CN105400752A - 一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-1及其编码基因与应用。本发明通过构建元基因组文库和活性筛选自云南洱源牛街热泉中分离到一个新的脂肪酶基因Lip-1，并且将该脂肪酶与芝麻的油体蛋白融合表达，通过体外人造油体重构实现了一步纯化和固定化脂肪酶Lip-1，并进行转酯反应。通过GC-MS测定表明，该脂肪酶具有良好的转酯活性以及有机溶剂和甲醇耐受性，可以有效的应用于生物柴油的生产。

Description

一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有转酯活性的脂肪酶Lip-1及其编码基因与应用。
背景技术
随着社会的进步，对燃料的需求量越来越大。由于地球上石油储量的减少和环境污染问题增加，生物柴油作为一种可再生的清洁能源，是化石燃料的理想代替燃料。酶催化法生产生物柴油具有设备要求简单、反应条件温和以及环境污染小等优点，因此脂肪酶介导的转酯反应生产生物柴油越来越受到关注。
脂肪酶为脂肪酸三酰甘油酰基水解酶，能够催化水解甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯生成脂肪酸和甘油。脂肪酶在热力学有利的条件下(如低水含量)可以催化合成反应如酯化和转酯反应。脂肪酶催化三酰甘油和低元醇反应生成甘油和脂肪酸甲酯，即生物柴油。由于其催化的化学反应具有位点选择性，化学选择性及底物专一性而且副反应少等特点而被广泛应用于去污剂，食品加工，有机合成，化妆品及医药等多种工业领域。
目前许多微生物(包括细菌、酵母及真菌)被认为是胞外脂肪酶的潜在生产菌株。尽管在高等植物及动物体内也存在脂肪酶，但是由于微生物脂肪酶基因资源丰富，酶稳定性好及广泛的底物特异性等特点而受到工业生产者的青睐。此外，油体固定化技术利用了油体蛋白两端亲水，中间强疏水的特性，由单层磷脂分子层包裹TAG，油体蛋白融合表达的目的蛋白通过油体蛋白的挂接效应固定并展示到油体的表面，从而实现了脂肪酶一步纯化和固定化，油体固定化脂肪酶将更有利于生物柴油的生产。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
b)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质；
d)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。
上述相关生物材料中，B1)所述核酸分子的为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
本发明还有一个目的是提供上述蛋白质的新用途。
本发明提供了上述蛋白质作为脂肪酶中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质在催化低元醇和动植物油脂进行转酯反应中的应用。
上述应用中，所述低元醇为甲醇，所述动植物油脂为橄榄油。
上述蛋白质或上述相关生物材料在制备生物柴油中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种生物柴油的制备方法。
本发明提供的生物柴油的制备方法包括如下步骤：将上述蛋白质、醇、动植物油脂、有机溶剂和水混匀，得到混合体系，反应，得到生物柴油。
上述方法中，所述水在所述混合体系中的质量分数为1-6％。
上述方法中，
所述有机溶剂为正己烷；
所述醇为甲醇；
所述动植物油脂为橄榄油。
本发明通过构建元基因组文库和活性筛选自云南洱源牛街热泉中分离到一个新的脂肪酶基因Lip-1，并且将该脂肪酶与芝麻的油体蛋白融合表达，通过体外人造油体重构实现了一步纯化和固定化脂肪酶Lip-1，并进行转酯反应。通过GC-MS测定表明，该脂肪酶具有良好的转酯活性以及有机溶剂和甲醇耐受性，可以有效的应用于生物柴油的生产。
附图说明
图1为pET32a-sole-Lip-1载体的构建示意图。
图2为脂肪酶Lip-1与油体蛋白oleosin融合蛋白表达SDS-PAGE图。其中，M:UnstainedProteinMWMarker；1:pET32a-空载IPTG诱导(上清)；2:pET32a-空载IPTG诱导(沉淀)；3:pET32a-sole-Lip-1IPTG未诱导(上清)；4:pET32a-sole-Lip-1IPTG未诱导(沉淀)；5:pET32a-sole-Lip-1IPTG诱导(上清)；6:pET32a-sole-Lip-1IPTG诱导(沉淀)。
图3为脂肪酶转酯酶活GC-MS定性TIC峰图结果。其中，A:标样；B:空白；C:pET32a-sole-Lip-1转酯酶活结果。
图4为脂肪酶Lip-1有机溶剂耐受性结果图。其中，1:正己烷；2:叔丁醇；3:石油醚；4:叔戊醇；5:正己烷:叔戊醇(4:1)；6:正己烷:叔丁醇(4:1)。
图5为脂肪酶Lip-1甲醇耐受性结果图。其中，横坐标代表反应体系中甲醇的终浓度。
图6为脂肪酶Lip-1含水量耐受性结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Lip-1基因的获得
一、热泉BAC文库构建和脂肪酶活性克隆的筛选
1、云南洱源牛街热泉微生物总基因组DNA的提取和纯化
(1)样品采集
样品(云南洱源牛街热泉微生物)采自云南洱源牛街热泉(北纬26.6040′，东经99.5649′)。热泉水温58℃，pH为7.0，富含钙、氟。用20μm的尼龙网粗过滤热泉水样，使用Millipore公司的0.22μm的膜包浓缩后，置于无菌离心管，密封，4℃运回实验室后-80℃保存。
(2)样品的处理
从-80℃冰箱取出100mL浓缩水样，室温解冻，经150×g离心，去除沉渣，上清12000×g离心，用灭菌的热泉水洗涤数次，直到颜色发白为止。用灭菌的热泉水悬浮沉淀，得到细胞悬浮液，使得细胞的浓度为每毫升107-108个。
(3)高分子量总基因组DNA的提取
将细胞悬浮液与等体积的1.6％低熔点琼脂糖(SeaPlaqueLMPagarose(FMC))于45℃混匀，立即加入可制成胶块的模具(Bio-Rad)中，4℃凝固30分钟，取出胶块，置于5倍体积的裂解液(10mMTris[pH8.0],50mMNaCl,0.1MEDTA,1％Sarkosyl,0.2％sodiumdeoxycholate,1mgoflysozymeperml)中37℃裂解1h，然后把胶块转到ESPbuffer(1％Sarkosyl–1mgofproteinaseKpermlin0.5MEDTA)中，50℃裂解48h，其间更换一次ESPbuffer。
(4)高分子量总基因组DNA纯化
用10-20倍体积的冰冷TE含0.1mMPMSF冰上洗涤包埋块，共3次每次1h。然后用10-20倍体积的冰冷TE冰上洗涤包埋块3次每次1h。此时，凝胶块中包含纯化的高分子量的总基因组DNA。将包埋块保存于0.05MEDTA(pH8.0)中，4℃可放置1年，DNA无明显降解。
2、高分子量的总基因组DNA的酶切与回收
将纯化后的胶块置于10倍体积的消化液(1×HindⅢ缓冲液加2mmolPL亚精胺)4℃温育40min，重复1次；每个1/3凝胶块加入170μL的消化液和0.8～1.0单位HindⅢ，冰浴2h；最后于37℃消化20min，加入1/10体积的0.5MEDTA(pH8.0)溶液中止反应。PFGELambdaLadder(NewEnglandBioLabs)作分子量标准，按下述条件进行脉冲凝胶电泳检测：16h电泳12.5℃，1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，泵速80，电场夹角120°，起始脉冲时间0.1s，终止脉冲时间40s，电场强度5V/cm。分离部分酶切大片段DNA，切下含有50～300kb大小DNA胶块，装入已处理好的透析袋中。电洗脱回收大片断DNA，用标准LamadaDNA定量大片断DNA的浓度。
3、DNA大片段与CopyControlpCC1BAC载体连接
在Eppendorf离心管中加入1μLCopyControlpCC1BACCloning-ready载体(Epicentre)100ng经HindⅢ酶切的大片段DNA加水至87μL，用吸头混匀，55℃温育10min，待冷却至室温后加10μL10×Fast-link连接缓冲液1μL，100mMATP，2μLFast-linkDNA连接酶，16℃温育4h，65℃加热15min使酶失活，用0.25mm的Millpore膜进行透析脱盐，取少量连接产物转化TransforMaxEPI300涂布LB平板12.5μg/ml氯霉素+15μg/mlIPTG+60μg/mlX-Gal，计算蓝白斑的比例提取白斑的质粒DNA并进行NotI(NewEnglandBioLabs)酶切，按下述条件电泳：16h电泳12.5℃，1％琼脂糖凝胶0.5×TBE，泵速80，电场夹角120°起始脉冲时间5sec，终止脉冲时间15sec，电场强度5V/cm，溴化乙啶染色照相，记录并计算插入片段的大小及空载体的比例，其余部分4℃保存，如果上述结果平均插入片段大小>50kb且空载体所占的比例<5％，则大规模转化其余部分并进行新的连接和转化直至获得足够多的文库克隆。
4、高效E.coliTransforMaxEPI300电转化感受态细胞的制备
挑取一个-80℃保存的E.coliTransforMaxEPI300单菌落接种于装有50mlSOB(无Mg2+)的500mL三角瓶中。于37℃剧烈震荡培养过夜，将1mL过夜培养物转接到装有1L新鲜SOB(无Mg2+)的2L三角瓶中，37℃继续剧烈震荡培养2-3小时，至OD550＝0.5。4℃，5000rpm(2600×g)离心10min收集菌体，用1L无菌冰冷的10％超纯甘油重悬浮细菌沉淀块，于4℃，5000rpm(2600×g)离心15min，重复洗涤一次。用10％超纯甘油重悬浮细胞至终浓度为OD550＝200～250。通常离心瓶中残留的洗液足以重悬细胞至所需浓度，所得感受态细胞约2ml。细胞可马上用于电转化，或分装成100μL/管，-80℃保存。用已知浓度的共价闭合环状的pUC19质粒DNA(10pg/uL)作标准检测转化效率。用于BAC文库构建的感受态细胞转化效率应大于1010cfu/μgpUC19DNA。
5、大肠杆菌的电转化
在冰上冻融TransforMaxEPI300大肠杆菌电转化感受态细胞，用吸头轻轻混匀，在20μl感受态细胞中加入1μl脱盐的连接产物，用吸头吹吸2或3次，将DNA和感受态细胞转移到转化杯的两极之间确保无气泡产生，GenePulser(Bio-Rad，USA，GenePulserII)电转化仪的参数调为1.8kv，200Ω，25μF，进行电转化，之后，向转化杯中加入1mL室温的SOC，吹吸2或3次，将细胞转入15mL离心管中200rpm恢复培养1hr。取100μl培养物涂布在LB含12.5μg/mL氯霉素，40μg/mLX-Gal和0.4mMIPTG平板上，37℃过夜培养。用记数器计算克隆，从而确定电激转化的最佳条件。
6、BAC质粒DNA的微量提取
在15mL管中用无菌牙签接种一个单菌落于3mL含12.5μg/mL氯霉素的2×YT培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜，取2mL培养物于12000rpm离心1分钟，去除上清，可再轻甩几秒种，用枪头彻底吸去上清。菌体用200μlP1溶液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，高压灭菌，4℃保存(使用前加RNaseA至100μg/mL重悬)。于冰上静置5分钟，加400ulP2溶液(使用前将0.4MNaOH和2％SDS等体积混合)，现配现用，缓慢颠倒离心管直到溶液变得澄清，于冰上放置5分钟左右。加入300μLP3溶液(3MKAc，用冰乙酸调pH至5.5)，缓慢颠倒离心管3-5次，置冰上至少5分钟。12000rpm，4℃冷冻离心5分钟。将上清转移至新的离心管中，于37℃静置30分钟。加入等体积的酚/氯仿，于12000rpm，室温离心5分钟。取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀室温放置2分钟。于13000rpm，室温离心5min。去除上清，加入1ml70％乙醇洗涤DNA沉淀1次，吸出乙醇，干燥至DNA变透明，加入30μLTE(pH8.0)溶解DNA。
7、BAC文库插入片段大小的检测
随机挑取一定数量的白色转化子根据上述方法小量提取BAC质粒DNA。按下述体系进行NotI酶切分析：5μLBAC质粒DNA，2μL10×NotI酶切缓冲液，2μL0.1％BSA，2μL0.1％TritonX-100，0.2μL10U/μlNotI，加水至20μl，37℃温育4hr。每管加入2μL6×DNA上样缓冲液混匀，65℃加热10min。用MidRangePFGMarkerI作分子量标准按下列条件进行脉冲电泳：16h电泳12.5℃，1％琼脂糖凝胶0.5×TBE，泵速80，电场夹角120°起始脉冲时间5sec，终止脉冲时间15sec，电场强度5V/cm。电泳结束后，将凝胶放入含溴化乙锭(0.5ug/ml)的0.5×TBE中染色30min，再在蒸馏水中脱色30min。凝胶成像仪照相记录，并计算插入片段大小。
8、文库装配和保存
假如预实验证实随机挑选的BAC克隆的插入片段大小和空载克隆比例符合研究要求，则将连接产物大规模转化，将白斑挑入384孔培养板的装有50μL细胞冻存培养基12.5μg/ml氯霉素的小孔中，37℃过夜培养，将384孔板进行系统编号后于-80℃保存。复制1套作备份。
9、文库的稳定性鉴定
随机挑取3个BAC克隆的单菌落接种到5ml含氯霉素LB培养基中，37℃过夜培养，每个克隆的24h培养物用LB培养基进行106倍稀释继续培养，如此连续转接培养4次，分别提取第1天(第0代)和第4天(约第100代)BAC克隆的质粒DNA，用HindIII酶切分析比较指纹图谱的变化，从而确定BAC克隆在继代培养中是否稳定。
10、文库的筛选
将保存在384板的BAC克隆，分别影印到筛选平板上1％三丁酸甘油酯的固体LB培养基(超声乳化，使三丁酸甘油酯均匀的分布在培养基中)，37℃培养24h后，菌落周围出现透明圈为阳性。
二、Lip-1基因的获得
将来自云南洱源热泉元基因组BAC文库的178块384孔板共计68,352个阳性克隆影印到含1％三丁酸甘油酯的LB固定培养基上进行脂肪酶筛选，初筛共得到12个产脂肪酶阳性克隆，复筛后仍然具有脂肪酶活性的克隆8个，分别为12-4B4、68-4G12、12-1B4、180-1H10、209-G20、53-E1、51-A7和207-D16。将8个阳性克隆提取BAC质粒混合后，经454测序、拼接、注释，得到8个可能的酯酶/脂肪酶基因ORF。将阳性克隆12-1B4；12-4B4；51-A7；209-G20提取BAC质粒混合后做模板，采用如下特定引物(Lip-1正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGAAAAATAGGAAACGGCAA；Lip-1反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTCAGAACGCCTTTTGCCAGT；Lip-2正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGCGCCGCATCGTCGCCCT；Lip-2反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTCAGCGCATGGCCTTGCCAG；Lip-3正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGAACCGTCGTCCCCGCAT；Lip-3反向引物：AAGCTTGTACGTAGAACTAGTTCAACCCAGGGCGGCTTC；Lip-4正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGCGCTGGATGCATCGCCTG；Lip-4反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTCAGCCACGGCTGCACCCGTC；Lip-5正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGGCACACCCCAAAACCGA；Lip-5反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTCTAGGAAGGGGGATAGACCGC；Lip-6正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGAGTAACTGGCCTTATCCCCGTAT；Lip-6反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTTAAGGCTGGAAATCCGGCCCGA；Lip-7正向引物：GGTACCATCGAAGGAAGAATGATGGCCGGCATGAGCGAGG；Lip-7反向引物：GAGCTCGTACGTAGAACTAGTTCAGGCCAGCGCGGCCCA；Lip-8正向引物：GGATCCATCGAAGGAAGAATGATGTCAGTGCTGAACGCGTC；Lip-8反向引物：AAGCTTGTACGTAGAACTAGTTCAGGCCAGTTTGGGTGAC)，分别扩增8个酯酶/脂肪酶基因片段，得到大小为1869bp的PCR扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将序列1所示的基因命名为Lip-1，其中，序列1中的1-1869为OFR，编码由622个氨基酸残基组成的蛋白质，将该蛋白命名为脂肪酶Lip-1，脂肪酶Lip-1的氨基酸序列为序列2。
实施例2、脂肪酶Lip-1的获得及转酯活性测定
一、脂肪酶Lip-1的获得
1、融合表达载体pET32a-sole-Lip-1的获得
将序列3插入pET32a载体(Novagen,69015-3)的BglⅡ和SacⅠ酶切位点之间，且保持pET32a载体的其他序列不变，得到融合表达载体pET32a-sole-Lip-1(图1)，其中序列3中第464-2332位为Lip-1基因，第23-442位为芝麻来源的油体蛋白sole基因(GenBankaccessionNo.AF091840)，Lip-1基因的N端和油体蛋白的C末端通过Linker相连。融合表达载体pET32a-sole-Lip-1表达融合蛋白sole-Lip-1，融合蛋白sole-Lip-1的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2、脂肪酶Lip-1的获得
(1)将融合表达载体pET32a-sole-Lip-1转化大肠杆菌Escherichiacoli表达菌株BL21(DE3)(北京博迈德基因技术有限公司，CC0602)中。
(2)在无菌操作台中用牙签挑取包含质粒pET32a-sole-Lip-1的大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)单菌落，接种在5mL含氨苄青霉素(Amp100μg/mL)的LB液体培养基中，并于37℃恒温振荡箱中培养。
(3)待菌液浓度达到OD600＝0.6时按1％的接种量接种到5mL的含氨苄青霉素(Amp100μg/mL)的LB液体培养基中，并于37℃恒温振荡箱中培养至OD600＝0.4时，加入终浓度为1.0mMIPTG，16℃诱导表达16-20h，得到诱导后的菌液，离心，收集菌体。
(4)将步骤(3)中收集的菌体进行超声破碎(功率：50w，破碎5s，间隔5s)，离心收集上清和沉淀，该沉淀为融合蛋白sole-Lip-1。
(5)将步骤(4)获得的上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测结果如图2所示：蛋白电泳结果表明脂肪酶Lip-1主要以包涵体的形式表达，脂肪酶Lip-1与油体的融合蛋白的分子量大小为102.4kDa。其中，M:UnstainedProteinMWMarker；1:pET32a-空载IPTG诱导(上清)；2:pET32a-空载IPTG诱导(沉淀)；3:pET32a-sole-Lip-1IPTG未诱导(上清)；4:pET32a-sole-Lip-1IPTG未诱导(沉淀)；5:pET32a-sole-Lip-1IPTG诱导(上清)；6:pET32a-sole-Lip-1IPTG诱导(沉淀)。
二、脂肪酶Lip-1的纯化和固定化
取诱导后的菌液(含质粒pET32a-sole-Lip-1的BL21(DE3)菌株)2mL于EP管中，13300×g4℃离心1min，收集菌体，弃掉培养基，再用1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)重悬，超声波处理(功率：50w，破碎5s，间隔5s，超声处理在冰浴上进行)30个循环，向超声EP管中加入300μg大豆卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司，69014994)和30μL的橄榄油(国药集团化学试剂有限公司，69018028)，用移液器混匀，再超声波处理(功率：50w，破碎5s，间隔5s，超声处理在冰浴上进行)15个循环；冰上放置5min。然后超声波处理20s(功率：50w)，冰上放置5分钟，重复两次后15000rpm离心20min收集上层油体，即为固定化脂肪酶Lip-1。
三、固定化脂肪酶Lip-1的转酯活性测定
将上述步骤二获得的固定化脂肪酶Lip-1转入到含有200μL橄榄油和6mL正己烷的带试管塞的大试管中，并加入0.6mmol的甲醇，得到转酯反应体系。然后将转酯反应体系在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯(生物柴油)。采用GC-MS测定转酯酶活，以转酯率定义酶活，转酯率的测定方法参照文献“BaiFW,YanW,ZhangSJ,YuD,BaiLH.Immobilizedlipaseofreconstructedoilbodiesanditspotentialapplicationinbiodieselproduction[J].Fuel.2014；128:340-6”中的方法。根据橄榄油的组成成分选择的标准品如下：棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯；同时还选取了一个橄榄油中不含有的脂肪酸，即十三酸甲酯。以不加入固定化脂肪酶Lip-1的转酯反应体系为空白对照。
标准品和脂肪酶Lip-1转酯反应生成的脂肪酸甲酯以及空白对照的TIC峰图如图3所示：标准品能够被气象色谱分离开并被质谱检测(表1，图3A)，与空白对照(表3，图3B)相比，脂肪酶Lip-1转酯反应得到的脂肪酸甲酯的量是空白对照的6.04倍(表2，表4，图3C)。说明了Lip-1具有转酯酶活性。
表1、GC-MS标准品信息
表2、脂肪酶Lip-1转酯酶活结果
表3、空白对照
表4、脂肪酶转酯反应比较结果
四、脂肪酶Lip-1有机溶剂耐受性
按照有机溶剂的不同，分为如下6组通过GC-MS检测上述步骤二获得的脂肪酶Lip-1在6个转酯反应体系中的相对转酯率：
1、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系1；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
2、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL叔丁醇、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系2；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
3、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL石油醚、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系3；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
4、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL叔戊醇、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系4；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
5、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷/叔戊醇(正己烷与叔戊醇体积比为4:1)、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系5；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
6、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷/叔丁醇(4:1)、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系6。然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
检测方法同上。
上述6组转酯反应体系中的脂肪酶Lip-1的相对转酯率如图4所示，脂肪酶Lip-1在叔丁醇、叔戊醇、正己烷/叔戊醇(4:1)和正己烷/叔丁醇(4:1)四种反应体系中的相对转酯率都低于正己烷，分别为正己烷的0.82倍、0.44倍、0.55倍和0.59倍；而石油醚中转酯率最高，达到了正己烷的1.44倍。
五、脂肪酶Lip-1甲醇耐受性
按照在转酯反应体系中一次加入甲醇的终浓度不同，分为如下6组通过GC-MS检测上述步骤二获得的脂肪酶Lip-1在6个转酯反应体系中的相对转酯率：
1、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为50mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系1；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
2、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为100mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系2；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
3、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为150mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系3；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
4、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为200mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系4；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
5、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为250mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应5；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
6、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为300mmol/L的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系6，然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
检测方法同上。
结果如图5所示：随着甲醇浓度的增加，相对转酯率增加，增加的幅度随甲醇浓度的增加而减少。当甲醇终浓度为300mmol/L时，转酯酶活依然没有下降的趋势，说明该脂肪酶Lip-1甲醇耐受性非常好。
六、脂肪酶Lip-1转酯反应最佳含水量测定
根据在转酯反应体系中加入水的质量分数不同，分为如下6组测定脂肪酶Lip-1转酯反应的产物的量：
1、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为0％)混匀，反应，得到转酯反应体系1；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
2、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为1％)混匀，得到转酯反应体系2；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
3、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为2％)混匀，得到转酯反应体系3；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
4、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为3％)混匀，得到转酯反应体系4；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
5、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为4％)混匀，得到转酯反应体系5；然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
6、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为5％)混匀，得到转酯反应体系6，然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
7、将EP管中全部固定化脂肪酶Lip-1、6mL正己烷、200μL橄榄油、终浓度为0.6mmol的甲醇和水(体积分数为6％)混匀，得到转酯反应体系6，然后在37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中反应，得到脂肪酸甲酯。
结果如图6所示：含水量为1％、2％和3％的相对转酯率约为含水量为0％时的2倍，含水量为1％时转酯率最高；随着水含量的增加，相对转酯率逐渐下降。当含水量小于等于5％时，反应体系中产生的脂肪酸的量相近，约为含水量为0％时的2倍左右；当水含量达到6％时，反应体系中的脂肪酸迅速增加，达到了0％时的40倍左右，此时脂肪酶Lip-1主要行使水解酶活，因此转酯反应需将含水量控制在6％以下。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
b)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质；
d)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与降解卤素化合物相关的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质作为脂肪酶中的应用。
5.权利要求1所述蛋白质在催化低元醇和动植物油脂进行转酯反应中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述低元醇为甲醇，所述动植物油脂为橄榄油。
7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述相关生物材料在制备生物柴油中的应用。
8.一种生物柴油的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质、醇、动植物油脂、有机溶剂和水混匀，得到混合体系，反应，得到生物柴油。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水在所述混合体系中的质量分数为1-6％。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述有机溶剂为正己烷；
所述醇为甲醇；
所述动植物油脂为橄榄油。
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