CN103275909A

CN103275909A - 一株邻苯二甲酸酯降解菌及其用途

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Publication number: CN103275909A
Application number: CN2013102481088A
Authority: CN
Inventors: 高大文; 温志丹; 李喆
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-21
Also published as: CN103275909B

Abstract

一株邻苯二甲酸酯降解菌及其用途，它涉及一株可降解邻苯二甲酸酯的微生物及其用途。该菌株是硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7671。邻苯二甲酸酯降解菌在邻苯二甲酸酯降解中的用途，可用于环境修复领域。

Description

一株邻苯二甲酸酯降解菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株可降解邻苯二甲酸酯的微生物及其用途。

背景技术

邻苯二甲酸酯（PAEs），又名酞酸酯，是一类广泛应用于塑料、涂料、农药、橡胶、个人护理用品等生产领域的人工合成化学添加剂。由于在塑料及其它制品中PAEs与其基体材料以氢键或范德华力相结合，因此在其生产、使用和废弃过程中，能够逐渐从其基体材料中迁移至外界环境中，并通过呼吸道、消化道和皮肤接触等多种途径进入人体和生物体内，参与生物代谢作用。PAEs具有致畸性、致突变性、致癌性及生殖毒性，对生物和自然生态环境造有很大的危害。目前这类物质已成为全球最普遍的重要环境有机污染物之一，在大气、土壤和水体中都检测到PAEs的存在，引起了世界各国的广泛关注。美国EPA已将其列入129种重点控制污染物名单中，在我国也是环境优先控制污染物。

邻苯二甲酸酯是大约30种化合物的总称，由邻苯二甲酸和相应的醇化合而成，一般为无色油状粘稠液体，难溶于水，易溶于有机溶剂，常温下不易挥发；其中小分子量PAEs（短链PAEs）以苯二甲酸二甲酯（DMP）、中分子量PAEs（中链PAEs）以邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、大分子量PAEs（长链PAEs）以邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯(DEHP)为代表。邻苯二甲酸酯成本较低，品种多，产量大，估计邻苯二甲酸酯类化合物在20世纪80年代初的世界年产量已超过130万吨，其中约95%用作增塑剂，其余5%则用作农药载体、驱虫剂、燃料助剂、化妆品和香料的调配剂，以及涂料和润滑剂的成分等。PAEs作为增塑剂应用最多的是邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯(DEHP)。

PAEs在自然环境条件下光解和水解速度极其缓慢，利用生物降解被认为是目前最为有效地方法。虽然目前已经分离得到多株具有邻苯二甲酸酯降解功能的微生物菌株，但是每一株都具有一定的局限性，仅仅能够降解某个分子量范围内的PAEs，尚未发现对邻苯二甲酸酯均具有降解作用的微生物菌株。

发明内容

本发明提供了一株对邻苯二甲酸酯均具有降解作用的微生物菌株，对有效全面的降解对邻苯二甲酸酯奠定了物质基础。

本发明邻苯二甲酸酯降解菌为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，属于节杆菌属（Arthrobacter）；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7671，保藏日期为2013年5月31日。

邻苯二甲酸酯降解菌硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，可用于邻苯二甲酸酯的降解。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21为革兰氏染色阳性菌，幼龄培养物细胞呈杆状，稳定期培养物细胞为球状，具有明显的球杆变化周期；无鞭毛，无芽孢，接触酶阳性，过氧化氢酶阳性，非发酵型，不抗酸，不利用纤维素，不利用柠檬酸，不水解淀粉，能够液化明胶，专性好氧。硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21菌落呈浅黄色、圆形、半透明、边缘整齐、光滑湿润。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21经16S rRNA基因序列比对与节杆菌属的Arthrobacter scleromae CM15的同源性高达99%，硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21与Genbank中收录的相近菌株的16S rRNA所构建的系统发育树如图1所示，确定硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21为节杆菌属菌株。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21可降解DMP、DBP和DEHP，而且可在邻苯二甲酸（PA）为唯一碳源和能源的无机盐培养液中生长繁殖，不同于现有已知任何节杆菌属菌株，因此确定硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21为节杆菌属（Arthrobacter）的一株新菌株，命名为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21。

纯培养条件下硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21在3天能将无机盐培养基中20mg/L的DMP降解90%以上，3天能将无机盐培养基中20mg/L的DBP降解75%以上，3天能将无机盐培养基中20mg/L的DEHP降解50%以上。

本发明使用单一的微生物硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21对PAEs进行降解，避免了混合微生物之间的竞争，也避免了不同微生物代谢产物之间的拮抗作用，同时由于采用单一微生物材料，降解条件更容易控制，便于管理。修复环境时硬结节杆菌（Arthrobacterscleromae）C21作为优势菌群进行投加，具有受环境干扰因素小，受限制条件少等优点；而且以邻苯二甲酸酯为唯一碳源和能源，因此，修复环境中邻苯二甲酸酯消失后，硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21也大量衰亡，不对环境造成影响和危害。

本发明对未来修复PAEs污染的生态系统、降低PAEs的生态危害具有重要的现实意义。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，属于节杆菌属（Arthrobacter）；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.7671，保藏日期为2013年5月31日。

附图说明

图1是硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21与Genbank中收录的相近菌株的16SrRNA基因序列所构建的系统发育树。

图2是硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21培养3天后对不同分子量PAEs的降解率示意图。

图3为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21以PA为唯一碳源培养时的OD₆₀₀连续监测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式邻苯二甲酸酯降解菌为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，属于节杆菌属（Arthrobacter）；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7671，保藏日期为2013年5月31日。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21为专性好氧细菌，可在pH值为5.5～9环境中生长，最适pH值为7.0；可生长温度为10～35℃，最适生长温度为25～30℃。30℃条件下，使用牛肉膏蛋白胨液体培养基对硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21进行摇床富集培养（120r/min），培养12h左右即可进入对数生长期，该牛肉膏蛋白胨液体培养基1升中含有10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠，pH值为7.0～7.2。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21降解DMP、DBP或DEHP：

将硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21培养于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，待菌液OD₍₆₀₀₎到1.2～1.4时离心收集菌体，再用pH值7.0的磷酸盐缓冲液清洗菌体。将洗后的菌体分别接种于含有不同PAEs的50mL的无机盐MSM培养液中，其中PAEs（DMP、DBP或DEHP）=20mg/L，震荡培养箱中120r/min，30℃避光培养3天后离心测定上清液中残留的PAEs浓度，用未接菌的无机盐MSM培养液（PAEs=20mg/L）作为非生物降解PAEs的对照，以上实验重复3次。采用微波萃取法（萃取液为正己烷）提取上清液中残余PAEs，采用Agilent6890-5973N气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪分析PAEs含量。实验结果如图2所示，硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21培养3天后对DMP、DBP和DEHP的降解率分别为99.5%、76.0％和51.4%。由此可知，硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21对不同分子量的PAEs均有一定的降解率，但降解作用随PAEs侧链烷基链的增长而下降，分子量较小的DMP的降解率明显高于长链DEHP。在培养3天后离心测定上清液中残留的PAEs浓度时，并未在GC-MS图谱中观察到PAEs的必经降解产物PA的峰出现，说明PA已经被矿化利用，推测其通过好氧代谢途径，降解为二氧化碳和水。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21降解PA：

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21能在以邻苯二甲酸（PA）为唯一碳源和能源的无机盐MSM培养液中生长繁殖，在底物PA浓度为150mg/L条件下，硬结节杆菌（Arthrobacterscleromae）C21纯培养7天（震荡培养箱中120r/min，30℃避光培养）对PA的利用率高达81%，说明硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21能通过PA途径实现对环境中的PAEs的完全降解。

图3为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21以PA为唯一碳源培养时的OD₆₀₀连续监测结果图。硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21在以PA为唯一碳源培养时的生长较为迅速，约培养2天后进入对数生长期，稳定期较短，培养6后已经进入衰亡期。在培养7天后，取培养液离心后对上清液中的残余PA含量进行分析，在底物PA浓度为150mg/L条件下，菌株硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21对PA的利用率很高，到达了81%。

虽然很多具有降解PAEs功能的微生物都能利用PAEs，但是并不能实现对其必经的降解中间产物PA的降解，即PAEs不能被这些微生物彻底降解为对任何自然无害的无机物。还有些降解菌株虽然被证明了含有邻苯二甲酸双加氧酶基因，但是在自然条件下这些降解菌株的邻苯二甲酸双加氧酶基因是否能够正常表达，能否实现对PA的降解，从而完成对PAEs的终极降解尚有待研究。

吴学玲（中南大学，Complete degradation of di-n-octyl phthalate by biochemical cooperationbetween Gordonia sp.strain JDC-2and Arthrobacter sp.strain JDC-32isolated from activatedsludge，Journal of Hazardous Materials，2010(176)：262–268）报道了一株大头茶属菌株JDC-2（Gordonia sp.）能降解DOP（DEHP的同分异构体），生成PA，但是不能再降解利用PA；而一株节杆菌属菌株JDC-32（Arthrobacter sp.），能够利用PA，但是节杆菌属菌株JDC-32单独却不能降解利用DOP。

具体实施方式二：本实施方式按以下步骤分离获得硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21。

步骤一、在辽宁省昌图县某处理生活污水的人工湿地采集土壤样品，该湿地的地理位置为124°4′44″N～124°4′59″N，42°45′43″E～42°45′58″E。采样前对所用的器皿进行高温灭菌，并用丙酮及超纯水清洗，取样前用所在采样点的水样润洗。采样时先用灭菌后的不锈钢采样铲去除表面10cm的土壤后采样，采用多点采集混合取样的方式。将采集的土壤样品5g加入到150mL的无菌三角瓶中，同时加入以PAEs为唯一碳源的无机盐MSM培养液驯化PAEs降解菌，所用PAEs为DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DOP的混合物，无机盐MSM培养液1升中含有1g(NH₄)₂SO₄、0.8g K₂HPO₄、0.2g KH₂PO₄、0.5g NaCl、0.43gZnSO₄·7H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.99g MnCl₂·4H₂O、0.19g NiCl·6H₂O、0.24gCoCl₂·6H₂O、0.01g FeSO₄、0.21g NaSeO₄·10H₂O和0.22g NaMoO₄·2H₂O，120mg/L PAEs混合物(包括20mg/L DMP、20mg/L DEP、20mg/L DBP、20mg/L BBP、20mg/L DEHP和20mg/L DOP)，pH值为7.0～7.2。

步骤二、再将三角瓶置于震荡培养箱中120r/min、30℃条件下培养7天，然后取1mL培养液加入到新无机盐MSM培养液中120r/min、30℃继续培养7天后转接，无机盐MSM培养液中PAEs浓度逐渐增加由120mg/L增加至360mg/L。经过3代反复驯化后取液体培养物0.1mL，涂布于含PAEs=120mg/L的无机盐MSM固体培养基（在液体无机盐MSM培养液基础上每升加20g琼脂）上，30℃条件下培养，菌落出现后分别挑取表型不同的单菌落培养于营养琼脂培养基（牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0g/L，pH=7）上，反复划线培养得到多株纯菌。

步骤三、将所得纯菌再次回接至无机盐MSM固体培养基平板上，在含PAEs的无机盐MSM固体培养基平板上能够生长，但在不含PAEs的无机盐MSM固体培养基平板上不能生长的菌株，被认为具有降解利用PAEs的能力。将这些纯菌接种至含PAEs的无机盐MSM培养液中检验其降解PAEs的能力，选择PAEs降解能力最高的菌株进行鉴定和检测，并将其命名为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21。

具体实施方式三：本实施方式邻苯二甲酸酯降解菌硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，可用于邻苯二甲酸酯的降解。

在受邻苯二甲酸酯污染的环境中投加硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，投加和降解选择环境温度为10～35℃，环境pH值为5.5～9的条件下进行。本实施方式硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21可用于水体或土壤修复。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21培养于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，将硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21培养液喷洒到到受邻苯二甲酸酯污染的土壤（土壤中含DMP、DEP、DBP、BBP、DPP、DEHP和DOP）中，喷洒量可根据受污染程度而定，通过微波萃取法检测，喷洒3天后土壤中的PAEs含量开始明显下降。为加强修复效果，可在喷洒后第6天进行第二次硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21投加喷洒，经一个月的修复，土壤中仅DPP还有微量检出，但PA未检出，说明硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21可有效地降解各种分子量的邻苯二甲酸酯，有效和彻底的将邻苯二甲酸酯分解为二氧化碳和水。

硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21同样可以修复受污染水体，实验室水体修复效果与土壤修复洗过基本相近。

修复环境时硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21作为优势菌群进行投加，具有受环境因素（如温度，土壤碱度）等干扰小、受限制条件少等优点。且节杆菌属（Arthrobacter）细菌均对人畜无害。

Claims

1.一株邻苯二甲酸酯降解菌，其为硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7671。

2.如权利要求1所述的邻苯二甲酸酯降解菌在邻苯二甲酸酯降解中的用途。

3.根据权利要求2所述邻苯二甲酸酯降解菌在邻苯二甲酸酯降解中的用途，其特征在于在受邻苯二甲酸酯污染的环境中投加硬结节杆菌（Arthrobacter scleromae）C21，投加和降解选择环境温度为20～38℃，环境pH值为5.5～9的条件下进行。