CN108850640A - 表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在肉鸡饲料添加剂中的应用 - Google Patents

表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在肉鸡饲料添加剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，所述表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的重量百分比为0.1％～10％，该饲料还包括以下重量份数的组成：玉米50～60份、玉米油2～4份、大豆粕20～30份、玉米蛋白粉(CP60％)2～4份、DDGS 4～6份、纤维粕2～4份、磷酸氢钙1～2份、石粉1～2份、盐0.15～0.2份、添加剂预混料0.5～1.5份。该饲料中的人溶菌酶的溶菌活性比目前广泛使用的鸡蛋清溶菌酶高3倍，具有杀菌效果强、杀菌谱广、稳定性强、易被机体所接受等优点，且无耐药性、无抗原性、无毒性，可替代抗生素作为一种安全无毒的动物饲料添加剂来使用。

Description

表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在肉鸡饲料添加剂中的 应用
技术领域
本发明涉及动物养殖饲料技术领域，具体涉及一种表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在动物饲料添加剂中的应用。
背景技术
饲料添加剂是实现饲料工业化生产和养殖现代化的重要物质前提，没有现代化的饲料添加剂工业，就没有饲料工业的现代化和现代养殖业。动物饲料中应用抗生素添加剂的主要目的是给小肠粘膜提供一个最佳环境,以利于营养成分的充分吸收,提高营养的利用率、饲料转化率以及生产率，同时预防或治疗动物的感染、降低动物的死亡率。在日粮中添加抗生素,对处于生长期的幼龄动物效果显著，健康仔猪甚至在较差的饲养环境和卫生条件下也能增重并可提高10％～15％的饲料转化率。但在动物饲料中大量、超量使用抗生素的危害十分严重，早已引起国内外的高度重视。
通过在禽畜饲料中添加抗生素虽然预防与治疗禽畜疾病，但长期使用，可在禽畜体内产生耐药菌，耐药菌随食物链进入人体造成感染性疾病，抗生素难以治疗，同时人类食用抗生素残留的肉类(包括污染的水)会破坏肠道内的微生态平衡，一方面使胃肠道内对抗生素敏感性强的微生物减少，而敏感性差的菌群趁机大量繁殖，引起微生物态失衡，另一方面体内的微生物被抗生素抑制后，为体外的微生物的侵入繁殖创造了条件，从而易产生致病的交叉感染。
因此禁用抗生素的呼声日益高涨，有必要研究一种新型的无耐药性、无抗原性、无毒性的抗菌药物作为动物饲料添加剂来替代抗生素。溶菌酶具有杀菌效果强、杀菌谱广、稳定性强、易被机体所接受等优点，且还能促进免疫功能恢复，并且对人禽无毒、没有任何毒副作用和不良反应、无药害残留。作为一种生物制剂，溶菌酶本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，在食品、医药、生物学中已得到了广泛的应用，同时也为饲料行业开发新型无公害绿色饲料添加剂开辟了一个新的途径。
溶菌酶又称细胞壁溶解酶，它广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。作为一种糖苷水解酶，溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的肽聚糖从而造成细胞溶解死亡。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，分子量为14.6kDa，具有很强的热稳定性(在pH＝4～7、100℃情况下处理1min不失活)，其溶菌活性比目前广泛使用的鸡蛋清溶菌酶高3倍。此外，与蛋清溶菌酶抑菌功能不同的是：该酶既对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成的菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌具有良好的分解作用，也能在动物体内分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，水解相当部分的革兰氏阴性菌如大肠杆菌、普通变球菌和副血性弧菌等。
虽然人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果，在临床上具有多种重要的应用价值，但天然人溶菌酶来源极其困难。人溶菌酶在母乳中含量较高，但其来源极其有限。另外虽然在饲料行业中逐步开展了一些有关溶菌酶应用方面的研究工作，但将人溶菌酶作为动物饲料添加剂还有待于进一步的研究开发，其应用范围和应用量的研究少有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明利用基因工程技术制备表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，在正常人溶菌酶的基础上外加四个氨基酸AEAE，得到表达量更高的重组人溶菌酶，并以表达此重组人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品作为肉鸡饲料添加剂添加到肉鸡饲料中，制备得到含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料。
为达到上述目的，本发明提供了一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，所述表达人溶菌酶的毕赤酵母的重量百分比为0.1％～10％。
在本发明的一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料中人溶菌酶的比活力为8000～20000活力单位/kg。
可以理解的是，所述肉鸡饲料还包括本领域技术人员常规肉鸡饲料组分。
在本发明的一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料包括：
在本发明的一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料中，表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品包括：将带有人溶菌酶基因的重组质粒，转染进入毕赤酵母中，再进行发酵生产，经脱水等处理后形成的产品。
在本发明的一具体实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，人溶菌酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示的序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。
优选地，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，人溶菌酶基因序列如SEQID NO:1所示。
在本发明的一具体实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述毕赤酵母包括X33，GS115，SMD1163、SMD1165、SMD1168，KM71H中的一种或多种。
在本发明的一具体实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述重组质粒包括pPIC9K、pPICZA或pPICZαA中的一种或多种。
在本发明的一具体实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述发酵生产的发酵温度为20～35℃。
在本发明的一具体实施例中，所述脱水步骤包括：将含表达人溶菌酶的毕赤酵母与淀粉和麸皮混合，然后控制温度在50℃以下进行脱水，烘干，最后粉碎，检测活性，成为合格的动物饲料添加剂产品。
在本发明的一具体实施例中，所述表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中人溶菌酶的酶活为4000～20000活力单位/g。
在本发明的一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，包括：
在本发明的一具体实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，包括：
本发明有益之处在于：
1、本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品在正常人溶菌酶的基础上外加四个氨基酸AEAE，得到表达量高于正常人溶菌酶基因的重组人溶菌酶，进一步解决了人溶菌酶获取因难的问题。
2、本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品直接将可表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品脱水处理形成，无需进行溶菌酶的提取纯化，简化了操作流程。
3、本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品中的人溶菌酶抗菌谱广，不但可引起普通细菌裂解，而且对临床上的致病菌(耐药菌)同样具有杀伤作用而且无明显毒副作用，不产生耐药性,可以长期使用。
4、本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品对革兰阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌等均有强力溶壁作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一定的溶解作用，添加在饲料中不会破坏饲料中的营养成分，在饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料的贮存期，降低摄入霉变饲料的几率，从源头预防动物感染。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明实施例提供了一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其中，所所述表达人溶菌酶的毕赤酵母的重量百分比为0.1％～10％，人溶菌酶的比活力为8000～20000活力单位/kg。
其组成如下：
在本发明一实施例中，所述的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品为将带有人溶菌酶基因的重组质粒，转染进入毕赤酵母中，再进行发酵生产，经脱水等处理后形成的产品，不进行人溶菌酶的分离与纯化，即发酵的毕赤酵母菌体和表达的人溶菌酶基因活性混合在一起，作为动物饲料添加剂替代抗生素的作用。
在本发明一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，人溶菌酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示的序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。
进一步地，所述人溶菌酶的编码基因序列编码所得的氨基酸序列如SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。
在在本发明一具体实施例中，所述人溶菌酶的编码基因序列编码所得的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，即在正常人溶菌酶的基础上外加四个氨基酸AEAE，得到表达量高于正常人溶菌酶基因的重组人溶菌酶，进一步解决了人溶菌酶获取因难的问题。
在本发明一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述毕赤酵母包括X33、GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168H、KM71H中的一种或多种。
在本发明一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述重组质粒包括pPIC9K、pPICZA、pPICZαA中的一种或多种。
在本发明一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中，所述发酵生产的发酵温度为20～35℃。
在本发明一实施例中，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中人溶菌酶的酶活为4000～20000活力单位/g。
一方面本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品在正常人溶菌酶的基础上外加四个氨基酸AEAE，得到表达量高于正常人溶菌酶基因的重组人溶菌酶，解决了人溶菌酶获取因难的问题，再者本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品作为饲料添加剂应用时，无需进行溶菌酶的提取纯化，简化了操作流程，另外本发明提供的表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品中的人溶菌酶抗菌谱广，不但可引起普通细菌裂解，而且对临床上的致病菌(耐药菌)同样具有杀伤作用而且无明显毒副作用，不产生耐药性，可以长期使用，添加在饲料中不会破坏饲料中的营养成分，可防止霉变，延长饲料的贮存期，从源头预防动物感染。
下面将就本发明提供的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料的制备及应用效果以实施例的方式展开说明：
实施例1
表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品的制备
1基因来源：
用化学合成法合成重组人溶菌酶基因，再通过DNA重组技术，将基因克隆于pUC19质粒载体中，克隆株通过核苷酸DNA序列分析，证实为重组人溶菌酶基因。
2重组人溶菌酶基因的制备：
2.1重组人溶菌酶基因设计并用化学合成法合成寡聚核苷酸引物：
P1:CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG(SEQ ID NO:3)，
P2：GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG(SEQ ID NO:4)。
2.2PCR扩增：RT产物10μl，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP1μl，15pmol/L P1引物1μl，15pmol/L P2引物1μl，Taq酶1μl(5u)，重蒸水31μl，总体积50μl；反应条件：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，35个循环。用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物约420bp的DNA片段。用EcoRI和SalI双酶切纯化的PCR产物DNA，并克隆到pUC19质粒中(转化方法为CaCl2法，宿主菌为大肠杆菌JM109)，得到重组质粒pUC19-LZ/JM109转化子，转化子经酶切和核苷酸序列分析证实为人溶菌酶基因，其表达的氨基酸序列在正常人溶菌酶的基础上在N端外加四个氨基酸AEAE。
3人溶菌酶基因表达载体的构建：
以得到的重组人溶菌酶基因重组质粒pUC19-LZ为模板，通过PCR和DNA重组技术，将重组溶菌酶基因插入到毕赤氏酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组溶菌酶表达载体pPIC9K-LZ。
P1:CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG(SEQ ID NO:3)，
P2：GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG(SEQ ID NO:4)。
PCR扩增：pUC19-LZ DNA1μl(50ng)，10XPCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP1μl，15pmol/L P1引物1μl，15pmol/L P2引物1μl，pfu taq酶1μl(5u上海博彩生物有限公司产品)，重蒸水40μl，总体积50μl；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟30个循环后，72℃10分钟，4℃2分钟。再用XhoI与EcoRI酶切纯化的PCR目的DNA片段并克隆到分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9上，得到重组子质粒pPIC9-LZ。
将所得2910个转化子，分别点种于2mg/ml G418YEPD培养皿中，30℃培养2天后，筛选到抗2mg/ml G418的转化子82个，再按上法，从MMD菌种取出相应的82个转化子点种3mg/ml G418YEPD培养基平皿，30℃培养2天后，筛到26个抗3mg/ml转化子，抗4mg/mlG418转化子13个，最后筛选到抗4mg/ml G418的转化子67个。
4、表达人溶菌酶毕赤酵母发酵产品的制备
4.1摇瓶种子制备：以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4～8毫升、MgSO4(硫酸镁)1～5克，K2SO4(硫酸钾)2～6克，KOH(氢氧化钾)1～3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1～3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20～35℃，在恒温床上培养36～48小时。2、种子罐培养：以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25～19毫升，MgSO4(硫酸镁)13～17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4～0.8克，K2SO4(硫酸钾)16～20克，KOH(氢氧化钾)2.12～6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20～32℃，PH值为2.0～8.0；溶解氧浓度为10～60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。
4.2生产罐培养：以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93～97毫升，MgSO4(硫酸镁)51～55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19～23克，K2SO4(硫酸钾)61～65克，KOH(氢氧化钾)13～17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25～32℃，PH值为4.0～8.0，溶解氧浓度为10～60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50～60小时，然后放罐培养结束。蛋白检测，每升表达量2克，活性检测，每毫升30000U，超过人溶菌酶正常基因表达水平。
实施例2
一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其组成如下：
实施例3
一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其组成如下：
实施例4
一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其组成如下：
实施例5
一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其组成如下：
实施例6
一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其组成如下：
应用实施例
将上述制得的肉鸡饲料对肉鸡进行喂养试验：
1材料与方法
1.1试验动物与设计：选用1日龄AA商品代肉仔鸡720只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复20只，各组间平均体重差异不显著。1组为对照组，即不添加抗生素或表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的基础肉鸡饲料，2组为抗生素组，即往基础肉鸡饲料添加72mg/kg盐霉素以及4mg/kg黄霉素，3–6组为表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品试验组，分别在肉鸡饲料里添加0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，即上述实施例2～5所示配比的肉鸡饲料。
1.2试验动物饲养管理：试验开始前对鸡舍及所有饲养用具进行清洗、熏蒸消毒(三氯异氰脲酸粉)，鸡舍密封24小时，通风12小时后进行喷雾消毒(新洁尔灭/无菌蒸馏水为1:15)，鸡舍密闭12小时后自然通风48小时后使用。试验肉鸡采用三层立式笼养，自由采食和饮水，第一周鸡舍温度维持在35～38℃，一周后每两天降1℃，直至维持在25～28℃，自然光照加人工补光，相对湿度50～60％，自然通风结合纵向负压通风。免疫程序：7d新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗滴鼻、点眼；14d饮水免疫法氏囊病活疫苗；21天饮水新城疫-传染性支气管炎二联活疫；28d饮水免疫法氏囊病活疫苗；其他消毒管理措施遵照鸡场正常程序进行。每天观察记录试验鸡采食、饮水及生长健康状况，及时记录试验鸡死淘情况及耗料量。饲养试验于2017年5月～6月在河南农业大学新乡肉鸡养殖基地进行。
1.3指标测定
1.3.1生长性能
饲养试验期间，每周按重复统计肉仔鸡耗料量和死淘情况；分别在饲养试验第22天、43天对每重复肉仔鸡进行空腹称重，准确记录肉仔鸡体重以及耗料量，计算平均日采食量ADFI(g/d)、平均日增重ADG(g/d)和料重比F/G(平均日采食量/平均日增重)。记录试验期间肉仔鸡死亡只数，计算死亡率。
死亡率(％)＝肉仔鸡死亡数/试验鸡总数×100
1.3.2血清指标
于饲养试验第43天早上肉仔鸡空腹称重后，从每重复随机选择一只接近平均体重的试验鸡，翅下静脉采血，然后在4℃下3000r/min离心10min制备血清，-20℃分装保存，待测。试验鸡各血清指标均送至郑州市颐和医院进行检测，其中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)等采用美国贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测。
1.3.3数据统计与分析方法
利用Excel 2003软件对各重复原始数据进行处理，采用SPSS 17.0软件one-wayANOVA进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，以0.05<P<0.1有提高或降低趋势，测定结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
2结果与分析
2.1表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品对AA肉鸡生长性能的影响
上述结果表明，在1～21日龄，实施例2～5及抗生素组的ADG、ADFI、F/D、21日龄体重和死亡率与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。在死亡率方面，抗生素组、实施例2～4较实施例5相比，有降低死亡率的趋势(P＝0.064)。
22～42日龄，在ADG和42日龄体重方面，实施例3～5显著高于对照组(P<0.05)，实施例2～5与抗生素组无显著差异(P>0.05)，实施例2与对照组间无显著性差异(P>0.05)。在料重比方面，抗生素组、实施例3～5与对照组比显著降低料重比(P<0.05)，其中实施例3料重比效果最佳，实施例3料重比显著低于对照组、抗生素组及实施例2(P<0.05)。在ADFI和死亡率与方面，不同处理组间均无显著差异(P>0.05)。说明在肉鸡饲料中添加0.2％、0.3％、0.4％的表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品有提高肉鸡日增重、42日龄体重，降低料肉比的效果，其中0.2％的人溶菌酶重组效果最好。
1～42日龄，在ADG方面，实施例3～5显著高于对照组(P<0.05)，表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品不同剂量组较抗生素组均无显著差异(P>0.05)，实施例2～5间ADG差异不显著(P>0.05)，对照组、抗生素组、实施例2间均无显著差异(P>0.05)。在料重比方面，实施例3～5及抗生素组显著低于对照组(P<0.05)，实施例3较对照组、抗生素组、实施例2、实施例4组显著降低料重比(P<0.05)，实施例2、实施例4、实施例5较抗生素组间差异不显著(P>0.05)。在ADFI和死亡率方面各组间均无显著差异，其中实施例3、实施例4死亡率最低。许多试验已证实了抗生素的促生长效果，其作用是改善肠道微生物区系和肠壁结构，通过抑制发酵，减少养分损失和增加代谢率以达到提高生产性能的目的。溶菌酶的促生长作用与抗生素不同的是，溶菌酶对环境PH的适应性很高，在强酸性的消化道内仍保持其生物活性。饲料中添加溶菌酶替代抗生素，可调节动物肠道内微生物平衡，促进促进饲料中营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，增强机体免疫力和成活率，提高动物生长性能。所以表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品能够通过提高营养物质利用来促进肉鸡生长，试验证明其可以直接添加于饲料中替代抗生素。
2.2人溶菌酶重组酵母菌对AA肉仔鸡血清指标的影响
血清生化指标与机体组织细胞通透性，机体代谢功能等息息相关，是研究动物机体营养代谢及免疫功能状况的重要指标之一，血液中的许多生化参数受年龄、发育阶段、营养水平和内分泌状况的影响，所以他们能有效反应机体的生理状况。血清中总蛋白含量可以反映出蛋白质的营养代谢情况和免疫程度。表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品不同剂量组、抗生素组与对照组相比提高了血清中总蛋白含量，表明加强机体免疫力。血清蛋白由白蛋白和球蛋白构成，其中球蛋白占的比例较大，球蛋白由单核巨噬细胞系统产生，试验各组较对照组显著提高了球蛋白水平，提高了机体的循环抗体水平。血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶是动物肝细胞参与氨基酸代谢的重要作用，谷丙转氨酶和谷草转氨酶主要存在于组织细胞内，且心脏、肝脏中活性最强，正常情况下血浆中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性很低，当心脏、肝脏等组织受损或通透性增大时，大量的谷丙转氨酶、谷草转氨酶就会进入血清中。抗生素组和实施例3～5与对照组比显著降低了血清中谷丙转氨酶的含量(P<0.05)，抗生素组较人溶菌酶不同剂量组血清谷丙转氨酶含量无显著差异(P>0.05)，抗生素组、实施例3、实施例4与对照组比显著降低肉鸡血清中谷草转氨酶含量(P<0.05)，实施例3～5与抗生素组比肉鸡血清谷草转氨酶均无显著差异(P>0.05)。说明饲料中添加表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在一定程度上能够改善肉鸡肝功能。糖是机体重要的能量物质，也是重要的细胞组成成分，抗生素组、实施例3肉鸡血清中葡萄糖含量显著低于对照组(P<0.05)，抗生素组、实施例3、实施例4肉鸡血清中葡萄糖含量显著低于对照组和实施例5(P<0.05)，对照组、实施例2、实施例5肉鸡血清葡萄糖含量均无显著差异(P>0.05)，实施例3、实施例4较抗生素组血清葡萄糖无显著差异(P>0.05)，表明饲喂0.2％、0.3％表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品后增强肉鸡对葡萄糖的转化和利用率效果较好。胆固醇是血清中主要脂质，其在血清中的含量影响机体健康，与对照组相比，抗生素组、实施例2～5均能在一定程度上降低血清中总胆固醇含量，说明表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品能够调节胆固醇代谢，但需要较大剂量。
2.3小结
本次试验得出如下结论：
表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品能够提高肉鸡日增重并降低料重比，改善胴体品质，与添加黄霉素+盐霉素抗生素复合组效果一致。从本次实验结果来看，以添加量为0.2％的表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品对肉鸡的促生长效应最好，可显著提高日增重、降低料肉比。
饲料中添加表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品能够提高血清中TP、GLB含量，降低ALT、GLU、CHOL等含量，增强机体的代谢功能，有利于动物增重，且试验各组与抗生素组基本一致。
综上所述，本发明提供的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料能促进肉鸡生长，提高其日增重，降低料肉比，增强其代谢功能且利于增重，是替代含抗生素饲料的一种理想选择。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广州奇龙生物科技有限公司
<120> 表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品在肉鸡饲料添加剂中的应用
<130> 2017
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgaagccga aaaggtcttt gaaaggtgtg agttggccag aactctgaaa agattgggaa 60
tggatggcta caggggaatc agcctagcaa actggatgtg tttggccaaa tgggagagtg 120
gttacaacac acgagctaca aactacaatg ctggagacag aagcactgat tatgggatat 180
ttcagatcaa tagccgctac tggtgtaatg atggcaaaac cccaggagca gttaatgcct 240
gtcatttatc ctgcagtgct ttgctgcaag ataacatcgc tgatgctgta gcttgtgcaa 300
agagggttgt ccgtgatcca caaggcatta gagcatgggt ggcatggaga aatcgttgtc 360
aaaacagaga tgtccgtcag tatgttcaag gttgtggagt gtaa 404
<210> 2
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ala Glu Ala Glu Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr
1 5 10 15
Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn
20 25 30
Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr
35 40 45
Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile
50 55 60
Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn
65 70 75 80
Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp
85 90 95
Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg
100 105 110
Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln
115 120 125
Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val
130 135
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcgagaaa agagaggctg aagctaaggt ctttgaaagg tg 42
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaattctta cactccacaa ccttg 25

Claims (10)

1.一种含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其特征在于，所述表达人溶菌酶的毕赤酵母的重量百分比为0.1％～10％。
2.如权利要求1所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其特征在于，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料中人溶菌酶的比活力为8000～20000活力单位/kg。
3.如权利要求1所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其特征在于，所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料包括以下重量份数的组成：
。
4.如权利要求1所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品的肉鸡饲料，其特征在于，所述表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品包括：将带有人溶菌酶基因的重组质粒，转染进入毕赤酵母中，再进行发酵生产，经脱水等处理后形成的产品。
5.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述人溶菌酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示序列有不低于85％、88％、90％、95％、98％、99％或100％同源性的序列。
6.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述毕赤酵母包括X33、GS115、SMD1163、SMD1165、SMD1168H、KM71H中的一种或多种。
7.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述重组质粒包括pPIC9K、pPICZA、pPICZαA中的一种或多种。
8.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述发酵生产的发酵温度为20～35℃。
9.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述脱水步骤包括：将含表达人溶菌酶的毕赤酵母与淀粉和麸皮混合，然后控制温度在50℃以下进行脱水，烘干，最后粉碎，检测活性，得含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品。
10.如权利要求4所述的含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品，其特征在于，所述含表达人溶菌酶的毕赤酵母发酵产品中人溶菌酶的酶活为8000～20000活力单位/g。
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