JPH09121860A - プロリンイミノペプチダーゼ - Google Patents
プロリンイミノペプチダーゼInfo
- Publication number
- JPH09121860A JPH09121860A JP7282716A JP28271695A JPH09121860A JP H09121860 A JPH09121860 A JP H09121860A JP 7282716 A JP7282716 A JP 7282716A JP 28271695 A JP28271695 A JP 28271695A JP H09121860 A JPH09121860 A JP H09121860A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- dna
- amino acid
- proline iminopeptidase
- proline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
（アミノ酸番号１〜311)により特定されプロリンイミノ
ペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、及び該ポリペ
プチドをコードするDNA 。 【効果】 上記ポリペプチドは、タンパク質の一次構造
を解析するための試薬などに有用である。
（アミノ酸番号１〜311)により特定されプロリンイミノ
ペプチダーゼ活性を有するポリペプチド、及び該ポリペ
プチドをコードするDNA 。 【効果】 上記ポリペプチドは、タンパク質の一次構造
を解析するための試薬などに有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なプロリンイミ
ノペプチダーゼ及び該酵素をコードするDNA に関するも
のである。
ノペプチダーゼ及び該酵素をコードするDNA に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ペプチダーゼはペプチド結合を加水分解
する酵素の総称であり、アミノアシルペプチド結合に作
用するもの（アミノアシルペプチダーゼ）、ペプチジル
アミノ酸に作用するもの、ジペプチドに作用するもの、
及びペプチジルペプチドに作用するものに大別される。
エキソペプチダーゼの一種であるアミノペプチダーゼは
アミノアシルペプチダーゼに含まれる酵素であり、タン
パク質の構造研究に於いてアミノ末端のアミノ酸解析に
有用である。
する酵素の総称であり、アミノアシルペプチド結合に作
用するもの（アミノアシルペプチダーゼ）、ペプチジル
アミノ酸に作用するもの、ジペプチドに作用するもの、
及びペプチジルペプチドに作用するものに大別される。
エキソペプチダーゼの一種であるアミノペプチダーゼは
アミノアシルペプチダーゼに含まれる酵素であり、タン
パク質の構造研究に於いてアミノ末端のアミノ酸解析に
有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、新規なアミノペプチダーゼ及
び該酵素のアミノ酸配列及び該酵素をコードするDNA を
提供することにある。
の手段】本発明の課題は、新規なアミノペプチダーゼ及
び該酵素のアミノ酸配列及び該酵素をコードするDNA を
提供することにある。
【０００４】本発明者らは、抗生物質であるアスカマイ
シンの活性化機構について研究をおこなっていたとこ
ろ、キサントモナス属に属する植物病原菌が、アスカマ
イシンのアラニン残基を切断する特異なアミノペプチダ
ーゼを有することを見出し、その酵素の精製に成功した
（特公平5-5473号公報）。本酵素は、ペプチド及びヌク
レオシドペプチドの構造研究に有用な酵素であることが
示唆された。
シンの活性化機構について研究をおこなっていたとこ
ろ、キサントモナス属に属する植物病原菌が、アスカマ
イシンのアラニン残基を切断する特異なアミノペプチダ
ーゼを有することを見出し、その酵素の精製に成功した
（特公平5-5473号公報）。本酵素は、ペプチド及びヌク
レオシドペプチドの構造研究に有用な酵素であることが
示唆された。
【０００５】そこで、本発明者らはさらに研究を行い、
該酵素をコードする遺伝子をクローニングするととも
に、上記アミノペプチダーゼのアミノ酸配列（一次構
造）を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに
至った。
該酵素をコードする遺伝子をクローニングするととも
に、上記アミノペプチダーゼのアミノ酸配列（一次構
造）を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに
至った。
【０００６】すなわち本発明は、配列表の配列番号１に
示すアミノ酸配列（アミノ酸番号 1〜311)により特定さ
れるポリペプチドを提供するものである。このポリペプ
チドは、プロリンイミノペプチダーゼとして作用するも
のであり、より具体的には、プロリンパラニトロアニリ
ドを基質として用いた場合にプロリンを遊離する作用を
有している。また、本発明の別の態様により、上記ポリ
ペプチドをコードするDNA；及び、その好ましい態様と
して、配列表の配列番号１に示す核酸配列の核酸番号 1
〜936(終始コドンを含む）で特定されるDNA が提供され
る。
示すアミノ酸配列（アミノ酸番号 1〜311)により特定さ
れるポリペプチドを提供するものである。このポリペプ
チドは、プロリンイミノペプチダーゼとして作用するも
のであり、より具体的には、プロリンパラニトロアニリ
ドを基質として用いた場合にプロリンを遊離する作用を
有している。また、本発明の別の態様により、上記ポリ
ペプチドをコードするDNA；及び、その好ましい態様と
して、配列表の配列番号１に示す核酸配列の核酸番号 1
〜936(終始コドンを含む）で特定されるDNA が提供され
る。
【０００７】本発明により提供されるポリペプチドに
は、上記のキサントモナス由来の天然型プロリンイミノ
ペプチダーゼの他、配列表の配列番号１に示すアミノ酸
配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が挿
入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有し、プロリ
ンイミノペプチダーゼ作用を有するポリペプチドが全て
包含される。
は、上記のキサントモナス由来の天然型プロリンイミノ
ペプチダーゼの他、配列表の配列番号１に示すアミノ酸
配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が挿
入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有し、プロリ
ンイミノペプチダーゼ作用を有するポリペプチドが全て
包含される。
【０００８】プロリンイミノペプチダーゼの活性測定方
法については、例えば、アルバートソンらの方法(Alber
toson, N., and Koonmy, M., Molecular Microbiology,
9(6), pp.1203-1211, 1993)が知られており、本明細書
の実施例には、本発明のポリペプチドの好ましい態様で
あるキサントモナス由来の天然型プロリンイミノペプチ
ダーゼについて、その酵素作用の検定方法が記載されて
いるので、該酵素のアミノ酸配列の構成アミノ酸残基に
挿入、欠失若しくは置換を伴う変異ポリペプチドが上記
所望の作用を有するか否かは、当業者が容易に検定可能
である。
法については、例えば、アルバートソンらの方法(Alber
toson, N., and Koonmy, M., Molecular Microbiology,
9(6), pp.1203-1211, 1993)が知られており、本明細書
の実施例には、本発明のポリペプチドの好ましい態様で
あるキサントモナス由来の天然型プロリンイミノペプチ
ダーゼについて、その酵素作用の検定方法が記載されて
いるので、該酵素のアミノ酸配列の構成アミノ酸残基に
挿入、欠失若しくは置換を伴う変異ポリペプチドが上記
所望の作用を有するか否かは、当業者が容易に検定可能
である。
【０００９】本発明の別の態様によれば、キサントモナ
ス由来の天然型プロリンイミノペプチダーゼであるポリ
ペプチドまたはその変異ポリペプチドのアミノ酸配列を
分子中に含み、かつ、プロリンイミノペプチダーゼ活性
を有するポリペプチドが提供される。これらのポリペプ
チドは、上記天然型又は変異ポリペプチドの全長をポリ
ペプチド分子の一部として含むことを特徴とするもので
ある。
ス由来の天然型プロリンイミノペプチダーゼであるポリ
ペプチドまたはその変異ポリペプチドのアミノ酸配列を
分子中に含み、かつ、プロリンイミノペプチダーゼ活性
を有するポリペプチドが提供される。これらのポリペプ
チドは、上記天然型又は変異ポリペプチドの全長をポリ
ペプチド分子の一部として含むことを特徴とするもので
ある。
【００１０】さらに別の態様によれば、キサントモナス
由来の天然型プロリンイミノペプチダーゼであるポリペ
プチドまたはその変異ポリペプチドのアミノ酸配列のう
ちプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する部分配列
（いわゆる活性ドメイン）をその一部または全部とし、
プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
が提供される。このようなポリペプチドは、上記活性ド
メインのみからなる場合と、活性ドメインをその一部と
して含む場合がある。
由来の天然型プロリンイミノペプチダーゼであるポリペ
プチドまたはその変異ポリペプチドのアミノ酸配列のう
ちプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する部分配列
（いわゆる活性ドメイン）をその一部または全部とし、
プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
が提供される。このようなポリペプチドは、上記活性ド
メインのみからなる場合と、活性ドメインをその一部と
して含む場合がある。
【００１１】プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
上記ポリペプチドは、発現後に細胞内に貯留される場合
がある。このような場合、上記ポリペプチドのから膜結
合ドメイン（疎水性ドメイン）を選択的に除去し、残部
である活性ドメインを含むポリペプチドをシグナルペプ
チドを結合させることにより、細胞外分泌型の可溶化酵
素を製造することが可能である。疎水性ドメインの決定
方法としては、例えば、カイトらの方法(Kyte, J. et a
l., J. Mol. Biol., 157, pp.105-132, 1982)や、Hopp
& Woods法などの周知の方法を採用することができる。
また、このような目的に使用されるシグナルペプチドの
種類は特に限定されない。
上記ポリペプチドは、発現後に細胞内に貯留される場合
がある。このような場合、上記ポリペプチドのから膜結
合ドメイン（疎水性ドメイン）を選択的に除去し、残部
である活性ドメインを含むポリペプチドをシグナルペプ
チドを結合させることにより、細胞外分泌型の可溶化酵
素を製造することが可能である。疎水性ドメインの決定
方法としては、例えば、カイトらの方法(Kyte, J. et a
l., J. Mol. Biol., 157, pp.105-132, 1982)や、Hopp
& Woods法などの周知の方法を採用することができる。
また、このような目的に使用されるシグナルペプチドの
種類は特に限定されない。
【００１２】本発明の別の態様によれば、上記のポリペ
プチドのいずれかをコードするDNAが提供される。例え
ば、本発明のDNA には、上記のキサントモナス由来の天
然型プロリンイミノペプチダーゼをコードする任意の D
NA；その好ましい例として、配列表の配列番号１に示す
核酸配列の核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定
されるDNA が包含される。
プチドのいずれかをコードするDNAが提供される。例え
ば、本発明のDNA には、上記のキサントモナス由来の天
然型プロリンイミノペプチダーゼをコードする任意の D
NA；その好ましい例として、配列表の配列番号１に示す
核酸配列の核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定
されるDNA が包含される。
【００１３】また、キサントモナス由来の天然型プロリ
ンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列の構成アミノ酸残
基に挿入、欠失若しくは置換を伴う変異ポリペプチドで
あって、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする任意のDNA ；並びに、配列表の配
列番号１に示す核酸配列の核酸番号 1〜936(終始コドン
を含む）で特定されるDNA において１個若しくは２個以
上の核酸が挿入、欠失若しくは置換されたDNA であっ
て、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする任意のDNA なども本発明に包含され
る。
ンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列の構成アミノ酸残
基に挿入、欠失若しくは置換を伴う変異ポリペプチドで
あって、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする任意のDNA ；並びに、配列表の配
列番号１に示す核酸配列の核酸番号 1〜936(終始コドン
を含む）で特定されるDNA において１個若しくは２個以
上の核酸が挿入、欠失若しくは置換されたDNA であっ
て、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする任意のDNA なども本発明に包含され
る。
【００１４】さらに、配列表の配列番号１に示す核酸配
列の核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定される
DNA にハイブリッドする DNAであって、天然、合成若し
くは半合成によって得られ、かつ、配列表の配列番号１
に示すDNA に対して１又は２以上のヌクレオチドの置
換、欠失、挿入、及び／又は逆位その他の突然変異によ
って関連づけられており、かつアミノペプチダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードする DNAが提供される。
列の核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定される
DNA にハイブリッドする DNAであって、天然、合成若し
くは半合成によって得られ、かつ、配列表の配列番号１
に示すDNA に対して１又は２以上のヌクレオチドの置
換、欠失、挿入、及び／又は逆位その他の突然変異によ
って関連づけられており、かつアミノペプチダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードする DNAが提供される。
【００１５】配列表の配列番号１に示すDNA に１個若し
くは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置換された上
記DNA 配列は、例えば、配列表の配列番号１に示すDNA
のうち核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定され
るDNA を保持する大腸菌などの微生物を、突然変異誘発
剤（例えば、N-ニトロ-N'-ニトロ-N- ニトロソグアニジ
ンなど）で処理し、菌体から上記遺伝子を回収すること
により製造できる。また、前記DNA を亜硫酸ナトリウム
等の薬剤で直接処理することによっても製造可能であ
る。あるいは、前記DNA に対してヌクレオチドの挿入、
欠失、又は置換を直接導入してもよいが、このような直
接導入には、部位特異的変異法(Kramer, W., et al., M
ethods in Enzymology, 154, p.350, 1987) やリコンビ
ナントPCR法(PCR Technology, Stockton press, 1989)
を採用できる。
くは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置換された上
記DNA 配列は、例えば、配列表の配列番号１に示すDNA
のうち核酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定され
るDNA を保持する大腸菌などの微生物を、突然変異誘発
剤（例えば、N-ニトロ-N'-ニトロ-N- ニトロソグアニジ
ンなど）で処理し、菌体から上記遺伝子を回収すること
により製造できる。また、前記DNA を亜硫酸ナトリウム
等の薬剤で直接処理することによっても製造可能であ
る。あるいは、前記DNA に対してヌクレオチドの挿入、
欠失、又は置換を直接導入してもよいが、このような直
接導入には、部位特異的変異法(Kramer, W., et al., M
ethods in Enzymology, 154, p.350, 1987) やリコンビ
ナントPCR法(PCR Technology, Stockton press, 1989)
を採用できる。
【００１６】本発明のDNA のうち、キサントモナス由来
の天然型プロリンイミノペプチダーゼをコードする DNA
（配列表の配列番号１に示されるDNA)については、実施
例中に詳細に単離方法が記載されている。従って、実施
例に記載された方法に従って、あるいはその記述を参照
しつつそれらの方法に適宜に改変や修飾を加えることに
よって、キサントモナス属に属する微生物や他の属に属
する微生物に由来するプロリンイミノペプチダーゼをコ
ードするDNA を製造することは当業者にとって容易であ
る。なお、キサントモナス属に属するキサントモナス・
コンペストリス・シトリ(IFO 3781)は柑橘類潰瘍病菌の
一種であり、財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カル
チャーズ(1978)に記載されており、何人も入手可能であ
る。
の天然型プロリンイミノペプチダーゼをコードする DNA
（配列表の配列番号１に示されるDNA)については、実施
例中に詳細に単離方法が記載されている。従って、実施
例に記載された方法に従って、あるいはその記述を参照
しつつそれらの方法に適宜に改変や修飾を加えることに
よって、キサントモナス属に属する微生物や他の属に属
する微生物に由来するプロリンイミノペプチダーゼをコ
ードするDNA を製造することは当業者にとって容易であ
る。なお、キサントモナス属に属するキサントモナス・
コンペストリス・シトリ(IFO 3781)は柑橘類潰瘍病菌の
一種であり、財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カル
チャーズ(1978)に記載されており、何人も入手可能であ
る。
【００１７】さらに本発明により、上記のいずれかの D
NAを含み、かつその DNAが発現コントロール配列に発現
可能に結合されている組み換え DNAが提供される。この
ようなDNA を用いると、プロリンイミノペプチダーゼ活
性を有するポリペプチドを高純度で大量に製造すること
ができるので有用である。また、上記のDNA を含む組換
えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形
質転換体である細胞が提供される。ベクターの種類は当
業者に利用可能なものであれば特に限定されず、形質転
換すべき宿主細胞との組み合わせで適宜選択すべきであ
る。宿主細胞の種類も特に限定されず、大腸菌等の微生
物細胞（原核細胞）や動物若しくは植物細胞（真核細
胞）などの任意の細胞を用いることが可能である。
NAを含み、かつその DNAが発現コントロール配列に発現
可能に結合されている組み換え DNAが提供される。この
ようなDNA を用いると、プロリンイミノペプチダーゼ活
性を有するポリペプチドを高純度で大量に製造すること
ができるので有用である。また、上記のDNA を含む組換
えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形
質転換体である細胞が提供される。ベクターの種類は当
業者に利用可能なものであれば特に限定されず、形質転
換すべき宿主細胞との組み合わせで適宜選択すべきであ
る。宿主細胞の種類も特に限定されず、大腸菌等の微生
物細胞（原核細胞）や動物若しくは植物細胞（真核細
胞）などの任意の細胞を用いることが可能である。
【００１８】なお、本発明のプロリンイミノペプチダー
ゼは、タンパク質の一次構造の解析に用いる試薬などに
有用である。以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定され
ることはない。
ゼは、タンパク質の一次構造の解析に用いる試薬などに
有用である。以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定され
ることはない。
【００１９】
(1) 染色体ＤＮＡの調製 キサントモナス属に属するキサントモナス・コンペスト
リス・シトリ(IFO 3781)を 25 mlの培地（栄研普通ブイ
ヨン 11.0 g 、乾燥酵母 3.0 g 、マルトエキストラク
ト 3.0 g 、グリセロール 10.0 g 、ジャガイモ抽出液
1.0リットル）に接種して27℃で20時間好気的に培養し
た。集めた菌体を PBSで洗浄した後、リゾチーム（30 m
g/ml）で細胞膜を破壊し、フェノールを用いて定法によ
り染色体DNAを得た。
リス・シトリ(IFO 3781)を 25 mlの培地（栄研普通ブイ
ヨン 11.0 g 、乾燥酵母 3.0 g 、マルトエキストラク
ト 3.0 g 、グリセロール 10.0 g 、ジャガイモ抽出液
1.0リットル）に接種して27℃で20時間好気的に培養し
た。集めた菌体を PBSで洗浄した後、リゾチーム（30 m
g/ml）で細胞膜を破壊し、フェノールを用いて定法によ
り染色体DNAを得た。
【００２０】(2) ゲノミック・ライブラリーの作製 ベクタープラスミドpUC 18（ファルマシア社）1 μg を
制限酵素 Pst Iで切断した。一方、上記染色体DNA 3 μ
g を同じ制限酵素で部分消化し、ベクターDNAとのライ
ゲーションを行った。得られた結合混合物を大腸菌JM 1
09（日本ジーン社）に形質転換してライブラリーを作成
した。
制限酵素 Pst Iで切断した。一方、上記染色体DNA 3 μ
g を同じ制限酵素で部分消化し、ベクターDNAとのライ
ゲーションを行った。得られた結合混合物を大腸菌JM 1
09（日本ジーン社）に形質転換してライブラリーを作成
した。
【００２１】(3) スクリーニング スクリーニングに用いた DNAは以下のように調製した。
まず、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する精製タ
ンパク質(38 kD: キサントモナス菌から Osada, H., an
d Isono, K., Biochem. J., 233, pp.459-463, 1986 に
記載された方法により精製したもの）のＮ末端20アミノ
酸（配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸
残基番号１〜20まで）から予想される両鎖の DNAを合成
した（東亜合成社製）。次に、ベーリンガー社製のジゴ
キシゲニン (DIG)ラベリングキットのプロトコールに従
って上記の合成 DNAの標識体を製造した。
まず、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する精製タ
ンパク質(38 kD: キサントモナス菌から Osada, H., an
d Isono, K., Biochem. J., 233, pp.459-463, 1986 に
記載された方法により精製したもの）のＮ末端20アミノ
酸（配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸
残基番号１〜20まで）から予想される両鎖の DNAを合成
した（東亜合成社製）。次に、ベーリンガー社製のジゴ
キシゲニン (DIG)ラベリングキットのプロトコールに従
って上記の合成 DNAの標識体を製造した。
【００２２】前項で作製したライブラリーのうち約 2,0
00コロニーについてハイブリダイゼーションによるスク
リーニングを行ったところ、ひとつの陽性コロニーを得
ることができた。このクローンは 2.7 kbpのPst I 断片
を含むベクタープラスミドpUC 18を保持しており、該Ps
t I 断片は 311アミノ酸をコードする933 bpにおよぶ単
一のオープンリーディングフレームを有していた。そこ
でこのプラスミドを pPIと命名した。pPI の制限酵素地
図を図１に示す。なお、シークエンシングはファルマシ
ア社製の ALFを使用し、プロトコールの指示に従って反
応を行った。
00コロニーについてハイブリダイゼーションによるスク
リーニングを行ったところ、ひとつの陽性コロニーを得
ることができた。このクローンは 2.7 kbpのPst I 断片
を含むベクタープラスミドpUC 18を保持しており、該Ps
t I 断片は 311アミノ酸をコードする933 bpにおよぶ単
一のオープンリーディングフレームを有していた。そこ
でこのプラスミドを pPIと命名した。pPI の制限酵素地
図を図１に示す。なお、シークエンシングはファルマシ
ア社製の ALFを使用し、プロトコールの指示に従って反
応を行った。
【００２３】この遺伝子及び該遺伝子によりコードされ
るポリペプチドは、従来公知のDNA配列及びポリペプチ
ド配列のいずれとも相違していたため、このポリペプチ
ドをXc-アミノペプチダーゼと命名し、このポリペプチ
ドをコードするDNA を有するプラスミド pPIを保持する
大腸菌JM 109株を工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市）に寄託番号 FERM P-15251 として平
成７年10月25日付けで寄託した。
るポリペプチドは、従来公知のDNA配列及びポリペプチ
ド配列のいずれとも相違していたため、このポリペプチ
ドをXc-アミノペプチダーゼと命名し、このポリペプチ
ドをコードするDNA を有するプラスミド pPIを保持する
大腸菌JM 109株を工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市）に寄託番号 FERM P-15251 として平
成７年10月25日付けで寄託した。
【００２４】(4) プロリンイミノペプチダーゼ活性の測
定 活性測定は、アルバートソンらの方法(Albertson, N.
H. and Koomy, M., Molecular Microbiology, 9(6), p
p.1203-1211, 1993)の方法に従って行った。プラスミド
pPIとpUC 18を保持している大腸菌JM 109をそれぞれ対
数増殖期まで培養した後、その培養液にイソプロピル-1
- チオ−β-D- ガラクトピラノシド (IPTG) を最終濃度
が 0.4 mM になるように添加した。培養を20時間継続し
た後に集菌し、菌体を PBSに懸濁して超音波破砕機によ
り細胞を破壊して粗酵素液を製造した。
定 活性測定は、アルバートソンらの方法(Albertson, N.
H. and Koomy, M., Molecular Microbiology, 9(6), p
p.1203-1211, 1993)の方法に従って行った。プラスミド
pPIとpUC 18を保持している大腸菌JM 109をそれぞれ対
数増殖期まで培養した後、その培養液にイソプロピル-1
- チオ−β-D- ガラクトピラノシド (IPTG) を最終濃度
が 0.4 mM になるように添加した。培養を20時間継続し
た後に集菌し、菌体を PBSに懸濁して超音波破砕機によ
り細胞を破壊して粗酵素液を製造した。
【００２５】これらの粗酵素液を SDSポリアクリルアミ
ド電気泳動とウェスタンブロッティングにより解析した
ところ、 pPIを保持する大腸菌にのみ、キサントモナス
・コンペストリス・シトリ IFO 3781 株から精製した酵
素に対する抗体 (Osada, H.and Isono, K., J. Antibio
tics, 39, pp.286-293, 1986 の方法により調製したも
の）に反応する 38 kDのバンドが認められた。前記酵素
液を用い、プロリンパラニトロアニリドを基質として上
述のアルバートソンらの方法に従って410 nmにおける吸
光度を測定したところ、図２の結果を得た。この結果か
ら明らかなように、 pPIを保持する大腸菌由来の酵素抽
出液にのみプロリンイミノペプチダーゼ活性が認められ
た。
ド電気泳動とウェスタンブロッティングにより解析した
ところ、 pPIを保持する大腸菌にのみ、キサントモナス
・コンペストリス・シトリ IFO 3781 株から精製した酵
素に対する抗体 (Osada, H.and Isono, K., J. Antibio
tics, 39, pp.286-293, 1986 の方法により調製したも
の）に反応する 38 kDのバンドが認められた。前記酵素
液を用い、プロリンパラニトロアニリドを基質として上
述のアルバートソンらの方法に従って410 nmにおける吸
光度を測定したところ、図２の結果を得た。この結果か
ら明らかなように、 pPIを保持する大腸菌由来の酵素抽
出液にのみプロリンイミノペプチダーゼ活性が認められ
た。
【００２６】
【発明の効果】本発明のポリペプチドは、タンパク質の
一次構造を解析するための試薬として有用である。ま
た、本発明のDNA は、上記ポリペプチドを高純度で大量
に製造する際に有用である。
一次構造を解析するための試薬として有用である。ま
た、本発明のDNA は、上記ポリペプチドを高純度で大量
に製造する際に有用である。
【００２７】
配列番号：１ 配列の長さ：1156 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖 配列の特徴：1-311 酵素 配列 cggtaagcgcagaaggttg -121 ggtgcgctcttcagggcttggcccatcacggcgaactcttctcttcgaatcgcatggcg -61 gcttgcccgtgtgcgtgcgcagctgccgatacactagcggtttcccgcaggaccgacgc -1 ATG CGC ACG CTC TAT CCC GAG ATC ACG CCC TAC CAG CAG GGC AGC 45 Met Arg Thr Leu Tyr Pro Glu Ile Thr Pro Tyr Gln Gln Gly Ser 15 CTG AAG GTC GAC GAT CGC CAT ACG CTG TAC TTC GAG CAG TGC GGC 90 Leu Lys Val Asp Asp Arg His Thr Leu Tyr Phe Glu Gln Cys Gly 30 AAT CCG CAC GGC AAG CCG GTG GTG ATG TTG CAT GGC GGC CCC GGC 135 Asn Pro His Gly Lys Pro Val Val Met Leu His Gly Gly Pro Gly 45 GGC GGA TGC AAC GAC AAG ATG CGG CGC TTC CAC GAC CCG GCC AAG 180 Gly Gly Cys Asn Asp Lys Met Arg Arg Phe His Asp Pro Ala Lys 60 TAC CGC ATC GTG CTG TTC GAT CAG CGC GGT TCC GGC CGC TCT ACG 225 Tyr Arg Ile Val Leu Phe Asp Gln Arg Gly Ser Gly Arg Ser Thr 75 CCG CAT GCC GAT CTG GTG GAC AAC ACC ACC TGG GAT CTG GTG GCC 270 Pro His Ala Asp Leu Val Asp Asn Thr Thr Trp Asp Leu Val Ala 90 GAT ATC GAA CGC GTG CGC ACG CAT CTG GGG GTC GAT CGC TGG CAG 315 Asp Ile Glu Arg Val Arg Thr His Leu Gly Val Asp Arg Trp Gln 105 GTG TTC GGG GGC AGC TGG GGA TCC ACG CTG GCG CTG GCC TAC GCG 360 Val Phe Gly Gly Ser Trp Gly Ser Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala 120 CAG ACC CAT CCG CAG CAG GTC ACC GAG CTG GTG CTG CGC GGT ATT 405 Gln Thr His Pro Gln Gln Val Thr Glu Leu Val Leu Arg Gly Ile 135 TTC CTG CTG CGT CGC TTC GAA CTC GAA TGG TTC TAC CAG GAA GGT 450 Phe Leu Leu Arg Arg Phe Glu Leu Glu Trp Phe Tyr Gln Glu Gly 150 GCC AGC CGC CTG TTC CCG GAT GCG TGG GAG CAT TAC CTC AAC GCG 495 Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Ala Trp Glu His Tyr Leu Asn Ala 165 ATT CCG CCG GTG GAA CGC GCC GAC TTG ATG TCT GCA TTC CAT CGC 540 Ile Pro Pro Val Glu Arg Ala Asp Leu Met Ser Ala Phe His Arg 180 CGT CTC ACC AGC GAT GAC GAG GCC ACG CGT CTG GCT GCG GCC AAA 585 Arg Leu Thr Ser Asp Asp Glu Ala Thr Arg Leu Ala Ala Ala Lys 195 GCC TGG AGC GTG TGG GAA GGC GCC ACC AGC TTC CTG CAT GTC GAC 630 Ala Trp Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Phe Leu His Val Asp 210 GAG GAC TTC GTC ACC GGA CAT GAA GAC GCG CAC TTT GCC CTG GCG 675 Glu Asp Phe Val Thr Gly His Glu Asp Ala His Phe Ala Leu Ala 225 TTC GCA CGC ATC GAA AAC CAT TAC TTC GTC AAC GGC GGT TTC TTC 720 Phe Ala Arg Ile Glu Asn His Tyr Phe Val Asn Gly Gly Phe Phe 240 GAG GTC GAA GAC AGT TGC TGC GCG ACG GAT CGC ATT GCC GAC ATT 765 Glu Val Glu Asp Ser Cys Cys Ala Thr Asp Arg Ile Ala Asp Ile 255 CCC GGC GTG ATC GTG CAC GGC CGC TAC GAT GTG GTG TGC CCG CTG 810 Pro Gly Val Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Val Val Cys Pro Leu 270 CAA AGC GCG TGG GAC CTG CAC AAG GCG TGG CCG AAG CAG TTG CAG 855 Gln Ser Ala Trp Asp Leu His Lys Ala Trp Pro Lys Gln Leu Gln 285 ATC AGC CCG GCA TCG GGG CAC TCA GCG TTC GAA CCG GAA AAC GTC 900 Ile Ser Pro Ala Ser Gly His Ser Ala Phe Glu Pro Glu Asn Val 300 GAT GCC TTG GTG CGT GCC ACC GAC GGG TTT GCG TAA cgagtgcatgc 933 Asp Ala Leu Val Arg Ala Thr Glu Gly Phe Ala * 311 gcatcgatcagagttcgctttggtcgatcggcatgatctctgccggacgcgctgaggtg cgatgacatacgca
【図１】 本発明のDNA を組み込んだプラスミドpPI の
制限酵素地図を示す図である。
制限酵素地図を示す図である。
【図２】 プラスミドpPI を保持する大腸菌から得た粗
抽出液のアミノペプチダーゼ活性を示す図である。
抽出液のアミノペプチダーゼ活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
（アミノ酸番号１〜311)により特定されるポリペプチ
ド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
（アミノ酸番号１〜311)において１個若しくは２個以上
のアミノ酸残基が挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸
配列を有し、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
ポリペプチド。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを
分子中に含み、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有す
るポリペプチド。 - 【請求項４】 請求項１又は２に記載のポリペプチドの
部分ポリペプチドであってプロリンイミノペプチダーゼ
として作用する活性ドメインを、その一部または全部と
するポリペプチド。 - 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
するDNA 。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に示す核酸配列の核
酸番号 1〜936(終始コドンを含む）で特定される請求項
５に記載のDNA 。 - 【請求項７】 請求項６に記載のDNA において１個若し
くは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置換されたDN
A であって、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするDNA 。 - 【請求項８】 請求項６に記載の DNAにハイブリッドす
る DNAであって、天然、合成若しくは半合成によって得
ることができ、請求項６に記載の DNAに対してヌクレオ
チドの置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入
およびヌクレオチド配列の逆位その他の突然変異によっ
て関連づけられており、かつ、プロリンイミノペプチダ
ーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA。 - 【請求項９】 請求項５ないし８のいずれか１項に記載
のDNA を含む組換えベクター。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の組換えベクターによ
り形質転換された形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7282716A JPH09121860A (ja) | 1995-10-31 | 1995-10-31 | プロリンイミノペプチダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7282716A JPH09121860A (ja) | 1995-10-31 | 1995-10-31 | プロリンイミノペプチダーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121860A true JPH09121860A (ja) | 1997-05-13 |
Family
ID=17656118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7282716A Pending JPH09121860A (ja) | 1995-10-31 | 1995-10-31 | プロリンイミノペプチダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09121860A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
-
1995
- 1995-10-31 JP JP7282716A patent/JPH09121860A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| US7618796B2 (en) | 2001-07-26 | 2009-11-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and peptide producing method |
| WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0612350A1 (en) | Ubiquitin-specific proteases | |
| Zhao et al. | Expression, characterization, and crystallization of a member of the novel phospholipase D family of phosphodiesterases | |
| Schlatter et al. | The primary structure of the psychrophilic lactate dehydrogenase from Bacillus psychrosaccharolyticus | |
| JPH09121860A (ja) | プロリンイミノペプチダーゼ | |
| FI93125B (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| JP3396033B2 (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| US5217880A (en) | L-fucose dehydrogenase gene, microorganism having said gene and production of l-fucose dehydrogenase by the use of said microorganism | |
| JP3375834B2 (ja) | 組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼ | |
| CA2243598C (en) | Cold-active protease cp70 | |
| JP3173619B2 (ja) | ピログルタミルアミノペプチダーゼの製造法 | |
| JPH09505989A (ja) | 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現 | |
| CA2451528C (en) | Novel aminopeptidase derived from bacillus licheniformis, gene encoding the aminopeptidase, expression vector containing the gene, transformant and method for preparation thereof | |
| JP3060019B2 (ja) | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 | |
| JPH09173083A (ja) | エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＡ遺伝子 | |
| JP2001258577A (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
| JP2671008B2 (ja) | シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 | |
| JPH09131181A (ja) | 変異型ｄｎａポリメラーゼ | |
| KR100532847B1 (ko) | β-프룩토푸라노시다아제활성을가진폴리펩티드 | |
| JP5004389B2 (ja) | レバンビオース生成酵素遺伝子 | |
| JPH0690765A (ja) | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法 | |
| JPH0856663A (ja) | 新規セルラーゼおよびその遺伝子 | |
| JP2001161375A (ja) | コレステロール・エステラーゼ遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びコレステロール・エステラーゼの製造法 | |
| JPH11318454A (ja) | プロリンジペプチダーゼをコードする遺伝子 | |
| JP4022611B2 (ja) | 好熱性アミノペプチダーゼ | |
| SCHLATTER et al. | Structure and function of L-lactate dehydrogenase from thermophilic, mesophilic and psychrophilic bacteria, VIII. The primary structure of the psychrophilic lactate dehydrogenase from Bacillus psychrosaccharolyticus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040330 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040413 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040804 |