CN110373345B

CN110373345B - Dehp水解酶和基因及其在邻苯二甲酸酯类塑化剂降解中的应用

Info

Publication number: CN110373345B
Application number: CN201910380995.1A
Authority: CN
Inventors: 黄晗; 张晓彦; 白云鹏; 徐殿胜
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2039-05-08
Also published as: CN110373345A

Abstract

本发明涉及戈登氏菌株(Gordonia polyisoprenivorans)，该菌株表达的邻苯二甲酸二(2‑乙基己)酯(DEHP)水解酶及其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及利用该重组酶降解邻苯二甲酸酯(PAEs)的方法。与现有技术相比，本发明DEHP水解酶具有底物谱广、催化效果好、反应条件温和、对环境友好等优势，因此在土壤生物修复，污染物生物降解中具有良好的应用前景。

Description

DEHP水解酶和基因及其在邻苯二甲酸酯类塑化剂降解中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)及其表达的DEHP水解酶，该酶的编码基因和氨基酸序列，以及含有所述编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶的制备方法，还涉及该重组酶作为催化剂降解邻苯二甲酸酯类塑化剂的应用。

背景技术

自20世纪30年代以来，邻苯二甲酸酯(PAEs)作为增塑剂广泛应用于各类塑料制品的生产和加工中，包括食品包装、血液容器、工业管道、电缆护套、农业塑料薄膜以及车辆塑料制品等，涵盖了日用品、医疗、建筑和汽车等重要行业。据统计，1975年，邻苯二甲酸酯的全球产量为180万吨；2014年的全球增塑剂消费量达到840万吨，其中，PAEs占全球增塑剂市场份额的70％，而邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)消耗量最大，每年超过300万吨。

塑料制品在全世界的广泛应用，导致邻苯二甲酸酯(PAEs)在环境中大量积累。研究表明，PAEs不与塑料基质共价结合，易于从塑料释放到外部环境中。相关实验研究表明，PAEs对人体健康和生态系统功能具有明显的危害性。PAEs的一个主要危害在于它的环境激素作用，在极低浓度下即可干扰人和动物的内分泌系统，会使男性精子数量减少、形态异常，引发许多生殖系统的问题，还会导致女性得乳腺癌的几率增加以及危害她们未来男婴的生殖系统，高浓度时还会引发癌症。鉴于PAEs对人类健康和生态环境造成的极大危害，六种常见的PAEs，包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)，邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)已被美国环境保护署(USEPA)，欧盟(EU)和中国国家环境监测中心列为优先污染物。

由于PAEs在自然条件下的水解和光解速率都比较缓慢，无法作为PAEs的有效降解途径。到目前为止，国内外的研究多数还是集中在寻求从环境中分离能够降解PAEs类化合物的微生物，希望通过生物降解的途径解决PAEs的污染问题。1975年，Engelhardt等人首次报道了PAEs的微生物代谢，此后的40年中，国内外的研究学者陆陆续续从各种环境条件下分离出多种的PAEs降解菌株。其中，被广泛报道的PAEs降解菌属有镰刀菌属(Fusarium)，戈登氏菌属(Gordonia)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)。

细菌对PAEs最常见的降解方式是通过酯酶逐步水解PAEs中的酯键。第一步也是最关键的步骤是将邻苯二甲酸双酯转化为相应的邻苯二甲酸单酯。已有许多涉及该步骤的酯酶被报道，包括来自Bacillus sp.K91的DIBP酯酶(CarEW)，Sulfobacillus acidophilusDSM10332的酯酶(EstS1)，Acinetobacter sp.M673的DBP水解酶等。第二步是将邻苯二甲酸单酯降解为邻苯二甲酸(PA)和相应的醇。例如来自于Rhodococcus sp.EG-5的MEHP水解酶(EG-5MehpH)，来自Gordonia sp.P8219的MEHP水解酶(P8219MehpH)，和来自Micrococcussp.YGJ1的邻苯二甲酸单酯水解酶。上述提到第一个酯键的水解酶的底物谱普遍较窄，只对小侧链基团PAEs有活性，如DMP、DEP、DPrP、DBP、DIBP、DPP、DHXP和BBP等。然而，这些酶不能降解DEHP、DNOP、DCHP等物质，这与DEHP这类大侧链基团PAEs具有较大的空间位阻有关。

鉴于DEHP是使用量最大的一种PAEs物质，其污染程度相较于其它的PAEs也是最大的，它的降解研究应该放在首位。但是目前关于DEHP的生物法降解研究主要还是停留在菌株降解研究上，很少有关于DEHP降解酶的研究。同理，与DEHP类似的具有大侧链基团的PAEs物质的降解也存在同样的酶法降解研究少的问题。有些研究通过蛋白质沉淀法得到了DEHP降解酶，但是相关的基因和蛋白质序列均没有报道，阻碍了进一步的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前酶法降解DEHP的技术中DEHP水解酶的基因序列未见公布的现状，提供一种来源于戈登氏菌株(Gordonia polyisoprenivorans)的催化活性高、广谱性的PAEs水解酶的基因序列。本发明还公开了包含该DEHP水解酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述重组DEHP水解酶在催化降解PAEs物质方面的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：提供一种食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)，其特征在于，所述食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)能表达DEHP水解酶，所述食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)于2019年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17621。

通过对自然界微生物以及实验室保藏微生物菌株的大规模筛选，发现获得的食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)可以降解DEHP。

本发明第二方面：提供一种DEHP水解酶。所述DEHP水解酶来源于食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)。

本发明通过基因挖掘获得了食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)中催化相应反应的DEHP水解酶，命名为GoEst15，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

蛋白质(a)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

蛋白质(b)：SEQ ID No.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加几个氨基酸且具有DEHP水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质

在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库上经过序列比对，发现本发明所述的DEHP水解酶GoEst15与同属菌株来源一个蛋白质，命名为carboxylesterase/lipasefamily protein(GenBank登录号：WP_020172296.1)的序列一致性最高，为100％，该酶蛋白的功能此前都未被验证。

本发明第三方面，提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述DEHP水解酶。

所述DEHP水解酶GoEst15的编码DNA的来源包括：通过基因克隆技术获得所述DEHP水解酶GoEst15的编码DNA，或者通过人工全序列合成的方法得到所述DEHP水解酶的编码DNA。

本发明所述DEHP水解酶基因来源于食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)。其编码DNA的具体制备方法包括：以食异戊二烯戈登氏菌(Gordoniapolyisoprenivorans)的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应，PCR)，获得编码所述DEHP水解酶GoEst15的完整DNA序列其中涉及的合成引物，优选的如SEQID No.3(上游引物)和SEQ ID No.4(下游引物)所示：上游引物：5’-GGAATTCATGGGAGTTCCGAACACC-3’，下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I的酶切位点；下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGACGTCGAGCGCGGC-3’，下划线所示序列为限制性内切酶Hind III的酶切位点。

所述DEHP水解酶GoEst15全长基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，全长为1620个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1620个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明第四方面，提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

所述重组表达载体可通过本领域常规方法将所述DEHP水解酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳的包括本领域常规的各种质粒载体，优选的为pET28a质粒。

较佳的，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的DEHP水解酶GoEst15的基因序列DNA片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载质粒pET28a用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，回收上述酶切后的DEHP水解酶GoEst15的基因DNA片段以及pET28a质粒，利用T₄DNA连接酶连接，构建获得包含所述DEHP水解酶GoEst15基因的重组表达载体pET28a-GoEst15。

本发明第五方面，提供包含所述重组表达载体的重组表达转化体。

所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的DEHP水解酶GoEst15的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌E.coli DH5α。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。例如，将重组表达载体pET28a-GoEst15转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GoEst15。

本发明第六方面，提供一种DEHP水解酶的制备方法。

本发明所述重组DEHP水解酶GoEst15的制备方法较佳地为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的DEHP水解酶GoEst15。

其中所述重组表达转化体培养所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组DEHP水解酶GoEst15的培养基。所述培养基优选LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述DEHP水解酶GoEst15即可。重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选的，将本发明所述的重组大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)/pET28a-GoEst15，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选1.0mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的DEHP水解酶GoEst15。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将收获的细胞悬浮于PB缓冲液(100mM,pH 7.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上清液，即可获得所述重组DEHP水解酶GoEst15的粗酶液。

DEHP水解酶GoEst15的活性测定：利用酯酶的通用底物对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)测定酯酶活性，pNPB与酯酶反应后会产黄色的对硝基苯酚，该反应过程中的物质变化可通过紫外分光光度计监测。活力检测体系如下：980μL 100mM的PB缓冲液(pH 7.0)，10μL的100mM pNPB，10μL酶液，检测波长为405nm，检测温度控制为30℃。通过测定反应1min内的吸光值变化量来计算酯酶的活力大小。蛋白浓度用Nanodrop测定。一个酶活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯酚的酶量。

根据下式计算得到酶活力：

ΔA：吸光值变化量V：反应总体积(mL)v：加入酶液体积(mL)

ε：摩尔吸光系数：17700L·cm^-1·mol^-1Δt：1min d：比色杯光径(cm)

本发明第七方面，提供所述的DEHP水解酶降解邻苯二甲酸酯的应用。

其中，所述邻苯二甲酸酯包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)，邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)，邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)，邻苯二甲酸二正戊酯(DPP)，邻苯二甲酸二正己酯(DHXP)，邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)，邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)和邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)。各化合物的化学结构式如下所示：

所述PAEs的降解反应，可按下述示例性方法进行：在pH 6.5-8.0的磷酸盐缓冲液中，在所述DEHP水解酶GoEst15的作用下，催化所述PAEs的降解反应。反应结束后，取出样品并加入100μL 1M HCl终止反应，用乙酸乙酯萃取。所述应用中，底物在反应液中的浓度可以为0.1～5mmol/L。根据所采用的反应体系，所述DEHP水解酶的用量可以为1～10U/mL。所述缓冲液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在6.5～8.0即可，比如磷酸钠、磷酸钾或者Tris-HCl缓冲液，优选pH为7.0。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05～0.1mol/L。所述的降解反应的温度可以是20～40℃，优选30℃。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1～24小时。反应转化率和产物可采用高效液相色谱(HPLC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行分析，优选的，HPLC分析：取1mL用乙酸乙酯萃取的样品放置于通风橱过夜挥干，然后向其中加入等量的甲醇溶液重溶，用0.22μm滤膜过滤去除其中的杂质，使用规格为5.0μm和4.6×250mm的HypersilODS2-C18柱，型号为Shimadzu LC-2010A HT的高效液相色谱仪。使用的流动相为95％甲醇和5％水，；流速设置为0.8mL/min，保温箱温度为30℃，紫外检测波长为254nm；GC-MS分析：利用衍生试剂N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)，99％BSTFA+1％TMCS对样品中的中间产物进行衍生化，衍生化体系为：60μL吡啶，20μL萃取液，20μL 99％BSTFA+1％TMCS，在65℃反应30min，使用规格为0.25μm×0.25mm×30m的DB-5ms柱，型号为ShimadzuGCMS-QP2010SE的气相色谱-质谱联用仪。以氦气作为载气按照1.5mL/min的流速运行。进样温度设置为250℃，离子源温度为230℃，GC烘箱升温程序为：80℃保持1分钟，按每分钟20℃的升温速度升至180℃，然后升温按每分钟10℃的升温速度升至280℃并在此温度下保持2分钟。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明提供的DEHP水解酶GoEst15，可催化包括DEHP在内的十一种PAEs物质的一个酯键水解，生成相应的邻苯二甲酸单酯物质和醇，由于其良好的降解效果和广泛的底物谱，该酶将是一种很有前景的生物催化剂，可作为蛋白质工程的起始酶，为未来土壤生物修复，污染物生物降解和水处理开发绿色，温和，高效的技术。

具体实施方式

本发明中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，应当理解，所列实施例虽然列举了本发明优选的实施方式，但所列具体实施例仅是为了更好地阐明本发明而给出，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。

下列实施例中的材料来源为：

食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)。

2×Taq PCR MasterMix、限制性内切酶EcoR I和Hind III均购于宝生物工程(大连)有限公司。

表达质粒pET28a、E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞来自于本实验。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。

实施例1 DEHP水解酶GoEst15的基因克隆

根据DEHP水解酶GoEst15的开放阅读框，设计上、下游引物，以食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

设计的上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.3：

5’-GGAATTCATGGGAGTTCCGAACACC-3’；

下游引物SEQ ID No.4：

5’-CCCAAGCTTTCAGACGTCGAGCGCGGC-3’；

其中，上游引物下划线部分为限制性内切酶EcoR I的酶切位点，下游引物下划线部分为限制性内切酶Hind III的酶切位点。

PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上游引物和下游引物(100μM)各0.5μL，1μL食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)的基因组DNA(100ng/μL)，以及23μL的ddH₂O。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行30次如下循环：95℃变性30秒，55～70℃退火30秒，72℃延伸90秒；循环结束后，最后再72℃延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列编码的开放阅读框全长1620bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2 DEHP水解酶GoEst15重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1中PCR扩增所得的DEHP水解酶目的DNA片段以及pET28a空质粒同时用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T₄DNA连接酶的作用下，于4℃连接16小时，得到重组质粒pET28a-GoEst15。

将所得重组质粒转化至E.coli DH5α，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养12小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取成功扩增出长度约1620bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-GoEst15。

实施例3 DEHP水解酶GoEst15的诱导表达

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-GoEst15，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有50mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的250mL三角烧瓶中，放入摇床中，37℃、200rpm振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以12000rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将如上方法所得的静息细胞悬浮于10mL的磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组DEHP水解酶GoEst15的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组DEHP水解酶GoEst15以可溶的形式存在。将获得的重组DEHP水解酶GoEst15的粗酶液进行镍柱纯化，制得重组DEHP水解酶GoEst15的纯酶，在pH 7.0和30℃下测定纯酶对于对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的比活为69.8±1.8U/mg。

实施例4 pH对DEHP水解酶GoEst15催化活性的影响

在pH 6.0～10.0的范围内按标准方法测定pH对重组DEHP水解酶GoEst15活性的影响。缓冲液分别为磷酸钾缓冲液(6.0～8.0)，Tris-HCl缓冲液(7.5～10.0)。

在1mL上述缓冲液体系中，加入对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)至终浓度为1mmol/L，预热至30℃，然后加入适量的DEHP水解酶GoEst15，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测405nm处的吸光度变化，测定不同pH的缓冲溶液中，对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的活性差异，结果如表1所示。优选酶促反应的pH范围为7.0～9.0。

表1 pH对GoEst15活性的影响

选择pH为7.0、7.5、8.0的磷酸钾缓冲液和pH为7.5、8.0、8.5的Tris-HCl缓冲液进行GoEst15稳定性分析，结果显示，在30℃条件下，酶在pH 8.0和8.5的缓冲液中温育1小时后的剩余活力仅为原始活力的10％，酶在pH 7.5的缓冲液中温育2小时后仅剩50％的活力，在pH 7.0的磷酸钾缓冲液中温育12小时后仍保持40％左右的活力，因此优选酶促反应的pH值为7.0。

实施例6温度对DEHP水解酶GoEst15催化活性的影响

在1mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)体系中，加入对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)至终浓度为1mmol/L，在0～50℃环境中预热2min，然后加入适量的GoEst15，混合均匀，在与预热温度相同的温度环境中保温反应，在分光光度计上检测405nm处的吸光度变化，测定不同温度条件下，GoEst15的活性差异，结果如表2所示。优选酶促反应的温度为30℃。通过热稳定性的测定，鉴定出GoEst15在25℃，30℃和40℃下的半衰期分别为24小时，12小时和0.65小时。

表2温度对GoEst15活性的影响

实施例7重组DEHP水解酶GoEst15对DEHP降解产物的鉴定

将10U GoEst15纯酶与5mM底物在1mL的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0，0.1％吐温80)中进行反应，30℃，1000rpm反应24小时，加入100μL 1M HCl终止反应，用1mL的乙酸乙酯萃取，萃取液用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后进行GC-MS分析。通过GC-MS分析GoEst15与DEHP反应的降解产物，在反应液中仅检测到MEHP的存在，由此推测GoEst15通过水解DEHP中的一个酯键生成终产物MEHP。

实施例8重组DEHP水解酶GoEst15对几种常见的PAEs物质的降解效果检测

测定了DEHP水解酶GoEst15对几种常见PAEs底物的降解效率。测定方法为：将10UGoEst15纯酶与5mM底物在1mL的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0，0.1％吐温80)中进行反应，30℃，1000rpm反应1小时，加入100μL 1M HCl终止反应，用1mL的乙酸乙酯萃取，进行高效液相色谱检测。检测结果如表3所示。

表3重组水解酶GoEst15对PAEs物质的降解效果

水解酶GoEst15对所测试的PAEs物质均能降解，GoEst15对短侧链PAEs表现出了非常好的降解效果，同时也具备水解大侧链PAEs的优势，是一个广谱酯酶。

实施例9重组DEHP水解酶GoEst15对DEHP的降解进程

将10U GoEst15纯酶与5mM DEHP在1mL的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0，0.1％吐温80)中，30℃和1000rpm条件下进行反应，定时取样，加入100μL 1M HCl终止反应，用1mL的乙酸乙酯萃取，进行高效液相色谱检测。在前5个小时内，有75％的DEHP被降解；反应进行到12小时，DEHP降解了95％以上；22小时后，DEHP被完全降解。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> DEHP水解酶和基因及其在邻苯二甲酸酯类塑化剂降解中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 戈登氏菌株(Gordonia polyisoprenivorans)

<400> 1

atgggagttc cgaacaccgc agtggccgac accagggtct cgaccgcgga ggggatcgtg 60

tccggggtcc gcggccggcg ttcacggcgc ggcaccgtcg cctggcgggg cattccgtat 120

gcggcgccgc cggtcggcgg tggacgtttt gacgccccgc aaccggtggc cccgtggccc 180

ggcgtgcggc gctgcgagaa cttcggcgac gccgcggtgc aggacaaact gctcaccgcg 240

accggcctcg gacgattcca gccggtgagc gaggactgcc tgaccctcaa cgtcgtcgcc 300

cccgacaccg tggcgagcgc gccgcgaccg gtgatggtgt tcatccacgg cggcgcctac 360

atcctgggca ccgcggcgac cccgctccac gacggcacgc acctcgcacg tgcgcaggac 420

gtcgtcgtgg tcaccatcca gtaccggttc gggccgttcg ggatgctcga tttcagcggc 480

tattcgacgc cggaacggca cttcgacgag aaccccggtc tcaaggacca catcgccgcc 540

ctgcaatggg tgcagcgcaa catcgcggcc ttcggcggcg atcccgacaa cgtcaccatc 600

ttcggcgagt ccgccggggg gacctcggtg ttgtgcctgc tcgccgcgcc cggcgcacgc 660

ggactgttcc accgggcgat cgccgagagc ccggccacct acctggcgat ctcccgcgag 720

agcgccgcgt tgttcgccga cgagttcctg cgcctgctgg ccgatccgag ccggcgcagc 780

accgacgcca ccagcccgcg cgagccgatc gacccgcacg aggcggcccg gcgcctcgac 840

gccgccaccc ctgaggaact ccaccgcgcc ggcggtcggc tgatgggctt cgcccgccac 900

gccgacagtg tcgaaccggc cccgttcgga ccggcctacg gggtgccgtc cctaccgcag 960

tcgccgtatg ccgcggcccg cgacggcaac accgcgccgg tcccgctgat catcggcacc 1020

aaccgcgacg agggcaaact cttcgacaag ttctggaatc tgctgcccga cacccagcgc 1080

accctgctgg ccatccagga cgagaccgcg cgcgacgaga tcatgaacca gtacgccggt 1140

ggccccgacg accagttgcg gctgaccgcc gacagcatct tctgggctcc ggtcaccgcc 1200

ttcgccgacg ctcatcgcga ggtggcaccg acgtatgtgt accgcttcga cttccatacg 1260

cgtgccctcg cgcgcgccgg actcggcgcc acgcacggaa ccgagttgtt cgcggtgttc 1320

ggcggatacc ggatgccggt gttcgccggg ctggcaacgg ccgactggcg cgccgcgggc 1380

gcgatggtcg acgagatgca gtcccggtgg ggcgatttcg ctcgcgggcg gcctcccggg 1440

ccggattggc ccgcctacga cgcggcgcat cggccggtga tggtgctcga ccgcaccagc 1500

cacgtcgagt ccgacccgga cgcgtcgcgc cggcaggcgt gggatcgggg gcgtcaactc 1560

ctcgtcgcgt ccggcggttc accggaggcg ccgtccgacg tcgccgcgct cgacgtctga 1620

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> 戈登氏菌株(Gordonia polyisoprenivorans)

<400> 2

Met Gly Val Pro Asn Thr Ala Val Ala Asp Thr Arg Val Ser Thr Ala

1 5 10 15

Glu Gly Ile Val Ser Gly Val Arg Gly Arg Arg Ser Arg Arg Gly Thr

20 25 30

Val Ala Trp Arg Gly Ile Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Val Gly Gly Gly

35 40 45

Arg Phe Asp Ala Pro Gln Pro Val Ala Pro Trp Pro Gly Val Arg Arg

50 55 60

Cys Glu Asn Phe Gly Asp Ala Ala Val Gln Asp Lys Leu Leu Thr Ala

65 70 75 80

Thr Gly Leu Gly Arg Phe Gln Pro Val Ser Glu Asp Cys Leu Thr Leu

85 90 95

Asn Val Val Ala Pro Asp Thr Val Ala Ser Ala Pro Arg Pro Val Met

100 105 110

Val Phe Ile His Gly Gly Ala Tyr Ile Leu Gly Thr Ala Ala Thr Pro

115 120 125

Leu His Asp Gly Thr His Leu Ala Arg Ala Gln Asp Val Val Val Val

130 135 140

Thr Ile Gln Tyr Arg Phe Gly Pro Phe Gly Met Leu Asp Phe Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Ser Thr Pro Glu Arg His Phe Asp Glu Asn Pro Gly Leu Lys Asp

165 170 175

His Ile Ala Ala Leu Gln Trp Val Gln Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly

180 185 190

Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Ser Val Leu Cys Leu Leu Ala Ala Pro Gly Ala Arg Gly Leu Phe His

210 215 220

Arg Ala Ile Ala Glu Ser Pro Ala Thr Tyr Leu Ala Ile Ser Arg Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Leu Phe Ala Asp Glu Phe Leu Arg Leu Leu Ala Asp Pro

245 250 255

Ser Arg Arg Ser Thr Asp Ala Thr Ser Pro Arg Glu Pro Ile Asp Pro

260 265 270

His Glu Ala Ala Arg Arg Leu Asp Ala Ala Thr Pro Glu Glu Leu His

275 280 285

Arg Ala Gly Gly Arg Leu Met Gly Phe Ala Arg His Ala Asp Ser Val

290 295 300

Glu Pro Ala Pro Phe Gly Pro Ala Tyr Gly Val Pro Ser Leu Pro Gln

305 310 315 320

Ser Pro Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Gly Asn Thr Ala Pro Val Pro Leu

325 330 335

Ile Ile Gly Thr Asn Arg Asp Glu Gly Lys Leu Phe Asp Lys Phe Trp

340 345 350

Asn Leu Leu Pro Asp Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ala Ile Gln Asp Glu

355 360 365

Thr Ala Arg Asp Glu Ile Met Asn Gln Tyr Ala Gly Gly Pro Asp Asp

370 375 380

Gln Leu Arg Leu Thr Ala Asp Ser Ile Phe Trp Ala Pro Val Thr Ala

385 390 395 400

Phe Ala Asp Ala His Arg Glu Val Ala Pro Thr Tyr Val Tyr Arg Phe

405 410 415

Asp Phe His Thr Arg Ala Leu Ala Arg Ala Gly Leu Gly Ala Thr His

420 425 430

Gly Thr Glu Leu Phe Ala Val Phe Gly Gly Tyr Arg Met Pro Val Phe

435 440 445

Ala Gly Leu Ala Thr Ala Asp Trp Arg Ala Ala Gly Ala Met Val Asp

450 455 460

Glu Met Gln Ser Arg Trp Gly Asp Phe Ala Arg Gly Arg Pro Pro Gly

465 470 475 480

Pro Asp Trp Pro Ala Tyr Asp Ala Ala His Arg Pro Val Met Val Leu

485 490 495

Asp Arg Thr Ser His Val Glu Ser Asp Pro Asp Ala Ser Arg Arg Gln

500 505 510

Ala Trp Asp Arg Gly Arg Gln Leu Leu Val Ala Ser Gly Gly Ser Pro

515 520 525

Glu Ala Pro Ser Asp Val Ala Ala Leu Asp Val

530 535

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggaattcatg ggagttccga acacc 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cccaagcttt cagacgtcga gcgcggc 27

Claims

1.一种DEHP水解酶降解邻苯二甲酸酯的应用，其特征在于：所述邻苯二甲酸酯选自邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二正戊酯、邻苯二甲酸二正己酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯和邻苯二甲酸二环己酯；

所述DEHP水解酶是由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

所述DEHP水解酶降解邻苯二甲酸酯的适用pH范围为6.5～8.0，所述DEHP水解酶降解邻苯二甲酸酯的适用温度为20～40℃。