CN103131679A

CN103131679A - 人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用

Info

Publication number: CN103131679A
Application number: CN2013100474164A
Authority: CN
Inventors: 朱登高; 蒋正芳; 钟诚
Original assignee: SHANGHAI GAOLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI GAOLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明公开了一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用。所述融合蛋白的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。试验表明，所述融合蛋白具有较好的抑菌性，可以作为添加剂应用于动物饲料中。

Description

人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用，具体涉及一种利用重组毕赤酵母生产的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白及其表达载体，以及将该融合蛋白作为一种新型绿色饲料添加剂在动物饲料中的应用。

背景技术

畜禽养殖生产过程中，使用抗生素作为促生长剂用于预防动物疾病，提高饲料报酬的作法广为业内人士认同，已经延用了50多年。进入新世纪以来，随着对食品安全、卫生、药物残留等问题日益关注，抗生素的负面效应越来越引起人们的重视，加入WTO后，饲料质量和安全性的提高更是迫在眉睫。

溶菌酶具有杀菌效果强、杀菌谱广、稳定性强、易被机体所接受等优点，且还能促进免疫功能恢复，并且对人禽无毒、没有任何毒副作用和不良反应、无药害残留。作为一种生物制剂，溶菌酶本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，在食品、医药、生物学中已得到了广泛的应用，同时也为饲料行业开发新型无公害绿色饲料添加剂开辟了一个新的途径。

溶菌酶又称细胞壁溶解酶，它广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。作为一种糖苷水解酶，溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的肽聚糖从而造成细胞溶解死亡。人溶菌酶（hLYS）由130个氨基酸残基组成，分子量为14.6kDa，具有很强的热稳定性（在pH=4-7、100℃情况下处理1min不失活），其溶菌活性比目前广泛使用的鸡蛋清溶菌酶高3倍。此外，与蛋清溶菌酶抑菌功能不同的是：该酶既对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成的菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌具有良好的分解作用，也能在动物体内分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，水解相当部分的革兰氏阴性菌如大肠杆菌、普通变球菌和副血性弧菌等。

目前商品溶菌酶大多由蛋清中提取而来，价格较高，此外其仅对革兰氏阳性菌有作用，限制了其应用范围。近年来，在饲料行业中逐步开展了一些有关溶菌酶应用方面的研究工作，但还有待于进一步的研究开发。在我国，溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限，但市场的需要量也在不断增长，可以预计溶菌酶将会是应用于我国饲料工业中一种重要的功能性添加剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用，从而解决现有商品化蛋清溶菌酶在生产和应用方面的不足。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白，其碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白是由优化的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因构建而成。具体包括以下步骤：

1）人溶菌酶基因序列的优化

以高活性的人溶菌酶基因序列（GenBank：J03801.1）为出发模板，根据毕赤酵母密码子偏好性对该编码基因进行了重新设计（密码子优化、加GST标签等），并人工合成，从而使hLYS基因在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达。经序列测定，人工合成的hLYS基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2）构建人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白

分别针对上述优化后人工合成的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因（GenBank：U13853.1，258-977bp）设计上下游引物，并经PCR扩增，割胶回收琼脂糖电泳上1100bp左右的片段，经序列测定，该基因的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即为本发明的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白（以下简称融合蛋白）。

其中，PCR扩增过程中所设计引物如下：

P1：5’-GGCGA ATTCATG TCCCCTATACTAGGTTATTG-3’

P2：5’-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCGAAAGGTTTTCGAAAGATGTGAATTGG-3’

P3：5’-GGCGCGGCCGCTTAAACACCACAACCTTGAACGTAT-3’

将上述合成的融合蛋白和克隆载体pMD19T连接，构建重组质粒pMD19T-hLYS，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，以重组质粒pMD19T-hLYS为模板经PCR扩增、酶切得到目的基因片段hLYS，与真核载体pPICZαA连接，构建重组质粒pPIC9K-hLYS。经过PCR扩增、酶切、连接等操作后克隆到真核表达载体pPIC9K中，构建表达载体pPIC9K-hLYS。

用限制性内切酶Sal I线性化上述表达载体pPIC9K-hLYS，用电转化法将其转入毕赤酵母GS115感受态细胞内，通过抗生素G418加压（0.5-5mg/mL）筛选获得表达hLYS的重组毕赤酵母。在合适的培养条件下（28-30℃，200r/min，甲醇浓度0.1-1%），利用该重组毕赤酵母表达hLYS。

进一步，对上述融合蛋白进行抑菌测试，结果表明，该融合蛋白对各检测菌种（金黄色葡萄糖球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎球菌、魏氏梭菌、多杀性巴氏杆菌、化脓棒状杆菌、破伤风梭菌、乳酸杆菌、双枝杆菌、腊孢杆菌）均表现出良好的抑菌效果，但对常见的3种有益菌（乳酸杆菌、双枝杆菌、腊孢杆菌）均无效果。

将上述融合蛋白作为抑菌添加剂应用于动物饲料中，实验结果显示，添加有本发明的融合蛋白的实验组平均日增重明显提高，并很好地控制了仔猪腹泻，有较好的饲料报酬，较对照组土霉素提高了6.32%，较空白对照组提高了22.7%。

有益效果：

本发明采用基因工程技术，根据毕赤酵母密码子偏好性对现有的人溶菌酶基因序列基因进行了重新设计并人工合成，并进一步将其与谷胱甘肽转移酶连接构建人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白，试验表明，该融合蛋白具有较好的抑菌性，可以作为添加剂应用于动物饲料中。

附图说明

图1为优化前后的人溶菌酶基因序列对比，其中现有的hLYS为现有的人溶菌酶基因序列，hLYS(P)为本发明根据毕赤酵母密码子偏好性优化后人工合成的hLYS基因序列。

图2为His^＋Mut^＋高拷贝转化子。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。应理解，本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1 人溶菌酶基因序列的优化

由于外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外援蛋白有效表达的重要因素。本发明以人溶菌酶基因（hLYS，GenBank：J03801.1）为出发模板，根据表1所示的毕赤酵母密码子的偏好性对该基因序列进行重新设计（密码子优化、加GST标签等，如低频密码子优化成高频密码子），并人工合成，从而使hLYS基因在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达。

表1 毕赤酵母密码子偏好性

经序列测定，优化后人工合成的hLYS基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示（该基因也可直接从华大基因公司购买）。图1为优化前后的序列对比，与Genebank中的hLYS基因序列相比，在393个碱基中，优化后的基因有79个发生了置换，但对应的氨基酸序列（SEQ ID No.2）是一致的。

实施例2人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白的合成

为了增加目标蛋白的表达效率，构建融合蛋白已成为一种行之有效的方法。本发明进一步通过基因工程手段构建了一种新型的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白。

分别针对上述优化前后的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因（GenBank：U13853.1，258-977bp）设计上下游引物，并经PCR扩增。

P1：5’-GGCGA ATTCATG TCCCCTATACTAGGTTATTG-3’

P2：5’-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCGAAAGGTTTTCGAAAGATGTGAATTGG-3’

P3：5’-GGCGCGGCCGCTTAAACACCACAACCTTGAACGTAT-3’

PCR采用Taq酶进行扩增，体系组成为：DNA5μL，10×PCR Buffer（Mg²⁺Plus）5μL，dNTPs（2mmol/L）5μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，Taqpolymerase（5U/μL）0.5μL，加ddH₂O至总体系为50μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30/60sec，循环30次；72℃延伸10min。

分别以上述实施例1合成的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因为模板，以P2、P3和P1、P2为引物进行PCR扩增，割胶回收琼脂糖电泳上400bp和700bp左右的片段，其中400bp片段为经PCR扩增后收集的实施例1合成的人溶菌酶基因，700bp片段为经PCR扩增后收集的谷胱甘肽转移酶基因。

以上述琼脂糖电泳回收的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因为模板，以P1、P2、P3为引物进行PCR扩增，割胶回收琼脂糖电泳上1100bp左右的片段，经序列测定，该基因的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即为本发明的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白（以下简称融合蛋白）。

实施例3重组表达载体pPIC9K-hLYS的构建

将上述合成的融合蛋白和克隆载体pMD19T连接，构建重组质粒pMD19T-hLYS，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，以重组质粒pMD19T-hLYS为模板经PCR扩增、酶切得到目的基因片段hLYS，与真核载体pPICZαA连接，构建重组表达载体pPIC9K-hLYS。具体步骤如下：

1）融合蛋白与克隆载体pMD19T的体外连接：采用TaKaRa公司生产的pMD19-T载体克隆试剂盒。按照使用说明，在微量离心管中制备下列连接反应液，全量10μL，pMD19-T Vector0.5μL，目标DNA片段4.5μL，Ligation solutionΙ5μL，16°C反应过夜。

2）质粒的转化：取100μL感受态细胞，加入10μL连接反应液，温和混匀，冰上放置30min；将离心管置于42°C水浴中保温90s进行热休克；将细胞迅速放回冰中，冷却2min后加入500μLLB培养液，置于37°C摇床培养1h；将培养物3500r/min离心2min后吸取500μL上清，将细胞重悬后涂布于含抗生素的LB平板培养基上，于37°C温箱培养约1h，挑取菌落进行下一步操作。

3）菌落-PCR：反应体系为：10×PCR Buffer（Mg²⁺Plus）5μL，dNTPs（2mmol/L）5μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，Taq polymerase（5U/μL）0.5μL，加ddH₂O至总体系为50μL。

常温下，用灭菌的枪头随机挑选转化板上的转化子，然后将沾有菌体的枪头置于相应的装有PCR反应体系的PCR管中，进行扩增。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸80sec，循环30次；72℃延伸10min。

4）限制性内切酶酶切反应：反应体系为：质粒DNA1μg，10×酶切缓冲液2μL，限制性内切酶5-10U，加ddH₂O至总体系为20μL，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。

经菌落-PCR和双酶切后，琼脂糖凝胶电泳上出现1100bp左右的条带，表明上述融合蛋白与克隆载体pMD19T构建成功，即得重组质粒pMD19T-hLYS，并成功转化大肠杆菌TOP10。

用EcoR I和Not I双酶切上述重组质粒pMD19T-hLYS，将该重组质粒中的hLYS基因DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒pPIC9K，得到另一DNA片段。将上述两个DNA片段混合后用连接酶连接在一起，即得表达载体pPIC9K-hLYS。

实施例4表达载体pPIC9K-hLYS在毕赤酵母中的表达

用限制性内切酶Sal I线性化上述表达载体pPIC9K-hLYS，用电转化法将其转入毕赤酵母GS115感受态细胞内，通过抗生素G418加压（0.5-5mg/mL）筛选得到His^＋Mut^＋表型的高拷贝转化子（参看图2）。

Sal I单酶切：以限制性内切酶Sal I酶切重组质粒，酶切体系为：pPIC9K-hLYS60mL，Sal I Buffer15μL，Sal I5μL，ddH₂O70μL，总体积150μL，混匀，37℃水浴2h。

接单菌落于25mL BMGY液体培养基中，28℃培养16-20h，离心收集菌体，用25mL新鲜BMMY培养基重悬，在28℃，200r/min进行诱导培养，甲醇浓度控制在1%左右。在0、24、48、72、96h分别取发酵液进行SDS-PAGE分析。结果显示，表观分子量为40kDa，摇瓶水平表达量可达上清分泌总蛋白的20%。

实施例5 抑菌实验

采用平板抑菌圈法检测融合蛋白的抑菌效果。采用平板打孔法检测药物对试验用菌的作用效果。在直径9cm的无菌平皿中加入1mL菌液，倒入冷却到50℃左右溶化的牛肉膏琼脂培养基15mL，充分混匀。待琼脂凝固后，用内径6mm的无菌牛津杯在琼脂上等距离打孔3个，并挖出孔内琼脂培养基，然后于每孔中滴加少量0.5%琼脂封底。于每孔中各自加入融合蛋白0.1mL，将平皿置于37℃温箱内培养24h后取出，测量抑菌圈的大小，结果参看表2。

表2 抑菌效果

从上述表2的抑菌结果显示，融合蛋白对各检测菌种均表现出良好的抑菌效果，远高于优化前的hLYS，但对常见的3种有益菌（乳酸杆菌、双枝杆菌、腊孢杆菌）均无效果。

实施例6 融合蛋白在预防仔猪腹泻中的应用

随机选取7日龄仔猪，分成三组。第一组为实验组，第二组为常规药物对照组，第三组为空白对照组。实验组在仔猪料中添加融合蛋白粉剂，添加量为10g/100kg饲料。常规药物对照组每100kg饲料中添加500g土霉素，空白对照组不添加任何药物。

表3 融合蛋白对仔猪生产性能的影响

实验结果显示，实验组和常规药物对照组的综合生产性能明显高于空白对照组。60日龄时，平均日增重分别为296g、286g和247g，实验组比空白组提高了19.8%。空白对照组由于仔猪的腹泻情况相对严重，造成了3头仔猪的死亡。而实验组和常规药物对照组很好的控制了腹泻，相比于空白组，腹泻率分别下降了77个和47个百分点，同时未发生死亡案例。实验组良好的生产性能也体现在了饲料报酬方面，三组实验的饲料报酬分别为1.63、1.74和2.11，实验组相较其它两组提高了6.32%和22.7%。

Claims

1.一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白，其碱基序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因U13853.1构建而成。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述人溶菌酶基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

5.一种包含权利要求1所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白的表达载体pPIC9K-hLYS。

6.权利要求5所述的表达载体pPIC9K-hLYS的应用，其特征在于，将所述表达载体pPIC9K-hLYS线性化后用电转化法将其转入毕赤酵母GS115感受态细胞内，通过抗生素G418筛选获得表达人溶菌酶的重组毕赤酵母。

7.权利要求1所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白在制备抑菌材料中的应用。

8.权利要求1所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白的应用，其特征在于，将所述融合蛋白作为绿色添加剂应用于动物饲料中。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白的添加量为2-20g/100kg饲料。