CN105316251A - 一株高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的根瘤菌属及其应用，该菌从大棚种植基地的土壤中分离、纯化而获得，为根瘤菌属的一个种，命名为Rhizobium？sp.LMB-1，保存在《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(China？General？Microbiological？Culture？Collection？Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC？NO.10432。该菌种具有较高降解常见的邻苯二甲酸酯类PAEs(DMP，DEP，DBP，DEHP)的能力，在5天内对100mg/L的DMP，DEP，DBP，DEHP这四种常见PAEs的降解率分别为99.71％，66.30％，71.54，54.02％。

Description

一株高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的菌株及其用途

发明领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的菌种及其应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯类(Phthalateesters，简称PAEs)是指邻苯二甲酸的酯化衍生物，是塑胶工业中最为常见的塑化剂，例如用于生产聚氯乙烯(PVC)、聚醋酸乙烯酯、纤维素和聚氨酯等，以此来提高塑料的机械性能和柔韧性。同时PAEs还可以用于油漆、胶水、润滑油、医药、化妆品、农药、食品包装、塑料管材、家具、儿童玩具和浴帘的生产。全球PAEs的年产量可达数百万吨，而且大多数的PAEs并没有以共价键的方式结合到塑料产品的基质中，而是以范德华力或者氢键的方式连接，并能够保留独立的化学性质，它们可以在产品生产、使用以及产品的后处理过程中逃逸到环境中污染环境。近年来，由于塑料制品的广泛使用导致PAEs在环境中无处不在。目前，特别是在一些工业发达的国家，已经从土壤、地表水、饮用水、垃圾场、植物、空气甚至食品中都检测到了邻苯二甲酸酯的存在，PAEs已经成为了全球最为普遍的污染物之一。PAEs在环境中分布广泛，由于其自身的疏水性及低水溶性，能很快进入到沉积环境中。并且它们随着碳链长度的增加，脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高。PAEs极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。

PAEs一般是无色油状粘稠的液体，易溶于有机溶剂和类脂而不易溶于水，在常温下不易挥发。在环境中常见的成分有DMP、DEP、DBP和DEHP等，其化学结构是由一个刚性平面基环和两个可塑的线性脂肪链组成，其化学结构为：

由于PAEs在塑料制品的生产、使用等过程中很容易释放出来，该类化合物已成为一种全球性的环境有机污染物，在土壤、水体、大气、生物甚至人体中都已发现PAEs的分布。大量研究表明：邻苯二甲酸酯为一种具有致畸、致癌、致突变“三致效应”的环境干扰剂。邻苯二甲酸酯类PAEs的性质稳定，易在环境中沉积，对人呼吸道和皮肤有毒害作用，可诱发很多生物的突变、畸变和癌变，并能通过食物链累积。

研究表明，邻苯二甲酸酯类PAEs的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解成为它们从环境中缓慢消失的主要途径，因此高效降解菌的筛选成为修复邻苯二甲酸酯类PAEs污染的生态系统的关键。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有降解邻苯二甲酸酯类PAEs存在的难题，提出一株具有高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs能力的根瘤菌属新种，该降解菌从江苏省南京市受邻苯二甲酸酯类PAEs长期污染的大棚种植土壤样品中分离，具有降解常见几种PAEs的能力。

本发明的另一目的是提供本发明的可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的应用，其应用是降解苯二甲酸酯类PAEs的用途。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种以保藏编号为CGMCCNO.10432，保藏于CGMCC的根瘤菌属(Rhizobiumsp.)菌株。该菌株于2014年8月6日保藏于《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)。

本发明所分离得到的新菌种命名为：Rhizobiumsp.LMB-1。

本发明还提出了一种获得可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的方法，其特点在于包括分离、纯化、诱变或遗传转化CGMCCNO.10432菌株的步骤。

本发明还提供了一种CGMCCNO.10432菌株的应用，是作为降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的用途。

该降解菌(称LMB-1)经形态、生理生化特性分析和16srRNA基因序列同源性分析，鉴定为根瘤菌属(Rhizobiumsp.)。LMB-1菌株在pH为6，温度37℃能以DEHP为唯一碳源生长，并且对其降解能力达到最高。

本发明通过对大棚种植(长期受到塑料薄膜覆盖)土壤样品进行分离、纯化，得到根瘤菌属的一个新种，采用HPLC对降解培养液中的PAEs中残留量进行定量分析，经过反复实验，发现该菌种具有高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的能力，从而实现本发明的目的。

本发明的可高效降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的筛选：

1、土样：采自江苏省南京市长期受邻苯二甲酸酯类PAEs污染的大棚种植土壤；

2、菌株的富集和分离；

将大棚种植土样混匀，称取5g加入到含有100mg/L的DEHP无机盐培养液，30℃，200rpm/min，摇床培养7d，用移液枪取2mL转接到新鲜的无机盐培养液，传代培养过程中，驯化3代，DEHP的无机盐培养液中DEHP浓度从100mg/L逐步提高到300mg/L；然后从最后一次无机盐培养液(DEHP浓度为300mg/L)中取100μL涂布于无机盐固体平板上(DEHP浓度为300mg/L)，30℃恒温培养箱，数天后，挑取生长良好的单菌落，划线纯化；该降解菌的分类命名为：根瘤菌属(Rhizobiumsp.)，于2014年8月6日保藏于《中国普通微生物菌种保藏管理中心》(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNO.10432。

所述的无机盐培养液(MSM)的组分及配比为：K₂HPO₄，5.8g；KH₂PO₄，4.5g；(NH₄)₂SO₄，2.0g；MgCl₂，0.16g；CaCl₂，0.02g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.24mg；FeCl₃，0.18mg；MnCl₂·2H₂O，0.15mg，NaOH调节pH至7.0。121℃高压灭菌15min。

本发明提供的可高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的鉴定与属性

1、菌株LMB-1的形态与生理生化特征

菌体的形态特性：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Rhizobiumsp.LMB-1的细胞为革兰氏阴性短杆菌，细胞较小。为0.5～1.0μm×1.2～3.0μm。

b.菌落的形态特性：

在TSA培养基平板上，37℃培养24h后，菌落呈乳白色，圆形，丰满，有光泽，表面光滑凸起，半透明，边缘整齐，直径1.0-2.0mm。

表1.菌株LMB-1的主要生理生化特性

注：“+”，阳性；“—”，阴性。

2、菌株LMB-1的16SrRNA基因序列(No.KM891589)

Rhizobiumsp.LMB-1的16srRNA

TGGTGGCGGCAGGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGATGAAGATAATGACGGTAGTCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTATGGGCATTGGAGACGATGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGCCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTATGTAAGGCGCC

采用小量DNA提取方法提取细菌总DNA。将获得的16SrRNA基因序列输入GenBank，用BLAST软件对菌株LMB-1的16srRNA的基因序列和GenBank中已经登录的序列进行核苷酸同源性比较，并通过软件CLUSTALW和MEGA4.1构建发育树，结果发现LMB-1与根瘤菌属Rhizobiumsp.同源度最高(见图1)。

综合上述生理生化特性、16SrRNA基因序列结果，本发明LMB-1应归属根瘤菌属。

表2.菌株LMB-1的16srRNA基因序列的BLAST分析

本发明的高高效降解邻苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的用途：

该菌株可降解塑料薄膜中的邻苯二甲酸酯类物质。该菌株可用途受这些物质污染的水体、土壤或农产品的生物净化及修复。

附图说明

图1是LMB-1发育树。

图2是LMB-1对常见4种PAEs的降解效果。

图3是LMB-1对DEHP(最难降解)的最佳降解pH和温度。

图4是LMB-1对不同浓度的DBP(典型的PAEs)的降解曲线。

具体实施方式

实施例1：使用菌株LMB-1降解4种常见PAEs

如图2所示，利用液相色谱HPLC法测定菌株LMB-1在45h内对对4种常见PAEs：DMP、DEP、DBP以及DEHP的降解效果。

从图中可知，Rhizobiumsp.LMB-1不仅能降解短链的DMP、DEP及DBP，更能降解长碳链的DEHP，随着碳链长度的增加，降解的难度也变大，在45h内，Rhizobiumsp.LMB-1对短链DMP的降解率就能达到99.71％，而对长碳链的DEHP，Rhizobiumsp.LMB-1在45h内只能降解54.02％。但与其他文献相比，菌株LMB-1的降解能力已经很有优势了。

测定PAEs的液相色谱条件如下：

实施例2：pH值、T对菌株LMB-1降解长碳链DEHP的影响

如图3A，调节MSM培养基为不同pH值(5～9)，在初始DEHP浓度为100mg/L的条件下，培养5天，采用HPLC测定pH对邻苯二甲酸酯类PAEs降解作用的影响。

如图3B，将菌株LMB-1接种于含有100mg/L的DEHP的MSM中，MSM培养基的pH值已调成最适pH(pH＝6)，分别放于20℃、30℃、37℃、45℃的摇床中培养5天，使用HPLC测定T对邻苯二甲酸酯类PAEs降解作用的影响。

由图3A可看出，在pH为6时，Rhizobiumsp.LMB-1对长碳链DEHP的降解作用最强，在5天后其降解率达84.68％。

由图3B可看出，在T为37℃时，Rhizobiumsp.LMB-1对长碳链DEHP的降解作用最强，在5天后其降解率达88.07％。

实施例3：不同初始DBP浓度对菌株LMB-1降解PAEs的影响

如图4，将菌株LMB-1分别接种于含有不同初始浓度的DBP无机盐培养液，采用HPLC每个12h测定培养液中的DBP残留浓度并测定菌体的生长量。

由图4可知，在不同初始浓度的DBP存在条件下，菌株LMB-1都能很好地生长，随着DBP初始浓度的增加，菌株MB-1对其降解的难度越来越大。但从中发现当DBP浓度低于200m/L时，菌株LMB-1对DBP的降解效果很好，48h内就能将50mg/L的DBP完全降解完，如图4A所示。对于200mg/L的DBP，60h内能达到74.36％，如图4D所示。但是当浓度高达300mg/L、400m/L时，在60h内，菌株LMB-1对DBP的降解率只能达到47.88％、47.99％，推测：随着PAEs碳链变长，降解过程中可能需要更多的菌体才能使碳链断裂，如图4E、4F所示。

Claims (4)

1.一种以保藏编号为CGMCCNO.10432，保藏于CGMCC的根瘤菌属(Rhizobiumsp.)菌株。

2.根据权利要求1所述的菌株，其分离得到的新菌种命名为Rhizobiumsp.LMB-1。

3.一种获得如权利要求1或2所述菌株的方法，其特点在于包括分离、纯化、诱变或遗传转化CGMCCNO.10432菌株的步骤。

4.一种CGMCCNO.10432菌株的应用，是作为降解苯二甲酸酯类PAEs的降解菌的用途。