具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一、溶菌酶基因的选择、优化和合成
1、溶菌酶基因的选择
来源不同的溶菌酶活性存在差异,人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍;而从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出的溶菌酶,其溶菌活性也远低于人溶菌酶;植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3。因此本发明选择活性较强的人溶菌酶基因进行表达。
2、溶菌酶基因序列的优化
外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白有效表达的重要因素。本发明根据毕赤酵母密码子偏好性,将溶菌酶基因的酵母低频密码子优化成高频密码子,以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。人溶菌酶基因的核苷酸序列与Genbank中人溶菌酶基因序列对比如附图1所示。
在附图1中,图谱上面一条序列是Genbank中人溶菌酶基因序列(NCBI序列号:NM_000239.2),下面一条是优化后的人溶菌酶基因序列,两者对比后的黑色部分为相同碱基,白色部分为相异碱基。
附图1表明,与Genbank中人溶菌酶基因序列相比,优化后的人溶菌酶基因有77个碱基发生了置换,但氨基酸序列并没有改变。
在人溶菌酶的C-端上加入5个氨基酸的肽链,使溶菌酶具有脂溶性,便于插入革兰氏阴性菌的脂多层中,可以在脂多层表面形成一个洞,切断下层的β-1,4糖苷键而发挥溶菌作用。因此在人溶菌酶基因序列3’端加上编码5个氨基酸的基因序列。
通过专业软件分析,在基因序列的5’端和3’端分别加上EcoR I、Not I两个酶切位点,酶切位点如表1下划线所示的核苷酸。
3、优化的人溶菌酶基因序列的合成
所述优化后的人溶菌酶基因序列由上海生工公司合成。合成的人溶菌酶基因HZ全序列如SEQ ID No:1所示。
AAGGTTTTTGAAAGATGTGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGATGGTTACAGAGGTATTTCTTTGGCTAATTGGATGTGTTTGGCAAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAATGCAGGTGATAGATCTACTGATTACGGTATCTTCCAGATCAACTCTAGATACTGGTGTAACGATGGTAAGACTCCAGGTGCTGTTAACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCTGCTTTGTTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTTGCATGTGCTAAGAGAGTTGTTAGAGATCCACAGGGTATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGATGCCAAAACAGAGATGTTAGACAGTATGTTCAAGGTTGTGGTGTTTTCTTCGTTGCTCCATAAGCGGCCGC
由SEQ ID No:1的核苷酸序列编码的人溶菌酶蛋白序列如SEQ ID No:2。
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVFFVAP
其分子量为15261.41Daltons。
二、重组质粒pUC18-T-HZ的构建
所采用的载体是商业购买的pUC18-T载体,构建载体的宿主细胞是DH5α。
1、新合成的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接
将所述合成好的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接,连接体系如下:
SolutionⅠ | 10μl |
pUC18-T | 1μl |
合成产物HZ | 9μl |
总体积 | 20μl |
离心混匀后,16℃低温水浴连接过夜。连接产物直接用于转化。
2、DH5α感受态细胞的制备
(1)取DH5α菌种,划线接种于LB固体培养基,培养过夜;
(2)取单个菌落,接种于含2 mL LB液体培养基的10 mL试管中,37℃振荡培养过夜,次日按1%转种于含50 mL LB液体培养基的250 mL三角烧瓶中,继续振荡培养至OD600值达到0.3-0.5左右时取出;
(3)无菌条件下将细菌转移到无菌的用冰预冷的50 mL聚丙烯离心管中,在冰上放置10 min;
(4)于4 ℃以4000 rpm离心10 min,倒出培养液,将管倒置1 min使残留液体流尽;
(5)用10 mL冰预冷的0.1 mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀,冰上放置5 min;
(6)于4 ℃以4000 rpm离心10 min,回收菌体;
(7)倒出培养液,将管倒置1 min使残留液体流尽;
(8)用1 mL冰浴预冷的0.1 mol/LCaCl2重悬细胞沉淀;
(9)用冷却的无菌吸头将感受态细胞分装于预冷的无菌微量离心管中,每管200 μL。
3、合成的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接后的连接产物转化
将上述制得的连接产物转化进DH5α感受态细胞中。转化步骤如下:
(1)将获得的连接产物10 μL加入200 μL感受态细胞中,同时设阴性对照,以及不加入任何质粒DNA的感受态细胞对照;
(2)轻轻混匀后,立即冰浴30 min;
(3)将装有混合物的离心管移入预加温至42 ℃的循环水浴中,恰好静置90 s;
(4)将离心管快速转移到冰浴中,放置2 min;
(5)在超净台里,将离心管中的混合物加到800 μL预热至37 ℃的LB液体培养基中;
(6)轻轻颠倒混匀,将混合物于37 ℃振荡培养45 min;
(7)将培养的菌液以3000 rpm离心5 min,在超净台里弃掉部分上清,留约100 μL上清,用加样器重悬菌体沉淀;
(8)取菌液涂布于含Amp的LB平板上,37 ℃倒置培养过夜。
4、重组质粒的序列测定
为了进一步确定上述步骤所得到的重组质粒,将阳性菌液由测序公司进行序列测定,并用DNAStar软件分析插入片段的正确性。将最终鉴定正确的重组质粒命名为pUC18-T-HZ。
三、重组质粒pPICZαA-HZ的构建
所采用的酵母表达载体为pPICZαΑ,构建载体的宿主细胞是大肠杆菌DH5α。
1、设计引物
根据新合成的人溶菌酶基因序列设计上下游引物F1、R1,及合成通用引物AOX1,所述引物均由上海生工公司合成,所述引物的序列如下,下划线部分碱基代表相应酶切位点:
表1:PCR扩增所用引物
2、人溶菌酶基因HZ的克隆
首先以获得的重组质粒pUC18-T-HZ为模板,用F1、R1引物进行PCR扩增,PCR反应体系如下:
ddH2O | 9.05 μL |
10×PCR buffer | 1.5 μL |
Mg2+ | 0.9 μL |
dNTP | 0.6 μL |
F1 | 0.375 μL |
R1 | 0.375 μL |
Taq DNA 聚合酶 | 0.2 μL |
pUC18-T-HZ | 2.0 μL |
总体积 | 15 μL |
反应条件:95 ℃,5 min;94 ℃,30 s,63 ℃,30 s,72 ℃,1 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。
所得的PCR产物跑0.8%琼脂糖凝胶电泳,切下目的条带,然后用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收,电泳图谱如图2所示。
3、PCR产物的纯化与回收
将经过初步鉴定后剩余的PCR产物全部跑0.8%琼脂糖凝胶电泳,切下目的条带,采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收,操作方法如下:
(1) 用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下含所要回收DNA的琼脂块,放入 1.5 mL离心管中。判定DNA片段的位置时,要尽可能使用长波长紫外光,在紫外光下照射的时间应尽可能短。
(2) 每100 mg琼脂糖凝胶中或100 μL的DNA溶液中加入400 μL Binding Buffer,置于50-60 ℃水浴中10 min,每2 min混匀一次,以保证凝胶全部融化。
(3) 将融化的胶溶液转移到套放于2 mL收集管的UNIQ-10柱中,室温放置2 min。8000 rpm室温离心1 min。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。
(4) 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中废液,将UNIQ-10柱放回收集管中,加入500 μL Wash Solution,10000 rpm室温离心30 s。
(5) 重复步骤(4)一次。
(6) 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中废液,将UNIQ-10柱放回收集管中,10000 rpm室温离心15 s。
回收得到目的片段HZ。
4、目的片段HZ与酵母表达载体pPICZαA的酶切回收
重组表达载体pPICZαA-HZ的构建图谱如图3所示。用EcoR I、Not I两种限制性内切酶双酶切PCR回收得到的目的片段HZ和pPICZαA载体,酶切体系如下:
ddH2O | 10 μL |
PCR产物或pPICZαA载体 | 60 μL |
1×H+BSA | 10 μL+10 μL |
EcoR 1 | 5 μL |
Not 1 | 5 μL |
总体积 | 100 μL |
回收酶切产物。
5、DH5α感受态细胞的制备
步骤如上所述。
6、目的片段HZ与pPICZαA载体酶切片段的连接转化
将HZ和pPICZαA酶切片段混合,然后用T4DNA 连接酶16 ℃过夜连接。连接体系如下:
ddH2O | 0.5 μL |
pPICZαA (EcoR 1及 Not 1酶切) | 3 μL |
HZ (EcoR 1及 Not 1酶切) | 5 μL |
10×T4 DNA Ligase buffer | 1 μL |
T4 DNA Ligase | 0.5 μL |
总体积 | 10 μL |
然后将连接产物转化进DH5α感受态细胞中,转化步骤如上所述,获得重组表达质粒。
7、重组表达质粒的提取
采用碱裂解法小量提取重组表达质粒DNA,具体方法如下:
(1) 从上述过夜培养的平板中随机挑取单个的白色菌落,接种于3 mL Amp的LB液体培养基中,37 ℃振摇培养过夜;
(2) 取1.5 mL菌液,于4 ℃以12000 rpm离心1 min,弃掉上清,将离心管倒置在吸水纸上,尽可能除去上清;
(3) 在细菌沉淀中加入100 μL 4 ℃预冷的SolutionⅠ,于旋涡混合仪上剧烈振荡;
(4) 加200 μL新配制的SolutionⅡ,盖紧管口,快速颠倒5次后将离心管放置于冰上2 min;
(5) 加入150 μL 4 ℃预冷的Solution Ⅲ,盖紧管口,温和颠倒10次使溶液在粘稠的细菌裂解液中分散均匀,然后将离心管放置于冰上3-5 min;
(6) 于4 ℃以 12000 rpm离心5 min后,将上清移至新离心管中;
(7) 加入等体积的饱和酚:氯仿(1:1),振荡混匀,于4 ℃以12000 rpm离心5 min,将上清移至另一新的离心管中;
(8) 用2倍体积的无水乙醇沉淀质粒DNA,振荡混匀,-20 ℃放置至少30 min;
(9) 于4 ℃以12000 rpm离心10 min,弃上清;
(10) 用4 ℃预冷的70%乙醇漂洗一遍沉淀;
(11) 将离心管倒置在吸水纸上,尽可能除去上清,自然干燥;
(12) 将质粒DNA溶于30 μL含RNA酶(20 μg/μL)的TE缓冲液中,37 ℃水浴消化30 min,备用。将所提取的质粒DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳,紫外灯下观察结果。
8、重组表达质粒的PCR鉴定
以F1、R1引物对重组表达质粒进行PCR扩增,对上述疑似阳性的重组质粒进行PCR鉴定。PCR反应体系如下:
ddH2O | 10.05 μL |
10×PCR buffer | 1.5 μL |
Mg2+ | 0.9 μL |
dNTP | 0.6 μL |
F1 | 0.375 μL |
R1 | 0.375 μL |
Taq DNA 聚合酶 | 0.2 μL |
重组质粒 | 1 μL |
总体积 | 15 μL |
离心混匀后,在PCR仪上执行如下反应程序:95 ℃,5 min;94 ℃,30 s,63℃,30 s,72 ℃,1 min, 35个循环;最后72 ℃延伸10 min。同时设立无模板的阴性对照,电泳图谱如图4所示。
9、重组表达质粒的酶切鉴定
对PCR扩增鉴定为阳性的重组质粒再用限制性内切酶EcoR I和Not I 进行双酶切鉴定。20 μL酶切反应体系如下:
ddH2O | 2 μL |
重组质粒 | 12 μL |
1×H+BSA | 2 μL+2 μL |
EcoR 1 | 1 μL |
Not 1 | 1 μL |
总体积 | 20 μL |
离心混匀后,于37 ℃水浴消化2 h,酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)电泳检查,电泳图谱如图5所示。
10、重组质粒的序列测定
为了进一步确定所得到的重组质粒,将阳性菌液送至上海生工公司进行序列测定,并用DNAStar软件分析插入片段的正确性。将最终鉴定正确的重组质粒命名为pPICZαA-HZ。
四、毕赤酵母表达载体的构建
1、线性化重组质粒pPICZαA-HZ
用Sac I将pPICZαA-HZ单酶切,酶切体系如下:
ddH2O | 70 μL |
质粒 | 60 μL |
10×H | 15 μL |
Sac I | 5 μL |
总体积 | 150 μL |
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。
2、GS115酵母感受态的制备及电转化
根据Shixuan Wu等的方法制备GS115酵母感受态,步骤如下:
(1) 挑取一单菌落接种到含2 mL YPD的大试管中,摇菌12 h。
(2) 吸取2 mL和1 mL,此菌液分别加入到含100 mLYPD的大三角烧瓶中,过夜培养。
(3) 当菌液的A600达到1-2时,将100 mL菌液离心收集菌体。
(4) 在室温下,用8mL的处理液(100 mM LiAC、10 mM DTT、0.6 M sorbitol、10 Mm Tris-Hcl pH7.5)重悬菌体,作用30 min。
(5) 将菌液离心,用1.5 mL预冷的山梨醇(1 M)重悬菌体,然后将其转移到1.5 mL的小离心管中,用预冷的山梨醇(1 M)清洗3次。后用适量的山梨醇(1 M)重悬菌体至终浓度为1010 cells/mL。
(6) 将3 ng DNA/1μL ddH2O的溶液与此菌液混合,转入到0.2 cm的电转杯中,在冰上冰浴5 min。
(7) 用BIO-RAD电转仪,在1.5 KV,25 μF,186 Ω的条件下电击酵母菌。电击后即刻用1 mL预冷的山梨醇(1 M)稀释,收集溶液至Eppendof管中。
(8) 取200 μL菌液涂布于含有1 mol/L 山梨醇的YPDS板(含Zeocin 为100 μg/mL)上,28 ℃避光培养2~3天直至长出酵母单菌落。
3、毕赤酵母转化子的表型鉴定
待28 ℃孵化4~6d 至MD平板出现乳白色的酵母转化菌落,将转化后所得到的阳性转化子再分别点接在MD和MM平板上,进行Mut+/Muts 表型鉴定,筛选都能在MD和MM上生长良好的Mut+的菌落,在两种平板均能正常生长的转化子为His+/Mut+型,而在MD平板上能正常生长,在MM平板上不生长或者生长缓慢的为His+/ Muts型。
4、高抗阳性转化子的筛选
用灭菌的牙签挑取在将MD和MM培养基平板中长出的最初His+/Mut+的单菌落,影印法分别点种在制备的 Zeocin质量浓度为1000、800、400、200 μg/mL的 YPDS 平板上。将平板倒置,放置在恒温培养箱中,30℃ 培养2~3 d。将高浓度抗性的克隆挑出来,分别划线Zeocin质量浓度为 100 μg/mL的 YPDS平板,以纯化单克隆。
5、PCR法鉴定重组菌株
采用PCR方法分析毕赤酵母转化子
(1) 酵母染色体DNA的提取
将筛选得到的重组多拷贝菌株,取单菌落中少量菌放入Eppendof管中,加12 μL的灭菌水,100 ℃沸水煮3-5 min,裂解酵母菌细胞壁,离心取上清液,以其中少量基因组DNA作模板,进行PCR。
(2) PCR扩增
以基因组DNA为模板,对整合到毕赤酵母GS115染色体DNA中的HZ基因进行PCR鉴定。分别以AOX1通用引物进行PCR扩增。在15 μL反应体系中依次加入如下组分:
PCR反应体系:
ddH2O | 9.05 μL |
10×PCR buffer | 1.5 μL |
Mg2+ | 0.9 μL |
dNTP | 0.6 μL |
5′AOX1 | 0.375 μL |
3′AOX1 | 0.375 μL |
Taq DNA 聚合酶 | 0.2 μL |
基因组DNA | 2 μL |
总体积 | 15 μL |
离心混匀后,在PCR仪上执行如下反应程序:95 ℃,5 min;94 ℃,40 s,53 ℃,40 s,72 ℃,1 min, 35个循环;最后72 ℃延伸10 min。同时设立无模板的阴性对照。
反应结束后,取5 μL PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)进行电泳检测,电泳图谱如图6所示,电泳图谱显示PCR以能扩增出约962bp的克隆定为阳性转化子。
6、阳性转化子的诱导表达
(1) 转化的单克隆重组酵母菌GS115/pPICZαA-HZ分别接种于含3 mLYPD液体培养基中,28 ℃,250 rpm的摇床中过夜培养。
(2) 按1:100的比例取菌液100 μL加入到含25 mL BMGY的三角烧瓶(100 mL)中,28 ℃,250 rpm的摇床中过夜培养。
(3) 当OD600值达2.0-6.0时,离心收集菌体转移到装有50 mL BMMY的三角烧瓶(250 mL)中,28 ℃,250 rpm的摇床中诱导表达。
(4) 每24 h补加一次终浓度为2%的甲醇,以保证持续诱导表达。
(5) 每隔24 h取一次样,以确定表达的最佳时间。连续诱导表达7 d。诱导结束后,培养液7000 rpm室温离心8 min收集上清,-20 ℃保存备用。
7、表达蛋白SDS-PAGE
表达蛋白SDS-PAGE(参照分子克隆实验指南操作)
(1) 按电泳装置的使用说明,装好洁净干燥的玻璃板。
(2) 分离胶的制备
按下列成分配制10mL 12%分离胶:
ddH2O | 3.2 mL |
30%丙烯酰胺混合液 | 4.0 mL |
1.5mol/L Tris(pH8.8) | 2.6 mL |
10%SDS | 0.1 mL |
10%过硫酸铵 | 0.1 mL |
TEMED | 0.004 mL |
总体积 | 10 mL |
各成分加入后迅速混匀,用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中,并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水,以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后,倒掉覆盖层,用水清洗凝胶顶部数次,用滤纸吸干凝胶顶端的水。
(3) 积层胶的制备
按下列成分配制3 mL5%的积层胶:
ddH2O | 2.1mL |
30%丙烯酰胺混合液 | 0.5 mL |
1.0mol/L Tris(pH6.8) | 0.38 mL |
10%SDS | 0.03 mL |
10%过硫酸铵 | 0.03 mL |
TEMED | 0.003 mL |
总体积 | 3 mL |
各成分加入后迅速混匀,用微量移液器将其灌注到分离胶上,灌满后小心插入加样梳,尽可能避免产生气泡。
(4) 待积层胶凝固后,小心拔下梳子。
(5) 将凝胶固定于电泳装置上,加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液,在电泳孔中分别加入20 μL各样品。
(6) 样品在积层胶中电泳时,使用90 V电压,待染料前沿进入分离胶后,将电压升至120 V,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部且开始泳出胶底面,关闭电源。
(7) 卸下凝胶,将其浸泡在至少5倍体积的染色液中,置摇床上室温染色至少4 h;移出并回收染液,以备再用;将凝胶浸泡于脱色液中,在摇床上脱色4-8 h,其间更换脱色液3-4次,直至凝胶脱色到满意为止,观察结果并照相。所得凝胶图谱如图7。
8、Bradford法测定表达上清中HZ蛋白含量
取16支10 mL干净的具塞试管,1支作空白,3支留作加不同体积样品,其余试管按表2取样,分别加入样品、水和考马斯亮蓝G-250试剂。即用1.0 mg/mL标准蛋白液(牛血清白蛋白)向各个试管中加入:0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mL,然后用去离子水补充到0.10 mL。最后各个试管中分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250,每加完一管立即在漩涡混合器上混匀(不能太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。放置2 min后用1 cm光经的比色杯在595 nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。样品加样量如下表中8、9、10管。
表2 标准曲线用溶液的配制
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
1.00 mg/mL标准蛋白液(mL) | 0.00 | 0.01 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 | 0.02 | 0.04 | 0.06 |
蒸馏水(mL) | 0.10 | 0.09 | 0.08 | 0.06 | 0.04 | 0.02 | 0.00 | 0.08 | 0.06 | 0.04 |
考马斯亮蓝G-250试剂(mL) | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 |
光密度OD595nm | 0 | 0.047 | 0.091 | 0.154 | 0.2 | 0.255 | 0.298 | 0.06 | 0.137 | 0.261 |
用标准蛋白浓度(mg/mL)为横坐标,以吸光度值OD595nm为纵坐标作图即得一条标准曲线。由此绘制的标准曲线图如附图8所示。根据测出的样品的吸光度值,即可得出样品中的总蛋白质含量。
由图8所示标准曲线得到一级方程式y=0.2534x-0.0027,代入三个不同浓度样品的OD595nm值y,从而得出各样品中总蛋白质的浓度值x,其平均值为1.451977 mg/mL。由Bandscan软件测定人溶菌酶蛋白占总蛋白的百分比约为35%,即人溶菌酶蛋白在上清液中的浓度约为508.6 mg/L。
9、Western blot分析
为了检测所表达的人溶菌酶蛋白,将SDS-PAGE电泳后的凝胶电转印于硝酸纤维素(NC)膜上。简略步骤如下:
(1) 剪一张与凝胶大小相同的NC膜,用去离子水浸透,同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。
(2) 按三明治法安装转印装置,即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹,使NC膜位于转印的正极面,凝胶位于负极面,其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中,加入转移缓冲液,0.35 A电泳1.5 h。
转印结束后,将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍,然后按常规方法进行Western blot检测:
(1) 将NC膜浸泡于封闭液中,4 ℃封闭过夜。
(2) 用PBST洗涤NC膜三遍,每次10 min。
(3) NC膜置于1:50的兔抗人溶菌酶的单抗作为一抗的溶液中,37 ℃反应1 h用PBST洗膜三次,10 min/次。
(4) NC膜置于1:50的羊抗兔IgG的酶标抗体作为二抗的溶液中,37 ℃反应1 h,用PBST洗膜三次,10 min/次。
(5) 将NC膜置于显色液DAB中,避光显色;此时应密切观察显色过程,并在较浅本底且达到适当显色强度时流水终止显色。Western blot 图谱如附图9所示。
五、人溶菌酶活性检测
1、人溶菌酶抑菌活性检测
(1) 接种溶壁微球菌于LB中(组成为:1%Trpton,0.5%Yeast Extract,1%NaCl,用NaOH调节pH值至7.0)液体培养基中,28℃振荡过夜,4000rpm离心收集菌体,用少许pH6.2的0.1M PBS重悬菌体;
(2) 称量1g Argoase 溶解于100ml pH6.2的0.1M PBS(组成为:NaH2PO4.2H2O 1.482g,Na2HPO4.12H2O 29.011g,NaCl 9.0g,加双蒸水至1000ml)中,121℃高压灭菌30min;
(3) 待冷却至50-60℃时,加入溶壁微球菌,调节OD600约为2.0左右;
(4) 浇制平板,冷凝后根据需要打制适当孔径的圆孔;
(5) 向圆孔内加各溶菌酶样品以及标准溶菌酶对照样品,37℃温箱孵育24h;
(6) 测定各样品加样孔周围形成的抑菌圈的直径,借以分析溶菌酶的抑菌活性;
2、溶菌酶抑菌活力单位的测定
(1) 试验菌悬浮液的制备:接种溶壁微球菌于试验菌斜面培养基上,28℃恒温培养48h。用灭菌蒸馏水将菌体洗下,4000rpm离心10min收集菌体,再用灭菌蒸馏水洗涤3次。最后用少量水调制成OD450为0.8左右的试验菌悬浮液冷藏备用。
(2) 标准酶液的配制:准确称取16mg溶菌酶粉,用pH6.2的0.1M PBS溶解,配成浓度为4mg/ml的酶溶液,再用同样缓冲液将此酶液依次稀释成2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/ml。
(3) 比浊测量:取试验菌悬浮液3.0ml,置于比色皿测定450nm下OD450值,然后加入酶液0.2ml,迅速摇匀。从加入酶液起计时,每隔30s记录一次OD450。
(4) 溶菌酶酶活力的计算:酶活力单位定义:在25℃和pH6.2条件下,OD450每分钟下降0.001为1个酶活力单位(IU)。由此得酶活力计算公式为:
每mg酶的活力单位=[ OD450 (零时)- OD450 (60s时) ]*1000/样品毫克数
经计算获得:人溶菌酶活为5426 U/mL,因人溶菌酶蛋白在上清液中的浓度约为508.6 mg/L,所以得出比活性为10668.5U/mg。
六、溶菌酶的作用及应用
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶,此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一,该酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌,在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下,还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。
溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎,尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性,其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长,并能防止疱疹性病毒感染。
因此,溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。但是由于溶菌酶抗菌谱较窄,只对G+细菌起作用,为了加强其溶菌作用,人们常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用,以增强对G-细菌的溶菌作用。 根据人溶菌酶的作用,可将毕赤酵母表达的人溶菌酶作为饲料添加剂应用于畜牧和饲料行业。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用,不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益,同时也可产生巨大的生态效益。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛根源生物技术集团有限公司
<120> 一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 422
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
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ggttacagag gtatttcttt ggctaattgg atgtgtttgg caaagtggga atctggttac 120
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gc 422
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Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
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65 70 75 80
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