CN105602872B - 一株高效降解草甘膦的细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有草甘膦农药高效降解特性的细菌，经分类命名为Aquamicrobium defluvii，标记为YU 1‑1，已将菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO.M2015816。本发明还公开了上述农药高效降解菌的草甘膦降解特性和生物降解机制。通过降解产物分析，将草甘膦分子首先降解为中间产物氨甲基膦酸（AMPA），然后进一步降解为磷酸分子和甲胺分子，为微生物生长分别提供磷源和碳源。该菌株降解草甘膦的代谢产物无毒性，环境亲和性高。因此本发明菌株在草甘膦农药污染的水体环境治理、土壤环境治理以及当前工业场地农药污染的综合治理中具有非常高的应用价值。

Description

一株高效降解草甘膦的细菌
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株能够高效降解草甘膦的细菌。
背景技术
农药的广泛使用，在给农业生产带来快速高效的作物产量之外，也给水体、土壤和大气环境造成了严重的污染，也增加了农产品的产品安全问题。目前常用的农药修复方法一般采用炉窑焚烧、热脱附和化学处理等方法，但是存在费用高，修复困难，容易造成二次污染等情况。利用水体和土壤中能够将有机农药作为能源物质，并将其降解为无毒或者低毒化合物的生物(主要为微生物)所建立的生物修复法，被公认为是一种高效、安全、无污染和廉价的修复方式，同时，因为微生物在环境中的种类丰富多样、分布广泛、适应性强、易驯化易突变等特点，在当前的农药生物修复中具有较大的优势。
有机磷除草剂农药草甘膦是1974年由美国孟山都公司(Monsanto)率先在美国注册登记，并在当年被评为最优秀的农药，至今已在全世界100多个国家地区注册并使用，也成为当今世界上除草剂使用量最大的农药之一。我国自上世纪八十年代开始生产并使用草甘膦，并迅速成为继美国之后的草甘膦世界第二大生产和出口国。草甘膦是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，对多种单子叶和双子叶木本、草本植物具有杀伤作用。由于草甘膦化学性质稳定，同时具有高效、广谱、低毒、低残留等优点，目前已广泛应用与橡胶园、果树园、茶园、桑园、甘蔗地及林业等地区的除草。
草甘膦对植物具有强烈的毒性作用，对于人、畜也存在毒性，依据2015年最新的世界卫生组织研究报告和国际癌症研究机构对美国、加拿大和瑞典的草甘膦使用情况的调查研究，农药草甘膦可能会引发人类淋巴腺癌和肺癌，这也是世界卫生组织首次确认草甘膦与癌症有关联。虽然我国还未有研究报告草甘膦的致癌性，但是其潜在的毒性作用依然需要国家政府和各地环保部分重视。
草甘膦在环境中不易被降解，其理化性质稳定，因此草甘膦的降解主要依赖于环境中的微生物，特别是在长期受草甘膦污染的土壤中。从污染环境中筛选毒害物质的微生物降解菌种已逐渐成为微生物资源开发的新手段和新策略。根据研究报道，草甘膦在土壤中，被微生物降解的速率较慢，半衰期约为60天左右，6个月后，90％的草甘膦才可被生物降解为水、二氧化碳等无机组分。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本专利以研究降低草甘膦农药的环境毒性和环境残留量为技术背景，从草甘膦的微生物降解技术出发，通过在生产农药的场地进行土样采集，并使用生物的方法对环境微生物进行长时间的培养驯化，以筛选出能够对高浓度草甘膦产生抗性和降解性的微生物为研究目的，并通过化学手段检测草甘膦的生物降解产物，从而得到能够应用于草甘膦污染的种植业、畜牧业及林业等地的模式微生物。
本发明的第一个目的是提供一种从湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司新厂区周边植物根际、非根际土样和采自于该厂区的5个排水口水样中筛选得到的对草甘膦具有高耐受性和高效降解性的细菌：Aquamicrobium defluvii YU 1-1，于2015年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2015816。
该菌株的生物学特征主要有：菌落圆形，不透明，成熟菌落直径约为0.8cm，淡黄色至黄色，菌落湿润粘稠易挑取。在液体发酵培养基摇床振荡培养48小时内达到对数生长期，培养5天内达到稳定期，发酵液浑浊，呈乳黄色粘稠状；在固体LB培养基上，该菌菌落大小规则，多为圆形或卵圆形，边缘光滑，成熟菌落中心深黄色，菌落边缘呈黄色或者淡黄色，不透明，成熟菌落边缘形成单层白色或者浅黄色的粘液层。
将该菌的16S rDNA序列通过PCR扩增，得到1392bp长度的扩增产物，扩增产物经测序公司序列测定，如SEQ NO.1，将序列与GenBank中的序列进行BLAST比对，结果表明该菌株与Aquamicrobium sp.同源性很高，其相似度超过99％。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为Aquamicrobium defluvii，在GenBank中的序列号为KP751409。
该菌株的草甘膦降解特性：在固体平板检测实验中，该菌株能在以草甘膦为惟一碳源、惟一磷源以及惟一碳磷源的培养基上正常生长，且生物量高，生长速率快。
在以草甘膦为惟一碳源的液体MSM培养基中，振荡培养24小时内即可达到对400mg/L草甘膦的完全降解。同时，该菌株对温度的适应性较强，能在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃振荡培养条件下快速生长，且能在除了40℃以外的其他实验条件下，培养48小时内达到对400mg/L草甘膦的完全降解。该菌可在草甘膦浓度最高为1000mg/L的固体和液体培养基中生长，且在48小时内最高可完全降解1000mg/L的草甘膦。初始接种量改变为2％、5％、10％、15％以及20％的条件下，该菌株对400mg/L的降解率均达到100％。培养基pH值对该菌株降解草甘膦存在较大影响，该菌只在培养基为中性条件下才可完全降解MSM培养基中的草甘膦。
该菌株的草甘膦降解机理：使用气相色谱-质谱联用方法，通过分析该菌株在MSM培养基中降解草甘膦的产物，发现在培养48小时过程中，草甘膦分子的相对丰度迅速降低至最终消失，而氨甲基膦酸(AMPA)分子的相对丰度出现先增高后降低的趋势。通过分析草甘膦分子和AMPA分子的结构，得出该菌对草甘膦的生物降解途径，揭示该菌对草甘膦的降解机理。
本发明的第二个目的是提供Aquamicrobium defluvii YU 1-1在降解草甘膦方面的应用。
本发明的再一个目的是提供培养保藏号为CCTCC NO：M2015816的Aquamicrobiumdefluvii YU 1-1菌株应用于降解草甘膦时的条件是，pH为7-8；温度为20-40℃，作用时间为24小时以上。
菌株对草甘膦分子的完全降解和充分利用，并且降解产物无毒，对环境无污染，因此揭示了该发明菌株的草甘膦高效生物降解作用，在草甘膦污染的环境中具有非常好的实际工业和农业应用价值。
附图说明
图1为菌株YU 1-1在LB固体平板上的生长情况和菌落形态示意图。
图2为菌株YU 1-1的16S rDNA的系统发育树图
图3为菌株YU 1-1的草甘膦降解动力曲线和生长曲线图。
图4为菌株YU 1-1在不同温度、pH值、接种量、初始草甘膦浓度培养条件下的降解率图。
图5为草甘膦和AMPA的质谱图以及菌株YU 1-1在MSM培养基内的草甘膦生物降解途径和降解机制图。
该细菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2015816。地址：中国.武汉.武汉大学，拉丁学名：Aquamicrobium defluvii YU 1-1，于2015年12月31日保藏。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】草甘膦农药高效降解菌的筛选
实验土样和水样均采自于湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司新厂区周边植物根际和非根际土样，水样也采自于该厂区的5个排水口，土样和水样采集后，回实验室立即放于-20℃保存，以杀死土壤中的昆虫和植物组织以及一些病毒。处理10小时之后，于4℃解冻，多余的土样置于4℃冰箱保存。取10g土样或者10mL水样，加入100mL灭菌的液体富集培养基(含无菌玻璃珠)(富集培养基成分：蛋白胨10g/L，NaCl 1.0g/L，KH2PO3 1.0g/L，pH＝7)，150rpm振荡7天。培养1周后，取富集培养基中的培养液10mL，分别加入含有50mg/L草甘膦的富集培养基中，于相同温度和振荡条件下培养1周。依此方式，按照浓度50,100,200,400和500mg/L驯化，至最高浓度后，按照稀释涂布平板法，取1mL上清液稀释至10-5，取其中10-3,10-4,10-5 3个稀释梯度下的溶液200μL，分别在以草甘膦农药为惟一碳源的MSM(MineralSalt Media)基础培养基(培养基成分：NH4NO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，pH＝7)培养基上进行涂布(草甘膦终浓度为100mg/L)，每个处理重复3个平板，然后将平板置于28℃恒温箱培养，5天后记录每个平板上的菌株数量，筛选、划线分离出以草甘膦为唯一碳源的高效纯种降解微生物。再于以草甘膦为唯一磷源(培养基中不添加KH2PO4和K2HPO4，而加入蔗糖10g/L和KCl 1.0g/L)和唯一碳磷源(培养基中不添加KH2PO4和K2HPO4，而加入KCl 1.0g/L)的固体MSM培养基检测微生物的生长情况。
【实施例2】菌株的鉴定
将纯化的菌株接种于固体LB培养基(成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物1g/L，NaCl1g/L，琼脂20g/L，pH＝7)培养5天后观察菌株在固体平板上的菌落形态特征：菌落圆形，不透明，成熟菌落直径约为0.8cm，淡黄色至黄色，菌落湿润粘稠易挑取(如图1所示)。
菌株的理化性质鉴定主要参照伯杰细菌鉴定生理生化测试。通过表格记录结果。
表1：细菌YU 1-1的生理生化检测
注：“+”表示培养5天后检测为阳性结果，“-”表示阴性结果
细菌16S rDNA测序包括了菌株DNA提取、16S rDNA体外扩增(使用16S通用引物1492R和27F)和基因测序。由基因公司测序得到的序列结果，经过软件分析、合并以及带入NCBI的数据库中进行BLAST基因序列比对，结果使用生物学软件分析，并与数据库中相似菌株的16S rDNA序列进行比对，建立菌株16S rDNA系统发育树如图2所示。
【实施例3】菌株对草甘膦的降解率分析
1、降解动力学模型构建
使用液体MSM培养基，加入草甘膦农药后的终浓度设定为100mg/L。测定前，将本菌株接种于LB液体培养基中活化，180rpm转速37℃活化培养24小时，然后取2mL活化培养液，测定OD600值，再加入2ml无菌蒸馏水制成均匀的菌悬液，以10％的体积比加入到培养基中。将所有培养基于摇床180rpm转速28℃摇床振荡培养24小时，每隔2小时测定上清液中草甘膦含量和菌株OD600值，上清液经稀释、亚硝化定容、过滤，使用反相高效液相色谱分析法测定菌株对草甘膦的残留量，根据草甘膦农药在培养基中的残留量变化，计算出各个检测时间段上微生物的草甘膦降解率。农药降解率的计算公式如下所示：
Ef＝(Cck-Ct)/C0
Ef表示草甘膦降解率，Ct表示在时间t下测定的实验组中草甘膦的残留浓度，Cck表示在时间t下测定的空白组中草甘膦的残留浓度，C0表示培养基中草甘膦的初始浓度。
在24小时培养周期时间内，菌株对草甘膦的降解呈显著变化趋势。在初始培养0小时至培养10小时内，培养基中的草甘膦浓度变化较低，而在培养10小时之后，草甘膦的残留量呈指数降低，该菌对草甘膦的降解率也呈指数形式增加，至培养24小时，降解率达到100％。整个培养过程中，菌株OD600变化相对较低(如图3所示)。
2、培养条件对草甘膦降解能力的影响：
分别研究培养温度、培养基pH值、菌种初始降解量和草甘膦初始浓度对该菌降解草甘膦的影响(如图4所示)。
(1)培养温度：将草甘膦降解的振荡稳定设为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，按照10％菌株接种量，草甘膦初始浓度为400mg/L，分别在培养24小时和48小时后，检测每个温度培养条件下的草甘膦残留量和菌株生物降解率。在培养24小时内，30℃培养条件下的草甘膦降解率达到100％，而低温20℃、25℃下降解率均未超过20％，35℃条件下超过50％降解率，40℃则没有发生降解。在培养48小时后，除了40℃降解率仅为28.5％外，其余4个培养条件下的草甘膦降解率均达到了100％。
3、pH值：
将MSM培养基的pH值调为5、6、7、8、9，按照10％菌株接种量，草甘膦浓度为400mg/L，35℃培养48小时。通过草甘膦残留量的测定，发现在培养基pH值为7的条件下，降解率可达到100％，而在偏酸性培养条件下，降解率均未超过3％，pH值为8条件下，降解率升为35.8％，随着pH值变为9，该菌失去降解草甘膦的能力。
3、菌株初始接种量：
设定该菌株的初始接种比例分别为2％、5％、10％、15％和20％(v/v)，草甘膦浓度为400mg/L，35℃培养48小时。通过实验结果测定，发现在5种实验处理下，草甘膦的降解率均达到100％。该结果说明了该菌株的初始接种量对草甘膦降解的影响小。
4、草甘膦初始浓度：
设定培养基中草甘膦初始浓度分别为200,400,600,800和1000mg/L，按照10％菌株接种量，30℃培养48小时。分别在培养24小时和48小时后，检测每个温度培养条件下的草甘膦残留量和菌株生物降解率。在培养24小时,4种实验处理下的草甘膦降解率分别为69.9％、59.6％、73.5％、62.4％，均超过50％降解率，且在草甘膦浓度为1000mg/L条件下能够生长，且降解率达到66.6％；而在培养48小时后，所有实验组中的草甘膦残留量均为0，该菌株在48小时内，能够完全降解草甘膦最高浓度为1000mg/L。该实验结果也说明了该株细菌的草甘膦高效降解能力和快速降解效率。
【实施例4】菌株的草甘膦降解机制
取培养24小时的MSM液体培养基，高速离心，弃沉淀取上清液，转至新玻璃氮吹管，在50℃下用氮气吹干，加入0.7ml的冰乙酸和1.5ml的原乙酸三甲酯，用漩涡震荡器震荡，再用超声处理5min，混匀后在85℃中衍生90min，取出冷却至室温后，用氮气吹干，加入1ml乙酸乙酯溶液溶解残渣，混匀后过滤使用气相色谱-质谱联仪分析。按照文献的检测步骤和参数，检测草甘膦及其降解产物的质谱图。如图5所示，草甘膦首先被菌株降解为氨甲基膦酸(AMPA)和乙酸，乙酸可作为碳源被微生物利用，从而达到促进微生物生长的作用。而AMPA可以继续被菌株降解为甲胺分子和磷酸分子，也可作为碳源和磷源分别被微生物利用，参与微生物体内的C1代谢循环，形成二氧化碳和水。根据检测到的产物建立的草甘膦降解途径，证实了该菌株对草甘膦分子的完全降解和充分利用，并且降解产物无毒，对环境无污染，因此更揭示了该发明菌株的草甘膦高效生物降解作用，在草甘膦污染的环境中具有非常好的实际工业和农业应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一株高效降解草甘膦的细菌
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> Aquamicrobium defluvii YU 1-1 16s rDNA
<400> 1
gccgtgacgg cagcccacca tgcaagtcga gcgccccgca aggggagcgg cagacgggtg 60
agtaacgcgt gggaatctac ccagctctac ggaataaccc agggaaactt ggactaatac 120
cgtatacgtc cttcgggaga aagatttatc ggagttggat gagcccgcgt tggattagct 180
agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca 240
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300
gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt 360
aaagctcttt caacggtgaa gataatgacg gtaaccgtag aagaagcccc ggctaacttc 420
gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa 480
gcgcacgtag gcggatcgat cagttagggg tgaaatccca gggctcaacc ctggaactgc 540
ctctaatact gtcgatctgg agttcgagag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga 600
aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggct cgatactgac 660
gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720
aacgatggaa gctagccgtc ggcaggttta cctgtcggtg gcgcagttaa cgcattaagc 780
ttcccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 840
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac 900
atcccgatcg cggttaccag agatggtttc cttcagttag gctggatcgg tgacaggtgc 960
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020
ccctcgccct tagttgccct tattcagtta ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc 1080
cgagaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg 1140
tgctacaatg gtggtgacag tgggcagcga gaccgcgagg tcgagctaat ctccaaaagc 1200
catctcagtt cggattgcac tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc 1260
gcagatcagc atgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320
atgggagttg gttttacccg aaggcgctgc gccaacccgc aaggaagcag gcgactcgcg 1380
tagtaggctg cg 1392

Claims (4)

1.一种细菌，其特征在于：该细菌是保藏号为CCTCC NO：M2015816的细菌Aquamicrobium defluvii YU 1-1。
2.权利要求1所述的细菌Aquamicrobium defluvii YU 1-1在降解草甘膦中的应用。
3.根据权利要求2所述的细菌Aquamicrobiumdefluvii YU 1-1在降解草甘膦中的应用，其特征在于：Aquamicrobiumdefluvii YU 1-1菌株应用于降解草甘膦时的条件是， pH为7-8，温度为20-40 ºC，作用时间为24小时以上。
4.根据权利要求2所述的细菌Aquamicrobium defluvii YU 1-1在降解草甘膦中的应用，其特征在于：该菌株将草甘膦分子首先降解为中间产物氨甲基膦酸，然后进一步降解为磷酸分子和甲胺分子。
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