KR20040023686A - 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법 - Google Patents

펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법 Download PDF

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KR20040023686A KR10-2004-7001175A KR20047001175A KR20040023686A KR 20040023686 A KR20040023686 A KR 20040023686A KR 20047001175 A KR20047001175 A KR 20047001175A KR 20040023686 A KR20040023686 A KR 20040023686A
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Abstract

본 발명은 염가로 입수할 수 있는 출발원료를 사용하여 공업적으로 유리하면서 간편한 경로로 디펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체 또는 당해 미생물의 균체 처리물을 사용하여 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 제조한다.

Description

펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및 디펩타이드의 제조방법{Peptide synthase gene, peptide synthase and process for producing dipeptide}
디펩타이드는 의약품 재료, 기능성 식품 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다. 예를 들면, L-알라닐-L-글루타민은 무혈청 배지의 성분으로서 유용하고, L-글루타민과 비교하여 안정적이며 수용성도 높아서 수액(輸液) 성분에 사용된다.
디펩타이드의 제조법으로는 통상적으로 화학합성법이 공지되어 있지만 이의 제조법이 반드시 간편한 것은 아니다. 예를 들면, N-벤질옥시카보닐알라닌(이하, Z-알라닌이라고 칭한다)과 보호 L-글루타민을 사용하는 방법[참고문헌: Bul1. Chem. Soc. Jpn., 34, 739(1961), Bul1. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966(1962)], Z-알라닌과 보호 L-글루탐산-γ-메틸에스테르를 사용하는 방법[참고문헌: Bul1. Chem.Soc. Jpn., 37, 200(1964)], Z-알라닌에스테르와 비보호 글루탐산을 사용하는 방법[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평) 1-96194호], 2-치환-프로피오닐할로이드를 원료로 하여 N-(2-치환)-프로피오닐글루타민 유도체를 중간체로 하여 합성하는 방법[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)6-234715호] 등이 공지되어 있다.
그러나 상기 어느 방법에서도 보호그룹의 도입 및 탈리, 또는 중간체의 합성이 필요하며 공업적으로 유리하고 충분하게 만족할 수 있는 제조방법은 아니다. 효소를 사용하는 디펩타이드의 대표적 제조법으로는 N-보호, C-비보호의 카복시 성분과 N-비보호, C-보호의 아민 성분을 사용하는 축합반응(반응 1) 및 N-보호, C-보호의 카복시 성분과 N-비보호, C-보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 2)이 공지되어 있고, 반응 1의 예로는 Z-아스파라긴산과 페닐알라닌메틸에스테르로부터의 Z-아스파르틸페닐알라닌메틸에스테르의 제조방법[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(소) 53-92729호], 반응 2의 예로는 아세틸페닐알라닌에틸에스테르와 로이신아미드로부터의 아세틸페닐알라닐로이신아미드의 제조방법[참고문헌: Biochemical J., 163, 531(1977)]을 들 수 있다. N-비보호, C-보호의 카복시 성분을 사용하는 방법의 연구보고 예는 매우 적으며 N-비보호, C-보호의 카복시 성분과 N-비보호, C-보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 3)의 예로는 특허 WO 90/01555가 있고, 예를 들면, 아르기닌에틸에스테르와 로이신아미드로부터의 알기닐로이신아미드의 제조방법을 들 수 있다. N-비보호, C-보호의 카복시 성분과 N-비보호, C-비보호의 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 4)의 예로는 특허 EP 278787A가 있고, 예를 들면, 티로신에틸에스테르와 알라닌으로부터의 티로실알라닌의 제조방법을 들 수있다. 이들 방법 중에서 가장 염가인 제조방법이 될 수 있는 것은 당연하게 보호그룹의 수가 가장 적은 반응 4의 범주에 들어가는 반응이다.
그러나 반응 4의 선행기술 예(특허 EP 278787A)에 사용하는 효소는 곰팡이, 식물 유래의 비교적 비싼 카복시펩티다제 표준품을 사용하고 있으며, 생산되는 디펩타이드도 비교적 소수도가 높은 아미노산을 함유하는 것이다. 반응 4에서 세균 및 효모 유래의 효소를 사용하는 방법은 전혀 공지되어 있지 않으며 친수성이 높은 알라닐글루타민이나 알라닐아스파라긴의 제조방법에 대해서도 전혀 공지되어 있지 않다. 이러한 이유로 이들 펩타이드의 공업적인 염가의 제조법 개발이 요망되고 있다.
한편, 프롤린이미노펩티다제는 N-말단에 프롤린을 갖는 펩타이드로부터 이의 N-말단 프롤린을 절단 인출하는 반응을 촉매하는 효소이며, 다수의 생물종에서 이의 존재가 공지되어 있다. 예를 들면, 기니어 피그(뇌)[참고문헌: J. Bio1. Chem., 258, 6147-6154(1983)], 래트(뇌·신장)[참고문헌: Eur. J. Biochem., 190, 509-515(1990)] 등의 고등동물, 살구씨[참고문헌: J. Biochem., 92, 413-421(1982)] 등의 고등식물, 트리코데마 덴테콜라(Trichoderma denticola)[참고문헌: Infect. Immun., 64, 702-708(1996)] 등의 구강 파상균, 페니실리움 등의 사상균[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평) 1-215288호], 표고버섯 등의 담자균[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(소) 58-36387호], 스트렙토마이세테스 블리카투스(Streptomycetes blicatus)[참고문헌: Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1250-1255(1992)] 등의 방선균류, 코리네박테리움바리아비리스(Corynebacterium variabilis)[참고문헌: J. App1. Microbio1., 90, 449-456(2001)] 등의 세균 등에 프롤린이미노펩티다제의 존재가 공지되어 있다.
또한, 프롤린이미노펩티다제 유전자도 아슬로박타 니코티아나(Arthrobacter nicotiana)[참고문헌: FEMS Microbio1. Lett., 78, 191-197(1999)], 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평) 2-113887호], 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum)[참고문헌: Arch. Biochem. Biophys., 336, 35-41(1996)], 하프니아 알베이(Hafnia alvei)[참고문헌: J. Biochem., 119, 468-474(1996)], 락토바실러스 데불키(Lactobacillus debrueckii)[참고문헌: Microbiology, 140, 527-535(1994)], 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) 유래[참고문헌: J. Bacterio1., 174, 7919-1925(1994)], 아에로모나스 소부리아(Aeromonas sobria) 유래[참고문헌: J. Biochem., 116, 818-825(1994)], 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)9-12186O호], 나이세리아 코놀로에(Neisseria gonorrhoeae)[참고문헌: Mo1. Microbio1., 9, 1203-1211(1993)], 프로피오니박테리움 프류덴리치(Propionibacterium freundenreichii)[참고문헌: App1. Environ. Micorbio1., 64, 4736-4742(1998)], 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)[참고문헌: J. Biochem., 122, 601-605(1997)] 및 서모플라즈마 아시드필룸(Thermoplasma acidophilum)[참고문헌: FEBS Lett., 398, 101-105(1996)]의 유전자의 클로닝, 염기서열이 보고되어 있다.
또한 최근, 미생물의 전체 게놈 해석에 의해 다수의 생물종에서 프롤린이미노펩티다제를 암호화한다고 추측되는 염기서열이 보고되어 있다. 예를 들면, 슈도모나스 아르기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 게놈 전체 염기서열이 보고되어 있으며[참고문헌: Nature, 406, 959(2000)], 이중에서 프롤린이미노펩티다제를 암호화한다고 추측되는 염기서열이 밝혀지고 있다.
한편, 프롤린이미노펩티다제에 의해 L-프롤린 또는 DL-프롤린의 에스테르와 α-아미노산을 반응시켜 프롤린 함유 디펩타이드를 생성하는 것이 밝혀지고 있다[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)3-13391호]. 그러나, 프롤린이미노펩티다제는 N-말단에 프롤린을 갖는 펩타이드로부터 이의 N-말단 프롤린을 절단 인출하는 반응을 촉매하는 효소이며, 이러한 기질 특이성으로부터 프롤린에스테르와 아미노산으로부터 프롤릴아미노산을 생성하는 것은 당연하다고 생각되지만, 프롤린이미노펩티다제를 사용하여 프롤린 이외의 아미노산에스테르와 아미노산으로부터 펩타이드를 합성하는 것은 전혀 공지되어 있지 않다. 물론, L-알라닌에틸에스테르 염산염 및 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민을 합성하는 것에 대해서도 지금까지 전혀 공지되어 있지 않다. 또한, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주 ATCC 12633의 프롤린이미노펩티다제 부분 염기서열이 공개되어 있지만(AF0 32970) 이의 활성에 관해서는 검출도 포함시켜 전혀 검토되고 있지 않다.
발명의 개시
본 발명은 염가에 입수할 수 있는 출발원료와 염가로 공급할 수 있는 효소원(미생물의 배양물, 미생물 균체, 균체 처리물 등)을 사용하여 공업적으로 유리하면서 간편한 경로로 디펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 프롤린이미노펩티다제가 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 것을 밝혀냈다. 또한, 당해 효소에 관해서 이의 유전자를 클로닝하고 발현함과 동시에 정제 재조합 효소를 사용하여 펩타이드 생성의 넓은 기질 특이성을 명백하게 함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 하기 (A) 또는 (B)의 단백질.
(A) 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(B) 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
[2] 하기(C) 또는 (D)의 단백질.
(C) 서열목록의 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(D) 서열목록의 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
[3] 하기 (E) 또는 (F)의 단백질.
(E) 서열목록의 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(F) 서열목록의 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
[4] 하기 (a) 또는 (b)의 DNA.
(a) 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기번호 57 내지 1295의 염기서열로 이루어진 DNA.
(b) 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기번호 57 내지 1295의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하며, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[5] 하기 (c) 또는 (d)의 DNA.
(c) 서열목록의 서열번호 14에 기재된 염기번호 486 내지 1496의 염기서열로 이루어진 DNA.
(d) 서열목록의 서열번호 14에 기재된 염기번호 486 내지 1496의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하며, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[6] 하기 (e) 또는 (f)의 DNA.
(e) 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기번호 311 내지 1279의 염기서열로이루어진 DNA.
(f) 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기번호 311 내지 1279의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하며, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[7] 엄격한 조건이 1 ×SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도로 60℃에서 세정되는 조건인 상기 [4] 내지 [6]의 어느 한 항에 기재된 DNA.
[8] 상기 [4] 내지 [7]의 어느 한 항에 기재된 DNA가 혼입된 재조합 DNA.
[9] 상기 [4] 내지 [7]의 어느 한 항에 기재된 DNA가 암호화하는 단백질을 발현할 수 있게 도입된 형질전환 세포.
[10] 상기 [9]에 기재된 형질전환 세포를 배지에서 배양하고, 배지중 및/또는 형질전환 세포중에 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 축적시키는 것을 특징으로 하는 디펩타이드 생성 효소의 제조방법.
[11] 상기 [9]에 기재된 형질전환 세포가 생성하는 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 사용하여 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
[12] 상기 L-아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [11]에 기재된 디펩타이드의 제조법.
[13] 상기 L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [11] 또는 [12]에 기재된 디펩타이드의 제조법.
[14] 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질을 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산에 작용시켜 디펩타이드를 합성하는 것을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조법.
[15] 상기 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질이 코리네박테리움속, 슈도모나스속, 바실러스속의 어느 하나에 속하는 미생물에서 유래하는 것을 특징으로 하는 상기 [14]에 기재된 디펩타이드의 제조법.
[16] 상기 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질이 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 바실러스 코아귤란스의 어느 하나로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 상기 [14]에 기재된 디펩타이드의 제조법.
[17] 상기 아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [14] 내지 [16]의 어느 한 항에 기재된 펩타이드의 제조법.
[18] 상기 L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [14] 내지 [17]의 어느 한 항에 기재된 펩타이드의 제조법.
[19] 코리네박테리움속, 슈도모나스속 또는 바실러스속에 속하며 아미노산에스테르와 아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물, 당해 배양물에서 분리한 미생물 균체, 또는 당해 미생물의 균체 처리물을 사용하여 아미노산에스테르와 아미노산으로부터 디펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조방법.
[20] 상기 아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [19]에 기재된 펩타이드의 제조법.
[21] 상기 L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 [19]에 기재된 펩타이드의 제조법.
본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 염가에 디펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이고, 상세하게는 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및 당해 효소를 사용하는 디펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 억제제를 첨가한 경우의 디펩타이드 합성 활성을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 신규한 단백질, 이를 암호화하는 DNA를 제공하고, 이들을 이용한 디펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 디펩타이드의 제조방법에서의 반응은 하기 반응식과 같이 나타낸다. 하기 화학식에 예시된 바와 같이 본 명세서에 "디펩타이드"란 펩타이드 결합을 1개 갖는 펩타이드 중합체를 말한다.
R1-CH(NH2)-COOR + H2N-CH(COOH)-R2
→R1-CH(NH2)-CONH-CH(COOH)-R2+ ROH
상기식에서,
R은 치환 또는 비치환의 탄화수소쇄이고,
R1은 아미노산에스테르의 측쇄이며,
R2는 아미노산의 측쇄이다.
아미노산에스테르는 염가로 입수할 수 있는 화합물이다. 아미노산에스테르와 비보호 아미노산을 출발 원료로 하여 세균, 효모 등을 효소원으로서 수용액 중에서 반응시키는 본 발명 방법은 종래에는 없던 새로운 디펩타이드의 제조방법이며, 의약품 재료, 기능성 식품으로서 유용한 디펩타이드를 보다 염가에 제공할 수 있게 하는 것이다.
이하, 본 발명에 관해서,
[I] L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물
[II] 펩타이드 생성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA의 분리 등
[III] 펩타이드 생성 효소의 성질
[IV] 디펩타이드의 제조방법의 순서로 상세하게 설명한다.
[I] L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는미생물
본 발명에 사용하는 미생물로는 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물로 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있다. L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물로는 바실러스속, 코리네박테리움속, 슈도모나스속에 속하는 미생물 등을 들 수 있지만 구체적으로는 하기의 것을 예시할 수 있다.
바실러스 서브틸리스 ATCC 6633
(Bacillus subtilis)
바실러스 코아귤란스 EKO1[참고문헌: J. Bacterio1. 174, 7919-7925(1992)]
(Bacillus coagulans)
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286
(Corynebacterium glutamicum)
슈도모나스 푸티다 AJ-2402 FERM BP-8101
(Pseudomonas putida)
슈도모나스 푸티다 ATCC 12633
(Pseudomonas putida)
슈도모나스 푸티다 AJ2048 FERM BP-8123
(Pseudomonas putida)
상기 균주 중에서 ATCC 번호가 기재되어 있는 것은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(P.0. Box 1549 Manassas, VA 20110)에 기탁되어 있으며 각 번호를 참조하여 분양을 받을 수 있다.
상기 균주 중에서 FERM 번호가 기재되어 있는 것은 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호 305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6)에 기탁되어 있으며 수탁번호가 부여된 미생물이다. 슈도모나스 푸티다 AJ-2402주는 2001년 10월 1일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁되어 있고 AJ-2402는 FERM P-18544의 수탁번호가 부여되어 있으며 다시 2002년 7월 1일에 국제기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-8101이 부여되어 있다. 또한, FERM BP-8101(AJ-2402)은 하기의 분류실험에 의해 상기한 슈도모나스 푸티다인 것이 동정되었다. 또한, 슈도모나스 푸티다 AJ 2048주는 2002년 7월 22일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁되어 있으며 FERM BP-8123의 수탁번호가 부여되어 있다.
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주는 간균(0.7 내지 0.8 ×1.5 내지 2.0μm), 그램 음성, 포자 형성없음, 운동성 있음, 콜로니 형태는 원형, 전체 테두리 매끄러운 모양, 볼록형, 광택 있음, 크림색, 30℃에서 생육, 카탈라제 양성, 옥시다제 양성, OF 테스트(글루코스) 음성 성질의 운동성을 갖는 무포자 간균이며, 슈도모나스에 속하는 세균으로 동정되었다. 또한, 질산염 환원 음성, 인돌 생성 음성, 글루코스로부터의 생성 음성, 아르기닌디하이드로라제 양성, 우레아제 음성, 에스클린 가수분해 음성, 젤라틴 가수분해 음성, β-갈락토시다제 음성, 글루코스 동화 양성, L-아라비노스 동화 음성, D-만노스 동화 양성, D-만니톨 동화 양성, N-아세틸-D-글루코사민 동화 음성, 말토스 동화 음성, 글루콘산칼륨 동화 양성, n-카프르산 양성, 아디프산 동화 음성, dl-말산 동화 양성, 시트르산나트륨 동화 양성, 아세트산페닐 동화 양성, 옥시다제 양성, 킹스비(King's B) 한천 배지에서의 형광색소 생산 양성, 자당으로부터의 레반 생성 양성, 소르비톨의 동화 미약이라는 생리학적 성질의 슈도모나스 푸티다로 동정되었다.
이들 미생물로는 야생주 또는 변이주의 어떤 것도 사용할 수 있으며, 세포 융합 또는 유전자 조작 등의 유전공학적 수법에 따라 유도되는 재조합주 등도 사용할 수 있다.
이러한 미생물 균체를 수득하기 위해서, 당해 미생물을 적당한 배지에서 배양 증식시키는 것이 바람직하다. 이러한 용도의 배지는 당해 미생물이 증식할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으며 통상적인 탄소원, 질소원, 인원, 황원, 무기 이온 및 필요에 따라 유기 영양원을 함유하는 통상적인 배지일 수 있다.
예를 들면, 탄소원으로는 상기 미생물을 이용할 수 있으면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스, 프룩토스, 말토스, 아밀로스 등의 당류, 소르비톨, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이들의 염류, 파라핀 등의 탄수화물류 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는 황산암모늄, 염화암모늄 등의 무기염의 암모늄염, 푸마르산암모늄, 시트르산암모늄 등의 유기산의 암모늄염, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 옥수수 침지액 등의 유기 질소 화합물 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
이외에 무기염류, 미량 금속염, 비타민류 등의 통상적인 배지에 사용되는 영양원을 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다.
배양조건에도 특별한 제한은 없으며 예를 들면, 호기적 조건하에 pH 5 내지 8, 온도 15 내지 40℃의 범위에서 pH 및 온도를 적당하게 제한하면서 12 내지 48시간 정도 배양하는 것이 바람직하다.
[II] 펩타이드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA의 분리 등
[II-1] DNA의 분리
본 발명자들은 상기한 미생물로부터 L-아미노산에스테르와 L-아미노산에서 디펩타이드를 합성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 본 발명의 DNA를 분리하고 서열을 결정하였다. 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기번호 57 내지 1295의 염기서열로 이루어진 DNA는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터 분리되었다. 또한, 서열목록의 서열번호 14에 기재된 염기번호 486 내지 1496의 염기서열로 이루어진 DNA는 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주로부터 분리되었다. 또한, 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기번호 311 내지 1279의 염기서열로 이루어진 DNA는 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주로부터 분리되었다. 또한, 본 명세서에서 "서열번호 4에 기재된 염기서열", "서열번호 14에 기재된 염기서열", "서열번호 16에 기재된 염기서열"이란 특별히 단정하지 않는 한, CDS 부분을 가리킨다.
*DNA를 분리한 예를 기재하자면, 처음에 정제된 펩타이드 생성 효소의 아미노산 서열을 결정한다. 에드만법[참고문헌: Edman, P., Acta Chem. Scand. 4,227(1950)]를 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또한 Applied Biosystems사에서 제조된 시퀀서를 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 정제된 펩타이드 생성 효소에 관한 N-말단, 또는 라이실 엔도펩티다제 등의 처리에 의해 수득된 펩타이드의 약 10 내지 30개 잔기의 아미노산 서열을 결정하고, 명백해진 아미노산 서열에 근거하여 이를 암호화하는 DNA의 염기서열을 연역할 수 있다. DNA의 염기서열을 연역하는 데는 유니버셜 코돈을 사용한다.
연역된 염기서열에 근거하여 30개 염기쌍 정도의 DNA 분자를 합성한다. 당해 DNA 분자를 합성하는 방법은 문헌[참고문헌: Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)]에 기재되어 있다. 또한, Applied Biosystems사에서 제조된 합성기를 사용하여 당해 DNA 분자를 합성할 수 있다. 당해 DNA 분자를 프라이머로서 사용하여 PCR법으로 염색체 DNA에서 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA를 증폭할 수 있다. 단, PCR법을 사용하여 증폭되는 DNA는 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA 전체 길이를 포함하고 있지 않으므로 PCR법을 사용하여 증폭되는 DNA를 프로브로서 사용하여 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA 전체 길이를 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 바실러스 서브틸리스 등의 각 균주의 염색체 유전자 라이브러리에서 분리한다.
대안으로, 유전자의 염기서열 일부가 공지인 경우에는 당해 공지된 서열을 갖는 DNA를 프로브로서 사용하여 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA 전체 길이를 염색체 유전자 라이브러리에서 분리할 수 있다.
또한, 유전자의 염기서열이 공지된 서열과 상동성을 갖는 경우에는 당해 공지된 서열을 갖는 DNA를 프로브로서 사용하여 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA 전체 길이를 염색체 유전자 라이브러리에서 분리할 수 있다.
PCR법의 조작에 관해서는 문헌[참고문헌: White, T. J. et a1., Trends Genet. 5, 185(1989)] 등에 기재되어 있다. 염색체 DNA를 제조하는 방법 및 DNA 분자를 프로브로서 사용하여 유전자 라이브러리에서 목적하는 DNA 분자를 분리하는 방법에 관해서는 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)] 등에 기재되어 있다.
분리된 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA의 염기서열을 결정하는 방법은 문헌[참고문헌: A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc.(1985)]에 기재되어 있다. 또한, Applied Biosystems사에서 제조된 DNA 시퀀서를 사용하여 염기서열을 결정할 수 있다. 이와같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주, 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주, 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주로부터 분리된 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA를 각각 서열목록의 서열번호 4, 14, 16에 기재한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 DNA는 서열목록의 서열번호 4, 14, 16에 명시된 DNA만이 아니다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터 분리된 서열목록의 서열번호 4의 DNA에 관해서 하기에 설명하자면, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주의 염색체 DNA에서 분리된 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA에 인공적으로 변이를 가한 DNA라도 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 경우에는 본 발명의 DNA이다. 인공적으로 변이를 가하는 방법으로는 빈번하게 사용되는 것으로서 문헌[참고문헌: Method. in Enzymol., 154(1987)]에 기재되어 있는 부위 특이적 변이도입법이 있다.
또한, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 염기서열을 가지며 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA도 본 발명에서 사용할 수 있는 DNA이다.
또한, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 CDS로 이루어진 DNA에 근거하여 제조되는 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, 펩타이드 합성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 본 발명의 DNA와 실질적으로 동일한 DNA가 수득된다. 프로브는 예를 들면, 서열번호 4에 기재된 염기서열에 근거하여 정해진 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 프로브를 사용하여 이것과 하이브리드화하는 DNA를 골라내어 목적하는 DNA를 분리하는 방법도 정해진 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, DNA 프로브는 플라스미드 또는 파지 벡터에서 클로닝된 염기서열을 증폭시키고, 프로브로서 사용하고 싶은 염기서열을 제한효소에 의해 절단하여 추출함으로써 제조할 수 있다. 절단하는 위치는 목적하는 DNA에 따라서 조절할 수 있다.
여기서, "엄격한 조건"이란 소위 특이적 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만 일례를 들면 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리드화하고, 이보다 상동성이 낮은 DNA끼리는 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상적인 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1 ×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 65℃, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. 펩타이드 생성 효소의 활성에 관해서는 이미 상기 설명한 바와 같다. 단, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기서열에 상보적인 염기서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 염기서열의 경우에는 50℃, pH 8의 조건하에 서열목록의 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 10% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상의 효소 활성을 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 DNA가 암호화하는 펩타이드 생성 효소와 실질적으로 동일한 단백질도 본 발명에서 사용할 수 있다. 따라서, "서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 반응을 촉매하는 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질"을 암호화하는 DNA도 본 발명에서 사용할 수 있다. 여기서, "수개"란 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조 또는 펩타이드 생성 효소 활성을 크게 손상하지 않는 범위의 것이며, 구체적으로는 2 내지 50개, 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개이다. 또한, 펩타이드 생성 효소의 활성에 관해서는 이미 설명한 바와 같다. 단, 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를포함하는 아미노산 서열의 경우에는 50℃, pH 8의 조건하에 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 10% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상의 효소 활성을 유지하는 것이 바람직하다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 DNA로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터 분리한 DNA, 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주로부터 분리한 DNA, 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주로부터 분리한 DNA 등 이외에 이들과 실질적으로 동일한 DNA도 제공된다. 즉, 본 발명이 제공하는 DNA로는 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(i) 서열목록의 서열번호 4, 14 또는 16에 기재된 CDS로 이루어진 DNA.
(ii) 서열목록의 서열번호 4, 14 또는 16에 기재된 CDS와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 반응을 촉매하는 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(iv) 서열목록의 서열번호 5, 15 또는 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(v) 서열목록의 서열번호 5, 15 또는 17에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 반응을 촉매하는 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
[II-2] 형질전환체의 작제
이어서 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질을 발현하는 형질전환체의 작제에 관해서 설명한다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 효소, 생리 활성물질 등의 유용 단백질을 제조하는 예는 다수 공지되어 있고, 재조합 DNA 기술을 사용하여 천연에 미량으로 존재하는 유용 단백질을 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 방법으로 사용할 수 있는 형질전환체로는 예를 들면, 하기 (AA), (BB) 또는 (CC) 등의 단백질을 발현할 수 있는 형질전환체가 바람직하다.
(AA) 서열목록의 서열번호 5, 15 또는 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(BB) 서열목록의 서열번호 5, 15 또는 17에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 반응을 촉매하는 펩타이드 생성 활성을 갖는 단백질.
(CC) 서열목록의 서열번호 4, 16 또는 18의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 4, 16 또는 18의 염기서열에 근거하여 제조된 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하며, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 반응을 촉매하는 펩타이드 생성 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 암호화된 단백질.
상기 (AA) 내지 (CC)의 펩타이드 생성 활성을 갖는 단백질을 발현하는 형질전환체를 작제하기 위해서는 상기 [II-1]에서 기재한 (i), (ii), (iii), (iv) 또는 (v)의 DNA를 숙주세포에 삽입하는 것이 바람직하다. 즉, (i), (ii), (iii), (iv)또는 (v)의 DNA를 숙주세포로 발현할 수 있는 재조합 DNA, 구체적으로는 발현 벡터 등에 혼입하고, 이를 숙주세포에 삽입한다.
또한, 상기 (BB)에 기재된 바와 같은 변이는 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해 본 효소 유전자의 특정 부위의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 염기서열을 변형함으로써 수득된다. 또한, 상기 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해서도 수득될 수 있다. 돌연변이 처리로는 본 효소를 암호화하는 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법 및 본 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 에스케리키아속 세균을 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상적인 인공 돌연변이에 사용되고 있는 변이제로 처리하는 방법 등을 들 수 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 대량생산하는 경우, 당해 단백질을 생산하는 형질전환체내에서 당해 단백질이 접합되어 단백질 봉입체를 형성하는 형태도 바람직한 한가지 실시 형태일 수 있다. 이러한 발현 생산방법의 잇점은 목적하는 단백질을 균체내에 존재하는 프로테아제에 의한 분해로부터 보호한다는 점과 목적하는 단백질을 균체 파쇄후 원심분리 조작에 의해 간단하게 정제할 수 있다는 점 등이다.
이와 같이 수득되는 단백질 봉입체는 단백질 변성제에 의해 가용화된 후, 주로 이러한 변성제 제거에 의한 활성 재생조작을 경유한 다음, 정확하게 접힌 생리적으로 활성인 단백질로 전환된다. 예를 들면, 사람 인터로이킨-2의 활성 재생[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(소)61-257931호] 등의 다수의 예가 있다.
단백질 봉입체로부터 활성형 단백질을 수득하기 위해서는 가용화 및 활성 재생 등의 일련의 조작이 필요하며, 직접 활성형 단백질을 생산하는 경우보다 조작이 복잡해진다. 그러나, 균체의 생육에 나쁜 영향을 미치는 단백질을 균체내에서 대량으로 생산시킬 경우, 불활성인 단백질 봉입체로서 균체내에 축적시킴으로써 이의 영향을 억제할 수 있다.
목적 단백질을 봉입체로서 대량생산하는 방법으로는 강력한 프로모터의 제어하에 목적하는 단백질을 단독으로 발현시키는 방법 이외에 대량으로 발현하는 것으로 공지된 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 방법이 있다.
또한, 융합 단백질로서 발현시킨 후 목적하는 단백질을 절단하기 위해 제한 프로테아제의 인식서열을 적당한 위치로 배치하는 것이 효과적이다.
단백질을 재조합 DNA 기술을 사용하여 대량생산하는 경우, 형질전환되는 숙주세포로는 세균 세포, 방선균 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포, 동물 세포 등을 사용할 수 있지만 일반적으로 대장균 등의 장내 세균, 바람직하게는 대장균(에스케리키아 콜라이)이 사용된다. 이는 대장균 등의 장내 세균을 사용하여 단백질을 대량생산하는 기술에 관한 다수의 발견이 있기 때문이다. 이하, 형질전환된 대장균을 사용하여 펩타이드 생성 효소를 제조하는 방법의 한가지 형태를 설명한다.
펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA를 발현시키는 프로모터로는 통상의 대장균에서 이종 단백질 생산에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있고, 예를 들면, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의PR프로모터 및 PL프로모터 등의 강력한 프로모터를 들 수 있다.
펩타이드 생성 효소를 융합 단백질 봉입체로서 생산하기 위해서 펩타이드 생성 효소 유전자의 상류 또는 하류에 다른 단백질, 바람직하게는 친수성 펩타이드를 암호화하는 유전자를 연결하여 융합 단백질 유전자를 수득한다. 이러한 다른 단백질을 암호화하는 유전자로는 융합 단백질의 축적량을 증가시켜 변성 및 재생공정 후 융합 단백질의 용해성을 높이는 것이면 바람직하고, 예를 들면, T7 유전자 10, β-갈락토시다제 유전자, 데하이드로엽산 환원효소 유전자, 인터페론 γ유전자, 인터로이킨-2 유전자 및 푸로키모신 유전자 등을 들 수 있다.
이들 유전자와 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 유전자를 연결할 경우, 코돈의 판독 프레임이 일치하도록 한다. 적절한 제한효소 부위로 연결하거나 적절한 서열의 합성 DNA를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 생산량을 증대시키기 위해서는 몇몇 경우 융합 단백질 유전자의 하류에 전사 종결서열인 터미네이터를 연결하는 것이 바람직하다. 이러한 터미네이터로는 T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터 및 대장균 trpA 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다.
펩타이드 생성 효소 또는 펩타이드 생성 효소와 다른 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 대장균에 도입하기 위한 벡터로는 소위 다중-복제형 벡터가 바람직하고, ColE1 유래의 복제 개시점을 갖는 플라스미드, 예를 들면, pUC계 플라스미드, pBR322계 플라스미드 또는 이의 유도체를 들 수 있다. 여기서, "유도체"란 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등에 의해 플라스미드를 변형시킨 것을 의미한다. 또한, 여기서 언급된 변형이란 변이제나 UV 조사 등에 의한 변이처리 또는 자연변이 등에 의한 변형을 포함한다. 보다 구체적으로는, 벡터로서 예를 들면, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등을 사용할 수 있다. 이외에도 파지 DNA, 트랜스포존 DNA의 벡터도 사용할 수 있다.
또한, 형질전환체를 스크리닝하기 위해서 당해 벡터는 암피실린 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드로서 강력한 프로모터를 갖는 발현 벡터가 시판되고 있다[pUC계(다카라슈조(주)제), pPROK계(클론텍제), pKK233-2(클론텍제) 외].
프로모터, 펩타이드 생성 효소 또는 펩타이드 생성 효소와 다른 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자, 경우에 따라서 터미네이터의 순서로 연결한 DNA 단편과 벡터 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다.
당해 재조합 DNA를 사용하여 대장균을 형질전환시키고, 이 대장균을 배양하면 펩타이드 생성 효소 또는 펩타이드 생성 효소와 다른 단백질과의 융합 단백질이 발현 생산된다. 형질전환되는 숙주는 이종 유전자의 발현에 통상적으로 사용되는 균주를 사용할 수 있지만, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 JM109주가 바람직하다. 형질전환시키는 방법 및 형질전환체를 스크리닝하는 방법은 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)] 등에 기재되어 있다.
융합 단백질로서 발현시킨 경우, 혈액 응고인자 Xa 또는 칼리크레인 등의 펩타이드 생성 효소내에 존재하지 않는 서열을 인식서열로 하는 제한 프로테아제를 사용하여 펩타이드 생성 효소를 절단할 수 있다.
생산 배지로는 M9-카사미노산 배지 또는 LB 배지 등의 대장균을 배양하기 위해 통상적으로 사용하는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 배양조건 및 생산 유도조건은 사용되는 벡터의 마커, 프로모터, 숙주균 등의 종류에 따라 적절하게 선택한다.
펩타이드 생성 효소 또는 펩타이드 생성 효소와 다른 단백질과의 융합 단백질을 회수하는 데는 하기 방법 등이 있다. 펩타이드 생성 효소 또는 이의 융합 단백질이 균체내에 가용화되어 있는 경우, 균체를 회수한 다음 균체를 파쇄 또는 용균시켜 조효소액으로서 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 통상적인 침전, 여과 또는 칼럼 크로마토그래피 등의 기술에 따라 펩타이드 생성 효소 또는 이의 융합 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이 경우, 펩타이드 생성 효소 또는 융합 단백질의 항체를 이용한 정제법도 사용할 수 있다.
단백질 봉입체가 형성된 경우에는 변성제로 이를 가용화한다. 균체 단백질과 함께 가용화할 수 있지만 이후의 정제조작을 고려하면 봉입체를 꺼내어 이를 가용화하는 것이 바람직하다. 균체로부터 봉입체를 회수하는 데는 종래 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 균체를 파괴하여 원심분리 조작 등에 의해 봉입체를 회수한다. 단백질 봉입체를 가용화시키는 변성제로는 구아니딘 염산(예: 6M, pH 5 내지 8) 또는 요소(예: 8M) 등을 들 수 있다.
이들 변성제를 투석등에 의해 제거하면 활성을 갖는 단백질로서 재생된다. 투석에 사용하는 투석 용액으로는 트리스-염산 완충액 또는 인산 완충액 등이 바람직하고, 농도는 20mM 내지 0.5M, pH는 5 내지 8일 수 있다.
재생 공정시 단백질 농도는 약 500μg/ml 이하로 억제하는 것이 바람직하다. 재생된 펩타이드 생성 효소가 자기-가교를 수행하는 것을 억제하기 위해 투석온도는 5℃ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 변성제 제거방법으로서 이러한 투석법 이외에 희석법 또는 한외여과법 등이 있으며 어떤 것을 사용해도 활성 재생을 기대할 수 있다.
펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA로서 서열목록 서열번호 4에 기재된 DNA를 사용하는 경우, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 생성 효소가 생산된다. 또한, 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA로서 서열목록 서열번호 14에 기재된 DNA를 사용하는 경우, 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 생성 효소가 생산된다. 또한, 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 DNA로서 서열목록 서열번호 16에 기재된 DNA를 사용하는 경우, 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 생성 효소가 생산된다.
또한, 유전공학 기술에 관해서는 예를 들면, 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)] 등에 기재된 기술에 따라 실시할 수 있다.
[III] 펩타이드 생성 효소의 성질
다음에 상기 미생물 중에서 예로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터 정제된 펩타이드 생성 효소의 성질에 관해서 설명한다.
L-알라닌에스테르와 L-글루타민을 원료(기질)로 하는 경우를 예로 들자면, 당해 펩타이드 생성 효소는 L-알라닌에스테르와 L-글루타민을 기질로 하여 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 활성을 갖는다. 또한, L-알라닌아미드와 L-글루타민을 원료로 하는 경우를 예로 들자면, 당해 펩타이드 생성 효소는 L-알라닌에스테르와 L-아스파라긴을 기질로 하여 L-알라닐-L-아스파라긴을 생성하는 활성을 갖는다.
효소 작용에 있어서, L-알라닌에스테르와 L-아스파라긴 또는 L-글루타민을 원료로 하는 경우를 예로 들자면, 당해 펩타이드 생성 효소는 L-알라닌에스테르 1분자와 L-글루타민 1분자로부터 L-알라닐-L-글루타민 1분자와 알콜 1분자를 생성하며, L-알라닌에스테르 1분자와 L-아스파라긴 1분자로부터 L-알라닐-L-아스파라긴 1분자와 알콜 1분자를 생성한다.
최적 pH는 6.0 내지 10.0 부근이고, 최적온도는 30 내지 50℃ 부근이다. 서브유니트의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 42,000 내지 46,000으로 산출된다.
[IV] 디펩타이드 제조방법
본 발명의 디펩타이드의 제조방법은 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 합성하는 활성을 갖는 효소 또는 당해 효소-함유물을 사용하여 디펩타이드를 제조하는 방법이다. 구체적으로는 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물, 당해 배양물에서 분리한 미생물 균체, 당해 미생물의 균체 처리물 또는 당해 미생물 유래의 펩타이드생성 효소를 사용하여 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 제조하는 것이다. 또한, L-아미노산에스테르 및 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 한, 상기 또는 하기 표 1 등에 예시한 미생물 유래의 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질을 사용할 수 있다.
상기 미생물이 생성하는 펩타이드 생성 효소는 L-아미노산에스테르와 L-아미노산을 기질로 하여 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 것이다.
상기 미생물이 생성하는 펩타이드 생성 효소를 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산에 작용시키는 방법으로는 상기 미생물을 배양하면서 배양액 중에 기질을 직접 첨가하거나, 배양 종료후 배양액 또는 미생물 배양물로부터 원심분리 등에 의해 균체를 분리하여 이를 그대로 또는 세정한 다음 완충액에 재현탁한 것에 L-아미노산에스테르-아미노산을 첨가하여 반응시킬 수 있다. 대안으로, 폴리아크릴아미드 겔법, 카라기난법 또는 알긴산 겔법 등의 공지된 방법으로 고정화된 균체를 사용할 수 있다.
또한, 미생물 균체의 처리물로서 균체 파쇄물, 아세톤 처리 균체 또는 동결건조 균체를 사용할 수 있다. 균체 파쇄에는 초음파 파쇄, 프렌치 프레스 파쇄 또는 유리 비드 파쇄 등의 방법을 사용할 수 있고, 또한 용균시키는 경우에는 난백 리소자임이나 펩티다제 처리 또는 이들을 적절하게 조합하는 방법이 사용된다.
또한, 당해 미생물 균체 처리물로부터 펩타이드 생성 효소를 회수하여 조효소액으로서 사용할 수 있고, 필요에 따라 효소를 정제하여 사용할 수 있다. 배양물로부터의 정제법으로는 통상적인 효소 정제법을 사용할 수 있다. 구체적으로는원심분리 등에 의해 균체를 수집한 후, 초음파 처리, 유리 비드 또는 다이노밀 등의 기계적 방법에 의해 균체를 파쇄하고, 세포편 등의 고형물을 원심분리에 의해 제거하여 조효소를 수득한 다음, 초원심분리 분획, 염석, 유기용매 침전, 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 등을 실시함으로써 펩타이드 생성 효소가 정제된다.
또한, "미생물 유래의 펩타이드 생성 효소"란 당해 미생물 균체 처리물로부터 정제공정을 경유하여 수득된 효소 뿐만 아니라 당해 효소의 유전자를 이종 또는 동종의 숙주에서 발현시킨 것에 따른 소위 유전공학적 수법에 의해 생산된 효소를 포함한다.
즉, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 분획물이면 효소와 당해 효소 함유물 모두를 사용할 수 있다. 여기서, "효소 함유물"이란 당해 효소를 함유하는 것을 나타내고, 구체적 형태로는 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체 및 균체 처리물 등이 포함된다. 미생물의 배양물이란 미생물을 배양하여 수득되는 물질이며, 보다 구체적으로는 미생물 균체, 당해 미생물 배양에 사용되는 배지 및 배양된 미생물에 의해 생성된 물질의 혼합물 등을 말한다. 또한, 미생물 균체는 세정하여 세정 균체로서 사용할 수 있다. 또한, 균체 처리물에는 균체를 파쇄, 용균 또는 동결건조한 것 등이 포함되며, 또한 균체 등을 처리하여 회수된 조효소 뿐만 아니라 정제한 정제 효소 등도 포함된다. 정제처리된 효소로는 각종 정제법에 의해 수득되는 부분 정제 효소 등을 사용할 수 있으며 이들을 공유결합법, 흡착법 또는 포괄법 등에 의해 고정화한 고정화 효소를 사용할 수 있다. 또한, 사용되는 미생물에 따라 배양중에 일부 용균되는 것도 있으므로 이 경우에는 배양액 상등액도 효소 함유물로서 사용할 수 있다.
또한, 배양물, 배양 균체, 세정 균체 또는 균체를 파쇄 또는 용균시킨 균체 처리물을 사용하는 경우, 펩타이드의 생성에 관여하지 않고 생성된 펩타이드를 분해하는 효소가 존재하는 경우가 많으며 이 경우에는 금속 효소 억제제, 예를 들면, 에틸렌디아민 4 아세트산(EDTA)과 같은 금속 프로테아제 억제제 등을 첨가하는 것이 바람직한 경우가 있다. 첨가량은 0.1mM 내지 100mM의 범위, 바람직하게는 1mM 내지 50mM이다.
효소 또는 효소 함유물의 사용량은 목적하는 효과를 발휘하는 양(유효량)이면 바람직하고, 이의 유효량은 당해분야 숙련가에 의해 간단한 예비실험으로 용이하게 결정되며 예를 들면, 세정 균체를 사용하는 경우 반응액 1리터당 1 내지 500g이다.
L-아미노산에스테르는 당해 펩타이드 생성 효소의 기질 특이성에서 L-아미노산과 디펩타이드를 생성할 수 있는 L-아미노산에스테르면 어떠한 것도 사용할 수 있고, 예를 들면, L-아미노산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, n-프로필에스테르, 이소-프로필에스테르, n-부틸에스테르, 이소-부틸에스테르 및 3급-부틸에스테르 등을 들 수 있다. 또한, 천연 아미노산에 상응하는 L-아미노산에스테르 뿐만 아니라 비천연 아미노산 또는 이의 유도체에 상응하는 L-아미노산에스테르도 사용할 수 있다. 본 발명에서 L-아미노산에스테르로는 바람직하게는 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르 등을 사용할 수 있다.
L-아미노산은 당해 펩타이드 생성 효소의 기질 특이성에서 L-아미노산에스테르와 디펩타이드를 형성하는 것이면 특별히 한정하지 않으며 공지된 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 L-아미노산으로는 바람직하게는 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산 등이며, 특히 바람직하게는 L-글루타민 및 L-아스파라긴 등을 사용할 수 있다.
출발원료인 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산의 농도는 각각 1mM 내지 10M, 바람직하게는 0.05M 내지 2M이지만, L-아미노산에스테르에 대하여 L-아미노산을 등몰량 이상 첨가하는 것이 바람직한 경우가 있다. 또한, 필요한 경우 예를 들면, 고농도의 기질이 반응을 억제하는 경우, 억제하지 않는 농도로 조절한 후 반응중에 이들을 차차 첨가할 수 있다.
반응온도는 3 내지 70℃, 바람직하게는 5 내지 50℃이고, 반응 pH는 pH 2 내지 12, 바람직하게는 pH 3 내지 11이다. 이와 같이 약 2 내지 48시간을 반응시킴으로써 반응 혼합물 중에 디펩타이드가 생성 축적된다. 생성된 디펩타이드는 정해진 방법에 따라 회수하고, 필요에 따라 정제할 수 있다.
이하, 실시예에서 보다 상세히 설명되지만 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예에서의 L-알라닌, L-알라닐-L-글루타민 또는 L-알라닐-L-아스파라긴의 정량은 고속 액체 크로마토그래피를 사용하는 방법(칼럼: GL 사이언스사의 InertsiL ODS-2, 용출액: 인산 수용액(pH 2.2, 5.0mM 1-옥탄설폰산나트륨 용액/메탄올= 100/15, 유량: 1.0mL/분, 검출 210nm)으로 실시하였다.
실시예 1
L-알라닐-L-글루타민 생성에 대한 EDTA의 첨가효과
1L중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g 및 펩톤 10g을 함유하는 배지(pH 7.0) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 옮겨넣고 115℃에서 15분 동안 살균하였다. 여기에 동일 조성을 함유하는 경사면 한천배지(한천 20g/L, pH 7.0)에서 30℃로 24시간 동안 배양한 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주를 1백금이(loop) 접종하고, 30℃에서 120왕복/분으로 17시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후 균체를 원심분리하고, 습윤 균체로서 100g/L이 되도록 100mM 1M 붕산 완충액(pH 9.0)에서 현탁하였다. 균체 현탁액 1mL를 EDTA 무첨가 또는 EDTA 20mM을 함유하고 L-알라닌에틸에스테르 염산염 200mM 및 L-글루타민 400mM을 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL(기질 용액)에 각각 첨가하고, 전량을 2mL로 한 다음, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과,EDTA 무첨가에서는 4.9mM, EDTA 첨가에서는 10.1mM의 L-알라닐-L-글루타민이 생성되었다.
또한, 이들 반응계에서 균체 현탁액 대신 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL를 기질 용액 1mL에 첨가한 조건(균체 무첨가구) 및 기질 용액 대신 L-알라닌에틸에스테르 염산염과 글루타민을 함유하지 않는 EDTA 무첨가 또는 20mM EDTA를 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL를 균체 현탁액에 첨가한 조건(기질 무첨가구)에서는 어느 경우에서도 L-알라닐-L-글루타민의 생성은 보이지 않는다.
실시예 2
기질로서의 아미노산에스테르
실시예 1과 동일하게 제조한 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주의 균체 현탁액 습윤 균체(100g/L) 1mL를 EDTA 20mM, 하기의 L-알라닌에스테르 염산염 200mM 및 L-글루타민 400mM을 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL에 각각 첨가하여 전량을 2mL로 한 다음, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과, L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 기질로 한 경우에는 14.9mM, L-알라닌에틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 기질로 한 경우에는 11.4mM, L-알라닌-3급-부틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 기질로 한 경우에는 0.5mM의 L-알라닐-L-글루타민이 생성되었다.
실시예 3
기질로서의 L-아미노산
실시예 1과 동일하게 제조한 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주의 균체 현탁액 습윤 균체(100g/L) 1mL를 EDTA 20mM과 L-알라닌메틸에스테르 염산염 200mM 및 L-글루타민 또는 L-아스파라긴 400mM을 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL에 각각 첨가하여 전량을 2mL로 한 다음, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과, L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 기질로 한 경우에는 12.7mM의 L-알라닐-L-글루타민, L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-아스파라긴을 기질로 한 경우에는 4.8mM의 L-알라닐-L-아스파라긴이 생성되었다.
실시예 4
L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 미생물
1L중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g 및 펩톤 10g을 함유하는 배지(pH 7.0) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 옮겨넣고, 115℃에서 15분 동안 살균한 것을 사용하여 미생물을 배양하였다. 여기에 1L중에 글루코스 5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g을 함유하는 경사면 한천배지(한천 2g/L, pH 7.0)에서 30℃로 24시간 동안 배양한 표 1의 세균을 1백금이 접종하고, 30℃에서 120왕복/분으로 17시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후 균체를 원심분리하고, 습윤 균체로서 100g/L이 되도록 10mM의 EDTA를 함유하는 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0)에서 현탁하였다. 배양 종료후, 이들 배양액으로부터 균체를 원심분리하고, 습윤 균체로서 100g/L이 되도록 10mM의 EDTA를함유하는 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0)에서 현탁하였다. 이들 미생물의 균체 현탁액 0.1mL에 EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 염산염 200mM 및 L-글루타민 400mM을 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 0.1mL를 각각 첨가하여 전량을 0.2mL로 한 다음, 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때의 L-알라닐-L-글루타민(Ala-Gln)의 생성량(mM)을 표 1에 기재한다.
미생물 Ala-Gln(mM)
바실러스 서브틸리스 ATCC 6633코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101 1.17.214.8
실시예 5
L-알라닐-L-글루타민 생성에 미치는 온도의 영향
실시예 4의 미생물 배양법에 따라 제조한 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주 균체 현탁액(100g/L) 1mL를 EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 염산염 200mM, L-글루타민 400 mM을 함유하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL에 각각 첨가하여 전량을 2mL로 한 다음, 20℃, 30℃, 40℃에서 각각 1시간 동안 반응시킨 결과를 표 2에 기재하였다. L-알라닐-L-글루타민(Ala-Gln)의 생성은 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101주의 경우에는 40℃에서 가장 높은 값을 나타냈다.
미생물 생성 Ala-Gln(mM)
20℃ 30℃ 40℃
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8101 8.2 16.9 20.8
실시예 6
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터 펩타이드 생성 효소의 정제 및 정제 효소에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 생산
1L중에 글리세롤 5g, 효모 추출물 5g, 펩톤 5g, 염화나트륨 5g 및 L-알라닌아미드 염산염 5g을 함유하는 배지 500mL를 5L 경사구 플라스크에 옮겨넣고, 120℃에서 20분 동안 살균하였다. 여기에 상기와 동일한 조성의 배지에서 20시간 동안 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주의 배양액을 5%(V/V)가 되도록 식균하고, 30℃에서 120왕복/분으로 20시간 동안 배양하였다. 이러한 배양액 8L로부터 원심분리에 의해 균체를 수집하였다. 이하의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시하였다. 균체를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 다음, O.1mm 직경의 유리 비드를 이용하여 약 10분 동안 파쇄처리하였다. 유리 비드와 균체 파쇄액을 분리하고, 20,000 ×g으로 30분 동안 원심분리하여 파쇄 균체 단편을 제거하여 무세포 추출액을 수득하였다. 다시 200,000 ×g으로 60분 동안 초원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고 상등액으로서 가용성 분획물을 수득하였다. 수득된 가용성 분획물에 황산암모늄을 60% 포화가 되도록 첨가하고, 20,000 ×g으로 30분 동안 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 수득된 침전물을 소량의 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해하고 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하였다. 이러한 효소액을 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화한 Q-Sepharose HP 칼럼에 적용하고, O 내지 1.OM 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 직선 농도 구배에서 효소를 용출시켰다. 활성 분획물을 수집하여 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에서 미리 평형화한 Superdex 200pg에 적용하고, 동 완충액으로 효소를 용출시켰다. 활성 분획물을 수집하여 0.5M 황산암모늄을 함유하는 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 0.5M 황산암모늄을 함유하는 20mM 인산칼륨 완충액(PH 7.0)으로 미리 평형화한 Phenyl-Sepharose HP에 적용시켰다. O.5 내지 0M 황산암모늄을 함유하는 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 직선 농도 구배에서 효소를 용출시켰다. 활성 분획물을 수집하여 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 이를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화한 MonoQ 칼럼에 적용하고, 0 내지 1.0M 염화나트륨을 함유하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)의 직선 농도 구배에서 효소를 용출시켰다. 이와 같이 펩타이드 정제 효소를 전기영동으로 균일하게 정제하였다.
본 정제 효소의 비활성은 9.841단위/mg으로, 상기 정제과정을 통하여 당해 펩타이드 정제 효소의 비활성은 약 246배로 상승하였다. 또한, 본 정제 효소 표준품의 분자량을 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 적용시킨 결과, 분자량 42,000 내지 46,000으로 산출되는 위치에 균일한 밴드가 검출되었다. 또한, 효소 역가를 하기와 같이 측정하였다. 트리스-염산 완충액(pH 9.0) 200μmol, L-알라닌아미드 50μmol 및 적당량의 효소액을 가하여 전량이 1ml로 되도록 혼합하여 30℃에서 60분 동안 반응시킨 다음, 인산 수용액(pH 2.1)을 4ml 가하여 반응을 정지하였다. 생성된 알라닌을 고속 액체 크로마토그래피로 정량하고, 1분 동안에 1μmol의 L-알라닌을 생성하는 효소량을 1단위로 하였다.
이러한 정제 효소를 EDTA, L-알라닌메틸에스테르 염산염 및 L-글루타민(또는 L-아스파라긴)을 함유하는 붕산 완충액(pH 9.0)에 가하여 전량이 1mL가 되도록 혼합[최종 농도에 있어서, 효소 첨가량은 알라닌아미드 분해활성 2단위, EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 염산염 100mM, L-글루타민200mM(또는 L-아스파라긴 200mM) 및 붕산 완충액 100mM]하여 30℃에서 4시간 동안 반응시켰다(또한, 효소의 단위수는 L-알라닌메틸에스테르와 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민 생성 활성이 아닌 간편한 L-알라닌아미드 분해활성으로 나타냈다). 이때, L-알라닐-L-글루타민의 생성량은 50.2mM, L-알라닐-L-아스파라긴의 생성량은 49.8mM이었다.
실시예 7
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터의 펩타이드 생성효소 유전자의 분리 및 이. 콜라이에서의 발현
이하, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주로부터의 펩타이드 생성 효소 유전자의 분리 및 에스케리키아 콜라이에서의 발현에 관해 기재한다. 유전자의 분리 및 발현 모두 이. 콜라이 JM109를 숙주로 사용하고, 벡터는 pUC18을 사용하였다.
1. 결정 아미노산 서열에 기초한 PCR 프라이머의 작제
실시예 1에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주 유래의 펩타이드 생성효소의 N-말단 아미노산 서열(서열목록 서열번호 1)을 기초로 하여 서열목록의 서열번호 2, 3에 각각 기재된 혼합 프라이머를 작제하였다.
2. 균체의 취득
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주를 CM2Gly 한천배지(0.5g/dl 글리세롤, 1.0g/dl 효모 추출물, 1.0g/dl 펩톤, 0.5g/dl NaCl, 2g/dl 한천, pH 7.0) 상에 30℃에서 24시간 동안 배양하고 균을 리프레쉬하였다. 이를 50ml의 CM2Gly 액체 배지로 가득 채운 500ml의 경사구 플라스크에 1백금이 식균하여 30℃에서 16시간 동안 호기 조건하에 진탕 배양하였다.
3. 균체로부터 염색체 DNA 취득
배양액 50mL를 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분 동안)하여 집균하였다. 이러한 균체를 10ml의 20mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 현탁하고 원심분리로 균체를 회수하였다. 다시 이러한 균체를 10ml의 20mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 현탁하였다. 추가로 이러한 현탁액에 0.5ml의 20mg/ml 리소자임 용액 및 1ml의 10% SDS(도데실황산나트륨) 용액을 가한 다음, 55℃에서 20분 동안 배양하였다. 이와 같이 배양한 용액에 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)으로 포화된 페놀을 등량 가하여 단백질을 제거하였다. 이와 같이 분리된 수성층에 등량의 2-프로판올을 가하여 DNA를 침전시켜 회수하였다. 침전된 DNA를 20mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0) 0.5ml에 용해한 다음, 5μl의 10mg/ml RNase 및 5μl의 10mg/ml ProteinaseK를 가하여 55℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응후, 이 용액에 등량의 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)으로 포화된 페놀로 단백질을 제거하였다. 또한, 분리된 수성층에 등량의 24:1 클로로포름/이소아밀알콜을 가하여 교반하여 수성층을 회수하였다. 이러한 조작을 다시 2회 실시한 후, 수득된 수성층에 최종 농도 0.4M이 되도록 3M 아세트산나트륨 용액(pH 5.2)을 가한 다음, 2배 용적의 에탄올을 가하였다. 침전되어 생긴 DNA를 회수하여 70% 에탄올로 세정한 다음, 건조시켜 1ml의 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 용해시켰다.
4. 카세트 PCR법에 의한 펩타이드 생성 효소 유전자의 일부를 함유하는 DNA 단편의 취득
카세트 PCR법에 의한 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 유전자(aah)를 함유하는 DNA 분자의 분리 및 증폭에는 TaKaRa LA PCR 시험관내 클로닝 키트(제조사: 다카라슈조)를 사용하였다. 이하, 달리 한정하지 않는 한, 설명서 방법에 근거하여 실험하였다. 카세트 PCR법에서 프라이머 1(1차 PCR, 서열목록 서열번호 2)과 2(2차 PCR, 서열목록 서열번호 3)를 프라이머로 하는 경우, EcoR I 카세트와의 사이에서 약 0.5kb의 밴드(단편 1)가 증폭되었다. 이러한 단편의 염기서열을 결정함으로써 단편 1이 aah의 일부분임을 확인하였다.
5. 유전자 라이브러리로부터 펩타이드 생성 효소 유전자의 클로닝
다음에, aah의 전체 길이를 취득하기 위해서 단편 1을 프로브로 하여 우선, 서던 하이브리드화하였다.
프로브로서 작용하는 DNA 단편을 약 50ng/μl로 조정하고, 이 DNA 용액 16μl를 DIG High Prime(제조사: Boehringer Mannheim)을 사용하여 프로토콜에 따라 37℃에서 24시간 동안 배양하여 프로브를 표지하였다.
염색체 DNA 1μg을 각종 제한효소의 조합으로 완전분해하여 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한 후 나일론 멤브레인(제조사: Boehringer Mannheim, 포지티브로 하전된 나일론 멤브레인)에 블롯팅하였다. 이어서, 하기 정해진 방법에 따라 서던 하이브리드화하였다. DIG Easy Hyb(제조사: Boehringer Mannheim)를 사용하여 하이브리드화하였고, 50℃에서 30분 동안 예비-하이브리드화를 실시한 후 프로브를 첨가하여 50℃에서 18시간 동안 하이브리드화시켰다. DIG 뉴클레오타이드 검출 키트(제조사: Boehringer Mannheim)를 사용하여 검출하였다.
그 결과, Bgl II의 절단물에서는 약 7kb 위치에 밴드가 검출되었다. 이 7kb 영역의 단편을 회수하여 pUC18에 연결하고, 이. 콜라이 JM109로 라이브러리(120주)를 작제하였다. 이하, 정해진 방법에 따라 콜로니 하이브리드화하였다. 콜로니를 나일론 멤브레인 필터(제조사: Boehringer Mannheim, Nylon mernbranes for colony and plaque hybridization)에 전사하여 알칼리 변성, 중화 및 고정화 처리를 하였다. DIG Easy Hyb를 사용하여 하이브리드화를 실시하였다. 필터를 완충액 중에 침지하여 42℃에서 30분 동안 예비-하이브리드화하였다. 다음에 상기한 표지 프로브를 첨가하여 42℃에서 18시간 동안 하이브리드화하였다. SSC 완충액에서 세정한 다음, DIG 뉴클레오타이드 검출 키트를 사용하여 포지티브 클론 1주를 선택하였다.
6. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286 유래의 펩타이드 생성 효소 유전자의 염기서열
선택된 형질전환체가 보유하는 플라스미드를 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press(1989)]에 기재된 방법에 따라 제조하여 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정하였다. 펩타이드 생성 효소의 30개 잔기의 N-말단 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF)이 존재하고, 펩타이드 생성 효소를 암호화하는 유전자 aah인 것을 확인하였다. 펩타이드 생성 효소 유전자 전체 길이의 염기서열을 서열목록의 서열번호 4에 기재하였다. 수득된 ORF는 공지된 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 세균 유래의 프롤린이미노펩티다제와 염기서열에서 57.6%의 상동성을 나타냈다. 또한, 상동성의 수치는 Genetyx를 사용하여 수득된 값이다(이하, 본 실시예에서 동일하다).
7. 이. 콜라이에서 펩타이드 생성 효소 유전자의 발현
aah를 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 pUC18의 lac 프로모터의 하류에 aah를 연결한 플라스미드 pUCAAH를 작제하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286 염색체 DNA를 주형으로 하고, 표 3의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 PCR 증폭시킨 단편을 SacI, SmaI로 처리하여 pUC18의 SacI, SmaI 절단물과 연결한 다음, 이. 콜라이 JM109로 형질전환시켰다. 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 가진 균주를 선택하고, 작제한 발현 플라스미드를 pUCAAH라고 명명하였다.
pUCAAH를 갖는 이. 콜라이에서의 펩타이드 생성 효소 발현 형질전환체를 O.1mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 16시간 동안 예비-배양하였다. LB 배지 50ml를 가득 채운 500ml 경사구 플라스크에 바로 전의 배양액을 1mL 접종하여 37℃에서 본-배양하였다. 배양 개시 2시간 후, 종료 농도 1mM이 되도록 이소프로필1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 다시 3시간 동안 배양하였다.
배양 종료후, 집균하여 세정하고, 10ml의 20mM 인산 완충액(pH 8.0)에 현탁하여 180W에서 30분 동안 초음파 파쇄하였다. 용액을 회수하여 12,000g ×10분 원심분리하여 이의 상등액을 무세포 추출액으로 하였다.
실시예 8
펩타이드 생성 효소 활성측정
1. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286 유래의 효소 활성
상기 기재된 방법으로 배양 종료후, 무세포 추출액을 제조하여 이를 효소원으로 하여 펩타이드 생성 효소 활성을 측정하였다. 펩타이드 생성 효소 활성의 측정은 10OmM L-알라닌메틸에스테르 염산염, 150mM L-글루타민, 100mM 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA 및 효소 용액을 함유하는 반응액을 30℃에서 60분 동안 배양한 다음, 4배 용적의 인산(pH 1.5)을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. L-알라닐-L-글루타민량을 HPLC로 정량하였다. 효소 활성 단위에 있어서, 이 조건하에서 1분 동안에 1μmol의 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 효소 활성을 1단위(U)로 정의하였다.
분석에 사용된 HPLC의 조건은 하기와 같다.
칼럼: Inertsil ODS-2
이동상: [인산 수용액(pH 2.1)], 2.5mM 나트륨-1-옥탄설포네이트/메탄올= 10/1
칼럼온도: 40℃
유속: 1.Oml/분
검출: UV 210nm
그 결과, pUC18AAH를 도입한 경우에 O.54U/mg의 L-알라닌메틸에스테르 염산염로부터 L-알라닐-L-글루타민 합성의 활성이 검출되며 클로닝한 aah 유전자가 E. coli에서 발현하는 것을 확인한다. 또한, 대조로서 pUC18만을 도입하는 경우에는 활성은 검출되지 않는다.
2. 이. 콜라이에서 His-Tag 펩타이드 생성 효소 유전자의 발현
aah를 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 pUC18의 lac 프로모터 하류에 His-Tag 단백질로서 펩타이드 생성 효소를 발현시키는 플라스미드 pQEAAH를 작제하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주 염색체 DNA를 주형으로 하고 표 4의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여 PCR로 증폭시킨 단편을 SacI, SmaI로 처리하여 pQE-30(제조사: Qiagen)의 SacI, SmaI 절단물과 연결한 다음, 이. 콜라이 JM109로 형질전환시켰다. 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택하고, 작제한 발현 플라스미드를 pQEAAH라고 명명하였다.
pQEAAH를 갖는 이. 콜라이에서의 펩타이드 생성 효소 발현 형질전환체에 관해 실시예 8과 동일한 방법으로 활성 측정한 바, 5.28U/mg의 펩타이드 생성 효소 활성을 나타냈다.
3. His-Tag 정제 효소의 제조
pQEAAH를 갖는 이. 콜라이 JM109의 배양액 150ml로부터 상기 방법으로 균체를 파쇄하고, His Trap 키트(제조사: Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 이의 첨부 프로토콜에 따라서 His-Tag L-알라닌아미드하이드로라제를 정제하였다.SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 나타내는 단백질이 24mg 수득되었다. 이 정제 효소의 L-알라닌메틸에스테르 염산염으로부터의 L-알라닐-L-글루타민 합성의 비활성은 148.3U/mg이고, L-알라닌메틸에스테르 염산염에 대하여 50.7%였다.
4. His-Tag 정제 효소를 사용한 기질 특이성 검토
취득한 펩타이드 생성 효소에 의한 L-알라닐-L-글루타민 이외의 펩타이드 합성에 관해서 His-Tag 정제 효소를 사용하여 검토하였다.
(1) L-알라닌메틸에스테르 및 다른 L-아미노산으로부터의 펩타이드 합성
100mM L-알라닌메틸에스테르 염산염, 150mM 공시(供試) 아미노산, 100mM 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA 및 효소 용액(0.05U/ml)을 함유하는 반응액을 25℃에서 3시간 동안 배양함으로써 합성반응을 수행한 다음, 생성된 펩타이드를 HPLC에서 정량하였다. 그 결과, L-아미노산으로서 L-아스파라긴을 사용한 경우에는 22.34mM의 L-알라닐-L-아스파라긴을, 글리신을 사용한 경우에는 5.66mM의 L-알라닐글리신, L-알라닌을 사용한 경우에는 10.63mM의 L-알라닐-L-알라닌, L-로이신을 사용한 경우에는 13.73mM의 L-알라닐-L-로이신, L-메티오닌을 사용한 경우에는 48.80mM의 L-알라닐-L-메티오닌, L-프롤린을 사용한 경우에는 1.02mM의 L-알라닐-L-프롤린, L-페닐알라닌을 사용한 경우에는 16.13mM의 L-알라닐-L-페닐알라닌, L-트립토판을 사용한 경우에는 15.31mM의 L-알라닐트립토판, L-세린을 사용한 경우에는 26.14mM의 L-알라닐-L-세린, L-트레오닌을 사용한 경우에는 24.23mM의 L-알라닐-L-트레오닌, L-티로신을 사용한 경우에는 0.956mM의 L-알라닐-L-티로신, L-라이신을 사용한 경우에는 7.91mM의 L-알라닐-L-라이신, L-아르기닌을 사용한 경우에는 24.87mM의 L-알라닐,-L-아르기닌, L-히스티딘을 사용한 경우에는 23.16mM의 L-알라닐-L-히스티딘 및 L-글루탐산을 사용한 경우에는 1.11mM의 L-알라닐-L-글루탐산이 생성되었다.
(2) 다른 L-아미노산메틸에스테르와 L-글루타민으로부터의 펩타이드 합성
L-알라닌메틸에스테르 이외의 아미노산메틸에스테르를 사용하여 반응시켰다.
100mM 공시 아미노산메틸에스테르, 150mM L-글루타민, 100mM 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA 및 효소(0.05U/ml)를 함유하는 반응액을 25℃에서 3시간 동안 배양함으로써 합성반응을 수행한 다음, 생성된 펩타이드를 HPLC에서 정량하였다. 그 결과, L-아미노산메틸에스테르로서 글리신메틸에스테르를 사용한 경우에는 52.19mM의 글리실-L-글루타민, L-발린메틸에스테르를 사용한 경우에는 5.94mM의 L-발릴-L-글루타민, L-이소로이신메틸에스테르를 사용한 경우에는 0.59mM의 L-이소로이실-L-글루타민, L-메티오닌메틸에스테르를 사용한 경우에는 4.31mM의 L-메티오닐-L-글루타민, L-페닐알라닌메틸에스테르 사용한 경우에는 3.67mM의 L-페닐알라닐-L-글루타민, L-세린메틸에스테르를 사용한 경우에는 40.44mM의 L-세릴-L-글루타민, L-트레오닌메틸에스테르를 사용한 경우에는 3.85mM의 L-트레오닐-L-글루타민, L-글루타민메틸에스테르를 사용한 경우에는 0.23mM의 L-글루타미닐-L-글루타민, L-티로신메틸에스테르를 사용한 경우에는 1.24mM의 L-티로실-L-글루타민, L-아르기닌메틸에스테르를 사용한 경우에는 6.52mM의 L-아르기닐-L-글루타민, L-아스파라긴산-α-메틸에스테르를 사용한 경우에는 8.22mM의 L-아스파르틸-L-글루타민이 생성되었다. 또한, 아미노산메틸에스테르로서 L-로이신메틸에스테르, L-아스파라긴메틸에스테르,L-라이신메틸에스테르, L-아스파라긴산-β-메틸에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 또는 L-글루탐산-γ-메틸에스테르를 사용한 경우에도, 상응하는 아미노산과 L-글루타민으로 이루어진 펩타이드의 생성이 확인되었다(표준품을 입수할 수 없으므로 정량하지 않았다).
(3) 프롤린이미노펩티다제(pepI) 활성 측정법
반응액[조성: 50mM 붕산 완충액(pH 9.0), 5mM EDTA, 1mM 프롤린2-나프틸아미드(proline-pNA)]을 사용하여 30℃에서 반응시켰다. 나프틸아미드의 유리속도를 405nm의 흡광도의 증대로 측정(ε= 9.83)하였다. 1분 동안 1μmol의 나프틸아미드를 방출하는 활성을 1U로 하였다.
정제 효소의 프롤린이미노펩티다제 활성은 5.83 ×1O3U/mg이었다.
실시예 9
슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주 프롤린이미노펩티다제(pepI) 유전자의 분리 및 이. 콜라이에서의 발현
1. 프롤린이미노펩티다제(pepI) 유전자의 부분 단편 취득
실시예 7의 3과 동일한 방법으로 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633의 배양 균체(50ml 배양)로부터 DNA를 분리하였다.
한편, 진뱅크에 공개되어 있는 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주의 프롤린이미노펩티다제의 부분 염기서열(AF0 32970)에 근거하여 합성 DNA 올리고머(서열번호10: GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A 및 서열번호 11: GGC GGA TC AGG TCG CCG CGT TCT TC)를 작제하고, 이들을 프라이머로서 TaKaRa LA(제조사: 다카라슈조)를 사용하는 PCR법에 의해 유전자 부분 단편을 증폭시켰다.
2. 유전자 라이브러리로부터 프롤린이미노펩티다제 유전자의 전체 길이 클로닝
슈도모나스 푸티다 ATCC 12633의 프롤린이미노펩티다제 유전자(pepI)의 전체 길이 취득을 위해 우선, 이러한 부분 단편을 프로브로서 사용하여 실시예 7의 5에 기재된 방법과 동일하게 서던 하이브리드화시켰다. 그 결과, XhoI의 절단물에서 약 2.8kb 위치에 밴드가 검출되었다. 다음에 이러한 2.8kb 영역의 단편을 회수하여 pUC18의 SalI 부위에 연결하여 이. 콜라이 JM109에서 라이브러리(100주)를 작제하였다. 실시예와 동일한 방법으로 콜로니 하이브리드화를 실시하여 포지티브 클론 1주를 선택하였다.
3. 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주의 프롤린이미노펩티다제 유전자의 염기서열
선택한 형질전환체가 보유하는 플라스미드를 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 기재된 방법에 따라 제조하고, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정하였다. 337개 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF)이 존재하고, 이러한 유전자 전체 길이가 취득된 것을 확인하였다. 프롤린이미노펩티다제 유전자 전체 길이의 염기서열을 서열목록 서열번호 14에 기재하였다.
또한, 수득된 ORF는 공지된 코리네속 세균 유래의 프롤린이미노펩티다제와 염기서열 46.3%의 상동성, 슈도모나스 아르기노사 PAO1의 프롤린이미노펩티다제와82.4%의 상동성을 나타냈다.
4. 이. 콜라이에서 프롤린이미노펩티다제 유전자의 발현
프롤린이미노펩티다제(pepI) 유전자를 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 pUC18의 lac 프로모터의 하류에 pepI 유전자를 연결한 플라스미드 pUCPPPEPI를 작제하였다. 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9, 11의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 9; GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A, 서열번호 11; CAC GCG CTG CAG CAA ACC CCT CAT)를 프라이머로 하여 PCR 증폭시킨 단편을 처리하여 pUC18 절단물과 연결한 다음, 이. 콜라이 JM109로 형질전환시켰다. 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택하였고, 작제된 발현 플라스미드 pUCPPPEPI라고 명명하였다.
pUCPPPEPI를 갖는 이. 콜라이 형질전환체를 O.1mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 16시간 동안 예비-배양하였다. LB 배지 50ml로 가득 채운 500ml 경사구 플라스크에 바로 전의 배양액을 1mL 접종하여 37℃에서 본 배양하였다. 배양 개시 2시간 후, 종료 농도 1mM이 되도록 이소프로필1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 다시 3시간 동안 배양하였다.
배양 종료후, 집균하여 세정하고, 10ml의 20mM 인산 완충액(pH 8.0)에 현탁하여 180W로 30분 동안 초음파 파쇄하였다. 용액을 회수하여 12,000g ×10분으로 원심분리하고, 이의 상등액을 무세포 추출액으로 하였다. 그 결과, pUCPPPEPI를 도입한 경우에만 프롤린이미노펩티다제 활성(1.21 ×103U/mg)이 검출되고 클로닝한pepI 유전자가 이. 콜라이에서 발현한 것이 확인되었다.
실시예 10
슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주의 프롤린이미노펩티다제에 의한 L-알라닐-L-글루타민 합성
1. 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주에서 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성의 검출
슈도모나스 푸티다 ATCC 12633을 L배지에서 30℃로 밤새 액체 배양하여 균체를 수득하였다. 취득한 균체를 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA에 현탁하여 효소액으로 하였다. 또한, L-알라닐-L-글루타민 합성 활성은 하기의 효소 활성측정법으로 측정하였다. 종료 농도 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA, 100mM L-알라닌메틸에스테르 염산염 및 150mM L-글루타민으로 이루어진 반응 용액에서 30℃로 효소반응을 실시하고, 반응에 따라 생기는 L-알라닐-L-글루타민을 HPLC에 의해 정량하였다. 1분 동안 1μmol의 L-알라닐-L-글루타민을 발생시키는 활성을 1U로 하였다.
배양액 1ml당 0.051U의 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성이 검출되었다.
2. 프롤린이미노펩티다제를 발현시키는 이. 콜라이에 의한 L-알라닐-L-글루타민 합성
상기 무세포 추출액을 사용하여 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성을 측정하였다. 그 결과, pUCPPPEPI를 도입한 경우에는 7.88U/mg의 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성이 검출되었고, 클로닝한 pepI 유전자가 L-알라닐-L-글루타민 합성효소의 유전자인 것이 확인되었다. L-알라닐-L-글루타민의 최고 축적은 25mM이었다.
실시예 11
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주로부터의 프롤린이미노펩티다제(pepI) 유전자의 분리 및 이. 콜라이에서의 발현
1. 프롤린이미노펩티다제(pepI) 유전자 부분의 취득
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주로부터 프롤린이미노펩티다제 유전자(pepI)를 수득하기 위해서 실시예 1과 동일한 방법으로 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주의 배양 균체(50ml 배양)로부터 DNA를 분리하였다.
한편, 실시예 9에서 증폭시킨 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주의 pepI 유전자 부분 단편을 프로브로서 사용하여 우선, 실시예 9의 5와 동일한 방법으로 서던 하이브리드화하였다. 그 결과, PstI의 절단물에서는 약 6.5kb의 위치에 밴드가 검출되었다.
다음에 이러한 6.5kb 영역의 단편을 회수하여 pUC18의 PstI 부위에 연결하고, 이. 콜라이 JM109로써 라이브러리(200주)를 작제하였다. 실시예와 동일한 방법으로 콜로니 하이브리드화하여 포지티브 클론 2주를 선택하였다.
2. 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주의 프롤린이미노펩티다제 유전자의 염기서열
선택된 형질전환체가 보유하는 플라스미드를 문헌[참고문헌: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)]에 기재된 방법에 따라 제조하고, 프로브와 하이브리드화한 근방의 염기서열을 결정하였다. 323개 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF)이 존재하고, 이러한 유전자 전체 길이가 수득된 것을 확인하였다. 프롤린이미노펩티다제 유전자 전체 길이의 염기서열을 서열목록 서열번호 16에 기재하였다. 수득된 ORF는 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주의 프롤린이미노펩티다제 유전자와 염기서열에서 83%, 아미노산 서열에서 85%의 상동성을 나타냈다.
3. 이. 콜라이에서 프롤린이미노펩티다제 유전자의 발현
pepI 유전자를 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 pUC18의 lac 프로모터의 하류에 pepI 유전자를 연결한 플라스미드를 작제하였다. 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12, 13의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 12; CCC GAA TTC TTA CGG AGC GCG CAA TG, 서열번호 13; CGG GGA TCC CTT CAT GCT TCT TCA GG)를 프라이머로 하여 PCR 증폭시킨 단편을 처리하여 pUC18 절단물과 연결한 다음, 이. 콜라이 JM109로 형질전환시켰다. 암피실린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 균주를 선택하였고, 작제된 발현 플라스미드를 pUCPGPEPI라고 명명하였다.
pUCPGPEPI를 갖는 이. 콜라이 형질전환체를 사용하여 실시예 8과 동일한 방법으로 무세포 추출액을 제조하고, 프롤린이미노펩티다제 활성을 측정한 바, 활성(3.48 ×101U/mg)이 검출되었고 클로닝한 pepI 유전자가 이. 콜라이에서 발현된 것이 확인되었다.
실시예 12
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주의 프롤린이미노펩티다제에 의한 L-알라닐-L-글루타민 합성
1. 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주에 의한 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성의 검출
슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주를 실시예 10과 동일하게 배양하여 효소 활성을 측정하였다. 배양액 1ml당 0.054U의 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성이 검출되었다.
2. L-알라닐-L-글루타민 합성 효소 활성의 검출
pUCPGPEPI를 갖는 이. 콜라이 형질전환체 무세포 추출액을 사용하여 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성을 측정하였다. 그 결과, pUCPGPEPI를 도입한 경우에는 0.470U/mg의 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성이 검출되었고, 클로닝한 pepI 유전자가 L-알라닐-L-글루타민 합성효소의 유전자인 것이 확인되었다. L-알라닐-L-글루타민의 최고 축적은 30mM이었다.
실시예 13
바실러스 코아귤란스 EKO1주의 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 효소에 의한 L-알라닐-L-글루타민 합성
도요보에서 시판되고 있는 바실러스 코아귤란스 EK01주의 정제 효소(3.93 ×105U/mg)를 이용하여 실시예 10에 기재된 방법으로 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성을 측정하였다. 그 결과, 52.0U/mg의 활성이 검출되었고, 이러한 프롤린이미노펩티다제가 L-알라닐-L-글루타민 합성 활성을 갖는 효소인 것이 확인되었다. L-알라닐-L-글루타민의 최고 축적은 18mM이었다.
실시예 14
수득된 효소의 활성에 대한 억제제 영향
수득된 프롤린이미노펩티다제에 대한 억제제의 영향을 조사하였다. O.1M 붕산 완충액(pH 9.0), 10mM EDTA, 100mM L-알라닌메틸에스테르 염산염, 150mM L-글루타민 및 1mM 억제제로 이루어진 반응 용액으로 30℃에서 30분 동안 효소반응을 실시하고 L-알라닐-L-글루타민 합성을 측정하였다. 바실러스 코아귤란스 EKO1, 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633주 및 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123주는 NEM(N-에틸말레이미드)을 1mM 첨가하면 효소 활성은 거의 완전하게 억제되었다. 또한, 1mM의 IAA(요오도아세트아미드) 첨가에 의해 활성이 어느 정도 감소되었다. 한편, 1mM의 PMSF(페닐메틸설포닐플루오리드) 첨가시에는 활성에 영향은 없었다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13286주는 조사한 어떤 억제제에서도 활성은 영향을 받지 않았다.
(서열목록 프리텍스트)
서열번호 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 펩타이드 생성 효소의 N-말단 아미노산 서열
서열번호 2: PCR용 프라이머
서열번호 3: PCR용 프라이머
서열번호 4: 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 펩타이드 생성 효소의 암호화 서열
*서열번호 5: 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 펩타이드 생성 효소의 아미노산 서열
서열번호 6: 프라이머
서열번호 7: 프라이머
서열번호 8: 프라이머
서열번호 9: 프라이머
서열번호 10: 프라이머
서열번호 11: 프라이머
서열번호 12: 프라이머
서열번호 13: 프라이머
서열번호 14: 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633 유래의 펩타이드 생성 효소의 암호화 서열
서열번호 15: 슈도모나스 푸티다 ATCC 12633 유래의 펩타이드 생성 효소의 아미노산 서열
서열번호 16: 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123 유래의 펩타이드 생성 효소의 암호화 서열
서열번호 17: 슈도모나스 푸티다 FERM BP-8123 유래의 펩타이드 생성 효소의 아미노산 서열
본 발명의 디펩타이드의 제조방법에 의해 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 염가로 입수할 수 있는 L-아미노산에스테르와 L-아미노산을 사용하여 디펩타이드를 제조할 수 있고, 의약품 재료, 기능성 식품 등으로서 유용한 디펩타이드의 제조원가 절감을 할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 디펩타이드의 제조방법에 따르면 다양한 종류의 아미노산에스테르 및 아미노산을 원료로 하여 각종 형태의 디펩타이드를 생성할 수 있다.

Claims (21)

  1. 하기 (A) 또는 (B)의 단백질:
    (A) 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (B) 서열목록의 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 함유하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
  2. 하기 (C) 또는 (D)의 단백질:
    (C) 서열목록의 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (D) 서열목록의 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 함유하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
  3. 하기 (E) 또는 (F)의 단백질:
    (E) 서열목록의 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (F) 서열목록의 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 함유하는 아미노산 서열로 이루어지고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질.
  4. 하기 (a) 또는 (b)의 DNA:
    (a) 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기번호 57 내지 1295의 염기서열로 이루어진 DNA;
    (b) 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기번호 57 내지 1295의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  5. 하기 (c) 또는 (d)의 DNA:
    (c) 서열목록의 서열번호 14에 기재된 염기번호 486 내지 1496의 염기서열로 이루어진 DNA;
    (d) 서열목록의 서열번호 14에 기재된 염기번호 486 내지 1496의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  6. 하기 (e) 또는 (f)의 DNA:
    (e) 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기번호 311 내지 1279의 염기서열로 이루어진 DNA;
    (f) 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기번호 311 내지 1279의 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  7. 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 엄격한 조건이 1 ×SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도로 60℃에서 세정하는 조건인 DNA.
  8. 제4항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 DNA가 혼입된 재조합 DNA.
  9. 제4항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따른 DNA가 이것이 암호화하는 단백질을 발현시킬 수 있도록 혼입된 형질전환 세포.
  10. 제9항에 따른 형질전환 세포를 배지에서 배양하고, 배지중 및/또는 형질전환 세포중에 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 축적시키는 것을 특징으로 하는, 디펩타이드 생성 효소의 제조방법.
  11. 제9항에 따른 형질전환 세포가 생성하는, L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 사용하여 L-아미노산에스테르와 L-아미노산으로부터 디펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, L-아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조법.
  14. 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질을 L-아미노산에스테르 및 L-아미노산에 작용시켜 디펩타이드를 합성하는 것을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조법.
  15. 제14항에 있어서, 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질이 코리네박테리움속, 슈도모나스속 및 바실러스속의 어느 하나에 속하는 미생물 유래인 것을 특징으로 하는 디펩타이드의 제조법.
  16. 제14항에 있어서, 프롤린이미노펩티다제 활성을 갖는 단백질이 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 바실러스 코아귤란스의 어느 하나로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조법.
  17. 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 펩타이드의 제조법.
  18. 제14항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 펩타이드의 제조법.
  19. 코리네박테리움속, 슈도모나스속 또는 바실러스속에 속하고, 아미노산에스테르와 아미노산으로부터 디펩타이드를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물, 당해 배양물에서 분리한 미생물 균체, 또는 당해 미생물의 균체 처리물을 사용하여 아미노산에스테르와 아미노산으로부터 디펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는, 디펩타이드의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 아미노산에스테르가 L-알라닌에스테르, 글리신에스테르, L-발린에스테르, L-이소로이신에스테르, L-메티오닌에스테르, L-페닐알라닌에스테르, L-세린에스테르, L-트레오닌에스테르, L-글루타민에스테르, L-티로신에스테르, L-아르기닌에스테르, L-아스파라긴산-α-에스테르, L-아스파라긴산-β-에스테르, L-로이신에스테르, L-아스파라긴에스테르, L-라이신에스테르, L-아스파라긴산-α,β-디메틸에스테르 및 L-글루타민-γ-에스테르로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 펩타이드의 제조법.
  21. 제19항에 있어서, L-아미노산이 L-글루타민, L-아스파라긴, 글리신, L-알라닌, L-로이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 펩타이드의 제조법.
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