述微生物的处理过的微生物细胞制品，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽。

Description

二肽生产方法，所用的L-氨基酸酰胺水解酶，以及L-氨基酸酰胺水解酶生产方法

技术领域

本发明涉及不采用复杂的合成方法，方便地和廉价地生产二肽的方法，更具体地讲，本发明涉及由L-氨基酸酰胺(amino acid amide)和L-氨基酸生产二肽的方法，涉及用于所述生产二肽的方法中的L-氨基酸酰胺水解酶，以及所述水解酶的生产方法。

背景技术

二肽被用于药品和功能食品领域以及各种其他领域。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可用作无血清培养基的成分，并且由于它具有比L-谷氨酰胺更高的稳定性和水溶性，它可用于输液。

尽管化学合成方法是本领域传统公知的生产二肽的方法，但是这些生产方法不一定简单。所述方法的已知例子包括使用N-苄基氧基羰基丙氨酸(以下称之为“Z-丙氨酸”)和受保护的L-谷氨酰胺的方法(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))，使用Z-丙氨酸和受保护的L-谷氨酸-γ-甲基酯的方法(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))，使用Z-丙氨酸酯和未保护的谷氨酸的方法(参见特开平1-96194号公报)，以及使用2-取代的丙酰卤化物作为原始材料，使用N-(2-取代的)丙酰谷氨酰胺衍生物作为中间产物合成二肽的方法(参见特开平6-234715号公报)。

不过，由于所有上述方法需要导入和消除保护基团或合成一种中间产物，在它们的工业优势方面，它们不被认为十分令人满意的。

另外，利用微生物酶系统生产二肽的方法的已知例子，包括使用Z-天冬氨酸和丙氨酸甲酯的方法(参见特开昭53-92729号公报)，以及使用天冬氨酸酰胺和丙氨酸甲酯的方法(参见特开平10-136992号公报)。在EPA 0278787和WO 90/01555中披露了通过酶促方法生产二肽的方法的其他公知例子。

不过，在以上所有微生物酶系统中，由于必须使用具有保护基团的氨基酸作为原始材料，因此有必要开发一种采用成本较低并且较容易获得的材料生产二肽的方法，该方法具有工业优点，并且采用一种简单的生产途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产二肽的方法，该方法使用较廉价的并且容易获得的原始材料，该方法具有工业优点，并且采用简单的生产途径。

对上述目的进行深入研究的结果是，本发明的发明人发现了某些微生物具有较廉价的并且便于获得的L-氨基酸酰胺和L-谷氨酸生产二肽的能力，从而完成了本发明。

就是说，本发明如下文所描述。

[1]一种二肽生产方法，包括：利用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含有酶的物质，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽。

[2]如上述[1]的二肽生产方法，其中酶或含有酶的物质是选自下列的一种或两种以上类型：具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的微生物培养物，从所述培养物中分离的微生物细胞，以及来自所述微生物的处理过的微生物细胞制品。

[3]如上述[2]的二肽生产方法，其中微生物属于芽孢杆菌属，棒杆菌属，欧文氏菌属，红球菌属，黄金杆菌属，微球菌属，假单胞菌属，隐球菌属，丝孢酵母属，红冬孢酵母属，掷孢酵母属，银耳属，有孢圆酵母属，梗孢酵母属或红酵母属。

[4]如上述[1]的二肽生产方法，其中酶是蛋白(A)或(B)：

(A)具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白，

(B)具有在序列表中的SEQ ID No.：5的氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应；

[5]如上述[1]的二肽生产方法，其中酶是由(C)的DNA编码的蛋白：

(C)能在严格条件下与由和序列表中的SEQ ID No.：4所示碱基序列的57-1295号碱基互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

[6]如[2]的二肽生产方法，其中微生物是已转化过的微生物，以便能够表达蛋白(A)、(B)或(C)：

(A)具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白，

(B)具有在序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

(C)由一种DNA编码的蛋白，该DNA能在严格条件下与由和序列表中的SEQ ID No.：4所示碱基序列的57-1295号碱基互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

[7]如上述[1]-[6]中任意一项的二肽生产方法，其中L-氨基酸酰胺是选自L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-谷氨酸-α-酰胺的一种或两种以上的类型。

[8]如上述[1]-[7]中任意一项的二肽生产方法，其中L-氨基酸选自下列的一种或两种以上类型：L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-酪氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸和L-谷氨酰胺。

[9]一种从属于以下属的微生物中获得的L-氨基酸酰胺水解酶：欧文氏菌属，红球菌属，黄金杆菌属，微球菌属，隐球菌属，丝孢酵母属，红冬孢酵母属，掷孢酵母属，银耳属，有孢圆酵母属，梗孢酵母属或红酵母属，所述酶能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

[10]L-氨基酸酰胺水解酶的生产方法，包括：在一种培养基中培养属于以下属的微生物：欧文氏菌属，红球菌属，黄金杆菌属，微球菌属，隐球菌属，丝孢酵母属，红冬孢酵母属，掷孢酵母属，银耳属，有孢圆酵母属，梗孢酵母属或红酵母属，并且在所述培养基和/或细胞中积累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶。

[11]L-氨基酸酰胺水解酶生产方法，包括：培养转化过的微生物，以便能够表达蛋白(A)，(B)或(C)：

(A)具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白，

(B)具有在序列表中的SEQ ID No.：5的氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

(C)由一种DNA编码的蛋白，该DNA能在严格条件下与由和序列表中的SEQ ID No.：4所示碱基序列的57-1295号碱基互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应，并且在所述培养基和/或细胞中积累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶。

附图的简要说明

图1是本发明二肽生产方法的流程图；

图2是源于谷氨酸棒杆菌ATCC13286的L-氨基酸酰胺水解酶的最佳pH曲线的曲线图；

图3是源于谷氨酸棒杆菌ATCC13286的L-氨基酸酰胺水解酶的最佳温度曲线的曲线图；

实施本发明的最佳方式

本发明二肽生产方法的特征是，使用具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的酶或含有酶的物质，更具体地讲，其特征是使用具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物培养物，从所述培养物中分离的微生物细胞，或来自所述微生物的处理过的微生物细胞制品。本发明二肽生产方法中的反应可以通过以下反应式表示。正如以下化学结构式所表明的，本说明书中所使用的术语“二肽”表示具有一个肽键的肽聚合物。

(在以上化学式中R¹表示氨基酸酰胺的氨基酸侧链，而R²表示L-氨基酸的氨基酸侧链)。

氨基酸酰胺是能够以商业化制品形式较廉价的获得的化合物。本发明的方法使用氨基酸酰胺和未保护的氨基酸作为原始材料，它能够廉价地提供可用作药物材料和功能性食品的二肽。

下面所提供的是按以下顺序结合附图对本发明的二肽生产方法进行的说明：

[I]具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物；

[II]L-氨基酸酰胺水解酶的特性；

[III]分离编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA；和

[IV]二肽生产方法。

[I]具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物

具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物，可以不受限制地用作在本发明中使用的微生物。具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物的例子包括属于以下属的微生物：芽孢杆菌属，棒杆菌属，欧文氏菌属，红球菌属，黄金杆菌属，微球菌属，假单胞菌属，隐球菌属，丝孢酵母属，红冬孢酵母属，掷孢酵母属，银耳属，有孢圆酵母属，梗孢酵母属或红酵母属。所述微生物的具体例子如下文所示。

巨大芽孢杆菌AJ3284 FERM BP-8090

谷氨酸棒杆菌 ATCC 13286

胡萝卜软腐欧文氏菌AJ2719 FERM BP-8089

紫红红球菌 ATCC 19149

脑膜脓毒性黄金杆菌 ATCC 13253

藤黄微球菌 ATCC 9341

嗜糖假单胞菌 ATCC 15946

浅白隐球酵母 IFO 0378

细长丝孢酵母菌 ATCC 24660

双倒卵形红冬孢酵母 ATCC 22264

赭色掷孢酵母 IFO 1038

茶银耳 IFO 9297

戴耳有孢圆酵母 IFO 1083

Sterigmatomyces elviae IFO 1843

Rhodotorula ingeniosa ATCC 22993

上述微生物的保藏机构如下文所述。

独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1中央第6)。

财团法人发酵研究所(Institute For Fermentation Osaka(IFO)，日本大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号)。

美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，USA)。

另外，巨大芽孢杆菌菌株AJ3284保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，保藏日期为2001年7月13日，确定的保藏号为FERM P-18421。根据布达佩斯条约规定，随后将该生物的对照交由独立行政法人产业技术综合研究所特许保藏中心(日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1中央第6)，保藏日期为2002年6月25日，确定的保藏号为FERM BP-8090。另外，将胡萝卜软腐欧文氏菌菌株巨大芽孢杆菌菌株AJ2719保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，保藏日期为2001年7月13日，确定的保藏号为FERM P-18420。随后根据布达佩斯条约规定，将该生物的对照交由独立行政法人产业技术综合研究所特许保藏中心(日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1中央第6)，保藏日期为2002年6月25日，确定的保藏号为FERM BP-8089。

可以将野生菌株或变体菌株用作上述微生物，并且还可以使用通过细胞融合、遗传操作或其他遗传学技术获得的重组菌株等。

推荐在合适的培养基中培养并且生长所述微生物，以便获得所述微生物的微生物细胞。对用于这一目的的培养基没有特定限制，只要它能使所述微生物生长就行。所述培养基可以是含有必需的普通碳源、氮源、无机离子，和有机营养源的普通培养基。

例如，任何碳源都可以使用，只要它能被所述微生物利用就行。可以使用的碳源的具体例子包括糖类，如葡萄糖、果糖、麦芽糖和直链淀粉，醇，如山梨糖醇、乙醇和甘油。有机酸，如富马酸、柠檬酸、乙酸和丙酸，以及它们的盐，烃类，如石蜡以及它们的混合物。

可以使用的氮源的例子包括无机酸的铵盐，如硫酸铵和氯化铵，有机酸的铵盐，如富马酸铵，和柠檬酸铵，硝酸盐，如硝酸钠和硝酸钾，有机氮化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏和玉米浆，以及它们的混合物。

另外，用于培养基中的普通营养源，如无机盐，微量金属盐和维生素也可以适当地混合并且使用。

在某些场合下，可以通过向培养基中进一步添加L-氨基酸酰胺获得具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的高的活性水平的微生物细胞。

对培养条件没有特殊限制，并且，举例来说，培养可以进行大约12-大约48小时，同时在有氧条件下分别将pH适当控制在5-8的范围内，并且将温度控制在20-40℃的范围内。

[II]L-氨基酸酰胺水解酶的特性

举上述谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286为例，提供了对纯化的L-氨基酸酰胺水解酶特性的说明，这种酶被用作具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性的酶。

L-氨基酸酰胺水解酶具有水解L-氨基酸酰胺形成L-氨基酸的活性，并且具有利用L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作底物形成二肽的活性。以用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺作为原材料(底物)为例，L-氨基酸酰胺水解酶至少具有通过水解L-丙氨酸酰胺形成L-丙氨酸的活性，以及通过利用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺作底物形成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性。另外，以利用L-丙氨酸酰胺和-L-天冬酰胺作为原材料为例，L-氨基酸酰胺水解酶至少具有通过水解L-丙氨酸酰胺形成L-丙氨酸的活性，以及通过利用L-丙氨酸酰胺和-L-天冬酰胺作底物形成L-丙氨酰-L-天冬酰胺的活性。

就酶的功能而言，以使用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺或L-天冬酰胺作原材料为例，L-氨基酸酰胺水解酶通过水解一个分子的L-丙氨酸酰胺形成了一个分子的L-丙氨酸和一个分子的氨，由一个分子的丙氨酸酰胺和一个分子的谷氨酰胺形成了一个分子的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和一个分子的氨，并且由一个分子的L-丙氨酸酰胺和一个分子的L-天冬酰胺形成了一个分子L-丙氨酰-L-天冬酰胺和一个分子的氨。

最佳pH接近6.0-10.0，最佳温度接近30-50℃。计算出的所述甲基的分子量为42000-46000，它是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的。

[III]分离编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的DNA

用于本发明中的能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的酶或含有酶的物质可以通过生产转化体获得，包括利用遗传工程技术从具有所述酶的上述微生物中分离编码所述酶的DNA。

例如，下面提供了编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA的例子，它是从谷氨酸棒杆菌[III-1]以及已插入了这种DNA的转化体[III-2]中分离的。

[III-1]DNA分离

首先，确定纯化的L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列。所述氨基酸序列可以使用Edman′s方法确定(参见Edman，R，Acta Chem.Scand.，4，227(1950))。另外，还可以用Applied Biosystems确定所述氨基酸序列。通过用赖氨酰内切肽酶等处理纯化的L-氨基酸酰胺水解酶，确定这种酶的N-末端或大约10-大约30个残基的氨基酸序列，并且，可以根据所确定的氨基酸序列推测编码所述水解酶的DNA的碱基序列。在推测所述DNA的碱基序列时采用了通用密码子。

根据推测的碱基序列，合成了具有大约30个碱基对的DNA分子。一种用于合成DNA分子的方法披露于Tetrahedron Letters，22，1859(1981)中。另外，还可以用合成仪(由Applied Biosystems生产)合成所述DNA分子。然后，可以通过PCR方法用所述DNA分子作为引物，由染色体DNA扩增编码L-氨基酸酰胺水解酶的DNA。不过，由于用PCR方法扩增的DNA不包括编码L-氨基酸酰胺水解酶的完整长度的DNA，编码L-氨基酸酰胺水解酶的完整长度的DNA，是利用通过使用扩增的DNA作探针，通过PCR方法从基因文库中分离的。

另外，当所述基因的一部分碱基序列是已知的时候，编码肽形成酶的完整长度的DNA可以利用具有已知序列的DNA作探针从染色体基因文库中分离。

另外，在所述基因的碱基序列具有与已知序列的同源性的场合下，编码肽形成酶的完整长度的DNA可以利用具有所述已知序列的DNA作探针从染色体基因文库中分离。

在以下文献中披露了所述PCR方法的方案：White，T.J.等，TrendsGenet.5，185(1989)。在以下文献中披露了用于制备染色体DNA的方法，以及用于利用DNA分子作探针从基因文库中分离靶DNA分子的方法：Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)。

用于确定编码L-氨基酸酰胺水解酶的分离的DNA的碱基序列的方法披露于以下文献中：A Practical Guide to Molecular Cloning，JohnWiley & Sons，Inc.(1985)。另外，还可以利用DNA测序仪(AppliedBiosystems)确定其碱基序列。在SEQ ID No.：4中示出了以这种方式从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286中分离的编码L-氨基酸酰胺水解酶的DNA。在SEQ ID No.：4的碱基序列中包括57-1295号碱基的碱基序列是CDS(编码区)(在本说明书中，“SEQ ID No.：4所示碱基序列”表示CDS部分，除非另有特别说明)。另外，尽管SEQ ID No.：4所示氨基酸酰胺水解酶是利用丙氨酸酰胺水解酶活性作为指标，根据一种纯化的酶分离的基因的固有的结果，它被称为氨基酸酰胺水解酶，因为它的底物专一性并不局限于丙氨酸酰胺，而是具有极广泛的范围。

可用于本发明的DNA并不仅仅是SEQ ID No.：4所限定的DNA。对于从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286中分离的SEQ ID No.：4的DNA来说，即使已将DNA人工突变成从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286的染色体DNA中分离的编码L-氨基酸酰胺水解酶的DNA，它仍然是本发明的DNA，只要它编码L-氨基酸酰胺水解酶就行。一种常用的用于人工突变DNA的方法是披露于以下文献中的位点专一性突变导入方法：Methods in Enzymol.，154(1987)。

另外，具有能在严格条件下与具有互补于SEQ ID No.：4所示57-1295号碱基的碱基序列的碱基序列的多核苷酸杂交的碱基序列，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA，也可以用作本发明的DNA。本文所说的“严格条件”表示能够产生所谓的专一性杂交，而不能产生非专一性杂交的条件。尽管难以对所述条件进行明显定量，所述条件的例子包括使得具有高度同源性的DNAs，如具有50％或更高同源性，优选80％或更高同源性，更优选90％或更高同源性的DNAs能彼此杂交，而具有低度同源性的DNAs不能彼此杂交的条件，以及在相当于60℃，1×SSC和0.1％SDS，优选60℃，0.1×SCC和0.1％SDS，更优选65℃，0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下使DNAs能杂交的条件，上述条件是普通Southern杂交的洗涤条件。L-氨基酸酰胺水解酶的活性如上文所述。不过，当一种碱基序列能在严格条件下与互补于序列表中的SEQ ID No.：4所示57-1295号碱基的碱基序列的碱基序列杂交时，在50℃和pH8的条件下，它优选保留了大约10％，优选大约50％或更高的具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白的酶活性。

另外，还可以将大体上与由序列表中的SEQ ID No.：4所示DNA编码的L-氨基酸酰胺水解酶相同的蛋白用于本发明。因此，还可以将编码“具有在序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白”的DNA用于本发明。在本文中，术语“多种”表示不会明显破坏具有所述氨基酸残基的蛋白的三维结构或L-氨基酸酰胺水解酶的活性的范围，更具体地讲，它的值为2-50，优选2-30，更优选2-10。另外，L-氨基酸酰胺水解酶的活性如上文所述。不过，对于在序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列来说，它优选保留了在50℃和pH8的条件下具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白的大约10％，优选大约50％或更高的酶活性。

正如已披露的，在具有从诸如谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286中分离的DNA的场合下，优选将以下DNA用于本发明：

(i)包括序列表中的SEQ ID No.：4所示57-1295号碱基的碱基序列的DNA；

(ii)能在严格条件下与包括互补于序列表中的SEQ ID No.：4所示57-1295号碱基的碱基序列的碱基序列的多核苷酸杂交，并且编码具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA；

(iii)编码具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白的DNA；和

(iv)编码具有在序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA。

[III-2]转化体的生产

下面将说明能表达具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的转化体的生产。利用重组DNA技术生产酶，生理学活性物质和其他有用蛋白的多种例子是已知的，并且重组DNA技术的使用能够大量生产在天然状态下仅以微小数量存在的有用蛋白。

可以用于本发明方法生产中的转化体的优选例子，包括能够表达下面的蛋白(A)，(B)或(C)的转化体。

(A)具有序列表中的SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白，

(B)具有在序列表中的SEQ ID No.：5所示的氨基酸序列上包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，

(C)由能在严格条件下与包括互补于序列表的SEQ ID No.：4所示碱基序列的碱基序列的多核苷酸杂交的DNA编码的蛋白，并且编码具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白。

为了生产能表达具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的上述(A)-(C)蛋白的转化体，应当将上述[III-1]部分中所述的(i)-(iv)的DNA插入宿主细胞。即，将(i)，(ii)，(iii)或(iv)的DNA整合在一种表达载体上，在将所述表达载体导入宿主细胞之后，该载体能在所述宿主细胞中表达。

在使用重组DNA技术大量生产蛋白的场合下，将所述蛋白缀合在能生产所述蛋白的转化体内，以便生产蛋白的包含体，这也是实施本发明的一种优选方式。该表达和生产方法的优点包括，保护靶蛋白免受存在于微生物细胞内的蛋白酶的消化作用，并且通过在破碎所述微生物细胞之后进行离心分离简单地纯化靶蛋白。

以这种方式获得的蛋白包含体，在经过活性再生过程之后被转化成适当折叠的、具有生理学活性的蛋白，所述再生过程主要包括用一种蛋白变性剂溶解所述蛋白，然后除去所述变性剂。有多种有关再生的例子，包括再生白介素-2的活性(特开昭61-257931号公报)。

为了从蛋白包含体中获得活性蛋白，需要一系列操作，包括溶解和活性再生，并且该方法比直接生产所述活性蛋白的方法更为复杂。不过，在微生物细胞内大量生产对微生物生长具有有害作用的蛋白时，通过在所述微生物细胞内以蛋白的无活性包含体形式积累所述蛋白可以抑制所述作用。

以包含体形式大量生产靶蛋白的例子包括在高效启动子的控制下独立表达靶蛋白的方法，以及以与已知能大量表达的蛋白融合的融合蛋白形式表达靶蛋白的方法。

另外，还可以将限制蛋白酶的识别序列安排在合适的位点，以便在以融合蛋白形式表达之后裂解所述靶蛋白。

在利用重组DNA技术大量生产蛋白的场合下，尽管被转化的宿主细胞的例子包括细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞和动物细胞，不过，通常使用的是诸如大肠杆菌的肠道细菌。这是因为现有多条信息都提到了利用大肠杆菌大量生产蛋白的技术。下面提供了对利用转化过的大肠杆菌生产L-氨基酸酰胺水解酶的方法的一种形式的说明。

可以将通常被用于在大肠杆菌中进行异源蛋白生产的启动子用作表达编码L-氨基酸酰胺水解酶的DNA的启动子。所述启动子的例子包括高效启动子，如T7启动子，trp启动子，lac启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体P_R启动子和P_L启动子。

为了以融合蛋白的包含体形式生产L-氨基酸酰胺水解酶，可以将编码另一种蛋白，优选编码亲水性肽的基因连接在L-氨基酸酰胺水解酶基因的上游或下游，以便获得融合蛋白基因。所述编码另一种蛋白的基因可以是能够提供融合蛋白的提高了的积累量和在变性和再生步骤之后提高融合蛋白的溶解度的基因。例如，所述基因的候选者包括T7基因10，β-半乳糖苷酶基因，脱氢叶酸还原酶基因，干扰素γ基因，白介素-2基因和原凝乳酶基因。

在连接所述基因与编码L-氨基酸酰胺水解酶的基因时，使密码子读框匹配。可以将它们连接在合适的限制酶位点上，或者可以使用具有合适序列的合成DNA。

另外，为了提高生产量，优选将终止子形式的转录终止序列连接在所述融合蛋白基因的下游。该终止子的例子包括T7终止子，fd噬菌体终止子，T4终止子，四环素抗性基因终止子和大肠杆菌trpA基因终止子。

优选用所谓的多拷贝载体作为将编码L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一种蛋白的融合蛋白的基因导入大肠杆菌，所述载体的例子包括具有源于ColE1的复制起点的质粒，如pUC质粒，pBR322质粒或它的衍生物。“衍生物”表示通过碱基取代、缺失、插入、添加或倒位修饰所述质粒的结果。另外，在本文中所说的修饰，包括由通过诱变剂或UV辐射进行诱变处理或自发突变所导致的修饰。更具体地讲，可以使用的载体的例子包括pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。另外，还可以使用噬菌体DNA的载体。

另外，所述载体优选具有诸如氨苄青霉素抗性的标记，以便筛选转化体。可以用通过商业渠道获得的具有高效启动子的表达载体作为所述质粒(如pUC载体(由宝酒造公司生产)，pPROK载体(由Clontech生产)和pKK233-2载体(由Clontech生产))。

重组DNA是通过将DNA片段连接在载体DNA上获得的。在这种场合下，按以下顺序连接启动子，编码L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一种蛋白的融合蛋白的基因，并且根据情况包括一个终止子。

用所述重组DNA转化大肠杆菌，并且培养所得到的大肠杆菌，导致了L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一种蛋白的融合蛋白的表达和生产。尽管可以将常用于异源基因表达的菌株用作要转化的宿主，举例来说，大肠杆菌菌株JM109是优选的。用于实施转化的方法以及用于筛选转化体的方法披露于Molecular Cloning，2ndEdition，Cold Spring Harbor Press(1989)和其他文献中。

在以融合蛋白形式表达时，可以用限制性蛋白酶裂解重组L-氨基酸酰胺水解酶，所述蛋白酶使用了不存在L-氨基酸酰胺水解酶上的序列作为识别序列，如凝血因子Xa或激肽释放酶。

可以将常用于培养大肠杆菌的培养基，如M9-酪蛋白氨基酸培养基或LB培养基用作生产培养基。另外，可以根据所使用的载体的标记、启动子、宿主微生物的类型等，适当选择培养条件和生产诱导条件。

可以用以下方法回收L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一种蛋白的融合蛋白。如果L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白已经溶解在所述微生物细胞内的话，在回收所述微生物细胞之后，破碎或裂解所述微生物细胞，以便可将其用作粗制酶液体。另外，在使用之前，可以根据需要通过诸如沉淀或过滤、柱层析的普通技术，纯化L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白。在这种场合下，还可以使用利用L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白的抗体的纯化方法。

在生产蛋白包含体的场合下，用一种变性剂溶解所述包含体。尽管可以用微生物细胞蛋白溶解它们，考虑到以下纯化方法，优选分离所述包含体，然后再溶解。可以用已知方法从细菌细胞中回收包含体。例如，可以通过破碎细菌细胞，然后离心分离回收包含体。能够溶解蛋白包含体的变性剂的例子包括盐酸胍(例如，6摩尔(M)，pH 5-8)和尿素(例如8M)。

例如，通过透析除去所述变性剂，再生具有活性的蛋白。在透析时，可以利用Tris-HCl或磷酸缓冲液等作为透析溶液，并且，举例来说，其浓度可以为20毫摩尔(mM)-0.5M，举例来说，pH可以为5-8。

在再生步骤期间，蛋白的浓度优选保持在大约500μg/ml或更低。透析温度优选等于或低于5℃，以便抑制再生的L-氨基酸酰胺水解酶出现自我交联。另外，除了透析之外，还可以利用稀释或超滤除去变性剂，并且预计通过采用上述任意一种方法都能够再生所述酶活性。

在将序列表中的SEQ ID No.：4所示DNA用作编码L-氨基酸酰胺水解酶的DNA时，生产了具有SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的L-氨基酸酰胺水解酶。

应当指出的是，可以按照在诸如Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)的文献中披露的技术，实施遗传工程技术。

[IV]二肽生产方法

本发明的二肽生产方法，利用具有能够由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性的酶或含有酶的物质，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸酰生产二肽，更具体地讲，利用微生物培养物，从所述培养物中分离的微生物细胞和来自所述微生物的处理过的微生物细胞。

上述L-氨基酸酰胺水解酶具有通过水解L-氨基酸酰胺形成L-氨基酸的活性，以及通过利用L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作底物生产二肽的活性。

图1是本发明二肽生产方法的流程图。

首先，在一种培养基中培养具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物，并且在所述培养物和/或细胞中生产并且积累L-氨基酸酰胺水解酶(步骤S1)。

然后，通过回收并且纯化L-氨基酸酰胺水解酶，生产纯化的L-氨基酸酰胺水解酶(步骤S2)。

然后，通过将L-氨基酸酰胺和L-氨基酸添加到在步骤S2中生产的纯化的L-氨基酸酰胺水解酶或在步骤S1中积累的L-氨基酸酰胺水解酶中，并且让反应能够进行(步骤S3)，可以大量生产二肽。

对于通过上述微生物生产L-氨基酸酰胺水解酶的方法来说，让所述微生物作用于L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，可以在培养上述微生物时将所述底物直接添加到培养液中，或者通过离心等从细菌培养物中分离微生物细胞，然后直接或者在洗涤之后将它们重新悬浮在缓冲液中，并且添加L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，然后让所得到的混合物起反应。另外，可以使用已通过已知方法用聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶、藻酸凝胶等固定的微生物细胞。

另外，可以将破碎的微生物细胞、丙酮处理过的微生物细胞或冷冻干燥的微生物细胞用作处理过的微生物细胞制品。将诸如超声波破碎、弗氏压力破碎和玻璃珠破碎的方法用于破碎微生物细胞，不过，在裂解微生物细胞的场合下，可以使用卵白溶菌酶的方法，肽酶处理或它们的合适的组合。

另外，可以从处理过的微生物细胞制品中回收L-氨基酸酰胺水解酶，并且用作粗制酶液体，或者在必要时，在使用之前纯化所述酶。可以用普通酶纯化方法纯化从培养物中获得的酶。更具体地讲，通过离心分离等方法收集微生物细胞，然后通过机械方法破碎所述细胞，如超声波处理，玻璃珠或动力磨(dynomill)，并且通过离心分离除去诸如细胞片段的固体材料，以便获得粗制酶，然后通过进行超级离心分离、盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析、疏水性层析等，纯化上述L-丙氨基酸酰胺水解酶。

就是说，当一种级份具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性时，可以使用整个的酶和含有酶的物质。在本文中，“含有酶的物质”表示含有所述酶的任何物质，并且包括诸如能产生所述酶的微生物的培养物、从所述培养物中分离的微生物细胞和处理过的微生物细胞的具体形式。微生物培养物表示通过培养微生物获得的物质，更具体地讲，表示微生物细胞、用于培养所述微生物的培养基和由所培养的微生物生产的物质的混合物。另外，可以洗涤所述微生物细胞，并且用作洗涤过的微生物细胞，或者可以使用已通过共价连接、吸附或包含方法固定的固定化细胞。另外，由于根据所使用的微生物，某些微生物在培养期间被部分裂解，在这种情况下，还可以将培养上清液用作含有酶的物质。

所使用的酶或含有酶的物质的量，应当是能够表现出预期作用的量(以下称之为“有效量”)，尽管该有效量可以由本领域普通技术人员通过简单的初步实验方便地加以确定，在使用洗涤过的细胞的场合下，举例来说，所述使用量为每升反应混合物1-500克(g)。

任何L-氨基酸酰胺都可用作所述L-氨基酸酰胺，只要它是能够被L-氨基酸酰胺水解酶的底物专一性水解的L-氨基酸酰胺就行。L-氨基酸酰胺的例子不仅包括相当于天然存在的氨基酸的L-氨基酸酰胺，而且还包括相当于非天然存在的氨基酸或它们的衍生物的L-氨基酸酰胺。另外，由于用于本发明的L-氨基酸酰胺水解酶通过非对称地水解消旋L-氨基酸酰胺产生L-氨基酸，还可以使用Strecker方法廉价合成的消旋氨基酸酰胺。在本发明中，L-氨基酸酰胺的优选例子包括L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸酰胺，特别优选的是L-丙氨酸酰胺。

对L-氨基酸没有具体限制，只要它能通过L-氨基酸酰胺水解酶的底物专一性作用与L-氨基酸酰胺形成二肽就行，并且可以使用已知的L-氨基酸。L-氨基酸的优选例子包括L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-酪氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，和L-谷氨酰胺，特别优选L-谷氨酸和L-天冬酰胺。

可以通过选择上述每一种L-氨基酸酰胺和L-氨基酸中的一种类型生产二肽，或者可以通过筛选两种以上类型生产二肽。

被用作原始材料的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸的浓度分别为1mM-10M，优选0.1-2M。不过，在某些场合下，所添加的L-氨基酸的数量优选等于或大于L-氨基酸酰胺的数量。另外，在必要时，例如，在高浓度底物抑制所述反应的场合下，在将它们调整到不会导致抑制作用的浓度之后，可以在反应期间连续添加所述底物。

反应温度为10-70℃，优选20-50℃，反应pH为2-12，优选3-11。通过以这种方式进行所述反应大约2-48小时，在反应混合物中产生并且积累了二肽。由于所述二肽生产反应是一种平衡反应，为了实现有效生产，通过分离所生产的二肽和氨让所述反应继续进行。

实施例

下面将通过实施例形式对本发明作更详细地说明。不过，不应当将本发明理解成局限于这些实施例。应当指出的是，在所述实施例中，L-丙氨酸，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-天冬酰胺的定量测定，是通过使用高效液相层析的方法进行的(柱：Inertsil ODS-2，由GLScience生产，洗脱液：含水磷酸溶液(pH 2.1)，2.5mM 1-辛烷磺酸钠/甲醇＝10/1，流速：1.0mL/分钟，检测：210纳米(nm))。

实施例1 L-丙氨酰-L-天冬酰胺的生产

将含有0.5％(w/v)酵母膏，0.5％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)甘油，0.5％(w/v)氯化钠和0.5％(w/v)L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐(pH 7.0)的500毫升(mL)等份样品，分装到500mL坂口烧瓶中，并且在120℃下灭菌20分钟。将一整环表1所示的微生物接种到上述培养基中，并且在30℃和120次冲程/分钟的条件下摇晃培养20小时，在接种之前，所述微生物在含有0.5％(w/v)酵母膏，0.5％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)甘油，0.5％(w/v)氯化钠，0.5％(w/v)L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和2％(w/v)琼脂(pH 7.0)的斜面培养基上，在30℃下培养了24小时。在所述培养之后，通过离心分离所述微生物细胞，用与培养液等量的生理盐水洗涤2次，并且再次离心，以便收集所述微生物细胞，然后用0.2M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)悬浮，达到10mL的最终体积。然后将1mL的该微生物细胞悬浮液添加到4mL含有62.5mM L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和250mM L-天冬酰胺的上述缓冲液中，在将总体积调整到5mL之后，让它在30℃下反应24小时。作为对照实验建立了一个在其中不添加微生物细胞的实验组。结果如表1所示。

表1

微生物	生产的L-Ala-L-Asn(mM)
微生物	生产的L-Ala-L-Asn(mM)	巨大芽孢杆菌FERM BP-8090	0.4
谷氨酸棒杆菌ATCC 13286	1.8	巨大芽孢杆菌FERM BP-8090	0.4

胡萝卜软腐欧文氏菌FERM BP-8089	0.5
胡萝卜软腐欧文氏菌FERM BP-8089	0.5	紫红红球菌ATCC 19149	1.0
脑膜脓毒性黄金杆菌ATCC 13253	0.1	紫红红球菌ATCC 19149	1.0
脑膜脓毒性黄金杆菌ATCC 13253	0.1	藤黄微球菌ATCC 9341	0.1
嗜糖假单胞菌ATCC 9114	0.1	藤黄微球菌ATCC 9341	0.1
嗜糖假单胞菌ATCC 9114	0.1	浅白隐球酵母IFO 610	1.8
细长丝孢酵母菌ATCC 24660	2.5	浅白隐球酵母IFO 610	1.8
细长丝孢酵母菌ATCC 24660	2.5	双倒卵形红冬孢酵母ATCC 22264	2.7
赭色掷孢酵母IFO 1038	1.5	双倒卵形红冬孢酵母ATCC 22264	2.7
赭色掷孢酵母IFO 1038	1.5	茶银耳IFO 9297	3.3
戴耳有孢圆酵母IFO 1083	2.9	茶银耳IFO 9297	3.3
戴耳有孢圆酵母IFO 1083	2.9	Sterigmatomyces elviae IFO 1843	0.1
Rhodotorula ingeniosa ATCC 22993	0.1	Sterigmatomyces elviae IFO 1843	0.1
Rhodotorula ingeniosa ATCC 22993	0.1	未添加微生物细胞	低于检测极限

L-Ala-L-Asn：L-丙氨酰-天冬酰胺

实施例2从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286中纯化L-丙氨酸酰胺水解酶

按下文所述方法进行酶效价的测定。添加200微摩尔Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，50微摩尔L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和合适数量的酶液体，并且混合，将最终体积调整到1ml，并且让它在30℃下反应60分钟。然后，添加4ml含水磷酸溶液(pH 2.1)，以便终止该反应。通过高效液相层析对所产生的L-丙氨酸进行定量。将在1分钟内产生1微摩尔的L-丙氨酸的酶的数量定义为1个酶单位。

按与实施例1相同的方法培养8升谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13286，然后通过离心分离收集微生物细胞。以下过程是在冰上或在4℃下进行的。在用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤所述微生物细胞之后，用直径为0.1mm的玻璃珠对所述细胞进行大约10分钟的破碎处理。然后分离所述玻璃珠和破碎的细胞液体，并且通过以20,000×g的速度离心分离30分钟，除去破碎的细胞片段，以便获得无细胞提取物。另外，通过以200,000×g的速度超速离心60分钟，除去不溶性级份，以便获得上清液形式的可溶性级份。然后将硫酸铵添加到所得到的可溶性级份中，使其达到60％的饱和度，然后通过以20,000×g的速度离心30分钟回收沉淀物。将所得到的沉淀物溶解在少量50mM的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，并且用50mM的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)透析。将该酶溶液加样到用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)预平衡的Q-Sepharose HP柱上，并且用含有0-1.0M氯化钠的线性浓度梯度的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗脱所述酶。收集活性级份，并且加样到用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)预平衡的Superdex200pg柱上，并且用相同的缓冲液洗脱所述酶。收集活性级份，并且用含有0.5M硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)透析，然后加样到用含有0.5M硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)预平衡的苯基-Sepharose HP柱上。然后用含有0.5-0M硫酸铵的线性浓度梯度的20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗脱所述酶。收集活性级份，并且用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)透析，然后将透析物加样到用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)预平衡的MonoQ柱上，用0-1.0M氯化钠的线性浓度梯度的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗脱酶。L-丙氨酸酰胺水解酶是以这种方式根据电泳均匀纯化的。在表2中示出了蛋白的总量以及每一个纯化步骤的活性。

表2

步骤	总活性(单位)	总蛋白(mg)	比活性(单位/mg)
步骤	总活性(单位)	总蛋白(mg)	比活性(单位/mg)	无细胞提取物	80	2000	0.040
可溶性级份	71	1690	0.042	无细胞提取物	80	2000	0.040
可溶性级份	71	1690	0.042	硫酸铵级份	79	1080	0.073
Q-Sepharose HP	56	379	0.149	硫酸铵级份	79	1080	0.073
Q-Sepharose HP	56	379	0.149	Superdex200pg	21	151	0.135
苯基-Sepharose HP	12.5	6.60	1.897	Superdex200pg	21	151	0.135
苯基-Sepharose HP	12.5	6.60	1.897	MonoQ	2.4	0.24	9.841

实施例3评估L-丙氨酸水解酶的分子量

将按照实施例2的方法获得的等同的0.5微克(μg)纯化的酶制剂用于聚丙烯酰胺电泳。在电泳缓冲液中使用0.3％(w！v)Tris，1.44％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)月桂基硫酸钠，使用凝胶浓度为10-20％的浓度梯度凝胶(Multigel 10-20，由Dauchi Pure Chemicals生产)用于所述聚丙烯酰胺凝胶，并且用精确预染色的标准物(由Biorad生产)作为分子量标记。在电泳结束之后，用考马斯亮兰R-250对所述凝胶进行染色，并且检测单一的带，在该位点上计算出它具有42,000-46,000的分子量。

实施例4L-丙氨酸酰胺水解酶的最佳pH的评估

用在实施例2中均匀纯化的L-丙氨酸酰胺水解酶水解L-丙氨酸酰胺，然后按以下方法评估能产生L-丙氨酸的反应的pH。添加包括乙酸钠缓冲液(pH 3.0-6.0)，磷酸钾缓冲液(pH 6.0-8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH7.0-9.0)，碳酸钠缓冲液(pH 8.0-10.0)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的200μmol的缓冲液，50μmol L-丙氨酸酰胺水解酶氢氯酸盐和适量的酶溶液，并且混合到1ml的最终体积，然后让它们在30℃下反应60分钟，并且评估酶活性。在图2中示出使用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)确定100％活性值的结果。

实施例5评估L-丙氨酸酰胺水解酶反应温度

用按实施例2方法均匀纯化的L-丙氨酸酰胺水解酶水解L-丙氨酸酰胺，然后按以下方法评估能产生L-丙氨酸的反应的反应温度。然后添加200μl Tris-HCl缓冲液，50μmol L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和适量的酶，并且混合到1ml的最终体积，然后在25，30，40，50或60℃的温度下，让它们反应60分钟，并且评估酶活性。在图3中示出了在40℃的反应温度下确定的100％活性值的结果。

实施例6L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产

让按实施例2方法均匀纯化的L-丙氨酸酰胺水解酶作用于L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和L-天冬酰胺或L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐和L-谷氨酰胺，以便生产L-丙氨酰-L-天冬酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。为了获得L-丙氨酰-L-天冬酰胺，添加200μmol Tris-HCI缓冲液(pH 9.0)，50μmol或L-丙氨酸酰胺氢氯酸盐，150μmol L-天冬酰胺和含有0.08个单位的L-丙氨酸酰胺水解酶的酶溶液，并且混合到1ml的最终体积。为了获得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，以与为了获得相同的条件混合反应物，所不同的是，用150μmol L-谷氨酰胺取代了150μmol的L-天冬酰胺。用一种底物建立了上述实验的对照实验，或者建立不添加酶的实验组。在30℃下的反应温度下让所述反应进行10小时，并且在表3中示出了对所述目标产物进行定量的结果。

表3

实施例7L-丙氨酸酰胺水解酶基因的分离

下面，将要说明L-丙氨酸酰胺水解酶基因的分离和L-丙氨酸酰胺水解酶在大肠杆菌(E.coil)中的表达。将谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286用作微生物菌株。将大肠杆菌JM109用作宿主细胞，并且将pUC18用作基因分离和L-丙氨酸酰胺水解酶表达的载体。

1.根据确定的氨基酸序列生产PCR引物

分别具有SEQ ID No.：2和SEQ ID No.：3所示碱基序列的混合引物是根据源于上述谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286的L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基序列生产的。

2.微生物细胞的获得

在30℃下在CM2Gly琼脂培养基(0.5g/dl甘油，1.0g/dl酵母膏，1.0g/dl蛋白胨，0.5g/dl NaCl，2g/dl琼脂，pH 7.0)上培养谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286 24小时，以便恢复所述微生物。然后将一整环的所述微生物接种到装有CM2Gly液体培养基的500ml体积的坂口烧瓶中，然后在30℃，在通气条件下摇晃培养16小时。

3.从微生物细胞中获得染色体DNA

对50ml培养液进行离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，以便收集所述微生物细胞。然后将所述微生物细胞悬浮在10ml含有20mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，然后通过离心分离回收所述微生物细胞。将所述微生物细胞重新悬浮在10ml含有20mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中。另外，在将0.5ml的20mg/ml溶菌酶溶液和1ml的10％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液添加到该悬浮液中之后，在55℃下培养该溶液20分钟。然后通过添加等体积的用含有1mMEDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)饱和的苯酚对培养的溶液进行脱蛋白化。将等体积的2-丙醇添加到所分离的含水层中，以便使DNA沉淀，然后回收所沉淀的DNA。将沉淀的DNA溶解在0.5ml含有20mMEDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，然后添加5μl的10mg/mlRNase和5μl的10mg/ml蛋白酶K，并且使其在55℃下反应2小时。在反应之后，通过添加等体积的含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)饱和的苯酚使该溶液脱蛋白化。另外，将等体积的24∶1的氯仿/异戊醇添加到分离的含水层中，以便回收所述含水层。向重复以上过程两次所获得的含水层中添加3M乙酸钠溶液(pH5.2)，并且将最终浓度调整为0.4M，并且添加2倍体积的乙醇。回收以沉淀形式产生的DNA，并且在用70％乙醇洗涤之后，进行干燥，并且溶解在1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中。

4.通过盒式(Cassette)PCR方法获得包括L-丙氨酸酰胺水解酶基因的部分的DNA片段

使用盒式PCR方法，将TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(TakaraShuzo)用于分离和扩增含有编码L-丙氨酸酰胺水解酶的基因(aah)的DNA分子。除非另有专门说明，有关实验是根据在所述手册中披露的方法进行的。在盒式PCR方法中，在用引物1(1st PCR，SEQ ID No.：2)和引物2(2nd PCR，SEQ ID No.：3)作为引物时，用Eco RI盒扩增了大约0.5kb的带(片段1)。

作为确定该片段碱基序列的结果，证实了片段1是aah的一部分。

5.克隆来自基因文库的L-丙氨酸酰胺水解酶基因

为了获得完整长度的aah，首先用片段1作探针进行了Southern杂交。

被用作探针的DNA片段被制备成大约50纳克/微升(ng/ml)，并且通过在37℃下将16μl的该DNA溶液与DIG High Prime(Boehringer-Mannheim)一起培养24小时对所述探针进行标记，使用所述方案。

通过组合各种限制酶彻底消化1μg的染色体DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，然后吸印到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim，带正电荷的尼龙膜)。然后按照已确定的方法进行Southern杂交。杂交是用DIGEasy Hyb(Boehringer-Mannheim)进行的，并且在50℃下杂交30分钟之后，添加所述探针，然后在50℃下杂交18小时。用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)进行检测。

结果，在Bgl II裂解产物的大约7kb的位置上检测到一条带。收集该7kb的结构域片段，并且连接在pUC18上，以便用大肠杆菌JM109产生一种文库(120个菌株)。然后按照建立的方法进行菌落杂交。然后将所述菌落转移到尼龙膜滤膜上(Boehringer-Mannheim，用于菌落和噬斑杂交的尼龙膜)，然后进行碱性变性，中和，和固定化处理。用DIGEasy Hyb进行杂交。将所述滤膜浸泡在一种缓冲液中，并且在42℃下预杂交30分钟。然后，添加上述标记过的探针，随后在42℃下杂交18小时。在用SSC缓冲液洗涤之后，用DIG核苷酸检测试剂盒选择了一个阳性克隆。

6.源于谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286的L-丙氨酸酰胺水解酶基因的碱基序列

按照披露于以下文献中的方法制备由所选择的转化体保留的质粒：Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)，并且确定靠近与所述探针杂交的部位的碱基序列。存在一个开放读框(ORF)，它所编码的蛋白含有L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基酸的30个残基，并且证实它是编码L-丙氨酸酰胺水解酶的基因aah。在序列表的SEQ ID No.：4中示出了完整长度L-丙氨酸酰胺水解酶基因的碱基序列。在用Genetyx检查所得到的ORF的同源性时，所述碱基序列表现出与源于丙酸杆菌属细菌的已知脯氨酸亚氨基肽酶具有57.6％的同源性。

实施例8在大肠杆菌中表达L-丙氨酸酰胺水解酶基因

构建了与pUC 18的lac启动子的aah下游连接的质粒pUCAAH，以便在大肠杆菌中表达aah。用Sac I和Sma I处理用谷氨酸棒杆菌ATCC 13286的染色体DNA作模板，并且用表4所示寡核苷酸作引物通过PCR扩增的片段，并且连接到Sac I-和Sma I-裂解的pUC18产物上，然后用于转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性菌株中筛选具有靶质粒的菌株，并且将所构建的表达质粒命名为pUCAAH。

表4

用于构建L-丙氨酸酰胺水解酶表达载体的引物

接种能在具有pUCAAH的大肠杆菌中表达L-丙氨酸酰胺水解酶的转化体，并且在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下培养16小时。将1ml该预培养液体接种到装有50ml LB培养基中的500ml坂口烧瓶中，然后在37℃下进行最后培养。在开始培养之后2小时，以1mM的最终浓度添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，然后再培养3小时。在所述培养结束之后，收集微生物，并且洗涤，悬浮在10ml 20mM磷酸缓冲液(pH 8.0)中，然后以180W的功率进行超声波破碎30分钟。回收所述溶液，并且以12,000rpm的速度离心10分钟，并且将所得到的上清液用作无细胞提取物。

实施例9测定L-丙氨酸酰胺水解酶的活性

在所述培养结束之后，制备无细胞提取物，并且用它作为酶源，确定L-丙氨酸酰胺水解酶的活性。L-丙氨酸酰胺水解酶活性的测定是通过以下方法进行的：在30℃下培养含有50mM L-丙氨酸酰胺，150mML-谷氨酰胺，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶溶液的反应混合物60分钟，然后通过添加相当于所述反应物4倍体积的含水磷酸(pH 1.5)终止该反应。通过HPLC确定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量。对于酶活性的单位来说，将在这种条件下，在1分钟产生1μmol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性定义为1个单位(U)。

用于分析的HPLC的条件如下文所述。

柱：Inertsil ODS-2

移动相：(含水磷酸溶液(pH 2.1))，2.5mM 1-辛烷磺酸钠/甲醇＝10/1

柱温度：40℃

流速：1.0ml/分钟

检测：UV，210nm

结果，在插入pUC18 AAH时检测到了0.05U/mg L-丙氨酸酰胺水解酶活性，因此证实了克隆的aah在大肠杆菌中的表达。另外，作为对照，在仅插入PUC18检测不到活性。

实施例10 His-标记的L-丙氨酸酰胺水解酶基因在大肠杆菌中的表达

构建能表达L-丙氨酸酰胺水解酶的质粒pQEAAH作为pUC的lac启动子的His-Taq蛋白下游，以便在大肠杆菌中表达aah。用Sac I和Sma I处理用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13286的染色体DNA作模板，并且用图5所示寡核苷酸作引物通过PCR扩增的片段，并且连接到用Sac I-Sma I-裂解的pQE-30(Qiagen)的产物上，并且用所得到的连接产物转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性菌株中筛选具有所述靶质粒的菌株，并且将所构建的表达质粒定义为pQEAAH。

表5

用于构建His-标记L-丙氨酸酰胺水解酶表达载体的引物

当按上述方法测定在具有pQEAAH的大肠杆菌中表达的L-丙氨酸酰胺水解酶的转化体的活性时，发现它具有0.48U/mg的L-丙氨酸酰胺水解酶活性。

实施例11 His-标记纯化酶的制备

按照上述方法破碎来自具有pQEAAH的大肠杆菌JM109的100ml培养液的微生物细胞，并且用His Trap试剂盒(由Amersham PharmaciaBiotech生产)，按照该试剂盒提供的方案纯化His-标记的L-丙氨酸酰胺水解酶。获得了24毫克蛋白，它在SDS-PAGE上表现出一条带，并且该蛋白的L-丙氨酸酰胺水解酶的比活性为13.4U/mg。与L-丙氨酸酰胺相比，Ala-Gln的产率为7.2％。

实施例12用His-标记纯化的酶研究底物专一性

用His-标记纯化的酶研究了所获得的L-丙氨酸酰胺水解酶对除了实施例6所示L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以外的肽的合成。

(1)L-丙氨酸酰胺和其他L-氨基酸的肽合成

通过在25℃下培养含有100mM L-丙氨酸酰胺，150mM实验氨基酸，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶溶液(0.0045U/ml)3小时，实施所述合成反应，然后通过HPLC定量所生产的肽。结果，除了L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺之外，产生了下面所示出的多种其他的肽。在用甘氨酸作为实验氨基酸时，合成了7.54mM L-丙氨酰-甘氨酸，在使用L-丙氨酸时，合成了10.11mM L-丙氨酰-L-丙氨酸，在使用L-缬氨酸时，合成了9.72mM L-丙氨酰-L-缬氨酸，在使用L-亮氨酸时，合成了9.60mM L-丙氨酰-L-亮氨酸，在使用L-异亮氨酸时，合成了14.11mM L-丙氨酰-L-异亮氨酸，在使用L-甲硫氨酸时，合成了14.49mM L-丙氨酰-L-甲硫氨酸，在使用L-脯氨酸时，合成了0.81mM L-丙氨酰-L-脯氨酸，在使用L-苯丙氨酸时，合成了13.42mM L-丙氨酰-L-苯丙氨酸，在使用L-色氨酸时，合成了10.09mML-丙氨酰-L-色氨酸，在使用L-丝氨酸时，合成了24.67mM L-丙氨酰-L-丝氨酸，在使用L-苏氨酸时，合成了20.76mM L-丙氨酰-L-苏氨酸，在使用L-酪氨酸时，合成了1.52mM L-丙氨酰-L-酪氨酸，在使用L-赖氨酸时，合成了18.83mM L-丙氨酰-L-赖氨酸，在使用L-精氨酸时，合成了27.69mM L-丙氨酰-L-精氨酸，在使用L-组氨酸时，合成了12.52mML-丙氨酰-L-组氨酸，在使用L-谷氨酸时，合成了1.20mM L-丙氨酰-L-谷氨酸。

(2)由其他L-氨基酸进行的肽合成和用甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸-α-酰胺取代L-丙氨酸酰胺进行的L-谷氨酰胺肽合成。

通过在25℃下培养含有100mM实验氨基酸酰胺，150mM L-谷氨酰胺，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶(0.0045U/ml)的反应混合物3小时，进行所述合成反应，然后通过HP LC定量所产生的肽。结果，在使用甘氨酸酰胺时，合成了17.7mM甘氨酰-L-谷氨酰胺。另外，在使用L-天冬氨酸-α-酰胺时，产生了21.2mM α-L-天冬氨酰-谷氨酰胺。

正如上文所述，已明确证实了按上述方法获得的L-丙胺酸酰胺水解酶能够使用各种类型的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作为底物。因此，明确证实了将所得到的酶称为L-氨基酸酰胺水解酶比将它称作L-丙氨酸酰胺水解酶更为合适。

[序列表]

SEQ ID No.：1：源于谷氨酸棒杆菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基酸序列

SEQ ID No.：2：PCR引物

SEQ ID No.：3：PCR引物

SEQ ID No.：4：源于谷氨酸棒杆菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的CDS序列

SEQ ID No.：5：源于谷氨酸棒杆菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的氨基酸序列

SEQ ID No.：6：引物

SEQ ID No.：7：引物

SEQ ID No.：8：引物

工业应用性

根据本发明的二肽生产方法，可以使用能够较廉价地获得的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽，而不进行复杂的合成方法。这样，可以降低可用作药物材料，功能食品等的二肽的生产成本。另外，根据本发明的二肽生产方法，可以用各种类型的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作为原材料生产各种类型的二肽。另外，本发明的L-氨基酸酰胺水解酶，优选被用于本发明的二肽生产方法中。

序列表

<110>味之素公司

<120>二肽生产方法，所用的L-氨基酸酰胺水解酶，以及L-氨基酸酰胺水解酶生产方法

<130>PAMA-14170

<150>日本专利申请2001-226568

<151>2001-07-26

<150>日本专利申请2001-310547

<151>2001-10-05

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>1

Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu

1 5 10 15

Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Xaa Arg Xaa Glu Xaa

20 25 30

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：盒式PCR引物1

<400>2

gghwsnytbc arytbgarga ratyac 26

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：盒式PCR引物2

<400>3

carytbgarg aratyacbyt bacbytb 27

<210>4

<211>1307

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(57)..(1295)

<400>4

ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt ccacccctgc gcgtaacctg ggaagc atg 59

Met

1

act aaa aca ctt ggt tcc ctt caa ctt gaa gaa att acc ttg acg ctc 107

Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu

5 10 15

cct ctg act gaa gat gtg gcc gat gaa cgc acc att gat gtg ttc gca 155

Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe Ala

20 25 30

cgc att gcc aca cgc gtc ggt ggg gaa gac ctt cca tat tta gta ttc 203

Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val Phe

35 40 45

ctg cag ggt ggg cct ggc aat gaa gct cca cgt cca agc ctt aat ccc 251

Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn Pro

50 55 60 65

ctc aac ccc aat tgg ttg ggc gtg gcc ttg gag gaa tac cgc gtg gtc 299

Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val Val

70 75 80

atg ttg gat caa cgt ggc acc ggc cgt tcc acc cca gtg ggt aat gat 347

Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn Asp

85 90 95

att ttg gaa aaa ccc aca gca gaa gta gtg gag tac tta tcc cac ctg 395

Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His Leu

100 105 110

cgc gca gat ggc att gtg cga gat gct gaa gcc ctg cgt aag cat ttg 443

Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His Leu

115 120 125

ggt gtg aat cag tgg aac ctt tta ggc cag tcc ttc gga ggt ttc acc 491

Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe Thr

130 135 140 145

acc ctg cat tac ttg tcc cgg cac gcc gat tcc ttg gac aac gtg ttt 539

Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val Phe

150 155 160

att acc ggc ggt ctc agc gct att gat cgc cca gca gaa gac gtg tat 587

Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val Tyr

165 170 175

gcc aac tgt tac aac cgc atg cgc cga aac tct gag gaa ttc tac cgt 635

Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr Arg

180 185 190

cgc ttc ccg caa tta cgg gaa act ttc cga ggg ttg gtt aat cgt gct 683

Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg Ala

195 200 205

cgc gcc ggg gag att gtg ctt ccc acc ggc gaa gtt gtg tca gaa acc 731

Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu Thr

210 215 220 225

agg ctg cga tcc ctt ggt cac ttg ttg ggt agc aat gac ggc tgg ttt 779

Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Phe

230 235 240

gat ctg tac aac ctg ctg gaa tta gat ccc acc tcc aac gct ttt gtc 827

Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe Val

245 250 255

cat gac ctg gca gga ctt ttg cct ttc ggc aac cgc aac cca att tat 875

His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile Tyr

260 265 270

tac gtg ctc cat gag tcc tct tac gcc gac ggt gtg gtg aca aat tgg 923

Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn Trp

275 280 285

gca gca gag cgt gtg ctt cca gag gat ttc cgc gag gat cca aca ctg 971

Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr Leu

290 295 300 305

ctc acc ggt gag cac gtg ttc cag gag tgg aca gac acc gtg ccg tcg 1019

Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro Ser

310 315 320

ctc aag ccg tgg aag gac gtt gcc ctg gca ttg gct cag cag gaa tgg 1067

Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu Trp

325 330 335

ccc aag ctt tat gat gcg aag gca ttg gaa aac tca cag gcc aag ggc 1115

Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys Gly

340 345 350

gct gca gca gtg tat ghc aat gac gtt ttc gtc cca gtg gat tac tct 1163

Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr Ser

355 360 365

ctg gaa acc gca caa cac ctg ccc ggt gtg cag ctg ttt atc acc agc 1211

Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr Ser

370 375 380 385

cag cat gaa cac aat gga ctt cgt gcc agc tca ggc gca gta ctg rag 1259

Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu Xaa

390 395 400

cac ctt ttc gat ctg gcc cac ggc cga gag gta cgc tgagggcccc cg 1307

His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg

405 410

<210>5

<211>413

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>5

Met Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr

1 5 10 15

Leu Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe

20 25 30

Ala Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val

35 40 45

Phe Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn

50 55 60

Pro Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn

85 90 95

Asp Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His

100 105 110

Leu Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His

115 120 125

Leu Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe

130 135 140

Thr Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val

145 150 155 160

Phe Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val

165 170 175

Tyr Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg

195 200 205

Ala Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu

210 215 220

Thr Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp

225 230 235 240

Phe Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe

245 250 255

Val His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile

260 265 270

Tyr Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn

275 280 285

Trp Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr

290 295 300

Leu Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro

305 310 315 320

Ser Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu

325 330 335

Trp Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys

340 345 350

Gly Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr

355 360 365

Ser Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr

370 375 380

Ser Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu

385 390 395 400

Xaa His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg

405 410

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

cgggggccct cagcgtacct ctcggccgtg 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

ggcgagctca tgactaaaac acttggttcc 30

1

Claims

1. 一种二肽生产方法，包括：利用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含有酶的物质，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽，其中酶或含有酶的物质是选自下列的一种或两种以上类型：具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的微生物培养物，从所述培养物中分离的微生物细胞，以及来自所述微生物的微生物细胞处理物。

2. 如权利要求1的二肽生产方法，其中微生物属于芽孢杆菌属，棒杆菌属，欧文氏菌属，红球菌属，黄金杆菌属，微球菌属，假单胞菌属，隐球菌属，丝孢酵母属，红冬孢酵母属，掷孢酵母属，银耳属，有孢圆酵母属，梗孢酵母属或红酵母属。

3. 如权利要求1的二肽生产方法，其中酶是蛋白(A)或(B)：

(A)氨基酸序列组成为序列表中SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白；和

(B)一种蛋白，其氨基酸序列组成为在序列表中SEQ ID No.：5的氨基酸序列上包括1-10个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且该蛋白具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

4. 如权利要求1的二肽生产方法，其中酶是由(C)的DNA编码的蛋白：

(C)能在相当于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度的严格条件下与由和序列表中的SEQ ID No.：4所示碱基序列的57-1295号碱基互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA，所述活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

5. 如权利要求1的二肽生产方法，其中微生物是经转化而能够表达蛋白(A)、(B)或(C)的微生物：

(A)氨基酸序列组成为序列表中SEQ ID No.：5所示氨基酸序列的蛋白；

(B)一种蛋白，其氨基酸序列组成为在序列表中SEQ ID No.：5的氨基酸序列上包括1-10个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且该蛋白具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应；和

(C)由一种DNA编码的蛋白，该DNA能在相当于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度的严格条件下与由和序列表中的SEQ ID No.：4所示碱基序列的57-1295号碱基互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，这种活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生产二肽的反应。

6. 如权利要求1-5中任意一项的二肽生产方法，其中L-氨基酸酰胺是选自L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸-α-酰胺的一种或两种以上的类型。

7. 如权利要求1-5中任意一项的二肽生产方法，其中L-氨基酸是选自下列的一种或两种以上类型：L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-酪氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸和L-谷氨酸。