JPH03133391A - ジペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、プＯＩＪン含有ペプチドの１！造法に関スル
。Ｌ−プロリル−し−フェニルアラニン、Ｌプロリル−
し−チロシンおよびＬ−プロリルＬ−）リブトファンな
どのプロリン含有ペプチドは、血圧降下剤の構成成分と
しての用途が期待される。

従来の技術 プロリン含有ペプチドの製造方法には、有機化学的方法
と酵素的方法がある。

有機化学的方法におけるペプチド合成は、Ｎ末端、Ｃ末
端および側鎖の保護、縮合、脱保護の３つの過程が要求
され、工程が複雑になっている。

また反応中に、酸処理、アルカリ処理および加熱処理を
伴うためラセミ化が起こる可能性もある。

有機化学的方法において保護を必要としない方法として
、例えばＬ−プロリンにホスゲンを作用させてＬ−プロ
リンのＮ−カルボキシアミノ酸無水物としたものと、Ｌ
−フェニルアラニンを含有するホウ酸カリウム水溶液と
をｐ　Ｈ１０，２で、０℃の温度で反応させる方法が知
られている〔ジャーナル・才ブ・オーガニック・ケミス
トリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　３２．３４１５（Ｉ９６７）］。

酵素的にプロリン含有ペプチドを合成する方法として、
例えば、Ｎ−カルボベンゾキシ−し−アルギニンメチル
エステルとＬ−プロリンアミドとにクロストリパイン（
酵素番号３．４．２２．８　＞を作用させてＮ−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニルヒープロリンアミドを合成
する方法が知られている〔バイオテクノロジー・レター
ズ（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ）８　
．８７３　（Ｉ９８６）］。

発明が解決しようとする課題 有機化学的方法におけるペプチド合成で、保護を必要と
しない方法は、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を合成す
る際、極めて毒性の高いホスゲンを使うため、危険な合
成法であるっ また、酵素的方法におけるペプチド合成で使用されるク
ロストリバインは、嫌気性細菌であるクロストリジウム
属由来のため調製が困難な点と、両方の基質がいずれも
保護アミノ酸で、しかも生成物の脱保護も必要であると
いう点で実用的な方法であるとは言い難い。

課題を解決するだめの手段 本発明者らは、プロリン含有ペプチドのＶ進法について
、鋭意検討した結果、Ｎ末端がプロリンであるペプチド
鎖からＮ末端のプロリンを特異的に除去できるプロリン
イミノペプチダーゼ（酵素番号３．４．１１．５　）の
存在下プロリンのエステル類とアミノ酸とを反応させた
際に、基質であるプロリンのエステル類のイミノ基、ま
たこれに作用するアミノ酸のカルボキシル基および側鎖
の官能基を保護する必要がなく縮合反応を行うことがで
き、かつ反応条件が中性かつ常温常圧であることよりラ
セミ化が起こる可能性が少ないプロリルアミノ酸で表わ
されるジペプチドが合成できることを見い出し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、水性媒体中、プロリンイミノペプ
チダーゼ活性を有する酵素源の存在下式（） （式中、Ｒは低級アルキル基または了り−ル基を表わす
） で表わされるし−またはＤＬ−プロリンのエステル類と
Ｌ−またはＤＬ−α−アミノ酸とを反応させ、該水性媒
体中に、式（［１） ％式％（） ） （式中、Ｒｏはα−アミノ酸残基を表わす）で表わされ
る含プロリンジペプチドを生成させることを特徴とする
ジペプチドの製造法を提供する。

式（Ｉ）のＲの定義中、低級アルキル基としては、炭素
数１〜８の直鎮または分岐状のアルキル、例えばメチル
、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、
イソブチル、５ｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル
、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチルなどの基があげられ
る。アリール基としては、フェニル、ナフチルなどの基
があげられる。

式（ＩＩ）のＲｏの定義中、α−アミノ酸残基にいうア
ミノ酸としては、いかなるアミノ酸も含まれろ。

本発明に用いるプロリンイミノペプチダーゼ活性を有す
る酵素源としては、ペプチド鎖のＮ末端に存在するブＤ
　ＩＪンをそのペプチドから遊離させる触媒作用を有す
る限り、とくに制限されるものではなく、該酵素の精製
標品、同粗精製標品、該酵素含有物、例えば該酵素活性
を有する微生物の菌体または菌体処理物などいずれも用
いることができる。

例えば、バチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒ
ｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８１８５、バチルス・プレビス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖ＋５）ＡＴＣＣ９９９９、バ
チルス・プレビス（Ｂａｃｉビｕｓ　ｂｒｅｖ＋５）Ｆ
ＥＲｌＪ　Ｐ−５２４２（特公昭６２−５１５９１号公
報）、ビフィドバクテリウム・インファンテイス（Ｂｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ「ａｎｔｉｓ）＾ＴＣＣ
Ｉ５６９７などの微生物が生産する酵素や高等動物の肝
臓由来または植物由来の酵素などを用いることができる
。

菌体処理物としては、例えばアルギン酸などの担体に固
定化したもの、凍結乾燥菌体、細胞膜を破壊して得られ
た粗抽出液、あるいはこの抽出液を上記と同様に固定化
したもの、また二の粗抽出液を塩析、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフイーなどの手段により精製したもの、さ
らにはこの精製標品を上記の様に固定化したものなどが
あげられる。また、遺伝子のクローニングにより得られ
る高発現プラスミドを有する組換株、あるいはその生産
する高力価酵素を利用することはさらに好ましい。

本発明のプロリンのエステル類とアミノ酸との縮合反応
は、水またはリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液など
の緩衝液、あるいはメタノール、エタノーノ呟ジメチル
フォルムアミドなどを含有する水性媒体中で、ｐＨ７〜
１０、好ましくはｐｈ８〜９で、１５〜８０℃、好まし
くは２５〜６０℃の温度で行う。プロリンのエステル類
は反応液に対して、１０〜１０００ｍＭ、好ましくは１
００〜５００ｍＭの濃度で用いられる。各種アミノ酸は
反応液に対して１〜１００　ｍＭ、好ましくは５〜５０
ｍ１Ａの濃度で用いられる。

プロリンイミノペプチダーゼは、抽出酵素を使う場合、
０．０５〜３．　ＯＵ／ｗｔ、好まシくハ０．２〜２、
　ＯＵ／−加え、直接微生物菌体を使う場合には、０、
１〜１０％（湿重量）菌体濃度で反応させる。

ここで、プロリンイミノペプチダーゼの酵素活性は、３
０℃、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で
、１分間にプロリンパラニトロアニリドより１μｍｏｌ
ｅのブＤ　ＩＪンを遊離させる力価を１単位（Ｉ［Ｉ）
として表わす。

縮合反応において、反応時間が長くなると生成物である
ジペプチドの加水分解が起こるので好ましくない。従っ
て、縮合反応終了と同時に反応液から菌体およびその処
理物を除去するか、加熱処理（約１００℃）などにより
酵素を失活させて反応を停止させ、生成したジペプチド
の加水分解を極力抑えることが必要である。

し−プロリル−し−アミノ酸で表わされるジペプチドの
合成反応が終了した時点で速やかに反応を停止させ、反
応液より目的物質であるジペプチドと未反応基質である
プロリンメチルエステルおよびＬ−アミノ酸とをそれぞ
れ分離回収する。この分離回収ｊよ、公知の吸着クロ７
トグラフイーイオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、溶媒抽
出、分別晶析などの方法で行うことができる。

以下に実施例を示す。

実施例Ｉ Ｌ−プロリンメチルエステル２００ｍ！Ｊ＆Ｌ−７ヱニ
ルアラニン２５ｍ！Ｊとを含むｐＨ８，０の反応液に、
プロリンイミノペプチダーゼを１．２Ｕ／ｄとブーるよ
うに添加し、全量を１００ｍとして３０℃で振盪しｍ；
がろ反応を行った。４０分間反応後、反応液を高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析したところプロ
リルフェニルアラニン１８ｍ！ｌの生成が認められた。

この反応液を加熱処理（Ｉ００℃、３分間）し、変性タ
ンパクを遠心分離で除去した後、まずシリカゲルカラム
クロマトグラフィーでプロリンメチルエステルを取り除
き、ついで逆相Ｉ（ＰＬＣを用いて目的物質プロリルフ
ェニルアラニンとフェニルアラニンとを分離した。

こ）結果、Ｌ−７’ロリルーＬ−フェニルアラニンを１
．４４ｍＭ得た。

実施例２ Ｌ−フェニルアラニン２５ｎ＋ｕの代わりにＤＬフェニ
ルアラニン２５ｍ！Ｊを用いる以外は実弥例１と同様に
行って、Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニンを０．７
２　ｍＭ得た。

実施例３ Ｌ−フェニルアラニン２５＋７１！Ｊの代わりにＬ〜チ
ロンン２５ｍ１Ｊを用いる以外は実施例１と同様に行−
で、Ｌ−プロリル−し−チロシンを１．３８　ｍ！、Ｉ
ｉ”、ｐｔこ。

実施例４ Ｌ−フェニルアラニン２５ｍＭの代わりにＬ　−トリプ
トファン２５ｍＭを用いる以外は実施例１と同様に行っ
て、Ｌ−プロリル−Ｌ−）　ＩＪブトファンを１．８８
ｍ！Ｊ得た。

実施例５ Ｌ−プロリンメチルエステル２００ｍＭの代わりにＤＬ
−プロリンメチルエステル２００ｍ１Ｊを用いる以外は
実施例１と同様に行って、Ｌ−プロリルＬ−フェニルア
ラニンを０．６８　ｍ！Ｊ得た。

発明の効果 本発明により効率のよいプロリン含有ペプチドの酵素的
製造法が提供される。

手続補正書（自発） ■、事件の表示 平成１年特許願第２７０１１４号 ２、発明の名称 ジペプチドの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称
　（Ｉ０２）協和醗酵工業株式会社（２）同書中、第１
Ｏ頁１３行目のｒｏ、７２ｍＪを「０．７２ｎ＋ｍｏｌ
」に訂正する。

（３）同書中、第１Ｏ頁下から４行目の’１．３８ｍ！
わをｒ　１．３８ｍｍｏｌ」に訂正する。

（４）同書中、第１１頁３行目のｒ　１８８　ｍ！Ｊ」
をｒ　１．８８ｍｍｏｌ」に訂正する。

（５）同書中、第１１頁８行目のｒＯ，６８ｍ！わを’
０．６８ｍｍｏＪに訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 水性媒体中、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
   酵素源の存在下、式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは低級アルキル基またはアリール基を表わす
   ） で表わされるＬ−またはＤＬ−プロリンのエステル類と
   Ｌ−またはＤＬ−α−アミノ酸とを反応させ、該水性媒
   体中に、式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ’はα−アミノ酸残基を表わす）で表わされ
   る含プロリンジペプチドを生成させることを特徴とする
   ジペプチドの製造法。