KR100463117B1 - 당질지방폐수의 생물학적 처리 방법 및 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 호기성 조건하에서 생육이 양호하며 리파아제의 활성이 우수하고 당질지방폐수의 처리능력이 탁월한 신규 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01(Enterobacter sp. CJ-L01), 이 균주의 분리방법 및 그 균주를 이용한 당질지방폐수의 생물학적 처리방법에 관한 것이다.

Description

당질지방폐수의 생물학적 처리 방법 및 미생물{Biological method and microorganism for treating waste water containing glycolipid}
본 발명은 생물학적 폐수처리에 관한 것이다. 보다 특정적으로는 본 발명은 생물학적 폐수처리의 호기성 조건하에서 생육이 양호하며 리파아제의 활성이 우수한 신규한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01(Enterobacter sp. CJ-L01)을 이용하여 당질지방폐수를 처리하는 방법에 관한 것이다.
현재 세계는 산업화로 인한 화석연료의 사용량증가, 오염물질 배출량 급증, 무리한 개발계획에 따른 자연파괴로 심각한 환경오염에 직면해 있다. 이러한 환경오염은 대기나 물을 매개체로 하여 인간의 생활에 직·간접적으로 영향을 미치게 되어 이에 대한 대책과 처리기술에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 즉, 산업폐수를 처리하는 방법으로 물리적, 화학적 및 생물학적 방법이 있으나 다양한 오염물질을 분해, 제거할 수 있는 방법으로서 물리, 화학적 처리법에 비하여 2차오염의 가능성이 적을 뿐만 아니라 보다 경제적이고 효율적인 처리방법으로 평가되고 있는 미생물을 이용한 생물공학적 처리법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
미생물에 대한 연구는 세균, 효모, 곰팡이, 원생동물, 후생동물등 다양하게 진행되고 있으며 특히 난분해화합물을 분해하는 능력을 지닌 균주를 선별하고 이용하는 연구가 많이 되고있다. 즉, 크산토박터속(Xanthobacter)에 의한 벤젠류화합물을 분해하는 방법(Helmut et al, Appl. Environ, Microbiol. 61, 3884:1995), 미생물을 고정화하여 방향족화합물을 분해하는 방법(Rehm et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39, 110:1993) 등이 보고되었다. 또한, 호기적 폐수처리시 슬러지감량에 원생동물과 후생동물의 이용방법(Nathscka et al, Biotech. Lett. 18, 429:1996)과 효모를 이용한 식품공업폐수처리법 개발(Kiyoshi Yoshizawa, Nippo Nogeikagaku Kaisai. 55, 705:1981) 등 실제 미생물을 이용한 현장의 폐수처리에 응용하려는 연구가 진행되고 있다.
즉, 이와 같은 미생물을 이용한 처리방법으로서 주로 3가지 단계를 들 수 있는데 첫째는 오염현장의 환경 중에 존재하는 미생물을 인공적으로 증식시키는 기존 유용미생물의 활성화이고 둘째는 자연계에서 분리한 화학물질 분해미생물을 대량배양해 오염현장에 살포하는 천연외래 유용미생물의 환경도입 마지막으로 유전자조작을 통해 인공적으로 화학물질 등의 분해능력을 획득한 유전자조작 유용미생물의 환경도입 등이다. 따라서, 생물학적처리는 처리수질을 향상시키고 시설과 에너지를 절감하며 슬러지 발생량을 줄이는 등 많은 장점을 지니고 있어서 최근에 분해능력이 우수한 활성이 높은 미생물을 분리, 선별해서 우점화, 고농도 화시키는 기술에 대한 확립과 실제 산업현장의 폐수처리 등에 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있다.
미생물을 이용한 생물학적처리에서는 처리수질을 안정화시켜 향상시킬 것, 시설을 최소화함과 동시에 에너지 절약을 도모할 것, 슬러지 발생량을 감량화시킴과 동시에 사용가능 자원을 회수할 것 등의 많은 과제를 안고 있다. 이러한 문제를 해결하는데 중요한 점은 반응조 내에 유용미생물들을 고밀도로 유지할 수 있을 것인가라는 점이고 또한, 개발된 기술을 적극적으로 보급할 수 있는 체제를 확립하는 것이 가능할 것인가 하는 점이다. 이러한 기술을 확립하기 위해서는 미생물의 분리, 동정시 다음 사항을 고려하여야만 할 것이다. 자연발생으로는 시간이 걸리는 유기물과 기타 화학물질을 분해하는 미생물을 선택·분리하고 고농도에서의 강화 순양 과정을 반복 실시하는 것과 유기물질의 분해에 관여하는 특정 효소를 측정하여 선택·분리하고 이를 통하여 처리성을 확인하는 것이며, 또한 이러한 유용미생물을 고농도로 우점화시키고 연속적인 모니터링을 통하여 유지할 수 있어야 한다.
생물학적 폐수처리는 혼합배양된 미생물에 의해서 혼합기질을 제거하는 것이며, 호기성처리와 혐기성처리가 있다. 호기성처리는 하기 반응 경로로 나타낸 바와 같이 호기성미생물에 의해 산소의 존재하에서 효소를 이용하여 폐수중의 유기물을 산화분해하여 에너지를 획득하고 이 에너지 일부를 활용하여 새로운 세포를 합성한다.
유기물 + O2 → CO2 + H2O + 에너지
유기물 + NH3 + O2 → 세포 + CO2 + H2O ± 에너지
세포 + O2 → CO2 + H2O + NH3 + 에너지
폐수중의 BOD원은 유기물질로서 주성분은 당류, 지방, 단백질로 구분되며 이들 화합물은 미생물의 산화환원작용, 가수분해작용, 탈아미노작용으로 분해된다. 당류, 지질, 단백질의 분해경로를 요약하면 다음과 같다.
따라서, 이러한 유기물질의 주요성분인 탄수화물(전분, 섬유소), 지방, 단백질을 분해하는 효소활성이 우수한 미생물을 각각 선별하고 이들 미생물들을 함께 이용하여 유기물질을 제거하는 것이 유기성폐수의 처리효율을 높이는 방법이라 할 수 있다.
본 발명자들은 각종 산업체의 폐수처리장과 축산·도축처리장에서 미생물을 분리하고 유기물질의 분해에 관여하는 각 효소의 활성을 측정하여 우수한 능력을 지닌 균주를 선별하는 시험을 하던 중 엔테로박터속 씨제이-엘01로 동정된 미생물이 우수한 리파아제 효소활성과 당질지방폐수의 처리능력을 지닌 것으로 판명되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 호기성 조건하에서 생육이 양호하며 리파아제의 활성이 우수하고 당질지방폐수의 처리능력이 탁월한 신규한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01을 제공한다. 본 발명의 균주는 한국종균협회에 1998년 10월 24일에 수탁번호 KFCC-11055로 기탁되었다.
본 발명자들은 서울특별시, 경기도, 강원도, 충청도지역의 산업체 폐수처리장과 축산·도축처리장의 폐수 및 폐수가 유출되는 하천주위의 물과 토양을 채취하여 균주분리용 시료로 사용하여 미생물들을 순수분리 하였다. 분리한 미생물들로부터 유기물분해에 관련된 효소인 리파아제(Lipase)의 활성을 측정하여 우수한 활성을 보인 미생물들을 1차선별한 다음 당질지방폐수에 대하여 생물화학적 산소요구량(BOD)의 제거율이 우수한 미생물들을 최종선별하여 엔테로박터속 씨제이-엘01로 동정하였다.
본 발명에 따른 엔테로박터속 씨제이-엘01은 복합배지상에서 둥글고 볼록한 콜로니를 형성하며 이의 특성은 하기 표 1, 표 2 및 표 3에 기재되어 있다.
엔테로박터속 씨제이-엘01의 형태적, 배양적 특성
항 목 특 성
그램 염색 -
모양 간균
운동성 -
엔테로박터속 씨제이-엘01의 생리, 생화학적 특성
항 목 +
용혈성 -
산화효소 +
카탈라제 조건적혐기성
산소요구성 -
인돌형성 -
질산을 아질산으로 환원 -
우레아제 형성 -
메틸레드 시험 -
전분 가수분해 -
젤라틴 가수분해 -
O+F 시험 F
엔테로박터속 씨제이-엘01의 유기물 이용능력
항 목 특 성
글루코스 +
프락토스 +
자일로즈 +
글리세롤 +
소비톨 -
만니톨 +
라피노즈 -
람로즈 -
m-이노시톨 -
또한 본 발명은 호기성 조건하에서 생육이 양호하며 리파아제의 활성이 우수한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01을 이용하여 당질지방폐수를 처리하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 효모추출물, 카제인, 스피리트블루 및 유지에멀션을 조성으로 한 배지에서의 균주성장시 나타나는 감청색으로 검출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터속 씨제이-엘01 균주의 분리방법을 제공한다.
다음의 실시예로 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 좀더 자세히 설명하고자 하는 것이며 이들로서 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
(실시예 1)
리파아제의 활성이 우수하고 당질지방합성폐수의 처리성이 우수한 엔테로박터 속 씨제이-엘01 미생물
균주의 분리 및 효소활성측정
리파아제 효소활성이 우수하고 당질지방 합성폐수의 처리성이 우수한 미생물을 분리하고자 하여 서울특별시, 경기도, 강원도, 충청도지역의 유가공공장 폐수처리장 시료를 채취하여 일정기간 당질지방 합성폐수에 순응시킨 후, 순응된 미생물을 멸균식염수에 현탁하여 LB배지를 유가공폐수(무균필터 0.2㎛로 여과) 1리터에 녹여 만든 평판배지에 도말하였다. 도말한 페트리디쉬를 25∼30℃의 인큐베이터에서 1∼3일간 배양하여 평판배지상에서 우수한 성장성을 보이는 15여종의 단일군락의 미생물들을 분리하였다. 분리한 미생물들에 대한 리파아제 효소활성을 측정하기 위하여 리파아제 효소활성측정 배지(효모추출물 5g, 카제인 10g, 스피리트블루 0.15g, 유지에멀션 30ml, 한천 20g)를 1리터에 녹여 만든 평판배지에 각각 한 백금니씩 접종한 후 성장이 이루어졌을 때 균주가 감청색을 나타내면 리파아제 활성을 지닌 균주로 판정하고 선별하였다. 그후 선별한 균주중에 상대적으로 짙은 감청색을 보인 5종의 균주를 1차선별하였다. 한편 상기의 1차선별한 미생물을 한천을 제외한 상기 조성의 LB배지 5ml씩 함유한 배양시험관에 한 백금니 접종한 후 진탕회전 배양기에서 25∼30℃로 24시간동안 배양하고 그 배양액을 원심분리기에서 5분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 미생물을 일부는 다음의 계속적인 실험에 사용하였으며 일부는 동결건조하여 보관하였다.
당질지방합성폐수처리능을 지닌 균주의 선별
상기의 1차 선별된 5종의 미생물들을 멸균증류수에 현탁한 후, 200ppm, 1000ppm, 3000ppm(BOD)으로 조정한 당질지방 합성폐수에 대하여 각 미생물을 1%(v/v)씩 접종하고 진탕회전 배양기에서 25∼30℃로 배양하였다. 이후 생육도를 관찰하고 또한 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 원심분리기에서 처리한 후, 상등액을 사용하여 BOD를 측정하여 유기물질의 제거능력을 비교하였다.
도1과 같이 200ppm, 1000ppm, 3000ppm(BOD)으로 조정한 당질지방 합성폐수에 대하여 24시간 생육을 관찰한 결과 엔테로박터속 씨제이-엘01로 동정된 미생물이 기타 미생물에 비하여 생육이 우수하였다. 또한, 상기 5종류의 미생물을 200ppm, 1000ppm, 3000ppm(BOD)으로 조정한 당질지방합성폐수에 대하여 유기물의 제거능력을 비교실험하였다. 본 발명자들이 사용한 당질지방 합성폐수의 조성은 포도당 20g/ℓ, 효모추출물 10mg/ℓ, 염화나트륨 0.1g/ℓ, 황산암모늄 10g/ℓ, 인산칼륨 0.5g/ℓ, 황산마그네슘 0.2g/ℓ, 염화철 5mg/ℓ, 염화칼슘 50mg/ℓ를 기본으로 하여 미강유 4g/ℓ, 글리세롤 4g/ℓ, 스테아릭산 4g/ℓ, 올레산 4g/ℓ, 리놀레산 4g/ℓ의 조성을 사용하였으며 필요에 따라 적당한 농도로 희석하여 사용하였다
상기의 원심분리기에서 회수한 균체를 멸균 증류수에 현탁한 후, 200ppm, 1000ppm, 3000ppm(BOD)으로 조정한 당질지방 합성폐수에 대하여 각 미생물을 1%(v/v)씩 접종하였다. 접종한 후 진탕회전 배양기에서 25∼30℃로 배양하면서 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 적당량 희석한 후 원심분리기에서 처리한 상등액을 사용하여 BOD 를 측정하여 각각의 폐수에 대한 미생물의 유기물 처리능력을 판정하였다. 그 결과 도2와 같이 엔테로박터속 씨제이-엘01로 동정된 미생물이 200ppm, 1000ppm, 3000ppm(BOD)으로 조정한 당질지방 합성폐수에 대하여 우수한 BOD제거율을 나타내었으므로 유기물의 처리성이 우수한 것으로 판명되어 최종 선별하였다.
산업체의 폐수처리장에서 분리, 선별된 엔테로박터속 씨제이-엘01의 당질지방폐수 처리능력은 실제 현장폐수의 처리에 이용이 가능하며 미생물을 이용한 환경처리제를 비롯한 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremediation)에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
도1은 본 발명의 신규한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01(Enterobacter sp. CJ-L01)의 당질지방 합성폐수에서의 성장률을 나타낸 그래프이다.
도2는 본 발명의 신규한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01을 이용하여 당질지방 합성폐수를 처리할 때 생물화학적 산소요구량(BOD)의 제거율을 나타낸 그래프이다.
도3은 본 발명의 신규한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01의 전자현미경사진(×10000)이다.

Claims (3)

  1. 호기성 조건하에서 생육이 양호하며 리파아제의 활성이 우수하고 당질지방폐수의 처리능력이 탁월한 미생물 엔테로박터속 씨제이-엘01(한국종균협회 기탁일: 1998년 10월 24일; 수탁번호 KFCC-11055).
  2. 제1항의 미생물을 이용하여 당질지방폐수를 처리하는 방법.
  3. 효모추출물, 카제인, 스피리트블루 및 유지에멀션을 조성으로한 배지에서의 균주성장이 나타나는 감청색으로 검출하는 것을 특징으로 하는 제1항의 미생물의 분리방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108251345A (zh) * 2017-12-28 2018-07-06 江苏世邦生物工程科技有限公司 用于生活污水处理的含有脂肪酶基因的重组工程菌及其构建方法

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