CN108251345A - 用于生活污水处理的含有脂肪酶基因的重组工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有脂肪酶基因的重组工程菌及其构建方法。本发明还公开了一种融合蛋白sole‑LIPY7。本发明还公开了重组工程菌株BL21‑pCAMBIA1301‑sole‑LIPY7在污水处理中的应用。本发明还公开了一种污水处理方法。本发明首次将sole基因和脂肪酶基因LIPY7融合获得融合基因sole‑lip‑948，并成功构建重组工程菌株BL21‑pCAMBIA1301‑sole‑LIPY7。本发明首次将该融合蛋白sole‑LIPY7与进行固定化获得固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶酶活高达200U/ml。本发明的固定化脂肪酶能高效处理生活污水，CODcr去除率高达96.8%，BOD去除率高达96.1%，氨氮去除率高达85.6%。

Description

用于生活污水处理的含有脂肪酶基因的重组工程菌及其构建 方法
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，特别涉及用于生活污水处理的含有脂肪酶基因的重组工程菌及其构建方法。
背景技术
随着我国的经济发展，社会的进步促进了工农提高，随之也带来了不同程度的环业生产能力得到境污染，特别是污水成为了环境污染的来源之一，污水的污染程度也日益严重，逐渐由低向高演变，处理污水的难度也日益加大。
目前，污水处理的方法主要有物理、化学和生物处理方法，其中，生物处理方法是利用微生物产生的酶进行对污水中的油脂进行水解从而达到净化污水的目的。近年来有不少研究者将脂肪酶用于污水处理获得了很大的进展。决定脂肪酶表达的因素有很多，比如宿主、外源基因、外界环境等因素，目前虽然有少数脂肪酶基因已经得到克隆和测序，但是克隆到工程菌中后，基本都用于洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域，很少有能成功用于污水处理的相关报道。而且目前也没有将融合基因用于污水处理领域的报道。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种含脂肪酶基因的工程菌的构建方法。本发明采用融合基因技术，采用重叠PCR技术将脂肪酶基因LIPY7与sole基因成功融合表达获得了融合基因sole-LIPY7。该融合基因sole-LIPY7是通过上海生工生物公司合成获得。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的构建方法获得的工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的构建方法获得的工程菌的高效表达。
本发明最后要解决的技术问题是提供了该含有脂肪酶基因的工程菌在污水处理中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有脂肪酶基因的重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)融合基因soe-LIPY7的获得；
2)将融合基因sole-LIPY7导入表达载体pCAMBIA1301中获得重组表达载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7；
3)将重组表达载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
其中，上述融合基因sole-LIPY7的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明中的LIPY7基因序列参见序列表SEQ ID NO：2所示。本发明中的sole基因序列参见序列表SEQ IDNO：3所示。
本发明内容还包括上述的构建方法获得的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
其中，上述重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7的培养温度为40～50℃。
本发明内容还包括一种融合蛋白sole-LIPY7，所述融合蛋白sole-LIPY7是通过将所述的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7进行诱导表达获得。
本发明内容还包括所述的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7在污水处理中的应用。
本发明内容还包括一种生活污水处理方法，包括以下步骤：
1)重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7进行诱导表达获得菌液；
2)脂肪酶LIPY7的纯化和固定化；
3)将固定化脂肪酶LIPY7进行生活污水处理。
其中，上述脂肪酶LIPY7的纯化和固定化步骤为：将步骤1)诱导后的菌液加入磷酸缓冲液，超声波处理，然后加入大豆卵磷脂和橄榄油混匀，再超声波处理，冰上放置然后超声波处理，冰上放置，然后离心收集上层油体即为固定化脂肪酶LIPY7。
其中，上述超声波的功率为30W、破碎时间为8s、间隔时间为8s，每次超声20个循环。
其中，上述污水处理环境温度为45℃，所述生活污水的pH为8.0。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明首次将脂肪酶基因LIPY7和sole融合获得融合基因sole-LIPY7，并成功构建重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
2)本发明首次对重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7成功诱导得到了融合蛋白sole-LIPY7。
3)本发明首次将该融合蛋白sole-LIPY7进行固定化获得固定化脂肪酶。该固定化脂肪酶酶活高达388U/g。
4)本发明首次将该固定化脂肪酶用于污水处理中，并获得了十分显著的效果。本发明的固定化脂肪酶能高效处理生活污水，CODcr去除率高达96.8％，BOD去除率高达96.1％，氨氮去除率高达85.6％。
具体实施方式：
下面通过实施例来进一步阐述本发明。
本发明使用的试剂及菌株均为市面上购买获得。
主要试剂：
Taq DNA聚合酶dNTPs、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker等试剂、PCR产物纯化试剂盒、切胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购买自大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素、卡拉霉素、IPTG购买自Promega(中国)公司；其他试剂均在市面常规购买得到。
实施例1：重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7的构建
1、根据NCBI上公布的sole(GENBANK登录号：AF091840)和LIPY7(GENBANK登录号：DQ200799.1)的登录号获得其基因序列，通过将LIPY7基因和油体蛋白通过Linker连接获得sole-LIPY7基因序列。所述Linker的基因序列为：ggtaccatcgaaggaagaatg；将sole-LIPY7碱基序列委托上海生工生物公司进行基因的合成；该设计的序列如SEQ ID NO：1所示。
2、将合成好的目的基因sole-LIPY7以及表达载体pCAMBIA1301分别进行内切酶双酶切，该内切酶为HindIII和EcoRI，酶切条件为常规的酶切温度和酶切体系。酶切体系为30μl，具体为质粒25μl、10*K Buffer 3μl、HindIII和EcoRI各1μl、37℃酶切过夜，同时，载体pCAMBIA1301也进行上述双酶切，1％琼脂糖电泳，分别切胶回收目的片段和载体，用胶回收试剂盒纯化。将酶切好的目的片段与载体pCAMBIA1301进行连接，反应体系为获得重组载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7，将重组载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7转入大肠杆菌BL21中即可获得重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
3、将重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7进行质粒提取获得的质粒送上海生工生物公司测序，测序结果显示重组载体成功转化至BL21中。实施例2IPTG诱导表达融合蛋白及其纯化和固定化
挑取重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-LIPY7按照1％的接种量接种到50ml的LB培养基中进行培养，37℃，220rpm培养过夜，然后按照2％的接种量接种到新鲜培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6时，加入IPTG至浓度为1.0mM，30℃，220rpm，诱导表达8h，7000rpm，4℃离心5min，菌泥用100mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，收集细菌沉淀并分别用1mL PBS缓冲液对其进行重悬，在冰水浴中进行超声裂解。分别取完整的诱导菌体以及超声波裂解后的上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳。在103kDa处出现与预期目标大小一致的条带。
将诱导后的菌液(含质粒pCAMBIA1301-sole-LIPY7的BL21(DE3)菌株)2mL于EP管中，15000×g 4℃离心1min，收集菌体，弃掉培养基，再用1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.5)重悬，超声波处理(功率：30w，破碎8s，间隔8s，超声处理在冰浴上进行)20个循环，向超声EP管中加入500μg大豆卵磷脂和50μL的橄榄油，用移液器混匀，再超声波处理(功率：30w，破碎8s，间隔8s，超声处理在冰浴上进行)20个循环；冰上放置5min。然后超声波处理20s(功率：30w)，冰上放置5分钟，重复两次后15000rpm离心20min收集上层油体，即为固定化脂肪酶LIPY7。
实验例2固定化脂肪酶LIPY7的酶活测定
脂肪酶酶活定义：1g固定酶粉或1ml液体酶，在一定温度pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以μ/g或μ/mL表示。
测定原理：脂肪酶在一定条件下，能使得甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。
将固定化脂肪酶LIPY7用磷酸缓冲液溶解并稀释，转入含有橄榄油(分析纯)和4％聚乙烯醇(橄榄油和4％聚乙烯醇＝1:3的比例)的试管中，采用指示剂滴定法进行测定并做平行实验，取平均值，最终测得固定化脂肪酶LIPY7的酶活力为388U/g。
实验例4固定化脂肪酶LIPY7污水处理研究
将实施例3制备的固定化脂肪酶LIPY7，分别在环境温度为40℃、45℃、50℃、生活污水的pH分别为7、8、9、10时，进行污水处理情况的实验研究。同时在同样的环境温度条件下，设置对比例1为污水PH为中性条件下时，采用市面上购买的常规的脂肪酶LIPY7的实验研究；对比例2为污水PH＝8的条件下采用的市面上购买的常规的脂肪酶LIPY7的实验研究。
通过对生活污水作为水样，具体的实验结果参见表1。
表1
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含有脂肪酶基因的重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）融合基因soe-LIPY7的获得；
2）将融合基因sole-LIPY7导入表达载体pCAMBIA1301中获得重组表达载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7；
3）将重组表达载体pCAMBIA1301-sole-LIPY7转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
2.根据权利要求1所述的一种含有脂肪酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于，所述融合基因sole-LIPY7的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的构建方法获得的重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7，其特征在于，所述重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7的培养温度为40~50℃。
5.一种融合蛋白sole-LIPY7，其特征在于，所述融合蛋白sole-LIPY7是通过将权利要求3所述的重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7进行诱导表达获得。
6.权利要求3所述的重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7在污水处理中的应用。
7.一种生活污水处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-LIPY7进行诱导表达获得菌液；
2）脂肪酶LIPY7的纯化和固定化；
3）将固定化脂肪酶LIPY7进行生活污水处理。
8.根据权利要求7所述的生活污水处理方法，其特征在于，所述脂肪酶LIPY7的纯化和固定化步骤为：将步骤1）诱导后的菌液加入磷酸缓冲液，超声波处理，然后加入大豆卵磷脂和橄榄油混匀，再超声波处理，冰上放置然后超声波处理，冰上放置，然后离心收集上层油体即为固定化脂肪酶LIPY7。
9.根据权利要求8的生活污水处理方法，其特征在于，所述超声波的功率为30W、破碎时间为8s、间隔时间为8s，每次超声20个循环。
10.根据权利要求8所述的生活污水处理方法，其特征在于，所述污水处理环境温度为45℃，所述生活污水的pH为8.0。
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