CN102229939A

CN102229939A - 一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用

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Publication number: CN102229939A
Application number: CN2011101364035A
Authority: CN
Inventors: 孙同毅; 张大伟; 王希辉
Original assignee: QINGDAO GENYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Current assignee: QINGDAO GENYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: CN102229939B

Abstract

本发明提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化并人工合成人溶菌酶基因，构建重组质粒pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ，将重组质粒pPICZαΑ-HZ线性化后转到毕赤酵母中，筛选获得阳性转化子，经实验结果表明重组毕赤酵母分泌表达了高活性的人溶菌酶，表达产物具有明显抑菌活性。本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

Description

一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于分子生物学制药技术领域，具体涉及一种优化的人溶菌酶基因及其表达载体和应用。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme) 全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它由英国细菌学家Fleming在1922年首先在人的唾沫、眼泪和鼻涕中发现，因其能溶解细菌细胞壁而具有溶菌作用而得其名。溶菌酶是人和动物体液和组织中的一种重要的防御因子，具有杀菌效果强，杀菌谱广，稳定性强，易被机体所接受的特点，还能促进免疫功能恢复，并且没有任何毒副作用和不良反应。因此溶菌酶作为一种生物制剂，被广泛应用于食品、饲料工业和临床医学。人溶菌酶参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有潜在的临床应用价值，在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。目前，国外已有小规模将人溶菌酶用于临床的报道，治疗效果也较好，且不会产生耐药性。人溶菌酶是溶菌酶中的一种，通常人溶菌酶是从人奶或胎盘中少量提取获得。由于其来源困难，不能进行工业化生产，采取DNA 重组技术，从原核或真核表达系统生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。酿酒酵母表达系统已被广泛应用，虽已积累大量经验，但也存在诸多不足之处，如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想。

发明内容

本发明针对现有技术中利用酿酒酵母表达系统生产人溶菌酶所存在的菌株生长速度慢、密度不高且外源蛋白的表达和翻译后加工不理想的不足，提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，本发明利用巴斯德毕赤酵母表达系统来作为生产人溶菌酶的表达系统，它具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、转录后加工修饰和良好的发酵与分泌性能等优点，本发明优化后的人溶菌酶基因经毕赤酵母表达系统产生的人溶菌酶具有高活性、高表达量的优点。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因HZ，它具有序列表SEQ ID NO:1的碱基序列，克隆所述基因的特异性引物为：

引物F1：5’-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’

引物R1：5’-ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’

引物AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

3’- GCAAATGGCATTCTGACATCC -5’

本发明还提供了一种高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO:1编码的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

本发明还提供了含有所述人溶菌酶基因HZ的重组载体，所述重组载体为pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ。

本发明还提供了所述人溶菌酶在作为饲料添加剂、食品添加剂和制药中的应用，所述人溶菌酶可制备用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药物，所述人溶菌酶与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐物质配合使用。

本发明选择活性较强的人溶菌酶基因，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化，并人工合成优化后的人溶菌酶基因，将其与pUC18-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒pUC18-T-HZ，以重组质粒pUC18-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增得到目的基因片段HZ。将合成的优化后的人溶菌酶基因与真核载体pPICZαΑ连接，构建了重组质粒pPICZαΑ-HZ。将重组质粒pPICZαΑ-HZ线性化后经电击转化法转到毕赤酵母GS115中，筛选能在MD和MM上生长良好的Mut+的菌落，然后经抗生素Zeocin筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于BMGY液体培养基中，于28 ℃，250 r/min摇床培养至OD₆₀₀为2.0－6.0左右，离心收集菌体，后转接到装有新鲜BMMY液体培养基中进行诱导表达。同时进行最佳诱导表达条件的探索，以确定表达的最佳条件。诱导结束后，培养液室温离心收集上清，将诱导上清进行SDS-PAGE，得到与预期一致大小约为15.26kD的目的条带，Western blot中将SDS-PAGE中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗人溶菌酶的单抗作为一抗，用羊抗兔IgG的酶标抗体作为二抗，最后用二氨基联苯胺（DAB）显色。结果表明，目的条带与兔抗人溶菌酶的单抗发生特异反应，确证重组毕赤酵母分泌表达了人溶菌酶HZ。用溶壁微球菌平板溶圈法鉴定表达产物的活性，检测得知具有明显抑菌活性。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，不受原材料来源的限制，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是Genbank中现有人溶菌酶基因序列与本发明优化后人溶菌酶基因序列对比图谱。

图2是本发明中以重组质粒pUC18-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增产物的电泳图谱，图中1表示DL2000 DNA marker; 2表示 PCR扩增产物。

图3是本发明中重组表达质粒pPICZαA-HZ的构建图谱。

图4是本发明中重组表达质粒pPICZαA-HZ的PCR鉴定电泳图谱，1表示DL2000 DNA marker；2表示质粒 pPICZαA-HZ的PCR产物。

图5是本发明中重组表达质粒pPICZαA-HZ的酶切鉴定电泳图谱，图中1表示DL2000 DNA marker；2和3表示表达载体pPICZαA-HZ经EcoRⅠ+NotⅠ酶切后产物。

图6是本发明中重组菌株的通用引物AOX1的PCR验证图谱， 1, 2, 3, 4, 5表示GS115/ pPICZαA-HZ 的PCR 产物；6表示DL2000 DNA marker。

图7是本发明中人溶菌酶蛋白SDS-PAGE的凝胶图谱，图中1表示蛋白MW Marker；2表示重组菌株GS115/ pPICZαA-HZ 表达上清；3表示重组菌株GS115/ pPICZαA 诱导上清。

图8是本发明中牛血清白蛋白标准曲线。

图9是本发明中人溶菌酶蛋白的Western blot分析图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、溶菌酶基因的选择、优化和合成

1、溶菌酶基因的选择

来源不同的溶菌酶活性存在差异，人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍；而从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出的溶菌酶，其溶菌活性也远低于人溶菌酶；植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1／3。因此本发明选择活性较强的人溶菌酶基因进行表达。

2、溶菌酶基因序列的优化

外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白有效表达的重要因素。本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，将溶菌酶基因的酵母低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。人溶菌酶基因的核苷酸序列与Genbank中人溶菌酶基因序列对比如附图1所示。

在附图1中，图谱上面一条序列是Genbank中人溶菌酶基因序列(NCBI序列号：NM_000239.2)，下面一条是优化后的人溶菌酶基因序列，两者对比后的黑色部分为相同碱基，白色部分为相异碱基。

附图1表明，与Genbank中人溶菌酶基因序列相比，优化后的人溶菌酶基因有77个碱基发生了置换，但氨基酸序列并没有改变。

在人溶菌酶的C-端上加入5个氨基酸的肽链，使溶菌酶具有脂溶性，便于插入革兰氏阴性菌的脂多层中，可以在脂多层表面形成一个洞，切断下层的β-1,4糖苷键而发挥溶菌作用。因此在人溶菌酶基因序列3’端加上编码5个氨基酸的基因序列。

通过专业软件分析，在基因序列的5’端和3’端分别加上EcoR I、Not I两个酶切位点，酶切位点如表1下划线所示的核苷酸。

3、优化的人溶菌酶基因序列的合成

所述优化后的人溶菌酶基因序列由上海生工公司合成。合成的人溶菌酶基因HZ全序列如SEQ ID No:1所示。

AAGGTTTTTGAAAGATGTGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGATGGTTACAGAGGTATTTCTTTGGCTAATTGGATGTGTTTGGCAAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAATGCAGGTGATAGATCTACTGATTACGGTATCTTCCAGATCAACTCTAGATACTGGTGTAACGATGGTAAGACTCCAGGTGCTGTTAACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCTGCTTTGTTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTTGCATGTGCTAAGAGAGTTGTTAGAGATCCACAGGGTATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGATGCCAAAACAGAGATGTTAGACAGTATGTTCAAGGTTGTGGTGTTTTCTTCGTTGCTCCATAAGCGGCCGC

由SEQ ID No:1的核苷酸序列编码的人溶菌酶蛋白序列如SEQ ID No:2。

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVFFVAP

其分子量为15261.41Daltons。

二、重组质粒pUC18-T-HZ的构建

所采用的载体是商业购买的pUC18-T载体，构建载体的宿主细胞是DH5α。

1、新合成的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接

将所述合成好的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接，连接体系如下：

SolutionⅠ	10μl
		pUC18-T	1μl
合成产物HZ	9μl
		总体积	20μl

离心混匀后，16℃低温水浴连接过夜。连接产物直接用于转化。

2、DH5α感受态细胞的制备

(1)取DH5α菌种，划线接种于LB固体培养基，培养过夜；

(2)取单个菌落，接种于含2 mL LB液体培养基的10 mL试管中，37℃振荡培养过夜，次日按1％转种于含50 mL LB液体培养基的250 mL三角烧瓶中，继续振荡培养至OD600值达到0.3-0.5左右时取出；

(3)无菌条件下将细菌转移到无菌的用冰预冷的50 mL聚丙烯离心管中，在冰上放置10 min；

(4)于4 ℃以4000 rpm离心10 min，倒出培养液，将管倒置1 min使残留液体流尽；

(5)用10 mL冰预冷的0.1 mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置5 min；

(6)于4 ℃以4000 rpm离心10 min，回收菌体；

(7)倒出培养液，将管倒置1 min使残留液体流尽；

(8)用1 mL冰浴预冷的0.1 mol/LCaCl2重悬细胞沉淀；

(9)用冷却的无菌吸头将感受态细胞分装于预冷的无菌微量离心管中，每管200 μL。

3、合成的人溶菌酶基因与pUC18-T载体连接后的连接产物转化

将上述制得的连接产物转化进DH5α感受态细胞中。转化步骤如下：

(1)将获得的连接产物10 μL加入200 μL感受态细胞中，同时设阴性对照，以及不加入任何质粒DNA的感受态细胞对照；

(2)轻轻混匀后，立即冰浴30 min；

(3)将装有混合物的离心管移入预加温至42 ℃的循环水浴中，恰好静置90 s；

(4)将离心管快速转移到冰浴中，放置2 min；

(5)在超净台里，将离心管中的混合物加到800 μL预热至37 ℃的LB液体培养基中；

(6)轻轻颠倒混匀，将混合物于37 ℃振荡培养45 min；

(7)将培养的菌液以3000 rpm离心5 min，在超净台里弃掉部分上清，留约100 μL上清，用加样器重悬菌体沉淀；

(8)取菌液涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃倒置培养过夜。

4、重组质粒的序列测定

为了进一步确定上述步骤所得到的重组质粒，将阳性菌液由测序公司进行序列测定，并用DNAStar软件分析插入片段的正确性。将最终鉴定正确的重组质粒命名为pUC18-T-HZ。

三、重组质粒pPICZαA-HZ的构建

所采用的酵母表达载体为pPICZαΑ，构建载体的宿主细胞是大肠杆菌DH5α。

1、设计引物

根据新合成的人溶菌酶基因序列设计上下游引物F1、R1，及合成通用引物AOX1，所述引物均由上海生工公司合成，所述引物的序列如下，下划线部分碱基代表相应酶切位点：

表1：PCR扩增所用引物

2、人溶菌酶基因HZ的克隆

首先以获得的重组质粒pUC18-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

ddH₂O	9.05 μL
		10×PCR buffer	1.5 μL
Mg²⁺	0.9 μL
		dNTP	0.6 μL
F1	0.375 μL
		R1	0.375 μL
Taq DNA 聚合酶	0.2 μL
		pUC18-T-HZ	2.0 μL
总体积	15 μL

反应条件：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s，63 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

所得的PCR产物跑0.8%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，然后用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收，电泳图谱如图2所示。

3、PCR产物的纯化与回收

将经过初步鉴定后剩余的PCR产物全部跑0.8%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收，操作方法如下：

(1) 用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含所要回收DNA的琼脂块，放入 1.5 mL离心管中。判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。

(2) 每100 mg琼脂糖凝胶中或100 μL的DNA溶液中加入400 μL Binding Buffer，置于50-60 ℃水浴中10 min，每2 min混匀一次，以保证凝胶全部融化。

(3) 将融化的胶溶液转移到套放于2 mL收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min。8000 rpm室温离心1 min。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。

(4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solution，10000 rpm室温离心30 s。

(5) 重复步骤(4)一次。

(6) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，10000 rpm室温离心15 s。

回收得到目的片段HZ。

4、目的片段HZ与酵母表达载体pPICZαA的酶切回收

重组表达载体pPICZαA-HZ的构建图谱如图3所示。用EcoR I、Not I两种限制性内切酶双酶切PCR回收得到的目的片段HZ和pPICZαA载体，酶切体系如下：

ddH2O	10 μL
		PCR产物或pPICZαA载体	60 μL
1×H+BSA	10 μL+10 μL
		EcoR 1	5 μL
Not 1	5 μL
		总体积	100 μL

回收酶切产物。

5、DH5α感受态细胞的制备

步骤如上所述。

6、目的片段HZ与pPICZαA载体酶切片段的连接转化

将HZ和pPICZαA酶切片段混合，然后用T4DNA 连接酶16 ℃过夜连接。连接体系如下：

ddH₂O	0.5 μL
		pPICZαA (EcoR 1及 Not 1酶切)	3 μL
HZ (EcoR 1及 Not 1酶切)	5 μL
		10×T4 DNA Ligase buffer	1 μL
T4 DNA Ligase	0.5 μL
		总体积	10 μL

然后将连接产物转化进DH5α感受态细胞中，转化步骤如上所述，获得重组表达质粒。

7、重组表达质粒的提取

采用碱裂解法小量提取重组表达质粒DNA，具体方法如下：

(1) 从上述过夜培养的平板中随机挑取单个的白色菌落，接种于3 mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜；

(2) 取1.5 mL菌液，于4 ℃以12000 rpm离心1 min，弃掉上清，将离心管倒置在吸水纸上，尽可能除去上清；

(3) 在细菌沉淀中加入100 μL 4 ℃预冷的SolutionⅠ，于旋涡混合仪上剧烈振荡；

(4) 加200 μL新配制的SolutionⅡ，盖紧管口，快速颠倒5次后将离心管放置于冰上2 min；

(5) 加入150 μL 4 ℃预冷的Solution Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒10次使溶液在粘稠的细菌裂解液中分散均匀，然后将离心管放置于冰上3-5 min；

(6) 于4 ℃以 12000 rpm离心5 min后，将上清移至新离心管中；

(7) 加入等体积的饱和酚：氯仿（1:1），振荡混匀，于4 ℃以12000 rpm离心5 min，将上清移至另一新的离心管中；

(8) 用2倍体积的无水乙醇沉淀质粒DNA，振荡混匀，-20 ℃放置至少30 min；

(9) 于4 ℃以12000 rpm离心10 min，弃上清；

(10) 用4 ℃预冷的70%乙醇漂洗一遍沉淀；

(11) 将离心管倒置在吸水纸上，尽可能除去上清，自然干燥；

(12) 将质粒DNA溶于30 μL含RNA酶（20 μg/μL）的TE缓冲液中，37 ℃水浴消化30 min，备用。将所提取的质粒DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察结果。

8、重组表达质粒的PCR鉴定

以F1、R1引物对重组表达质粒进行PCR扩增，对上述疑似阳性的重组质粒进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：

ddH₂O	10.05 μL
		10×PCR buffer	1.5 μL
Mg²⁺	0.9 μL
		dNTP	0.6 μL
F1	0.375 μL
		R1	0.375 μL
Taq DNA 聚合酶	0.2 μL
		重组质粒	1 μL
总体积	15 μL

离心混匀后，在PCR仪上执行如下反应程序：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s，63℃，30 s，72 ℃，1 min， 35个循环；最后72 ℃延伸10 min。同时设立无模板的阴性对照，电泳图谱如图4所示。

9、重组表达质粒的酶切鉴定

对PCR扩增鉴定为阳性的重组质粒再用限制性内切酶EcoR I和Not I 进行双酶切鉴定。20 μL酶切反应体系如下：

ddH2O	2 μL
		重组质粒	12 μL
1×H+BSA	2 μL+2 μL
		EcoR 1	1 μL
Not 1	1 μL
		总体积	20 μL

离心混匀后，于37 ℃水浴消化2 h，酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）电泳检查，电泳图谱如图5所示。

10、重组质粒的序列测定

为了进一步确定所得到的重组质粒，将阳性菌液送至上海生工公司进行序列测定，并用DNAStar软件分析插入片段的正确性。将最终鉴定正确的重组质粒命名为pPICZαA-HZ。

四、毕赤酵母表达载体的构建

1、线性化重组质粒pPICZαA-HZ

用Sac I将pPICZαA-HZ单酶切，酶切体系如下：

ddH2O	70 μL
		质粒	60 μL
10×H	15 μL
		Sac I	5 μL
总体积	150 μL

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

2、GS115酵母感受态的制备及电转化

根据Shixuan Wu等的方法制备GS115酵母感受态，步骤如下：

(1) 挑取一单菌落接种到含2 mL YPD的大试管中，摇菌12 h。

(2) 吸取2 mL和1 mL，此菌液分别加入到含100 mLYPD的大三角烧瓶中，过夜培养。

(3) 当菌液的A600达到1-2时，将100 mL菌液离心收集菌体。

(4) 在室温下，用8mL的处理液（100 mM LiAC、10 mM DTT、0.6 M sorbitol、10 Mm Tris-Hcl pH7.5）重悬菌体，作用30 min。

(5) 将菌液离心，用1.5 mL预冷的山梨醇（1 M）重悬菌体，然后将其转移到1.5 mL的小离心管中，用预冷的山梨醇（1 M）清洗3次。后用适量的山梨醇（1 M）重悬菌体至终浓度为1010 cells/mL。

(6) 将3 ng DNA/1μL ddH2O的溶液与此菌液混合，转入到0.2 cm的电转杯中，在冰上冰浴5 min。

(7) 用BIO-RAD电转仪，在1.5 KV，25 μF，186 Ω的条件下电击酵母菌。电击后即刻用1 mL预冷的山梨醇（1 M）稀释，收集溶液至Eppendof管中。

(8) 取200 μL菌液涂布于含有1 mol/L 山梨醇的YPDS板（含Zeocin 为100 μg/mL）上，28 ℃避光培养2~3天直至长出酵母单菌落。

3、毕赤酵母转化子的表型鉴定

待28 ℃孵化4～6d 至MD平板出现乳白色的酵母转化菌落，将转化后所得到的阳性转化子再分别点接在MD和MM平板上，进行Mut+/Muts 表型鉴定，筛选都能在MD和MM上生长良好的Mut+的菌落，在两种平板均能正常生长的转化子为His+/Mut+型，而在MD平板上能正常生长，在MM平板上不生长或者生长缓慢的为His+/ Muts型。

4、高抗阳性转化子的筛选

用灭菌的牙签挑取在将MD和MM培养基平板中长出的最初His+/Mut+的单菌落，影印法分别点种在制备的 Zeocin质量浓度为1000、800、400、200 μg/mL的 YPDS 平板上。将平板倒置，放置在恒温培养箱中，30℃ 培养2～3 d。将高浓度抗性的克隆挑出来，分别划线Zeocin质量浓度为 100 μg/mL的 YPDS平板，以纯化单克隆。

5、PCR法鉴定重组菌株

采用PCR方法分析毕赤酵母转化子

(1) 酵母染色体DNA的提取

将筛选得到的重组多拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendof管中，加12 μL的灭菌水，100 ℃沸水煮3-5 min，裂解酵母菌细胞壁，离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR。

(2) PCR扩增

以基因组DNA为模板，对整合到毕赤酵母GS115染色体DNA中的HZ基因进行PCR鉴定。分别以AOX1通用引物进行PCR扩增。在15 μL反应体系中依次加入如下组分：

PCR反应体系：

ddH2O	9.05 μL
		10×PCR buffer	1.5 μL
Mg2+	0.9 μL
		dNTP	0.6 μL
5′AOX1	0.375 μL
		3′AOX1	0.375 μL
Taq DNA 聚合酶	0.2 μL
		基因组DNA	2 μL
总体积	15 μL

离心混匀后，在PCR仪上执行如下反应程序：95 ℃，5 min；94 ℃，40 s，53 ℃，40 s，72 ℃，1 min， 35个循环；最后72 ℃延伸10 min。同时设立无模板的阴性对照。

反应结束后，取5 μL PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）进行电泳检测，电泳图谱如图6所示，电泳图谱显示PCR以能扩增出约962bp的克隆定为阳性转化子。

6、阳性转化子的诱导表达

(1) 转化的单克隆重组酵母菌GS115/pPICZαA-HZ分别接种于含3 mLYPD液体培养基中，28 ℃，250 rpm的摇床中过夜培养。

(2) 按1：100的比例取菌液100 μL加入到含25 mL BMGY的三角烧瓶（100 mL）中，28 ℃，250 rpm的摇床中过夜培养。

(3) 当OD600值达2.0-6.0时，离心收集菌体转移到装有50 mL BMMY的三角烧瓶（250 mL）中，28 ℃，250 rpm的摇床中诱导表达。

(4) 每24 h补加一次终浓度为2%的甲醇，以保证持续诱导表达。

(5) 每隔24 h取一次样，以确定表达的最佳时间。连续诱导表达7 d。诱导结束后，培养液7000 rpm室温离心8 min收集上清，-20 ℃保存备用。

7、表达蛋白SDS-PAGE

表达蛋白SDS-PAGE（参照分子克隆实验指南操作）

(1) 按电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。

(2) 分离胶的制备

按下列成分配制10mL 12%分离胶：

ddH2O	3.2 mL
		30%丙烯酰胺混合液	4.0 mL
1.5mol/L Tris(pH8.8)	2.6 mL
		10%SDS	0.1 mL
10%过硫酸铵	0.1 mL
		TEMED	0.004 mL
总体积	10 mL

各成分加入后迅速混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖层，用水清洗凝胶顶部数次，用滤纸吸干凝胶顶端的水。

(3) 积层胶的制备

按下列成分配制3 mL5%的积层胶：

ddH2O	2.1mL
		30%丙烯酰胺混合液	0.5 mL
1.0mol/L Tris(pH6.8)	0.38 mL
		10%SDS	0.03 mL
10%过硫酸铵	0.03 mL
		TEMED	0.003 mL
总体积	3 mL

各成分加入后迅速混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。

(4) 待积层胶凝固后，小心拔下梳子。

(5) 将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在电泳孔中分别加入20 μL各样品。

(6) 样品在积层胶中电泳时，使用90 V电压，待染料前沿进入分离胶后，将电压升至120 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。

(7) 卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的染色液中，置摇床上室温染色至少4 h；移出并回收染液，以备再用；将凝胶浸泡于脱色液中，在摇床上脱色4-8 h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到满意为止，观察结果并照相。所得凝胶图谱如图7。

8、Bradford法测定表达上清中HZ蛋白含量

取16支10 mL干净的具塞试管，1支作空白，3支留作加不同体积样品，其余试管按表2取样，分别加入样品、水和考马斯亮蓝G-250试剂。即用1.0 mg/mL标准蛋白液（牛血清白蛋白）向各个试管中加入：0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL，然后用去离子水补充到0.10 mL。最后各个试管中分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250，每加完一管立即在漩涡混合器上混匀（不能太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。放置2 min后用1 cm光经的比色杯在595 nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。样品加样量如下表中8、9、10管。

表2 标准曲线用溶液的配制

管号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											1.00 mg／mL标准蛋白液(mL)	0.00	0.01	0.02	0.04	0.06	0.08	0.10	0.02	0.04	0.06
蒸馏水(mL)	0.10	0.09	0.08	0.06	0.04	0.02	0.00	0.08	0.06	0.04
											考马斯亮蓝G-250试剂(mL)	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
光密度OD_595nm	0	0.047	0.091	0.154	0.2	0.255	0.298	0.06	0.137	0.261

用标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度值OD_595nm为纵坐标作图即得一条标准曲线。由此绘制的标准曲线图如附图8所示。根据测出的样品的吸光度值，即可得出样品中的总蛋白质含量。

由图8所示标准曲线得到一级方程式y=0.2534x-0.0027，代入三个不同浓度样品的OD_595nm值y，从而得出各样品中总蛋白质的浓度值x，其平均值为1.451977 mg/mL。由Bandscan软件测定人溶菌酶蛋白占总蛋白的百分比约为35%，即人溶菌酶蛋白在上清液中的浓度约为508.6 mg/L。

9、Western blot分析

为了检测所表达的人溶菌酶蛋白，将SDS-PAGE电泳后的凝胶电转印于硝酸纤维素（NC）膜上。简略步骤如下：

(1) 剪一张与凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。

(2) 按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，0.35 A电泳1.5 h。

转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，然后按常规方法进行Western blot检测：

(1) 将NC膜浸泡于封闭液中，4 ℃封闭过夜。

(2) 用PBST洗涤NC膜三遍，每次10 min。

(3) NC膜置于1：50的兔抗人溶菌酶的单抗作为一抗的溶液中，37 ℃反应1 h用PBST洗膜三次，10 min/次。

(4) NC膜置于1：50的羊抗兔IgG的酶标抗体作为二抗的溶液中，37 ℃反应1 h，用PBST洗膜三次，10 min/次。

(5) 将NC膜置于显色液DAB中，避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适当显色强度时流水终止显色。Western blot 图谱如附图9所示。

五、人溶菌酶活性检测

1、人溶菌酶抑菌活性检测

(1) 接种溶壁微球菌于LB中（组成为：1%Trpton，0.5%Yeast Extract，1%NaCl，用NaOH调节pH值至7.0）液体培养基中，28℃振荡过夜，4000rpm离心收集菌体，用少许pH6.2的0.1M PBS重悬菌体；

(2) 称量1g Argoase 溶解于100ml pH6.2的0.1M PBS（组成为：NaH2PO4.2H2O 1.482g，Na2HPO4.12H2O 29.011g，NaCl 9.0g，加双蒸水至1000ml）中，121℃高压灭菌30min；

(3) 待冷却至50-60℃时，加入溶壁微球菌，调节OD600约为2.0左右；

(4) 浇制平板，冷凝后根据需要打制适当孔径的圆孔；

(5) 向圆孔内加各溶菌酶样品以及标准溶菌酶对照样品，37℃温箱孵育24h；

(6) 测定各样品加样孔周围形成的抑菌圈的直径，借以分析溶菌酶的抑菌活性；

2、溶菌酶抑菌活力单位的测定

(1) 试验菌悬浮液的制备：接种溶壁微球菌于试验菌斜面培养基上，28℃恒温培养48h。用灭菌蒸馏水将菌体洗下，4000rpm离心10min收集菌体，再用灭菌蒸馏水洗涤3次。最后用少量水调制成OD₄₅₀为0.8左右的试验菌悬浮液冷藏备用。

(2) 标准酶液的配制：准确称取16mg溶菌酶粉，用pH6.2的0.1M PBS溶解，配成浓度为4mg/ml的酶溶液，再用同样缓冲液将此酶液依次稀释成2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/ml。

(3) 比浊测量：取试验菌悬浮液3.0ml，置于比色皿测定450nm下OD₄₅₀值，然后加入酶液0.2ml，迅速摇匀。从加入酶液起计时，每隔30s记录一次OD₄₅₀。

(4) 溶菌酶酶活力的计算：酶活力单位定义：在25℃和pH6.2条件下，OD₄₅₀每分钟下降0.001为1个酶活力单位（IU）。由此得酶活力计算公式为：

每mg酶的活力单位=[ OD₄₅₀ (零时)- OD₄₅₀ (60s时) ]*1000/样品毫克数

经计算获得：人溶菌酶活为5426 U/mL，因人溶菌酶蛋白在上清液中的浓度约为508.6 mg/L，所以得出比活性为10668.5U/mg。

六、溶菌酶的作用及应用

溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，该酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。

溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。

因此，溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。但是由于溶菌酶抗菌谱较窄，只对G+细菌起作用，为了加强其溶菌作用，人们常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用，以增强对G-细菌的溶菌作用。　根据人溶菌酶的作用，可将毕赤酵母表达的人溶菌酶作为饲料添加剂应用于畜牧和饲料行业。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛根源生物技术集团有限公司

<120> 一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 422

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gaattcaagg tttttgaaag atgtgaattg gctagaactt tgaagagatt gggtatggat 60

ggttacagag gtatttcttt ggctaattgg atgtgtttgg caaagtggga atctggttac 120

aacactagag ctactaacta caatgcaggt gatagatcta ctgattacgg tatcttccag 180

atcaactcta gatactggtg taacgatggt aagactccag gtgctgttaa cgcttgtcat 240

ttgtcttgtt ctgctttgtt gcaagataac atcgctgatg ctgttgcatg tgctaagaga 300

gttgttagag atccacaggg tattagagct tgggttgctt ggagaaacag atgccaaaac 360

agagatgtta gacagtatgt tcaaggttgt ggtgttttct tcgttgctcc ataagcggcc 420

gc 422

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly

1 5 10 15

Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala

20 25 30

Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp

50 55 60

Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala

85 90 95

Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp

100 105 110

Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys

115 120 125

Gly Val Phe Phe Val Ala Pro

130 135

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgaattcaa ggtttttgaa agatgtga 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcaaatggca ttctgacatc c 21

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<120> 一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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Claims

1.一种优化的高活性人溶菌酶基因HZ，其具有序列表SEQ ID NO:1的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的一种人溶菌酶基因HZ，其特征在于克隆所述基因的特异性引物为：

引物F1：5’-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’；

引物R1：5’-ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’；

引物AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；

3’- GCAAATGGCATTCTGACATCC -5’。

3.一种高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO:1编码的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

4.重组载体，其含有权利要求1所述的人溶菌酶基因HZ。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ。

6.一种根据权利要求3所述的人溶菌酶在作为饲料添加剂、食品添加剂和制药中的应用。

7.根据权利要求6所述的一种人溶菌酶在制药中的应用，其特征在于所述人溶菌酶在制备用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种人溶菌酶在制药中的应用，其特征在于所述人溶菌酶与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐物质配合使用。