CN111560334A - 溶磷固氮复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溶磷固氮复合菌剂，该复合菌剂含有活菌数之间的比值为0.5‑1.5:1的果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)与芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其中，所述果胶杆菌的保藏编号为M20191010，所述芽孢杆菌的保藏编号为M20191011。制备上述复合菌剂的方法，该方法包括：混合果胶杆菌和芽孢杆菌。上述复合菌剂在促进植物对磷素吸收中的应用。上述复合菌剂在促进植物根系生长中的应用。上述复合菌剂在提高植物光合速率中的应用。本发明提供的溶磷固氮复合菌剂能够促进植物对磷素吸收、促进植物根系生长以及提高植物光合速率。

Description

溶磷固氮复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及溶磷固氮复合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

磷素是核酸、核蛋白、磷脂、植素、ATP和含磷酶等物质的重要组成元素，对光合作用、呼吸作用和遗传信息的传递等方面均起着重要的作用；同时磷还参与植物体内以碳水化合物为主的多种有机物的合成和分解代谢；参与ATP和ADP的转化，也是能量代谢的关键介导元素之一。我国土壤中的全磷含量尽管量大，但其中95％为次效形式，据报道我国国内74％的耕地缺乏有效磷(含量≤10mg/kg)。有效磷的缺乏会造成植株的光合作用、生理代谢不良以及成株后的果实发育受阻等不良影响。

土壤中含有大量促生微生物，其中溶磷菌能够溶解或释放土壤中难溶性或不溶性磷素，以提供给植物生长发育所必需的磷营养，进而加强植物的光合作用和碳水化合物的合成与转运，提高土壤地力。并且能与固氮菌、根瘤菌等具有其它功能的微生物发生协同作用，从而更好的促进植株的生长发育。利用土壤中不同菌群之间的协同作用，制备溶磷菌与固氮菌复合菌剂，实现对作物的促生作用，同时增强菌剂改善土壤的功效。

发明内容

本发明的目的提供了一种溶磷固氮复合菌剂及其制备方法和应用。

本发明的发明人在研究中发现果胶杆菌和芽孢杆菌配合时能够促进植物对磷素吸收、促进植物根系生长以及提高植物光合速率，因此，为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种溶磷固氮复合菌剂，该复合菌剂含有活菌数之间的比值为0.5-1.5:1的果胶杆菌 (Pectobacterium cypripedii)zafuRP7与芽孢杆菌(Bacillus sp.)zafuGD5，其中，所述果胶杆菌的保藏编号为M20191010，所述芽孢杆菌的保藏编号为M20191011。

本发明第二方面提供了制备上述复合菌剂的方法，该方法包括：混合果胶杆菌和芽孢杆菌。

本发明第三方面提供了上述复合菌剂在促进植物对磷素吸收中的应用。

本发明第四方面提供了上述复合菌剂在促进植物根系生长中的应用。

本发明第五方面提供了上述复合菌剂在提高植物光合速率中的应用。

本发明提供的溶磷固氮复合菌剂能够促进植物对磷素吸收、促进植物根系生长以及提高植物光合速率。

生物保藏

本发明的果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)zafuRP7于2019年12月4日被保藏在中国典型培养物保藏中心(缩写为CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮政编码：100101)，保藏编号为M20191010。

本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)zafuGD5于2019年12月4日被保藏在中国典型培养物保藏中心(缩写为CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮政编码：100101)，保藏编号为M20191011。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为溶磷固氮复合菌剂与单独的溶磷菌的溶磷量的比对(平均值±标准误差，小写字母表示可溶磷含量差异显著性p<0.05)。

图2为溶磷固氮复合菌剂处理下番茄与山核桃的根系扫描图(A-B为山核桃根系扫描图； E-F为番茄根系扫描图；CK为空白对照)。

图3为溶磷固氮复合菌剂处理下山核桃幼苗与番茄幼苗植株全磷指标(平均值±标准误差，小写字母表示全磷含量差异显著性p<0.05，CK为空白对照)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供的溶磷固氮复合菌剂含有活菌数之间的比值为0.5-1.5:1的果胶杆菌与芽孢杆菌，其中，所述果胶杆菌的保藏编号为M20191010，所述芽孢杆菌的保藏编号为M20191011。

只要按照上述方式配合使用果胶杆和芽孢杆菌即可实现本发明的目的，然而，根据本发明的优选实施方式，所述复合菌剂含有活菌数之间的比值为0.9-1.1:1(最优选1:1)的果胶杆菌与芽孢杆菌。

根据本发明，所述复合菌剂可以以各种常规的形态存在，例如，固体粉剂、液体制剂(如菌悬液)，根据本发明一种优选的实施方式，所述复合菌剂以固体粉剂的形式存在。固体粉剂可以由微生物菌体与水、甘油、脱脂奶粉、蔗糖、谷氨酸钠和维生素C等辅料，混合均匀后低温冷冻干燥而成。

根据本发明，对溶磷固氮复合菌剂中总活菌数的含量没有特别的要求，优选地，所述复合菌剂中的总活菌数为10⁸-10⁹CFU/mL(以复合菌剂的干基为基准)。

本发明提供的制备上述复合菌剂的方法包括：混合果胶杆菌和芽孢杆菌。

另外，本发明还提供了溶磷固氮复合菌剂在促进植物对磷素吸收、促进植物根系生长以及提高植物光合速率中的应用。以山核桃和番茄幼苗为例，复合菌剂的能够促进了根系生长发育，从而提升了植株对于磷素的吸收与储存能力，进一步提高了光合速率，增加了山核桃和番茄的生物量。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，使用的复合菌剂的组成如下所示：

以下实施例所用的溶磷固氮复合菌剂为保藏编号为M20191010的果胶杆菌和保藏编号为 M20191011的芽孢杆菌，二者活菌数之间的比值为1:1，所述复合菌剂中的总活菌数为 10⁸-10⁹CFU/mL(以复合菌剂的干基为基准)。

1材料与方法

1.1菌种分离与鉴定

本试验所用溶磷固氮复合菌株，分离自浙江省杭州临安区山核桃试验地的根际土。将10.0 g山核桃根际土壤，接入100mL无菌水中，28℃下180r·min^-1振荡30min，经梯度稀释后，分别涂布于以磷酸三钙为无机磷源的PVK培养基(葡萄糖10g/L,磷酸三钙5g/L,硫酸铵0.5 g/L,氯化钠0.2g/L,硫酸镁0.1g/L,氯化钾0.2g/L,酵母浸膏0.5g/L,硫酸锰0.002g/L,硫酸亚铁0.002g/L,琼脂18g/L)和固氮菌培养基(蔗糖15g/L,磷酸二氢钾0.8g/L,硫酸镁0.2g/L, 氯化钠0.2g/L,碳酸钙1g/L,质量分数为10％的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL,琼脂18g/L,pH为6.5～7.0)平板上，置于28℃培养箱中培养。

选取PVK平板上产生溶磷圈的单菌落和固氮菌培养基上的单菌落，经平板划线纯化后，分别转接入5mL对应的液体培养基中，28℃下180r·min^-1摇菌培养。纯化的各菌株利用通用引物27F和1492R扩增16S rRNA序列，经与NCBI数据库序列同源性比对确定其种属。同时，菌株用甘油管保藏于超低温冰箱。

1.2溶磷固氮复合菌剂筛选

所分离的溶磷细菌株摇菌培养后，各取1μL滴加在PVK平板上，28℃下培养3天后，在5mL PVK液体培养基中各加入1μL溶磷菌(果胶杆菌Pectobacterium cypripedii R7)和自生固氮菌(芽孢杆菌Bacillus sp.G5)，另取对照组加入1μL溶磷菌R7和1μL无菌水，在28℃下摇菌培养5天后通过钼锑抗比色法定量分析比较各培养基的无效磷释放量(有效磷含量)。

1.3溶磷固氮复合菌剂接种山核桃幼苗

试验地位于浙江农林大学果木园实验基地(30°15′N,119°43′E)，实验土壤为低有效磷土壤 (有效磷含量为4.73mg·kg^-1)。试验植株为48株6个月龄的山核桃幼苗和48株1个月龄的番茄幼苗。将幼苗移栽到低有效磷土壤，缓苗一个月后用于接种。在植株根系附近选取4个注射点，每点注射复合菌剂(溶磷菌与固氮菌摇菌培养3日后等体积混合)7.5mL，1个月后重复注射一次。另各取12株山核桃和番茄幼苗同期注射无菌水作为对照组(CK)。第二次注射后培养2个月，每个处理随机选取9株，测定各项生长和生理等指标。

1.4植株根系数据、光合速率指标以及全磷含量的测定

根系分析采用根系扫描仪(Epson Expression 1680Scanner,Seiko Epson Corp,Tokyo,Japan) 进行图像扫描，并使用WinRHIZO根系分析系统(Regent Instruments Inc,Quebec,Canada)分析根系数据。选取不同处理下全部植株的顶端第三个成熟叶片进行光合测定，光合测定仪选用 LI-6800光合仪。

钼锑抗比色法测定植物全磷含量，分别配制0、0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/L标准磷溶液，测定OD700并绘制标准曲线。吸取植物消煮液10mL于50mL容量瓶中，加水稀释至30mL，加二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠(2mol/L)和硫酸(0.5mol/L)调节pH至溶液刚成微黄色。然后加入钼锑抗显色剂5mL，定容放置30min后，在紫外分光光度计用波长 700nm比色，以空白溶液为参比液，读取吸收值并按下式计算浓度。

w(P)＝c*V*ts*100/m*106

式中：

c——测的显色液中磷的质量浓度mg/L；

Ts——稀释倍数＝100*50/10；

V——显色液体积mL；

M——烘干样品质量g。

1.5数据分析

采用IBM SPSS Statistics进行数据分析，GraphPad Prism 7.00软件进行制图、数据显著性方差分析运用Duncan’s新复极差法进行。

2结果与分析

2.1菌株分离与复合菌剂筛选

从山核桃林区土样中分离纯化得到具有溶磷能力的菌种以及具有固氮能力的菌种，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序确定所用的溶磷菌(果胶杆菌Pectobacterium cypripedii R7)和自生固氮菌(芽孢杆菌Bacillus sp.G5)。如图1和表1所示，使用钼锑抗比色法测定培养基中溶磷量，果胶杆菌R7与芽孢杆菌G5(R7G5)的组合明显好于单菌R7的释磷效果。

表1溶磷效果对比

小写字母表示溶磷量差异显著性(p<0.05)

2.2 R7G5复合菌剂处理对根系指标的影响

表2和图2所示，R7G5复合菌剂对山核桃与番茄幼苗根系发育具有显著的促进作用。其中，根长方面，山核桃和番茄R7G5处理分别比对照CK增长68.2％和35.7％；总根投影面积，分别多50.8％和23.0％；根表面积，增长了56.6％和34.4％；根体积，增长35.4％和37.3％；根尖数，增长34.0％和43.1％；分支数，增长67.5％和25.4％。

表2 R7G5复合菌剂处理对山核桃和番茄根系指标的影响

小写字母表示根系指标差异显著性(p<0.05)

2.3 R7G5复合菌剂处理对光合参数指标的影响

表3所示，在R7G5复合菌剂处理下，山核桃与番茄的光合都受到不同程度的影响，其净光合速率、胞间CO₂浓度(Ci)、净光合速率(Pn)、蒸腾速率和叶片气孔导度(Gs)与对照CK 比较均有提升。

表3 R7G5处理对山核桃与番茄光合指标的影响

小写字母表示光合指标差异显著性(p<0.05)

2.4 R7G5复合菌剂处理对全磷含量的影响

表4和图3所示，山核桃和番茄幼苗在R7G5复合菌剂处理下的全磷含量均高于对照组，且山核桃中在R7G5复合菌剂处理下全磷含量差异明显，较对照上升43.1％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种溶磷固氮复合菌剂，其特征在于,所述复合菌剂含有活菌数之间的比值为0.5-1.5:1的果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)与芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其中，所述果胶杆菌的保藏编号为M20191010，所述芽孢杆菌的保藏编号为M20191011。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂含有活菌数之间的比值为1:1的果胶杆菌与芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂，其中，所述复合菌剂以固体粉剂或菌悬液的形式存在。

4.根据权利要求1所述的复合菌剂，其中，复合菌剂中的总活菌数为10⁸-10⁹CFU/mL。

5.一种制备权利要求1-4中任意一项所述的复合菌剂的方法，其特征在于，该方法包括：混合果胶杆菌和芽孢杆菌。

6.权利要求1所述的复合菌剂在促进植物对磷素吸收中的应用。

7.权利要求1所述的复合菌剂在促进植物根系生长中的应用。

8.权利要求1所述的复合菌剂在提高植物光合速率中的应用。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的应用，所述植物为山核桃或番茄。

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