CN114891665B

CN114891665B - 一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用

Info

Publication number: CN114891665B
Application number: CN202210413478.1A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 龚劲松; 高涵; 许正宏; 苏畅
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114891665A

Abstract

本发明公开了一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，本发明的杓兰果胶杆菌，保藏编号为CGMCC No.17442。本发明首次报道了一种产海藻糖酶的杓兰果胶杆菌，海藻糖酶酶活为19U/mL。将该海藻糖酶基因在大肠杆菌体系中异源表达，重组菌在5 L罐发酵28 h达到最高酶活2150 U/mL。重组蛋白PCTre的最适反应温度和pH分别为35°C和5.5，在25‑55°C、pH 5‑8.5条件下均有较好的稳定性，对有机溶剂耐受性好，在10%乙醇溶液中16 h仍能保留70%的酶活。该海藻糖酶水解酵母粉中海藻糖，可在20 min内完全水解，体系中可利用糖比率从1.45%增加到10.31%。

Description

一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用

技术领域

本发明涉及一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，属于工业微生物技术领域。

背景技术

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1糖苷键构成的非还原性糖，性质稳定，能耐受高温。海藻糖酶(Trehalase)可将其水解为葡萄糖，在食品、农业、发酵工业等领域应用广泛。

酵母具有利用糖质原料合成海藻糖的能力，在高浓糖质底物发酵体系中酵母甚至能够合成4％以上的海藻糖，成为发酵液中残糖的主要部分，导致原料利用率下降。为此，杜邦公司在2016年推出Synerxia发酵技术体系，其核心创新是在酶制剂中加入了海藻糖酶，宣称可降低糖耗并增产乙醇2％。随后诺维信公司在2017年也推出了含海藻糖酶的全新淀粉酶产品，其目标是将二糖残留值降低达70％，此举进一步推动了海藻糖酶的应用。然而我国海藻糖酶的研究相对滞后，亟须在海藻糖酶新基因发现、高表达体系以及应用研究方面予以重视，提高产酶水平、降低生成成本、改善催化性能以更好地用于工业生产。

由于在昆虫体内，海藻糖是重要的能量物质，因此海藻糖酶及海藻糖合成酶的研究一直是昆虫代谢机制、昆虫抗逆特性研究的关注点，昆虫海藻糖酶基因位点也被作为农业杀虫剂的新靶点；而在微生态领域，由于海藻糖酶能够破坏生物膜的形成与稳定，也可以作为绿色抑菌剂成分进行使用；此外，在临床医学研究中，发现海藻糖酶的竞争性抑制剂1,5-脱水山梨醇(1,5-AG)是血液中能够反应血糖中长期代谢水平的关键指标，比糖化血红蛋白(HbA1c)更为敏感，因而利用海藻糖酶开发1,5-AG的检测试剂盒也是国际研究中的一个热点，其在临床检测领域潜力巨大。

酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉等酵母制品中通常含有较高的海藻糖，作为培养基用于工程菌发酵时，所含的海藻糖可干扰微生物的代谢，如果在酵母制品生产过程中，采用海藻糖酶将其转化为葡萄糖，不仅能够降低对微生物的影响、使培养过程和产物代谢更为可控，而且可以提高酵母粉的发酵利用效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一株产海藻糖酶菌A4，经鉴定为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)以及表达海藻糖酶的重组菌株及应用。

本发明的第一个目的是提供一株杓兰果胶杆菌，命名为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17442。

本发明的第二个目的是提供一种海藻糖酶，所述海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种编码所述的海藻糖酶的基因。

进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的海藻糖酶的重组细胞或重组菌。

进一步地，所述的重组菌以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的海藻糖酶、重组细胞或重组菌在水解酵母制品中的应用。

进一步地，所述的应用包括如下步骤：将海藻糖酶添加至酵母制品溶液中对酵母制品进行水解。

进一步地，水解的条件为：反应温度30～37℃、反应pH 5～6、酵母制品浓度1～10％，加酶量50～200U。

本发明的有益效果是：

本发明筛选获得一株产海藻糖酶的野生菌，通过形态学和分子生物学鉴定将其命名为杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii，克隆了其海藻糖酶编码基因PCTre并在大肠杆菌体系实现了成功异源表达，酶活为289.40U/mL，蛋白分子量为64kDa。5L罐上发酵，28h时酶活可达到2150U/mL。对其酶学性质探究表明其能够在酸性条件下发挥水解作用，其反应的最适pH为5.5，最适温度为35℃。该酶具有良好的稳定性，能够耐受有机溶剂，尤其是乙醇体系下酶活性能够维持较长的时间。该酶对海藻糖有高度的水解特异性。此外，探究了以PCTre作为海藻糖酶，水解酵母制品最适宜的条件，即反应温度36℃、反应体系pH 5.5、酵母制品浓度5％，加酶量100U，水解时间20min。以海藻糖含量最高的Procelys YeastExtract7样品为例(海藻糖含量为8.42％)，在最适反应条件下，其海藻糖在20min内可完成完全降解，体系中葡萄糖含量相应从1.45％增加到10.31％。后续研究将进一步优化重组菌的罐上发酵工艺，提高重组菌的酶活、降低生产成本，以期推进海藻糖酶在酵母制品水解及其他领域的工业化应用。

生物材料保藏：

杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17442。

附图说明：

图1电镜下杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii的菌株形态。

图2基于杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii16S rDNA序列的系统进化树分析结果。

图3为PCR扩增海藻糖酶编码基因的核酸电泳图谱。泳道1-5：扩增得到的海藻糖酶基因(PCTre)；泳道M：2000bp DNA Marker。

图4为pET-3b(+)-PCTre质粒双酶切后的核酸电泳图谱。泳道1-5：双酶切后的pET-3b(+)-PCTre质粒；泳道M：10000bp DNA Marker。

图5为重组菌E.coli BL21/pET-3b(+)-PCTre的SDS-PAGE图谱。泳道1-3：对照菌株破碎上清、E.coli BL21(DE3)/pET3b-PCTre上清、E.coli BL21(DE3)/pET3b-PCTre破碎上清；泳道M：蛋白标准Marker。

图6为PCTre的最适pH(A)及pH稳定性(B、C)。

图7为PCTre的最适温度(A)及温度稳定性(B、C)。

图8为金属离子对PCTre酶活的影响。

图9为有机溶剂对PCTre酶活的影响。

图10为表面活性剂对PCTre酶活的影响。

图11为5L发酵罐放大产酶结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

海藻糖酶酶活性的测定方法

10％海藻糖底物的配制：将10g海藻糖溶于100ml去离子水中配制成10％的海藻糖底物溶液。

测定方法：根据3,5-二硝基水酸(DNS)比色法测定海藻糖酶分解海藻糖产生的葡萄糖含量。分别以发酵液和海藻糖溶液为实验组，发酵液和水作为对照组，37℃反应15min，加入DNS试剂，沸水浴终止反应，冷却后使用酶标仪在540nm处测量吸光值。制备不同浓度的葡萄糖溶液，建立葡萄糖标准曲线。

酶活计算方法：酶活(1U)定义为上述实验条件下，1mL的酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，测定均重复3次。以此作为海藻糖酶酶活标准测定方法。

实施例1：杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)的富集筛选过程

从江苏无锡长广溪湿地公园采集土壤样品，取土壤悬液上清，富集培养，以海藻糖为碳源的固体筛选培养基进行筛选，挑选平板菌株接种于液体筛选培养基培养36h，通过海藻糖酶活测定筛选高酶活菌株。以通用引物27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492r(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)为引物，提取野生菌基因组，扩增16S rDNA并测序，与Genbank中已有的序列比对，进行菌种鉴定和保藏。

该野生菌菌落为较小的圆形，呈乳白色，边缘整齐，无芽孢，镜检结果见图1，革兰氏染色显示为革兰氏阴性菌。将其编号为A4。该菌株的16S rDNA序列长度为1408bp，在NCBI数据库中进行核苷酸序列Blast比对，并建立系统进化树(图2)。结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)。测定了以海藻糖为底物时，菌株A4的酶促反应最适温度为35℃，最适pH 6.0，海藻糖酶酶活为19U/mL。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17442。

实施例2：海藻糖酶基因的克隆和表达

从NCBI获取野生菌A4的海藻糖酶基因PCTre，以其为模板设计扩增引物F1(5’-taagaa gga gat ata cat atg ATT AAT ACT AAC CAC CAG CAA AAT AAT GT-3’)和R1(5’-gctttg tta gca gcc gga tcc TCA ATC CGC CAG CAA ATG C-3’)。以基因组为模板进行PCR扩增，回收扩增产物(图3)，同时用BamHⅠ、NdelⅠ内切酶线性化pET3b质粒并回收。用一步重组克隆试剂盒将PCR扩增产物和线性化质粒于连接，转化到E.coli JM109中，涂布培养，取单菌落进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定(图4)。将海藻糖酶表达载体pET3b-PCTre转入E.coliBL21(DE3)中，发酵36h。离心收集菌体，将菌体用去离子水复溶，超声破碎30min，离心收集上清液和沉淀，分别进行酶活测定和SDS-PAGE。

结果显示，海藻糖酶PCTre基因长度1656bp(SEQ No.2)，编码氨基酸552个(SEQNo.1)。与NCBI数据库的其他海藻糖酶比对发现PCTre与来自Pantoea cypripedii的海藻糖酶TreF(WP_084876646.1)具有最大的相似性为86.59％；另外与同样来自Pantoeacypripedii的海藻糖酶TreF(MBP2194980.1)具有81.16％的相似性。重组菌E.coli BL21/pET3b-PCTre酶活达到289.40U/mL，为野生菌A4酶活的14.5倍。因而以该重组菌进行后续研究。SDS-PAGE结果表明PCTre的蛋白大小为64kDa左右，符合预期(图5)。

实施例3：海藻糖酶酶学性质的测定

考察海藻糖酶对双糖的水解活性，分别以10％的蔗糖、麦芽糖、乳糖作为底物替换海藻糖，测定海藻糖酶对双糖的催化活性；用不同pH的磷酸缓冲液代替去离子水稀释酶液，获得最适pH值；将酶液置于不同pH的缓冲液中冰浴1h，并测定酶活，以不同pH下最初的酶活为100％，获得pH稳定性曲线；将酶活标准测定方法中的温度改为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，获得最适温度；按照酶活标准测定方法，在25-70℃下孵育1h，以不同温度下最初的酶活为100％，获得温度稳定性曲线；分别配制200mmol/L的Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、K⁺、Na⁺、Fe²⁺、Sn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Co²⁺和Li⁺等金属离子溶液，以不同的终浓度加入海藻糖酶酶活检测体系中，以不加金属离子的反应作为对照，测定不同金属离子对酶活的影响)；分别配制甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙酮的溶液，以5％和10％的终浓度加入酶活检测反应体系中，测定不同有机溶剂对酶活的影响；分别配制吐温40(Tween-40)、吐温80(Tween-80)、曲拉通100(Tritonx-100)、曲拉通114(Tritonx-114)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)和二甲基亚砜(DMSO)的溶液，以0.1％和0.5％的终浓度加入酶活检测反应体系，测定不同表面活性剂对酶活的影响。

结果表明本论文研究的海藻糖酶PCTre只对海藻糖有水解作用，具有高度底物特异性；海藻糖酶PCTre的最适pH为5.5(图6A)，在pH 4-6范围内的相对酶活力在80％以上。当pH小于4或大于7.5时，相对酶活急剧下降，总体来说在酸性环境下相对酶活更高(图6B、C)，适合在乙醇、氨基酸等发酵过程中使用。对PCTre1的最适作用温度进行了检测(图7A)，发现其在35℃下酶活最高，在25-50℃下相对酶活超过60％，温度超过55℃后酶活急剧下降，在70℃时相对酶活约为30％。在不同温度下保温1h，发现PCTre在25-45℃处理后残余酶活均能超过75％，而45℃以上的温度会导致残余酶活显著降低(图7B、C)。不同浓度的Mn²⁺离子对酶活均有较为明显的促进作用，5mmol/L和10mmol/L浓度的Mn²⁺处理下相对酶活超过240％。1mmol/L和5mmol/L浓度的K⁺对酶活影响不大，但10mmol/L浓度处理下，海藻糖酶酶活降至67.0％；1mmol/L的Al³⁺、Li⁺对酶活影响不大，而5mmol/L及以上的浓度处理后，相对酶活大大降低；Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺的对酶活具有较高的抑制作用(图8)。在10％的丙酮体系中，海藻糖酶相对酶活接近60％；在10％的乙醇体系中，相对酶活接近90％(图9A)。进一步探究了10％浓度的乙醇对PCTre活性的影响(图9B)，16h后PCTre剩余酶活仍超过70％，处理32h后剩余酶活为36％并趋于稳定，在乙醇环境中的耐受性说明PCTre适用于乙醇发酵工业作为酶制剂添加。而表面活性剂差异较大(图10)，其中曲拉通X-114对酶活有很大提升，0.5％吐温40能使海藻糖酶相对酶活达到178.7％，但0.1％的吐温40却导致酶活大量损失。

实施例4：海藻糖酶重组菌在5L发酵罐中产酶情况

为了进一步提高海藻糖酶的表达量和酶活，在固体LB平板上活化重组菌E.coliBL21(DE3)/pET3b-PCTre，于37℃培养12h，挑取单菌落接种到一级种子培养基中培养12h，以2％的接种量接种到二级种子培养基中培养10-12h。采用5L发酵罐，加入3L TB培养基灭菌。冷却后以10％的接种量将二级种子液接种到发酵罐中。初始培养温度37℃、pH 7.2。转速和通气量联动，控制溶氧水平不低于30％。每隔4h取样检测菌浓(OD₆₀₀)和海藻糖酶酶活。

重组菌E.coli BL21(DE3)/pET3b-PCTre在以8g/L的甘油为碳源的发酵培养基中生长正常，OD₆₀₀在20h达到最大值17.3，随后进入稳定期，菌浓逐渐下降；酶活在28h达到最大值2150U/mL，36h后逐渐下降；发酵过程中，pH随着先下降至6.25，随后上升到7.38，后期趋于稳定(图11)。

实施例5：酶法检测海藻糖含量方法的建立

酶解反应体系包含去离子水稀释的100μL酶液+400μL海藻糖标品溶液，体系中海藻糖酶总活力为100U；反应在37℃下进行60min，反应完成后取样，用生物传感分析仪测定葡萄糖含量。

配制不同浓度(0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、2.5g/L、5.0g/L)的海藻糖溶液，酶法测量海藻糖含量，与实际浓度进行对比(表1)。检测结果与实际浓度无显著差别，检测结果准确；5次平行检测确定的相对标准偏差均小于5％，表明该方法检测海藻糖含量稳定性较好。

葡萄糖与海藻糖含量的换算公式如下：

C_T＝0.95(C₂-C₁)

式中：

C_T—反应体系中海藻糖含量，mg/ml；

C₁—酶解前葡萄糖含量，mg/ml；

C₂—酶解后葡萄糖含量，mg/ml；

0.95—海藻糖与葡萄糖含量换算系数。

表1酶法水解海藻糖标品及该检测方法的稳定性

取3种酵母制品(Procelys Nucel 870酵母抽提物膏、Procelys Nucel 880酵母提取物、Procelys Nucel Yeast Extract 7)作为样品，分别用HPLC法和酶法同时检测其海藻糖含量，将两种方法检测得出的海藻糖含量进行比较(表2)，确定酶法检测海藻糖含量的可行性。

表2两种检测海藻糖方法的差异性分析

实施例6：海藻糖酶水解酵母粉的探究

取5％的酵母制品水溶液(Procelys Nucel 870、Procelys Nucel 880、ProcelysNucel Yeast Extract 7、Sinopharm、Angel、Basebio、Macklin、OXOID)作为样品，在37℃、pH 5.5条件下用100U海藻糖酶PCTre水解60min，测量其海藻糖含量(表3)。

以PCTre为水解酶，在不同温度(32℃、34℃、36℃、38℃)、pH条件(5.0、5.5、6.0、6.5)、不同浓度的酵母制品(1％、5％、10％)和不同的加酶量(50U、100U、200U)下进行水解实验，测定海藻糖含量。确定酶解酵母制品最适宜的温度、pH、酵母制品浓度、加酶量和水解时间。

表3水解前后酵母制品的葡萄糖含量

研究显示，适宜的水解温度是36℃，但OXOID公司的酵母样品受温度影响较小；适宜的水解pH为5.5，而Procelys Yeast Extract 7和Procelys 870的受pH影响较大，当pH为6.5时水解完全需要长达50min的时间。在优化的水解条件下，采取5％的样品浓度进行水解，全程仅需20min，其水解过程迅速，较为完全。加酶量大，其水解所需时间更少，综合考虑，其适宜的加酶量在1-20U/g。

以酵母制品最适宜的水解条件，测量水解前后酵母制品葡萄糖含量的变化，结果如表3，水解后酵母制品的葡萄糖含量均有增加，其中Procelys Yeast Extract 7增加最为明显，从1.45％增加到10.31％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Asn Thr Asn His Pro Gln Asn Asn Val Phe Glu Glu His Arg Gly

1 5 10 15

Asp Ala Glu Leu Lys Tyr Gln Gln Leu Pro His Glu Leu Ile Leu Glu

20 25 30

Gly Met Gln Asp Ser Glu Pro Glu Pro Glu Leu Ile Glu Gly Leu Pro

35 40 45

Ala Pro Asp Ala Leu Thr Pro Ala Asp Arg Tyr Met Glu Leu Phe Glu

50 55 60

His Val Gln Met Ser Arg Ile Phe Ala Asp Ser Lys Thr Phe Pro Asp

65 70 75 80

Cys Ala Pro Lys Tyr Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Arg Tyr Arg Arg

85 90 95

Arg Lys Arg Ser Ala Asp Phe Asp Leu Leu Lys Phe Val His Asp His

100 105 110

Phe Tyr Leu Pro Gln Ser Asn Glu Ser Phe Tyr Val Ser Asn Pro Asp

115 120 125

Lys Thr Leu Thr Glu His Ile Glu Pro Asp Ile Leu Val Leu Thr Lys

130 135 140

Met Pro Cys Glu His Met Pro His Ser Ser Leu Leu Pro Leu Pro Lys

145 150 155 160

Pro Tyr Val Val Pro Gly Gly Arg Phe Gly Glu Thr Tyr Tyr Trp Asp

165 170 175

Ser Tyr Phe Thr Met Leu Gly Leu Gln Glu Ser Ser Ala Gln Pro Leu

180 185 190

Leu Arg Asp Met Ala Asp Asn Asp Ala Trp Leu Ile Asp Asn Tyr Gly

195 200 205

His Val Pro Asn Gly Asn Arg Thr Tyr Leu Leu Ser Arg Ser Gln Pro

210 215 220

Pro Asn Tyr Ala Leu Met Val Glu Leu Phe Glu Glu Leu Leu Lys Arg

225 230 235 240

Gly Ala Lys Arg Tyr Leu Asp His Leu Tyr Lys Ser Tyr Gln Phe Trp

245 250 255

Asp Ala Gly Ala Gly Ser Leu His Pro Asp Gln Ala Tyr Arg His Val

260 265 270

Val Arg Met Pro Asp Asp Ser Leu Asn His Phe Tyr Trp Asp Asp Arg

275 280 285

Asp Thr Pro Arg Asp Glu Ser Gly Ile Glu Asp Val Glu Tyr Phe Ser

290 295 300

Lys Ser Arg Arg Pro Ala Asn Glu Val Tyr Arg Ala Ala Trp Leu Gly

305 310 315 320

Ala Ala Ser Gly Trp Asp Tyr Leu Ser Arg Trp Leu Arg Asp Pro His

325 330 335

Arg Leu Ala Ser Ile Arg His Thr Gln Phe Ile Pro Val Asp Leu Asn

340 345 350

Ala Phe Leu Tyr Lys Thr Glu Leu Met Ile Ser Thr Leu Ser His Thr

355 360 365

Lys Gly Glu Glu Leu Thr Ala Leu Ala Val Gln Lys Lys Ala Asp Val

370 375 380

Arg Lys Arg Arg Ile His Arg Tyr Leu Trp Asp Gln Thr Ala Gly Val

385 390 395 400

Tyr Arg Asp Tyr Ala Trp Arg Arg Gln Arg Phe Gly Ala Phe Met Ala

405 410 415

Ala Ala Val Val Pro Leu Phe Leu Gly Leu Ala Thr Pro Glu Gln Ala

420 425 430

His Leu Gln Ala Val Ala Leu Arg Gln Leu Leu Leu Thr Gln Gly Gly

435 440 445

Leu Val Thr Ser Met Val Glu Ser Gly Glu Gln Trp Asp Lys Pro Asn

450 455 460

Gly Trp Ala Pro Leu Gln Trp Met Ala Ile Val Gly Leu Asn His Tyr

465 470 475 480

Gly Glu Glu Thr Leu Ala Thr Glu Ile Ala Val Asn Trp Leu Thr Thr

485 490 495

Val Lys Asn Phe Tyr Ser Leu His His Lys Leu Val Glu Lys Tyr Asp

500 505 510

Ile Ser Gly Glu Arg Ala Arg Pro Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala Lys

515 520 525

Pro Cys Asp Ser Val Pro Glu Asn Gln Pro Ala Ala Asn Glu Glu Ala

530 535 540

Ala Pro Val Lys Ala Ala Ala Gln

545 550

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgtatcagc aattgcccca tgagcttatc ctcgaaggca tgcaggactc tgagccagaa 60

ccggagctaa tagaaggact gcctgccccc gatgcattaa ccccagcgga ccgctacatg 120

gagttgttcg aacacgtcca aatgtcccga atttttgctg attcaaagac attcccggac 180

attaatacta accatcctca aaataacgtt tttgaagagc accgtggtga tgctgaatta 240

tgtgccccta aatatgatcc ccttgacatc ctcatacggt acagaaggcg taagcgctcg 300

gcagattttg acctactgaa attcgtacat gatcactttt atttaccaca gagtaatgag 360

agcttctacg tgtctaaccc ggacaagacg ttgactgaac atattgagcc tgatatcctt 420

gttctcacca aaatgccctg cgaacacatg ccacattcct cactactgcc gttacctaag 480

ccctatgtcg taccaggggg tcgatttggc gagacatact attgggactc gtacttcacg 540

atgttgggac ttcaagaaag tagcgcgcag ccgctcctac gggatatggc tgacaatgat 600

gcctggctga tagacaacta tgggcacgtg cctaatggta acagaactta cttattgtct 660

aggtcccaac ccccaaatta tgcacttatg gttgagctct ttgaagagct actgaaacgt 720

ggcgcgaagc gctacttaga tcatttgtat aaatcatacc agttctggga cgctggagcc 780

gggtcgcttc acccggatca agcatatcga catgtcgtac ggatgcctga cgatagtctc 840

aaccactttt actgggacga tagagacacc cccagggatg aaagcggtat tgaggacgtg 900

gaatatttct ctaagtcccg tcgcccagcg aatgaggttt accgagctgc ctggctaggc 960

gcagcgtcag gatgggatta tctgtcgcgg tggttaagag acccgcatag gttggctagt 1020

atccgtcaca cacagtttat acctgtcgat cttaacgcct tcctctacaa aacggaacta 1080

atgattagca ctctgtctca taccaagggg gaggaattaa cagcattggc ggtacaaaaa 1140

aaggctgacg tgcgcaaacg acggatccac agatatcttt gggatcagac ggccggtgtt 1200

tacagggact atgcatggcg tcgccaacga tttggcgcgt tcatggctgc cgcagtcgta 1260

cccctctttc taggactggc gactccagag caggctcatt tacaagccgt ggcattgcgg 1320

cagcttctcc taacccaagg gggtctggtt acatccatgg tcgaatcagg cgagcagtgg 1380

gataagccga atggatgggc gcctttacaa tggatggcta tagtagggtt gaaccactac 1440

ggtgaagaga cgcttgccac tgaaattgca gtgaattggc tcaccacagt taaaaacttc 1500

tattcgctac atcacaagct ggtcgagaaa tacgacatca gtggcgaaag agcgaggccc 1560

ggaggggtat gtccaaaggc taaaccgtgc gatagcgtgc ctgagaatca gcccgccgca 1620

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Claims

1.一株杓兰果胶杆菌，命名为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)，其特征在于，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17442。

2.一种海藻糖酶，其特征在于，所述海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种编码权利要求2所述的海藻糖酶的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种携带权利要求3或4任一项所述的基因的表达载体。

6.一种表达权利要求2所述的海藻糖酶的重组细胞或重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述的重组菌以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主。

8.权利要求2所述的海藻糖酶、权利要求6所述的重组细胞或重组菌在水解酵母制品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：将海藻糖酶添加至酵母制品溶液中对酵母制品进行水解。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，水解的条件为：反应温度30～37℃、反应pH 5～6、酵母制品浓度1～10％，加酶量50～200U。